CN1269963C - 心房肽基因转染细胞微囊 - Google Patents

Abstract

本发明的心房肽基因转染细胞微囊，涉及医药中的基因制品。旨在解决心房肽基因治疗疾病带来的免疫耐受、安全、使用时间和剂量限制等问题。本发明的微囊在中空的聚己内酯微囊或聚氨酯微囊中包被人类心房肽基因编码序列转染永生化细胞，上述聚己内酯微囊或聚氨酯微囊的囊体上的孔径为5-10nm，人类心房肽基因编码序列是人ANPcDNA(CANP)编码全部序列，即核苷酸1到456。永生化细胞是CHO细胞、COS细胞、EVC304人脐静脉内皮细胞、骨髓基质细胞、3T3TK成纤维细胞和人胚肺细胞中的一种。本发明的微囊适用于植入人体，能长时间不断地释放人类心房肽，治疗高血压、心力衰竭、肾功能不全等疾病。

Description

心房肽基因转染细胞微囊

技术领域

本发明涉及医药中的基因制品，特别是能植入人体不断地释放人类心房肽，治疗高血压、心力衰竭、肾功能不全的微囊制品。

背景技术

高血压是一种影响人类健康的主要疾病，目前发病率呈上升趋势，高血压有许多并发症：脑血管疾病、心脏疾病、肾脏疾病等。因此寻找一种有效的治疗药物或技术成为当务之急。目前高血压主要应用药物治疗，但这些药物治疗存在许多问题：必须定时长期服药，给患者带来许多不便；同时由于有很强的副作用，使药物的应用时间和剂量受到很大的限制。

心房肽(ANP)是一种心脏激素，主要由心房对局部张力产生应答而分泌的。ANP有许多生理功能：a)降低血压；b)增加盐与水的排泄；c)促进血浆中渗出的水分到组织间隙；d)抑制几种激素如：血管紧张素原II(ANG II)、内皮素(ET)、肾素、血管加压素的释放和作用。ANP对血管、肾脏、肾上腺及其它器官产生快速而持续的作用，既降低了系统血压又减少了血容量。由于ANP具有这些独特的功能，使得其在治疗高血压、肾衰、及扩张性心脏病方面受到高度重视。

目前已经经过实验的将ANP作为治疗性药物的途径(Heikki Ruskoaho，Atrialnatriuretic peptide：synthesis，release，and metabolism[J].PharmacologicalReviews.1992；44：479-602.)，有如：(1)抑制ANP的降解：目前还没有确定的实验表明能通过利用ANP类似物抑制ANP的降解应用于人类的可行性。(2)ANP静脉输入：由于心房肽较短的血浆半衰期及在胃肠内易受消化酶影响，使心房肽不易通过口服用药。实验表明，长期的输入ANP可使心房肽血浆浓度高于生理水平并且产生持久的血压降低。但是，由于ANP的半衰期短，作为一种药物，必须持续输入，这就失去了作为治疗高血压药物的实用价值。并且ANP易被消化酶降解，使得ANP只能局限于静脉给药。通过皮下注射的方式给药尚未观察到利尿和利钠的效果。(3)ANP受体类似物：尽管这些类似物可以制得，但特异性的、稳定的、不易被降解的分子形式还是很难获得；另外要使合成的这种类似物易于从肠道吸收而不被破坏也有困难。(4)ANP基因治疗高血压：目前进行的基因治疗方法是将人类ANP基因整合到RSV-LTR(Rous Sarcoma Virus 3`-Long Terminal Repeat，劳氏肉瘤病毒3，-长末端重复序列)上。Chao等人已经利用心房肽基因的过度表达来控制高血压病鼠的血压(Lin KF，Chao J，Chao L.Atrialnatriuretic peptide gene delivery attenuates hypertension cardiac hypertropy andrenal injury in salt sensive rats[J].Hum Gene Ther.1998；9：1429-1438.)。他们的研究主要是通过质粒DNA或借助病毒载体直接输入动物体内。ANP基因治疗高血压目前还在尝试阶段，还没有明确的方法和手段，并且对基因载体的安全性要求较高。实际应用仍有许多困难，一个最重要的困难是靶组织的导入基因的较低转染率，另一个困难是如何提高转基因免疫耐受性、安全性及基因表达。严重的副作用或致死性可能伴随着病毒介导的基因治疗。基因治疗的案例中，很少有成功的，一个主要的障碍是安全问题(Seppo Yla-Herttuala，John F Martin.Cardiovascular gene therapy[J].Lancet.2000；355：213-22.)。体细胞基因治疗高血压和充血性心力衰竭的可行性在动物模型上已得到证实。直接植入转染细胞可能是一种有效的体细胞治疗方案，但也存在着许多缺点：不能控制细胞的游走性，不能控制治疗的持续性。

