CN1729010A - 美拉加群在制造治疗i型糖尿病的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
根据本发明,提供了美拉加群或其药学上可接受的衍生物在制造治疗I型糖尿病的药物中的用途。
Description
本发明涉及一种低分子量凝血酶抑制剂的新用途。
肾脏-胰腺联合移植术已经成为治疗并发有终末期糖尿病性肾病的I型(胰岛素依赖型)糖尿病的一种有效的治疗选择,因为其修复了新陈代谢控制,提高了生命质量同时降低了这类病人中通常出现的高致死率。
80%的接受肾脏-胰腺移植的病人在10年后仍然存活,这与那些仅接受肾脏移植的20%的存活率形成强烈对比。
然而,由于涉及的手术风险,以及经常产生的术后并发症,胰腺移植仅典型的施用于患有终末期糖尿病肾病的病人。
由于该实用性的缺乏,一种涉及分离的兰氏胰岛细胞移植的潜在降低胰岛素依赖的替代方法已经被开发出来。
虽然许多移植位点已在实验模型中被评估,但迄今为止只建立了用于临床中的胰岛移植的门内移植。
胰岛移植易于实施并且安全,虽然数年来临床结果显著其低于全胰腺移植,其中移植1年后只有8%的病人呈胰岛素非依赖性,相比之下,全肾脏-胰腺移植达大约70%。这些较差的结果用于表明,在这类移植后,只有一小部分的胰岛物质进行了有效的植活。
Shapiro等人(N.Etage.J Med.,343,230(2000))的最近的突破性发现显示,通过采用来源于多于一个供体的胰岛反复移植来治疗病人可以十分容易地达到胰岛素非依赖性。
为了调查单一供体移植病例中观察到的较差结果的可能的原因,一种模拟紧随胰岛细胞植入门静脉后的体内情形的体外胰岛灌注系统被设计出来(Bennet et al,Diabetes,48,1907(1999))。该项研究表明在体外将人胰岛暴露于ABO相容性血中可诱导广泛的一系列炎症结果,即凝血作用和补体系统的活化、血小板的快速结合和活化以及白细胞的结合共同导致了胰岛完整性的破裂。同种异体胰岛的肝内移植显示在猪活体内引起了类似的系列结果。
这种瞬时血液介导的炎症反应(IBMIR)的有害作用可以为胰岛移植方法的相对较低的成功率和/或为了达到血糖量正常需要从许多供体中分离胰岛提供了一种解释。
Bennet等还报道了肝素和可溶性重组CR1(补体抑制剂)的组合,但是,有趣的是,不是单个物质单独地预防了大多数的正常胰岛形态的破裂和胰岛的渗透。尽管存在这种预防作用,仍可在胰岛表面观察到一薄层血小板和纤维蛋白。也参见国际专利申请WO 00/45837。
因此,仍然存在对I型糖尿病人治疗后,例如通过兰氏胰岛细胞移植,特别是涉及来源于单个供体的胰岛的单一移植过程后,增加手术后胰岛素非依赖性的有效途径的临床需求。
国际专利申请WO 94/29336公开了一组作为丝氨酸蛋白酶,例如凝血酶和/或激肽原酶抑制剂使用的化合物。因此,抑制凝血酶的化合物被指示作为抗凝剂,抑制激肽原酶的化合物被指示作为抗炎药剂。但是,这些化合物在治疗糖尿病和/或细胞,例如兰氏胰岛细胞移植中的用途既没有公开也没有暗示。
一种在WO 94/29336中特别公开的抑制凝血酶的化合物为HOOC-CH2-(R)Cgl-Aze-Pab-H(其中Cgl表示环己基甘氨酸基,Aze表示(S)-氮杂环丁烷-2-羧基,且Pab表示对-眯基苄胺基),其也被称为美拉加群(melagatran)(参见WO 94/29336的实施例1)。
国际专利申请WO 97/23499公开了包括美拉加群在内的前体药物。同样的,该化合物在治疗糖尿病和/或细胞,例如兰氏胰岛细胞移植中的用途既没有公开也没有暗示。
国际专利申请WO 00/41716公开了美拉加群及其衍生物在治疗炎症中的用途。既没有提到也没有暗示美拉加群在治疗IBMIR、糖尿病和/或细胞,例如兰氏胰岛细胞移植中的应用。
我们现在发现美拉加群几乎完全抑制IBMIR,包括补体活化以及血小板对兰氏胰岛细胞的结合和活化,因此美拉加群及其衍生物可潜在地用于治疗糖尿病。
