KR20040075096A

KR20040075096A - 유형ｉ 당뇨를 치료하기 위한 약제 제조용 멜라가트란의용도

Info

Publication number: KR20040075096A
Application number: KR10-2004-7011228A
Authority: KR
Inventors: 올레 코르스그렌; 보 닐슨
Original assignee: 아스트라제네카 아베
Priority date: 2002-01-23
Filing date: 2003-01-21
Publication date: 2004-08-26
Also published as: US7045502B2; WO2003061682A1; IL162853A0; NZ533749A; JP2005516035A; ZA200405342B; MXPA04007192A; US20060148720A1; CN100430089C; EP1469874A1; CA2472241A1; SE0200198D0; NO20043483L; US20050090424A1; CN1729010A; BR0306798A

Abstract

본 발명에 따라, 유형 I 당뇨를 치료하기 위한 약제 제조용 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체의 용도가 제공된다.

Description

유형Ｉ 당뇨를 치료하기 위한 약제 제조용 멜라가트란의 용도{THE USE OF MELAGATRAN FOR THE MANUFACTURE OF A MEDICAMENT FOR THE TREATMENT OF TYPE 1 DIABETES MELLITUS}

복합 신장-췌장 이식은 대사 조절을 회복하고 삶의 질을 개선하며 이러한 환자군에서 통상 발견되는 높은 사망률을 감소시킨다는 점에서, 말기 당뇨성 신증을 갖는 유형 I(인슐린-의존성) 당뇨의 치료에 효과적인 치료적 대안이 되어왔다.

신장-췌장 이식이 행해진 환자들의 80%는 10년 후에도 여전히 생존해 있었는데, 이는 신장만이 이식된 환자들의 생존률인 20%에 대해 현저히 대조된다.

그러나, 수술후 합병증은 물론 이에 내포된 수술상 위험이라는 점에서, 췌장 이식은 전형적으로 말기 당뇨성 신증을 갖는 환자에게만 제공되고 있다.

이러한 유용성의 결여로 인해, 분리된 랑게르한스 섬의 이식을 포함하는 인슐린 의존성을 잠재적으로 감소시키는 대안적인 방법이 개발되어왔다.

여러 이식 부위가 실험 모델에서 평가되었음에도, 임상에서는 섬 이식과는 거리가 먼 내부간문맥 이식만이 확립되어왔다.

섬만을 이식한 환자들의 8%만이 이식 1년 후 인슐린 비의존성을 보이는 반면, 신장-췌장 전체를 이식한 경우는 70%라는 점에서, 수년 동안의 임상 결과가 전체 이식에 비교해 현저히 열등함에도, 섬 이식은 수행이 용이하며 안전하다. 이러한 좋지 않은 결과로 단지 적은 비율의 섬 부분만이 이러한 유형의 이식에 이어 효과적으로 접목(engraft)되어 수행되고 있다.

최근의 Shapiro 등(N. Engl. J. Med., 343, 230 (2000))에 의한 새로운 발견은 1명 이상의 기증자로부터 유래된 섬을 환자에게 반복 이식하여 치료함으로써, 인슐린 비의존성이 더욱 용이하게 얻어질 수 있음을 입증하였다.

단일 기증자 이식의 경우 관찰되는 좋지 않은 결과에 대한 가능한 이유들의 조사 수단으로, 문맥으로의 섬 세포 이식 직후 생체내 상황을 모방한 시험관내 섬 관류 시스템이 고안되었다(Bennet 등, Diabetes, 48, 1907 (1999)). 이 연구는 시험관내 ABO 양립성 혈액에 대한 인간 섬의 노출이 중요한 일련의 염증성 반응, 즉 응고 및 보체 시스템의 활성화, 혈소판의 신속한 결합 및 활성화, 및 백혈구의 결합(섬 보전(islet integrity)의 파괴 초래와 함께)을 유도함을 설명하였다. 동종이계 섬의 내부간문맥 이식은 돼지 생체내에서 유사한 일련의 반응들을 초래함이 밝혀졌다.

섬 이식 과정의 상대적으로 낮은 성공률 및/또는 정상혈당을 얻기 위해 여러 기증자들로부터 섬이 요구됨은 이러한 즉각적 혈액 매개 염증성 반응(IBMIR)의 악효과로 설명될 수 있다.

Bennet 등은 또한 흥미롭게도 개별적 물질 단독이 아니라, 헤파린 및 가용성 재조합 CR1(보체 저해제)의 결합이 정상 섬 형태의 파괴 및 섬의 침윤 대부분을 방해한다고 보고하였다. 이러한 방해 효과에도 불구하고, 혈소판 및 피브린의 박층은 여전히 섬 표면에 관찰된다. 국제 특허 출원 WO 00/45837을 또한 참고해라.

따라서, 유형 I 당뇨 환자의 치료(예컨대, 랑게르한스 섬의 이식, 특히, 단일 기증자 유래 섬의 단일 이식을 포함하는 과정)에 잇따르는 수술후 인슐린 비의존성을 증가시키는 효율적인 수단에 대한 임상적 요구는 여전하다.