发明内容

鉴于上述，本发明的目的在于提供一种治疗高血压、心力衰竭、肾功能不全等疾病，且治疗安全、治疗持续时间长的心房肽基因转染细胞微囊。

本发明采用将心房肽基因编码序列转染的永生化细胞包被在聚己内酯或聚氨酯微囊中来实现其目的。

本发明的心房肽基因转染细胞微囊是在聚己内酯或聚氨酯微囊中包被人类心房肽基因编码序列转染永生化细胞，上述聚己内酯微囊或聚氨酯微囊的囊体上的孔径为5-10nm(纳米)，上述人类心房肽基因编码序列如下：

atg agc tcc ttc tcc acc acc acc ctg agc ttc ctc ctt tta ctg gca      48

Met Ser Ser Phe Ser Thr Thr Thr Val Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala

-25                 -20                 -15                 -10

ttc cag ctc cta ggt cag acc aga gct aat ccc atg tac aat gcc gtg      96

Phe Gln Leu Leu Gly Gln Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val

                -5              -1   1              5

tcc aac gca gac ctg atg gat ttc aag aat ttg ctg gac cat ttg gaa      144

Ser Asn Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Asn Leu Leu Asp His Leu Glu

        10                  15                  20

gaa aag atg cct tta gaa gat gag gtc gtg ccc cca caa gtg ctc agt      192

Glu Lys Met Pro Leu Glu Asp Glu Val Val Pro Pro Gln Val Leu Ser

    25                  30                  35

gag ccg aat gaa gaa gcg gcg gct gct ctc agc ccc ctc cct gag gtg      240

Glu Pro Asn Glu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val

40                  45                  50                  55

cct ccc tgg acc ggg gaa gtc agc cca gcg cag aga gat gga ggt gcc      288

Pro Pro Trp Thr Gly Glu Val Ser Pro Ala Gln Arg Asp Gly Gly Ala

                60                  65                  70

ctc ggg cgg ggc ccc tgg gac tcc tct gat cga tct gcc ctc cta aaa      336

Leu Gly Arg Gly Pro Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys

75                  80                  85

agc aag ctg agg gcg ctg ctc act gcc cct cgg agc ctc cgg aga tcc      384

Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser

        90                  95                  100

agg tgc ttc ggg ggc agg atg gac agg att gga gcc cag agc gga ctg      432

Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu

    105                 110                 115

ggc tgt aac agc ttc cgg tac tga                                      456

Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr

120                 125

上述的永生化细胞可以是CHO细胞(仓鼠卵巢细胞)。

上述的永生化细胞也可以是COS细胞(恒河猴肾细胞)。

上述的永生化细胞还可以是EVC304人脐静脉内皮细胞，骨髓基质细胞，3T3TK成纤维细胞，人胚肺细胞等。

上述的聚己内酯微囊是分子量为72000-90000道尔顿的聚己内酯85％混合pluronicF6815％采用通常技术制成的微囊。

上述的聚氨酯微囊为多嵌段聚醚型聚氨酯微囊。

本发明将人类心房肽基因编码序列ANP cDNA(ANP的mRNA的互补脱氧核糖核酸)转染的永生化细胞包被在聚己内酯(PCL)或聚氨酯(PU)微囊内，然后将聚己内酯微囊或聚氨酯的微囊植入动物体内。使用共聚焦激光扫描显微镜和免疫细胞化学技术，特异性放射免疫法检测证明ANP cDNA转染的永生化细胞能够存活在聚己内酯或聚氨酯的微囊内至少六个月并且能够持续地向培养基中分泌ANP。ANP cDNA转染的永生化细胞包被在聚己内酯或聚氨酯的微囊内8天后，转染的永生化细胞繁殖和死亡达到均衡，同时也说明ANP cDNA转染的永生化细胞适合聚己内酯微囊或聚氨酯微囊内环境。

本发明中的聚己内酯微囊的降解产物(H₂O，CO₂)易于消除，聚己内酯由于其具有亲水性、体外稳定性、热稳定性、缓慢降解性(3个月到3年)、无毒性，被大量应用于临床。在所有的生物降解聚酯材料中，聚己内酯的药物通透性最好。聚己内酯的微囊由于其具有生物相容性而被应用于细胞的载体，且具有的亲水性适于细胞附着(DominicWalsh，Tsutomu Furuzono，Junzo T anak.Preparation of porous composite implantmaterials by in situ polymerization of porous apatite containing caprolactoneor methyl methacrylate[J].Biomaterials.2001；22：1205-1212.)。本发明中的聚氨酯微囊为非生物降解医用高分子材料，植入体内可长期存在。现已广泛的用于人工血管，药物释放体系。聚氨酯由于具有生物相容性、血液相容性、耐生物老化和物理机械性能，而适于作植入体内的细胞载体。本发明的多嵌段聚醚型聚氨酯(SPEU)微囊还具有血液相容性和良好生物力学性能。

由于血压存在昼夜节律的变化，因此，治疗时应考虑以适应人体的血压昼夜节律变化的同步性。为此，可以采用melatonin浸泡本心房肽基因转染细胞微囊，使微囊中的心房肽基因转染细胞的行为同步化，改变其时间生物学特征。

本发明的心房肽基因转染细胞微囊的制作步骤如下：

1、微囊的制备：采用通常方法制备聚己内酯微囊或聚氨酯微囊。微囊的形状和大小按治疗要求确定。

2、人类心房肽基因编码序列转染永生化细胞的制备：人类心房肽基因编码序列即人ANP cDNA(CANP)编码全部序列(核苷酸1到456)从人心房的mRNA通过RT-PCR(反转录多聚酶链式反应)扩增得到。然后，采用已有方法进行永生化细胞的培养及转染。

3、用注射器将转染细胞注入聚己内酯微囊或聚氨酯微囊中，封闭开口，放入培养基中生长。

4、用melatonin浸泡本心房肽基因转染细胞微囊适当时间，使其中的心房肽基因编码序列转染细胞的行为同步化，改变其时间生物学特征。以适应人体的血压昼夜节律变化的同步性。

从而制成本发明的心房肽基因转染细胞微囊。

经免疫细胞化学、放免法检测ANP、共聚焦激光扫描显微镜检测和动物实验，证明本发明的心房肽基因转染细胞微囊能够分泌生物活性ANP，应用于治疗高血压等疾病。

使用本发明时，将本发明的心房肽基因转染细胞微囊植入机体，使其不断的释放心房肽，治疗疾病。

本发明的心房肽基因转染细胞微囊与现有技术相比较，具有如下的明显优点和显著效果。

一、本发明将人类心房肽基因编码序列转染永生化细胞，用聚己内酯微囊或聚氨酯微囊包被，使人类心房肽基因编码序列转染的永生化细胞在微囊中表达产生心房肽，植入体内后能有效的治疗疾病。用本发明治疗疾病，能克服已有的ANP基因治疗疾病的困难，避免基因治疗所带来的免疫耐受和安全问题，同时弥补单纯药物治疗的应用时间和剂量的限制。