根据本发明的第一方面,提供了美拉加群或其药学上可接受的衍生物在制造治疗I型糖尿病的药物中的用途。
术语“I型糖尿病”将被本领域普通技术人员理解为包括胰岛素依赖型糖尿病(IDD)。
美拉加群及其衍生物被发现在治疗涉及移植的I型糖尿病中具有特殊的功用。这种移植可涉及肾脏移植、胰腺移植或肾-胰联合移植,但是优选涉及细胞,例如产胰岛素细胞或其前体的移植。优选的产胰岛素细胞包括兰氏胰岛细胞。产胰岛素细胞前体包括这类细胞的前体,例如采用本领域技术人员熟知的技术注射进胰腺并随后发育成为产胰岛素细胞的干细胞。
因此,根据本发明另外的方面,提供了美拉加群或其药学上可接受的衍生物在制造用于细胞移植的方法的药物中的用途,所述的细胞包括产胰岛素细胞或其前体,例如兰氏胰岛细胞或干细胞。
优选的兰氏胰岛细胞包括β细胞(即,胰腺产胰岛素细胞),不过根据本发明所述的用途不仅限于移植这类细胞。移植可涉及单个或多个方法,同时细胞可从一个或多个供体中获得用于该方法(a)。优选的方法可涉及来源于单个供体的单一移植。
我们发现当与缺乏美拉加群/衍生物的植活相比较时,美拉加群和其药学上可接受的衍生物可增强移植后(例如肝内移植)兰氏胰岛细胞在肝脏中的植活。
因此,提供了美拉加群或其药学上可接受的衍生物在制造用于如下方法的药物中的用途:
(a)兰氏胰岛细胞的植活,例如在肝脏中的植活;和
(b)提高患有I型糖尿病的病人的胰岛素非依赖性(例如达到正常的血糖量)。
此外,还进一步提供了美拉加群或其药学上可接受的衍生物在制造治疗IBMIR的药物中的用途。
本文中采用的术语“IBMIR”(血液介导的瞬时炎症反应)包括已知的发生于兰氏胰岛细胞移植入门静脉后的一系列炎症反应,即凝集作用和补体系统的活化以及血小板的快速结合和活化以及白细胞的结合,这些反应将破坏胰岛的完整性。
为了避免疑问,术语“治疗”既包括治疗性又包括预防性治疗。就预防性治疗来说,我们包括了例如IBMIR的发展的预防(抑制)。
美拉加群的“药学上可接受的衍生物”包括盐(例如,药学上可接受的非毒性的有机或无机酸加成盐)和溶剂化物。应当理解该术语还进一步包括具有或提供与美拉加群相同的生物学功能和/或活性的衍生物。因此,为了本发明的目的,该术语还包括美拉加群的前体药物。美拉加群的“前体药物”包括经口服或非肠道方式给药后,在一定时间内(例如,在一介于6到24小时的剂量间隔内(即每日给药一到四次))在活体内代谢形成实验上可检测量的美拉加群的任何组成的物质。为了避免产生疑问,术语“非肠道”给药包括除了口服给药外的所有给药形式。
可以提到的美拉加群的前体药物包括那些在国际专利申请WO97/23499中公开的物质。优选的前体药物为那些具有通式R1O2C-CH2-(R)Cgl-Aze-Pab-OH(参见上述缩写表或WO 97/23499)的前药,其中R1表示C1-10烷基或苯甲基,例如直链或支链C1-6烷基(例如C1-4烷基,尤其是甲基、正丙基、异丙基、叔丁基,特别是乙基),同时OH基团取代了Pab中的一个脒基氢。
根据本发明,美拉加群及其衍生物可通过口服的、肝内的、静脉内的、皮下的、向颊的、直肠的、真皮的、鼻腔的、气管的、支气管的、局部的给药方式给药,或通过任何其他非肠道方式或通过吸入方式给药。
美拉加群及其衍生物可以以包含以药学上可接受的剂量形式存在的美拉加群的药物制剂的形式给药。根据接受治疗的病人以及给药方式的不同,这种组合物可以不同剂量给药。
优选的给药方式为系统给药。对于美拉加群及其衍生物来说,优选的给药方式为非肠道(更优选静脉给药方式,特别是肝内给药方式)的或口服的方式。发现这种给药方式可以在给药后使肝脏内美拉加群/衍生物浓度的最大化。
在I型糖尿病的治疗中,美拉加群及其衍生物优选地与胰岛移植过程中的兰氏胰岛细胞共同给药。
根据本发明的更进一步的方面,提供了一种包括如下组分的组分试剂盒:
(a)包括美拉加群或其药学上可接受的衍生物的第一组分;和
(b)包括细胞,例如产胰岛素细胞或其前体,比如兰氏胰岛细胞或干细胞的第二组分,
