CN1234417C - 用于自身免疫疾病免疫疗法的包含树突细胞的药物组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于自身免疫疾病免疫治疗的药物组合物，其包含(a)治疗有效剂量的成熟树突细胞，和(b)药学上可接受的载体；以及用于自身免疫疾病免疫治疗的方法。
Description
发明背景
发明领域
本发明涉及用于自身免疫疾病的免疫治疗的药物组合物，特别是用于自身免疫疾病免疫治疗的包含树突细胞(DC)的药物组合物及其使用。
相关技术描述
自身免疫是由免疫系统调控的破坏引起的，能够导致针对自身抗原和组织的炎症反应。自身免疫疾病与T淋巴细胞对自身抗原的破坏有关，包括多发性硬化症、胰岛素依赖型糖尿病(也称“IDDM”或“I型DM”)以及类风湿关节炎等(KJ Johnson等，Immunopathologyin Pathology，pp.104-153(1999))。
胰岛素依赖型糖尿病是由自身免疫T淋巴细胞对胰小岛中的β-细胞破坏引起的，可以通过检测到针对β-细胞中特异抗原如谷氨酸脱羧酶(GAD65)抗体的存在来进行诊断(Lohmann等，Lancet，343：1607(1994)；Yoon等，Science，284：1183-1187(1999))或对胰岛素抗体的存在进行诊断(Williams等，J.Autoimmun.13(3)：357-363(1999)；和Yu等，PNAS.USA，97(4)：1701-1706(2000))；但是，对于I型DM的准确病因和免疫机理以及遗传因素的理解还有待于进一步弄清，可靠的疗法也还没有开发出来。
尽管已有NOD(非肥胖糖尿病)小鼠(Makino等，Exp.Anim.，29：1-13(1980))和BB(BioBreeding)大鼠(Like等，Science，216：644-646(1982))被作为人类I型糖尿病的动物模型，但病因机制或治疗方法都没有被完全了解。
Green等(Immunity，9：733-743(1998))提出I型糖尿病涉及潜在的抗原呈递细胞DC；特别是在胰岛特异性TNF-α转基因NOD小鼠中，其在胰岛中进行的TNF-α局部表达引发了胰岛炎，这表明DC细胞迁移到炎症位点并诱导了针对胰岛特异性抗原的自身免疫T淋巴细胞的强活化，从而加速胰岛炎，最终导致了DM。
但是，Green等不能阐明在正常NOD小鼠中DM发展的机制。同时，报道DC细胞能够有效的提呈从凋亡细胞中所获得的抗原，并通过交叉提呈作用(cross-priming)活化细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)(Albert等，Nature，392：86-89(1998))。此外，Reovere等通过将正常小鼠和NOD小鼠进行对照阐明了DC与DM发展的相关性(J.Immunol.，161：4467-4471(1998)；和J.Leuk.Biol.，66：345-349(1999))。根据Rovere等，在正常小鼠中，胰岛β-细胞的再生是伴随着凋亡细胞的清除，主要是通过巨噬作用，部分是通过非成熟DC细胞，这些DC细胞诱导克隆消除或胰岛抗原特异性CTLs的无反应化，然后导致了对胰岛抗原的耐受。相反，在NOD小鼠中，由于有过量的凋亡细胞，大量非成熟DC细胞参与到凋亡细胞的消除过程中，在凋亡细胞的消除过程中一些DC细胞成熟并活化胰岛抗原特异性CTLs，导致了胰岛的破坏和DM的发展。
用B细胞缺陷型NOD(B-NOD)小鼠的研究指出在早期胰岛炎中B细胞扮演了抗原呈递细胞(APC)的作用的事实(Akashi等，Int.Immunol.，9：1159-1164(1997)；Noorchashm等，Diabetes，46：941-946(1997)；和Serreze等，J.Exp.Med.，184：2409-2053(1996))。但是，还有一些报道表明在早期的DM中主要是和DC而不是B细胞相关；Green等表明在TNF-α-NOD小鼠模型中缺乏B细胞情况下，也有DM的发生(Curr.Opinion.Immunol.，11：663-669(1999))，Delon等指出在DM的发展中，活化的DC要比同样数量的活化B细胞强10倍(J.Exp.Med.，188：1473-1484(1988))，Voorbij等表明在早期DM的过程中，有大量的DC浸润到NOD小鼠或BB大鼠的胰岛中(Diabetes，38：1623-1629(1989)；Jansen等，Diabetes，43：667-675(1994)；Dahlen等，J.Immunol.，160：3585-3593(1998)；Papaccio等，J.Cell Biochem.，74：447-457(1999)；Rosmalen等，Lab Invest.，80：23-30(2000)；和Rosmalen等，Lab Invest.，80：769-777(2000))。此外，Ludwig等报道EAE(实验性自身免疫性脑炎)，一种自身免疫性脑部疾病的动物模型，能够被自身抗原的表达或有自身抗原加载的DC细胞所启动(Ludwig等，J.Exp.Med.，188：1493-1501(1998)；和Dittel等，J.Immunol.，163：32-39(1999))。这些研究都表明了在DM发展中DC的关键作用。
在近来DM的DC治疗中突破性研究中，最成功的是通过用IFN-γ处理过的低粘附性脾DC细胞(分离自于正常的NOD小鼠的脾)腹膜注射到1-4周龄的NOD小鼠中，使NOD小鼠DM的发生减少(从70％到26.3％)(Shinomiya等，Clin.Exp.Immunol.，117：38-43(1999))。Shinomiya等证实ICR脾DC细胞被转移到NOD小鼠中起到相似的预防效应。在其它试验中，Shinomiya等观察到如果在出生后第4周和第6周注射2次DC，经过30周所有6只NOD小鼠中都没有DM发生。除了在1-4周龄的NOD小鼠中DC的强预防作用外，DC注射6周龄或更大的NOD小鼠是没有作用的。Clare-Salzler等(Clare-Salzler等，J.Clin，Invest.，90：741-748(1992))表明注射胰腺淋巴结DC的NOD小鼠表现出明显的MD预防效果。这些结果表明DC能够被用于DM的预防目的。