국제 특허 출원 WO 94/29336는 트롬빈 및/또는 키니노지나제와 같은 세린 프로테아제의 저해제로 유용한 화합물의 한 군을 공개한다. 트롬빈 저해 화합물은 응고저해제로, 키니노지나제 저해 화합물은 항염증제로 지시된다. 당뇨의 치료 및/또는 랑게르한스 섬과 같은 세포 이식에 이러한 화합물들을 사용하는 것에 대해서는 공개되거나 제안된 바 없다.

WO 94/29336에 상세하게 공개된 트롬빈 저해 화합물들 중 하나는 HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab-H(여기서, Cgl은 시클로헥실글리시닐을, Aze는 (S)-아제티딘-2-카르복실을, Pab은 파라-아미디노벤질아미노를 나타냄)이며, 이는 또한 멜라가트란으로도 알려져 있다(WO 94/29336의 실시예 1 참고).

국제 특허 출원 WO 97/23499는 특히 멜라가트란의 프로드러그를 공개한다. 반복하여, 당뇨의 치료 및/또는 랑게르한스 섬과 같은 세포 이식에 이러한 화합물들을 사용하는 것에 대해서는 공개되거나 제안된 바 없다.

국제 특허 출원 WO 00/41716은 염증 치료에 있어 멜라가트란 및 이의 유도체의 용도를 공개한다. IBMIR, 당뇨 및/또는 랑게르한스 섬과 같은 세포 이식에 멜라가트란을 사용하는 것에 대해서는 언급되거나 제안된 바 없다.

멜라가트란이 보체 활성화, 및 혈소판의 활성화 및 이의 랑게르한스 섬에 결합을 포함하여, IBMIR을 거의 완전히 저해함이 현재 밝혀졌으므로, 멜라가트란 및 이의 유도체는 잠재적으로 당뇨 치료에 유용하다.

본 발명은 저분자량 트롬빈 저해제의 새로운 용도에 관한 것이다.

도 1은 멜라가트란을 0 내지 10 μM 농도로 함유하는 ABO-양립성 혈액으로채워진 튜빙 루프 모델에서 항온 처리된 인간 섬에서의 다양한 생물학적 마커의 변화를 나타낸다. 패널 A는 혈소판 입자 계수(하얀 사각형) 및 β-TG의 방출(검은 사각형)의 변화를 나타낸다. 패널 B는 프로트롬빈 단편 1+2(하얀 사각형), TAT(검은 사각형) 및 FXIa-AT(검은 삼각형)의 변화를 나타낸다. 패널 C는 림프구(검은 사각형), 단구(하얀 사각형) 및 PMN(검은 삼각형) 입자 계수의 변화를 나타낸다. 이 수치는 60분 후의 데이타에서 배지 대조군(섬 또는 멜라가트란의 부재)을 뺀 수치를 나타내며, 인간 섬을 함유하나 멜라가트란은 함유하지 않는 비처리된 대조군에 대한 수치 %로 표현하였다.

도 2는 섬이 존재하지 않는 혈청 모델에서의 가용성 C3a(하얀 사각형) 및 부착된 C3 단편(검은 사각형)의 발생 변화, 및 멜라가트란을 0 내지 10 μM 농도로 포함하는 ABO-양립성 혈액에서 섬을 함유하는 튜빙 루프 모델에서의 가용성 C3a(검은 다이아몬드형)의 변화를 나타낸다.

본 발명의 첫번째 양태에 따라, 유형 I 당뇨를 치료하기 위한 약제 제조용, 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체의 용도가 제공된다.

용어 "유형 I 당뇨"는 인슐린 의존성 당뇨(IDD)를 포함한다고 당업자에게 이해될 것이다.

멜라가트란 및 이의 유도체는 이식이 포함되는 유형 I 당뇨의 치료에 있어 특정 유용성이 발견될 수 있다. 이러한 이식에는 신장 이식, 췌장 이식 또는 복합 신장-췌장 이식이 포함될 수 있으나, 인슐린 생산 세포 또는 이의 전구체와 같은 세포의 이식이 포함되는 것이 바람직하다. 바람직한 인슐린 생산 세포에는 랑게르한스 섬이 포함된다. 인슐린 생산 세포의 전구체에는 줄기세포와 같은 전구 세포가 포함되며, 이는 본 기술 분야 당업자에게 알려진 기술들을 사용하여 췌장으로 주입되어, 인슐린 생산 세포로 발달될 수 있다.

따라서, 본 발명의 추가적 양태에 따라, 인슐린 생산 세포 또는 이의 전구체, 예컨대, 랑게르한스 섬 또는 줄기 세포가 포함되는 세포의 이식 방법에 사용하기 위한 약제 제조용, 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체의 용도가 제공된다.

바람직한 랑게르한스 섬에는 베타 세포(즉, 췌장 인슐린 생산 세포)가 포함되나, 본 발명에 따른 용도가 이러한 세포의 이식으로만 제한되는 것은 아니다. 이식에는 분리 과정 및 다중 과정이 포함될 수 있으며, 세포는 1명 이상의 기증자로부터 이러한 과정(들)의 사용으로 얻어질 수 있다. 바람직한 과정에는 단일 기증자로부터의 단일 이식이 포함될 수 있다.

