CN1178553A - 通过将编码肌球蛋白重链sm1同型蛋白的dna整合到载体dna中而制备的重组dna,含有该重组dna的微生物和治疗动脉硬化的药剂 - Google Patents

Abstract

通过将编码平溶肌型肌球蛋白的重链SM₁同型蛋白整合入载体DNA所制备的重组DNA,携带该重组DNA的微生物和包含该重组DNA的用于治疗动脉硬化的药剂。该DNA可用作治疗PTCA治疗后再狭窄的基因药物。

Description

通过将编码肌球蛋白重链SM1同型蛋白的DNA整合到载体DNA 中而制备的重组DNA，含有该重组DNA的微生物和治疗动脉硬化 的药剂

技术领域

本发明涉及包含插入至载体DNA中的编码肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白DNA的重组DNA，携带该重组DNA的微生物和一种用于基因治疗的包含该重组DNA的动脉硬化治疗药剂。

背景技术

平滑肌类型的肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白负责平滑肌的收缩和松弛，并且是一种在平滑肌细胞中特异表达的肌球蛋白重链同种型蛋白。对于编码该蛋白的DNA来说，编码兔SM₁同种型cDNA的核苷酸序列(P.Babij等.：美国国家科学院院刊.88，10676(1991))是已知的，但是对这类DNA核苷酸序列间的任何同源性尚属未知。进而，迄今也无人知晓包含插入载体DNA的编码平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白DNA的重组DNA以及该重组DNA能被注射到动物细胞。

现已报道：存在于平滑肌细胞中的calponin蛋白其cDNA被导入大鼠肺动脉来源的血管平滑肌细胞系并表达时，细胞倍增时间延长大约4小时(Takahashi等：循环，88，I-174(1993))。当人calponin cDNA注入兔局部位点，该处颈动脉已经气囊擦伤，此时内膜的增厚被抑制(Takahashi等：循环，88，I-656(1993))。对包括插入载体DNA的编码肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白DNA的重组DNA具有药理学效应并可用于基因治疗则无报道。

动脉硬化的治疗，经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)是用气囊导管使狭窄部位扩张，此途径已获广泛应用。这种治疗方法的优点是易于操作，成功率高于建立旁路的外科手术途径等，但其缺陷在于30-40％的病人治疗后由于血管内细胞的异常增殖而重新发生狭窄。因此这就需要一种有效治疗动脉硬化的药剂来防止这类再狭窄的发生。

发明公开

本发明包括：(1)重组DNA，其包括插入至载体DNA中的编码平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白的DNA。(2)根据(1)的重组DNA，其中载体DNA是逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体或能在动物中表达的质粒。(3)根据(2)的重组DNA，其中能在动物中表达的质粒是PCXNZ或PAGE208。(4)根据(1)-(3)的任何一种的重组DNA，其中平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白是人平滑肌类型、兔肌类型或小鼠肌类型。(5)根据(1)-(3)的任何一种的重组DNA，其中编码平滑肌类型的肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白之核苷酸序列显示在SEQ ID NO：1或核苷酸序列如SEQ ID NO：1中所示，但其中至少有一个核苷酸被添加、缺失或替代。(6)编码平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白的DNA，其核苷酸序列显示在SEQ ID NO：1或显示在SEQ ID NO：1的核苷酸序列中，但其中至少一个核苷酸被添加、缺失或替代。(7)携带(5)述及的重组DNA的微生物。(8)根据(7)的微生物，该微生物属于大肠杆菌属。(9)治疗动脉硬化的药剂，包括(1)-(5)任一项中述及的重组DNA。

编码平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白的DNA，包括编码平滑肌肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白的cDNA或基因组DNA，优选来自人、兔、小鼠等的DNA。

编码平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白的DNA的核苷酸序列包括兔SM₁同种型蛋白cDNA的核苷酸序列(美国国家科学院院刊88，10676(1991))，如SEQ ID NO：1所示的编码小鼠肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白的DNA的核苷酸序列，和在SEQ ID NO：2所显示的核苷酸序列，其为上述两核苷酸序列之间的同源区所详细列明)在序列表中Y代表T、U或C；S代表G或C；V代表A、G或C；B代表G、C、T或U；W代表A、T或U；N代表A、C、G、T、U或一种单键；密码子YAS(388-390)代表TAC或CAG。因此，在SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列含有SEQ ID NO：1的核苷酸序列和编码兔SM₁同种型蛋白的cDNA的核苷酸序列。现已知编码人平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白cDNA的部分核苷酸序列(美国医学遗传学杂志46，61-67(1993))，根据本发明此部分核苷酸序列与SEQ ID NO：2的部分核苷酸序列结合而成的核苷酸序列也包含在编码平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白的核苷酸序列之中。

进而，根据本发明显示SEQ ID NO：2的核苷酸序列或SEQ ID NO：2的部分核苷酸序列和来自人平滑肌DNA的核苷酸结合，其中一或多个核苷酸经定点突变被添加、缺失或替代(核酸研究10，6487-6508(1982))，也包含在编码平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白DNA的核苷酸序列中。

能使用的DNA载体包括病毒载体，例如逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺伴随病毒载体以及能在动物中表达的质粒如PCXN2(基因，108，193-200(1991))和PAGE207(日本专利公开46841/1994)以及它们的修饰载体。

根据本发明：治疗动脉硬化的药剂通过包括插入载体DNA中的编码平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白作为活性组分和基因治疗使用的基料(base)共同组成。在用药前，药用制剂可用于动脉硬化的基因治疗，若需要可在脂质体中形成胶囊等等后再用药(美国国家科学院院刊，90，11307(1993))。

编码平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白的DNA插入病毒载体，治疗性制剂便可制备出含有重组DNA的病毒颗粒，于是它们和基因治疗使用的基料一起复合。

要基因治疗的药剂中使用的基料是一般在注射中使用的任何一种基料。基料包括如：蒸馏水、氯化钠盐溶液、氯化钠和无机盐混合物或加甘露糖醇溶液、乳糖溶液、葡聚糖溶液、葡萄糖溶液等；氨基酸溶液如甘氨酸、精氨酸等；有机酸的混合溶液或葡萄糖和盐溶液及类似物。进而，注射剂以通常方式制备成溶液，悬液或经添加辅药如渗透压控制试剂，pH值调节剂、植物油如芝麻油、豆油等，或表面活性剂如卵磷脂、无离子表面活性剂等加至上述基料中。这些注射剂可被粉化、冷冻干燥等，恰在使用前溶解。

治疗动脉硬化的制剂可在溶液状态使用，就固体而言，其被溶于事先灭菌的基料中，如果必需，只在用于基因治疗时才溶解。

根据本发明治疗动脉硬化制剂的用法包括对已行PTCA治疗的病人行局部给药，剂量1ng至1g/日或外科手术后经导管注入等，由此被吸收到靶点处的血管平滑肌细胞。

根据本发明治疗动脉硬化所用制剂在本剂量范围内是安全的。

由此，对产生包括插入到载体DNA中编码平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白重组DNA的方法加以描述。

包括插入载体DNA中的编码平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白的重组DNA可以通过以下常用的遗传工程方法或其修饰的方法获得。

编码平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白的DNA克隆采用A.，Abe等的方法(ECL直接DNA标记检测系统指南(Amersham))，可在主要由平滑肌组成的子宫、主动脉等组织的cDNA文库中检测。

包括插入的编码肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白的DNA的重组DNA，可通过将该DNA片段连接至适当的载体DNA启动子的下游区而产生(J.Sambrook等，分子克隆，第二版；卷1，冷泉港实验室出版社(1989))。以动物细胞作为宿主，以来自SV40的启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子等作为启动子。为了表达，使用增强子也是有效的。

上述重组技术的反应条件如下：用限制酶消化DNA，限制酶量为0.1-100单位，优选1-3单位/μgDNA作用于0.1-200μgDNA，在反应液中通常含2-200mM Tris-HCl缓冲液，优选10-40mM；pH6.0-9.5，优选7.0-8.0。氯化钠0-200mM，氯化镁2-20mM，氯化镁优选5-10mM；温度20-70℃(最适温度的变化取决于所使用的限制酶)时间15分钟-24小时。反应液达55-75℃，5-30分钟终止反应或用试剂如酚等使限制酶失活。经限制酶消化产生的DNA片段或有缺口的双链DNA，用Prep-A-Gene Matrix(Bio-Rad)纯化，用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.)完成DNA片段的连接。

包含编码平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白的重组DNA以这种方法构建成功，用来产生转化子。

在动物中能表达质粒的宿主如属于大肠杆菌属的微生物，其中大肠杆菌K12·HB101(H.W.Boyer等：分子生物学杂志，41，459(1969))，DH5α(D.Hanahan：分子生物学杂志，166，557(1983))等。大肠杆菌属微生物转化采用Cohen等的方法(S.N.Cohen等：美国国家科学院院刊，69，2110(1972))。

