JP5559217B2 - Mnk−1タンパク質の結晶学的構造 - Google Patents
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(A)Lys113と、
(B)推定受容体ベースAsp205を含有する触媒ループ(残基205−210)と、
(C)γリン酸の活性に必要なマグネシウムイオンを配位する、DF(G/D)モチーフの第1のAsp226と、
である。
i.細胞、例えば大腸菌中におけるヒトMnk−2タンパク質の発現;
ii.Mnk−2タンパク質祖調製物を回収するための細胞を溶解すること;
iii.Mnk−2タンパク質祖調製物を、例えば、親和性タグクロマトグラフィーによって精製すること;および
iv.精製されたヒトMnk−2タンパク質を、例えば、拡散蒸着によって結晶化すること、
によって調製することができる。ヒトMnk−2タンパク質、特に、本発明による、ヒトMnk−2aタンパク質またはMnk−2bタンパク質、より好ましくは、ヒトMnk−2aタンパク質のキナーゼドメインの結晶化方法は、ヒトMnkタンパク質の結晶構造データの生成に特に用いることができる。特に、配位子、特に阻害因子や基質との結合部位または相互作用部位がそれによって得られる。さらには、タンパク質を活性または不活性形態に維持するために結合部位を特定することができる。さらに、ここで得られるMnk−2タンパク質の結果により、Mnk−1などのMnk−2のアイソフォームの配位子、特に阻害因子や基質もまた特定することができる。本発明による結晶化方法は、好ましくは単結晶であり、より好ましくは少なくとも1μm、さらに好ましくは少なくとも10μm、最も好ましくは少なくとも50μmの端長を有する結晶である。結晶は、X線構造解析を実施可能な方法で配置することが好ましい。したがって、本発明のその他の主題は、ヒトMnk−2タンパク質、特に、表1、表1aまたは表3に示す構造配座の全てまたは選択されたタンパク質によって決定されるヒトMnk−2aタンパク質の結晶構造である。好ましくは、不活性ヒトMnk−2aタンパク質の結晶構造が考慮される。結晶構造は、50Å以上の分解能、より好ましくは10Å以上、さらに好ましくは3Å以上の分解能を有することが望ましい。
(i)Asp191はGlu94に結合し;
(ii)Asp193はAsp170に結合する。
(I)阻害された状態;
(II)中間状態;
(III)プライム化状態;および
(IV)活性状態(図12)。
i.例えば大腸菌などの細胞中でヒトMnk−1タンパク質の発現;
ii.粗Mnk−1タンパク質調製物を回収するために細胞を溶解する;
iii.粗Mnk−1タンパク質調製物を、例えば、タグクロマトグラフィなどにより精製する;および
iv.例えば拡散蒸着などにより、精製したヒトMnk−1タンパク質を結晶化する。
図1:Mnk2の組織と配列アライメント
(A)(ラベルを付したように)機能ドメインの配置を示す、ヒトMnk2の2つのスプライス変異体の概略的な比較図。ここで調査する領域(Mnk2キナーゼ領域、Mnk2−KR)は四角で囲まれている。代替的なスプライスは、N末端にもキナーゼドメイン、NLS核局在信号、elF4G真核細胞阻害因子4G、翻訳阻害複合体の足場タンパク質に影響を与えず、Mnk1とMnk2に結合する(1999年のパイロネット(Pyronnet)等、2001年のシェーパー(Scheper)等)
(B)ヒトMnk1とMnk2のキナーゼドメインの配列アライメント、DrosophilaおよびC.elegansMnk遺伝子座(Lk6とR166.5のそれぞれ)および既知構造の3つのヒトCaMK群キナーゼ(MAPKAP−MAPキナーゼ活性化タンパク質キナーゼ)Mnk2のナンバリングは、最近報告された配列に基づく(2000年のスレンツ−ケスラー(Slenz−Kesler)等)。Mnk2−KR中に見いだされた二次構造要素は、以下の配列に示される。星印は、リン酸化部位を示している(2001年のシェーパー(Scheper)等)。触媒ループ(i)DFDモチーフ(その他のキナーゼ中のDFG);と(ii)P+1ループとは、(iii)着色されたバーでマークされている。Mnkの挿入部の特徴は四角でかんでいる(l1−l3)。白抜きの円は、グリシンリッチループのGly91とGly93、ATP結合に重要であることが知られているLys113とGlu129(1994年のテイラーとラッジオ−アンゼルム(Taylor and Radzio−Andzelm))、黒塗りの円は、N末端ローブとC末端ローブを分離するヒンジ領域のGly163とGly165を示す。