二、本发明中的聚己内酯微囊和聚氨酯微囊的囊体上的孔径为5-10nm，可通过分子量≤150000道尔顿的多肽或蛋白质，使人类心房肽基因编码序列转染永生化细胞在微囊中表达产生的心房肽能通过微囊上的微孔释放到微囊外，而人类心房肽基因编码序列转染永生化细胞由于直径大而不能通过微囊上的微孔释放出来，并且免疫球蛋白也不能由微囊外进入微囊内。人类心房肽基因编码序列转染永生化细胞在微囊中可长期生存，在微囊中表达产生心房肽。聚己内酯微囊或聚氨酯微囊在植入体内后，在使用期内不会降解，并且可从体内去除。

本发明的心房肽基因转染细胞微囊适用于植入人体，能长时间不断地释放心房肽，治疗高血压、心力衰竭、肾功能不全等疾病。

下面，再用实施例对本发明作进一步地说明。

具体实施方式

实施例1

本发明的一种心房肽基因转染细胞微囊，在聚己内酯或聚氨酯微囊中包被人类心房肽基因编码序列转染永生化细胞。

本实施例的心房肽基因转染细胞微囊的制作步骤如下：

1、微囊的制备

1)聚己内酯微囊的制备：优选分子量72000-90000道尔顿的聚己内酯(PCL)85％混合pluronic F6815％，其中pluronic F68(普朗尼克F68)是一种表面活性剂，本发明作为成孔剂使用。采用通常的工艺制成长3厘米左右、直径1厘米左右的中空形的微囊，囊体上的孔径为5-10nm。为充填细胞的需要，在囊体的适当部位制有1个或2个小的开口。微囊的形状、长度、直径均根据治疗需要确定，没有严格的限制。在包被前，经Co-60(钴-60)γ射线灭菌60min后备用。

2)聚氨酯微囊的制备：优选具有血液相容性和力学性能的多嵌段聚醚型聚氨酯(SPEU)为原料，水溶性物质聚乙二醇(分子量4000-6000)为成孔剂，采用通常的工艺制成。聚氨酯微囊的囊体上的孔径、形状、长度、直径、灭菌处理均与聚己内酯微囊相同。

2、人类心房肽基因编码序列转染永生化细胞的制备

1)RSV-cANP质粒DNA的构建：ANP cDNA(ANP的mRNA的互补脱氧核糖核酸)(456bp)的表达受控于劳氏肉瘤病毒长未端重复序列(RSV-LTR)，并且有一simian(类人猿)病毒40(SV40)Poly A(多聚腺苷酸)信号。人ANP cDNA(CANP)编码全部序列(核苷酸1到456)从人心房的mRNA通过RT-PCR(反转录多聚酶链式反应)扩增得到。引物为人ANP cDNA(456bp)的1-20(5’-ATGAGCTCCTTCTCCACCAC-3’)，反义引物为末端的456-437(5’-TCAGTACCGGAAGCTGTTAC-3’)，扩增产物克隆入PCR II vector(PCR II载体，购自invitrogen公司)。为了质粒RSV-cANP构建，人ANP cDNA(CANP)用Xho I，HindIII限制性内切酶消化从PCRII vector释放出来，克隆入质粒PREP8的Xho I，HindIII位点，表达载体PREP8包括ori P和EBNA-1基因，控制其灵长类和犬科细胞的染色体外复制。(参考《分子克隆实验指南》第二版第一章、第五～七章、第十四章、第十六章，科学出版社；《现代分子生物学实验技术》第二版第三章、第四章、第七章、第十三章、第十六章、第十七章，中国协和医科大学出版社)。