病毒载体使用的宿主包括有产生病毒能力的动物细胞如猴细胞COS-7，中国仓鼠细胞CHO，小鼠细胞BALB/3T3，人细胞HeLa等；逆转录病毒载体的宿主包括ψCRE，ψCRIP(美国国家科学院院刊，85，6460(1988))，MLV(病毒学杂志，65，1202(1991))等；腺病毒载体和腺伴随病毒载体的宿主包括来自人胎儿肾的293细胞(“JikkenIgaku”(实验医学)，12，316(1994))等。病毒导入动物细胞使用磷酸钙法(病毒学52，456(1973))等。

产生的转化细胞可依以下方法培养，该方法取决于细胞于细胞种系产生重组DNA的方式的差异。

培养来自大肠杆菌属微生物的转化子作为宿主适宜的培养液是一种液体培养液，它包含转化子生长必须的碳源、氮源、无机物等。碳源包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、庶糖、甘油等；氮源包括铵盐、蛋白胨、酪蛋白等和无机物包括氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁等，进一步可加入酵母提取物、维生素等。培养液优选pH5-8。培养大肠杆菌属的微生物，培养液优选Terrific肉汤(K.D.Tartof等：Bethesda研究和实验，9，12(1987))或类似物。转化子通常在15-43℃培养大约8-24小时，若需要则行通气或摇动。培养完成后，包含编码平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白DNA的重组DNA经Birnboim法(核酸研究，7，1513(1979))等纯化而获得。

培养来自动物细胞的转化子作为宿主，使用的培养液包含约5-20％胎牛血清，培养液如199培养液(Morgan等；生物医学学会会报，73，1(1950))，MEM培养液(H.Eagle：科学122，501(1952))，DMEM(R. Dulbecco等：病毒学，8，396(1959))或类似物。pH值优选6-8。转化子通常培养在30-40℃约18-60小时，必要时通气或摇动。

由于包含重组DNA的病毒颗粒释放到培养上清液中，因此含有编码平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白的DNA可经浓缩上清液和氯化铯离心法(Koji sawada等：“Shin Seikagaku Jckken Kouza 2-V”(新生化进程2-V)，33(1992))，聚乙二醇沉淀法(病毒学报，71，185)(1982))，过滤浓缩法(细胞生物学杂志，111，217(1990))，等从上清液中获得。

附图简述

图1.示编码小鼠平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白cDNA的限制酶图谱和编码区的定位。质粒名：SM-1F text质粒大小：6175 bp框中的区域：编码区A：ApaIB：BamHISa：SacISm：SmaI

图2.示质粒pSE-SM₁-Hyg导入后用潮霉素筛选的CHO细胞集落面积和质粒PAGE 208导入后CHO细胞集落面积对比。

图3.示质粒pSE-SM₁-Hyg导入后用潮霉素筛选的Hela细胞集落面积和质粒PAGE 208导入后HeLa细胞集落面积对比。

图4.示MTT法比较CHO细胞的野生型、PAGE 208导入的克隆和SM₁同型表达克隆(SM₁-5-2-1，SM₁-5-3-3)的增殖率。-O-CHO-Δ-PAGE 208-1-●-SM₁5-2-1-■-SM₁5-3-3

图5.示SM₁基因导入(实施例)和β-半乳糖苷酶基因导入(对比例)气囊损伤兔模型的血管壁之后内膜的增厚程度。

实现本发明的最好方式

下文将更详细地引用不用于限制本发明范围的实例来描述本发明。实施例1.包括插入载体DNA中的编码小鼠平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白DNA的重组DNA(a)探针的制备

使用质粒pSMHC29和pIH61，其中编码兔平滑肌类型肌球蛋白重链SM2同种型蛋白cDNA片段已被克隆(生物化学杂志，264，9734-9737(1989))。这些质粒用EcoRI(Takara Shuzo有限公司的产品，除非特别说，下面所用的限制酶都是Takara Shuzo有限公司的产品)消化以制备将被插入的兔平滑肌类型肌球蛋白重链SM2同种型蛋白的cDNA片断。cDNA片段用ECL直接DNA标记系统(Amersham)标记，用来作为以下筛选的探针。(b)筛选

λgtll载体小鼠子宫cDNA文库(Clontech)与大肠杆菌Y 1090(Clontech)混合，于37℃培养15分钟，接着添加0.7％琼脂糖NZY(核酸研究，16，7583-7600(1988))，涂布在1.5％琼脂NZY平板上。尼龙膜放于平板上，平板上出现的噬斑由此转移至膜上。此膜经碱处理变性和80℃加热2小时将DNA固定。DNA与上述(a)中ECL直接DNA标记系统方法事先标记的探针杂交，然后杂交了的克隆用ECL检测系统(Amersham)放射自显影检测。(c)DNA核苷酸序列的分析

共鉴定出4个克隆，每个克隆被亚克隆于pUC119(Takara ShuzoCo.，Ltd)或pBluescript SK(-)(Stratagene)中供分析DNA核苷酸序列。大肠杆菌DH5α用产生的质粒转化形成转化子大肠杆菌属大肠杆菌DH5α/pmsmhc20，pmsmhcC5，pmsmhcN08和pmsmhcN14。经转化子产生的质粒用外切酶消化使之发生分步缺失或用适当的限制酶消化接着自身环化或亚克隆制备模板DNA，进行序列分析(基因，28，351-359(1984))。荧光型DNA序列仪(Applied Biosystems)用于测序，MacMolly(Soft Gene GmbH)用于资料分析，被测定的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：1中，由核苷酸序列推断的氨基酸序列也显示在SEQ IDNO：1中。(d)小鼠平滑肌类型肌球蛋白重链同种型蛋白基因表达质粒的构建

从以前获得的4个克隆中，质粒pmSM₁包含SM₁同种型全编码区的cDNA按下列方法制备(J.Sambrook等，分子克隆，第2版，卷1，冷泉港实验室出版，1989)。为缩短5′非编码区，质粒pmsmhcN14即4个克隆之一用限制酶BamHI和BglII消化，因此5kb DNA片段被纯化和回收。该DNA片段自身环化和转化大肠杆菌DH5α产生氨苄抗性菌落。自菌落中挑取期望的微生物并培养，用已知方法回收质粒DNA(H.C.Bimboim等：核酸研究，7，1513(1979))。由此得到的质粒结构用BamHI和KpnI消化后，经琼脂糖电泳确认。该质粒被称为pmsmhcN14′。

得到的质粒pmsmhcN14′用限制酶NsiI(New England Biolabs)及EcoRV消化，由此4kb DNA片段被纯化和回收。此外，质粒pmsmhcN08也分别使用NsiI和EcoRV消化，1kb DNA片段被纯化和回收并连接到以前获得的来自质粒pmsmhcN14′的4kb DNA片段上，构建成质粒pmsmhcN14-08。该质粒用NSiI和EcoRV消化确认。所产生的质粒pmsmhCN14-08用限制酶ApaI和KpnI消化，5kb DNA片段被纯化和回收。质粒pmsmhc20也用Apai和Kpni以相似方法消化，1.5kb DNA片段被纯化、回收并连接到以前获得的5kb DNA片段上，构建成质粒pmsmhcN14-08-20，该质粒用ApaI及KpnI消化确认。

所产生的质粒pmsmhcN14-08-20用限制酶ApaI消化，由此纯化和回收所产生的6kb DNA片段。质粒pmsmhcC5也用ApaI消化，纯化和回收其2kb DNA片段连接到来自pmsmhcCN14-08-20的6kb DNA片段中，由此构建成质粒pmsmhcN14-08-5-20，该质粒用EcoRI和NruI消化确认。

质粒pmsmhcN14-08-5-20用限制酶NsiI和NruI消化，8kb DNA片段被纯化和回收。质粒pmsmhcN08也用相似的方法NsiI和NruI消化，1.5kb DNA片段被纯化、回收和连接到以前获得的8kb DNA片段上。由此包含小鼠平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型的全编码区的质粒pmSM₁构建完毕。该质粒用NsiI和NruI消化确认。

所产生的质粒pmSM₁用限制酶XbaI和KpnI消化，纯化和回收6kbDNA片段。另外，来自表达载体PAGE 207(日本专利公开NO.46841/1994)的表达载体PAGE 208删除了PAGE 207中潮霉素B抗性基因启动子区中定位的SmaI位点，用XbaI和KpnI消化、纯化、回收的6kb DNA片段连接到先前从质粒pmSM₁衍生的6kb DNA片段上，由此构建了表达质粒pSE-SM₁-Hyg，该质粒的结构通过用XbaI和KpnI消化来确认。

质粒pmSM₁用XbaI和KpnI消化获得的DNA片段，使用DNA平端试剂盒(Takara Shuzo CO.，Ltd.)使末端平齐。此外，表达载体PCXN₂用XhoI消化，用DNA平末端试剂盒使末端平齐。这两种DNA连接构建表达质粒PCAG-SM₁，该质粒的结构用BglII消化确认。