멜라가트란 및 이의 유도체가 이식(에컨대, 내부간문맥 이식)에 잇따르는 간에서의 랑게르한스 섬의 접목을, 멜라가트란/유도체의 부재시 이식에 잇따르는 접목에 비교하여, 증강시킬 수 있음을 밝혔다.

따라서, (a) 랑게르한스 섬의 예컨대 간에서의 접목; 및 (b) 유형 I 당뇨를 갖는 환자들에서 인슐린 비의존성의 개선(예컨대, 정상혈당의 획득) 방법에 사용하기 위한 약제 제조용, 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체의 용도가 제공된다.

IBMIR을 치료하기 위한 약제 제조용, 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체의 용도가 추가로 제공된다.

본 문맥에 사용시, 용어 "IBMIR"(즉각적 혈액 매개 염증성 반응)에는 랑게르한스 섬의 문맥으로 이식 후에 나타난다고 알려진 일련의 염증성 반응들, 즉, 섬 보전의 파괴를 초래할 수 있는 응고 및 보체 시스템의 활성화, 혈소판의 빠른 결합 및 활성화, 및 백혈구의 결합이 포함된다.

의심의 여지를 피하기 위해, 용어 "치료"에는 치료적 및 예방적 치료 모두가 포함된다. 예방적 치료에는 예컨대 IBMIR의 진행 방해(저해)가 포함된다.

멜라가트란의 "약학적으로 허용되는 유도체"에는 염(예컨대, 약학적으로 허용되는 비독성 유기산 또는 무기산 첨가 염) 및 용매화물이 포함된다. 이 용어에 멜라가트란과 동일한 생물학적 기능 및/또는 활성을 가지는 또는 제공하는 유도체들이 추가로 포함된다는 것은 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해, 이 용어에는 또한 멜라가트란의 프로드러그가 포함된다. 멜라가트란의 "프로드러그"에는 경구 또는 비경구 투여 이후, 생체내에서 대사되어 미리결정된 시간 이내에(예컨대, 6 내지 24시간 사이의 투여 간격 이내(즉, 하루에 1번 내지 4번)), 실험적으로 검출가능한 양의 멜라가트란을 형성하는 물질의 어떠한 조성물이 포함된다. 의심의 여지를 피하기 위해, 용어 "비경구" 투여에는 경구 투여가 아닌 모든 투여 형태들이 포함된다.

언급될 수 있는 멜라가트란의 프로드러그에는 국제 특허 출원 WO 97/23499에서 공개된 것들이 포함된다. 바람직한 프로드러그는 화학식 R¹0₂C-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab-OH(상기 약자 목록 또는 WO 97/23499를 참고)의 것들이며, 여기서 R¹은 C_1-10알킬 또는 벤질, 예컨대, 직쇄 또는 분지쇄 C_1-6알킬(예컨대, C_1-4알킬, 특히, 메틸, n-프로필, i-프로필, t-부틸 및 특히, 에틸)을 나타내며, OH기는 Pab내 아미디노 수소 중 하나를 대체한다.

본 발명에 따라, 멜라가트란 및 이의 유도체는 경구, 간문맥내, 정맥내, 피하내, 구강내, 직장내, 피부내, 비강내, 도관내, 기관지내, 국부, 기타 비경구 투여 경로, 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다.

멜라가트란 및 이의 유도체는 약학적으로 허용되는 제형내 멜라가트란을 포함하는 약학적 제제 형태로 투여될 수 있다. 투여 경로는 물론 치료될 환자에 따라, 이러한 조성물은 상이한 투여량으로 투여될 수 있다.

바람직한 전달 방식은 전신적인 것이다. 멜라가트란 및 이의 유도체의 경우, 바람직한 투여 방식은 비경구(더욱 바람직하게는 정맥내, 특히 간문맥내) 또는 경구적인 것이다. 이러한 투여 방식들이 투여 이후 간 내에서 멜라가트란/유도체 농도의 극대화를 제공함이 밝혀질 수 있다.

유형 I 당뇨의 치료에서, 멜라가트란 및 이의 유도체는 섬 이식 과정에서 랑게르한스 섬과 함께 투여되는 것이 바람직하다.

본 발명의 또다른 추가적 양태에 따라, (a) 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체를 포함하는 제1 성분; 및 (b) 세포, 예컨대, 인슐린 생산 세포 또는 이의 전구체, 예컨대, 랑게르한스 섬 또는 줄기 세포를 포함하는 제2 성분을 포함하는 부분들의 키트가 제공된다. 이 때, 성분 (a) 및 (b)는 유형 I 당뇨의 치료 및/또는 세포 이식 방법에서, 서로와 함께 투여에 적합한 형태로 각각 제공되며, 또한 이는 순차적 사용, 분리 사용 및/또는 동시 사용에 적합하다.