2)细胞的培养及转染：本实施例采用的永生化细胞选用CHO细胞，将商品化的CHO细胞珠，在培养基(CHO-S-SFM培养基购自GIBCO/BRL公司，按说明配制)中，37℃，5％CO₂条件下生长，细胞每周传代2次。转染前，CHO细胞在100mm培养板上生长到密度70-80％。转染时，将3ug质粒RSV-cANP，30ul-Liposome(脂质体)和300ul培养基顺次加到聚苯乙稀管内，在室温下放置25min。然后将其直接加入到去除培养液的培养板上，在37℃，5％CO₂条件下放置4hr后，倒掉上述液体，加入培养基在37℃，5％CO₂条件下培养48hr。转染后的细胞用G418筛选6-10days(培养基中G418浓度600ug/ml)。从培养板中选出10个克隆分别放入10个培养基中生长。(参考：《分子克隆实验指南》第二版第一章、第五～七章、第十四章、第十六章，科学出版社；《现代分子生物学实验技术》第二版第三章、第四章、第七章、第十三章、第十六章、第十七章，中国协和医科大学出版社；《体外培养的原理和技术》第一版，科学出版社)

3)通过免疫细胞化学和放免法检测ANP确定RSV-cANP质粒DNA通过Liposome转染CHO细胞成功。

(1)免疫细胞化学：将转染组细胞和对照组细胞分别在培养板上生长至单层后用PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗3次，然后用丙酮在37℃浸泡固定4分钟；洗涤后与羊抗人ANP Ab(1∶20)，37℃反应2hr；PBS洗3次，再与兔抗羊IgG/Fab结合HRP(辣根过氧化物酶)(1∶200)反应15min；PBS洗3次，与DAB(二氨基联苯胺)显色剂反应显色。通过此免疫细胞化学方法来证实细胞转染的成功。其结果为阳性，在转染组细胞质中有棕色的颗粒形成，表明细胞转染的成功。(hANP RIA kit，兔抗山羊IgG/Fab’HRP标记，FITC-兔抗山羊IgG，DAB购自北京中山生物技术公司。)

(2)放免法检测ANP：从转染细胞株中分泌到培养基(n＝10)内的ANP浓度用特异性放射免疫法检测。通过此放免法检测ANP，证实细胞转染的成功。

3、转染细胞的微囊包被

将转染细胞计数采用通常方法制成密度为3×10⁶个/ml的细胞悬液，用注射器将200μl的细胞悬液注入上述制备好的聚己内酯微囊或聚氨酯的微囊中，微囊的开口用温热的手术钳封闭，然后将包被后的微囊放入2ml培养基中，在37℃，5％CO₂下培养生长。

4、在ANP从微囊中释放的峰值位相点，将微囊放入melatonin(1mg/ml)处理10分钟，然后，放入培养基在37℃，5％CO₂下培养生长。改变其时间生物学特征，使心房肽基因编码序列转染细胞的行为与血压昼夜节律变化同步。

经上述步操制成本发明的一种心房肽基因转染细胞微囊。

本实施例采用的永生化细胞优选CHO细胞，但本发明不限于CHO细胞。同样适用于其他永生化细胞，对于其他永生化细胞只须根据已有知识，选择相应合适的培养基及培养条件。从而制成多种本发明的心房肽基因转染细胞微囊。

然后，将本发明的心房肽基因转染细胞微囊作如下步骤的质量检测：

1、本发明的心房肽基因转染细胞微囊是否释放免疫活性ANP的检测：

方法：培养基每24hr收集并检测1次，用通常的特异性放射免疫法检测。

结果：特异性放射免疫法检测为阳性。见表1，在细胞被聚己内酯微囊包被2天后，培养基(n＝10)内的ANP浓度用特异性放射免疫法检测结果：ANP浓度为46.5pg/ml，包被9天后，培养基(n＝10)内的ANP浓度为241.8pg/ml。