上述质粒pSE-SM₁-Hyg插入大肠杆菌，由此获得转化子。

转化子大肠杆菌pSE-SM₁-Hyg(FERM BP-4974)自1995年1月24日起存放到国立生物科学和人类技术研究所、工业科学和技术院，日本茨城县筑波市东1区1条3号。实施例2.SM₁同种型在CHO细胞和HeLa细胞中表达对细胞增殖的作用

表达质粒pSE-SM₁-Hyg 2μg和脂转染胺试剂(Lipofectamine^(TM)(Gibco))4μl混合，孵育15分钟形成复合物。复合物加入CHO或Hela细胞中37℃孵育5小时以致基因被导入细胞。细胞被稀释并铺在器皿中，在潮霉素(hygromycine^(TM)(sigma)存在条件下选择已导入基因的细胞。大约10天后，药物抗性细胞集落用考马氏蓝^(TM)(Bio-Rad)染色，用影像分析仪测定它们的面积。结果表明：许多集落的面积小于导入对照载体PAGE208的集落，故说明它们的增殖受到SM₁同种型表达的抑制(附图2和3)。另外，克隆具有潮霉素抗性的CHO细胞和检查所形成的克隆SM₁-5-2-1和SM₁-5-3-3的增殖率，结果表明它们的增殖率较野生型或PAGE208导入细胞低(附图4)。实施例3.强制导入SM₁基因至气囊损伤兔模型血管壁对内膜增厚的抑制作用

3弗伦奇(Fr)的PTCA导管在X光下经股动脉进入重2.4-3.2kg日本白家兔的右侧颈总动脉。右颈总动脉用以10个大气压扩张的气囊擦伤3次，以损伤血管壁。擦伤后3天，血管损伤部分用300mgPCAG-SM₁和脂转染试剂(lipofectin(Gibco BRL))的混合物经Wolinsky型灌注导管(BARD产品)以6个大气压注入。对比的实例，另一些家兔经同样方法处理，以β-半乳糖苷酶表达载体取代PCAG-SM₁，导入血管的损伤部位。

注入3日后，动物用肝素生理盐水灌注致死，分离右侧颈总动脉并切薄，接着加入1ml ISOGEN(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd)，组织用Polytron匀浆器匀浆。总RNA按照AGPC法提取(P.Chomczynski and N.Sacchi分析生物化学，162，156-159(1987))，SM₁的mRNA用RT-PCR法扩增。来自实施例(导入SM₁基因)和对比例(导入β-半乳糖苷酶基因)的扩增的DNA和用限制酶NheI消化的片段进行琼脂糖凝胶电泳。SM₁带在实施例中明显而在对比例中微弱，并且仅在实施例中的带能被NheI消化。这就支持小鼠来源的SM₁基因在实施例中表达，因为限制酶的消化位点不存在于来自家兔SM₁的DNA中，但存在于小鼠SM₁的DNA中。

基因导入之后2周，兔用含2％多聚甲醛的PBS灌注致死并固定，分离其右侧颈总动脉。灌注导管导入的部分被解剖出来并用石蜡包埋，制备出薄的血管横断面切片。一根血管平分成4块组织，每块组织制备出一张切片，苏木精-伊红染色。血管以内弹力板(plate)为界分成内膜和中膜并测定其各自的面积。对每张切片测定其内膜与中膜面积的比率并计算出均值，使用均值判定内膜增厚的程度。从3只实施例动物和3只对比例动物内膜增厚程度的判定，确认血管内膜增厚由于SM₁基因的强行导入而受到抑制。

本结果提示质粒pSE-SM¹-Hyg和PCAG-SM¹具有抑制细胞增殖的作用，对由于血管细胞异常增殖造成的动脉硬化再狭窄是有效果的。产业的适用性

现已表明：根据本发明当包括插入至载体DNA的编码平滑肌类型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白DNA的重组DNA在动物细胞中表达时，可抑制动物细胞的增殖。这种作用在人源HeLa细胞中也被观察到。因此，本发明的重组DNA能有效地作为用于PTCA处理后再狭窄的基因治疗制剂。

                        序列表SEQ ID NO：1序列长度：6175序列类型：核酸链型：双拓扑结构：线性分子类型：cDNA至mRNA来源生物体：小鼠特征信号指示特征：CDS位置：105，6023确定特征的方法：E信号指示特征：成熟肽位置：105，6023确定特征的方法：S序列描述：AGATTTGGAC CATCCCAGCC TGGGATCAGT GCCAGATCCG AGCTCTCCAT CCGGTGTCCT   60CCTGCTAATC CACCCCCGGA GTAGATCTGG GACCACCAGA CATC ATG GCG CAG AAA   116

                                             Met Ala Gln Lys

                                               1GGG CAG CTC AGC GAT GAT GAG AAG TTC CTC TTT GTG GAT AAA AAC TTC    164Gly Gln Leu Ser Asp Asp Glu Lys Phe Leu Phe Val Asp Lys Asn Phe5              10                      15                  20ATG AAC AGC CCA ATG GCT CAG GCC GAC TGG GTA GCC AAG AAG CTG GTG    212Met Asn Ser Pro Met Ala Gln Ala Asp Trp Val Ala Lys Lys Leu Val

             25                  30                  35TGG GTC CCT TCA GAG AAG CAG GGC TTC GAA GCA GCC AGC ATC AAG GAG    260Trp Val Pro Ser Glu Lys Gln Gly Phe Glu Ala Ala Ser Ile Lys Glu

         40                  45                  50GAG AAG GGC GAT GAG GTG GTC GTG GAG TTG GTG GAA AAT GGA AAG AAG    308Glu Lys Gly Asp Glu Val Val Val Glu Leu Val Glu Asn Gly Lys Lys

     55                  60                  65GTC ACA GTT GGC AAA GAT GAC ATC CAA AAA ATG AAC CCA CCC AAG TTC    356Val Thr Val Gly Lys Asp Asp Ile Gln Lys Met Asn Pro Pro Lys Phe

 70                  75                  80TCT AAG GTG GAG GAC ATG GCA GAG CTG ACG TGC CTC AAT GAG GCC TCT    404Ser Lys Val Glu Asp Met Ala Glu Leu Thr Cys Leu Asn Glu Ala Ser85                  90                  95                 100GTG CTG CAC AAC CTG AGG GAG CGA TAC TTC TCA GGC CTC ATC TAT ACC    452Val Leu His Asn Leu Arg Glu Arg Tyr Phe Ser Gly Leu Ile Tyr Thr

            105                 110                 115TAC TCT GGC CTC TTC TGT GTG GTG GTC AAC CCC TAC AAG TAC CTA CCC    500Tyr Ser Gly Leu Phe Cys Val Val Val Asn Pro Tyr Lys Tyr Leu Pro

        120                 125                 130ATC TAC TCA GAA AAG ATC GTG GAT ATG TAC AAG GGC AAG AAG AGG CAT    548Ile Tyr Ser Glu Lys Ile Val Asp Met Tyr Lys Gly Lys Lys Arg His

    135                 140                 145GAG ATG CCG CCT CAC ATC TAT GCC ATT GCC GAC ACA GCC TAC AGA AGC    596Glu Met Pro Pro His Ile Tyr Ala Ile Ala Asp Thr Ala Tyr Arg Ser

150                 155                 160ATG CTA CAA GAT CGT GAA GAC CAG TCC ATT CTG TGC ACA GGT GAG TCT    644Met Leu Gln Asp Arg Glu Asp Gln Ser Ile Leu Cys Thr Gly Glu Ser165                 170                 175                 180GGA GCC GGA AAG ACA GAG AAC ACA CAG AAA GTC ATA CAG TAC TTG GCT    692Gly Ala Gly Lys Thr Glu Asn Thr Gln Lys Val Ile Gln Tyr Leu Ala

            185                 190                 195GTG GTG GCG TCC TCC CAC AAG GGC AAG AAA GAC AGC AGC ATC ACG GGG    740Val Val Ala Ser Ser His Lys Gly Lys Lys Asp Ser Ser Ile Thr Gly

        200                 205                 210GAG CTG GAA AAG CAG CTT CTA CAG GCA AAC CCA ATC CTG GAG GCT TTC    788Glu Leu Glu Lys Gln Leu Leu Gln Ala Asn Pro Ile Leu Glu Ala Phe

    215                 220                 225GGC AAT GCG AAA ACC GTC AAG AAC GAC AAC TCC TCT CGC TTT GGC AAG    836Gly Asn Ala Lys Thr Val Lys Asn Asp Asn Ser Ser Arg Phe Gly Lys

230                 235                 240TTC ATT CGC ATC AAC TTC GAT GTC ACT GGT TAC ATT GTA GGT GCC AAT    884Phe Ile Arg Ile Asn Phe Asp Val Thr Gly Tyr Ile Val Gly Ala Asn245                 250                 255                 260ATT GAA ACA TAT CTT CTG GAA AAG TCT AGG GCT ATT CGA CAG GCT AGG    932Ile Glu Thr Tyr Leu Leu Glu Lys Ser Arg Ala Ile Arg Gln Ala Arg