而且，人γ-球蛋白(HGG)处理从NOD小鼠中分离脾DC细胞，在12只NOD小鼠中有11只NOD小鼠表现出DM的预防效应，并且这种预防效应持续25周，注射DC的NOD小鼠的胰岛培养物中被证实含有被降低水平的IFN-γ和TNF-α以及被升高水平的IL-4和IL-10(Papaccio等，Endocrinology，141：1500-1505(2000))。相反，未经HGG处理的DC没有表现出任何DM预防效应。这些结果表明对非正常免疫反应的控制可能是通过DC的适当活化，同时也表明DC的不正常活化可作为在I型DM患者或NOD小鼠中的病因之一。实际上，一些研究者已经指出在I型DM患者中(Jansen等，Lancet，345：491-492(1995)；和Takahashi等，J，Immunol.，161：2629-2635(1999))和在NOD小鼠中(Serreze等，J.Immunol.，150：2534-2543(1993))抗原呈递细胞(APC)是可能的病因。未成熟DC对T淋巴细胞的调控失败也被认为是导致DM的原因之一(Delemarre等，J.Immunol.，162：1795-1801(1999))。此外，Lee等表明NOD小鼠的骨髓衍生的DC细胞很难成熟为骨髓DC细胞，与C57BL/6小鼠相比表现出II型MHC、共刺激分子(B7-1和B7-2)，CD40和降低水平的IL-12分泌物的表达(J.Korean Med.Sci.，15：217-223(1999))。Takahashi等的研究(J.Immunol.，161：2629-2635(1999))表明成熟的单核来源的DC(Mo-DC)不能够有效活化T淋巴细胞支持了这些结果，原因之一被认为是在I型DM患者中B7分子的低表达。
尽管上述结果表明DC在I型DM中的关键作用以及用DC对I型DM的预防可能性，用DC对DM进行治疗应用还有待于进一步研究。
目前，用于治疗或缓解类风湿关节炎的药物包括氨甲蝶呤，硫唑嘌呤，环磷酰胺和皮质类固醇(Johnson CJ等，Ann.Pharmacother.，35(4)：464-471(2001)；和Seymour HE等，Br.J.Clin.Pharmacol.，51(3)：201-208(2001))。但是，所述的药物不能有效预防关节的损坏而且有多种副作用。
美国专利6,007,821揭示了自身免疫疾病的治疗方法和药剂，其包括gp96，hsp90和hsp70。美国专利6,098,631揭示了用鞘磷脂信号转导通路的抑制剂来治疗自身免疫疾病的方法。此外，美国专利6,184,253揭示了给予需要治疗的病人有效治疗剂量的托瑞米芬或其药用盐的方法来治疗自身免疫疾病。
贯穿本申请的全文，括弧号中为引用的不同的发明和出版物。这些发明和出版物以其标题名称被本申请所引用是为了使所述的本发明已经与本发明相关的技术领域能够被充分的理解
发明概要
本发明已经从鼠的脾脏中分离了特定的树突细胞亚群，并已经发现用适当的细胞因子处理该树突细胞亚群使之成熟具有能够缓解或消除自身免疫反应的效果，从而完成本发明。
相应的，本发明的目的是提供用于自身免疫疾病的免疫治疗的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供自身免疫疾病的免疫治疗方法。
本发明的其它目的和优势在接下来的详细描述以及权利要求书和图表中将清晰的表现出来。
附图简述
图1a-1f为本发明所用的分离特定树突细胞的方法简要示意图。
图2a-2d为实施例中分离的树突细胞表面蛋白表达模式的FACS结果。
图3为根据分离方法得到CD11b-/CD8a+/CD86-产量。
图4表明在IFN-γ存在情况下培养的所分离的CD11b-/CD8a+/CD86-树突细胞的存活能力。
图5a表明NOD小鼠血糖水平随着时间的变化。
图5b为NOD小鼠的糖尿病随着时间的发展模式。
图6a为单注射DC的初始反应的评价。数值代表具有初始反应的NOD小鼠的百分比；括号中的数值代表被测试的NOD小鼠的总数。
图6b为在注射DC的NOD小鼠中基于DC亚群的DC的变化所产生的初始反应和血糖正常化所持续的时间。
图6c表明在用DC注射和加强的NOD小鼠产生的血糖正常化所持续的时间以DC亚群为基础的变化。
图7为胰岛的苏木精和伊红染色结果，表示了DC对于糖尿病的治疗效果。
图8为胰岛素的免疫组化染色结果，表明DC对于糖尿病的治疗效果。
图9为体内DC和自身免疫T淋巴细胞迁移的结果。
图10a表示在胰腺淋巴结细胞中IL-4和IFN-γ含量的变化，该细胞分离自具有早期糖尿病的NOD小鼠中，用胰岛抗原处理过。
图10b表示在胰腺淋巴结细胞中IL-4和IFN-γ含量的变化，该细胞分离自糖尿病被治愈的NOD小鼠中，表明了免疫反应的转换。
图11表明了在用IFN-γ处理后CD11b-/CD8a+DC的形态学变化。
图12表明分离自人外周血的CD11c-和CD11c+DC的形态学变化。
发明详述
本发明的一个方面是提供了用于自身免疫疾病的免疫治疗的药物组合物，其包括(a)有效治疗剂量的成熟树突细胞；及(b)药物上可接受的载体。
此处所用的术语“成熟树突细胞”是指用适当的细胞因子作用于没有表面共刺激分子(如对于小鼠来说，为B7分子，CD80或CD86)的非成熟树突细胞，在体内或者体外得到的成熟的树突细胞。树突细胞在下文中简称为“DC”。
术语“治疗”或“处理”是指(a)预防或阻止在动物身上发生自身免疫性疾病，所述动物优选的为哺乳动物，更为优选的是易发该种疾病但尚未诊断具有该疾病的人。(b)自身免疫性疾病的抑制，即抑制其发展；和(c)缓和或减轻自身免疫性疾病。
本发明中，可用DC进行治疗应用的自身免疫性疾病包括由自身免疫反应所导致的任何疾病或功能紊乱，包括I型DM，类风湿性关节炎，多发性硬化症，系统性红斑狼疮，sjogren综合症，硬皮病，多肌炎，慢性活动性肝炎，混合性结缔组织病，原发性胆汁性肝硬变，恶性贫血，自身免疫性甲状腺炎，独特型Addison病，白斑，谷胶肠病，Graves病，重症肌无力，自身免疫性嗜中性白血球减少症，血小板减少紫癜，肝硬化，寻常性天疱疮，自身免疫性不育，Goodpasture病，大疱性类天疱疮，盘状狼疮，溃疡性结肠炎以及致密沉积物疾病。本发明的药物组合物优选可适用的疾病为I型DM或类风湿性关节炎。
如上所述，尽管DC的DM预防效应已经被公开，用成熟的DC作为I型DM的治疗性应用还没有被尝试。因此，本发明中的发现，即用成熟的DC对I型DM成功的治疗性应用是新颖并令人惊讶的。此外，用DC对I型DM治疗的可行性提示了用DC可以进行其它自身免疫性疾病的免疫治疗。
例如，类风湿性关节炎代表了一类系统性慢性自身免疫性疾病，关节中的炎症能够持续的浸润到软骨和骨样组织，导致了骨腐蚀作用。II型胶原蛋白，关节中的一种主要组分，是已知能够导致关节炎的抗原，已经有报道表明II型胶原蛋白能够在具有特异性MHC抗原的小鼠中导致类风湿性关节炎(LK Myers等，Life Sci.，19：1861-1878(1997))。在关节炎病人中，从巨噬细胞或成纤维细胞中分泌的细胞因子的量是增加的，Th1特异性细胞因子包括IFN-γ和IL-2也增加。Th1特异性细胞因子与包含IL-4和IL-10在内，有关节炎预防效果的Th2细胞因子作用相反，能够使关节炎恶化。而且，SH Kim等将表达Th2细胞因子，IL-4或IL-10的关节炎诱导的小鼠病毒载体注射到腿中后，能够在注射和非注射的腿中都得到关节炎的治疗效果(SH Kim，等，J.Immunol.，166：3499-3505(2001))。这些发现表明类风湿性关节炎和I型糖尿病具有相同的病因以及相同的自身免疫反应治疗机理，而对于类风湿性关节炎来说具有不同的MHC抗原。
基于这些原因，本发明所使用的对DM有效的DC也能够治疗类风湿性关节炎。