其中组分(a)和(b)各以适于与这两种组分中的另一组分联合给药的形式存在,也适合于按顺序使用、独立使用和/或同时用于I型糖尿病的治疗和/或细胞移植方法中。
因此,组分(a)和(b)可以以美拉加群/衍生物,或细胞形式(视情况而定),与一种药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体一起存在。
根据本发明的进一步的方面,提供了一种制备上述的组分试剂盒的方法,所述的方法包括使如上文所限定的组分(a)与如上文所限定的组分(b)关联,从而使该两个组分适合于相互联合给药。
因此,还进一步提供了一种组分试剂盒,其包括:
(I)本文所限定的组分(a)和(b)中的一种;以及
(II)将该组分与这两种组分中的另外一种联合使用的说明书。
就如本文所述的组分试剂盒来说,谈到“与...联合给药”,我们包括了各自的组分(a)和(b)在治疗进程中按顺序的、单独的和/或同时的给药。此外,术语“与...联合”包括两种组分(a)和(b)中的一种或另一种可以先于、后于和/或与另一组分同时给药。当在本上下文中使用时,术语“同时给药”和“与...同时给药”包括所述的两种组分相互之间在48小时(例如,24小时)内给药。
当单独的组分给药时,其给药的顺序(例如,是否给药,在哪一点给药,按什么顺序给药,单独给药和/或同时给药)可由医师或熟练的技术人员来决定。
在哺乳动物的治疗性治疗中,特别是人类中,美拉加群/衍生物将以与根据计划的给药途径和标准的给药惯例选择的药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体的混合药学制剂形式给药。
用于美拉加群及其衍生物(包括药物前体)给药的合适的制剂记载于公开文献中,例如,如国际专利申请WO 94/29336,WO 96/14084,WO 96/16671,WO 97/23499,WO 97/39770,WO 97/45138,WO 98/16252,WO 99/27912,WO 99/27913,WO 00/12043和WO 00/13671中所记载的,在此也并入这些文件的说明书作为参考。此外,合适的制剂的制备也可以由本领域技术人员通过常规技术非创造性地实现。
根据本发明进一步的方面,提供了一种用于治疗I型糖尿病的药物制剂,其包括有效量的美拉加群或其药学上可接受的衍生物,并与与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合。
各制剂中含有的美拉加群/衍生物的量由病情的严重性、准备接受治疗的病人以及采用哪一种/哪些化合物来决定;但这些可由本领域的技术人员非创造性的确定。
美拉加群/衍生物在哺乳动物,特别是人类病人的治疗中的合适的剂量可由执业医师或其他熟练的技术人员例行决定,同时本文上文中已提到的在先技术文件中论述的个别剂量也包括在内,这些文件中的相关说明书在此也并入作为参考。
在美拉加群的情况中,活性化合物、药物前体及其衍生物在哺乳动物,特别是人类病人治疗和/或预防治疗中的合适的剂量包括那些使平均血液浓度最高达到5μmol/L的剂量,例如在相关病症的治疗过程中0.001至5μmol/L的范围。对于美拉加群,合适的剂量可以是在0.1mg每天一次到25mg每天三次的范围内,和/或在24小时期间内非胃肠道最高灌注100mg,对于那些在本文中特别提到的美拉加群前体药物,剂量还可以是在0.1mg每天一次到100mg每天三次的范围内。
在任何情况下,主治医师,或熟练技术人员,都能够确定最适合病人个体的实际剂量,该剂量有可能根据年龄、体重、性别和特定的接受治疗的病人的反应来变化。上述提到的剂量以平均情况为例;当然,可以存在个别情况,其中应该采用较高或较低的剂量范围,这些也在本发明的范围之内。
兰氏胰岛细胞的移植可以采用任何常规技术来进行,例如,通过将其悬浮于合适的缓冲液中,随后通过肝胆管注射器或导管,或如Boker et al在World J Surg.,25,481(2001)中所述的方式(该文件的相关说明书在此并入参考),或如下文所述的方式,通过注射和/或输液该悬浮液至肝门静脉来进行。
