JP2001526029A - 免疫反応に関係するｇタンパク質共役型受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、免疫応答に関係する２つのヒトGタンパク質共役型受容体（GRIR）ならびにGRIRを同定およびコードするポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト、及びアンタゴニストを提供する。さらに本発明は、GRIRの発現に関わる疾患の治療および予防の方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 技術分野 本発明は、免疫応答に関係する新たな２つのGタンパク質共役型受容体の核酸 配列及びアミノ酸配列、並びに細胞増殖及び細胞シグナル伝達に関わる疾患の診
断・予防・治療におけるこれらの配列の利用法に係るものである。

【０００２】 発明の背景 Gタンパク質共役型受容体（G-protein coupled receptors；GPCR）は、細胞外
のシグナルを伝達する必須の膜タンパク質のスーパーファミリーである。GPCRに
は、例えばドーパミン、エピネフリン、ヒスタミン、グルタミン酸（向代謝性の
効果）、アセチルコリン（ムスカリン性の効果）、セロトニン等の生体アミンに
対する受容体や、プロスタグランジン、血小板活性化因子、ロイコトリエンのよ
うな炎症の脂質媒介物等に対する受容体や、カルシトニン、C5aアナフィラトキ シン、卵胞刺激ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、ニューロキニン、オキ
シトシン、トロンビン等のようなペプチドホルモンに対する受容体や、網膜感光
色素、嗅覚刺激性分子のような感覚性のシグナル媒介物に対する受容体が含まれ
る。

【０００３】 高度に保存されたこれらの受容体の構造は、7つの疎水性膜貫通領域、第2及び
第3の細胞外ループの間のシステインジスルフィドブリッジ、細胞外N末端、およ
び細胞質内C末端からなる。3つの細胞外ループは、3つの細胞内ループに代替さ れて7つの膜貫通領域と結びつく。N末端は配位子と相互作用し、ジスルフィドブ
リッジはアンタゴニスト及びアゴニストと相互作用し、また大きな第三細胞内ル
ープはGタンパク質と相互作用して、サイクリックAMP、ホスホリパーゼC、イノ シトール3リン酸、またはイオンチャネルタンパク質のようなセカンドメッセン ジャーを活性化する。これらのタンパク質の最も保護された部分は、膜貫通領域
および第１の2つの細胞質内ループである。第２の細胞質内ループに存在する保 護された酸性−Arg−芳香族トリプレットは、Gタンパク質と相互作用する。共通
パターン、[GSTALIVMYWC]-[GSTANCPDE]-{EDPKRH}-x(2)-[LIVMNQGA]-x(2)-[LIVMF
T]-[GSTANC]-[LIVMFYWSTAC]-[DENH]-R-[FYWCSH]-x(2)-[LIVM]は、このスーパー ファミリーに属する殆どのタンパク質に特有のものである (Watson, S.およびS.
Arkinstall (1994) The G-protein Linked. Receptor Facts Book, Academic Pr
ess. San Diego,CA; Bolander, F.F.(1994) Molecular Endcrinology, Academic
Press, San Diego, CA.)。

【０００４】 臭気物質の受容体は、環境から嗅覚神経細胞を通して脳の皮質領に揮発性の化
学的シグナルを伝達する主要因である多重遺伝子族の構成要素である。臭気物質
の受容体は、多くの哺乳類の種（例えば、イヌ、ラット、マウス、ヒト）の嗅上
皮において検出されており、受容体の相同的系統群はヒトの精巣において発現さ
れ、それは精液の走化性の要因である(Parmentier, M.ら (1992; Nature 355:45
3-455.)。

【０００５】 ラットの嗅覚のタンパク質は、臭気物質の受容体の系統群の構成要素であり、
第１の分子の１つが、分子基準の匂い認識の研究に用いられる(Buck L.およびR.
Axel (1991) Cell 65:175-187.)。ラットのタンパク質は、333のアミノ酸の長さ
であり、またN₅にグリコシル化部位を、C₃₀₆にパルミトイル化部位を、C₉₇とC_{18 9} にジスルフィド結合を有する。相同的なヒト嗅覚受容体（OR）およびOR疑似遺 伝子は、mRNA及びゲノムDNAからクローニングされる（Crowe, M.L. (1996) Gene
169:247-249）。

【０００６】 走化性の受容体は、免疫応答において重要である。それらは、ケモカイン、血
小板活性化因子（PAF）、及びプロテアーゼによって活性化される。これらの受 容体は、モルモット、ラット、マウス、ヒトを含むある種の哺乳類の単球、リン
パ球、好中球、好塩基球、好酸球、血小板、白血球において発見されている。走
化性の受容体は、末梢組織において広く発現され、また平滑筋、肺、脳、肝臓、
内皮細胞に存在する。

【０００７】 補体は肝臓において生成され、血液および細胞外液中を循環して感染症と戦う
ための細胞を刺激する。補体5（C5）は、補体系が活性化された場合は常にタン パク分解性に切断されて(proteolytically cleaved)C5a及びC5bを生成する。C5a
は、血液からの外来性の粒子及び生物体を明らかにすることを担う13の血漿タン
パク質の１つである。更に、ヒトC5a（74のアミノ酸ペプチド）は、免疫系の細 胞に対する化学誘引物質として機能する。

【０００８】 C5a受容体は、好中球、マクロファージ、肥満細胞に存在するGPCRであり、ま たGq／G11-タンパク質と相互作用してホスホイノシトールのシグナル伝達経路を
活性化すると考えられている。KIAA0001/C5a受容体は、338のアミノ酸の長さで あり、Asn3にN-グルコシル化部位を有する(Nomura,N.ら(1994) DNA Res. 1:27-3
5.)。

【０００９】 Charlton. M.E.ら (1997: Brain Res. 764:141-8)は、ラットの腹側の被蓋か ら305のアミノ酸のGPCR、VTR15-20を同定した。そのcDNAはオーファンレセプタ ーと相同性を共有し、類推されるタンパク質は、スーパーファミリーの中で保存
された特定の領域を示す。VTR 15-20は、哺乳類の神経系の至る所で発現され、 また培養されたラットのミクログリア及びアストロサイトにおいて発現される。
最高レベルのVTR 15-20 mRNAの発現が、抹消組織および脾臓で確認されている。
細胞の分布、脳および脾臓における発現、免疫の攻撃および神経単位の発作に基
づき、VTR 15-20は神経免疫機能の役割を担うと考えられる。

【００１０】 免疫応答に関係する新たなGタンパク質共役型受容体およびこれらの受容体を コードするポリヌクレオチドの開示は、細胞増殖及び細胞シグナル伝達に関わる
疾患の診断・予防・治療に役立つ新たな成分を提供して従来技術における要求を
満たすものである。

【００１１】 発明の概要 本発明は、実質的に精製されたポリペプチド、免疫反応に関係するGタンパク 質共役型受容体（まとめて「GRIR」、個別には「GRIR-1」及び「GRIR-2」と称する）を
特徴とするものである。ある局面において、本発明はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3
、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ ID NO:3の断片からなる一群より選択されたア
ミノ酸を含む実質的に精製されたポリペプチド、GRIRを提供する。

【００１２】 また、本発明は、SEQ ID NO:1若しくはSEQ ID NO:3、またはこれらの配列の断
片のアミノ酸配列に対して少なくとも90%以上の同一性を有する実質的に精製さ れたGRIRの変異体を提供する。更に、本発明は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SE
Q ID NO:1の断片、およびSEQ ID NO:3の断片からなる一群より選択されたアミノ
酸配列を含むポリペプチドをコードする単離および精製されたポリヌクレオチド
配列を提供する。更に、本発明には、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1 の断片、およびSEQ ID NO:3の断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を 含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90%以 上の同一性を有する単離および精製されたポリヌクレオチド配列の変異配列が含
まれる。

【００１３】 更に、本発明は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ
ID NO:3の断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド配列を含む成分を提供する。更に、本発明は、SEQ
ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ ID NO:3の断片からなる
一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドに対して相補的な単離および精製されたポリヌクレオチド配列だけでなく、
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ ID NO:3の断片から
なる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド配列と厳密な条件の下でハイブリダイズする単離および精製されたポリ
ヌクレオチド配列を提供する。

【００１４】 また、本発明は、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2の断片、およびSEQ
ID NO:4の断片からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離お
よび精製されたポリヌクレオチド配列を提供する。更に、本発明は、SEQ ID NO:
2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2の断片、およびSEQ ID NO:4の断片からなる一群か
ら選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列に対して相補的
な単離および精製されたポリヌクレオチド配列だけでなく、SEQ ID NO:2、SEQ I
D NO:4、SEQ ID NO:2の断片、およびSEQ ID NO:4の断片からなる一群から選択さ
れたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90% 以上のポリヌクレオチドの同一性を有する単離および精製されたポリヌクレオチ
ド配列の変異配列を提供する。

【００１５】 更に、本発明は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ
ID NO:3の断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド配列の少なくとも断片を含む発現ベクターを提供す
る。別の側面では、その発現ベクターは宿主細胞に包含される。

【００１６】 また、本発明は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ
ID NO:3の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法を提供し、その方
法には、（ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件下で、GRIRをコードするポ
リヌクレオチド配列の少なくとも断片を含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養
する過程と、（ｂ）その宿主細胞の培地からポリペプチドを回収する過程とが含
まれる。

【００１７】 また、本発明は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ
ID NO:3の断片のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたGRIRを適切な製薬用
担体と共に含む医薬品成分を提供する。

【００１８】 更に、本発明には、前記ポリペプチドに対する精製されたアゴニストおよび精
製されたアンタゴニストだけでなく、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1 の断片、およびSEQ ID NO:3の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合す る精製された抗体が含まれる。

【００１９】 また、本発明は、所定の腫瘍性疾患の治療又は予防の方法を提供し、その方法
には、そのような治療が必要な被験者に対してGRIRのアンタゴニストを有効な量
投与する過程が含まれる。

【００２０】 更に、本発明は、所定の免疫応答の治療又は予防の方法を提供し、その方法に
は、そのような治療が必要な被験者に対してGRIRのアンタゴニストを有効な量投
与する過程が含まれる。

【００２１】 また本発明は、核酸を含む生物学的サンプルにおけるGRIRをコードするポリヌ
クレオチドの検出方法を提供し、その検出方法には、（ａ）SEQ ID NO:1、SEQ I
D NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびSEQ ID NO:3の断片を含むポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド配列の相補配列と生物学的サンプルの核酸の少なくと
も一部をハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程
と、（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の存在が、生物学的サンプルにお
けるGRIRをコードするポリヌクレオチドの存在と相関性を有する、前記ハイブリ
ダイゼーション複合体を検出する過程とが含まれる。ある局面においては、ハイ
ブリダイゼーション過程の前に、ポリメラーゼ連鎖反応法により生物学的サンプ
ルの核酸を増幅する。

【００２２】 発明を実施するための形態 本発明のタンパク質、核酸配列、及び方法について説明する前に、本発明は、
ここに開示した特定の方法論、プロトコル、細胞系、ベクター、及び試薬に限定
されるものではなく、その実施形態は変更可能であることを理解されたい。また
、ここで使用した専門用語は、特定の実施例のみを説明する目的で用いたもので
あり、特許請求の範囲のみで限定される本発明の範囲を限定することを意図した
ものではないことも理解されたい。

【００２３】 請求の範囲を含む本明細書において、単数形の「或る」及び「その（この）」
の表記は、文脈からそうでないことが明らかである場合以外は、複数の意味も含
むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」の表記には、複数のそ
のような宿主細胞が含まれ、この「抗体」の表記は、１またはそれ以上の抗体及
び当業者に周知のその等価物なども表している。

【００２４】 特別に定義されていない限り、本明細書における全ての専門用語及び特定の用
語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に一般に理解され
るものと同じ意味を有する。ここで説明したものと類似あるいは等価な方法や材
料を本発明の実施や試験において使用可能であるが、本明細書においては好適な
方法、装置、材料を説明する。本発明で言及した全ての文献は、文献で報告され
た本発明に関して用いられ得る株化細胞、ベクター、及び方法論を説明・開示す
るために引用したものである。本明細書のあらゆる開示内容は、本発明が従来発
明によるそのような開示に先行し得ないことを認めるものと解釈してはならない
。

【００２５】 定義 ここで用いるGRIRは、任意の種、詳細にはウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ
、及び好ましくをヒトを含む特定の哺乳類の種から得られたものであって、天然
、合成、半合成か、或いは組換え体を起源として得られた実質的に精製されたGR
IRのアミノ酸配列を指す。

【００２６】 ここで用いる用語「アゴニスト」は、GRIRと結合した場合にGRIRの効果を高めた
り、その効果の持続時間を延ばす分子を指す。アゴニストには、GRIRに結合して
その作用を調節するタンパク質、核酸、糖質、または任意の他の分子が含まれ得
る。

【００２７】 ここで用いる「アレル」または「アレルの配列」は、GRIRをコードする遺伝子の対
立形である。アレルは、核酸配列における少なくともひとつの突然変異に起因し
、変異したmRNA或いはポリペプチドが生ずるが、それらの構造又は機能は変化す
る場合と変化しない場合がある。与えられた任意の自然の遺伝子または組換え型
の遺伝子には、アレル形がないもの、１つ存在するもの、或いは多数存在するも
のがある。一般にアレルが生じる通常の変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付
加、または置換に因るものである。これらのタイプの変化の各々は、単独または
他の変化と組み合わされて、所定の配列において１またはそれ以上の回数で生じ
得る。

【００２８】 ここで用いるGRIRをコードする「変異した（altered）」核酸配列は、結果とし て同一のGRIRまたはGRIRの機能的特徴の少なくとも１つをともなうポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレオチドの欠失、挿入、ま
たは置換をともなうそれらの配列含み、この定義には、GRIRをコードするポリヌ
クレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な、或
いは検出困難な多形性と、またGRIRをコードするポリヌクレオチド配列の正常の
染色体の位置（locus）とは別の所定の位置を伴うアレルに対する不適切な或い は予期しないハイブリダイゼーションとが含まれる。コード化されたタンパク質
もまた「変異した」ものであり得て、サイレント変化（silent change）を生ずる アミノ酸残基の置換、欠失、または挿入を含み、結果的に機能的に等価GRIRとな
るものである。意図的なアミノ酸置換が、GRIRの生物学的または免疫学的活性が
保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および
／または両親媒性の性質についての類似性に基づき行なわれ得る。例えば、負に
荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正に荷電し
たアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ、同様な親水性値を有する非電
荷の極性頭基（polar head groups）を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロ イシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、ス
レオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。

【００２９】 ここで用いる「アミノ酸」または「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチ ド、ポリペプチド、又はタンパク質の配列、またはそれらの何れかの断片であり
、自然発生又は合成の分子を指す。GRIRの断片は、好ましくは約５〜約１５個の
アミノ酸の長さを有し、GRIRの生物的活性又は免疫学的活性を保持しているもの
である。この文脈において、「断片」、「免疫原性の断片」、または「抗原性の断片」
は、好ましくは約5〜15のアミノ酸の長さであってGRIRの生物学的活性または免 疫学的活性を保持するGRIRの断片を指す。ここで「アミノ酸配列」は、自然発生
タンパク質分子のアミノ酸配列を指すものとして挙げているが、「アミノ酸配列
」や類似の用語は、列挙されたタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミ
ノ酸配列にアミノ酸配列を限定する意味で用いられるわけではない。

【００３０】 ここで用いる「増幅」は、核酸配列の追加の複製物を生成することであり、通
常は当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて実施される（Die
ffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) PCR Primer. a Laboratory Manual,p
p.1-5, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY参照）。

【００３１】 ここで用いる用語「アンタゴニスト」は、GRIRに結合した場合にGRIRの生物学
的又は免疫学的活性の効果の程度を低下させたり、効果の持続時間を短縮する分
子を指す。アンタゴニストには、タンパク質、核酸、糖質、或いはGRIRの作用を
低下させる任意の他の分子が含まれ得る。

【００３２】 ここで用いる用語「抗体」は、完全な分子、並びに抗原決定基と結合し得るFa
、F(ab')₂、及びFvフラグメントのようなそれらの断片も指す。GRIRポリペプチド
に結合する抗体は、無処置のポリペプチドを用いて、或いは免疫化する抗原とし
て関与する小型のペプチドを含むその断片を用いて調製することができる。動物
（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）を免疫化するのに用いるポリペプチ
ドまたはオリゴペプチドは、RNAの翻訳または化学的に合成されたものから得ら れ、必要ならば担体タンパク質と結合可能である。ペプチドと化学的に結合する
通常用いられる担体には、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリン、キーホー
ルリンペットヘモシアニン（KLH）が含まれる。次に、この結合したペプチドを 用いて動物を免疫化する。

【００３３】 ここで用いる用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の断片（即ち
、エピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質の断片を用いてホストの動
物を免疫化する場合、このタンパク質の多くの領域が、抗原決定基（タンパク質
の所定の領域または三次元構造）と特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。
抗原決定基は抗体への結合について元の抗原（即ち、免疫応答を誘発するために
用いられる免疫原）と競合し得る。