表1

	时间(天)
										1	2	3	4	5	6	7	8	9
	ANP(pg/m)		46.5	81.1	124.5	158.6	162.0	165.4	221.0										241.8

	时间(天)
										10	11	12	13	14	15	16	17	18
	ANP(pg/m)	217.4	256.5	254.4	250.0	263.7	252.1	251.0	249.0										250.6

结论：表明本心房肽基因转染细胞微囊的确释放了ANP。

2、本发明的心房肽基因转染细胞微囊释放活性ANP的时间生物学特征检测：

方法：为了获得melatonin对ANP从心房肽基因转染细胞微囊中释放的时间生物学特征的影响，在ANP从心房肽基因转染细胞微囊中释放的峰值位相点，将心房肽基因转染细胞微囊放入melatonin(1mg/ml)处理10分钟，然后，放入培养基，培养基每4hr收集1次，收集24hr，用特异性放射免疫法检测。ANP释放的时间生物学特征分析方法如下：首先，将数据排列在表格中，横坐标代表取样时间，纵坐标代表各取样时间对应的特异性放射免疫法检测的浓度。其次，用简单余弦法分析上述数据确定ANP释放的时间生物学特征。

结果：见表2，表3。

表2放射免疫法检测的每4hr内从心房肽基因转染细胞微囊中释放ANP浓度，2组为经melatonin处理组。1组为未经处理组。

	时间(钟点)
							24	04	08	12	16	20
	ANP(pg/ml)1组	30.3	59.4	48.0	46.0	45.3							28.9
ANP(pg/ml)2组							31.6	39.0	53.3	47.3	42.5	40.8

表3用简单余弦法分析上述数据确定ANP释放的时间生物学特征参数：显示了心房肽基因转染细胞微囊内转染CHO细胞分泌的ANP水平呈昼夜节律性变化的mesor(midline estimating statistic of rhythm中值)，acrophase(顶相)，amplitude(振幅，P(概率值)。

	mesor	amplitude	acrophase	P
					未经melatonin处理组	43.0	13.8	4∶18	＜0.05
经melatonin处理组	42.4	9.07	7∶56	＜0.05

结论：本发明的心房肽基因转染细胞微囊释放活性ANP有时间生物学特征，而用melatonin处理可以改变微囊释放活性ANP的时间生物学特征，使其更适应治疗需要。

3、本发明的心房肽基因转染细胞微囊中转染细胞生长检测：

方法：为了检验心房肽基因转染细胞微囊是否适于转染细胞附着生长，将心房肽基因转染细胞微囊切开用PBS洗3次，然后用丙酮在37℃浸泡固定4分钟；洗涤后与羊抗人ANPAb(1∶20)，37℃反应2hr；PBS洗3次，再与兔抗羊FITC-兔抗山羊IgG反应15min；PBS洗3次，用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)检测转染细胞和生长情况。

结果：转染CHO细胞在被聚己内酯微囊包被6个月后，共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)检查发现：转染CHO细胞分布在聚己内酯微囊的内表面。

结论：本发明的心房肽基因转染细胞微囊适于转染细胞附着生长，转染细胞可在微囊中长期存在。

4、动物实验：

方法：将本发明的心房肽基因转染细胞微囊植入高血压病的大鼠(n＝10)腹腔，每鼠植入两个心房肽基因转染细胞微囊，然后将手术切口缝合。用血压计检测血压。对照组采用将包被有未经心房肽基因编码序列转染细胞的聚己内酯微囊或聚氨酯微囊植入高血压大鼠(n＝10)腹腔。每隔4小时检测血压，呼吸，心率，体温，尿量。实验持续五个月，每隔一个月将两只鼠腹内的聚己内酯或聚氨酯的微囊取出，在培养基内重新培养，检测微囊的完整性，释放ANP的水平。然后，将管切开，用共聚焦激光扫描显微镜检测。