            265                 270                 275GAT GAG AGA ACA TTT CAC ATC TTC TAC TAC CTG CTC GCC GGA GCC AAG    980Asp Glu Arg Thr Phe His Ile Phe Tyr Tyr Leu Leu Ala Gly Ala Lys

        280                 285                 290GAA AAG ATG AAA AGT GAC CTG CTT TTG GAG AGC TTC AAC AGC TAC ACA   1028Glu Lys Met Lys Ser Asp Leu Leu Leu Glu Ser Phe Asn Ser Tyr Thr

    295                 300                 305TTT TTA TCC AAT GGC TTT GTG CCC ATC CCA GCT GCA CAA GAT GAT GAG   1076Phe Leu Ser Asn Gly Phe Val Pro Ile Pro Ala Ala Gln Asp Asp Glu

310                 315                 320ATG TTC CAG GAG ACA CTG GAA GCC ATG TCT ATC ATG GGC TTC AAT GAA   1124Met Phe Gln Glu Thr Leu Glu Ala Met Ser Ile Met Gly Phe Asn Glu325                 330                 335                 340GAG GAA CAG CTA GCC ATC TTG AAG GTA GTA TCA TCT GTC CTT CAG CTT   1172Glu Glu Gln Leu Ala Ile Leu Lys Val Val Ser Ser Val Leu Gln Leu

            345                 350                 355GGA AAC ATT GTC TTC AAG AAG GAG CGA AAC ACA GAC CAG GCA TCC ATG   1220Gly Asn Ile Val Phe Lys Lys Glu Arg Asn Thr Asp Gln Ala Ser Met

        360                 365                 370CCT GAT AAC ACA GCG GCT CAG AAA GTT TGC CAC CTC GTG GGG ATT AAT   1268Pro Asp Asn Thr Ala Ala Gln Lys Val Cys His Leu Val Gly Ile Asn

    375                 380                 385GTG ACA GAT TTC ACT AGA GCC ATC CTG ACC CCA CGT ATC AAA GTT GGA   1316Val Thr Asp Phe Thr Arg Ala Ile Leu Thr Pro Arg Ile Lys Val Gly

390                 395                 400CGG GAT GTG GTG CAG AAG GCT CAG ACC AAA GAA CAG GCT GAC TTC GCC   1364Arg Asp Val Val Gln Lys Ala Gln Thr Lys Glu Gln Ala Asp Phe Ala405                 410                 415                 420ATC GAG GCC TTA GCC AAG GCC ACC TAT GAG CGC CTT TTC CGA TGG ATT   1412Ile Glu Ala Leu Ala Lys Ala Thr Tyr Glu Arg Leu Phe Arg Trp Ile

            425                 430                 435CTC AGC CGT GTA AAC AAG GCC TTG GAC AAG ACC CAT CGG CAG GGG GCC   1460Leu Ser Arg Val Asn Lys Ala Leu Asp Lys Thr His Arg Gln Gly Ala

        440                 445                 450TCC TTC CTG GGC ATT CTG GAT ATT GCT GGG TTT GAA ATC TTT GAG GTA   1508Ser Phe Leu Gly Ile Leu Asp Ile Ala Gly Phe Glu Ile Phe Glu Val

    455                 460                 465AAC TCC TTC GAG CAG CTG TGC ATC AAC TAC ACC AAC GAG AAG CTG CAG   1556Asn Ser Phe Glu Gln Leu Cys Ile Asn Tyr Thr Asn Glu Lys Leu Gln

470                 475                 480CAG CTG TTC AAC CAC ACG ATG TTC ATC CTG GAG CAG GAA GAG TAC CAG   1604Gln Leu Phe Asn His Thr Met Phe Ile Leu Glu Gln Glu Glu Tyr Gln485                 490                 495                 500CGA GAG GGC ATC GAG TGG AAC TTC ATC GAC TTC GGC CTG GAC CTG CAG   1652Arg Glu Gly Ile Glu Trp Asn Phe Ile Asp Phe Gly Leu Asp Leu Gln

            505                 510                 515CCT AGT ATT GAG CTG ATT GAG CGG CCG AAC AAC CCT CCC GGT GTG CTG   1700Pro Ser Ile Glu Leu Ile Glu Arg Pro Asn Asn Pro Pro Gly Val Leu

        520                 525                 530GCC CTG CTG GAT GAA GAA TGC TGG TTC CCC AAA GCT ACA GAC AAG TCT   1748Ala Leu Leu Asp Glu Glu Cys Trp Phe Pro Lys Ala Thr Asp Lys Ser

    535                 540                 545TTT GTG GAG AAG CTA TGC TCA GAG CAG GGA AAT CAC CCC AAA TTT CAG  1796Phe Val Glu Lys Leu Cys Ser Glu Gln Gly Asn His Pro Lys Phe Gln

550                 555                 560AAG CCC AAG CAG CTA AAG GAC AAA ACA GAG TTC TCC ATC ATC CAC TAT   1844Lys Pro Lys Gln Leu Lys Asp Lys Thr Glu Phe Ser Ile Ile His Tyr565                 570                 575                 580GCT GGG AAG GTG GAC TAC AAT GCA AGT GCC TGG CTG ACC AAG AAC ATG   1892Ala Gly Lys Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ala Trp Leu Thr Lys Asn Met

            585                 590                 595GAC CCG CTA AAT GAC AAT GTG ACA TCA CTC CTC AAT GCC TCC TCT GAC   1940Asp Pro Leu Asn Asp Asn Val Thr Ser Leu Leu Asn Ala Ser Ser Asp

        600                 605                 610AAG TTT GTG GCT GAC CTG TGG AAG GAT GTG GAC CGC ATT GTG GGG CTG   1988Lys Phe Val Ala Asp Leu Trp Lys Asp Val Asp Arg Ile Val Gly Leu

    615                 620                 625GAC CAG ATG GCC AAG ATG ACT GAG AGC TCA CTG CCC AGT GCC TCA AAG   2036Asp Gln Met Ala Lys Met Thr Glu Ser Ser Leu Pro Ser Ala Ser Lys

630                 635                 640ACC AAA AAG GGC ATG TTC CGC ACC GTG GGA CAG CTC TAC AAA GAG CAG   2084Thr Lys Lys Gly Met Phe Arg Thr Val Gly Gln Leu Tyr Lys Glu Gln645                 650                 655                 660TTG GGG AAA CTG ATG GCT ACA CTG CGC AAT ACC ACG GCT AAC TTT GTG   2132Leu Gly Lys Leu Met Ala Thr Leu Arg Asn Thr Thr Ala Asn Phe Val

            665                 670                 675CGC TGC ATC ATC CCC AAC CAT GAG AAG AGG TCT GGC AAG CTG GAT GCA   2180Arg Cys Ile Ile Pro Asn His Glu Lys Arg Ser Gly Lys Leu Asp Ala

        680                 685                 690TTT CTA GTG CTG GAA CAG CTG CGC TGC AAC GGT GTG TTG GAA GGC ATC   2228Phe Leu Val Leu Glu Gln Leu Arg Cys Asn Gly Val Leu Glu Gly Ile

    695                 700                 705CGC ATC TGC CGT CAG GGC TTC CCC AAC AGG ATT GTC TTC CAA GAG TTC   2276Arg Ile Cys Arg Gln Gly Phe Pro Asn Arg Ile Val Phe Gln Glu Phe

710                 715                 720CGG CAA CGC TAT GAG ATC CTG GCA GCG AAC GCC ATC CCC AAA GGC TTC   2324Arg Gln Arg Tyr Glu Ile Leu Ala Ala Asn Ala Ile Pro Lys Gly Phe725                 730                 735                 740ATG GAT GGA AAG CAA GCC TGC ATT CTC ATG ATC AAA GCC CTC GAA CTT   2372Met Asp Gly Lys Gln Ala Cys Ile Leu Met Ile Lys Ala Leu Glu Leu

            745                 750                 755GAC CCT AAC CTG TAC AGG ATT GGG CAG AGC AAA ATC TTC TTC CGA ACG   2420Asp Pro Asn Leu Tyr Arg Ile Gly Gln Ser Lys Ile Phe Phe Arg Thr

        760                 765                 770GGG GTC CTG GCC CAC CTA GAG GAG GAA CGA GAC CTG AAA ATT ACT GAT   2468Gly Val Leu Ala His Leu Glu Glu Glu Arg Asp Leu Lys Ile Thr Asp

    775                 780                 785GTC ATC ATG GCC TTC CAG GCA ATG TGT CGT GGC TAC CTT GCC AGA AAG   2516Val Ile Met Ala Phe Gln Ala Met Cys Arg Gly Tyr Leu Ala Arg Lys