【００３４】 ここで用いる用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列と相補的な核酸配列を
含む任意の成分を指す。用語「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖に対して相補
的な核酸鎖に関して用いられる。アンチセンス分子は、合成や転写を含む任意の
方法で作り出すことができる。この相補的ヌクレオチドは、一度細胞内に導入さ
れると、細胞によって作られた天然の配列と結合して二重鎖を形成し、転写や翻
訳を妨げる。「マイナス（−）」なる表現がアンチセンス鎖を指し、「プラス（
＋）」なる表現がセンス鎖を指すことがある。

【００３５】 ここで用いる用語「生物学的に活性」は、自然発生の分子の構造的機能、調節
機能、又は生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に「免疫学的に活性」
は、天然の、組換え体の、又は合成のGRIR、若しくはその任意のオリゴペプチド
の能力を指し、適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗体
に結合する。

【００３６】 ここで用いる用語「相補的」または「相補性」は、許容的な塩類(permissive
salt)及び温度条件の下での塩基対によるポリヌクレオチド同士の自然な結合で ある。例えば、配列「A-G-T」は相補的配列「T-C-A」に結合する。２つの一本鎖
分子間の相補性は、幾つかの核酸のみが結合しているような「部分的」なもので
あるか、或いは一本鎖分子間に完全な相補性が存在するような「完全」なものであ
り得る。核酸鎖同士の相補性の程度は、核酸鎖同士のハイブリダイゼーションの
効率及び強度に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖同士の結合によって左
右される増幅反応や、ペプチド核酸（PNA）分子の設計及び使用において特に重 要である。

【００３７】 ここで用いる「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のア ミノ酸配列を含む組成物」とは、概して所定のポリヌクレオチド配列またはアミ ノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥した製剤、水溶液、
または無菌の組成物が含まれ得る。GRIRまたはGRIRの断片をコードするポリヌク
レオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして利用でき
る。このプローブは凍結乾燥した形態で保存することができ、糖質のような安定
化剤と結合させることができる。ハイブリダイゼーションにおいて、このプロー
ブは、塩（例えば、NaCl）、界面活性剤（例えば、SDS）及び他の物質（例えば 、デンハート液、乾燥ミルク、サケ精子DNA等）を含む水溶液に配置することが できる。

【００３８】 ここで用いる用語「コンセンサス配列」は、再度シークエンシング(resequenc
ed)して不要な塩基が分離された核酸配列か、XL-PCR^TM(Perkin Elmer, Norwalk,
CT)を用いて5’方向及び／又は3’方向に延長された核酸配列か、再度シークエ
ンシングされた核酸配列か、或いはフラグメントの組み合わせのためのコンピュ
ータプログラム（例えば、GELVIEW^TM Fragment Assembly system, GCG, Madison
WI）を用いて２種以上のインサイト社クローンの重複した配列から組み合わせ て作られた核酸配列である。いくつかの配列が延長され、かつ組み合わされてコ
ンセンサス配列が作られる。

【００３９】 ここで用いる用語「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」とは、ノーザ
ン解析によるGRIRをコードする核酸配列と同一かまたは関連する核酸の存在の検
出が、サンプル内のGRIRをコードする核酸の存在を示しており、従ってGRIRをコ
ードするポリヌクレオチドからの転写産物の発現と相関性を有している、という
ことを表している。

【００４０】 ここで用いる「欠失」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化
であり、結果的に１個またはそれ以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸残基が欠
けることである。

【００４１】 ここで用いる用語「誘導体」は、GRIR、GRIRをコードするポリヌクレオチド配
列、またはGRIRをコードするポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド
配列を化学修飾したものを指す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば
、水素からアルキル基、アシル基、又はアミノ基への置換が含まれる。ポリヌク
レオチド誘導体は、自然発生の分子の生物学的又は免疫学的機能を保持している
ポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、グリコシル化、ポリエチレ
ングリコール化(pegylation)、または元のポリペプチドの生物学的又は免疫学的
機能を保持する別の任意のプロセスで修飾されたものである。

【００４２】 ここで用いる用語「相同性」は、或る程度の相補性を意味する。部分的な相同
性と、完全な相同性の場合があり得る。用語「相同性」の代わりに「同一性」を用い
ることができる。同一の配列が標的の核酸とハイブリダイズするのを少なくとも
部分的に阻害する部分的に相補的な配列は、「実質的に相同な」ことを指す。完
全に相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、緩やかな厳
密性のもとで、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザン法またはノーザン法、
溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検定可能である。実質的に相同な配列
またはハイブリダイゼーションプローブは、緩やかな厳密性の下で完全に相同な
配列との結合について標的の配列と競合し、それを阻害する。このことは、緩や
かな厳密性の条件が、非特異的な結合を許容するようなものであるということを
意味するわけではなく、緩やかな厳密性の条件では、２つの配列の相互の結合が
特異的（即ち選択的）相互作用であることが必要である。非特異的結合が存在し
ないことを、部分的な程度の相補性（即ち約３０％未満の同一性）さえも有して
いない第２の標的配列を用いることにより検査することができる。非特異的結合
が存在しない場合、概ね相同な配列またはプローブは第２の非相補的な標的配列
とハイブリダイズしない。

【００４３】 「ヒト人工染色体」（HACs）は6kb〜10MbのサイズのDNA配列を含んでおり、安定
した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の小染色体
である(Harrington, J.J.ら (1997) Nat Genet. 15:345-355)。

【００４４】 ここで用いる用語「ヒト化抗体」は、抗体が本来の結合能力をそのまま保持し
ながらヒト抗体により近づくように、非抗体結合領域におけるアミノ酸配列配列
を置換した抗体分子を指す。

【００４５】 ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対合を介し
て相補鎖と結合する任意の過程を指す。

【００４６】 ここで用いる用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基の間の
水素結合形成の効力によって、２つの核酸配列で形成された複合体を指す。ハイ
ブリダイゼーション複合体は、溶液中で形成されるか（例えば、Ｃ₀ｔ又はＲ₀ｔ
解析）、或いは核酸は溶液中に存在する一方の核酸と固体支持体（例えば、紙、
メンブラン、フィルタ、ピン、またはスライドガラス、ポリマー、または細胞や
その核酸が固定される他の適切な基板）に固定されたもう一方の核酸との間で形
成され得る。

【００４７】 ここで用いる「炎症」は、「免疫応答」と置き換え可能であり、それらの用語は、
心的外傷、免疫不全ならびに伝染性もしくは遺伝性の疾病に関する状態を指し、
またサイトカイン、ケモカイン、並びに細胞及び全身の防御系を活性化する他の
シグナル伝達分子を生成することにより特徴づけられる。

【００４８】 ここで用いる「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子にみられる配列に対
して、１個または２個以上のヌクレオチド、アミノ酸残基が各々加わるような、
ヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。

【００４９】 「マイクロアレイ」とは、例えば紙、ナイロン、又は他のタイプのメンブラン
、フィルタ、チップ、スライドガラス、又は他の任意の適切な固体支持体のよう
な基板上に配列された個々のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを配列し
たものを指す。

【００５０】 ここで用いる用語「変調」は、GRIRの活性の変化を指す。例えば、変調によっ
て、タンパク質活性の向上や低下、結合特性の変化、又はGRIRの生物学的、機能
的、免疫学的特性等の他の変化がもたらされる。

【００５１】 ここで用いる「核酸」または「核酸配列」は、一本鎖または二本鎖の、センス鎖
又はアンチセンス鎖である、ゲノム起源又は合成起源のDNA、RNAや、ヌクレオチ
ド、オリゴヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、及びその任意の断片や、ペプ
チド核酸（PNA）や、任意のDNA様もしくはRNA様材料を指す。「フラグメント（ 断片）」は、長さが60ヌクレオチド以上の核酸配列であり、最も好ましくは、長
さが100ヌクレオチド以上、又は1000ヌクレオチド以上、更には10,000ヌクレオ チド以上の断片を指す。

【００５２】 ここで用いる「オリゴヌクレオチド」は、PCR増幅又はハイブリダイゼーショ ンアッセイ、またはマイクロアレイで用いることができる核酸配列であって、長
さが少なくとも約6ヌクレオチドから約60ヌクレオチド程度のもので、好適には1
5〜30ヌクレオチド、より好適には20〜25ヌクレオチドであるものを指す。ここ で用いる「オリゴヌクレオチド」は、当技術分野において一般に定義されている用
語「アンプライマー（amplimer）」、「プライマー」、「オリゴマー」、及び「
プローブ」と概ね同義である。

【００５３】 ここで用いる「ペプチド核酸」（PNA）は、末端がリジンであるアミノ酸残基 のペプチドバックボーンに結合した5ヌクレオチド以上の長さのオリゴヌクレオ チドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤(anti-gene agent)を指す。末端の リジンがその組成に溶解性を賦与している。PNAは相補的な一本鎖DNAやRNAに優 先的に結合して転写物の伸長を止め、このような細胞では、PNAをポリエチレン グリコール化して細胞におけるPNAの寿命を延ばすことが可能である。(Nielsen,
P.E.ら(1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63)。

【００５４】 ここで用いる用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられる。GRIRをコ
ードする核酸、もしくはその断片、またGRIR自体を含む疑いのある生物学的サン
プルは、体液や、細胞から分離された染色体、細胞小器官、又は細胞膜からの抽
出物や、細胞や、（溶液中の、或いは固体支持体に結合した）ゲノムのDNA、RNA
、またはcDNAや、組織や、組織プリントその他を含み得る。

【００５５】 ここで用いる用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、抗体及びタ
ンパク質またはペプチド、抗体及びアンタゴニストの相互作用を指す。この相互
作用は、結合する分子が認識するタンパク質の特定の構造（即ち、抗原決定基、
つまりエピトープ）の存在に左右されることを意味している。例えば、抗体がエ
ピトープ「A」に対して特異的である場合、標識された自由な「A」及びその抗体
を含む反応において、エピトープA（或いは遊離し、標識されないA）を含むポリ
ヌクレオチドが存在することにより、抗体に結合した標識されたAの量が低下す る。

【００５６】 ここで用いる用語「厳密な条件」は、ポリヌクレオチド配列と要求されたポリ
ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションが可能な条件を指す。適切な厳密
な条件は、例えば、プレハイブリダイゼーションにおける塩類またはホルムアミ
ドの濃度、ハイブリダイゼーション溶液、ハイブリダイゼーション温度によって
定義することが可能であり、これらの条件は当技術分野で周知である。特に、塩
類の濃度を低下させることや、ホルムアミドの濃度を上昇させることや、ハイブ
リダイゼーション温度を上昇させることによって厳密性が増す。

【００５７】 例えば、高い厳密性の条件の下でのハイブリダイゼーションは、約37℃から42
℃の約50%のホルムアミド中において起こり得る。またハイブリダイゼーション は、約30℃から35℃の約35%〜25%のホルムアミド中の緩やかな厳密性の条件下で
起こり得る。特に、ハイブリダイゼーションは、42℃の50%のホルムアミド中、5
X SSPE、0.3%SDS、および200μg/mlの切断され変性したサケの精液DNA、という 高い厳密性の条件下で起こり得る。また、ハイブリダイゼーションは、35%のホ ルムアミド中の35℃に低下させた温度において、前述のような緩やかな厳密性の
条件下で起こり得る。特定のレベルの厳密性に対応する温度範囲は、対象物の核
酸のピリミジンに対するプリンの割合を算出して、温度を調節することによって
さらに狭めることができる。上述の温度範囲および条件の変更例は、当業者には
周知である。

【００５８】 ここで用いる用語「実質的に精製」は、天然の環境から取り除かれ、天然には
それが結合して存在する他の構成成分から単離又は分離されて、その構成要素が
60%以上、好ましくは75%以上、最も好ましくは90%以上除去された核酸配列又は アミノ酸配列である。

【００５９】 ここで用いる「置換」は、それぞれ1個または2個以上のヌクレオチド或いはア
ミノ酸を、別のヌクレオチド或いはアミノ酸に各々置換することを指す。

【００６０】 ここで用いる「形質転換」の定義は、外来性のDNAが入り込みレシピエント細 胞を変化させるプロセスを意味する。形質転換は、当業者に周知の種々の方法を
用いた天然または人工の条件の下で起こり得て、また外来性の核酸配列を原核細
胞または真核細胞の宿主細胞に導入するための任意の既知の方法に基づいている
。形質転換の方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択され、以下
のものに限定されないが、ウイルス感染、熱ショック、電気穿孔法（エレクトロ
ポレーション）、リポフェクション、及び微粒子銃を用いる方法が含まれる。こ
のような「形質転換された」細胞には、挿入されたDNAを自律的に複製するプラ スミドとして、または宿主の染色体の一部として複製が可能な安定的に形質転換
された細胞が含まれ、またそれは限られた時間で導入されたDNAやRNAを一過性に
発現する細胞を指す。

【００６１】 ここで用いるGRIRの「変異体」は、１又は２以上のアミノ酸が変異したアミノ
酸配列である。この変異体は「保存的」変化を含むものであり得、この場合、例
えばロイシンをイソロイシンで置き換えるように、置換されるアミノ酸が類似な
構造的及び化学的特性を有する。稀にではあるが、例えばグリシンがトリプトフ
ァンで置換されるように、変異体が「非保存的」に変化する場合もある。類似し
た小さい変化には、アミノ酸の欠失または挿入、或いはその両方が含まれる。例
えばDNASTARソフトウエアのような周知のコンピュータプログラムを用いて、何 れのアミノ酸残基が生物学的或いは免疫学的活性を損なわずに置換、挿入、又は
除去可能であるということを決定するガイダンスを提供することができる。

【００６２】 発明 本発明は、免疫応答に関係する新規なGタンパク質共役型受容体（GRIR）、GRI
Rをコードするポリヌクレオチドの発見、並びに細胞増殖および細胞シグナル伝 達に関する疾病の診断、予防、又は治療のためのこれらの物質の使用法に基づく
ものである。

【００６３】 本発明のGRIR-1をコードする核酸は、アミノ酸配列アライメントのためのコン
ピュータ検索を用い、前立腺cDNAライブラリー(SYNORAB01)からのインサイト社 クローン364702に於いて初めて同定された。コンセンサス配列、SEQ ID NO:2は 、インサイト社クローン605666 (BRSTTUT01)および364702 (PROSNOT01)から導出
された。

【００６４】 図１Ａから図１Ｅに示すように、本発明の一実施例ではSEQ ID NO:1のアミノ 酸配列を含むポリペプチドを包含する。GRIR-1は326のアミノ酸の長さであり、N ₂₈ 及びN₈₈に２つの潜在的Nグルコシル化部位と、S₉₀、S₁₇₇、T₂₄₃、S₂₈₅、S₃₀₉ に５つの潜在的リン酸化部位を有する。図２Ａ及び図２Ｂに示すように、GRIR-1
は、イヌ、ラット、ヒトの嗅覚の受容体（g1314667, SEQ ID NO:3; g205814, SE
Q ID NO:4および g32086, SEQ ID NO:5の各々）と化学的及び構造的相同性を有 する。詳細にはGRIR-1は、イヌORと45%、ラットORと44%、ヒトORと42%の同一性 を有する。更に、疎水性の膜貫通ドメインは、これらの分子の間でかなり良好に
保存される。TM1は概ねV₄₉からS₇₃まで、TM2は概ねP₈₁からP₁₀₂まで、TM3は概ね
M₁₂₄からC₁₄₁まで、TM4は概ねF₁₆₃からL₁₈₂まで、TM5は概ねI₁₂₂からV₂₄₃まで、
TM6は概ねP₂₆₁からL₂₇₇まで、TM7は概ねA₂₈₉からL₃₀₉までそれぞれ伸長する。C_{1 20} 、C₁₄₇、C₁₆₄、C₂₀₃におけるシステインは、全ての４つの受容体に跨り保存さ
れる。概ねヌクレオチド712からヌクレオチド783までの細胞外の配位子結合ドメ
インは、SEQ ID NO:2の最も有用な断片である。ノーザン分析（図５Ａ）は、胃 腸、雄性の生殖、及び筋肉のcDNAライブラリーにおけるこの配列の発現を示す。
これらのライブラリーのおよそ48%が腫瘍性の疾患に関係し、およそ38%が免疫応
答に関係する。

【００６５】 一実施例において、本発明は図３Ａから図３Ｄに示すようなSEQ ID NO:3のア ミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。GRIR-2は358のアミノ酸の長さであ り、N₄、N₂₅、N₃₃、N₇₂、N₂₅₁に５つの潜在的Nグルコシル化部位と、Y₁₅₃、S₂₃₆ 、S₂₄₄、S₂₄₅、S₂₅₃、S₂₇₈、S₃₃₇、S₃₄₃、Y₃₅₂に９つの潜在的リン酸化部位を有
する。図４Ａ及び図４Ｂに示すように、GRIR-2は、ヒトKIAA0001（g285995, SEQ
ID NO:8）およびVTR 15-20（g49443, SEQ ID NO:9）GPCRと化学的及び構造的相
同性を有する。詳細にはGRIR-2は、KIAA0001と42%、VTR 15-20と24%の同一性を 有する。更に、疎水性の膜貫通ドメインは、これらの分子の間でかなり良好に保
存される。TM1は概ねV₄₄からW₆₅まで、TM2は概ねF₇₈からV₉₉まで、TM3は概ねT_{12 7} からV₁₄₃まで、TM4は概ねT₁₅₈からL₁₇₄まで、TM5は概ねV₂₀₇からC₂₅₅まで、TM6
は概ねI₂₅₄からS₂₇₅まで、TM7は概ねE₂₉₇からC₃₁₈までそれぞれ伸長する。C₁₁₄ におけるシステインは、全ての３つの受容体に跨り保存される。SEQ ID NO:4の 最も有用な断片には、概ねヌクレオチド319からヌクレオチド444までの固有の細
胞外の配位子結合ドメインが包含される。ノーザン分析（図５Ｂ）は、生殖のcD
NAライブラリーにおけるこの配列の発現を示す。これらのライブラリーのおよそ
83%が腫瘍性の障害に関係する。