在本发明的优选实施方案中，成熟的DC能够通过直接从动物体内分离成熟DC制备，或通过用适当的细胞因子处理分离的未成熟DC使之成熟。此外，本发明中所使用的DC可以从动物体内分离，优选的为哺乳动物，更为优选的为人的器官，组织，骨髓或血液。
使DC成熟的适合细胞因子包括IFN-γ，TNF-α，TGF-β，IL-4和IL-10，其中IFN-γ最适合。使DC成熟所使用的IFN-γ量为102-106DC/单位，更优选的为104-105DC/单位。
根据本发明，成熟DC对于自身免疫疾病的治疗效果是通过抑制自身免疫性T淋巴细胞的活性，即通过将自身免疫性Th1淋巴细胞转化为Th2淋巴细胞或通过产生新的Th2淋巴细胞来完成。
尽管异源或同源的DC可用于本发明，由于他们对于自身免疫性疾病的显著效果同源DC是优选的。此处所用的术语“异源DC”是指从主要组织相容性异于受体的供体上分离得到的DC。例如，将NOD小鼠(H-2bIA-g7)作为受体的情况下，从BalB/c小鼠(H-2d；C3H，H-2k)中分离得到的被认为是异源DC。
根据本发明优选的实施方案，淋巴和骨髓DC都适合，从治疗效果来看淋巴DC更为优选。此处所用的术语“淋巴DC”是指和T细胞和B细胞具有相同造血祖细胞谱系的DC，例如：对于小鼠来说，表面蛋白为CD11b-/CD8a+表型的DC，“骨髓DC”是指和单核细胞及巨噬细胞具有相同造血祖细胞谱系的DC，例如：对于小鼠来说，表面蛋白为CD11b+/CD8a-表型的DC。
根据本发明的最优选实施方案，本发明的药物组合物含有表面表型为CD11c-/CD4a+的人DC亚群。通过用适当的细胞因子如IFN-γ处理，使CD11c-/CD4a+DC成熟为CD11c-/CD4a+/CD86+DC。相应于CD11c-/CD4a+人DC的小鼠DC亚群为CD11b-/CD8a+DC，如实施例中所示。
根据最优选的实施方案，本发明提供用于自身免疫疾病的免疫治疗的药物组合物，其包括(a)通过用IFN-γ预处理制备的有治疗效果剂量的成熟DC，以及(b)药学上可接受的载体。
在本发明的药物组合物中，药学上可接受的载体可以是常规用来制剂的一种，包括但不限于乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，D-甘露醇，淀粉，阿拉伯树胶，磷酸钙，藻酸盐，明胶，硅酸钙，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素，水，糖浆，甲基纤维素，甲羟基苯甲酸脂，丙羟基苯甲酸脂，滑石，硬脂酸，镁和矿物油。本发明的药物组合物进一步包括湿润剂，甜味剂，乳化剂，悬浮剂，防腐剂，调味剂，香料，润滑剂或这些物质的混合物。此外，本发明的药物组合物能够被容易的制备，因为该药物组合物中包含生理盐水作为载体。
本发明的药物组合物可以经口服或经肠胃外给药，肠胃外给药包括静脉注射，皮下注射，肌内注射以及腹膜内注射。而且，根据疾病不同给药模式也可以变化，例如对于I型DM来说，腹膜注射可能是优选的，因为注射的DC能够迁移到胰腺而不会被进一步稀释。此外，静脉注射适用于类风湿性关节炎，但最优选的给药方式是在关节附近直接注射。
本发明药物组合物的确切剂量可以根据特定的剂型，应用方式，年龄，体重，患者性别，饮食，给药时间，患者条件，药品组合，反应敏感性和疾病的严重程度而变化。可以理解的是普通的医师可以很容易的确定并处方本发明药物组合物的正确剂量。对于I型DM患者腹膜注射剂量的实例为106-107成熟DC，对于类风湿性关节炎患者来说，在关节中注射105-106成熟DC。
根据本领域的技术人员已知的常规方法，本发明的药物组合物可以与药学上可接受的载体和/或上述的载体制剂，最终提供的几个剂型包括单位剂量形式。非限定性剂型的实例包括但不限于溶液，悬浮液或乳液，提取物，酏剂，粉剂，颗粒剂，片剂，胶囊，硬膏剂，涂抹剂，洗液以及油膏。
本发明的另一个方面，提供了自身免疫疾病免疫治疗的方法，包括的步骤为(a)制备成熟DC；和(b)给予哺乳动物包含(i)治疗有效剂量的成熟DC以及(ii)药学上可接受的载体的药物组合物。
本方法的特征是使用上述的成熟DC。因此，本发明方法和药物组合物中相同的描述被省略以避免说明书的复杂性，导致的不必要的重复。
本发明中，可用本方法进行治疗的自身免疫性疾病包括由自身免疫反应所导致的任何疾病或功能紊乱，包括I型DM，类风湿性关节炎，多发性硬化症，系统性红斑狼疮，Sjogren综合症，硬皮病，多肌炎，慢性活动性肝炎，混合性结缔组织病，原发性胆汁性肝硬变，恶性贫血，自身免疫性甲状腺炎，独特型Addison病，白斑，谷胶肠病，Graves病，重症肌无力，自身免疫性嗜中性白血球减少症，特发性血小板减少性紫癜，肝硬化，寻常性天疱疮，自身免疫性不育，Goodpasture病，大疱性类天疱疮，盘状狼疮，溃疡性结肠炎以及致密沉积物疾病。本发明的方法可适用的疾病优选的为I型DM或类风湿性关节炎。
在本发明的优选实施方案中，成熟的DC能够通过直接从动物体内分离成熟DC制备，或通过用适当的细胞因子处理分离的未成熟DC使之成熟。此外，本发明中所使用的DC可以从动物体内分离，优选的为哺乳动物，更为优选的为人的器官，组织，骨髓或血液。
在本发明的治疗方法中，异源或同源的DC都可以使用，同源DC是优选的。淋巴DC适用于这种治疗方法，其中CD11c-/CD4+DC亚群更为适合。CD11c-/CD4a+DC经过IFN-γ处理会成熟为CD11c-/CD4a+/CD86+。
在本发明的治疗方法中，单次给予DC是有效果的，但是，经过初次注射后再进行附加注射强化是更优选的。而且，用于强化的优选的候选者为反式异源DC。“反式异源DC”这一术语表示DC供体的MHC抗原和初次使用的不同。
根据本发明，给药的步骤为口服或经肠胃外给药。肠胃外给药包括静脉注射，皮下注射，肌内注射以及腹膜内注射。而且，根据疾病不同给药模式也可以变化，例如对于I型DM来说，腹膜注射可能是优选的，因为注射的DC能够迁移到胰腺而不会被进一步稀释。此外，静脉注射适用于类风湿性关节炎，但最优选的给药方式是在关节附近直接注射。
根据本发明的实施例，I型DM的发展根据下列症状被分为6个阶段(Eisenbarth，New Engl.J.Med.314：1360-1368(1986))：(a)阶段I的特征为在没有DM产生的明显症状时表现出实质性的遗传易感性；(b)阶段II，激发针对胰岛β-细胞的自身免疫反应的活化；(c)阶段III的特征表现为胰岛β-细胞的降低，非正常免疫如针对胰岛素和胰岛细胞胞浆抗原的自身免疫抗体的出现；(d)阶段IV的特征为胰岛β-细胞持续降低导致胰岛素的分泌也降低，尽管表现为正常的血糖水平；(e)阶段V表现出明显的DM的症状(高血糖症)以及约有90％的胰岛β-细胞被破坏，需要胰岛素处理以维持病人的存活；和(f)阶段VI表示所有胰岛β-细胞被破坏，以及血中的C肽的缺失。根据DM的发展阶段，本发明的药物组合物和方法可以应用于所有发展阶段，能够提高治疗效果。优选的，本发明适用于在步骤II-V的患者，即使处于步骤V的患者也能够得到明显的改善。