790                 795                 800GCC TTC ACC AAG AGG CAG CAA CAG CTG ACA GCC ATG AAG GTG ATC CAG   2564Ala Phe Thr Lys Arg Gln Gln Gln Leu Thr Ala Met Lys Val Ile Gln805                 810                 815                 820AGG AAC TGC GCT GCC TAC CTT AAG CTC CGC AAC TGG CAA TGG TGG CGG   2612Arg Asn Cys Ala Ala Tyr Leu Lys Leu Arg Asn Trp Gln Trp Trp Arg

            825                 830                 835CTC TTC ACC AAA GTA AAG CCA TTG CTC CAG GTG ACA CGG CAG GAG GAG   2660Leu Phe Thr Lys Val Lys Pro Leu Leu Gln Val Thr Arg Gln Glu Glu

        840                 845                 850GAG ATG CAG GCC AAG GAG GAG GAG ATG CAA AAG ATC ACG GAG CGG CAG   2708Glu Met Gln Ala Lys Glu Glu Glu Met Gln Lys Ile Thr Glu Arg Gln

    855                 860                 865CAG AAG GCA GAG ACT GAG TTG AAG GAG CTG GAG CAG AAG CAC ACT CAG   2756Gln Lys Ala Glu Thr Glu Leu Lys Glu Leu Glu Gln Lys His Thr Gln

870                 875                 880CTG GCT GAG GAG AAG ACT CTG CTG CAG GAG CAG TTG CAG GCA GAG ACA   2804Leu Ala Glu Glu Lys Thr Leu Leu Gln Glu Gln Leu Gln Ala Glu Thr885                 890                 895                 900GAG CTG TAT GCT GAG TCT GAG GAG ATG CGG GTC CGG TTG GCA GCC AAG   2852Glu Leu Tyr Ala Glu Ser Glu Glu Met Arg Val Arg Leu Ala Ala Lys

            905                 910                 915AAG CAG GAA CTG GAG GAG ATC CTA CAT GAG ATG GAG GCC CGC CTG GAG   2900Lys Gln Glu Leu Glu Glu Ile Leu His Glu Met Glu Ala Arg Leu Glu

        920                 925                 930GAA GAG GAA GAC CGG CGC CAG CAA CTA CAG GCT GAG AGG AAG AAG ATG   2948Glu Glu Glu Asp Arg Arg Gln Gln Leu Gln Ala Glu Arg Lys Lys Met

    935                 940                 945GCT CAG CAG ATG CTA GAC CTG GAG GAG CAA CTG GAG GAG GAA GAG GCC   2996Ala Gln Gln Met Leu Asp Leu Glu Glu Gln Leu Glu Glu Glu Glu Ala

950                 955                 960GCC AGA CAG AAA CTA CAG CTA GAG AAG GTC ACG GCT GAG GCC AAG ATC   3044 Ala Arg Gln Lys Leu Gln Leu Glu Lys Val Thr Ala Glu Ala Lys Ile965                 970                 975                 980AAG AAA CTG GAG GAT GAC ATC TTG GTT ATG GAT GAT CAG AAC AGT AAA   3092Lys Lys Leu Glu Asp Asp Ile Leu Val Met Asp Asp Gln Asn Ser Lys

             985                 990                 995CTT TCA AAA GAA CGA AAA CTC CTT GAA GAG AGG GTC AGC GAC TTG ACA   3140Leu Ser Lys Glu Arg Lys Leu Leu Glu Glu Arg Val Ser Asp Leu Thr

        1000                1005                1010ACC AAC CTA GCA GAA GAG GAA GAA AAG GCT AAA AAC CTC ACA AAG CTG   3188Thr Asn Leu Ala Glu Glu Glu Glu Lys Ala Lys Asn Leu Thr Lys Leu

    1015                1020                1025AAG AGC AAG CAT GAG TCT ATG ATC TCA GAG CTG GAG GTG AGG CTG AAG   3236Lys Ser Lys His Glu Ser Met Ile Ser Glu Leu Glu Val Arg Leu Lys

1030                1035                1040AAA GAG GAG AAG AGC CGG CAG GAG CTG GAG AAA CTC AAG AGG AAA CTG   3284Lys Glu Glu Lys Ser Arg Gln Glu Leu Glu Lys Leu Lys Arg Lys Leu1045                1050                1055                1060GAG GGT GAT GCC AGT GAC TTC CAT GAG CAG ATC GCT GAC TTG CAG GCC   3332Glu Gly Asp Ala Ser Asp Phe His Glu Gln Ile Ala Asp Leu Gln Ala

            1065                1070                1075CAG ATT GCA GAG CTC AAG ATG CAG CTG GCA AAG AAA GAG GAA GAG CTA  3380Gln Ile Ala Glu Leu Lys Met Gln Leu Ala Lys Lys Glu Glu Glu Leu

        1080                1085                1090CAG GCA GCT CTA GCC AGG CTT GAT GAA GAG ATC GCC CAG AAA AAC AAT   3428Gln Ala Ala Leu Ala Arg Leu Asp Glu Glu Ile Ala Gln Lys Asn Asn

    1095                1100                1105GCC CTA AAG AAG ATT CGC GAG CTA GAG GGC CAT ATC TCA GAC CTA CAA   3476Ala Leu Lys Lys Ile Arg Glu Leu Glu Gly His Ile Ser Asp Leu Gln

1110                1115                1120 GAG GAC CTA GAC TCA GAG CGG GCT GCC AGG AAC AAG GCC GAG AAG CAG  3524Glu Asp Leu Asp Ser Glu Arg Ala Ala Arg Asn Lys Ala Glu Lys Gln1125                1130                1135                1140AAG CGA GAC CTG GGG GAG GAG CTG GAG GCA CTC AAG ACG GAG CTG GAG  3572Lys Arg Asp Leu Gly Glu Glu Leu Glu Ala Leu Lys Thr Glu Leu Glu

            1145                1150                1155GAT ACG CTG GAC AGC ACA GCT ACC CAG CAG GAG CTC AGA GCC AAG AGG  3620Asp Thr Leu Asp Ser Thr Ala Thr Gln Gln Glu Leu Arg Ala Lys Arg

        1160                1165                1170GAA CAG GAG GTG ACA GTG CTG AAG AAG GCC CTG GAT GAG GAG ACG CGG  3668Glu Gln Glu Val Thr Val Leu Lys Lys Ala Leu Asp Glu Glu Thr Arg

    1175                1180                1185TCC CAT GAG GCC CAG GTC CAG GAG ATG AGG CAG AAG CAC ACA CAG GCA  3716Ser His Glu Ala Gln Val Gln Glu Met Arg Gln Lys His Thr Gln Ala

1190                1195                1200GTG GAG GAA CTC ACA GAG CAG CTG GAG CAG TTC AAA AGG GCC AAG GCA  3764Val Glu Glu Leu Thr Glu Gln Leu Glu Gln Phe Lys Arg Ala Lys Ala1205                1210                1215                1220AAC CTG GAC AAA AGC AAG CAG ACA CTG GAG AAG GAG AAC GCG GAC CTG  3812Asn Leu Asp Lys Ser Lys Gln Thr Leu Glu Lys Glu Asn Ala Asp Leu

            1225                1230                1235GCT GGG GAG CTG CGT GTC CTG GGC CAG GCG AAG CAG GAG GTG GAA CAC  3860Ala Gly Glu Leu Arg Val Leu Gly Gln Ala Lys Gln Glu Val Glu His

        1240                1245                1250AAG AAG AAG AAG CTG GAG GTG CAG CTG CAG GAT CTG CAG TCC AAG TGC  3908Lys Lys Lys Lys Leu Glu Val Gln Leu Gln Asp Leu Gln Ser Lys Cys

    1255                1260                1265AGT GAT GGG GAG CGT GCC CGG GCT GAG CTC AGT GAC AAG GTC CAC AAG  3956Ser Asp Gly Glu Arg Ala Arg Ala Glu Leu Ser Asp Lys Val His Lys

1270                1275                1280CTA CAG AAT GAA GTG GAG AGT GTC ACT GGC ATG CTC AAT GAG GCA GAG   4004Leu Gln Asn Glu Val Glu Ser Val Thr Gly Met Leu Asn Glu Ala Glu1285                1290                1295                1300GGC AAA GCC ATC AAA CTG GCC AAA GAT GTG GCT TCC CTT GGA TCC CAG   4052Gly Lys Ala Ile Lys Leu Ala Lys Asp Val Ala Ser Leu Gly Ser Gln

            1305                1310                1315CTT CAG GAC ACC CAA GAG CTG CTC CAA GAA GAA ACC CGG CAG AAG CTC   4100Leu Gln Asp Thr Gln Glu Leu Leu Gln Glu Glu Thr Arg Gln Lys Leu

        1320                1325                1330AAT GTG TCT ACC AAG CTG CGT CAG TTG GAA GAT GAA AGG AAC AGC CTG   4148Asn Val Ser Thr Lys Leu Arg Gln Leu Glu Asp Glu Arg Asn Ser Leu

    1335                1340                1345CAG GAC CAG CTG GAT GAG GAG ATG GAG GCT AAG CAA AAC CTG GAG CGC   4196Gln Asp Gln Leu Asp Glu Glu Met Glu Ala Lys Gln Asn Leu Glu Arg