따라서, 성분 (a) 및 (b)는 약학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체와 함께, (적절한) 멜라가트란/유도체 또는 세포의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 추가적 양태에 따라, 전술된 바와 같은 성분 (a)를 전술된 바와 같은 성분 (b)와 회합하여, 두 성분이 서로와 함께 투여에 적합하게 되는 것을 포함하는, 전술된 바와 같은 키트의 제조 방법이 제공된다.

따라서, (I) 본 명세서에 서술된 바와 같은 성분 (a) 및 (b) 중 하나를; (II) 두 성분을 서로와 함께 사용하기 위한 지시서와 함께 포함하는 부분들의 키트가 추가로 제공된다.

본 명세서에 서술된 바와 같은 부분들의 키트에 관하여, "함께 투여"된다는 것에는 각각의 성분 (a) 및 (b)가 치료 과정을 통해 순차적으로, 분리되어, 및/또는 동시에 투여되는 것이 포함된다. 더욱이, 용어 "함께"에는 두 성분 (a) 및 (b) 중 어느 하나가 다른 성분의 투여 이전, 이후 및/또는 동시에 투여될 수 있다는 것이 포함된다. 본 문맥에 사용시, 용어 "동시에 투여되는" 및 "동일한 시간에 투여되는"에는 두 성분이 서로 48시간 이내(예컨대, 24시간)에 투여되는 것이 포함된다.

성분들이 분리되어 투여될 때, 이들의 투여되는 순서(즉, 순차, 분리 및/또는 동시 투여의 여부 및 시기)는 내과의사 또는 당업자에 의해 결정될 수 있다.

포유동물 및 특히 인간의 치료적 치료에서, 멜라가트란/유도체는 약학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체와 혼합된 약학적 제제로 투여될 것이며, 이는 의도된 투여 경로 및 표준 약학적 관례에 따라 선택될 수 있다.

멜라가트란 및 이의 유도체(프로드러그 포함)의 투여에 사용되기 위한 적합한 제제는 문헌, 예컨대, 특히 국제 특허 출원 WO 94/29336, WO 96/14084, WO 96/16671, WO 97/23499, WO 97/39770, WO 97/45138, WO 98/16252, WO 99/27912, WO 99/27913, WO 00/12043 및 WO 00/13671에 공개되어 있으며, 이들 문서의 명세서는본 명세서에 참고 문헌으로 편입된다. 이와 달리, 적합한 제제의 제조는 일상적인 기술을 사용하여 당업자에 의해 비발명적으로 성취될 수도 있다.

본 발명의 추가적 양태에 따라, 유효한 양의 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체를 약학적으로 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체와 함께 포함하는, 유형 I 당뇨의 치료에 사용하기 위한 약학적 제제가 제공된다.

각각의 제제에서 멜라가트란/유도체의 양은 질병의 중증도, 치료될 환자, 및 사용될 화합물(들)에 의존할 것이나, 당업자에 의해 비발명적으로 결정될 수도 있다.

포유동물, 특히 인간 환자의 치료에 있어, 멜라가트란/유도체의 적합한 투여량은 의료업자 또는 기타 당업자에 의해 일상적으로 결정될 수 있으며, 본 명세서에 참고 문헌으로 편입된 전술된 선행 기술 문서인 관련 명세서에 서술된 개별적 투여량이 포함될 수 있다.

멜라가트란의 경우, 포유동물, 특히 인간 환자의 치료적 및/또는 예방적 치료에 있어, 활성 화합물, 이의 프로드러그 및 유도체의 적합한 투여량은 관련 질환의 치료 과정을 통해, 5 μmol/L 까지의 평균 혈장 농도, 예컨대, 0.001 내지 5 μmol/L의 범위를 나타내는 것들이 포함된다. 따라서, 적절한 투여량은 하루에 1번 0.1 mg 내지 하루에 3번 25 mg의 범위일 수 있고, 및/또는 멜라가트란의 경우에는 24시간에 걸쳐 100 mg까지 비경구적으로 주입될 수 있으며, 본 명세서에서 상세하게 언급된 것들이 포함되는 멜라가트란의 프로드러그의 경우에는 하루에 1번 0.1 mg 내지 하루에 3번 100 mg의 범위일 수 있다.

좌우간, 내과의사 또는 당업자는 치료될 특정 환자의 나이, 체중, 성별 및 반응에 따라 상이한, 개별적인 환자에게 가장 적합할 실제 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 상기 언급된 투여량은 평균적인 경우의 예시이므로, 더 많은 또는 더 적은 투여량이 합당하고, 본 발명의 범위 이내라면 개별적인 예들도 물론 가능하다.

랑게르한스 섬의 이식은 일상적인 기술 수단, 예컨대, 이들을 적절한 완충액에 현탁하고, 그 후 경간 주사기 또는 도뇨관을 통해, 또는 Boker 등(World J. Surg., 25, 481 (2001))(이 문서의 관련 명세서는 본 명세서에 참고 문헌으로 편입)에 의해 서술된 바와 같이, 또는 본 명세서에 이후 서술된 바와 같이, 현탁액을 간문맥에 주사 및/또는 주입하여 성취될 수 있다.