図2: Mnk−2キナーゼの全位相。キナーゼドメインのコアの外側の構造的部分は削除された。CAMK1(a,1a06.pdb)、DAPK1(b,1jks.pdb)およびMAKPKAPK2(c;1kwp.pdb)のアポ酵素の構造は、Mnk−2(b)上に重ねられ、同様の配向上に示されている。電子密度でトレースできない部分は点線で示されている。
図3:活性化セグメントの開放形態。赤と青で着色された2つの対称性等価Mnk−2分子は、(a)に示される。同分子は、90°だけ回転された、上から示されている。(c)は、1σで着色された2Fo−Fc電子密度とDAPK1の同じ領域(黒)を示している。
図4:ATP結合ポケットの形態。Mnk−2(青)、MAPKAP2(赤)、CaMk1(緑)およびDAPK1(黒)からの触媒作用の重要性を有する領域が示されている。(a)は、Ly113とGlu129(Mnk−2ナンバリング)を示す。(b)において、Cループのバックボーンと、Asp205とAsn210の側鎖とは、MAPKAP2/ADP共構造(1ny3.pdb)由来のADP(黄)と一緒に示されている。(c)は、DFG(DFD)モチーフ周囲のバックボーンを示しており、(d)はこの領域と(b)由来のADPの側鎖を包含している。
図5:亜鉛結合部位。(a)Mnk−2中の推定状の亜鉛部位の領域が、1σ(青)で描かれた2Fo−Fcマップと、5σで描かれたDANOマップとともにバックボーンプロットとして示されている。領域は、我々の結晶中で高度にフレキシブルであり、Trp305からGlu309までの領域は鮮明なバックボーン密度を欠いている。(b)I=ZnKα線、II=ZnKベータ、IIIコンプトン散乱、IV弾性散乱に対応するピークを有する、天然Mnk−2結晶のX線放射スペクトル。
図6:Mnk−2キナーゼドメインとp38との比較
A.同じ配向のMnk−2キナーゼドメイン(左)とp38(右;PDB ID1KV1)のリボンプロット。分子はN末端(青)からC末端(赤)まで七色に着色されており、その他のタンパク質キナーゼでも観察されるように、全て同じ構造的構成を示している。
B.2つのタンパク質の最適グローバルアライメント後のDFD/DFG領域の空間プロット。Mnk−2−石灰;p38−コムギ。DFD/DFGモチーフは、スティック形状で示されており、原子型でカラーコードされている(炭素(Mnk−2)−石灰;炭素(p38)−コムギ;酸素−赤;窒素−青)。Mnk−2のアスパルテート226と228は、ポリペプチド鎖の方向を示すようラベルを付されている。周囲を取り囲む構造要素はリボンで示されている。p38の非定型型DFG形態は、尿素ジアリール型の阻害因子の結合によって誘導される(図示せず;PDB ID1KV1と1KV2)。Mnk−2は、本発明の結晶中で自然に同じ形態に適合する。阻害因子の尿素ジアリールクラスはp38のDFGモチーフとヘリックスとの間で結合し、ヘリックスはバックグラウンド中に表れた。Mnk−2のDFDモチーフは、阻害因子結合ポケットに向かってさらに置き換えられ、阻害因子によって本発明の形態中に同様に捉えることができることを示唆している。
図7:Mnk−2キナーゼドメインに結合する阻害因子のモデル
A.ジアリール尿素ベースの阻害因子(1−(5−tブチル−2−メチル−2H−ピラゾール−3−イル)−3−(4−クロロフェニル)尿素;BMU;PDB ID 1KV1)との錯体であるMnk−2キナーゼドメインの外観。Mnk−2は、その二次構造要素(ヘリックス−赤、ストランド−青、ループ−グレイ)に従って示される。阻害因子1(炭素−オレンジ)、DFDモチーフ(炭素−ピンク)とその他の薬(炭素−シアン)に接触するMnk−2残基は、スティック形状で示される。モデルは、p38−BMU複合体(PDB ID1KV1)のCα原子位置と、Mnk−2キナーゼドメインのCα配位との最適なスーパーポジションによって作製される。MNU配置は、続いて、手動により示されたMnk−2キナーゼドメインの結合ポケットに適合させた。いくつかのMnk−2残基の側鎖形態も同様に不良接触を排除するよう適合させた。