1350                1355                1360CAT GTC TCA ACA CTG AAC ATT CAG CTC TCA GAC TCT AAG AAG AAG CTG   4244His Val Ser Thr Leu Asn Ile Gln Leu Ser Asp Ser Lys Lys Lys Leu1365                1370                1375                1380CAG GAC TTT GCA AGT ACC ATC GAG GTC ATG GAG GAG GGG AAG AAG AGG   4292Gln Asp Phe Ala Ser Thr Ile Glu Val Met Glu Glu Gly Lys Lys Arg

            1385                1390                1395TTA CAG AAA GAG ATG GAG GGC CTC AGC CAG CAG TAT GAG GAG AAG GCG   4340Leu Gln Lys Glu Met Glu Gly Leu Ser Gln Gln Tyr Glu Glu Lys Ala

        1400                1405                1410GCT GCC TAT GAC AAA CTG GAG AAA ACC AAG AAC AGG CTC CAG CAG GAG   4388Ala Ala Tyr Asp Lys Leu Glu Lys Thr Lys Asn Arg Leu Gln Gln Glu

    1415                1420                1425CTG GAT GAC CTG GTC GTG GAC TTG GAC AAC CAG CGG CAA CTG GTA TCC   4436 Leu Asp Asp Leu Val Val Asp Leu Asp Asn Gln Arg Gln Leu Val Ser

1430                1435                1440AAT CTG GAA AAG AAG CAG AAG AAA TTT GAC CAG TTG TTA GCT GAG GAG   4484Asn Leu Glu Lys Lys Gln Lys Lys Phe Asp Gln Leu Leu Ala Glu Glu1445                1450                1455                1460AAG AAC ATC TCC TCC AAG TAT GCG GAT GAG AGA GAC CGA GCT GAA GCA   4532Lys Asn Ile Ser Ser Lys Tyr Ala Asp Glu Arg Asp Arg Ala Glu Ala

            1465                1470                1475GAG GCC AGG GAA AAG GAG ACA AAG GCT TTG TCT CTA GCC CGG GCC CTG   4580Glu Ala Arg Glu Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ser Leu Ala Arg Ala Leu

        1480                1485                1490GAG GAA GCC CTG GAA GCC AAA GAA GAG CTG GAG AGG ACC AAC AAG ATG   4628Glu Glu Ala Leu Glu Ala Lys Glu Glu Leu Glu Arg Thr Asn Lys Met

    1495                1500                1505CTC AAA GCT GAG ATG GAA GAC CTG GTC AGC TCC AAG GAT GAT GTA GGC   4676Leu Lys Ala Glu Met Glu Asp Leu Val Ser Ser Lys Asp Asp Val Gly

1510                1515                1520AAG AAC GTG CAT GAA CTG GAG AAG TCC AAG CGT GCC TTG GAG ACC CAG   4724Lys Asn Val His Glu Leu Glu Lys Ser Lys Arg Ala Leu Glu Thr Gln1525                1530                1535                1540ATG GAA GAG ATG AAA ACC CAG CTG GAG GAG TCG GAG GAT GAC GTG CAG   4772Met Glu Glu Met Lys Thr Gln Leu Glu Glu Ser Glu Asp Asp Val Gln

            1545                1550                1555GCC ACT GAG GAT GCC AAG CTG CGG CTA GAG GTC AAC ATG CAG GCC CTC   4820Ala Thr Glu Asp Ala Lys Leu Arg Leu Glu Val Asn Met Gln Ala Leu

        1560                1565                1570AAG GGC CAG TTT GAA CGC GAT CTC CAG GCT CGG GAT GAA CAG AAT GAG   4868Lys Gly Gln Phe Glu Arg Asp Leu Gln Ala Arg Asp Glu Gln Asn Glu

    1575                1580                1585 GAG AAG AGG AGG CAG CTA CAG CGG CAG CTG CAC GAG TAT GAG ACA GAA   4916Glu Lys Arg Arg Gln Leu Gln Arg Gln Leu His Glu Tyr Glu Thr Glu

1590                1595                1600CTG GAA GAT GAA CGG AAG CAG AGA GCT CTG GCG GCG GCA GCT AAG AAG   4964Leu Glu Asp Glu Arg Lys Gln Arg Ala Leu Ala Ala Ala Ala Lys Lys1605                1610                1615                1620AAG CTG GAA GGG GAC CTA AAA GAC CTA GAG CTC CAG GCT GAC TCA GCC   5012Lys Leu Glu Gly Asp Leu Lys Asp Leu Glu Leu Gln Ala Asp Ser Ala

            1625                1630                1635ATC AAA GGG AGG GAG GAA GCC ATC AAG CAG CTT CGA AAA CTG CAG GCT   5060Ile Lys Gly Arg Glu Glu Ala Ile Lys Gln Leu Arg Lys Leu Gln Ala

        1640                1645                1650CAG ATG AAG GAC TTC CAA AGA GAG CTG GAT GAT GCC CGT GCC TCC AGG   5108Gln Met Lys Asp Phe Gln Arg Glu Leu Asp Asp Ala Arg Ala Ser Arg

    1655                1660                1665GAT GAG ATC TTT GCC ACC TCA AAA GAG AAT GAG AAG AAA GCC AAG AGT   5156Asp Glu Ile Phe Ala Thr Ser Lys Glu Asn Glu Lys Lys Ala Lys Ser

1670                1675                1680CTG GAG GCA GAC CTC ATG CAG CTC CAA GAG GAC CTG GCA GCA GCT GAG   5204Leu Glu Ala Asp Leu Met Gln Leu Gln Glu Asp Leu Ala Ala Ala Glu1685                1690                1695                1700AGA GCT CGC AAG CAA GCT GAC CTG GAG AAG GAG GAG CTG GCC GAG GAG   5252Arg Ala Arg Lys Gln Ala Asp Leu Glu Lys Glu Glu Leu Ala Glu Glu

            1705                1710                1715CTG GCT AGC AGC TTG TCA GGA AGG AAT ACA CTG CAG GAT GAG AAG CGC   5300Leu Ala Ser Ser Leu Ser Gly Arg Asn Thr Leu Gln Asp Glu Lys Arg

        1720                1725                1730CGC CTG GAG GCA AGG ATC GCC CAA CTA GAG GAG GAG CTG GAG GAA GAG   5348Arg Leu Glu Ala Arg Ile Ala Gln Leu Glu Glu Glu Leu Glu Glu Glu

    1735                1740                1745CAG GGC AAC ATG GAG GCC ATG AGT GAT AGA GTA CGC AAG GCC ACA CTG   5396Gln Gly Asn Met Glu Ala Met Ser Asp Arg Val Arg Lys Ala Thr Leu

1750                1755                1760CAG GCT GAG CAA CTG AGC AAT GAG CTG GCC ACA GAA CGC AGC ACG GCT   5444Gln Ala Glu Gln Leu Ser Asn Glu Leu Ala Thr Glu Arg Ser Thr Ala1765                1770                1775                1780CAG AAG AAT GAG AGC GCA CGG CAA CAG CTG GAG CGC CAG AAC AAG GAA   5492Gln Lys Asn Glu Ser Ala Arg Gln Gln Leu Glu Arg Gln Asn Lys Glu

            1785                1790                1795CTG CGA AGC AAG TTG CAG GAG GTA GAA GGT GCT GTC AAA GCC AAG CTC   5540Leu Arg Ser Lys Leu Gln Glu Val Glu Gly Ala Val Lys Ala Lys Leu

        1800                1805                1810AAG TCC ACT GTT GCG GCG CTG GAG GCC AAG ATT GCA CAG CTG GAG GAG   5588Lys Ser Thr Val Ala Ala Leu Glu Ala Lys Ile Ala Gln Leu Glu Glu

    1815                1820                1825CAG GTT GAA CAG GAG GCC AGA GAG AAA CAG GCG GCC ACC AAG TCG CTG   5636Gln Val Glu Gln Glu Ala Arg Glu Lys Gln Ala Ala Thr Lys Ser Leu

1830                1835                1840AAG CAA AAG GAC AAG AAG CTA AAG GAG GTC CTG CTG CAG GTG GAG GAT   5684Lys Gln Lys Asp Lys Lys Leu Lys Glu Val Leu Leu Gln Val Glu Asp1845                1850                1855                1860GAG CGC AAG ATG GCA GAG CAG TAC AAG GAG CAG GCA GAG AAA GGA AAC   5732Glu Arg Lys Met Ala Glu Gln Tyr Lys Glu Gln Ala Glu Lys Gly Asn

            1865                1870                1875ACC AAG GTC AAG CAG CTG AAG AGG CAG CTG GAA GAG GCA GAG GAG GAG   5780Thr Lys Val Lys Gln Leu Lys Arg Gln Leu Glu Glu Ala Glu Glu Glu