结果：如表4，高血压大鼠(n＝10)(植入心房肽基因转染细胞微囊第15天)血压，呼吸，心率，体温，尿量( x±s)

参数	心房肽基因转染细胞微囊植入组	对照组
			收缩压(mmHg)	165.8±3.03*	179.6±3.03
心率(次/分)	349.0±6.62#	350.5±6.23
			尿量(ml/100g体重)/天	5.28±0.89*	3.78±0.66
呼吸；体温；体重	两组无显著性差异

●P＜0.05#与对照组无显著性差异

表5：高血压病大鼠植入心房肽基因转染细胞微囊的完整性，释放ANP的水平，心房肽基因转染细胞生长情况。

	第1月	第3月	第5月
				心房肽基因转染细胞微囊的完整性	完整，无细胞逸出。	完整，无细胞逸出。	完整，无细胞逸出。
释放ANP的水平(pg/ml)	260.1	255.2	248.7
				心房肽基因转染细胞生长情况，共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)检测	细胞贴壁生长，形态良好。	细胞贴壁生长，形态良好。	细胞贴壁生长，形态良好。

结论：心房肽基因转染细胞微囊植入高血压病的大鼠腹腔，可显著降低其血压，增加大鼠尿量，但不影响其正常生理行为。心房肽基因转染细胞微囊在体内可长期保持完整、ANP释放的水平保持平稳、心房肽基因转染细胞生长良好。

结语：以上实验说明心房肽基因转染细胞微囊可长期在高血压患者体内发挥作用，不影响患者正常生理。本发明适用于治疗高血压、心力衰竭、肾功能不全等疾病。实践应用中可根据患者情况及临床实际，选择心房肽基因转染细胞微囊的植入部位及个数，以达到最佳临床效果。

                  心房肽基因转染细胞微囊

<110>四川大学王正荣

<120>心房肽基因转染细胞微囊

<160>2

<210>1

<211>456

<212>DNA

<213>人种(Homo sapiens.)

<220>

<221>CDS

<222>(1)…(456)

<400>1

atg agc tcc ttc tcc acc acc acc ctg agc ttc ctc ctt tta ctg gca      48

Met Ser Ser Phe Ser Thr Thr Thr Val Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala

-25                 -20                 -15                 -10

ttc cag ctc cta ggt cag acc aga gct aat ccc atg tac aat gcc gtg      96

Phe Gln Leu Leu Gly Gln Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val

                -5              -1   1              5

tcc aac gca gac ctg atg gat ttc aag aat ttg ctg gac cat ttg gaa      144

Ser Asn Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Asn Leu Leu Asp His Leu Glu

        10                  15                  20

gaa aag atg cct tta gaa gat gag gtc gtg ccc cca caa gtg ctc agt      192

Glu Lys Met Pro Leu Glu Asp Glu Val Val Pro Pro Gln Val Leu Ser

    25                  30                  35

gag ccg aat gaa gaa gcg gcg gct gct ctc agc ccc ctc cct gag gtg      240

Glu Pro Asn Glu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val

40                  45                  50                  55

cct ccc tgg acc ggg gaa gtc agc cca gcg cag aga gat gga ggt gcc      288

Pro Pro Trp Thr Gly Glu Val Ser Pro Ala Gln Arg Asp Gly Gly Ala

                60                  65                  70

ctc ggg cgg ggc ccc tgg gac tcc tct gat cga tct gcc ctc cta aaa      336

Leu Gly Arg Gly Pro Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys

75                  80                  85

agc aag ctg agg gcg ctg ctc act gcc cct cgg agc ctc cgg aga tcc      384

Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser

        90                  95                  100

agg tgc ttc ggg ggc agg atg gac agg att gga gcc cag agc gga ctg      432

Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu

    105                 110                 115

ggc tgt aac agc ttc cgg tac tga                                      456

Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr

120                 125

<210>2

<211>151

<212>PRT

<213>人种(Homo sapiens.)