본 발명의 추가적 양태에 따라, 치료상 유효한 양의 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체를 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 유형 I 당뇨의 치료 방법이 제공된다.

본 명세서에 서술된 용도 및 방법은 유형 I 당뇨의 치료에 있어, 특히 유 형 I 당뇨를 갖는 환자에서 랑게르한스 섬의 이식에 의한 인슐린 의존성을 완화시키는데 있어 장점을 가질 수 있으며, 멜라가트란 및 이의 유도체는 알려진 요법들의 단점을 갖지 않을 수 있다.

본 발명을 이하 실시예로 설명하나 이로 제한되는 것은 아니다.

멜라가트란의 IBMIR에 대한 효과

<재료 및 방법>

섬 분리

췌장은 기관 기증자 등록소 또는 관계 기관의 동의를 얻은 후 시체 기증자로부터 얻었다. 기관은 3명의 여성 및 2명의 남성의 정상혈당 기증자들(나이 59세 내지 85세, 혈액형은 3명은 O형 2명은 A형)로부터 얻었다. 섬은 웁살라 대학교의 임상 면역학부에서, 전술된 반자동화된 침지-여과 방법을 변형하여 사용함으로써 분리하였다(Brandhorst 등, Cell Transplant., 7, 489 (1998) 및 Ricordi 등, Diabetes, 37, 413 (1988)). 이 분리 과정 후, 냉장 COBE 2991 원심분리기(COBE Blood Component Technology, Lakewood, CO, USA)에서 연속 밀도 구배하에 추가 정제하였다. 섬을 비처리된 배양 플라스크에 두고, 37℃에서(5% CO₂) 1일 내지 5일 동안 현탁 배양하였다. 배양 배지(CMRL 1066; ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA)는 2일마다 교환하였다. 섬의 부피 및 순도는 디페닐티오카르바존으로 염색한 후, 격자 상에서 현미경 사이징으로 결정하였다. 본 연구에 사용된 섬 제조 순도는 40% 내지 95%의 범위(70 ±6.3%)이다(엑소크린/제조된 도관 조직에 대한 엔도크린의 양; 평균 ±SD). 생존률은 동적 관류 시스템에서 글루코즈 공격에 대한 반응인 인슐린 분비로 환산하여 평가하였다(1.67 mmol/L 글루코즈, 그 후 16.7 mmol/L, 최종적으로 1.67 mmol/L로 복귀한 농도에서).

헤파린 처리

전체 혈액과 접촉하는 모든 재료들은 제조자의 권고에 따라 코린 헤파린 표면(Corline, Uppsala, 스웨덴)으로 제공하였다(J. Clin. Immunol., 16, 222 (1996) 참고). 헤파린의 표면 농도는 2-4 pmol/cm²의 안티트롬빈 결합 능력을 갖는, 약 0.1 U/cm²에 대응하는 0.5 ㎍/cm²이었다.

혈액의 준비

적어도 14일 동안 약제를 전혀 투여받지 않은 건강한 지원자로부터 얻은 신선한 인간 혈액을 표면이 헤파린으로 처리된 60 mL 주사기(18 게이지, Microlance;Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)로 회수하였다. 주사기의 캐뉼러를 표면이 헤파린으로 처리된 실리콘 튜빙에 연결하였다. 시료 채취시, 주사기를 연속적으로 회전하였다.