【００６６】 また本発明はGRIRの変異体を含む。GRIR変異体は、GRIRの機能的または構造的
特徴の少なくとも１つを含むGRIRアミノ酸配列に対して、好ましくは少なくとも
80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%以上のアミ ノ酸配列の同一性を有する。

【００６７】 また本発明は、GRIR-1およびGRIR-2をコードするポリヌクレオチドを含む。特
定の実施例に於いては、本発明はGRIRをコードするSEQ ID NO:2およびSEQ ID NO
:4の配列を含むポリヌクレオチドを含む。

【００６８】 また本発明は、GRIRをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。特
に、ポリヌクレオチド配列のそのような変異配列は、GRIRをコードするポリヌク
レオチド配列に対して、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも9
0%、最も好ましくは少なくとも95%以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有す る。本発明の特定の局面においては、SEQ ID NO:2に対して、好ましくは少なく とも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%以上の ポリヌクレオチド配列の同一性を有するSEQ ID NO:2の変異配列を包含する。ま た、本発明の特定の局面においては、SEQ ID NO:4に対して、好ましくは少なく とも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%以上の ポリヌクレオチド配列の同一性を有するSEQ ID NO:4の変異配列を包含する。上 述の何れのポリヌクレオチド変異配列も、GRIRの機能的または構造的特徴の少な
くとも１つを含むアミノ酸配列をコードすることが可能である。

【００６９】 遺伝暗号のデジェネラシーの結果、既知のの遺伝子及び自然発生の遺伝子のポ
リヌクレオチド配列に対する最小のホモロジーを有する、GRIRをコードするポリ
ヌクレオチド配列の幾つかが作り出されることが、当業者には理解されるであろ
う。従って、本発明は、可能なコドン選択に基づく組合せの選択により作り出さ
れ得るポリヌクレオチド配列の可能な全ての変異を予期する。これらの組合せは
標準の遺伝暗号に従い自然発生のGRIRのヌクレオチド配列に対し適用され、また
全てのそのような変異はここに明確に開示されると考えられたい。

【００７０】 GRIR及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は、適切に選択された厳密
性の条件下に於いて、好ましくは自然発生のGRIRのヌクレオチド配列に対しハイ
ブリダイズ可能であり、それはGRIR又は実質的に異なるコドンの用法を有するそ
の誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すのに有利である。コドンは、
真核生物又は原核生物のホストに於いて特定のコドンがホストにより利用される
頻度に従い、ペプチドの発現が起こる割合を高めるように選択され得る。コード
されたアミノ酸配列を変質させることなしにGRIR及びその誘導体をコードするヌ
クレオチド配列を実質的に変更させるための別の理由は、自然発生の配列から作
り出された転写物よりも長い半減期のようなより望ましい特性を有するRNA転写 物を作り出すためである。

【００７１】 また本発明は、GRIR及びその誘導体をコードするDNA配列およびGRIR誘導体、 またはその断片を専ら合成化学によって作り出すことを含む。作り出した後に、
合成の配列は、当業者によって周知の試薬を用いて任意の多くの利用可能な発現
ベクター及び細胞系に挿入されうる。更に、合成化学を利用し、GRIR又はそれら
の任意のフラグメントをコードする配列に突然変異を導入しうる。

【００７２】 また本発明は、Wahl, G.M.及びS.L. Berger（1987; Methods Enzymol. 152:39
9-407）及びKimmel, A.R.（1987; Methods Enzymol. 152:507-511）によって教 示された種々の厳密な条件の下で、要求されたヌクレオチド配列、特にSEQ ID N
O:2、若しくはSEQ ID NO:2の断片、並びにSEQ ID NO:4、若しくはSEQ ID NO:4の
断片に示されたものに対しハイブリダイズが可能なポリヌクレオチド配列を含む
。

【００７３】 DNA塩基配列決定方法は周知のものであり、一般に先行技術に於いても利用さ れ、本発明の任意の実施例においても利用されうる。その方法は、DNAポリメラ ーゼＩのクレノウフラグメント、シークエナーゼ^ョ（US Biochemical Corp, Clev eland, OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、耐熱性のT7ポリメラーゼ（Am
ersham, Chicago, IL）、或いはGibco/BRL（Gaithersburg, MD）によって市販さ
れるELONGASE増幅システムに於いて発見されたようなプルーフリーディングエキ
ソヌクレアーゼ及びポリメラーゼの組合せのような酵素を使用する。そのプロセ
スは、Hamilton Micro Lab 2200（Hamilton, Reno, NV）、Peltier Thermal Cyc
ler（PTC200; MJ Research, Watertown, MA）及びABI触媒及び373及び377 DNA配
列決定装置（Perkin Elmer）のような装置によって自動化されることが好ましい
。

【００７４】 GRIRをコードする核酸配列は、部分的なヌクレオチド配列を使用し、またプロ
モータ及び調節性要素のような上流の配列を検出するための先行技術に於いて周
知の種々の方法を使用して伸長しうる。例えば、用いられた方法の１つである「
制限部位」PCR法は、万能なプライマーを使用し、既知の位置に隣接する未知の 配列を検索する（Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322）。特に ゲノムDNAは、リンカーシークエンスに対するプライマー及び既知の領域に対し 特異的なプライマーの存在下に於いてまず増幅される。そこで増幅された配列は
、同様なリンカープライマ及び最初のものに対し別の特異的な性質を有するプラ
イマの存在下に於いて、２ラウンドのPCRを受ける。PCRの各ラウンドの生成物は
、適切なRNAポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用い配列決定される 。

【００７５】 また逆PCR法（inverse PCR）を用いて、既知領域に基づく多岐のプライマーを
用いた配列の増幅、または伸長を行ないうる（Triglia, T.ら（1988）Nucleic A
cids Res 16:8186）。プライマーは、工業用として入手可能なOLIGO 4.06プライ
マー分析ソフトウエア（National Biosciences社, Plymouth MN）や他の適切な プログラムを用いて、長さが22〜30ヌクレオチドで、50%以上のGC含量を有し、 約68〜72℃の温度で標的配列をアニーリングするように設計する。その方法によ
り、いくつかの制限酵素を用いて遺伝子の既知領域における適当な断片を作り出
す。そこで、この断片を分子内連結反応により環状にし、PCR用の鋳型として使 用する。

【００７６】 使用できる別の方法には捕獲PCR法（capture PCR）があり、この方法には、ヒ
ト及び酵母菌人工染色体DNA内の既知の配列に隣接するDNA断片のPCR増幅が含ま れる（Lagerstrom, M.ら（1991）PCR Methods Applic 1:111-119）。またこの方
法では、PCRの前に、複数の制限酵素による消化及びライゲーションを用いて、D
NA分子の未知の断片に操作された二本鎖配列を配置しうる。未知の配列を引き出
すために用いることができる別の方法として、Parker, J.D.らの方法（1991; Nu
cleic Acids Res. 19:3055-3060）がある。更に、PCR、ネスト化（nested）プラ
イマー、PromoterFinder^TMライブラリーを用いて、ゲノムDNA歩行（walk）を行 うことができる（Clontech, Palo Alto CA）。このプロセスは、ライブラリーの
スクリーニングが不要で、イントロン／エクソン接合部の発見に有用である。

【００７７】 完全長cDNAをスクリーニングするとき、大きなcDNAを含むようにサイズ選択さ
れたライブラリーを用いることが好ましい。またランダムに準備刺激された（ra
ndom primed）ライブラリーは、遺伝子の5’領域を含む配列をより多く含むとい
う点で好適である。ランダムに準備刺激されたライブラリーは、オリゴd(T)ライ
ブラリーで完全長cDNAが得られない場合には特に好適である。またゲノムライブ
ラリーは、5’非転写領域における配列の伸長のために役立ちうる。

【００７８】 配列決定やPCRの産物のヌクレオチド配列のサイズ分析、或いは確認のために 、市販のキャピラリー電気泳動法システムを用いることができる。特に、キャピ
ラリーシークエンシングでは、電気泳動分離のための流動性ポリマー、レーザー
で活性化される４つの異なる蛍光色素（各ヌクレオチドに対して１つ）、放射さ
れた波長の検出を行うCCDカメラを使用する。出力／光強度は適切なソフトウエ ア（例えば、Perkin Elmer製のGenotyper^TM及びSequence Navigator^TM）を用い て電気信号に変換され、サンプルのローディングからコンピュータ解析及び電子
データ表示までの全過程がコンピュータ制御され得る。キャピラリー電気泳動法
は、特定のサンプル内に限られた量だけ存在するDNAの小片の配列決定に特に好 適である。

【００７９】 本発明の別の実施例では、GRIRをコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を組換えDNA分子に用いて、GRIR及びその断片、或いはその機能的等価物の 適切な宿主細胞内における発現を指向することができる。遺伝暗号の固有の縮退
によって、実質的に同一または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のDN
A配列が作り出され、これらの配列はGRIRのクローニングや発現のために用いる ことができる。

【００８０】 当業者に理解されるように、非自然発生コドンを有するGRIRコーディング（en
coding）ヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。例えば、特定の原
核生物或いは真核生物の宿主において選好されるコドンを選択することにより、
タンパク質の発現率を増大させたり、或いは自然発生配列から生成された転写物
よりも長い半減期であるような望ましい特性を有するRNA転写物を生成すること が可能である。

【００８１】 限定はしないが遺伝子産物のクローニング、プロセシング及び／又は発現を改
変すること等の種々の理由により、GRIRをコードする配列を改変するために、本
発明のヌクレオチド配列を当業者に周知の方法を用いて操作可能である。ランダ
ムな断片化によるDNA組換えや、遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのPCR再
構成を用いて、ヌクレオチド配列を操作できる。例えば、特異的部位突然変異誘
発を用いることにより、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、
コドン選好の変化、スプライシングバリアントの生成、突然変異の誘発等をもた
らすことができる。

【００８２】 本発明の別の実施例では、GRIRをコードする自然な、改変された、或いは組換
え型の核酸配列を、融合タンパク質をコードするために、非相同的な配列に結合
させうる。例えば、GRIR活性のインヒビターに対するペプチドライブラリーをス
クリーニングするために、市販の抗体により認識される異なるペプチドを発現す
るキメラGRIRタンパク質をコードすることが有用である。また、融合タンパク質
はGRIRコーディング配列と非相同的なタンパク質配列との間の位置に切断部位を
有するように操作可能で、これによってGRIRが切断され、非相同的な部分から分
けて精製することが可能となる。

【００８３】 本発明の別の実施例では、当業者によく知られた化学的手法（Caruthers. M.H
.ら（1980）Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn, T.ら（1980）Nucl.
Acids Res. Symp. Ser.225-232参照）を用いて、GRIRをコードする配列の全体、
或いはその一部を合成することができる。或いは、化学的手法を用いてタンパク
質自体を作り出し、GRIRのアミノ酸配列又はその一部を合成することができる。
例えば、種々の固相技術（Roberge, J.Y.ら(1995) Science 269:202-204）を用 いてペプチド合成を行うことができ、ABI 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin E
lmer）を用いて合成の自動化を達成することができる。

【００８４】 この新たに合成されたペプチドは、分離用の高速液体クロマトグラフィにより
実質的に精製することができる（Chiez, R.M.およびRegnier. F.Z. (1990) Meth
ods Enzymol. 182:392-421.）。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸解析或 いはシークエンシングにより確認することができる（the Edman degradation pr
ocedure described in Creighton, T. (1983) Proteins. Structures avd Molec ular Properties , WH Freeman and Co., New York, NY.）。さらに、GRIRのアミ
ノ酸配列或いはその任意の部分を、直接の合成において改変することにより、及
び／又は他のタンパク質或いはその任意の部分に由来する配列と結合させること
により、変異体ポリペプチドを作り出すことができる。

【００８５】 生物学的に活性なGRIRを発現させるために、GRIRまたはその誘導体をコードす
るヌクレオチド配列或いはその機能的等価物を、適切な発現ベクター（即ち、挿
入されたコーディング配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むベクター）に挿入
する。

【００８６】 GRIRをコードする配列および適切な転写や翻訳の調節領域を含む発現ベクター
を作成するために、当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には、in v itro 組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝的組換え技術が含まれる。この
ような技術は、Sambrook, J.らの文献（1989；Molecular Cloning, A Laborator y Manual , Cold Spring Harbor Press, Plainview,NY）及びAusubel, F.M.らの 文献（1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biol ogy , ch. 9. 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, NY）に開示されてい る。

【００８７】 GRIRをコードする配列を包含および発現するために、種々の発現ベクター／宿
主系が利用できる。これらには、以下に限定するものではないが、組換え型のバ
クテリオファージ、プラスミド或いはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した 細菌のような微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌や、ウイルス
発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス
発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイ
クウイルスTMV）或いは細菌の発現ベクター（例えば、TiまたはpBR322プラスミ ド）で形質転換した植物細胞系や、或いは動物細胞系が含まれる。本発明は、利
用される宿主細胞によって限定されるものではない。

【００８８】 これらの系の「調節領域」或いは「制御配列」は、転写及び翻訳を実行するた
めに宿主細胞のタンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域（即ち、エンハ
ンサー、プロモーター並びに5′及び3′非翻訳領域）である。このようなエレメ
ントの作用の強さ及び特異性は様々である。利用されるベクター及び宿主に応じ
て、構成的及び誘導的プロモーターを含む任意の数の適切な転写及び翻訳エレメ
ントを用いることができる。例えば、細菌系にクローニングする場合、Bluescri
ptョ ファージミド（Stratagene, LaJolla,CA）またはpSport1^TMプラスミド（Gib co BRL）等のハイブリッドlacZプロモーターのような誘導性のプロモーターを用
いることができる。昆虫細胞においてバキュロウイルスポリヘドリンプロモータ
ーを用いることができる。植物細胞のゲノムに由来するプロモーター或いはエン
ハンサ（例えば、熱ショック, RUBISCO及び貯蔵タンパク質遺伝子）、若しくは 植物ウイルスに由来するプロモーター或いはエンハンサ（例えば、ウイルス性プ
ロモータ或いはリーダー配列）をベクターにクローン化しうる。哺乳類細胞系に
おいては、哺乳類の遺伝子或いは哺乳類ウイルス由来のプロモーターが好ましい
。GRIRをコードする配列の多数の複製を含む株化細胞を作る必要がある場合、SV
40或いはEBVに基づくベクターを適切な選択マーカーと共に用いることができる 。

【００８９】 細菌系では、GRIRの用途に応じて多数の発現ベクターを選択することができる
。例えば、抗体の誘発のために大量のGRIRが必要な場合は、容易に精製される融
合タンパク質を高レベルで発現するベクターが用いられうる。そのようなベクタ
ーには、以下に限定はしないが、GRIRをコードする配列を、アミノ末端メチオニ
ン及び後続のβ-ガラクトシダーゼの7残基の配列を備えたフレーム内においてベ
クターに結合してハイブリッドタンパク質を生成できるBluescriptョ（Stratagen e）のような、多機能の大腸菌クローニング、発現ベクターや、pINベクター（Va
n Heeke, G.及びS.M. Schuster（1989）J. Biol. Chem. 264:5503-5509）等が含
まれる。またｐＧＥＸベクター（Promega、Madison WI）も、グルタチオンS-ト ランスファーゼ（GST）を伴う融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現す るため用いることができる。一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であ
り、グルタチオンアガロースビーズへ吸着させた後に遊離グルタチオンの存在下
で溶出させることによって、溶解した細胞から容易に精製できる。そのような系
において生成されるタンパク質は、ヘパリン、トロンビン或いはXA因子プロテア
ーゼ切断部位を含み、目的のクローン化ポリペプチドをGST部分から随意に放出 させることができるように設計できる。

【００９０】 酵母菌、Saccharomyces cerevisiaeでは、α因子、アルコールオキシダーゼ及
びＰＧＨのような構成的或いは誘導的プロモーターを含む多数のベクターを用い
ることができる。レビューには、Ausubelら（前出）及びGrantらの文献（1987；
Methods Enzymol.153:516-544）を参照されたい。

【００９１】 植物発現ベクターを用いる場合には、GRIRをコードする配列の発現は、任意の
多数のプロモータで行なわれうる。例えばＣａＭＶの３５Ｓ及び１９Ｓプロモー
ターのようなウイルスのプロモーターを単独で用いるか、或いはＴＭＶ（Takama
tsu,N.ら（1987）EMBO J.6:307-311）由来のオメガリーダー配列と併用すること
ができる。その代わりに、RUBISCOの小サブユニットまたは熱ショックプロモー ターのような植物プロモーターを用いてもよい（Coruzzi, G.ら（1984）EMBO J.
3:1671-1680）; Broglie, R. ら（1984）Science 224:838-843; 及びWinter, J.
ら（1991）Results Probl. Cell Differ. 17:85-105）。これらの作製物は、直
接のDNA形質転換または病原体が媒介したトランスフェクションにより植物細胞 内に導入できる。このような技術は一般に入手可能な多くの文献に記載されてい
る（例えば、Hobbs, S.又はMurry, L.E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology （1992）McGraw Hill New York,NY; pp.191-196を参照）。