B.Mnk−2キナーゼドメインのヌクレオチド結合ポケット中に配置されたDAPK1(PDB ID 1lG1)の共晶構造由来の、ATPアナログ(AMPPNP)の詳細な空間図。モデルは、Aで説明したような2つのタンパク質分子の最適なスーパーポジションによって作製された。標準結合モデル中のAMPPNP分子が、本発明の形態のMnk−2のDFDモチーフと立体的に干渉するように見える。この発見は、生産的なMnk−2へのATP結合がDFDモチーフ内での再配置を必要とすることを示唆する。その結果、本発明の形態において、Mnk−2は、ATP結合内において不活性であることが導き出される。別の分子とモチーフは、原子型ごとにカラーコードされている。炭素(AMPPNP)−オレンジ;炭素(DFD)−ピンク;窒素−青;酸素−赤;亜リン酸−石灰。A中に二次構造要素。
C.Mnk−2−BMU複合体モデルの詳細な空間図。BMUは、疎水性ポケットでt−ブチル基と結合し、Phe227(DFDモチーフ由来)とPhe159の芳香環の間のpクロロフェニル環をスライドさせる場合がある。別の分子とモチーフは、原子型ごとにカラーコードされている:炭素(BMU)−オレンジ;炭素(DFD)−ピンク;炭素(疎水性ポケット)−シアン;窒素−青;酸素−赤;塩素−緑。A中のような二次構造要素。
図8:立体的表現(a)と主要配列(b)におけるMnk−1の全構造。他に示さない限り、着色法は以下のスタイルに維持される。Nローブ:グレイ;Cローブ:黒;Cループ:黄;DFG/Dモチーフ:オレンジ;αCヘリックスとLys−Glu対:シアン;活性化セグメント:緑。(b)ATPと相互作用すると知られている残基をカラーコードでマークし、DFG/Ginポケットからなる残基:緑の白抜きの円;DFG/DOUTポケットからなる残基:赤の白抜きの円。Mnk固有のアミノ酸挿入部は、四角で囲まれ、官能性の適合性の高いMnk固有残基は、赤い矢印でハイライトしている。リン酸化部位は星印で示している。
図9:活性化セグメントにより誘導されたNローブ移動。Mnk−1(a)とMnk−2(b)の全構造。残基を含むMnk−1(a)は、NローブαC相互作用、Phe239とDFDモチーフに包含された。スティックで表されたPhe。Arg90とArg93は、亜リン酸アミノ酸と相互作用することが知られている残基に対応した(クリュッパ(Krupa)等の、J. Mol. Biol.(339)(2004)1025−1039)。Mnk−2(b)中で対応する残基は、Phe265、Arg123とArg125である。
図10:c−KIT(a,b)とMnk−1(C)における自動阻害c−KITの自動阻害JMドメインは赤で着色されている。
図11:(a)DAPL1(1ig1;(テレスコ(Tereshko)等の、Nat.Struct.Biol.(8)(2001)899−907));(b)Mnk−1;Mnk−2のATP結合ポケット。分子は図8のように同じ配向にあり、ATP結合領域が拡大されている。(a)は活性状態のCaMK群のタンパク質キナーゼを例示し、非クリーブ化ATPアナログANP−PNPと、Mg2+の代わりに官能部位においてMn2+を含む。マグネシウム結合DFGモチーフの許容可能なDFG/Dinポケット形態に留意。Mnk−1(b)とMnk−2のATP部位遮断は、阻害DFG/DOUT配座によって得られる。Mnk−1(b)は、酸−酸側鎖の相互作用がMnk−2中に存在しないことを示している。
図12:Mnk活性化カスケードモデル。
図13:DFDモチーフの近傍