        1880                1885                1890TCC CAG TGC ATC AAC GCC AAC CGC AGG AAG CTG CAG CGG GAG CTA GAT   5828 Ser Gln Cys Ile Asn Ala Asn Arg Arg Lys Leu Gln Arg Glu Leu Asp

    1895                1900                1905GAG GCC ACA GAG AGC AAT GAG GCC ATG GGC CGT GAG GTG AAC GCC CTC   5876Glu Ala Thr Glu Ser Asn Glu Ala Met Gly Arg Glu Val Asn Ala Leu

1910                1915                1920AAG AGC AAA CTC AGG AGA GGA AAC GAG GCT TCA TTT GTT CCT TCC AGA   5924Lys Ser Lys Leu Arg Arg Gly Asn Glu Ala Ser Phe Val Pro Ser Arg1925                1930                1935                1940AGG GCT GGG GGC CGT AGA GTT ATT GAA AAC ACA GAT GGT TCT GAA GAA   5972Arg Ala Gly Gly Arg Arg Val Ile Glu Asn Thr Asp Gly Ser Glu Glu

            1945                1950                1955GAA ATG GAC GCT CGG GAC TCA GAC TTC AAT GGA ACC AAA GCC AGT GAA   6020Glu Met Asp Ala Arg Asp Ser Asp Phe Asn Gly Thr Lys Ala Ser Glu