<400>2

Met Ser Ser Phe Ser Thr Thr Thr Val Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala

-25                 -20                 -15                 -10

Phe Gln Leu Leu Gly Gln Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val

                -5              -1   1              5

Ser Asn Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Asn Leu Leu Asp His Leu Glu

        10                  15                  20

Glu Lys Met Pro Leu Glu Asp Glu Val Val Pro Pro Gln Val Leu Ser

    25                  30                  35

Glu Pro Asn Glu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val

40                  45                  50                  55

Pro Pro Trp Thr Gly Glu Val Ser Pro Ala Gln Arg Asp Gly Gly Ala

                60                  65                  70

Leu Gly Arg Gly Pro Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys

75                  80                  85

Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser

        90                  95                  100

Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu

    105                 110                 115

Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr

120                 125

Claims (6)

1、一种心房肽基因转染细胞微囊，其特征在于在中空的聚己内酯微囊或聚氨酯微囊中包被人类心房肽基因编码序列转染的永生化细胞，上述聚己内酯微囊或聚氨酯微囊的囊体上的孔径为5-10nm，上述人类心房肽基因编码序列如下：

atg agc tcc ttc tcc acc acc acc ctg agc ttc ctc ctt tta ctg gca 48

Met Ser Ser Phe Ser Thr Thr Thr Val Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala

-25                 -20                 -15                 -10

ttc cag ctc cta ggt cag acc aga gct aat ccc atg tac aat gcc gtg 96

Phe Gln Leu Leu Gly Gln Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val

                -5              -1   1              5

tcc aac gca gac ctg atg gat ttc aag aat ttg ctg gac cat ttg gaa 144

Ser Asn Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Asn Leu Leu Asp His Leu Glu

        10                  15                  20

gaa aag atg cct tta gaa gat gag gtc gtg ccc cca caa gtg ctc agt 192

Glu Lys Met Pro Leu Glu Asp Glu Val Val Pro Pro Gln Val Leu Ser

    25                  30                  35

gag ccg aat gaa gaa gcg gcg gct gct ctc agc ccc ctc cct gag gtg 240

Glu Pro Asn Glu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu Pro Glu Val

40                  45                  50                  55

cct ccc tgg acc ggg gaa gtc agc cca gcg cag aga gat gga ggt gcc 288

Pro Pro Trp Thr Gly Glu Val Ser Pro Ala Gln Arg Asp Gly Gly Ala

                60                  65                  70

ctc ggg cgg ggc ccc tgg gac tcc tct gat cga tct gcc ctc cta aaa 336

Leu Gly Arg Gly Pro Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala Leu Leu Lys

            75                  80                  85

agc aag ctg agg gcg ctg ctc act gcc cct cgg agc ctc cgg aga tcc 384

Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala Pro Arg Ser Leu Arg Arg Ser

        90                  95                  100

agg tgc ttc ggg ggc agg atg gac agg att gga gcc cag agc gga ctg 432

Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu

    105                 110                 115

ggc tgt aac agc ttc cgg tac tga                                 456

Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr

120                 125

2、根据权利要求1所述的心房肽基因转染细胞微囊，其特征在于所说的永生化细胞是CHO细胞。

3、根据权利要求1所述的心房肽基因转染细胞微囊，其特征在于所说的永生化细胞是COS细胞。

4、根据权利要求1所述的心房肽基因转染细胞微囊，其特征在于所说的永生化细胞是EVC304人脐静脉内皮细胞、骨髓基质细胞、3T3TK成纤维细胞和人胚肺细胞中的一种。

5、根据权利要求1、2、3或4所述的心房肽基因转染细胞微囊，其特征在于所说的聚己内酯微囊是分子量为72000-90000道尔顿的聚己内酯85％混合pluronic F6815％制成的微囊。

6、根据权利要求1、2、3或4所述的心房肽基因转染细胞微囊，其特征在于所说的聚氨酯微囊为多嵌段聚醚型聚氨酯微囊。