根据本发明的进一步的方面,提供了一种治疗I型糖尿病的方法,其中包括向需要接受这种治疗的病人给药治疗有效量的美拉加群或其药学上可接受的衍生物。
本文所述的用途和方法的优点在于,在I型糖尿病的治疗中,尤其是在通过兰氏胰岛细胞移植来缓解患有I型糖尿病的病人的胰岛素依赖性的治疗中,美拉加群及其衍生物不具有已知治疗方法的缺点。
通过如下实施例对本发明进行说明,但本发明并非局限于如下实施例,其中:
图1显示了培养于充满含有0至10μM浓度范围的美拉加群的与ABO相容的血液的管状回路模型中的人胰岛细胞中的各种生物标记的变化。A组显示了血小板颗粒的计数(白色正方形)和β-TG的释放(黑色正方形)的变化。B组显示了凝血酶原片段1+2(白色正方形)、TAT(黑色正方形)和FXIa-AT(黑色三角形)的变化。C组显示了淋巴细胞(黑色长方形)、单核细胞(白色长方形)和PMN(黑色三角形)的颗粒计数的变化。这些数值代表了60分钟后减去培养基对照(无胰岛细胞或美拉加群)的数值,且表示为占含有人胰岛细胞但不含美拉加群的未处理对照值的百分比。
图2显示了无胰岛细胞存在的血清模型中的可溶性C3a(白色正方形)和结合的C3片段(黑色正方形)的变化,以及在含有0至10μM浓度的美拉加群的与ABO相容的血液中包含胰岛细胞的管状回路模型中的可溶性C3a(黑色菱形)的变化。
实施例
美拉加群对IBMIR的影响
材料和方法
胰岛细胞的分离
经器官捐赠登记处或经亲属处获得允许后,从捐赠的尸体中取得胰腺。从三名女性和两名男性血糖量正常的捐赠者(年龄59-85岁,3人血型为O型,2人血型为A型)中获得所述器官。采用先前记载的半自动消化-过滤方法(Brandhorst et al,Cell Transplant.,7,489(1998)and Ricordi et al,Diabetes,37,413(1988))的改进方法,在Uppsala大学的临床免疫系进行分离得到胰岛细胞。在分离过程后,采用冷冻离心机COBE 2991(COBE Blood ComponentTechnology,Lakewood,CO,USA)进行连续密度梯度离心从而进一步纯化。将胰岛细胞置于未处理的培养瓶中,并在37℃下(5% CO2)保持悬浮培养1至5天。其中每隔1天更换一次培养基(CMRL 1066;ICN Biomedicals,Costa Mesa,CA)。经双硫腙染色后,通过在显微镜的网格上确定大小来确定胰岛细胞的体积和纯度。本研究中采用的胰岛细胞制剂的纯度在40%至95%的范围内变化(70±6.3%)(与外分泌物/管组织相比制剂中内分泌物的量;平均值±SD)。可通过动态灌注系统中响应葡萄糖激发的胰岛素的分泌量来评价存活力(置于1.67mmol/L的葡萄糖中,然后置于16.7mmol/L的葡萄糖中,最后回到1.67mmol/L的葡萄糖中)。
肝素处理
所有与全血接触的物质都按制造商的说明(参见J.Clin.Immunol.,16,222(1996))覆盖了一层可的松肝素表面(可的松,Uppsala,Sweden)。肝素的表面浓度为0.5μg/cm2,相应于大约0.1U/cm2,其抗凝血酶结合能力为2-4pmol/cm2。
血液的制备
取自至少14天未接受药物治疗的健康志愿者的新鲜人血,收集于表面肝素化的60-mL注射器中(18规格,Microlance;BectonDickinson,Franklin Lakes,NJ)。注射器的套管与表面肝素化硅管相连。在取样过程中,不断转动注射器。
作为模型的管状回路