【００９２】 昆虫系もGRIRの発現に用いることができる。例えば、そのような系の一つにお
いては、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusiaの幼生において外来遺 伝子を発現するためのベクターとして、Autographa californica多核角体病ウイ
ルス（AcNPV）を用いる。GRIRをコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子のよう なウイルスの非必須な領域にクローン化され、ポリヘドリンプロモーターの制御
下に置くことができる。GRIRコーディング配列の挿入の成功により、ポリヘドリ
ン遺伝子が不活性になり、コートタンパク質膜が欠如した組換え型のウイルスが
生成される。そこで、この組換え型のウイルスを用いて、例えばS.frugiperda細
胞またはTrichoplusiaの幼生へ感染させ、その中でGRIRを発現させうる（Engelh
ard, E.K.ら（1994）Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227）。

【００９３】 哺乳類の宿主細胞においては、多数のウイルス性の発現系を利用することがで
きる。発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合、GRIRをコードする
配列が、後発のプロモータ及び三連のリーダー配列からなるアデノウイルス転写
／翻訳複合体内に結合され得る。ウイルスのゲノムの非必須Ｅ１又はＥ３領域に
おける挿入により、感染した宿主細胞においてGRIRを発現可能な生存可能なウイ
ルスが得られる（Logan, J.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:
3655-3659）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサのような転写エン
ハンサを、哺乳類の宿主細胞内の発現を増大させるために用いることができる。

【００９４】 また、ヒト人工染色体（HAC）を用いることにより、プラスミドに含まれ、発 現され得るものに比べてより大きなDNAの断片を供給することもできる。治療を 目的とし、6kb〜10MbのHACを構築して従来のデリバリー方法（リポソーム、ポリ
カチオンのアミノポリマー、又はベシクル）を介して供給することができる。

【００９５】 また、特定の開始シグナルを用いて、GRIRをコードする配列のより効率的な翻
訳を果たしうる。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接する配列が含 まれる。GRIRをコードする配列及びその開始コドン及び上流配列が適切な発現ベ
クター内に挿入された場合、付加的な転写または翻訳の制御シグナルは不要であ
る。しかし、コーディング配列又はその一部のみが挿入される場合には、ATG開 始コドンを含む外来性の翻訳制御シグナルを与えなければならない。さらに、全
てのインサートの転写を確実にするために、開始コドンは正しい読み枠になけれ
ばならない。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、自然及び合成両方の種
々の起源に由来するものでありうる。文献（Scharf,D.ら（1994）Results Probl
. Cell Differ. 20:125-162）に記載されているように、用いられる特定の細胞 系に適切なエンハンサーを含めることにより、発現の効率を高め得る。

【００９６】 さらに宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節する能力や、発現したタン
パク質を望ましい形にプロセシングする能力によって選択されうる。このような
ポリペプチドの修飾には、以下に限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化
、グリコシル化、リン酸化、リピド化（lipidation）及びアシル化が含まれる。
またタンパク質の「プレプロ」形を切り離す翻訳後のプロセシングを用いて、正
しい挿入、折り畳み、及び／又は機能することを促進できる。翻訳後の活性のた
めの特定の細胞器械及び特徴的な機構を有している異種の宿主細胞（例えば、CH
O、HeLa、MDCK293、WI38）はAmerican Type Culture Collection（ATCC; Bethes
da, MD）より入手可能であり、これらを、外来タンパク質の正しい修飾やプロセ
シングを確実に行なうために選択してもよい。

【００９７】 長期間にわたる組換え型タンパク質の高収率の産生を確保するためには安定し
た発現が好ましい。例えば、ウイルス起源の複製及び／又は内在性発現エレメン
ト及び選択可能な標識遺伝子を同一のベクター上、或いは別々のベクター上に含
む発現ベクターを用いて、GRIRを安定的に発現可能な株化細胞を形質転換するこ
とができる。ベクターの導入の後、細胞を、選択培地に切り替える前に濃縮培地
内で１〜２日間増殖させる。選択マーカーの目的は、選択のための耐性を与える
ことであり、その存在によって導入された配列をうまく発現する細胞の増殖およ
び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞
の型に適した組織培養技術を用いて増殖することができる。

【００９８】 形質転換細胞系を回収するために任意の数の選択系を用いることができる。こ
れらには、以下に限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝
子（Wigler, M.ら（1977）Cell 11:223-32）及びアデニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ遺伝子（Lowy, I. ら（1980）Cell 22:817-23）が含まれ、それぞ れは、tk^-及びapr^-細胞において用いられる。また代謝拮抗剤、抗生剤或いは除 草剤への耐性を選択の基礎として用いることが可能で、例えばdhfrはメトトレキ
セートに対する耐性を与え（Wigler, M.ら(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.77:3567-7
0）、nptはアミノグリコシドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え（Colbe
rre-Garapin, F. ら（1981）J.Mol.Biol.150:1-14）、als或いはpatはクロルス ルフロン（chlorsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ （phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える（Murry, 前出）
。さらに選択可能な遺伝子として、例えば、細胞がトリプトファンの代わりにイ
ンドールを利用できるようにするtrpB、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノー
ル（histinol）を利用できるようにするhisDが文献に記載されている（Hartman,
S.C.及びR.C. Mulligan（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51）。最近 では、例えば、アントシアニン、β-グルクロニダーゼ及びその基質GUS、及びル
シフェラーゼ及びその基質ルシフェリンのようなマーカーと共に可視マーカーが
よく利用されるようになった。これらのマーカーは形質転換体を確認するだけで
なく、特定のベクター系による一過性の或いは安定的なタンパク質発現の量を定
量するために広く用いられる（Rhodes, C.A. ら（1995）Methods Mol. Biol. 55
:121-131）。

【００９９】 標識遺伝子発現の存在／非存在によって目的の遺伝子の存在も示唆されるが、
その遺伝子の存在及び発現は確認する必要がある。例えばGRIRをコードする配列
が標識遺伝子配列内に挿入された場合、GRIRをコードする配列を含む形質転換さ
れた細胞は標識遺伝子の機能の非存在により確認できる。或いは、単一のプロモ
ータの制御下において、標識遺伝子をGRIRをコードする配列と直列に配置するこ
とができる。選択または誘導に応じた標識遺伝子の発現は、通常直列に配置され
た配列の発現も同様に示す。

【０１００】 或いは、当業者に周知の様々な方法により、GRIRをコードする核酸配列を含み
GRIRを発現する宿主細胞を識別しうる。このような方法には、以下に限定しない
が、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーション及び、核酸及びタンパク質
配列を検出及び／又は定量するための技術に基づく膜、溶液或いはチップを含む
タンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイが含まれる。

【０１０１】 GRIRをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはプローブまたは断片を用い
て、DNA−DNA又はDNA−RNAハイブリダイゼーション又は増幅により、GRIRをコー
ドするポリヌクレオチド配列の存在を検出できる。GRIRをコードするDNA或いはR
NAを含む形質転換体を検出するために、核酸増幅に基づくアッセイは、GRIRをコ
ードする核酸配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマーの使用を含む。

【０１０２】 GRIRの発現を検出・測定するための種々のプロトコルは、このタンパク質に特
異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれかを用い、当業者に
周知のものである。そのような技術の例には、酵素結合免疫検定法（ELISA）、 ラジオイムノアッセイ（RIA）及び蛍光発色セルソーター（FACS）が含まれる。G
RIR上において２つの非干渉エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を 利用する二部位のモノクローナルベースのイムノアッセイ（two-site, monoclon
al-based immunoassay）が好ましいが、競合的結合実験も用いられうる。これら
アッセイおよび他のアッセイは、例えばHampton, R.らの文献（1990; Serologic al Methods, a Laboratory Manual , Section IV, APS Press, St Paul ,MN）及 びMaddox, D.E.らの文献（（1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216）に詳細に記載
されている。

【０１０３】 多様なラベル及び結合技術が当業者には周知であり、そして種々の核酸及びア
ミノ酸のアッセイにおいて用いることができる。GRIRをコードするポリヌクレオ
チドに関係する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプロ
ーブやPCRプローブを作り出すための手段には、オリゴ標識（oligolabeling）、
ニックトランスレーション法、末端標識（end-labeling）、或いは標識ヌクレオ
チドを用いるPCR増幅などが含まれる。或いは、GRIRをコードする配列、又はそ の任意の断片を、mRNAプローブの作成のためのベクターにクローン化しうる。そ
のようなベクターは当業者に周知で、また市販されており、これを用いて、例え
ばT7、T3或いはSP6のような適切なRNAポリメラーゼ及び標識化したヌクレオチド
を加えることによってin vitroでRNAプローブを合成することができる。これら の方法は、種々の市販のキット（Pharmacia & Upjohn（Kalamazoo, MI）；Prome
ga（Madison WI）；及びU.S. Biochemical Corp.,Cleveland, OH提供）を用いて
実施することができる。適切なレポーター分子、すなわち標識には、放射性核種
、酵素、蛍光剤、化学発光剤或いは色素生産剤や、基質、コファクター、インヒ
ビター、磁性粒子等が含まれる。

【０１０４】 細胞培養からのタンパク質の回収および発現に適した条件下において、GRIRを
コードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を培養することができる
。形質転換された細胞により作り出されるタンパク質は、用いられる配列及び／
またはベクターに応じて分泌される、つまり細胞内に含まれるようにすることが
できる。当業者に理解されるように、GRIRをコードするポリヌクレオチドを含む
発現ベクターは、原核生物か真核生物の細胞膜を通してGRIR分泌を指向するシグ
ナル配列を含むように設計することができる。また他の作成物を用いることによ
り、GRIRをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチド
ドメインをコードするヌクレオチド配列に結合することができる。そのような精
製を容易にするドメインには、以下に限定しないが、固定化金属上での精製を可
能にするヒスチジントリプトファンモジュールのような金属キレート化ペプチド
類、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、及び
ＦＬＡＧＳ延長／アフィニティー精製システムにおいて用いられるドメイン（Im
munex Corp., Seattle WA）が含まれる。精製ドメインとGRIRコーディング配列 の間におけるXA因子またはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego CA）に対
して特異的な配列のような切断可能なリンカー配列の包含により、精製が容易に
なる。このような発現ベクターの１つは、６個のヒスチジン残基、それに続くチ
オレドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位およびGRIRをコードする核酸を含む
融合タンパク質を発現する。ヒスチジン残基が固定化金属イオンアフィニティク
ロマトグラフィー（IMIAC；Porath, Jら (1992) Prot. Exp. Purif. 3:263-281 に記載）での精製を促進する一方、エンテロキナーゼ切断部位が融合タンパク質
からのGRIRの精製のための手段を与える。融合タンパク質を含むベクターについ
ての解説は、Kroll, D.J.ら（1993; DNA Cell Biol. 12:441-453）に記載されて
いる。

【０１０５】 組換え体の生成によってだけでなく、固相技術を用いた直接のペプチド合成に
よって、GRIRの断片を作り出すことができる（Merrifield J. (1963) J. Am. Ch
em. Soc. 85:2149-2154参照）。タンパク質合成は手作業または自動で行なうこ とができる。自動化された合成は、例えば、Applied Biosystem 431Aペプチドシ
ンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行うことができる。GRIRの種々の断片を個
別に合成して、次に結合させて完全長分子を作り出しすことも可能である。

【０１０６】 治療 GRIRと、イヌ、ラット及びヒトの嗅覚の受容体（g1314667,SEQ ID NO:5; g205
814, SEQ ID NO:6; g32086, SEQ ID NO:7の各々）との間に化学的および構造的 相同性が存在する。更にGRIR-1は、胃腸、雄性の生殖、及び筋肉のcDNAライブラ
リーにおけるこの配列の発現を示す。これらのライブラリーのおよそ48%が腫瘍 性の障害に関係し、およそ38%が免疫応答に関係する。従ってGRIR-1は、細胞増 殖及び細胞シグナル伝達に関連する役割を担っていると考えられる。

【０１０７】 GRIR-2と、ヒトKIAA0001（g285995, SEQ ID NO:8）およびラットVTR 15-20（g
49443, SEQ ID NO:9）GPCRとの間に化学的及び構造的相同性が存在する。更にGR
IR-2は、主として生殖組織で発現される。これらのライブラリーのおよそ80%が 腫瘍性の疾患に関係する。従ってGRIR-2は、細胞増殖及び細胞シグナル伝達に関
連する役割を担っていると考えられる。

【０１０８】 一実施例においては、腫瘍性疾患の治療および予防のためにGRIRのアンタゴニ
ストを被験者に投与することがある。そのような腫瘍性疾患には、以下に限定は
しないが、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫、並びに
特に、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎
臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾
臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれる。

【０１０９】 別の実施例では、限定はしないが上述の疾患を含む腫瘍性疾患の治療又は予防
のために、GRIRをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを
被験者に対して投与し得る。

【０１１０】 更に別の実施例では、免疫反応の治療および予防のためにGRIRのアンタゴニス
トを被験者に投与することがある。そのような免疫応答には、以下に限定はしな
いが、AIDS、アジソン病、成人呼吸困難症候群、アレルギー、アナフィラキシー
、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免
疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、滑液包炎、胆嚢炎、肝硬変、
接触皮膚炎、クローン病、嚢胞性線維症、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病
、肺気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛
風、グレーブス病、慢性肉芽腫症、橋本病（甲状腺炎）、過剰好酸球増加症、被
刺激性腸症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または
心臓周囲の炎症、骨関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、関節リウマチ
、強皮症、鎌形赤血球貧血、シェーグレーン症候群、全身性硬化症、地中海貧血
症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌・血液透析・体外循環の合併症、ウィ
ルス性・細菌性・真菌・寄生虫・原生動物・寄生虫様の感染症、心的外傷が含ま
れる。

【０１１１】 別の実施例においては、限定はしないが上述の疾患を含む免疫応答の治療又は
予防のために、GRIRをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクタ
ーを被験者に対して投与し得る。

【０１１２】 或る局面では、GRIRと特異的に結合する抗体をアンタゴニストとして直接用い
るか、或いはGRIRを発現する細胞や組織に薬剤をもたらす送達機構またはターゲ
ティングとして間接的に用いることができる。

【０１１３】 他の実施例においては、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、
アゴニスト、相補的配列またはベクターを、他の適切な治療薬と組合せて投与す
ることもできる。従来の製薬の原理に基づき、当業者は併用療法で使用するため
の適切な薬剤を選択することができるであろう。治療薬を組み合わせることによ
り、上述の種々の反応の治療又は予防に効果を与える相乗作用をしうる。この方
法を用いることにより、各薬剤の少ない投与量で治療効果を上げることができ、
従って副作用の可能性を低下させることができる。

【０１１４】 GRIRのアンタゴニストは、当業者に周知の方法を用いて製造することができる
。詳細には、精製されたGRIRを用いて、抗体を作り出し、或いはGRIRに特異的に
結合するものを同定するために、薬剤のライブラリーをスクリーニングすること
ができる。GRIRに対する抗体は、当業者によく知られた方法を用いて作り出すこ
とができる。このような抗体には、以下に限定されないが、ポリクローナル抗体
、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、及びFab発現
ライブラリーにより作られたフラグメントが含まれる。中和抗体（即ち、二量体
形成を阻害するもの）は治療の用途に特に好適である。

【０１１５】 抗体を作り出すために、GRIRか、免疫学的特性を有するその任意の断片或いは
そのオリゴペプチドを注射することによって、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、
ヒト等を含む種々の宿主を免疫化することができる。宿主の種に応じて、免疫学
的反応を増強するために種々のアジュバントを用いることができる。そのような
アジュバントには、以下に限定するものではないが、フロイントのアジュバント
、アルミニウムの水酸化物ようなミネラルゲルアジュバント、リゾレシチンのよ
うな界面活性剤アジュバント、プルロニックポリオール（pluronic polyols）ア
ジュバント、ポリアニオンアジュバント、ペプチドアジュバント、オイルエマル
ジョンアジュバント、KLHアジュバント及びジニトロフェノールアジュバントが 含まれる。ヒトで使用するアジュバントのなかで、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン
杆菌）及びコリネバクテリウム−パルヴム（Corynebacterium parvum）が特に好
ましい。

【０１１６】 GRIRに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド類、
またはその断片は、好ましくは少なくとも5個のアミノ酸、より好ましくは少な くとも10個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。またこれらのオリゴペプ
チド、ペプチド、または断片は、自然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一で
、小形の自然発生の分子の全アミノ酸配列を含んでいることが好ましい。GRIRア
ミノ酸の短い伸展部が、KLHのような別のタンパク質の伸展部と融合し、 キメラ分子に対する抗体が産生され得る。