(A)DFD領域とATP結合クレフトの拡大空間図。野生型Mnk2−KRのDFG/DOUT配座は、左上にAsp226、Phe227とAsp228に関して、Phe227とAsp228とがATP結合クレフト内に突き出した状態でスティックにより示されている(炭素、シアン)。DFG/DIN配座(右下;炭素、緑)は、Mnk2−KRのAsp228Gly突然変異体について観察されるように、その他のキナーゼに見られるDFG/DIN配座に従ってモデル化された。Mnk2−KRのバックボーントレースは、半透明なグレイのチューブで示される。DFG/DINまたはOUT配座いずれかにおけるDFDモチーフ周囲の径4Å内の残基は、スティックで示されている(炭素、グレイ)。DFG/DOUT配座を安定化する、タンパク質マトリックスとの直接的な相互作用は、点線で示されている。Phe227は、2つの異なる疎水性ポケット中に2つの異なる配座で存在するようになる。DFG/DIN配座の適合に対する障害は見えない。
(B)((A)におけるのと同様にカラーコードされている)スティックで示されたDFDモチーフの2つの配座をともなう、静電ポテンシャルごとにカラーコードされたMnk2−KRの分子構造の空間図(青、正電荷;赤、負電荷)。ATP結合クレフトが指摘されている。いずれかの配座にあるAsp228は、水溶性溶媒を良好に利用可能である。DFG/DOUT配座は、ATP結合クレフト中にPhe228とAsp228を位置するだけでなく、このクレフトの前からのアクセスを遮断する。分子は、DFDポケット中への遮断されていない図を得るために、水平軸(N末端ローブから後ろ)について、(A)に対して30°回転されている。
(C)DAPK1との共晶構造(PDB ID 1IG1)に見られるようにスーパーインポーズされた、非加水分解性のATPアナログ(アデノシン5’−[β,γ−イミド]三リン酸[AMPPNP]);炭素、ベージュ、亜リン酸、紫)による(A)におけるのと同じ図。DFG/DOUT配座において、アデノシン塩基はPhe227の側鎖とクラッシュし、リン酸基はAsp228の側鎖とクラッシュする。
(D)DFG/DOUT配座のみが示された、(A)と(C)におけるのと同じ図。p38−BMU阻害複合体(PDB ID 1KV1)のDFG領域は、タンパク質構造のグローバルスーパーポジション後に見られるように、比較目的で示されている(マジェンタ色のチューブ;スティックで示されたDFG;炭素、マジェンタ色)。BMU阻害因子(炭素、ベージュ;塩素、緑)は、DFG/DIN結合ポケットの部分をふさぎ、p38中にDFG/DOUT配座を誘導する。
表1:ヒトMnk−2の原子配位を示す。
表1a:ヒトMnk−2突然変異D228Gの原子配位を示す。
表2:ヒトMnk−1の原子配位を示す。
表3:ヒトMnk−2キナーゼ突然変異D228Gと一般的なタンパク質キナーゼ阻害因子スタウロスポリンとの共結晶の原子配位を示す。
Mnk−2とMnk−1キナーゼ領域のクローニングと精製
従来既知の技術を用いて、アミノ酸残基72〜385に対応し、キナーゼドメイン(KD)を包含するヒトMnk−2のcDNAフラグメントを、F(forward)/R(reverse)プライマー対5’CGGGATCCACCGACAGCTTCTCGGGCAGG / 5’ACGCGTCGACCTACCTCTGCAGGACCATGGGAG (利用した限定部位は下線部)を用いて増幅し、ベクターpGEX−4T1のBamHiとSall部位中にクローン化した(アマーシャム(Amersham)の、スウェーデン、cat.no.27−4580−01)。この構築により、N末端を有する融合タンパク質、トロンビンクリーブ可能なグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)タグとしてのMnk−2キナーゼ領域(KR)の原核細胞発現が可能となる。
2.結晶化とデータ収集