采用了一种以前描述过的模型(参见Bennet et al,Diabetes,48,11907(1999),Gong et al,J.Clin.Immunol.,16,222(1996)和Larsson et al,Immnunopharmacology,38,119(1997))的改进模型。该装置由PVC制成的回路组成(直径6.3mm;长度390mm),其内表面覆盖有固定的肝素。管状结构通过特别设计的肝素化接头连接起来。当接头的末端紧紧地插入管状结构末端腔中时,即形成一环状回路。一置于37℃培养箱中的摇动装置用于在回路内部产生血液流动。回路在一防止血液与接头接触的设定值下进行振荡。可以同时振荡至多12个装置。进行十组60-分钟胰岛细胞实验,所述胰岛细胞分离来自5位不同的捐赠者。分别在0,0.4μM,1μM,4μM的浓度下对溶解于含有0.15M NaCl,pH 5.5的5mM柠檬酸缓冲液中的美拉加群(AstraZeneca R & DMlndal,Sweden)进行实验。对于每一实验,均采用了两个不含胰岛细胞的新鲜人血的回路作为对照,其中一个含有CMRL 1066(GibcoRBL,USA),一个含有10μM的美拉加群。来自同一捐赠者的新鲜的与ABO相容的人血液被加入每一回路中。将回路与美拉加群或柠檬酸缓冲液一起置于摇动装置上预培养10分钟。此后,打开回路,向回路中加入150μL的含有或不含4μL胰岛细胞(大约4000 IEQ)的CMRL 1066,随后置于振荡装置上在37℃进行另一60-分钟的培养。在灌注前,通过葡萄糖测量仪(Glucometer Elite;Bayer Diagnostics,Leverkusen,Germany)测量血液葡萄糖的水平。在每一次灌注后,将回路内容物通过70μm-直径的过滤器进行过滤(Filcons,Cuptype;DAKO,Denmark)。肉眼可见的血液凝块和从过滤器回收的组织均采用液氨冷冻用于免疫组织化学染色。为了用于免疫组织化学比较,非灌注的胰岛细胞也采用相同的方法进行冷冻和染色。将过滤留下的血液收集于4.1mM EDTA(终浓度)中,并用于血液学分析(血小板,淋巴细胞,单核细胞和粒细胞)和凝集活化试验(凝血酶原片段1+2,凝血酶-抗凝血酶[TAT]和因子XIa抗凝血酶复合体[FXIa-AT])、补体活化试验(C3a和sCSb-9)、血小板活化试验(β-血小板球蛋白[β-TG])以及胰岛素试验。在0分钟时取样的样品也包括在内。在这些样品中,并不将血液加入管状回路,而是立即将其转移至含有EDTA的试管中。血液样品在4℃下,以3290xg的速度离心20分钟,并收集血浆且在分析前保存于-70℃下。
在微量滴定板的孔中的补体活化
采用将血清培养于微量滴定板的孔中的培养方法来研究美拉加群对补体系统的直接作用(Nilsson et al,Mol.Immunol.,30,211(1993))。将血清(100μL)与终浓度分别为0,0.4,1,4,或10μM的美拉加群一起加入96孔微量滴定板的每孔中。经37℃培养30分钟后,血清被转移至含有EDTA(终浓度10mM)的试管中。在进行补体片段C3a分析前(参见下文),将这些样品保存于-70℃下。为了检测结合的C3片段,采用含有0.05%(v/v)TWEEN 20的PBS洗涤微量滴定板的孔,并与100μL的与辣根过氧化物酶(HRP)结合的抗-C3c(DAKO AS,Glostrup,Denmark)一起在37℃下培养60分钟。通过加入1,2-对苯二胺二盐酸盐(Fluka,Switzerland)来检测抗体的结合,且染色在492nm下进行监测。
血液和血浆分析
采用EDTA-处理的血液在Coulter ACT-diff分析仪(BeckmanCoulter,FL,USA)上分析血小板计数和不同的白细胞计数。
酶免疫测定(ELA)
A.凝血酶原片段1+2和凝血酶-抗凝血酶(TAT)
采用商业化购买的EIA试剂盒(Enzygnost凝血酶原,片段1+2;TAT,Behringswerke,Marburg,Germany)对凝血酶原片段1+2和TAT的血浆水平进行定量。测量值分别以nmol/L和μg/L来表示。
B.因子XIa-抗凝血酶(FXIa-AT)
按照Sanchez et al,Thromb.Res.,89,41(1998)的方法在血浆中测定FXIa和AT之间形成的复合体。测量值以μmol/L表示。
C.β-血小板球蛋白(β-TG)