【０１１７】 GRIRのモノクローナル抗体は、培養における連続的な株化細胞によって抗体分
子を産生させる任意の技術を用いて調製できる。このような技術には、以下に限
定しないが、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、及びEBV-ハ イブリドーマ技術（Kohler, G.ら(1975) Nature 256:495-497；Kozbor, D. ら(1
985) Immunol. Methods 81 :31-42；Cote, R.J. ら(1983) Proc. Natl. Acad. S
ci. 80:2026-2030；Cole, S.P. ら(1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120）が含ま
れる。

【０１１８】 さらに、適切な抗原特異性並びに生物活性を備えた分子を得るために、「キメ
ラ抗体」の産生、ヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングのため
に開発された技術が用いられる（Morrison,S.L.ら(1984)Proc. Natl. Acad. Sci
. 81:6851-6855;Neuberger, M.S. ら(1984)Nature 312:604-608;Takeda, S. ら(
1985)Nature 314:452-454）。或いは、当業者に周知の方法を用いて単鎖の抗体 の生成のための技術を適用して、ABBR-特異的単鎖抗体を作り出すことができる 。関連する特異性を有し、イディオタイプ組成が異なる抗体は、ランダムな組み
合わせの免疫グロブリンライブラリーからの鎖混合（chain shuffling）によっ て作り出すことができる（Burton D.R.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:1112
0-3）。

【０１１９】 また文献（Orlandi, R.ら(1989), Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837；Wi
nter, G.ら(1991) Nature 349:293-299）に開示されているように、抗体は、免 疫グロブリンライブラリーまたは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニ
ングすることにより、或いはリンパ球集団でのin vivo産生を誘導することによ り作り出すことができる。

【０１２０】 またGRIRに対する特異的な結合部位を含む抗体フラグメントも作り出すことが
できる。例えば、このような断片には、以下に限定はしないが、抗体分子のペプ
シン消化により生成することができるF(ab′)₂フラグメントや、F(ab′)₂フラグ
メントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるFabフラグ メントが含まれる。或いは、所望の特異性を備えたモノクローナルFabフラグメ ントを迅速かつ容易に識別可能なように、Fab発現ライブラリーを構成しうる（H
use, W.D.ら(1989)Science 254:1275-1281）。

【０１２１】 種々のイムノアッセイを、所望の特異性を有する抗体を識別するためのスクリ
ーニングに用いることができる。確立された特異性を有するモノクローナル抗体
またはポリクローナル抗体のいずれかを用いる、競合的結合アッセイ或いは免疫
放射線測定法の多数のプロトコルが、当技術分野で周知である。このようなイム
ノアッセイには、一般にGRIRとその特異的な抗体との間の複合体の形成の測定が
含まれる。2つの非干渉GRIRエピトープに対して反応するモノクローナル抗体を 用いる二部位のモノクローナル抗体ベースのイムノアッセイ（two sites monocl
onal based immunoassay）が好適であるが、競合的結合アッセイも用いられうる
（Maddox , 前出）。

【０１２２】 本発明の別の実施例では、GRIRをコードするポリヌクレオチド、またはその任
意の断片や相補配列を、治療を目的として用いることができる。或る局面では、
mRNAの転写を阻害することが望ましい状況において、GRIRをコードするポリヌク
レオチドに対する相補配列を用いることができる。詳細には、GRIRをコードする
ポリヌクレオチドに相補的な配列で細胞を形質転換することができる。従って、
GRIRの活性を変調する、或いは遺伝子の機能を調節するために、相補的な分子ま
たは断片を用いることができる。現在このような技術は周知であり、センス又は
アンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはより大きな断片が、GRIRをコードする
配列のコード領域や調節領域に従う様々な位置から設計可能である。

【０１２３】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクシニアウイルスに由来
する、或いは種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的の器官、
組織、即ち細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられ得る。当業者に
周知の方法を用いて、GRIRをコードする遺伝子のポリヌクレオチドに相補的な核
酸配列を発現するベクターを作り出すことができる。これらの技術は、例えばSa
mbrook（前出）及びAusubel（前出）に記載されている。

【０１２４】 GRIRをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を高レベルで発現する発現
ベクターで細胞または組織を形質転換させることによって、GRIRをコードする遺
伝子を作り出すことができる。このような作成物は、翻訳不能なセンス配列或い
はアンチセンス配列を細胞に導入するために用いることができる。DNAへ組み込 みが存在しない場合でも、このようなベクターは、それらが内在性のヌクレアー
ゼにより無能となるまで、RNA分子を転写し続けうる。一過性の発現は、非複製 ベクターでも1ヶ月以上、適切な複製エレメントがベクター系の一部である場合 にはさらに長い期間持続し得る。

【０１２５】 前述のように、GRIRをコードする遺伝子の制御、5′、即ち調節領域に対する 相補配列、つまりアンチセンス分子（DNA、RNAまたはPNA）を設計することによ って、遺伝子発現の修飾を行なうことができる。転写開始点、例えば開始部位か
ら+10〜-10の位置に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、「三重ら
せん体」塩基対形成方法論を用いて、阻害を達成することができる。ポリメラー
ゼ、転写制御因子、或いは調節分子の結合のために二重らせんが十分にほどける
能力を阻害するので、三重らせん対合は有用である。三重のDNAを用いた最近の 治療の進歩については、文献（Gee, J.E.ら(1994)In: Huber, B.E.及びB.I. Car
r, Molecular and Immunologic Approaches, pp.163-177, Futura Publishing C
o., Mt.Kisco,NY）に記載されている。転写物のリボソームへの結合を阻止する ことによりmRNAの転写を阻害するために、相補的配列、即ちアンチセンス分子を
設計得る。

【０１２６】 リボザイム、酵素RNA分子はRNAの特異的切断を触媒することができる。リボザ
イム作用機構では、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列の特異的ハイブリ ダイゼーションが行われ、その後ヌクレオチド鎖切断が行なわれる。例えば、操
作されたハンマーヘッド（hammerhead）モチーフリボザイム分子は、GRIRをコー
ドする配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効果的に触媒し得る。

【０１２７】 任意の潜在的なRNA標的物内の特異的なリボザイム切断部位は、最初、後続す る配列GUA、GUU並びにGUCを含むリボザイム切断部位に対する標的分子を走査す ることによって同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領
域に対応する15〜20個のリボヌクレオチドの間の短いRNA配列は、そのオリゴヌ クレオチドを動作不能（inoperable）とする２次の構造的特徴について評価する
ことができる。また候補の標的の適合性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用
い、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する接触性（
accessibility）の検査により評価することができる。

【０１２８】 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子を合成するのための
当技術分野で周知の方法により作り出すことができる。これらには、固相ホスホ
ラミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドの化学的合成のための技術が含
まれる。或いは、RNA分子は、GRIRをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo の転写により作り出すことができる。このようなDNA配列は、T7或いはSP6のよう
な適切なRNAポリメラーゼプロモーターを伴う多様なベクターに取り込むことが できる。或いは、構成的または誘導的に相補的なRNAを合成するこれらのcDNA作 成物は、株化細胞、細胞または組織内に導入することができる。

【０１２９】 細胞内の安定性を高め、また半減期を長くするために、RNA分子は修飾するこ とができる。可能な修飾としては、以下に限定しないが、その分子の５′末端及
び／又は3′末端でのフランキング配列の付加や、分子のバックボーン内におけ るホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネート或いは2′O-メチルを使用 を含む。この概念はPNA生成において固有のものであり、内在性エンドヌクレア ーゼにより容易に認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウ
リジンの、アセチル−、メチル−、チオ−、及び類似の修飾形態だけでなく、イ
ノシン、クエオシン（queosine）、及びワイブトシン（wybutosine）のような従
来よりあまり用いられない塩基を含めることにより、これら全ての分子にに拡張
可能である。

【０１３０】 細胞或いは組織内にベクターを導入するための多くの方法が利用可能で、同様
にin vivo、in vitro、及びex vivoでの使用にも適している。ex vivoでの治療 法のに対し、ベクターを患者から採取された幹細胞に導入し、自己移植して同じ
患者に戻すためにクローンとして増殖させることができる。トランスフェクショ
ンによるデリバリー、或いはリポソーム注入またはポリカチオンアミノポリマー
によるデリバリーは、当技術分野でよく知られた方法を用いて実施することがで
きる（Goldman, C.K.ら(1997) Nature Biotechnology 15:462-466）。

【０１３１】 前述の治療法は何れも、例えばイヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及
び最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む治療が必要な任意の対象に適用する
ことができる。

【０１３２】 本発明の更なる実施例では、前述の任意の治療効果のために、医薬成分を薬剤
上受け入れられる担体とともに投与する。このような医薬成分は、GRIR、GRIRの
抗体、GRIRの擬態（mimetics）、アゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビタ
ーからなるものでありうる。この成分は、単体或いは例えば安定化する配合よう
な1以上の他の薬剤とともに、任意の無菌の生体適合性の医薬用担体に投与され 、その担体には、以下に限定しないが、生理食塩水、バッファー食塩水、ブドウ
糖或いは水が含まれる。このような組成物は、単体或いは他の薬剤、ドラッグや
ホルモンと結合した形で患者に投与されうる。

【０１３３】 本発明で用いられる医薬品組成物の投与経路には、以下に限定されないが、経
口投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄内投与、くも膜下腔内投与、
脳室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経腸投与、局所的
投与、舌下投与、或いは直腸投与が含まれうる。

【０１３４】 活性成分に加えて、これらの医薬成分は、活性化合物を医薬上使用できる製剤
にするための処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含む、適切な医薬上認
められる担体を含みうる。更に、製剤或いは投与に関する技術の詳細は、Reming ton's Pharmaceutical Sciences （Maack Publishing Co., Easton,PA）の最新版
に記載されている。

【０１３５】 経口投与のための医薬成分は、当技術分野でよく知られる医薬上認められる担
体を用いて、経口投与に適当な投与量に配合される。このような担体により、医
薬成分を、患者に摂取させるための錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液体剤、
ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液等に処方できる。

【０１３６】 経口投与に用いるための製剤は、活性化合物と固形の賦形剤とを配合すること
によって得られるが、必要に応じて適切な補助剤を添加した後に、また（所望に
より、得られた混合物を粉砕した後に）顆粒の混合物を処理し、錠剤或いは糖衣
丸コア（dragee core）を作ることができる。必要ならば、適切な添加物が加え られる。適切な医薬品添加物には、ラクトース、スクロース、マンニトール或い
はソルビトールを含む砂糖のような糖質またはタンパク質賦形剤、トウモロコシ
、コムギ、コメ、ジャガイモ等からのデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシ
プロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのよ
うなセルロース、アラビアゴム或いはトラガカントゴムのようなゴム、並びにゼ
ラチン或いはコラーゲンのようなタンパク質が含まれる。必要ならば、クロスリ
ンクしたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン
酸、又はその塩のような、崩壊剤（disintegrating agents）或いは可溶化剤が 加えられる。

【０１３７】 糖衣丸コアは、濃縮糖液のような適切なコーティングと結合するが、溶液には
アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤(carbopol ge
l)、ポリエチレングリコール及び／又はチタンの二酸化物、ラッカー溶液及び適
切な有機溶剤或いは溶剤の混合物を含みうる。錠剤の識別のため、或いは活性化
合物の量（即ち投与量）を特徴づけるために、染料或いは色素を錠剤或いは糖衣
錠皮に加えることができる。

【０１３８】 経口投与できる製剤には、ゼラチンからなるプッシュフィット(push-fit)カプ
セル、ゼラチンからなる柔らかくシールされたカプセル及びグリセロール或いは
ソルビトールのようなコーティングが含まれる。プッシュフィットカプセルは、
ラクトース或いはデンプンのような賦形剤または結合剤、タルク或いはステアリ
ン酸マグネシウムのような潤滑剤、及び所望により安定剤と混合された活性成分
を含みうる。柔らかいカプセルにおいて、活性化合物は、安定剤とともに或いは
安定剤なしに、脂肪性の油、液体、または液状ポリエチレングリコールのような
適切な液体に溶解或いは懸濁される。

【０１３９】 非経口投与用の製剤は、水溶液中、好適にはハンク溶液(Hanks's solution)、
リンゲル溶液或いは生理緩衝食塩水のような生理学的に適合するバッファーの中
で配合することができる。水性の注射懸濁液は、カルボキシルメチルセルロース
ナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁液の粘性を高める物
質を含みうる。更に、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注入懸濁液として調製
される。適切な親油性の溶媒或いは媒介物は、胡麻油のような脂肪性の油や、オ
レイン酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのような合成脂肪酸エステル
を含む。また非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、送達のために用いられる。
所望により、懸濁液は化合物の溶解度を増加させて濃縮度の高い溶液の調製を可
能にする適切な安定剤または薬剤を含んでもよい。

【０１４０】 局所または経鼻投与用には、浸透する特定の障壁に対して適切な浸透剤が調合
に用いられる。このような浸透剤は、当技術分野において周知のものである。

【０１４１】 本発明の医薬組成物は周知の方法、例えば通常の混合処理、溶解処理、顆粒化
処理、糖衣形成処理、湿式粉砕処理(levigating)、乳化処理、カプセル化処理、
エントラップ処理(entrapping)或いは凍結乾燥処理により製造される。

【０１４２】 この医薬組成物は塩類として提供されることもあり、以下に限定しないが、塩
酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む多くの酸とともに
形成することができる。塩は水性或いはプロトニック溶剤において、対応する遊
離塩基形態であるよりも溶解性が高くなる傾向がある。別のケースにおいて、好
適な製剤としては、1mM〜50mMのヒスチジン、0.1%〜2%のショ糖、使用前に緩衝 剤と結合させたpH4.5〜5.5の範囲にある2%〜7%のマンニトールの何れか、或いは
全てを含む凍結乾燥粉末でもよい。

【０１４３】 医薬組成物は、調製された後に適切な容器内に入れられて、示された状態の治
療のためにラベル付けされうる。GRIRの投与の場合では、このようなラベルには
、投与量、投与頻度、投与方法が表示される。

【０１４４】 本発明において使用するのに適切な医薬組成物は、所望の目的を達成するため
に、活性成分を効果的な量だけ含む成分を含んでいる。有効量の決定は、当業者
の能力の範囲内で十分行うことができる。

【０１４５】 任意の化合物の場合、治療に有効な量は、例えば最初は腫瘍性細胞の細胞培養
のアッセイにおいて見積もられ、或いは一般にマウス、ウサギ、イヌ、ブタのよ
うな動物モデルにおいて見積もられる。そこで、このような情報を利用して、ヒ
トにおける有効な量や投与経路を決定することができる。

【０１４６】 治療的に有効な量とは、例えば、症状や状態を回復させるGRIRまたはその断片
、GRIRの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの活性成分の量
である。治療的な効力および毒性は、細胞培養或いは実験動物における標準的な
製薬方法により、例えばED50(母集団の50%における治療的な有効投与量）または
LD50(母集団の50%の致死投与量)統計量を計算することによって決定することが できる。毒性と治療的な有効性との間の用量比が治療指数であり、LD50/ED50の 比として表すことができる。医薬組成物は大きな治療指数を示すことが好ましい
。細胞培養のアッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトの使用のための
投与量の範囲をまとめるのに用いることができる。そのような成分の用量は、毒
性少ないか或いは全く毒性がなく、ED50を含む循環する濃度の範囲内にあること
が好ましい。使用する剤形、患者の感受性並びに投与経路に応じて、投与量はこ
の範囲内で変化する。

【０１４７】 正確な用量は、治療が必要な被験者に関連する要因の観点から医師が決定する
。投与及び投薬量は、十分なレベルの活性成分を与える、即ち所定の効果を維持
するために調節される。考慮すべき要因としては、疾病状態の重症度、被験者の
通常の健康、年齢、体重、性別、食餌、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反
応感受性、および治療への耐性／反応が含まれる。長時間作用性の医薬組成物は
３〜４日毎に、１週間毎に、或いは半減期及び特定の製剤のクリアランス速度に
応じて２週間に１度投与してもよい。

【０１４８】 通常の投与量は0.1〜100,000μgの範囲であり、最大約1gの総投与量まで、投 与経路に応じて変化する。特定の投与量或いは送達の方法のガイダンスは文献に
おいて提供され、通常当技術分野の医師に利用可能である。当業者は、ヌクレオ
チドに対しては、タンパク質やインヒビター用の製剤とは異なる製剤を採用する
ことができる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の
細胞、状態、位置等に対して特異的でありうる。

【０１４９】 診断 別の実施例においては、GRIRに特異的に結合する抗体を、GRIRの発現によって
特徴づけられる状態や疾病の診断や、GRIR又はGRIRのアゴニスト、アンタゴニス
ト、インヒビターで治療を受けている患者のモニタリングのためのアッセイに用
いることができる。診断目的に対し有用な抗体は、前述の治療のためのものと同
様の方法で作製することができる。GRIRの診断のアッセイには、ヒトの体液、細
胞或いは組織の抽出物においてGRIRを検出するために抗体および標識を用いる方
法が含まれる。抗体は修飾しても、修飾なしでも用いることができ、また共有結
合或いは非共有結合かのいずれかによりリポーター分子と結合させて標識するこ
とができる。当業者に周知の多様なリポーター分子が用いられ、その幾つかにつ
いては前述の通りである。