모델로서 튜빙 루프

전술된 모델을 변형하여 사용하였다(Bennet 등, Diabetes, 48, 1907 (1999), Gong 등, J. Clin. Immunol., 16, 222 (1996) 및 Larsson 등, Immnunopharmacology, 38, 119 (1997) 참고). 이 장치는 PVC로 된 루프들(직경 6.3 mm; 길이 390 mm)로 구성되며, 이 루프의 내부 표면은 고정된 헤파린을 제공한다. 튜빙은 특별히 고안된 헤파린으로 처리된 연결부와 함께 유지된다. 원형 루프는 연결부의 말단이 튜빙 말단의 루멘을 단단히 밀고 있을때 형성되었다. 37℃ 항온기에 둔 진동(rocking) 기구를 루프 내부로의 혈액 흐름을 발생하는데 사용하였다. 연결부와 밀착되어 유입되는 혈액을 방해하는 조절점에서 루프는 진동된다. 12개 까지의 장치가 동시에 진동될 수 있다. 5명의 상이한 기증자들에서 분리된 섬을 사용하여, 10개의 60-분 섬 실험을 수행하였다. 5 mM 시트레이트 완충액(0.15 M NaCl 포함, pH 5.5)에 용해된 멜라가트란(AstraZeneca R & D Molndal, 스웨덴)을 0, 0.4, 1, 4 및 10 μM에서 시험하였다. 각각의 실험에서, 섬이 배제된 신선한 인간 혈액의 2개의 루프(하나는 CMRL 1066 (GibcoRBL, USA) 함유, 다른 하나는 10 μM의 멜라가트란 함유)는 대조군으로 포함되었다. 동일 기증자(5 mL)의 신선한 ABO-양립성 인간 혈액을 각 루프에 첨가하였다. 이 루프를 진동 장치상에 두고 10분 동안 멜라가트란 또는 시트레이트 완충액과 함께 예비 항온 처리하였다. 그 후, 루프를 개방하고, 150 μL의 CMRL 1066을 4 μL의 섬(약 4,000 IEQ)의 존재 또는 부존재하에 루프에 첨가한 후, 다시 37℃, 진동 장치상에서 60-분 항온 처리하였다. 혈액 글루코즈 수치는 관류 이전에 글루코미터(Glucometer Elite; Bayer Diagnostics, Leverkusen, 독일)로 측정하였다. 관류 후 마다, 루프 성분을 70 ㎛ 직경 여과기(Filcons, Cuptype; DAKO, 덴마크)로 여과하였다. 여과기에 회수된 육안으로 보이는 혈액 응혈 및 조직 모두를 면역조직화학 염색을 위해 액체 질소에서 동결하였다. 면역조직화학 비교를 위해, 비관류된 섬 또한 동결하여, 동일한 과정으로 염색하였다. 남아있는 여과된 혈액을 4.1 mM EDTA(최종 농도)에 회수하고, 혈액학 분석(혈소판, 백혈구, 단구, 및 과립구), 및 응고 활성화(프로트롬빈 단편 1+2, 트롬빈-항트롬빈[TAT], 및 인자 XIa-항트롬빈 복합체[FXIa-AT]), 보체 활성화(C3a 및 sC5b-9), 혈소판 활성화(β-트롬보글로불린[β-TG]), 및 인슐린 분석에 사용하였다. 0분에서 취한 시료 또한 포함되었다. 이러한 시료에서, 혈액은 튜빙 루프에 첨가되지 않았으나, 대신 즉시 EDTA-함유 튜브로 전이하였다. 혈액 시료를 4℃, 3290 x g에서 20분 동안 원심분리하고, 혈장을 회수하여 분석 전까지 -70℃에서 보관하였다.

마이크로타이터 플레이트의 웰에서 보체의 활성화

멜라가트란의 보체 시스템에 대한 직접적 효과는 혈장을 마이크로타이터 플레이트의 웰에서 배양하는 방법을 사용하여 연구하였다(Nilsson 등, Mol. Immunol., 30, 211 (1993)). 혈장(100 μL)을 멜라가트란(최종 농도 0, 0.4, 1, 4, 또는 10 μM)과 함께 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다.37℃에서 30분 동안 항온 처리 후, 혈장을 EDTA(최종 농도, 10 mM)가 함유된 튜브로 옮겼다. 이 시료들을 보체 단편 C3a 분석(이하 참고) 이전까지 -70℃에서 보관하였다. 부착된 C3 단편을 검출하기 위해, 마이크로타이터 플레이트의 웰을 0.05%(부피/부피) TWEEN 20을 함유한 PBS로 세척하고, 100 μL의 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-컨주게이트된 항-C3c(DAKO AS, Glostrup, 덴마크)와 함께 37℃에서 60분 동안 항온 처리하였다. 항체의 결합은 1,2-페닐렌디아민 디히드로클로라이드(Fluka, 스위스)의 첨가로 검출하였으며, 염색은 492 nm에서 모니터링하였다.

혈액 및 혈장 분석

혈소판 계수 및 차별적 백혈구 계수는 Coulter ACT-diff 분석기(Beckman Coulter, FL, USA) 상에서 EDTA-처리된 혈액을 사용하여 분석하였다.

효소 면역분석(EIA)

A. 프로트롬빈 단편 1+2 및 트롬빈-안티트롬빈(TAT)

프로트롬빈 단편 1+2 및 TAT의 혈장 수치는 시판되는 EIA 키트(Enzygnost Prothrombin, 단편 1+2; TAT, Behringswerke, Marburg, 독일)를 사용하여 정량화하였다. 수치는 각각 nmol/L 및 ㎍/L로 제시하였다.

B. 인자 XIa-안티트롬빈(FXIa-AT)

FXIa 및 AT 간의 복합체는 혈장 내에서 Sanchez 등의 방법(Thromb. Res., 89, 41 (1998))에 따라 측정하였다. 수치는 μmol/L로 표현하였다.

C. β-트롬보글로불린(β-TG)

β-TG는 EDTA-혈장 내에서 Asserachom(Diagnostica Stago, Asnieres-sur-Seine, 프랑스)을 사용하여 분석하였다. 수치는 IU/mL로 표현하였다.

D. C3a

EDTA-혈장은 앞서 서술된 바와 같이 분석하였다(Nilsson Ekdahl 등, Scand. J. Immunol., 35, 85 (1992)). 모노클로날 항체 4SD17.3을 캡쳐 항체로 사용하였다. 부착된 C3a를 바이오틴화된 폴리클로날 항-C3a, 및 이후 HRP-컨주게이트된 스트렙타비딘(Amersham, Buckinghamshire, UK)으로 검출하였다. 정제된 C3a 용액에 대해 조정된 자이모산-활성화된 혈장은 표준으로 제공되며, 수치는 ng/mL로 제시하였다.