通过Asserachom(Diagnostica Stago,Asnieres-sur-Seine,France)分析EDTA-血浆中的β-TG。测量值以IU/mL表示。
D.C3a
EDTA-血浆按照前述方法(Nilsson Ekdahl et al,Scand.J.Immunol.,35,85(1992))来分析。将单克隆抗体4SD17.3用作捕捉抗体。采用生物素化的多克隆抗-C3a,以及随后的与HRP结合的链霉抗生物素蛋白来检测结合的C3a(Amersham,Buckinghamshire,UK)。采用纯化的C3a校准的酵母多糖-活化血清作为标准,测量值以ng/mL表示。
E.sCSb-9
采用Mollnes et al(参见Scand.J.Immunol.,35,85(1992)和Artif.Organs,19,909(1995)所述的EIA的改进方法来分析血浆。EDTA-血浆被加入包被有mAb的抗-neoC9的微量滴定板中。采用多克隆抗-C5抗体(DAKO),以及随后的HRP轭合的抗-兔免疫球蛋白(DAKO)来检测sCSb-9。将定义为含有40,000任意单位(AU/mL)的酵母多糖活化的血清作为标准。测量值以AU/mL表示。
F.胰岛素
采用商业化的EIA试剂盒(DAKO)在胰岛细胞灌注之前和之后分析胰岛素的血浆浓度。测量值以pmol/L表示。
免疫组织化学染色
经血液和各种浓度的美拉加群灌注后在过滤器上回收的胰岛细胞和肉眼可见的凝块收集于包埋培养基(Tissue-Tek;Miles,Eckhart,IN,USA)中并在液氮中速冻。将胰岛细胞切片,并随后采用HRP-轭合的小鼠抗-人CD41a(R & D Systems,Abingdon,UK)和抗-CD11b(Clone 2LPM 19c,DAKO)进行染色。
统计分析
由于个体差异存在于血液细胞计数和血浆参数中,所述改变既可以用来自于培养基对照回路(为血细胞)中的测量值百分比来计算,又可以用来自于实验回路和无美拉加群的胰岛回路中的测量值的比例来计算。全部结果以平均值±SEM表示。采用Friedman ANOVA(Analyse-It,version 1.44,Software Ltd,UK)比较平均值。在α=0.05时确定显著性差异。图1B、C和图2中出现的数值表示已减去了0分钟样品的数值后的净值。
胰岛细胞功能不受美拉加群影响
为了证实美拉加群对胰岛细胞功能无负面影响,我们采用了一胰岛细胞灌注系统中的回路实验(10μM),在最高浓度下测试了该抑制剂。采用10μM美拉加群灌注胰岛细胞并不能诱导胰岛素的释放,同时随后的葡萄糖激发(16.7mmol/L)也显示正常。
在管状回路模型中采用新鲜的人ABO-相容血来灌注人胰岛细胞
参考表1。在胰岛细胞灌注前,血液的葡萄糖浓度在4.5-7.4mmol/L的范围内变化。经过60-分钟的无胰岛细胞存在于对照管状回路中的新鲜非-抗凝集的人血培养后,与0分钟的样品相比,可观察到血细胞计数的轻微下降。此外,还可观察到凝集(TAT,凝血酶原片段1+2,和FXIa-AT)、血小板(β-TG)和补体(C3a和sC5b-9)参数的增加(3倍至接近50倍)。然而,所有的这些变化其绝对值小,从而被认为是血液与管道表面相互作用和液体-空气中间相相互作用产生的正常的背景变化。在无美拉加群的管状回路中,经过60分钟后几乎所有的血小板都被消耗,并伴随有显著的β-TG分泌。60分钟后,粒细胞和单核细胞也被消耗,然而淋巴细胞基本上不受影响。此外,在缺乏美拉加群的情况下,可以观察到肉眼可见的血凝决并伴随有TAT,凝血酶原片段1+2,和FXIa-AT复合体水平的显著升高。同时还观察到补体活化产物C3a和血浆中胰岛素水平的显著增加,以及sC5b-9的较小幅度的增加。
表1
采用新鲜ABO-相容的血液进行60分钟人胰岛细胞灌注之前和之后的血细胞计数、凝集和补体参数
0分钟 | 60分钟 | |||
无胰岛细胞* | 无胰岛细胞* | 胰岛细胞 | ||
无美拉加群 | 10μM美拉加群 | |||