下面的具体实施例用来说明本发明，和所附加的权利要求书一样不应解释为对被发明范围的限制。
实施例I：从鼠皮中分离CD11b-/CD8a+/CD86-树突细胞(DC)I-1：分离CD11b-/CD8a+/CD86-树突细胞(DC)(方法1)
从ICR或BalB/c小鼠(Daehan Biolink，Korea)中取出脾脏，在有盖培养皿中用PBS漂洗，然后将胶原酶溶液(100单位/ml PBS：SigmaType IV，USA)用注射器注射到经过漂洗的脾脏中。反应5分钟后，用注射针头将脾脏切开使得脾脏细胞能够渗出到胶原酶溶液中。通过将脾脏和胶原酶溶液在50ml管中，RT(室温)下反应25分钟，从而将剩余的脾脏细胞分散到胶原酶溶液中。
10mM EDTA被加入到胶原酶溶液并充分混合。经过离心过滤后，脾脏细胞被悬浮到含2％FCS，10mM HEPES和10mM EDTA的冷PBS中，然后在Ficoll-Hypaque(Amersham Pharmacia Biotech，USA)中离心分离低密度细胞。分离的细胞用PBS漂洗两次，重新悬浮，在上层用17.5％甲泛葡胺(No.M3383；Sigma，USA)溶液覆盖，然后再次离心分离低密度细胞。分离的细胞用MACS溶液(PBS，包含0.5％BSA和2mM EDTA)漂洗，计数并与10μl/107细胞的抗CD90，CD19和NK的磁化抗体(Microbeads：No.130-049-101，130-049-601，130-052-501；Miltenyi Biotech，Germany)在6-12℃反应15分钟，然后过LS或MS柱(No.130-042-401，130-042-201；Miltenyi Biotech，Germany)。为分离CD11b-/CD8a+DC，用10μ1/107细胞的抗CD8a抗体(No.130-049-401；Miltenyi Biotech，Germany)在6-12℃反应15分钟，然后连续过MS柱。通过用1ml的MACS溶液洗脱将柱中的结合的CD11b-/CD8a+/CD86-DC收集。本实施例简要的操作过程如图1a所示。
I-2：分离CD11b-/CD8a+/CD86-树突细胞(DC)(方法2)
从ICR或BalB/c小鼠(Daehan Biolink，Korea)中取出脾脏，在有盖培养皿中用PBS漂洗，然后将胶原酶溶液(100单位/ml PBS：SigmaType IV，USA)用注射器注射到经过漂洗的脾脏中。反应5分钟后，用注射针头将脾脏切开使得脾脏细胞能够渗出到胶原酶溶液中。通过将脾脏和胶原酶溶液在50ml管中，RT(室温)下反应25分钟从而将剩余的脾脏细胞分到胶原酶溶液中。
10mM EDTA被加入到胶原酶溶液并充分混合。离心后，在RT下通过在10ml红细胞特异性裂解缓冲液(0.14M NH4Cl，0.02M Tris-Cl，pH 7.2)反应10分钟将红细胞破坏。将红细胞被破坏的脾脏细胞重新悬浮到5％FBS-RPMI 1640(Gibco BRL，USA)溶液中，介质体积被调整到不超过1×108细胞/100mm皿，并在37℃孵育90分钟。孵育后，以松散方式粘接到平皿底部的细胞用吸管移去9-10次。剩余的松散连接的细胞用10ml在37℃水浴中预先温热的RPMI 1640以前述同样的漂洗方式移去。10ml/皿的预先加热的5％FBS-RPMI 1640被重新补充并孵育60分钟。孵育后，细胞以如前所述的方式漂洗两次。在最终的漂洗后，10ml/皿的5％FBS-RPMI 1640更新，然后孵育18-24小时。收集悬浮在介质中的细胞。收集松散粘接到平皿上的细胞，细胞在5ml 5％FBS-RPMI 1640中漂洗。
收集的细胞被计数并与10μl/107细胞的抗CD90，CD19和NK的磁化抗体(Microbeads：No.130-049-101，130-049-601，130-052-501；Miltenyi Biotech，Germany)在6-12℃反应15分钟，然后过LS或MS柱(No.130-042-401，130-042-201；Miltenyi Biotech，Germany)。为分离CD11b-/CD8a+DC，与10μl/107细胞的抗CD8a抗体(No.130-049-401；Miltenyi Biotech，Germany)在6-12℃反应15分钟，然后连续过MS柱。通过用1ml的MACS溶液(冷PBS中包含2mM EDTA和0.5％BSA)洗脱，将柱中结合的CD11b-/CD8a+DC收集。本实施例简要的操作过程如图1b所示。
实施例II：从小鼠脾脏中分离CD11b-/CD8a+/CD86+树突细胞(DC)II-1：分离CD11b-/CD8a+/CD86+树突细胞(DC)(方法3)
从ICR或BalB/c小鼠(Daehan Biolink，Korea)中取出脾脏，在有盖培养皿中用PBS漂洗，然后将胶原酶溶液(100单位/ml PBS：SigmaType IV，USA)用注射器注射到经过漂洗的脾脏中。反应5分钟后，用注射针头将脾脏切开使得脾脏细胞能够渗出到胶原酶溶液中。通过使脾脏和胶原酶溶液在50ml管中，RT(室温)下反应25分钟，从而将剩余的脾脏细胞分散到胶原酶溶液中。
10mM EDTA被加入到胶原酶溶液并充分混合。经过离心后，脾脏细胞再悬浮到含2％FCS，10mM HEPES和10mM EDTA的冷PBS中，然后在Ficoll-Hypaque(Amersham Pharmacia Biotech，USA)中离心分离低密度细胞。分离的细胞用PBS漂洗两次，重新悬浮，在上层用17.5％甲泛葡胺(No.M3383；Sigma，USA)溶液覆盖，然后再次离心分离低密度细胞。分离的细胞用MACS溶液(PBS，包含0.5％BSA和2mM EDTA)漂洗，计数并与10μl/107细胞的抗CD90，CD19和NK的磁化抗体(Microbeads：No.130-049-101，130-049-601，130-052-501；Miltenyi Biotech，Germany)在6-12℃反应15分钟，然后过LS或MS柱(No.130-042-401，130-042-201；Miltenyi Biotech，Germany)。为分离CD11b-/CD8a+DC，与10μl/107细胞的抗CD8a抗体(No.130-049-401；Miltenyi Biotech，Germany)在6-12℃反应15分钟，然后连续过MS柱。通过用1ml的MACS溶液洗脱将柱中结合的CD11b-/CD8a+DC收集。本实施例简要的操作过程如图1c所示。
II-2：分离CD11b-/CD8a+/CD86+树突细胞(DC)(方法4)
从ICR或BalB/c小鼠(Daehan Biolink，Korea)中取出脾脏，在有盖培养皿中用PBS漂洗，然后将胶原酶溶液(100单位/ml PBS：SigmaType IV，USA)用注射器注射到经过漂洗的脾脏中。反应5分钟后，用注射针头将脾脏切开使得脾脏细胞能够渗出到胶原酶溶液中。通过将脾脏和胶原酶溶液在50ml管中，RT(室温)下反应25分钟，从而将剩余的脾脏细胞分散到胶原酶溶液中。