E. sCSb-9

혈장은 Mollnes 등(Scand. J. Immunol., 35, 85 (1992) 및 Artif. Organs, 19, 909 (1995) 참고)에 의해 서술된 EIA를 변형 사용하여 분석하였다. EDTA-혈장을 mAb 항-neoC9로 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 첨가하였다. sCSb-9는 폴리클로날 항-C5 항체(DAKO), 및 이후 HRP-컨주게이트된 항-토끼 면역글로불린(DAKO)으로 검출하였다. 40,000 임의 단위(AU/mL)를 함유한다고 정의된, 자이모산-활성화된 혈장은 표준으로 제공된다. 수치는 AU/mL로 제시하였다.

F. 인슐린

인슐린의 혈장 농도는 섬 관류 전후에 시판되는 EIA 키트(DAKO)로 분석하였다. 수치는 pmol/L로 제시하였다.

면역조직화학 염색

혈액 및 다양한 농도의 멜라가트란으로 관류 후 여과기 상에 회수된 섬 및육안으로 보이는 응혈을 엠베딩 배지(Tissue-Tek; Miles, Eckhart, IN, USA)에 모으고, 액체 질소에서 스냅 동결하였다. 섬을 박편화하고, 그 후 HRP-컨주게이트화된 마우스 항-인간 CD41a(R & D Systems, Abingdon, UK) 및 항-CDllb(Clone 2LPM19c, DAKO)로 염색하였다.

통계적 분석

혈액 세포 계수 및 혈장 변수들의 개별적 다양성 때문에, 배지 대조군 루프 내 얻어진 수치 %로서(혈액 세포에 대한), 또는 실험적 루프 및 멜라가트란이 없는 섬 루프 내에서 얻어진 수치의 비로서 변화들을 계산하였다. 모든 결과들은 평균 ±SEM으로 표현하였다. 평균 수치는 Friedman ANOVA(Analyse-It, 버젼 1.44, Software Ltd, UK)를 사용하여 비교하였다. 유의도는 α=0.05에서 결정하였다. 도 1B, C 및 2에 표시된 데이타는 0-분 시료에 대한 데이타를 삭감한 후의 네트 수치를 나타낸다.

<결과>

섬 기능은 멜라가트란에 의해 영향받지 않는다

멜라가트란이 섬 기능에 반대적인 영향을 주지 않음을 확인하기 위해, 섬 관류 시스템 내에서 루프 실험에 사용된 최고 농도(10 μM)에서 본 저해제를 시험하였다. 섬을 10 μM의 멜라가트란과 함께 관류한 경우 인슐린 방출을 유도하지 않았으며, 이후의 글루코즈 자극(16.7 mmol/L) 또한 정상이었다.

튜빙 루프 모델에서 신선한 인간 ABO-양립성 혈액으로 인간 섬의 관류

표 1에 대한 참고로, 섬 관류 이전의 혈액내 글루코즈 농도는 4.5 내지 7.4mmol/L의 범위이었다. 대조군 튜빙 루프에서 섬 부재하에 신선한 비-항응고된 인간 혈액의 60-분 항온 처리 후, 0-분 시료와 비교하여 혈액 세포 계수에 약간의 감소가 관찰되었다. 더욱이, 응고(TAT, 프로트롬빈 단편 1+2, 및 FXIa-AT), 혈소판(β-TG), 및 보체(C3a 및 sC5b-9) 변수들에 있어서의 증가(3 내지 거의 50배) 또한 관찰되었다. 그러나, 이러한 변화 모두는 절대적으로 작은 수치이며, 튜빙 표면 및 유체-공기 간의 혈액 상호작용으로 초래되는 정상적인 백그라운드 변화로 간주된다. 멜라가트란이 없는 튜빙 루프에서, β-TG의 현저한 분비와 동시에, 거의 모든 혈소판들이 60분 후 소비되었다. 과립구 및 단구 또한 60분 후 소비되는 반면, 백혈구는 본질적으로 영향을 받지 않았다. 덧붙여, 멜라가트란의 부재시, 육안으로 보이는 응혈이 관찰되며, TAT, 프로트롬빈 단편 1+2, 및 FXIa-AT 복합체 수치의 두드러진 증가가 동반되었다. 보체 활성화 산물 C3a 및 혈장 인슐린 수치의 두드러진 증가 또한 관찰되었으며, sC5b-9 또한 증가하였으나 적은 범위이었다.