【０１５０】 ELISA、RIA及びFACSを含む、GRIRを測定するための種々のプロトコルが当技術 分野では周知であり、またこれによりGRIR発現の変化や異常性のレベルを診断す
るための基礎が得られる。GRIRの発現の正常値、即ち標準値は、複合体形成に適
した条件下で、哺乳類、好ましくはヒトの正常な被験者から得られる体液或いは
細胞抽出物とGRIRに対する抗体を結合させることによって確立できる。標準の複
合体形成量は、種々の方法、好ましくは測光の手段を用いて定量化できる。被験
者の生検組織からの調節及び疾病サンプルにおいて発現されたGRIRの量を、標準
値と比較する。標準値と被験者の値との偏差から、疾病診断のためのパラメータ
が確立される。

【０１５１】 本発明の別の実施例において、GRIRをコードするポリヌクレオチドを、診断目
的で用いることができる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチ
ド配列、相補的RNA及びDNA分子、及びPNAが含まれる。このポリヌクレオチドは 、GRIRの発現が疾病と関連するような生検組織における遺伝子発現を検出および
定量するために用いられる。診断アッセイは、GRIRが存在、非存在、過剰発現の
いずれの状態かを識別したり、治療の処置の際にGRIRレベルの調節をモニタリン
グするために用いることができる。

【０１５２】 ある局面では、GRIRまたは近い関連の分子をコードする、ゲノム配列を含むポ
リヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブとのハイブリダイゼーションを用 いて、GRIRをコードする核酸配列を同定することができる。そのプローブの特異
性、つまりそのプローブが非常に高度に特異的な領域（例えば、5′調節領域） に由来するか、或いはより特異性の度合いの低い領域（例えば、特に3′コーデ ィング領域）の何れに由来するかによって、またハイブリダイゼーション或いは
増幅（最大の、高い、中程度の或いは低い）の厳密性によって、そのプローブが
GRIRをコードする自然発生の配列のみを同定するか、或いはアレルや関連する配
列も同定するかということが決定される。

【０１５３】 プローブは関連する配列を検出するためにも用いることができ、また好ましく
はGRIRをコードする任意の配列からのヌクレオチドを少なくとも５０％含むべき
である。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、DNAやRNAか、またSEQ ID
NO:2、SEQ ID NO:4のヌクレオチド配列に由来するものか、或いは自然発生GRIR
のイントロン、エンハンサーエレメント、及びプロモータを含むゲノムの配列に
由来するものでもよい。

【０１５４】 GRIRをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブを作 製するための手段には、mRNAプローブを作り出すために、GRIR又はGRIR誘導体を
コードするポリヌクレオチド配列をベクターにクローンニングする方法がある。
このようなベクターは当業者に周知であり、また市販されており、適切なRNAポ リメラーゼや適切な標識されたヌクレオチドを付加することにより、in vitroで
RNAプローブを合成するために用いることができる。ハイブリダイゼーションプ ローブは種々のリポータグループにより標識され、例えば、この標識には、³²P や³⁵Sのような放射性核種によるものや、アビジン／ビオチン結合系を介してプ ローブに結合するアルカリホスファターゼのような酵素による標識等が含まれる
。

【０１５５】 GRIRをコードするポリヌクレオチド配列を、GRIRの発現に関係する症状または
疾患の診断のために用いることができる。腫瘍性疾患の例には、以下に限定はし
ないが、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫、並びに特
に、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓
、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓
、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれる。また免疫応答の例には、以下に限
定はしないが、AIDS、アジソン病、成人呼吸困難症候群、アレルギー、アナフィ
ラキシー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症
、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、滑液包炎、胆嚢炎、
肝硬変、接触皮膚炎、クローン病、嚢胞性線維症、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎
、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症
候群、痛風、グレーブス病、慢性肉芽腫症、橋本病（甲状腺炎）、過剰好酸球増
加症、被刺激性腸症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、心
筋または心臓周囲の炎症、骨関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、関節
リウマチ、強皮症、鎌形赤血球貧血、シェーグレーン症候群、全身性硬化症、地
中海貧血症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌・血液透析・体外循環の合併
症、ウィルス性・細菌性・真菌・寄生虫・原生動物・寄生虫様の感染症、心的外
傷が含まれる。GRIRをコードするポリヌクレオチド配列を、患者の生検組織や体
液を利用するサザンブロットまたはノーザン分析、ドットブロット法或いは他の
膜ベース(membrane-based)技術や、PCR技術や、ディップスティック試験法(dips
tick)、ピン、ELISAアッセイまたはマイクロアレイにおいて用いて、GRIR発現の
変化を検出することができる。このような定性的または定量的試験法は当技術分
野では周知である。

【０１５６】 特定の局面では、特に上述のような関連する疾患の存在を検出するアッセイに
おいて、GRIRをコードするヌクレオチド配列は有用であり得る。GRIRをコードす
るヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識され、またハイブリダイゼーション
複合体の形成に適した条件下で、患者からの体液や組織サンプルに加えることが
できる。適当なインキュベーション期間の後、そのサンプルは洗浄され、シグナ
ルが定量されて標準値と比較される。患者のサンプルにおけるシグナルの量が、
比較できる対照サンプルから有意に変化している場合、そのヌクレオチド配列は
サンプルのヌクレオチド配列とハイブリダイズしており、またサンプルのなかの
GRIRをコードするヌクレオチド配列のレベルの変化するということは、関連する
疾患の存在を示している。また、このようなアッセイを用いて、動物実験、臨床
試験、または個々の患者の治療のモニタリングにおける特定の治療学的な処置法
の有効性を評価することもできる。

【０１５７】 GRIRの発現に関連する疾病の診断のための基礎を提供するために、正常な、即
ち標準の発現のプロフィールを確立する。これは、ハイブリダイゼーション或い
は増幅に適した条件下で、動物またはヒト何れかの正常な被験者から採取された
体液或いは細胞抽出物を、GRIRをコードする配列又はその断片と結合させること
により達成される。標準のハイブリダイゼーションは、正常な被験者から得られ
る値と、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験から
得られる値とを比較することにより定量しうる。正常なサンプルから得られた標
準値は、疾病の徴候がある患者のサンプルから得られる値と比較することができ
る。標準値からの偏差を用いて疾病の存在を証明する。

【０１５８】 一旦疾患の存在が確認され、治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼ
ーションアッセイが定期的に繰り返され、患者の発現のレベルが正常な患者にお
いて観察されるレベルに近づき始めたか否かを評価することができる。連続的な
アッセイから得られる結果を用いて、数日から数ヶ月にわたる治療の効果を示す
ことができる。

【０１５９】 癌に関しては、個体からの生検組織における比較的多量の転写物の存在が、疾
病の発生の素因を示し、つまり実際の臨床的症状が現れる前に疾病を検出するた
めの手段となり得る。このタイプのより決定的な診断により、健康の専門家が予
防的処置を講じたり、より早期に積極的な治療を行なうことが可能となり、故に
癌の発生や更なる進行を予防することができる。

【０１６０】 GRIRをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの付加的な診断のた
めの使用法には、PCR法の利用が含まれる。これらのオリゴマーは化学的に合成 され、酵素を用いて作成され、またはin vitroで作成されてもよい。オリゴマー
は、好ましくはGRIRをコードするポリヌクレオチドの断片、またはGRIRをコード
するポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、特定の遺伝子
或いは状態を識別するための最適化された条件の下で用いられる。また深く関わ
るDNAまたはRNA配列の検出及び／又は定量のために、オリゴマーは緩やかな厳密
性の条件で用いることができる。

【０１６１】 またGRIR発現を定量するために用いられる方法には、放射標識或いはビオチン
化したヌクレオチドの利用、対照核酸の同時増幅(coamplification)の利用、及 び標準の検量線で補間する実験結果の利用が含まれる（Melby, P.C.ら(1993) J.
Immunol. Methods, 159:235-244；Duplaa, C. ら(1993) Anal. Biochem. 229-2
36）。多数のサンプルの定量の速度は、目的のオリゴマーが様々な希釈溶液中に
存在し、分光光度法または比色定量応答により迅速に定量するELISA形式におい てアッセイを実施することによって加速することができる。

【０１６２】 別の実施例においては、ここに開示した任意のポリヌクレオチド配列に由来す
るオリゴヌクレオチド又はより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いることができる。マイクロアレイを用いて、同時に多くの遺伝子の発現レベ
ルをモニタし（転写物イメージを生成する）、また遺伝子の変異配列、変異及び
多形性を同定することができる。この情報は、遺伝子機能の決定、疾病の遺伝的
基礎の理解、疾病の診断、並びに治療薬の開発およびその活性のモニタリングに
おいて有用である。

【０１６３】 一実施例においては、PCT出願WO95/11995（Cheeら）、Lockhart, D. J. ら （
1996; Nat.Biotech. 14: 1675-1680）及びSchena, M.ら（1996; Proc. Natl. Ac
ad. Sci. 93: 10614-10619）に記載のような当業者に周知の方法に従いマイクロ
アレイを準備して利用する。これらの文献はここで言及することにより本明細書
の一部とする。

【０１６４】 マイクロアレイは、固形支持体に固定された、一般に合成アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドまたはcDNAの断片の何れかの、数多くの独特の一本鎖の核酸配列か
ら好ましくは構成される。そのオリゴヌクレオチドは、好ましくは約6〜60個の ヌクレオチドの長さ、より好ましくは約15〜30個のヌクレオチドの長さ、最も好
ましくは約20〜25個のヌクレオチドの長さをなす。マイクロアレイの一定のタイ
プに対しては、約7〜10個のヌクレオチドの長さしかないオリゴヌクレオチドを 用いるのが好ましいことがあり得る。マイクロアレイは、既知の5’又は3’配列
をカバーするオリゴヌクレオチドや、完全長配列をカバーする連続的なオリゴヌ
クレオチドや、或いは配列の長さに沿った特定の領域から選択された独特のオリ
ゴヌクレオチドを含み得る。マイクロアレイで用いられるポリヌクレオチドは、
少なくとも配列の断片が既知である目的の遺伝子又は遺伝子群に特異的なオリゴ
ヌクレオチドか、特定の細胞または組織のタイプ、または正常、発生的若しくは
疾患状態に対して共通な１またはそれ以上の未同定のcDNAに特異的なオリゴヌク
レオチドであり得る。所定の状況においては、マイクロアレイにおいて対をなす
オリゴヌクレオチドを用いることが適当である。その対は、配列の中央に好まし
くは位置する1つのヌクレオチドを除けば、同一のものである。その対における 第2のオリゴヌクレオチド（１つのヌクレオチドは一致していない）は、調節に 役立つ。対をなすオリゴヌクレオチドの数は、約2〜1,000,000の範囲である。

【０１６５】 マイクロアレイのための既知の配列に対するオリゴヌクレオチドを作製するた
めに、コンピュータアルゴリズムを用いて、ヌクレオチド配列の5’またはより 好ましくは3’末端から始めて、目的の遺伝子を調査する。このアルゴリズムに より、その遺伝子に独特な、ハイブリダイゼーションに適した範囲のＧＣ含量を
有する、ハイブリダイゼーションを妨げうる予想された二次構造のない、限定さ
れた長さのオリゴマーを同定する。ある局面においては、オリゴマーは、光照射
（light-directed）化学プロセスを用いて、基板上の指定された領域において合
成される。その基板は、紙、ナイロン、又は他のタイプのメンブラン、フィルタ
、チップ、スライドガラス、又は他の適切な任意の固形支持体であり得る。

【０１６６】 別の局面では、オリゴヌクレオチドを基板表面上で、PCT出願WO95/251116 （B
aldeschweilerら）に記載のような化学結合プロシージャ及びインクジェット装 置を用いて合成することができる。前記PCT出願はここで言及することにより本 明細書の一部とする。また別の局面では、ドットブロット又はスロットブロット
（HYBRIDOT^ョ apparatus, IBCO/BRL）に類似のグリッドアレイを用い、真空シス テム、熱、ＵＶ、機械的又は化学的結合プロシージャを利用してcDNA断片又はオ
リゴヌクレオチドを基板の表面に対して配置及び結合することができる。更に別
の局面では、アレイは、手作業或いは市販の装置で、材料、及び機械（Brinkman
n^ョ マルチチャネルピペッターまたはロボット装置を含む）を用いることにより
製作することができ、また市販の器具を効果的に使用できる8、24、96、384、1536、 又は6144個のオリゴヌクレオチド、或いは2個から100万個の範囲の任意の数のオ
リゴヌクレオチドを含み得る。

【０１６７】 マイクロアレイを用いてサンプル解析を実施するために、ポリヌクレオチドが
生物学的サンプルから抽出される。生物学的サンプルは、任意の体液（血液、尿
、唾液、痰、胃液など）、培養細胞、生検材料、または他の組織標本から得られ
る。プローブを作製するために、サンプルから抽出されたポリヌクレオチドは、
マイクロアレイ上の核酸と相補的な核酸配列を作るのに用いられる。マイクロア
レイがcDNAからなる場合、アンチセンスRNA（aRNA）がプローブに適している。 従って、ある局面においては、mRNAを用いてcDNAを生成し、次に蛍光性ヌクレオ
チドの存在下において、cDNA用いてフラグメントまたはオリゴヌクレオチドaRNA
プローブを作製する。これらの蛍光性に標識されたプローブをマイクロアレイと
共にインキュベートし、プローブ配列がマイクロアレイのcDNAオリゴヌクレオチ
ドとハイブリダイズすようにする。別の局面では、プローブとして用いられる核
酸配列には、ハイブリダイズ技術として当業者に周知の制限酵素、PCR技術およ びオリゴラべリング(Oligolabeling)またはTransProbe kits (Pharmacia & Upjo
hn)を用いて作り出されたポリヌクレオチド、断片、および相補的配列もしくは アンチセンス配列が含まれる。

【０１６８】 インキュベーションの条件は、ハイブリダイゼーションが正確な相補的一致を
伴い起こるか、或いはより低い相補性の種々のレベルで起こるように調節される
。ハイブリダイズしていないプローブを取り除いた後、スキャナーを用いて、蛍
光のレベル及びパターンを決定する。マイクロアレイ上の各オリゴヌクレオチド
配列の相補性の程度及び相対的な量を決定するために、スキャンされたイメージ
を調べる。検出システムを用いて、全ての個別の配列に対して同時にハイブリダ
イゼーションの非存在、存在、及び量を測定することができる。このデータは、
サンプル中の配列、突然変異、変異体、又は多形体におけるラージスケールの相
関性の研究、または機能分析のために用いることができる（Heller. R.A.ら (19
97) Proc.Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155.）。

【０１６９】 本発明の別の実施例においては、GRIRをコードする核酸配列を用いて、自然発
生のゲノム配列をマッピングするために有用なハイブリダイゼーションプローブ
を作り出すこともできる。この配列は、特定の染色体、染色体の特定の領域、又
は人工染色体作成物にマッピングすることができ、その人工染色体作製物には、
Price, C.M. の文献（1993；Blood Rev. 7:127-134） 及びTrask, B.J. の文献 （1991；Trends Genet. 7:149-154）に記載のように、ヒト人工染色体（HACs） 、酵母菌人工染色体（YACs）、細菌人工染色体（BACs）、細菌性P1作製物又は一
本鎖染色体cDNAライブラリーがある。

【０１７０】 蛍光性インサイチューハイブリダイゼーション（FISH. 、Heinz-Ulrichら (19
95) in Meyers, R.A. (ed.) Molecular Biology and Biotechnology, pp. 965-9
68, VCH Publishers New York, NY.に記載）は、他の物理的な染色体マッピング
技術及び遺伝地図データと関連し得る。遺伝地図データの例は、種々の科学誌、
またはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）部位に見られる。物理的 な染色体地図上のGRIRをコードする配列の位置および特定の疾病、もしくは特定
の疾病の素因との関連性の助けにより、疾患に関係するDNAの領域の範囲を定め ることができる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者とキャリア、即ち
発症した個体との遺伝子配列の違いを検出することができる。

【０１７１】 遺伝地図を広げるために、染色体作成物のin situハイブリダイゼーション及 び確立された染色体マーカーを用いる連鎖解析のような物理的なマッピング技術
を用いることができる。場合によっては、特定のヒト染色体の数やアームが未知
であっても、マウスのような別の哺乳類の染色体上の遺伝子配置によって関連す
るマーカーが明らかになる。物理的なマッピングによって、新たな配列を染色体
のアーム、或いはその一部へ割当てることができる。これにより、位置クローニ
ングまたは別の遺伝子発見技術を用いて、疾病遺伝子を検索する研究者に価値あ
る情報を提供できる。ひとたび疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えば
AT to 11q22-23（Gatti, R.A.ら（1988）Nature 336:577-580）への遺伝連鎖に よって不完全な局所化がなされると、その領域にマッピングされる任意の配列は
、さらなる研究のための関連する遺伝子または調節遺伝子を表し得る。また、本
発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者の染色体の位置と、キャリア、即ち発
症した個体の、転座、逆位等によって生じた染色体の位置との違いを検出するこ
ともできる。