10mM EDTA被加入到胶原酶溶液并充分混合。经过离心后，脾脏细胞被洗到含2％FCS，10mM HEPES和10mM EDTA的冷PBS中。洗涤后，脾脏细胞被重新悬浮到1ml/小鼠的高密度BSA溶液(38％BSA)中，5-6ml的再悬浮溶液在15ml管中等分。分离低密度细胞，1-1.5ml的冷RPMI 1640被轻轻的覆盖到溶液上并离心。将被分离的细胞漂洗两次并计数。
被分离的脾脏细胞被重新悬浮到10％FCS-RPMI 1640(Gibco BRL，USA)中，介质体积被调整到不超过1×108细胞/100mm皿，并在37℃孵育2小时。孵育后，以松散方式粘接到平皿底部的细胞用吸管移去9-10次。剩余的松散连接的细胞用10ml的在37℃水浴中预先加热的RPMI 1640以前述同样的漂洗方式移去。10ml/皿的预先加热的10％FBS-RPMI 1640被重新补充并孵育18小时。收集悬浮在孵育介质中的细胞。收集松散连接到平皿上的细胞，细胞在5ml 10％FBS-RPMI 1640中漂洗。
收集的细胞被计数，并与10μl/107细胞的抗CD90，CD19和NK的磁化抗体(Microbeads：No.130-049-101，130-049-601，130-052-501；Miltenyi Biotech，Germany)在6-12℃反应15分钟，然后过LS或MS柱(No.130-042-401，130-042-201；Miltenyi Biotech，Germany)。为分离CD11b-/CD8a+DC，与10μl/107细胞的抗CD8a抗体(No.130-049-401；Miltenyi Biotech，Germany)在6-12℃反应15分钟，然后连续过MS柱。通过用1ml的MACS溶液(冷PBS中包含2mM EDTA和0.5％BSA)洗脱，将柱中结合的CD11b-/CD8a+DC收集。本实施例简要的操作过程如图1d所示。
实施例III：淋巴树突细胞(DC)的分离效率和细胞表面蛋白表达的比较
从实施例I和II中分离的DC用PE(藻红蛋白)和FITC(异硫氰酸荧光素)标记的单克隆抗体(Pharmingen，USA)进行免疫染色并按如下方法测定：从实施例I和II中分离的2×104DC被分装到各流式细胞管中(Falcon 2052：Becton Dickinson，USA)，加入3ml的流式细胞溶液(0.2％BSA，在冷的PBS中)并离心。离心后，细胞被重新悬浮到200μl的流式细胞溶液中，和4μl的荧光标记的单克隆抗体混合，并在4℃反应30分钟。依次加入3ml的流式细胞溶液，将未结合的抗体移去并离心。离心的细胞被完全悬浮到200μl的流式细胞溶液中并用装有流式细胞分析程序(CellQuest software，USA)的流式细胞仪(FACScalibur flow cytometer；Becton Dickinson，USA)分析(Fig.2)。
如图2所示，被分离的细胞没有被抗CD3，CD19和CD14所免疫染色，这些分别为T细胞，B细胞和单核细胞的表面标志分子。这个结果表明从实施例I和II中分离的为DC，而不是淋巴细胞和单核细胞。此外，B7分子(CD80/CD86)的低表达，其表达在活化的抗原呈递细胞(APC)表明从实施例I中分离的DC为未成熟DC亚群而不是完全成熟的DC。相反，从常规的实施例II中分离的细胞表明了B7分子的高表达。而且，已经证实如实施例I所描述应用17.5％甲泛葡胺的方法1中表明在细胞数目上比结合应用的方法2有高7倍的分离效率(图3)。
实施例IV：经IFN-γ处理的分离CD11b-/CD8a+/CD86-树突细胞(DC)的存活能力
2×106细胞/ml的CD11b-/CD8a+/CD86-DC，按照如实施例I中所描述的方法1分离，被悬浮到包含100U/ml的IFN-γ(PharMingen19301T，USA)的10％FBS-RPMI 1640(Gibco RBL 31800-022，USA)，并孵育15小时。如图4所示，在孵育15小时后分离细胞的存活能力为50-60％。
实施例v：依赖于NOD小鼠年龄的自发性糖尿病(DM)的发生率和血糖水平的治疗标准的测定
7-8周龄的雌性NOD/Ltj小鼠(Jackson，USA)在控制室温(23±2℃)和湿度(55±10％)情况下，在饲养笼中饲养。小鼠饲养槽(Myungjin，Korea)中不超过每笼5只，并有12小时/天的人工日光。水和饲料(Samyang-Feed，Korea)随意供给。
通过测量体重和血糖水平每周于上午十点检查DM的情况。血液的样本用肝素预处理过的毛细管(Chase 2051，USA)取自视网膜静脉，并用血糖计(Glucotrend；Boehringer Mannheim，Germany)测试血糖浓度，用动物天平(Mettler，USA)测量体重。
24周后，有57.75％的小鼠表现出糖尿病的症状(67/116NOD小鼠)，并有超过80％的NOD小鼠，其血糖浓度一度达到约200mg/dl，表现出严重的糖尿病病程(图5a)。图5a在图5b中简要描述。在图5b中，类型A小鼠在10-12周中表现出具有迅速的糖尿病发展(一周内血糖水平达到400mg/dl)，类型B小鼠在16-18周中表现出具有相对较低的糖尿病发展(两周内血糖水平达到400mg/dl)，而类型C小鼠在20周或更晚表现出非常低的糖尿病发展(四周或更晚血糖水平达到400mg/dl)。类型A，B和C为以具有糖尿病倾向(DP)分类的小鼠，其它小鼠的血糖水平甚至在24周后还低于150mg/dl，被分类为具有糖尿病抗性的小鼠(DR)。
下文中，所有的实施例都是用图5中类型B小鼠(16-22周龄)进行，如实施例VI所示在实施例I-1中分离的DC被腹膜注射到高血糖水平(200mg/dl)的小鼠中。
实施例VI：在糖尿病NOD小鼠中腹膜注射树突细胞(DC)的治疗效果
VI-1：单次注射树突细胞(DC)亚群的治疗效果
将实施例I-1中分离的CD11b-/CD8a+/CD86-DC或其它DC亚群用PBS清洗两次后，将每支1×106细胞/400μl PBS腹膜注射到糖尿病NOD小鼠中。然后，按照实施例V中描述的方法连续4周测定体重和血糖。并结合初始反应和反应持续时间来分析治疗效果。初始反应表明当注射DC后血糖降低到低于200mg/d作为起点，反应持续时间以从初始反应时间到当血糖水平升高到高于200mg/dl时治疗的持续时间(天)(图6a和6b)。
图6a和6b表明在单次注射DC后初始反应和持续时间。同源DC为从具有相同的主要组织相容性抗原(MHC，如NOD小鼠)所分离，异源DC为从具有不同MHC的其它小鼠(BalB/c小鼠)中分离。
如图6所示，所有IFN-γ处理的DC亚群在早期糖尿病(early DM)阶段表现出初始反应。反应持续时间从1到130天。