初期結晶スクリーニングは、100μl貯留溶液と、200nl〜1μlの範囲の液滴寸法とを用いる96ウェルフォーマット中でMicroSys SQシリーズ4000/4100(デカルト分配システム(Cartesian Dispensing Systems))により実施した。回折研究に用いた結晶は、20℃で懸滴または座滴のいずれかを用いて拡散蒸着によって成長させた。タンパク質溶液は、タンパク質溶液の10倍を超える量までの貯留バッファ(100mMNa−Hepes、pH7.8、22%ポリアクリル酸5100と2%2,3−メタンペンタジオール(MPD))と混合した。結晶は、液体窒素中で凍結させた。回折データは、Mar−Research(ノルデステット(Norderstedt)、ドイツ)CCD検出器の100Kおよびλ=1.05で、HASYLABビームラインBW6(DESY、ドイツハンブルグ)上に回収し、HKLパッケージ(オトウィノスキ・ゼット(Otwinowski,Z)とマイナー・ダブリュー(Minor,W)の、オシレーションモードにおけるX線開設データの処理、Methods Enzymol. 167, 307-326, 1997年9月)で処理した。
3.構造決定と精製
初期相は、研究モデル(PDB ID:1lG1)として死亡関連タンパク質キナーゼ(DAPK)を用いたCCP4パッケージ(Collaborative Computational Project, The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography. Acta Cryst. D 50, 760-763, Dec 1994年)からのMolRep自動化分子置換ルーチンを用いて得た。相情報を有するmtz形式のファイルを、REFMAC(Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Lebedev, A., Wilson, K. S.とDodson, E. J.のFFTを用いた効率的な分子構造の異方性精製、Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 55 (Pt 1), 247-255,1999年1月)中で剛性体精製を用いて作製し、arp/warpによる自動化モデルの構築(Morris, R. J., Perrakis, A.とLamzin, V. S. ARP/wARPとタンパク質電子密度マップの自動翻訳;Methods Enzymol. 374, 229-244 (2003年))に用いた。得られたモデルは、Xフィット(McRee, D. E.の、原子座と電子密度を操作するためのXtalView/Xfit-Aバーサタイルプログラム;J. Struct. Biol. 125(2-3), 156-165, 1999年4月)を用いて手動でさらに変更した。精製は、CNS(Brunger, A. T., Adams, P. D., Clore, G. M., DeLano, W. L., Gros, P., Grosse-Kunstleve, R. W., Jiang, J. S., Kuszewski, J., Nilges, M., Pannu, N. S., Read, R. J., Rice, L. M., Simonson, T.およびWarren, G. L.の、結晶学とNMRシステム:マクロ分子構造決定に適した新しいソフトウェア、Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 54 (Pt 5), 905-921, 1998年9月)とREFMAC(Murshudov, G. N.等, 1999年、上記参照)を用いて実施した。
4.ゲルろ過と光散乱
Superdex75PC3.2/30カラム(ファーマシア(Pharmacia)製)を用いてSMARTシステムによりゲルろ過クロマトグラフィを実施した。実験は、バッファA(20mMトリスHCl、pH7.5、100mMNaCl、1mMDTT)中で0.04ml/分の流速において室温で行った。Mnk−2KDの分子量は、基準タンパク質(Bio−Rad)を用いて推定した。マルチアングルレーザ光散乱を、UV分光計と、ドーンとオプチラブ(Dawn and Optilab)計器XY(ワイアットテクノロジー社(Wyatt Technology Corp.))に接続したHR−10/30Superdex−200サイズの排除カラム(アマーシャム)で行った。30μmのMnk−2a溶液を、バッファA中で、632.8nm、90度におけるUV吸収、光散乱で、クロマトグラフィによって分離し、溶出プロファイルの屈折差はASTRAソフトウェアパッケージ(Wyatt, P.のマクロ分子の光散乱と絶対化学分析:Anal. Cim. Acta 272, 1-40 (1993年))で監視し、分析した。