【０１７２】 本発明の別の実施例においては、GRIRや、その触媒作用性または免疫原性断片
、即ちそれらのオリゴペプチドを、種々の薬剤スクリーニング技術における化合
物のライブラリーのスクリーニングのために用いることができる。そのようなス
クリーニングにおいて用いられる断片は、溶液中で遊離しているか、固体支持体
へ付着しているか、細胞表面へ付着しているか、或いは細胞内に位置しているも
のでありうる。GRIRと検定する薬剤との結合複合体の形成を測定することができ
る。

【０１７３】 用いることのできる別の薬物スクリーニング技術として、公開されたＰＣＴ出
願WO84/03564（Geysenら）に記載のような、目的のタンパク質に対する適切な結
合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングが提供される。この方
法において、多くの異なる小形の試験化合物が、プラスチックピン或いは別の表
面のような固体基質において合成される。試験化合物をGRIR又はその断片と反応
させ、そして洗浄する。次に、当技術分野で周知の方法で結合GRIRを検出する。
また、前述の薬剤スクリーニング技術において使用するために、精製されたGRIR
をプレート上に直接コーティングすることもできる。或いは、非中和性抗体を用
いて、ペプチドを捕捉して固体支持体上に固定することができる。

【０１７４】 別の実施例においては、GRIR結合のためにGRIRと結合可能な中和抗体が試験化
合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイを用いることができ
る。この方法において、抗体を用いて、１またはそれ以上の抗原決定基をGRIRと
共有する任意のペプチドの存在を検出することができる。

【０１７５】 さらに別の実施例においては、その新技術が、以下に限らないが、トリプレッ
ト遺伝暗号及び特異的な塩基対相互作用のようなものを含む特性の現在周知のヌ
クレオチド配列の特性に基づくものであれば、GRIRをコードするヌクレオチド配
列を、未だ開発されていない分子生物学的技術に用いることができる。

【０１７６】 以下に示す実施例は本発明の例示であって、本発明を限定しようとするもので
はない。

【０１７７】

【実施例】

１ PROSNOT01クローニングおよびcDNA の単離 ライブラリー作製に用いる前立腺組織は、白血病を患う78歳の白人男性（Lot
No. 94-039, International Institute for the Advancement of Medicine, Ext
on PA）から得られた。患者の病歴には、皮膚癌、肺気腫、喘息、および胆嚢切 除の手術が含まれていた。患者は、白血病のためにヒドロキシ尿素を服用してい
た。

【０１７８】 その前立腺組織を瞬間冷凍し、乳鉢および乳棒で粉砕し、グアニジニウムイソ
チオシアネート(guanidinium isothiocyanate)を含むバッファー中に即時に溶解 し、塩化セシウムで遠心分離(spun)した。その溶解産物をpH8.0のフェノールクロ
ロホルムを用いて2度抽出し、さらに塩化セシウム(CsCl)勾配遠心法によりBeckm
an L8-70M超遠心機(Beckman Instruments)のBeckman SW28ローターを用いて遠心
分離した。そのRNAを0.3Mの酢酸ナトリウム及び2.5倍の容量のエタノールを用い
て沈殿させ、水中に再懸濁させ、37℃で15分間DNaseで処理した。Qiagen Oligot
ex kit（QIAGEN Inc., Chatsworth CA）を用いてRNAを単離し、cDNAライブラリ ーの作製に用いた。

【０１７９】 第１鎖cDNA合成は、XhoI制限部位を含むoligo d(T)プライマー／リンカーを用
いて実施した。第２鎖合成は、DNAポリメラーゼI、E.coilリガーゼおよびRNase
Hを組合せて用いて実施し、続いて平滑末端cDNAに対してEcoRIアダプターの付加
を行なった。EcoRI適合させた2本鎖cDNAを、XhoI制限酵素で消化し、セファクリ
ルS400において分割し、1000bpを超えるサイズの配列が得られた。選択したサイ
ズのDNAを、LambdaZap^ョ vector system (Stratagene. La Jolla CA)に入れ、pBl uescript^TM phagemid (Stratagene)を含むそのベクターを、E.coil,strain XL I
-BlueMRF^TM (Stratagene)に形質転換した。

【０１８０】 個々のcDNAクローンのファージミド形態は、in vivo切除プロセスによって得 られた。pBluescriptおよび同時形質転換されたflヘルパーファージニックのDNA
の両方からの酵素により、新たなDNA合成が開始され、cDNA挿入断片を含むより 小さい１本鎖環状ファージミドDNA分子が作られた。ファージミドDNAを遊離させ
、精製して、新たな宿主細胞（SOLR, Stratagene）の再感染に用いた。β-ラク タマーゼに対して遺伝子を運ぶファージミドの存在により、形質転換された細菌
がアンピシリンを含む培地で成長することが可能となった。

【０１８１】 プラスミドDNAを細胞から遊離し、REAL Prep 96 Plasmid Kit for Rapid Extr
action Alkaline Lysis Plasmid Minipreps (Catalog #26173, QIAGEN, Inc.)を
用いて精製した。このキットにより、マルチチャネル試薬ディスペンサーを用い
て96穴ブロックにおける96のサンプルの同時精製が可能となった。推奨プロトコ
ルを用いたが、以下の点を変更した。１）細菌は、25mg/Lのカルベニシリン及び
0.4%のグリセロールと共に1mlの滅菌Terrific Broth(Catalog#22711, GIBCO/ BR
L)において培養した。２）接種の後、培養株を19時間インキュベートし、インキ
ュベーションの終了時に細胞を0.3mlの溶解バッファーで溶解した。３）イソプ ロパノール沈殿の後に、プラスミドDNAペレッを0.1mlの蒸留水中に再懸濁した。
プロトコルの最終ステップの終了後に、サンプルを96穴ブロックに移して4℃で 保管した。

【０１８２】 ファージミドDNAを細胞から遊離させ、Miniprep Kit (Catalog # 77468; Adva
nced Genetic Technologies Corporation, Gaithersburg MD)を用いて精製した 。このキットは960の精製のための試薬を伴う96穴ブロックからなる。推奨プロ トコルを用いたが、以下の点を変更した。１）96穴の各々を、25mg/Lのカルベニ
シリン及び0.4%のグリセロールと共に1mlの無菌のTerrific Broth(Catalog#2271
1, GIBCO/ BRL)のみで満たした。２）ウェルに植え付けた後、細菌を24時間培養
し、その後60μlの溶解バッファーで溶解した。３）遠心分離処置（Beckman GS-
6R @2900rpmで5分間）を実施した後、ブロックの含有物を一次フィルタプレート
に加えた。４）トリスバッファにイソプロパノールを添加する採用随意のステッ
プはルーチン的に行わなかった。プロトコルの最終ステップの後、サンプルを保
管のためBeckman96穴ブロックに移した。

【０１８３】 プラスミドDNAを精製する別の方法には、MAGIC MINIPREPS^TM DNA精製システム
（Catalog #A7100, Promega, Madison WI）またはQIAwell^{T M}-8 Plasmid、QIAwel
l PLUS DNA 及び QIAwell ULTRA DNA精製システム（QIAGEN）の使用が含まれる 。

【０１８４】 ２ PROSTUT09クローニングおよびcDNA の単離 PROSTUT09 cDNAライブラリーの場合、前立腺の腫瘍を66歳の白人男性から得た
。手術には、根治的前立腺切除、根治的胆嚢切除、腸への尿道分岐(urinary div
ersion)が含まれていた。病理学報告は、侵襲性のグレード3（3の）移行上皮癌 が前立腺周囲の腺を含むように延在する尿道前立腺部にあり、それは前立腺の実
質組織の前後部に拡散的に浸潤していることを示していた。輸尿管を含む全ての
最終的な外科手術上の縁（左右、複数の再切除の後）および尿道前立腺部は腫瘍
に対して陰性であった。移行上皮癌の広範な併発に加えて、右の前立腺には腺癌
の微視的な病巣（Gleason grade 3+2）が含まれ、それは前立腺に限られ、莢膜 の浸入(capsular penetration)を示さなかった。複数の左右の骨盤のリンパ節は
腫瘍に対して陰性であった。患者は、前立腺の炎症性の疾患を呈していた。患者
の病歴には、経尿道の前立腺切除、肺の腫瘍、良性の高血圧症、及びタバコの習
慣が含まれていた。患者は、手術の際にインシュリンおよびDyazide^ョ （利尿薬
／降圧薬; SmithKline Beecham Pharmaceuticals, Philadelphia, PA）を服用し
ていた。

【０１８５】 凍結組織をBrinkmann Homogenizer Polytron PT-3000（Brinkmann Instrument
s,Westbury,NJ）を用いて均質化してグアニジニウムイソチオシアネート溶液中 に溶解した。溶解産物は、Beckman L8-70M超遠心機のBeckman SW28ローター(Bec
kman Instruments)を用いて、室温において25,000rpmで18時間、5.7MのCsClクッ
ションで遠心分離した。RNAを酸性フェノール（pH4.7）で抽出し、0.3Mの酢酸ナ
トリウムおよび2.5倍の容量のエタノールを用いて沈殿させ、RNAseフリーの水に
再懸濁させ、37℃においてDnaseで処理した。前述のようにRNAの抽出および沈殿
を繰返した。mRNAをQiagen Oligotex kit (QIAGEN)を用いて単離してcDNAライブ
ラリーの作製に使用した。

【０１８６】 mRNAは、cDNA合成およびプラスミドクローニングのためのSuperScript Plasmi
d Systemの推奨プロトコル(Catalog #18248-013. Gibco/BRL)に従い取扱った。c
DNAをセファロースCL4Bカラム(Catalog #275105-01; Pharmacia)において分別し
、400bpを超えるこれらのcDNAをpINCY 1と結びつけた。続いて、プラスミドpINC
Y 1をDH5a^TMコンピテント細胞(Catalog #18258-012;Gibco/BRL)に形質転換した 。

【０１８７】 ３ cDNAクローン及びそれらの類推されるタンパク質の配列決定および相同性 検索 4台のPeltier Thermal Cyclers (PTC200 from MJ Research, Watertown MA)並
びにApplied Biosystems 377もしくは373 DNA Sequencing Systems (Perkin Elm
er)及びHamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno,NV)を組み合わせて用いて、
Sanger F及びAR Coulson(1975,J.Mol.Biol.94:441f)の方法により、このcDNAの 配列決定を行ない、読み枠を画定した。これらのデータベースには既に同定され
、注釈を付けた配列を含んでおり、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool
；Altschul, S.F.(1993)J.Mol.Evol 36:290-300; およびAltschulら(1990)J. Mo
l. Biol. 215:403-410）を用いて相同性を有する領域の検索が行われた。

【０１８８】 BLASTはヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを生成し、配列 類似性を判定する。そのアライメントの局部的性質のため、BLASTは厳密な一致 を判定する、即ち原核生物（細菌）又は真核生物（動物、真菌、植物）起源のホ
モログを同定する際に特に有効である。他のアルゴリズム、例えばSmith,Tら(19
92, Protein Engineering 5:35-51)に記載のアルゴリズムを、一次配列パターン
及び二次的な構造ギャップペナルティを取り扱う際に用いることができる。本明
細書に開示された配列は、少なくとも49ヌクレオチドの長さであり、不要な塩基
は12%未満である（ここでは、A、C、G、TではなくNが記録される）。

【０１８９】 BLASTアプローチは、問い合わせ配列とデータベースの配列の一致を検索する 。また、BLASTは、発見されたあらゆる配列の一致の統計的有意性を評価して、 ユーザが選択した有意性のしきい値を満たすそれらの一致のみを報告する。本出
願でのしきい値は、ヌクレオチドで10^-25、ペプチドで10^-14に設定した。

【０１９０】 インサイト社のヌクレオチド配列を、霊長類（pri）、げっ歯類（rod）、及び
他の哺乳類配列（mam）のGenBankデータベースで検索し、そして同じクローンか
ら類推されたアミノ酸配列を、GenBankの機能性タンパク質データベース、哺乳 類（mamp）、脊椎動物（vrtp）、及び真核生物（eukp）で、相同性について検索
した。

【０１９１】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織に由来するRNAが結合されている膜への標識 されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う（Sambrookら、前出,
ch.7並びにAusubel, F.M.ら前出, ch.4および16.）。

【０１９２】 BLAST（Altschul,S.F.(1993)J.Mol.Evol.36:290-300; Altschul,S.F.ら(1990)
J.Mol.Evol. 215:403-410）を使用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenB
ank或いはLIFESEQ^TM データベース（インサイト社）のようなヌクレオチドデー
タベース内の同一或いは関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブ
リダイゼーションより非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更
して、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れとして分類され
るかを決定することができる。検索の基準は、以下で定義される積スコア（prod
uct score）である。 （%配列同一性×%最大BLASTスコア）／100 積スコアは、2つの配列間の類似度及び配列一致の長さの両方を考慮に入れる。 例えば、積スコア40の場合、その一致は1〜2%誤差の範囲内の正確さであり、積ス
コア70の場合は正確な一致となる。相同性分子は通常、15〜40間の積スコアを示す
分子を選択することにより同定されるが、それより低いスコアでも関連した分子
が同定される場合もある。

【０１９３】 ノーザン分析の結果は、GRIRをコードする転写物が発生するライブラリのリス
トとして報告される。また存在量及び存在比も報告される。存在量は、特定の転
写物がcDNAライブラリ内に現れる回数を正に表すものであり、存在率は、存在量
をcDNAライブラリ内で試験された配列の全数で割った値である。

【０１９４】 ５ GRIRをコードするポリヌクレオチドの伸長 インサイト社クローン364702及び1650519の核酸配列を用いて、部分ヌクレオ チド配列を完全長まで伸長するためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した
。各核酸配列に対して、一方のプライマーを合成してアンチセンスポリヌクレオ
チドの伸長を開始し、他方のプライマーを合成してセンスポリヌクレオチドの配
列を伸長を開始した。プライマーを用いることにより、対象の領域に対する新た
な未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを「外側に」発生させる既知の配
列の伸長を容易にした。初期のプライマーを、OLIGO4.06 (National Bioscience
s)或いは他の適切なプログラムを用いて、約22〜30ヌクレオチドからなる長さで
、50%以上のGC含有物を有し、且つ約68〜72℃の温度で標的配列にアニーリング するようにcDNAから設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー2量体 を生ずるようなヌクレオチドの如何なる伸展も避けた。

【０１９５】 選択されたヒトcDNAライブラリ(Gibco/BRL)を用いて配列を伸長した。２つ以 上の伸長が必要である、もしくは望まれる場合には、さらに別のプライマの組を
設計して既知領域をさらに伸長させる。

【０１９６】 XL-PCR kit (Perkin Elmer)の取扱説明書に従って、酵素及び反応混合物を完 全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られた。PCRはPeltier Thermal
Cycler (PTC200; M.J.Research, Watertown,MA)を用いて実施され、以下のパラ
メータで、40pmolの各プライマおよびキットの他の全ての成分を推奨された濃度
で開始した。 ステップ1 94℃で1分間(初期変性） ステップ2 65℃で1分間 ステップ3 68℃で6分間 ステップ4 94℃で15秒間 ステップ5 65℃で1分間 ステップ6 68℃で7分間 ステップ7 ステップ4〜6をさらに15サイクル繰返す ステップ8 94℃で15秒間 ステップ9 65℃で1分間 ステップ10 68℃で7分15秒間 ステップ11 ステップ8〜10を12サイクル繰返す ステップ12 72℃で8分間 ステップ13 4℃（保持する） 反応混合物の5〜10μlのアリコットを低濃度（約0.6〜0.8%）アガロースミニ ゲル上で電気泳動法により分析し、どの反応物が配列の伸長に成功したかを判定
した。最も大きな生成物を含むと考えられるバンドをゲルから切出し、QIA Quic
k^TM (QIAGEN)を用いて精製し、クレノウ酵素を用いてオーバーハングを切除して
、再連結及びクローニングを容易にした。

【０１９７】 エタノール沈殿の後、その生成物を13μlの連結緩衝液中に再溶解し、1μlT4-
DNAリガーゼ（15単位)及び1μlT4ポリヌクレオチドキナーゼが加えて、その混合
物を2〜3時間室温で、或いは16℃で一晩インキュベートした。コンピテントE.col i 細胞(40μlの適切な培養液中の）を3μlの連結混合物を用いて形質転換し、80μ
lのSOC培養液で培養した（Sambrook、前出,Appendix A, p.2）。37℃で1時間イ ンキュベートした後、E.coli混合物を、2x Carbを含むLuria Bertani (LB)-agar
(Sambrook、前出,Appendix A, p.1)上で培養した（plated）。翌日、いくつか のコロニーを各プレートから無作為に選択して、適切な市販の滅菌96穴マイクロ
タイタープレートの個々のウエル内に置かれた150μlの液体LB/2xCarb培地で培 養した。その翌日、終夜培養した各5μlの培養物を非滅菌の96穴プレートに移し
、水で1:10に希釈した後、各サンプルから5μlをのPCRアレイに移した。

【０１９８】 PCR増幅の場合、4単位のrTthDNAポリメラーゼ、ベクタプライマー、及び伸長 反応のために用いられる１つ或いは両方の遺伝子特異的プライマーを含む18μl の濃縮PCR反応混合物(3.3x)が各ウエルに加えられた。増幅は、以下の条件で実 施した。 ステップ1 94℃で60秒間 ステップ2 94℃で20秒間 ステップ3 55℃で30秒間 ステップ4 72℃で90秒間 ステップ5 ステップ2〜4をさらに29サイクル繰返す ステップ6 72℃で180秒間 ステップ7 4℃（保持する） PCR反応物のアリコットを、分子量マーカと共にアガロースゲル上で移動させ た。PCR生成物の大きさを元の部分cDNAと比較し、適切なクローンを選択し、プ ラスミドに結合させて、配列決定した。