对于明显的DM和晚期DM，仅有IFN-γ处理过的异源淋巴DC表现出初始反应。特别的，IFN-γ处理过的骨髓DC只在早期DM中表现出初始反应，而在明显的DM或晚期DM中都没有，这表明淋巴DC和骨髓DC的不同机制。此外，IFN-γ处理过的同源DC在早期DM中也表现出治疗效果。
这些结果表明控制或除去自身免疫T淋巴细胞是可行的，如果DC能够在体外被以适当的方式分化或成熟。
VI-2：重复腹膜注射异源淋巴CD11b-/CD8a+/CD86-DC亚群的治疗效果
尽管单次注射根据小鼠不同表现出降低的血糖水平持续130天，但大多数例子表明这只是暂时效应。因此，异源淋巴CD11b-/CD8a+/CD86-DC，在单次注射中被评价为最有效的DC，其在体外经IFN-γ处理活化，按照如下程序重复注射(加强)IFN-γ处理的CD11b-/CD8a+/CD86-DC，用来延长或终身的治疗效果：
IFN-γ处理过的异源淋巴CD11b-/CD8a+/CD86-DC从ICR或BalB/c小鼠中分离，以实施例VI-1同样的方式注射到17-23周龄的5只具有DM症状的NOD小鼠，并当血糖水平提高时或提前进行加强。如图6c所示，用相同的异源DC加强表现出非常短的效应。但是，反式-异源-DC处理(BalB/c到ICR，BalB/c到C3H或ICR到BalB/c)，通过两次加强表现出延长的血糖降低。在图6c中，只用从ICR小鼠中分离的DC就有足够的效果可以用反式-异源-DC效应解释，这是因为ICR小鼠为远系繁殖的品系。
实施例VI-3：只用IFN-γ处理的治疗效应
如实施例VI-1所示，IFN-γ为用DC治疗DM的先决条件。因此，要评价单独用IFN-γ对于DM的效应。实施例V中的NOD小鼠用600U/鼠的IFN-γ注射，但所有的小鼠都没有表现出任何的治疗效应，只有一只小鼠在表现出短暂的治疗效应后死去。这个结果表明了IFN-γ处理过的DC对于DM的治疗效果，如实施例V-1所描述，不是由于IFN-γ自身，而且是局部免疫反应而不是系统免疫。
实施例VII：DC对于DM治疗的组织病理学确认
VII-1：胰腺的苏木精和伊红(H&E)染色确认
在实施例V中所用的具有早期DM的NOD小鼠用异源的IFN-γ处理的淋巴CD11b-/CD8a+/CD86-DC(1×106细胞/鼠)按照实施例VI-1中的描述进行腹膜注射，在DC注射后4周，小鼠被断头并移出胰腺。移出的胰腺固定在10％的中性福尔马林中24小时，用酒精脱水，埋入石蜡中并用切片机(Zeiss Super Cut 2050，Germany)切成4μm厚度。然后，切片用苏木精和伊红染色，并在光学显微镜(Nicon，Japan)下观察胰岛炎的等级(图7)。胰岛炎被按照如下方式分级：胰岛炎0级，没有淋巴细胞浸润；1级，低于25％的胰岛被淋巴细胞浸润；2级，25-50％的胰岛被淋巴细胞浸润；3级，50-75％的胰岛被淋巴细胞浸润；以及4级，超过75％的胰岛被淋巴细胞浸润。
图7中NOD-DM表明在未经DC处理的小鼠中胰岛炎的严重程度，其在DM发病后1周内表现出早期胰岛炎(A，胰岛炎级别1)，胰岛炎迅速发展(B，胰岛炎级别3)，胰岛全部充满T淋巴细胞表明所有的β-细胞(C，胰岛炎等级4)被破坏。在DC处理过的胰岛中，胰岛炎的严重性可以被忽视，因为仅观察到轻微的T细胞浸润，而且没有严重的胰岛炎(A，胰岛炎等级1)。尽管在一些小鼠中，DC处理过的胰岛的外周表现出被T细胞浸润(B，胰岛炎等级2)，胰岛的中央区域与高血糖对照相比显示正常的外观(C，胰岛炎等级0)。在一些例子中，观察到有T细胞浸润的迹象，但都消失表现出正常的胰岛的外观。
VII-2：胰岛的胰岛素免疫染色确认
为进行胰岛素分泌的免疫组化分析，移出的胰岛被固定在10％的中性福尔马林中24小时，用酒精脱水，埋入石蜡中并用切片机切成4μm厚度的组织切片，切片用亲和素-生物素复合物进行分泌胰岛素的细胞(胰岛β-细胞)按照下述方法染色：胰腺组织切片和含有甲醇和1％双氧水的溶液反应30分钟，使内部的过氧化氢酶失活，抗胰岛素抗体(1∶400，豚鼠抗胰腺胰岛素，Dako Co.，Denmark)在4℃，潮湿的槽中处理并进行探针标记24小时。生物素标记的抗豚鼠IgG(Vector，USA)被作为二级抗体进行探针标记并且和辣根过氧化酶标记的亲和素溶液(Vector，USA)反应。每次染色都在包含10％羊血清(S-2007，Sigma，USA)0.1M的0.1M PBS中进行。在抗原-抗体标记后，0.3mg/ml的3，3’-二氨基联苯胺(DAB，D8001，Sigma，USA)和0.003％H2O2被加入用来显色。在光学显微镜下观察，当适当的颜色显示时反应被终止。显色片用Meyer苏木精进行染色计数(图8)。
在图8中，3张NOD-DM的照片表明在没有DC注射情况下对照NOD小鼠胰岛的胰岛素免疫染色结果，2张NOD-DC的照片表明糖尿病NOD小鼠的免疫染色结果，其血糖通过注射IFN-γ处理过的异源淋巴CD11b-/CD8a+/CD86-DC被恢复到正常水平，其表现出正常血糖水平持续20天。
如图8所示，未经DC处理的对照小鼠表现出多数胰岛都被胰岛炎所破坏，因此胰岛素活性很弱(图8，NOD-DM-A，-B)或无法检出(图8，NOD-DM-C)。相反，DC处理过的NOD小鼠的胰腺分泌表现为存在未经破坏的部分胰岛，具有正常胰岛素活性(图8，NOD-DC-A，-B)。此外，DC处理过的小鼠在胰岛管和外分泌部分有大量的胰岛素阳性小的胰岛簇，这表明在经处理后新胰岛能够持续的形成(图8，NOD-DC-A)。
实施例VIII：通过用CMTMR或CMFDA示踪来研究DC或自身免疫T淋巴细胞的体内迁移
2μM CMTMR(No.C-2926，Molecular Probe，USA)和CMFDA(No.C-2925，Molecular Probe，USA)被用于在体内追踪细胞，使用之前细胞在没有血清或其它成分的RPMI 1640中稀释。用尼龙羊毛从明显为糖尿病的NOD小鼠中分离T淋巴细胞，并使用实施例I中的方法1来分离淋巴和骨髓DC。为染色，100μl/106细胞的CMTMR或CMFDA溶液被加入，在37℃中反应15分钟并清洗2次。然后，用新鲜的RPMI 1640将细胞重新悬浮并在37℃孵育30分钟，将整合的CMTMR或CMFDA转化为不可渗透的分子。用乙醚轻度麻醉明显有DM的NOD小鼠，在200μl PBS中含3×106 CMFDA染色的自身免疫T淋巴细胞被通过尾静脉注射，在400μl PBS中含1×106 CMTMR染色的淋巴或骨髓DC通过腹膜注射到NOD小鼠中。48小时后，小鼠被处死，取出胰腺，在组织冰冻液(Jung 0201 08926，Germany)中立即将组织冰冻。冰冻的组织用Cryostat(CM1510-3，Leica，Germany)切成5μm厚度的切片，然后在共聚焦显微镜(Bio-Rad，MRC 1024ES，Hercules，USA)下直接观察(图9)。