n血小板(X109/L)淋巴细胞(X109/L)单核细胞(X109/L)粒细胞(X109/L)TAT(μg/ml)凝血酶原片段1+2(nmol/L)FXIa-AT(μmol/L)β~TG(IU/mL)C3a(ng/mL)SC5b-9(AU/mL)胰岛素(mU/L) | 10240±112.2±0.10.4±0.04.0±0.39.4±2.21.5±0.20.02±0.0520±130120±1524±3.412±4.3 | 10160±7.62.0±0.10.5±0.13.8±0.3470±8725±5.10.4±0.11300±180530±62130±1610±4.0 | 102.4±1.1+1.7±0.10.1±0.0+1.0±0.1+16000±2900+1000±180+14±2.6+4000±450950±140+180±31460±140+ | 10170±8.2++2.0±0.1++0.6±0.1++3.7±0.3++890±160++110±28++0.9±0.6++1300±200++510±50++140±17.01500±350++ |
*含有血液和培养基,但不含胰岛细胞的对照
+60分钟灌注后,与对照回路相比有显著差异
++与不含美拉加群的胰岛细胞回路相比有显著差异
美拉加群以剂量依赖的方式抑制IBMIR
美拉加群以一种剂量依赖的方式减少细胞消耗和级联系统的活化(表1;图1A-C)。对于大多数参数的作用效果已在低至0.4μM的浓度下进行了观察。在≥4μM时细胞计数完全恢复(图1A,1C)。在相同剂量下β-TG的释放也开始正常化(图1A)。凝集参数TAT和FXIa-AT下降至几乎与4μM美拉加群浓度下的培养基对照相同的水平,但是对凝血酶原片段1+2形成的抑制需要更高剂量的美拉加群(图1B)。与FXIa-AT和TAT复合体类似,补体活化产物C3a也被美拉加群所抑制(图2)。为了调查是否美拉加群对补体系统具有任何直接的作用效果,采用人血清测试其作用效果,其中在微量滴定板孔的聚苯乙烯表面上将补体活化(图2)。美拉加群对C3片段与聚苯乙烯表面的结合或C3a的产生没有任何影响,这表明其不直接影响补体丝氨酸蛋白酶。
在管状回路模型灌注后对人胰岛细胞,进行的免疫组织化学染色
经过60分钟灌注后,发现胰岛细胞被紧紧包埋于血凝块中。抗-CD41a单克隆抗体的免疫组织化学染色显示一纤维蛋白和血小板的囊膜包裹着胰岛细胞。此外,在血栓块中存在CD 11b+PMN和单核细胞的聚集,其中的许多渗入胰岛细胞。与之相对照,采用含有10μM美拉加群的新鲜人血液培养的胰岛细胞没有血凝块形成的迹象。几乎没有CD41+血小板围绕在胰岛细胞表面周围,仅仅只观察到少量的CD11b+细胞渗入胰岛细胞中。在没有与血液接触的对照胰岛细胞中没有观察到CD41+或CD11b+染色。
这些结果表明美拉加群在体外废除了IBMIR,因此可潜在地用于兰氏胰岛细胞的移植,因而可用于治疗糖尿病。
Claims (38)
1.美拉加群或其药学上可接受的衍生物在生产治疗I型糖尿病的药物中的应用。
2.美拉加群或其药学上可接受的衍生物在生产用于细胞移植方法的药物中的应用。
3.如权利要求2所要求保护的应用,其中所述的细胞为产胰岛素细胞或其前体。
4.如权利要求2或3所要求保护的应用,其中所述的细胞为兰氏胰岛细胞。
5.如权利要求3所要求保护的应用,其中所述的产胰岛素细胞的前体为干细胞。
6.美拉加群或其药学上可接受的衍生物在生产用于植活兰氏胰岛细胞的方法的药物中的应用。
7.如权利要求6所要求保护的应用,其中所述的胰岛细胞在肝脏中植活。
8.美拉加群或其药学上可接受的衍生物在生产用于提高患有I型糖尿病的病人的胰岛素非依赖性的方法的药物中的应用。
9.美拉加群或其药学上可接受的衍生物在生产用于治疗血液介导的瞬时炎症反应的药物中的应用。
10.如权利要求1到9中任意一项所要求保护的应用,其中所述的美拉加群衍生物为美拉加群前体药物。
11.如权利要求10所要求保护的应用,其中所述的前体药物的通式为