        1960                1965                1970TAAATTCAGG ATTGGACACC ATGTCAGGGA AAACAGAACA CTAAACGACA GCAGAGCCCA 6080GCAGACTGCT TAGCACTTGT GTCCATTCGT TCTCAAGTCA CAGAAATCAC TCCACCCCTC 6140ACCAGGAGTC AACCACAGCC CTGCACAAAG GGTGT                            6175SEQ ID NO：2序列长度：5919序列类型：核酸链型：双拓扑结构：线性分子类型：cDNA至mRNA特征确定特征的方法：SATG GCG CAG AAN GGN CAN CTC AGC GAN GAT GAG AAG TTC CTC TTT GTG    48GAN AAN AAC TTC ATN AAC AGC CCN NTG GCN CAG GCC GAC TGG GTN GCC    96AAG ANG CTG GTG TGG GTC CCT TCN GAG AAG CAG GGC TTC GAN GCN GCC    144AGC ATC AAG GAG GAG AAG GGN GAT GAG GTG GTC GTG GAG NTG GTG GAN         192AAT GGN AAG AAG GTC ACN GTN GGC AAN GAT GAC ATC CAN AAN ATG AAC         240CCN CCC AAG TTC TCN AAG GTG GAN GAC ATG GCN GAG CTG ACG TGB CTC         288AAN GAN GCN TCN GTG CTG CAC AAC CTG AGG GAG VGN TAC TTC TCN GGN         336CTC ATC TAN ACN TAC TCN GGC CTC TTC TGB GTG GTG GTC AAC CCC TAC         384AAG YAS CTN CCC ATC TAC TCN GAN AAG ATC GTG GAN ATG TAC AAG GGC         432AAG AAG AGG CAN GAG ATG CCN CCN CAC ATC TAB GCC ATN GCC GAC ACN         480GCC TAC AGN AGC ATG CTN CAN GAT CGN GAN GAC CAG TCC ATT CTN TGC         528ACA GGN GAG TCT GGA GCC GGN AAG ACN GAG AAC ACN VAG AAA GTC ATN         576CAG TAC NTG GCN GTG GTG GCN TCN TCC CAC AAG GGC AAG AAN GAC ANN         624AGC ATC ACG GGG GAG CTG GAN AAG CAG CTT CTN CAN GCA AAC CCN ATC         672CTG GAG GCN TTN GGC AAN GCN AAN ACN GTC AAG AAN GAC AAC TCC TCN         720CGN TTN GGC AAG TTC ATN CGC ATC AAC TTN GAN GTC ACT GGT TAC ATN         768GTN GGN GCC AAN ATT GAN ACN TAT CTN CTG GAA AAG TCN VGN GCN ATN         816CGN CAN GCN VGN GAN GAG AGN ACN TTN CAC ATC TTN TAC TAC CTG NTN         864GCN GGN GCC AAG GAN AAG ATG ANA ANT GAC NTG CTN TTG GAG NGC TTC         912AAC ANC TAC ACA TTN NTN TCC AAT GGC TTT GTG CCC ATC CCA GCN GCN         960CAN GAT GAN GAG ATG TTC CAG GAN ACN NTG GAN GCC ATG TCN ATC ATG        1008GGC TTC ANT GAA GAG GAN CAG CTN NCN NTN TTG AAG GTN GTN TCN TCN        1056GTC CTN CAG CTT GGA AAC ATN GTC TTC AAG AAG GAN VGA AAC ACA GAC        1104CAG GCN TCC ATG CCN GAN AAC ACA GCN GCN CAG AAA GTT TGC CAC CTC        1152NTG GGN ATT AAN GTG ACA GAT TTC ACN AGA NCC ATC CTG ACC CCN CGT        1200ATC AAA GTT GGA CGG GAN GTN GTG CAG AAN GCT CAG ACN AAA GAA CAG        1248GCN GAC TTC GCN NTC GAG GCN TTN GCN AAG GCC ACN TAT GAN CGC CTT        1296TTC CGN TGG ATN CTC AGC CGT GTN AAC AAN GCC NTG GAC AAG ACC CAT        1344CGG CAG GGG GCN TCC TTC CTG GGN ATN CTG GAN ATN GCT GGN TTT GAN        1392ATC TTT GAG GTN AAC TCC TTC GAG CAG CTG TGC ATC AAC TAC ACC AAC        1440GAG AAG CTG CAG CAG CTG TTC AAC CAC ACN ATG TTC ATC CTG GAG CAG        1488GAN GAG TAC CAG CGN GAG GGC ATC GAG TGG AAC TTC ATC GAC TTC GGN        1536CTN GAC CTG CAG CCN WGY ATT GAG CTN ATT GAG CGG CCG AAC AAC CCT        1584CCN GGT GTG CTG GCC CTG CTG GAT GAN GAN TGC TGG TTC CCC AAA GCN        1632ACA GAN AAG TCT TTT GTG GAG AAG CTN TGC NCA GAG CAN GGN AAN CAC        1680CCC AAN TTN CAG AAG CCC AAG CAG CTN AAG GAC AAA ACN GAG TTC TCC        1728ATC ATC CAN TAN GCT GGG AAG GTG GAC TAC AAN GCN AGT GCC TGG CTG        1776ACC AAG AAC ATG GAC CCN CTN AAT GAC AAN GTG ACN TCN CTC CTC AAN        1824GCC TCC TCN GAC AAG TTN GTG GCN GAC CTN TGG AAG GAN GTG GAC CGC        1872ATN GTG GGG CTG GAC CAG ATG GCC AAG ATG ACN GAG AGC TCA CTG CCC        1920AGN GCC TCN AAG ACC AAN AAG GGC ATG TTC CGC ACN GTG GGN CAG CTN        1968TAC AAN GAG CAG NTG GGG AAN CTG ATG NCN ACN CTG CGC AAN ACC ACG        2016NCN AAC TTN GTG CGC TGC ATC ATC CCC AAC CAN GAG AAG NGG TCN GGC        2064AAG CTG GAN GCN TTN CTN GTG CTG GAN CAG CTG CGN TGC AAC GGN GTG        2112NTG GAA GGC ATC CGN ATC TGC CGN CAG GGC TTC CCC AAC AGG ATN GTC        2160TTC CAN GAG TTC CGN CAA CGC TAN GAG ATC CTG GCA GCN AAC GCC ATC        2208CCC AAN GGC TTC ATG GAT GGN AAG CAA GCC TGC ATT CTC ATG ATC AAA        2256GCN CTN GAA CTN GAC CCN AAC NTG TAC AGG ATN GGG CAG AGC AAA ATC        2304TTC TTC CGN ACG GGN GTN CTG GCC CAC CTN GAG GAG GAN CGN GAC NTG        2352AAN ATN ACN GAN GTC ATC ATG GCC TTC CAG GCN ATG TGT CGT GGC TAC        2400CTN GCC VGN AAG GCC TTC NCC AAG NGG CAG CAN CAG CTG ACN GCC ATG        2448AAG GTG ATC CAG AGG AAC TGC GCN GCC TAC CTN AAG CTN CGN AAC TGG        2496CAN TGG TGG CGN CTC TTC ACC AAN GTN AAG CCN NTG CTN CAG GTG ACA        2544CGG CAG GAG GAG GAG ATG CAG GCC AAG GAG GAN GAG NTG CAN AAG ATC        2592ANG GAG CGN CAG CAG AAG GCN GAG ANN GAG NTN VAG GAG CTG VAG CAG        2640AAG CAC ACN CAG CTG NCN GAG GAG AAG ANN CTG CTG CAG GAG CAG NTG        2688CAG GCN GAG ACN GAG CTG TAN GCN GAG NCN GAG GAG ATG CGN GTC CGG        2736NTG GCN GCC AAG AAG CAG GAN CTG GAG GAN ATC CTN CAT GAG ATG GAG        2784GCC CGC CTG GAG GAN GAG GAA GAC CGG NGC CAG CAN CTN CAG GCN GAG        2832AGG AAG AAG ATG GCN CAG CAG ATG CTN GAC CTG GAN GAG CAA CTG GAG        2880GAG GAN GAN GCN GCC AGN CAG AAN CTA CAG CTN GAN AAG GTC ACN GCN        2928GAG GCC AAG ATC AAG AAN NTG GAG GAN GAC ATC NTG GTN ATG GAN GAT        2976CAG AAC ANN AAN CTN TCA AAA GAN CGA AAA CTC CTN GAA GAG AGG NTN        3024AGN GAN TTN ACA ACN AAN CTN GCN GAN GAG GAA GAN AAG GCN AAN AAC        3072CTN ACN AAG CTG AAG ANC AAG CAT GAN TCN ATG ATC TCA GAN CTG GAN        3120GTG NGG CTG AAG AAN GAG GAG AAG AGC CGG CAG GAG CTG GAG AAN CTN        3168AAG NGG AAN NTG GAN GGN GAN GCC AGT GAC NTC CAN GAG CAG ATC GCN        3216GAC NTN CAG GCN CAG ATN GCA GAG CTC AAG ATG CAG CTG GCN AAG AAN        3264GAN GAN GAG CTN CAG GCN GCN CTN GCC AGG CTN GAN GAN GAN ANN NCN        3312CAG AAN AAC AAN GCC CTN AAG AAG ATN CGN GAG CTN GAG GGN CAN ATC        3360TCN GAC CTN CAN GAG GAC CTN GAC TCA GAG CGG GCN GCC AGG AAC AAG        3408GCN GAN AAG CAG AAG CGA GAC CTN GGN GAG GAG CTG GAG GCN CTN AAG        3456ACN GAG CTG GAN GAN ACN CTG GAC ANC ACN GCN ACN CAG CAG GAG CTC        3504VGN GCC AAG NGG GAN CAG GAG GTG ACN GTG CTG AAG AAG GCC CTG GAN        3552GAN GAG ACN CGG TCC CAT GAG GCN CAG GTC CAG GAG ATG AGG CAG AAN        3600CAC NCA CAG GNN GTG GAG GAN CTC ACN GAG CAG CTN GAN CAG TTC AAN        3648AGG GCC AAG GCN AAC CTN GAC AAN ANC AAG CAG ACN CTG GAG AAN GAG        3696AAC GCN GAC CTG GCN GGN GAG CTG CGN GTC CTG GGC CAG GCN AAG CAG        3774GAG GTG GAN CAN AAG AAG AAG AAG CTG GAG GNG CAG NTG CAG GAN CTG        3792CAG TCC AAG TGC AGN GAT GGG GAG CGN GCC CGG GCN GAG CTC ANN GAC        3840AAN GTC CAC AAG CTN CAG AAT GAA GTN GAG AGN GTC ACN GGN ATG CTN        3888ANN GAG GCN GAG GGN AAN GCC ATN AAN CTG GCC AAN GAN GTG GCN TCC        3936CTN GGN TCC CAG CTN CAG GAN ACC CAN GAG CTG CTN CAA GAA GAA ACC        3984CGG CAG AAG CTC AAN GTG TCN ACN AAG CTG CGN CAG NTG GAN GAN GAN        4032NGG AAC AGC CTG CAN GAN CAG CTG GAN GAG GAG ATG GAG GCN AAG CAN        4080AAC CTG GAG CGC CAN NTC TCN ACN CTN AAC ATN CAG CTC TCN GAC TCN        4128AAG AAG AAG CTG CAG GAC TTT GCN AGN ACC NTN GAN NNY NTG GAN GAN        4176GGN AAG AAG AGG TTN CAG AAN GAN ATN GAG NNC CTC ANC CAG CAG TAY        4224GAN GAG AAN GCN GCN GCN TAN GAN AAA CTG GAN AAN ACC AAG AAC AGG        4272CTN CAG CAG GAG CTG GAN GAC CTG GTN GTN GAN TTG GAN AAC CAG CGG        4320CAA CTN GTN TCC AAN CTG GAA AAG AAG CAG ANG AAN TTN GAN CAG TTG        4368TTA GCN GAG GAN AAN AAC ATC TCN TCC AAN TAN GCG GAT GAN AGN GAC        4416VGA GCN GAN GCN GAN GCN AGG GAN AAG GAN ACN AAG GCN NTG TCN CTN        4464GCN CGG GCC CTN GAN GAN GCC NTG GAN GCC AAA GAN GAN CTN GAG VGN        4512ACC AAC AAN ATG CTC AAN GCN GAN ATG GAA GAC CTN GTC AGC TCC AAG        4560GAN GAN GTN GGC AAG AAC GTN CAT GAN CTG GAG AAG TCC AAG CGN GCC        4608NTG GAG ACN CAG ATG GAN GAG ATG AAN ACN CAG CTG GAN GAG YYR GAG        4656GAN GAN NTG CAN GCC ACN GAG GAN GCC AAN CTG CGG NTN GAN GTC AAC        4704ATG CAG GCN CTC AAN GNC CAG TTN GAN VGN GAT CTC CAN GCN CGG GAN        4752GAN CAG AAN GAG GAG AAG AGG AGG CAN CTN CAG VGN CAG CTN CAN GAG        4800TAN GAG ACN GAA CTG GAA GAN GAN CGN AAG CAN VGN GCN CTG GCN GCN        4848GCA GCN AAG AAG AAG CTG GAN GGG GAC CTN AAA GAC CTN GAG CTN CAG        4896GCN GAC TCN GCC ATC AAN GGG NGG GAG GAA GCC ATC AAG CAG CTN CNN        4944AAA CTG CAG GCT CAG ATG AAG GAC TTN CAN AGA GAN CTG GAN GAT GCC        4992CGT GCC TCC AGN GAN GAG ATC TTT GCC ACN NCN AAN GAG AAN GAG AAG        5040AAA GCC AAG AGN NTG GAN GCA GAC CTC ATG CAG CTN CAA GAG GAN CTN        5088GCN GCN GCN GAG AGN GCT CGC AAN CAN GCN GAC NTN GAG AAG GAG GAN        5136CTG GCN GAG GAG CTG GCN AGN AGC NTG TCN GGA AGG AAN NCN CTN CAG        5184GAN GAG AAG CGC CGC CTG GAG GCN NGG ATC GCN CAN CTN GAG GAG GAG        5232CTG GAG GAN GAN CAG GGC AAC ATG GAG GCN ATG AGN GAN VGN GTN CGC        5280AAN GCN ACN CNG CAG GCN GAG CAN CTN AGC AAN GAG CTG GCC ACA GAN        5328CGC AGC ACN GCN CAG AAG AAT GAG AGN NCN CGG AN  CAG CTN GAG CGN        5376CAG AAC AAG GAN CTN MRN AGC AAG NTN CAN GAG NTN GAN GGN GCN GTC        5424AAN NCC AAG NTC AAN TCC ACN NTN GCG GCG CTG GAG GCC AAG ATT GCN        5472CAG CTN GAG GAG CAG GTN GAN CAG GAG GCC AGA GAG AAN CAG GCG GCC        5520NCC AAG NCG CTG AAG CAN ANN GAC AAG AAG CTN AAG GAN NTN NTG CTG        5568CAG GTG GAN GAN GAG CGC AAG ATG GCN GAG CAG TAC AAG GAG CAG GCA        5616GAG AAA GGN AAN NCC ANG GTC AAG CAG CTN AAG AGG CAG CTG GAN GAG        5664GCN GAG GAG GAG TCN CAG NGC ATC AAC GCC AAC CGC AGG AAG CTG CAG        5712

Claims (9)

1.一种重组DNA，包括插入载体DNA中的编码平滑肌型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白的DNA。

2.根据权利要求1的重组DNA，其中的载体DNA是逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体或能在动物中表达的质粒。

3.根据权利要求2的重组DNA，其中能在动物中表达的质粒是pCXN2或PAGE208。

4.根据权利要求1的重组DNA，其中的平滑肌型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白是人类平滑肌型、兔平滑肌型或小鼠平滑肌型。

5.根据权利要求1的重组DNA，其中编码平滑肌型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白的DNA是SEQ ID NO：1中的核苷酸序列或SEQ IDNO：1中至少一个核苷酸被添加、删除或替代的核苷酸序列。

6.编码平滑肌型肌球蛋白重链SM₁同种型蛋白DNA，它是SEQID NO：1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO：1中至少一个核苷酸被添加、删除或替代的核苷酸序列。

7.携带权利要求5的重组DNA的微生物。

8.根据权利要求7的微生物，其属于大肠杆菌属。

9.治疗动脉硬化的药剂，其包含权利要求1的重组DNA。

Images