图9中，LDC+T表示注射淋巴DC和自身免疫T淋巴细胞的NOD小鼠，MDC+T表示注射骨髓DC和自身免疫T淋巴细胞的NOD小鼠。每张照片表明CLN(颈淋巴结)切片，DLN(深部淋巴结)切片，PI(胰岛)切片，Spl(脾脏)切片，PLN(胰淋巴结)切片或Thy(胸腺)的荧光范围。如图9所示，注射15小时后能够在胰淋巴结和按照顺序的在脾脏，胸腺，胰岛和腹膜远端组织发现大量的注射的CD11b-/CD8a+/CD86-DC和经IFN-γ处理过的CD11b-/CD8a+/CD86-DC。发现自身免疫T淋巴细胞的分布和注射的DC有相同的方式，这表明注射的DC主要是在发生自身免疫疾病的组织和胸腺内起作用。
实施例IX：对胰岛抗原特异性胰腺淋巴结细胞的培养和细胞因子表达的定量
如实施例VI-1所述，在DM被治疗的NOD小鼠中通过单次注射IFN-γ刺激的ICR小鼠CD11b-/CD8a+DC，按照下述方式检测针对胰岛β-细胞的自身免疫反应的变化：
IX-1：对胰岛抗原特异性的淋巴结细胞的繁殖和胰岛的分离
在早期DM并且经1×106的IFN-γ处理CD11b-/CD8a+DC注射的NOD小鼠中取出胰腺淋巴结，从中分离淋巴结细胞。此外，从未经DC处理的具有早期DM的NOD小鼠中分离淋巴结细胞。然后，分离的细胞用5％FBS-DMEM悬浮，并且以5×104细胞/孔的浓度分装到各孔中。
分别的，从NOD小鼠中分离胰腺胰岛的β-细胞并超声破碎，然后2.5×104或5×104(CEQ：当量细胞)细胞提取物被加入到每孔中作为胰岛抗原并孵育96小时。上清液中IFN-γ(活化Th1的指示分子)以及IL-4(活化Th2的指示分子)被按照实施例IX-2的三文治ELISA方法测量。
上述分离的胰岛按照如下的方法得到：NOD小鼠被从腹膜注射1ml/100g 20％尿烷麻醉，腹膜被剪开并在将胶原酶P注射到胰腺管后将胰腺取出。取出的胰腺在37℃孵育10分钟，收获被消化的胰腺中渗出的组织。收集组织通过离心用PBS清洗两次，轻柔的以1.086g/ml的密度重新悬浮到Ficoll中，并用密度为1.076和1.053g/ml的Ficoll进行系列覆盖。然后，试管在低温离心机上以800Xg的速度离心10分钟，密度为1.076和1.053的胰岛被小心的取出，用PBS清洗两次，在37℃，5％CO2孵化箱中孵育24小时，然后在显微镜下手工挑选培养的胰岛。
IX-2：ELISA方法对细胞因子的定量
培养上清液中的IL-4和IFN-γ用如下所述的三文治-ELISA方法测定(所有的物质和配对抗体对来自Endogen)：96孔培养板用100μl(2μg/ml)的包被抗体(Endogen，USA)在RT下涂复10-14小时，并洗涤。然后，200μl的分析缓冲液(PBS，4％BSA，pH 7.2-7.4)被加入，并在RT下反应1小时。三次清洗后，50μl的缓冲上清液和标准液以重复的方式被分别加入到每孔中，50μl(250μg/ml)的生物素标记的次级抗体被加入并孵育1-2小时。反应六被洗涤，100μl的HRP-融合抗生蛋白链菌素(1∶12,000，Endogen，USA)被加入，并在暗处反应30分钟。每孔用清洗缓冲液洗涤，和TMB物质(Sigma T-3405，USA)反应30分钟，反应被添加2M H2SO4所终止。参照标准溶液在OD570对细胞因子的量进行计算(图10a和b)。
图10a表示从如实施例V中所用的经过DC处理的具有早期DM的NOD小鼠的淋巴细胞所产生的细胞因子；图10b表明用单次注射DC由DM治愈的小鼠的淋巴结细胞所产生的细胞因子。在未经DC处理的对照中，在胰岛抗原中培养的淋巴结细胞培养物中只能够检测到IFN-γ而不是IL-4(图10a)。而在经DC注射后DM治愈的NOD小鼠中，当胰岛抗原的数量增加时，能够检测到IFN-γ和IL-4的显著增加(图10b)。
这些结果表明对DM的治疗应用，其中胰岛炎的发展通过DC处理而受到抑制，可能是导致了Th1自身免疫T淋巴细胞发展为Th2自身免疫T淋巴细胞，或者是通过新生的胰岛抗原特异性Th2淋巴细胞的作用将T淋巴细胞去活化。
实施例X：用透射电镜对CD11b-/CD8a+DC的形态学研究
CD11b-/CD8a+/CD86-DC用和实施例I中同样的步骤从ICR小鼠中分离，用PBS清洗，在用0.1M PBS溶解并清洗3次的2％多聚甲醛/2.5％戊二醛溶液(4℃，pH 7.2)预固定2小时。清洗后的DC再在1％OsO4的PBS溶液(4℃，pH7.2)中在固定1小时。固定的DC用PBS清洗几次并用梯度酒精稀释液(30，50，70，80，90，95％各一次，纯酒精两次)进行连续脱水。脱水样本用环氧丙烷清洁，埋入到Epon-Araldite溶液中(Poly/Bed 812 Embedding Media，Polysciences Inc.)并在60℃进行加热聚合28个小时。
埋入的组织用LKB-V超微切片机进行半薄切片，用溶解在1％vorax中的1％甲苯胺蓝在60℃加热的板上染色，并在光学显微镜进行观察。然后，制备薄切片，结合到镍格上，用混合有枸橼酸铅的醋酸双氧铀染色，并在80kV下通过透射电镜(JEOL co.，Japan)观察(图11)。
图11中，底片A表示未经IFN-γ处理的CD11b-/CD8a+/CD86-DC照片而底片B表示经过IFN-γ处理的CD11b-/CD8a+DC照片。内质网(ER)，核膜和染色体和在未经IFN-γDC中立即分离出来的DC一样清晰可见，但在经过IFN-γ处理的DC中ER结构消失，plasmasytoid结构变化，核膜变得不清楚，染色体松散而且树突明显增加(图11)。这些出现在正常发展的DC中的形态学变化表明IFN-γ活化了未发育的淋巴DC，使之成为完全成熟的DC，正如活化骨髓DC一样，尽管它们的起源不同。
实施例XI：从人分离CD11c-/CD4+/CD86-DC
小鼠的CD11b-/CD8a+DC亚群没有在人中发现。在本发明中，人CD11c-DC被认为是小鼠CD11b-/CD8a+DC是基于如下基础：图12的底片A表示分离自人外周血的CD11c-DC；底片B表示CD11c-DC的形态学特征。图12为CD11c-DC的电子显微镜特征，引自一篇发表的文献(J.Immunol.163：3250-3259(1999))，表明在ER的发展和染色体的形状中与CD11b-/CD8a+DC具有相似的特征(图12，A)。这个假设被另一篇论文所支持(O’Doherty等，Immunology，82：487-493(1994))，其表明CD11c-DC作为淋巴DC对于免疫反应调节的可能。基于此假设，按照如下方法从人血液中分离CD11c-DC(图1e-1f)：
XI-1：从PBMC中分离
用购自Miltenyi Biotech的DC分离试剂盒(No.468-01)从人血中分离CD11c-DC：从正常人白细胞分离法(leukapheresis)中得到的浓缩的淋巴细胞用3倍体积的PBS稀释，并加入Ficoll-Hypaque(10ml/30ml稀释的淋巴细胞)，RT下用2000g离心30分钟，收集中层的悬浮细胞。然后，收集的细胞用PBS清洗3次并用依次降低的速度(1600g，1200g和900g)离心5分钟。清洗的外周血单核细胞(PBMC)被计数，然后按照如下方法从2.5-3×108PBMC中分离CD11c-DC亚群(图1e).