【０１９９】 同様に、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:4のヌクレオチド配列を用いて、上記手
順、5´伸長用に設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを 用いる5´制御配列を得る。

【０２００】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用 SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:4に由来するハイブリダイゼーションプローブを
用いて、cDNA、ゲノムDNA、又はmRNAをスクリーニングする。約２０塩基対から なるオリゴヌクレオチドの標識化について特に記載するが、より大きなヌクレオ
チドフラグメントにも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO 4.
06 (National Biosciences)のような現状の技術分野のソフトウエアを用いて設 計し、50pmolの各オリゴマーと250μCiの[γ-³²P]アデノシン三リン酸 (Amersha
m)及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN^ョ, Boston MA)とを組み合わせる ことにより標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、Sephadex G-25超精細 樹脂カラム(Pharmacia＆Upjohn)を用いて実質的に精製する。毎分10⁷カウントの
標識されたプローブを含むアリコットを、エンドヌクレアーゼ（Ase I, Bgl II,
Eco RI, Pst I, Xba 1.或いは Pvu II(DuPont NEN^ョ)）の1つで消化されたヒト
ゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析に用いる。

【０２０１】 各消化物からのDNAを、0.7%アガロースゲルに上で分画して、ナイロン膜(Nytr
an Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH)に転写する。ハイブリダイゼーシ ョンは40℃で16時間実施する。非特異的シグナルを除去するために、0.1×クエ ン酸ナトリウム食塩水及び0.5%ドデシル硫酸ナトリウムまでの徐々に厳密性を増
す条件下で、ブロットを室温にて連続的に洗浄する。XOMAT AR^TM フィルム (Kod
ak, Rochester,NY)が数時間Phosphoimager cassette (Molecular Dynamics, Syn
nyvale,CA)内でブロットに露光された後、ハイブリダイゼーションパターンを視
覚的に比較する。

【０２０２】 ７ マイクロアレイ マイクロアレイ用のオリゴヌクレオチドを作り出すために、本発明のヌクレオ
チド配列を、そのヌクレオチド配列の3´末端から開始して、所定のコンピュー タアルゴリズムを用いて調べる。そのアルゴリズムによって、その遺伝子に固有
で、ハイブリダイゼーションに適した範囲内のGC含有物を有し、ハイブリダイゼ
ーションに妨げとなるような予測された二次的構造がない特定の長さのオリゴマ
を同定する。そのアルゴリズムは、長さが約20ヌクレオチドからなる（20量体)2
0個の特異な配列のオリゴヌクレオチドを同定する。各配列の中央の1つのヌクレ
オチドが変化していることを除いて一致したオリゴヌクレオチドの組を形成する
。このプロセスはマイクロアレイ内の各遺伝子に対して繰返され、20個の20量体
からなる組の2つが、光配向（light-directed）化学処理（Chee (前出)に記載）
を用いてシリコンチップの表面上で合成及び配列される。

【０２０３】 別法として、化学的結合プロシージャ及びインクジェット装置を用いることに
より、基板の表面上でオリゴマを合成する（Baldeschweiler,前出）。さらに別 の方法では、ドットブロット又はスロットブロット法に類似のグリッドアレイを
用いて、真空システムまたは熱、紫外線（UV）、機械的或いは化学的結合プロシ
ージャを利用して、基板の表面にcDNAフラグメント或いはオリゴヌクレオチドを
配列及び結合させる。一般にアレイは手動で或いは市販の道具及び装置を用いて
、8ドット、24ドット、96ドット、384ドット、1536ドット或いは6144ドットのグ
リッドを含むように製造できる。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを
洗浄してハイブリダイズしていないプローブを除去し、スキャナーを用いて蛍光
のレベル及びパターンを判定する。スキャナーで読取られた画像が検査して、マ
イクロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の度合及び相対的な存在量
／発現レベルを判定する。

【０２０４】 ８ 相補的ポリヌクレオチド GRIRをコードする配列に相補的な配列或いはその任意の一部を用いて、自然発
生GRIRの発現を検出して低下させ、即ち抑制する。約15〜約30塩基対を含むオリ
ゴヌクレオチドの使用について記載するが、より小さな、或いはより大きな配列
フラグメントの場合でも概ね同じ方法が用いられる。Oligo4.06ソフトウエア及びG RIRコーディング配列を用いて適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を抑 制するために、相補オリゴヌクレオチドを最も独特の5´配列から設計し、プロ モーターのコーディング配列への結合を防止するために用いる。翻訳を抑制する
ために、相補的なオリゴヌクレオチドを、リボソームのGRIRをコードする転写物
への結合を防ぐように設計する。

【０２０５】 ９ GRIRの発現 GRIRの発現は、cDNAを適切なベクタにサブクローニングし、ベクターを宿主細
胞に形質転換することにより行われる。この場合には、クローニングベクターを
用いて、E.coliにおいてGRIRを発現させる。クローニング部位の上流では、この
ベクターはβ-ガラクトシダーゼのためのプロモータを含み、それにアミノ末端M
et及びそれに後続するβ-ガラクトシダーゼの7残基を含む配列が続く。直後のこ
れら8残基は、転写のために有用なバクテリオファージプロモータ及び多くの特 有の制限部位を含むリンカーである。

【０２０６】 単離され、標準的な方法を用いてIPTG (isopropyil beta-D-thiogalactopyran
oside)と転換された菌種の誘発により、β-ガラクトシダーゼの最初の8残基、リ
ンカーの約5〜15残基及び完全長タンパク質からなる融合タンパク質を生成する 。このシグナル残基により細菌増殖培地へのGRIRの分泌が促され、この培地を後
述の活性のためのアッセイにおいて直接用いることができる。

【０２０７】 １０ GRIR活性の実証 SEQ ID NO:2及びSEQ ID NO:4でコードされるような受容体は、非相同的な発現
系において発現され、それらの生物活性は、Erbらの文献(1993; Proc.Natl. Aca
d. Sci. 90:10449-53.) に記載のようなプリン受容体系（P_2U）を用いて検定さ れる。培養されたK562ヒト白血病細胞はP_2U受容体を欠くので、ノルマルまたは キメラP_2Uのどちらかを含む発現ベクターで形質移入され、fula−∝、およびCa^{+ +} に対する蛍光プローブが付加される。細胞外のUTP又はATPと共に適切に集めら れた機能的な細胞外のSP-膜貫通／細胞内P_2U受容体の活性化により、fula−∝と
反応する細胞内のCa⁺⁺が動員され、それが蛍光分光分析(spectrofluorometrical
ly)測定される。形質移入されたK562細胞を適当な配位子を含むマイクロウェル に浸すことが、SPのエフェクターの蛍光活性の規定および結合の誘因となる。一
旦配位子及び官能基が確定されると、結合を防いでそのような蛍光性の反応を防
止するアンタゴニストまたはインヒビターの規定のためにP_2U系は有用である。

【０２０８】 １１ GRIR特異的抗体の産生 PAGE電気泳動法（Harrington,M.G.(1990)Methods Enzymol.182:488-495）、或
いは他の精製技術を用いて実質的に精製されたGRIRを用いて、ウサギを免疫化し
、標準的なプロトコルを使用して抗体を生成する。アミノ酸配列を、DNASTAR so
ftware （DNASTAR Inc）を用いて分析して、免疫原性の高い領域を判定し、対応
するオリゴポリペプチドを合成し、これを用いて当業者に知られた方法により抗
体を作り出す。C-末端付近、或いは親水性領域内のエピトープのような適切なエ
ピトープの選択については、Ausubel F.M.らの文献（1995,定期的に増補；Curre
nt Protocols in Molecular Biology,ch. 11, John Wiley & Sons, New York,
NY）などに記載される。

【０２０９】 通常、オリゴペプチドは15残基の長さであり、fmoc法の化学作用を利用するApp
lied Biosystems Peptide Synthesizer Model 431Aを用いて合成し、MBS（M-mal
eimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester : Ausubelら、前出）を用いた反応
によりKLH(Sigma, St.Louis, MO)に結合させる。ウサギは、完全なフロイントの
アジュバントにおけるオリゴペプチド-KLH複合体で免疫化する。その結果生じる
抗血清は、例えば、プラスチックにペプチドを結合させ、1%BSAでブロッキング し、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウ
サギIgGと反応させることにより、抗ペプチド活性に対して検査される。

【０２１０】 １２ 特異的抗体を用いる自然発生GRIRの精製 GRIRに対して特異な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィによ
り、自然発生或いは組換えGRIRを実質的に精製する。イムノアフィニティーカラ
ムは、GRIR抗体を、CnBr-activated Sepharose (Pharmacia＆Upjohn)のような活
性化されたクロマトグラフィー用樹脂に共有結合させることにより作製する。結
合の後、製造者の取扱説明書に従って樹脂をブロック及び洗浄する。

【０２１１】 GRIRを含む培養液を免疫親和性カラムに通し、そのカラムをGRIRを優先的に吸
着させる条件下（例えば、界面活性剤の存在下における高イオン強度のバッファ
ー）で洗浄する。抗体／ABBR結合を分裂させる条件下（例えば、pH2〜3のバッフ
ァー、又は尿素もしくはチオシアン酸塩イオンのような高濃度のカオトロープ(c
haotrope)）でカラムを溶出させ、GRIRを回収する。

【０２１２】 １３ GRIRと相互作用する分子の同定 ¹²⁵I Bolton-Hunter試薬(Boltonら(1973) Biochem.J.133:529)を用いて、GRIR
或いはその生物学的に活性な断片を標識する。マルチウエルプレートのウエル内
に予め配列した候補分子を、標識されたGRIRでインキュベートし、洗浄し、標識
されたGRIR複合体を有する任意のウエルを検定する。種々のGRIR濃度で得られた
データを用いて、数、親和性及びGRIRと候補分子との会合についての値を計算す
る。

【０２１３】 上記の刊行物および特許出願の全ては、ここで言及することにより本明細書の
一部とする。当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本明細書に
記載した方法及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。本発明を
特定の好適実施例に関して説明してきたが、請求する発明がそのような特定の実
施例に過度に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、記載した本
発明の実施のための方法の種々の改変は、分子生物学或いは関連する分野の当業
者には明らかであり、請求の範囲内に含まれることを意図するものである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 GRIR-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）および核酸配列（SEQ ID NO:2）を示す
図である（図１Ａ乃至図１Ｅの配列アライメントの作成にはMacDNAsis PROTMソ フトウエア(Hitach Software Engineering CO.Ltd.San Bruno,CA)を使用した） 。

【図１Ｂ】 GRIR-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）および核酸配列（SEQ ID NO:2）を示す
図である。

【図１Ｃ】 GRIR-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）および核酸配列（SEQ ID NO:2）を示す
図である。

【図１Ｄ】 GRIR-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）および核酸配列（SEQ ID NO:2）を示す
図である。

【図１Ｅ】 GRIR-1のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）および核酸配列（SEQ ID NO:2）を示す
図である。

【図２Ａ】 GRIR-1（364702; SEQ ID NO:1）およびイヌ、ラットおよびヒトの嗅覚の受容 体（g1314667, SEQ ID NO:5; g205814, SEQ ID NO:6;およびg32086, SEQ ID NO:
7の各々）の中のアミノ酸配列アライメントを示す図である。

【図２Ｂ】 GRIR-1（364702; SEQ ID NO:1）およびイヌ、ラットおよびヒトの嗅覚の受容 体（g1314667, SEQ ID NO:5; g205814, SEQ ID NO:6;および g32086, SEQ ID NO
:7の各々）の中のアミノ酸配列アライメントを示す図である。

【図３Ａ】 GRIR-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:3）および核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す
図である（図３Ａ乃至図３Ｄの作成にはMacDNAsis PROTMソフトウエアを使用し た）。

【図３Ｂ】 GRIR-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:3）および核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す
図である。

【図３Ｃ】 GRIR-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:3）および核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す
図である。

【図３Ｄ】 GRIR-2のアミノ酸配列（SEQ ID NO:3）および核酸配列（SEQ ID NO:4）を示す
図である。

【図４Ａ】 GRIR-2（1650519; SEQ ID NO:3）、ヒトKIAA0001（g285995, SEQ ID NO:8）、
およびラットのVTR 15-20受容体（g49443, SEQ ID NO:9）の中のアミノ酸配列ア
ライメントを示す図である。

【図４Ｂ】 GRIR-2（1650519; SEQ ID NO:3）、ヒトKIAA0001（g285995, SEQ ID NO:8）、
およびラットのVTR 15-20受容体（g49443, SEQ ID NO:9）の中のアミノ酸配列ア
ライメントを示す図である。

【図５Ａ】 GRIR-1（SEQ ID NO:1）のノーザン分析を示す図である。

【図５Ｂ】 GRIR-2（SEQ ID NO:3）のノーザン分析を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８４ 16/28 1/19 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｃ１２Ｒ 1:19） // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 バンドマン、オルガ アメリカ合衆国カリフォルニア州94043・ マウンテンビュー・アンナアベニュー 366 (72)発明者 ヒルマン、ジェニファー・エル アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃12・モンロードライ ブ 230 (72)発明者 ユエ、ヘンリー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・ルイスアベニュー 826 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 DA78 FB02 FB03 4B024 AA01 BA63 CA04 DA06 FA02 GA11 GA19 HA01 HA12 HA15 HA17 4B063 QA01 QA12 QA18 QA19 QQ02 QQ42 QQ52 QR32 QR40 QR55 QR62 QR84 QS25 QS34 QX01 4B064 AG20 CA02 CA19 CC24 DA05 DA14 4B065 AA26X AA93Y AB01 AC14 BA02 BD14 CA24 CA31 CA44 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA20 BA22 CA53 NA14 ZB012 ZB262 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA44 DA50 DA76 DA86 EA28 EA51 FA72 FA74

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およびS
   EQ ID NO:3の断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含む、免疫反応に
   関係する実質的に精製されたGタンパク質共役型受容体（GRIR）。
2. 【請求項２】 請求項１のアミノ酸配列と少なくとも90%以上のアミノ酸 同一性を有する実質的に精製されたGRIRの変異体。
3. 【請求項３】 請求項１のGRIRをコードする単離され精製されたポリヌク
   レオチド配列。
4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチド配列と少なくとも90%以上の ポリヌクレオチド同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチドの変異配
   列。
5. 【請求項５】 請求項３のポリヌクレオチド配列を含む所定の組成物。
6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチド配列と厳密な条件の下でハイ
   ブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド配列。
7. 【請求項７】 請求項３のポリヌクレオチド配列に対して相補的な、単離
   され精製されたポリヌクレオチド配列。
8. 【請求項８】 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2の断片、およびS
   EQ ID NO:4の断片からなる一群より選択されたポリヌクレオチド配列を含む、単
   離され精製されたポリヌクレオチド配列。
9. 【請求項９】 ポリヌクレオチド配列の断片であって、 ａ）SEQ ID NO:2のヌクレオチド712乃至783 ｂ）SEQ ID NO:4のヌクレオチド319乃至444 からなる一群より選択されることを特徴とする請求項８に記載のポリヌクレオチ
   ド配列の断片。
10. 【請求項１０】 請求項８のポリヌクレオチド配列に対して相補的な、単
    離され精製されたポリヌクレオチド配列。
11. 【請求項１１】 請求項３のポリヌクレオチド配列の少なくとも断片を含
    む発現ベクター。
12. 【請求項１２】 請求項１１の発現ベクターを含む宿主細胞。
13. 【請求項１３】 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1の断片、およ びSEQ ID NO:3の断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で、請求項１２の宿主細胞を
    培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
    を特徴とするポリペプチドの製造方法。
14. 【請求項１４】 適切な医薬用担体と共に請求項１のGRIRを含む医薬品組
    成物。
15. 【請求項１５】 請求項１のGRIRに特異的に結合する精製された抗体。
16. 【請求項１６】 請求項１のGRIRの精製されたアゴニスト。
17. 【請求項１７】 請求項１のGRIRの精製されたアンタゴニスト。
18. 【請求項１８】 腫瘍性疾患の治療方法または予防方法であって、 そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１７のアンタゴニス
    トを投与する過程を含む方法。
19. 【請求項１９】 免疫応答の治療方法または予防方法であって、 そのような治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１７のアンタゴニス
    トを投与する過程を含む方法。
20. 【請求項２０】 核酸を含む生物学的サンプルにおけるGRIRをコードする
    ポリヌクレオチドの検出方法であって、 （ａ）請求項７のポリヌクレオチドを生物学的サンプルの少なくとも１つの核
    酸材料とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と
    、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、該複合体
    の存在が、前記生物学的サンプルにおけるGRIRをコードするポリヌクレオチドの
    存在と相関性を有する、該過程とを含むことを特徴とするGRIRの検出方法。
21. 【請求項２１】 ハイブリダイゼーションの前に、前記核酸材料をポリメ
    ラーゼ連鎖反応法によって増幅することを特徴とする請求項１９に記載の方法。