Mnk−2特異阻害因子設計のために誘導されたp38−ジアリール尿素阻害因子共晶構造
タンパク質キナーゼp38の構造は、全体的に、Mnk−2キナーゼドメインの構造に非常に類似している(図1A)。p38は、ATP結合ポケット中の典型的なDFG配列モチーフを特徴付ける。ジアリール尿素足場に基づくp38特定の阻害因子を設計し、p38のこれら2つの阻害因子(BMUとBIRB796、(Pargellis et al. (2002年), Nat. Struct. Biol. 9, 268-272))との共晶構造を解明した(PDB Ids 1KV1と1KV2のそれぞれ)。これらの阻害因子は、p38の非カノニカル形DFG配座(DFGOUTと称す)を誘導し、この配座においては、フェニルアラニンは疎水性ポケットにおけるその標準位置から置き換えられており(DFGINと称す)、アポ酵素とその他タンパク質キナーゼ構造中に存在する(図1B)。DFGモチーフのDFGOUT配座は、立体障害により生産的ATP結合と干渉する。
Mnk−1−KRの構造決定および全構造
野生型Mnk1−KRの針状結晶を、タンパク質溶液を等容量の20%(w/v)PEG3350と0.2M硫酸アンモニウムと0.1Mクエン酸ナトリウムを含有するpH5.4の貯留溶液とを混合後の拡散蒸着により、20℃で成長させた。結晶は、20%のグリコールで補った貯留溶液中で凍結させた(液体窒素)。回折データを、ビームラインPXII(SLS、ビリンゲン(Villingen)、スイス)に対して、MarResearch(ノルダーシュテット(Norderstedt)、ドイツ)CCD検出器における100Kで収集し、HKLパッケージ(オトウィノスキ・ゼット(Otwinowski,Z)とマイナー・ダブリュー(Minor,W)、1997年)で処理した(表2参照)。
Claims (12)
- 空間群P43212と、a=93.5Å、b=93.5Åおよびc=175.2Åであるユニットセル寸法を有する、野生型ヒトMnk−1キナーゼの残基37−341からなる断片である、結晶ヒトMnk−1キナーゼ。
- 前記ヒトMnk−1キナーゼがキナーゼドメインを含む、請求項1記載の結晶ヒトMnk−1キナーゼ。
- 前記ヒトMnk−1キナーゼが不活性形態である、請求項1又は2に記載の結晶ヒトMnk−1キナーゼ。
- 単結晶である、請求項1から3のいずれかに記載の結晶ヒトMnk−1キナーゼ。
- 表2に示す構造配座によって決定される三次元構造を有する、請求項1から4のいずれかに記載の結晶ヒトMnk−1キナーゼ。
- 不活性なヒトMnk−1キナーゼの結晶構造を有する、請求項3に記載の結晶ヒトMnk−1キナーゼ。
- (i)細胞中のヒトMnk−1キナーゼを発現すること、
(ii)粗Mnk−1キナーゼ調製物を回収するために細胞を溶解すること、
(iii)粗Mnk−1キナーゼ調製物を精製すること、
(iV)精製したヒトMnk−1キナーゼを結晶化すること、
を含み、前記結晶が拡散蒸着によって成長される、請求項1から6のいずれかに記載の結晶ヒトMnk−1キナーゼ調製物の製造方法。 - 前記ヒトMnk−1キナーゼがアミノ酸残基37−341を有するMnk−1キナーゼフラグメントであることを特徴とする、請求項7記載の方法。
- 前記Mnk−1キナーゼが、大腸菌中の融合タンパク質として発現される、請求項7または8記載の方法。
- 前記Mnk−1キナーゼが、融合タグに結合するカラムを用いて精製される、請求項7から9のいずれかに記載の方法。
- ヒトMnkキナーゼの結晶構造データを生成するための、請求項1から6のいずれかに記載のまたは請求項7から10のいずれかに記載の方法によって得られたヒトMnk−1キナーゼの結晶調製物の使用。
- 配位子、基質および/または阻害因子の結合部位を決定するための、請求項11記載の使用。
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