用20ml MACS溶液(2mM EDTA，0.5％BSA，在冷PBS中)清洗2.5-3×108PBMC。然后，MACS溶液被加入使总体积达1.2ml，细胞被轻柔的重新悬浮，血液DC分离试剂盒(No.468-01，MiltenyiBiotech)中的0.4ml FcR-封闭溶液和0.4ml庚烷-Ab鸡尾酒被加入，然后混合物在4℃反应20分钟。细胞在40ml的MACS溶液中清洗两次，离心，并且在每次离心步骤中所有的上清液用真空泵吸取干净。加入MACS溶液使总体积为3.6ml，轻柔的重新悬浮，0.4ml MACS抗-庚烷珠溶液被很好的混合，并在4℃反应20分钟。CS柱被保持在冰箱中并组装到MAC分离器(VarioMACS，No.130-090-282，MiltenyiBiotech)，然后在4℃用60ml MACS溶液清洗。
2ml的反应细胞过CS柱，用30ml MACS溶液清洗，通过的细胞被收集以进行下一步程序。细胞被计数，离心，并弃去上清液。包含15μg CD11c抗体(1μg/μl，BD science 30480D，USA)的MACS溶液被加入，达到107细胞/70μl，而且附加的70μl的CD14抗体被加入，轻柔混合，并在4℃反应20分钟。用3ml MACS溶液清洗2次后，被清洗的细胞混合在MACS溶液中达到70μl体积，和标记着小鼠Ig-G特异性抗体(Goat Anti-Mouse IgG MicroBeads：No.130-048-401，Miltenyi Biotech)的30μl磁珠在4-6℃反应15分钟。然后，3ml MACS溶液被加入，并离心丢弃未结合的细胞。
细胞在0.5ml MACS溶液中被稀释，过MS柱分离弃去磁珠标记的细胞。MS柱用MACS溶液清洗3次，分离没有磁化的细胞。离心细胞并混合到MACS溶液中，到0.2ml体积，血液DC分离试剂盒(No.468-01，Miltenyi Biotech)中的0.2ml抗-CD4磁珠被加入，并在4℃反应30分钟。没有结合的磁性珠在附加的8ml MACS溶液中离心除去，未和磁珠结合的细胞在0.5ml MACS溶液中重新悬浮，并过MS柱除去。该柱用0.5ml MACS溶液清洗3次，并从MACS分离器中(VarioMACS，No.130-090-282，Miltenyi Biotech)取出。在柱中的细胞通过加1ml MACS溶液并用注射器推动柱，收集到15ml离心管中。剩余的没有磁化的细胞再次通过MS柱来除去。经过用0.5ml MACS溶液三次清洗后，在MS柱中的磁化细胞按照前述方法用1ml MACS溶液分离。最后，细胞被离心并用流式细胞仪测定CD11c-/CD4+/CD86-DC的纯度。
XI-2：从脾脏细胞中分离
用购自Miltenyi Biotech DC分离试剂盒No.468-01按照修改后的程序从人脾脏细胞中分离CD11c-DC：
通过胶原酶的处理从脾脏中释放人的脾脏细胞，并在用于PBMC分离的标准Ficoll条件下离心，然后从边界取细胞并用PBS清洗。其中，3×108细胞被洗入到20ml MACS溶液中(2mM EDTA，0.5％BSA，在冷PBS中)。补充MACS溶液，使总体积达1.2ml，轻柔混合并按照前述XI-1的方法分离CD11c-/CD4+/CD86-DC(图1f)。即使没有丢弃CD11c+细胞步骤的情况下，高纯度的(86％)CD11c-/CD4+/CD86-DC亚群也被分离得到。
实施例XII：DC对于I型DM患者的治疗效应
按照实施例IV中所述的方法用IFN-γ处理分离的CD11c-/CD4+/CD86-DC。然后，CD11c-/CD4+DC的培养液用离心方法沉淀，弃去上清液并加入盐水。制备的DC被腹膜注射给I型DM患者。然后，基于血糖水平来评价DC的治疗效果。
实施例XIII：DC对由胶原蛋白诱导的类风湿关节炎小鼠的治疗效应
XIII-1：在DBA/1小鼠中用胶原蛋白诱导类风湿关节炎
5-6周龄的雄性DBA/1小鼠(Jackson Laboratory，USA)被使用。2mg/ml的牛II型胶原蛋白被加入到0.05M乙酸盐溶液中，在4℃搅拌24小时使其溶解。溶解的胶原蛋白与同样量的完全Freund佐剂(CFA)混合，并且以100μg/小鼠的胶原蛋白从尾静脉注射给小鼠。三周后，非完全Freund佐剂(IFA)中100μg/小鼠的胶原蛋白从尾静脉注射。为了和关节炎同步开始，在初次胶原蛋白注射4周后腹膜注射40μgLPS(SH Kim，等，J.Immunol.，166：3499-3505(2001)).。
XIII-2：DC亚群的治疗效应
按照实施例I中所述从正常DBA/1小鼠的脾脏中分离CD11b-/CD8a+/CD86-DC，按照实施例II用IFN-γ处理，并且按照实施例XII-1将CD11b-/CD8a+DC注射到小鼠的腿关节中来检查对于关节炎的治疗效果。
DC对于关节炎的治疗效果通过用下述肉眼可见的方法分级为0到4级(SH Kim，等，J.Immunol.，166：3499-3505(2001))；0：没有浮肿和肿胀；1：在部分指或踝关节有微小浮肿和肿胀；2：在全部踝到指关节有微小浮肿和肿胀；3：在踝到指关节有明显的浮肿和肿胀；4：在踝到指关节有严重的浮肿和肿胀，特别是踝或指发生畸形或僵硬。
平均关节炎指数＝所有小鼠中关节炎级别为4的鼠爪总数/全部
有关节炎的小鼠爪(％)＝所有级别超过2的爪/所有的爪×100
浮肿严重程度＝所有级别为4的鼠爪的厚度/鼠的数目
XIII-3：DC治疗效应的组织学检查
踝关节，用实施例XIII-2的方法新从经过CD11b-/CD8a+DC处理的小鼠中解剖出来，在10％中性福尔马林溶液中固定24小时，在15％EDTA和30％甘油中脱钙，并在梯度序列酒精中进行连续脱水，埋入石蜡中，切成厚度为5μm的切片，用苏木精和伊红染色(H&E)，用淋巴细胞的浸润和骨的腐蚀来评价治疗效果(SH Kim，等，J.Immunol.，166：3499-3505(2001))。
实施例XIV：DC对于类风湿关节炎患者的治疗效果
按照实施例IV所描述的方法将实施例X分离的CD11c-/CD4+/CD86-DC用IFN-γ处理。然后，CD11c-/CD4+DC的培养基被离心，上清液被弃去，并加入盐水。制备的CD11e-/CD4+DC被注射到类风湿关节炎患者的关节中。然后评价CD11c-/CD4+DC的治疗效果。
已经描述了本发明的优选实施方案，应该理解到按照本发明的精神所进行的变化和修饰对本领域的技术人员非常明显，本发明的范围由附加的权利要求书和它们的等同物所决定。
Claims (11)
1.用于I型糖尿病免疫治疗的药物组合物，其中包括(a)治疗有效剂量的用IFN-γ成熟的淋巴树突细胞，以及(b)药学上可接受的载体。
2.根据权利要求1的药物组合物，其中成熟的淋巴树突细胞通过将Th1淋巴细胞转化为Th2淋巴细胞或产生新的Th2淋巴细胞抑制自身免疫反应。
3.根据权利要求1的药物组合物，其中的淋巴树突细胞由离体的人的器官，组织，骨髓或血液分离。
4.根据权利要求1的药物组合物，其中的淋巴树突细胞为异源树突细胞。
5.根据权利要求1的药物组合物，其中的淋巴树突细胞为CD11c-/CD4+树突细胞。
6.用IFN-γ成熟的淋巴树突细胞在制备用于I型糖尿病免疫治疗的药物中的应用。
7.根据权利要求6的应用，其中成熟的淋巴树突细胞通过将Th1淋巴细胞转化为Th2淋巴细胞或产生新的Th2淋巴细胞抑制自身免疫反应。
8.根据权利要求6的应用，其中的淋巴树突细胞自离体的人的器官，组织，骨髓或血液分离。
9.根据权利要求6的应用，其中的淋巴树突细胞为异源树突细胞。
10.根据权利要求6的应用，其中的淋巴树突细胞为CD11c-/CD4+树突细胞。
11.根据权利要求6的应用，其中的应用特征在于用反式-异源-树突细胞加强。
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