R1O2C-CH2-(R)Cgl-Aze-Pab-OH,
其中R1表示直链或支链C1-6烷基,同时OH基团取代了Pab中的一个脒基氢。
12.如权利要求11所要求保护的应用,其中所述的R1表示甲基、正丙基、异丙基或叔丁基。
13.如权利要求12所要求保护的应用,其中所述的R1表示乙基。
14.一种治疗I型糖尿病的方法,其包括向需要接受这种治疗的病人给药治疗有效量的美拉加群或其药学上可接受的衍生物。
15.一种细胞移植的方法,该方法包括向准备接受、正在接受或已经接受了这种移植的病人给药治疗有效量的美拉加群或其药学上可接受的衍生物。
16.如权利要求15所要求保护的方法,其中所述的细胞为产胰岛素细胞或其前体。
17.如权利要求15或16所要求保护的方法,其中所述的细胞为兰氏胰岛细胞。
18.如权利要求16所要求保护的方法,其中所述的产胰岛素细胞前体为干细胞。
19.一种兰氏胰岛细胞的植活方法,该方法包括向准备接受、正在接受或已经接受这种胰岛细胞移植的病人给药治疗有效量的美拉加群或其药学上可接受的衍生物。
20.如权利要求19所要求保护的方法,其中将所述的胰岛细胞在肝脏中植活。
21.一种提高患有I型糖尿病的病人的胰岛素非依赖性的方法,该方法包括向需要这种改善的病人给药治疗有效量的美拉加群或其药学上可接受的衍生物。
22.一种治疗血液介导的瞬时炎症反应的方法,该方法包括向需要这种治疗的病人给药治疗有效量的美拉加群或其药学上可接受的衍生物。
23.如权利要求14至22中任意一项所要求保护的方法,其中所述的美拉加群衍生物为美拉加群前体药物。
24.如权利要求23所要求保护的方法,其中所述的前体药物的通式为
R1O2C-CH2-(R)Cgl-Aze-Pab-OH,
其中R1表示直链或支链C1-6烷基,同时OH基团取代了Pab中的一个脒基氢。
25.如权利要求24所要求保护的方法,其中所述的R1表示甲基、正丙基、异丙基或叔丁基。
26.如权利要求25所要求保护的方法,其中所述的R1表示乙基。
27.一种用于I型糖尿病治疗的药物制剂,该制剂包括有效量的美拉加群或其药学上可接受的衍生物。
28.美拉加群或其药学上可接受的衍生物在通过对病人给药美拉加群或其药学上可接受的衍生物而治疗I型糖尿病中的应用。
29.一种组分试剂盒,包括下列组分:
(a)包含美拉加群或其药学上可接受的衍生物的第一组分;和
(b)包含细胞的第二组分,
其中组分(a)和(b)各以适合与这两种组分中的另一组分联合给药的形式提供。
30.一种如权利要求29所要求保护的试剂盒,其中所述的细胞为产胰岛素细胞或其前体。
31.一种如权利要求29或权利要求30所要求保护的试剂盒,其中所述的细胞为兰氏胰岛细胞。
32.一种如权利要求30所要求保护的试剂盒,其中所述的产胰岛素细胞的前体为干细胞。
33.一种组分试剂盒,包括:
(I)如权利要求29至32中的任意一项中定义的组分(a)和(b)中的一种;和
(II)将该组分与这两种组分中的另一种联合使用的说明书。
34.如权利要求27至33中任意一项(合适时)所要求保护的制剂、应用或试剂盒,其中所述的美拉加群衍生物为美拉加群的前体药物。
35.如权利要求34中要求保护的制剂、应用或试剂盒,其中所述的前体药物具有如下通式
R1O2C-CH2-(R)Cgl-Aze-Pab-OH,
其中R1表示直链或支链烷基,且OH基团取代了Pab中的一个脒基氢。
36.如权利要求35中要求保护的制剂、应用或试剂盒,其中R1表示甲基、乙基、正丙基、异丙基或叔丁基。
37.如权利要求36中要求保护的制剂、应用或试剂盒,其中R1表示乙基。
38.一种制备如权利要求29至32或34至37中任意一项所定义的组分试剂盒的方法,该方法包括将如权利要求29至32或34至37中任意一项所定义的组分(a)与如权利要求29至32或34至37中任意一项所定义的组分(b)联合,从而使该两个组分适于互相联合给药。
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