신선한 ABO-양립성 혈액으로 인간 섬 관류 60분 전후의 혈액 세포 계수, 응고 및 보체 변수

	0분	60분
	섬 부존재^*	섬 부존재^*	섬
	섬 부존재^*	섬 부존재^*	멜라가트란부존재	10 μM멜라가트란
n	10	10	10	10
혈소판(x10⁹/L)	240 ±11	160 ±7.6	2.4 ±1.1^†	170 ±8.2^‡
림프구(x10⁹/L)	2.2 ±0.1	2.0 ±0.1	1.7 ±0.1	2.0 ±0.1^‡
단구(x10⁹/L)	0.4 ±0.0	0.5 ±0.1	0.1 ±0.0^†	0.6 ±0.1^‡
과립구(x10⁹/L)	4.0 ±0.3	3.8 ±0.3	1.0 ±0.1^†	3.7 ±0.3^‡
TAT(㎍/mL)	9.4 ±2.2	470 ±87	16000 ±2900^†	890 ±160^‡
프로트롬빈 F1+2(nmol/L)	1.5 ±0.2	25 ±5.1	1000 ±180^†	110 ±28^‡
FXIa-AT(μmol/L)	0.02 ±0.0	0.4 ±0.1	14 ±2.6^†	0.9 ±0.6^‡
β-TG(IU/mL)	520 ±130	1300 ±180	4000 ±450	1300 ±200^‡
C3a(ng/mL)	120 ±15	530 ±62	950 ±140^†	510 ±50^‡
sC5b-9(AU/mL)	24 ±3.4	130 ±16	180 ±31	140 ±17.0
인슐린(mU/L)	12 ±4.3	10 ±4.0	460 ±140^†	1500 ±350^‡

^*혈액 및 배지를 함유하나, 섬은 함유하지 않은 대조군

^†관류 60분 후, 대조군 루프와 비교시 중요한 차이점

^‡멜라가트란이 없는 섬 루프와 비교시 중요한 차이점

멜라가트란은 투여량-의존성 방식에서 IBMIR을 저해한다

멜라가트란은 투여량-의존성 방식에서 세포 소비 및 캐스캐이드 시스템 활성화를 감소시켰다(표 1; 도 1A-C). 대부분의 변수들에 대한 영향이 0.4 μM이라는 낮은 농도에서 이미 관찰되었다. 세포 계수는 4 μM 이상의 농도에서 완전히 회복되었다(도 1A, 1C). β-TG의 방출 또한 동일한 투여량에서 정상화되었다(도 1A).응고 변수 TAT 및 FXIa-AT는 4 μM의 멜라가트란에서의 배지 대조군과 거의 동일한 수치로 감소되었으나, 프로트롬빈 단편 1+2 형성의 저해에는 더 많은 투여량의 멜라가트란이 요구되었다(도 1B). FXIa-AT 및 TAT 복합체와 평행하게, 보체 활성화 산물 C3a 또한 멜라가트란에 의해 저해되었다(도 2). 멜라가트란이 보체 시스템에 어떠한 직접적 영향을 주는지 여부를 조사하기 위해, 이 영향을 마이크로타이터 플레이트 웰의 폴리스티렌 표면상에서 보체가 활성화된 인간 혈장에서 시험하였다(도 2). 멜라가트란은 폴리스티렌 표면에의 C3 단편의 결합 또는 C3a의 생성(이는 보체 세린 프로테아제에 직접 영향을 주지 않음을 의미함)에 영향을 주지 않았다.

튜빙 루프 모델에서 관류 후 인간 섬의 면역조직화학 염색

관류 60분 후 섬이 응혈 내 엠베드됨이 일관되게 관찰되었다. 항-CD41a 모노클로날 항체로의 면역조직화학 염색 결과 섬으로 둘러싸여진 피브린 캡슐 및 혈소판이 관찰되었다. 덧붙여, 트롬비 내 CD1lb⁺PMN 및 단구가 축적되며, 이들 대부분이 섬으로 침투되는 것으로 보여졌다. 대조적으로, 10 μM 멜라가트란 존재하에 신선한 인간 혈액과 항온 처리된 섬은 응혈 형성의 신호가 없었다. 섬 표면으로 둘러싸인 CD41⁺혈소판은 거의 없었으며, 단지 약간의 CD1lb⁺세포만이 섬으로 침투됨이 밝혀졌다. CD41⁺또는 CDllb⁺염색은 혈액에 노출되지 않은 대조군 섬에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 멜라가트란이 시험관내에서 IBMIR을 폐기하여, 랑게르한스 섬의 이식 및 이로 인한 당뇨의 치료에 잠재적으로 사용가능함을 설명해준다.

Claims

유형 I 당뇨를 치료하기 위한 약제 제조용 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체의 용도.
세포 이식 방법에 사용하기 위한 약제 제조용 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체의 용도.
제2항에 있어서, 상기 세포가 인슐린 생산 세포 또는 이의 전구체인 것인 용도.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 세포가 랑게르한스 섬인 것인 용도.
제3항에 있어서, 상기 인슐린 생산 세포의 전구체가 줄기 세포인 것인 용도.
랑게르한스 섬의 접목(engrafting) 방법에 사용하기 위한 약제 제조용 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체의 용도.
제6항에 있어서, 상기 섬을 간에 접목하는 것인 용도.
유형 I 당뇨를 갖는 환자의 인슐린 비의존성 개선 방법에 사용하기 위한 약제 제조용 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체의 용도.
즉각적 혈액 매개 염증성 반응을 치료하기 위한 약제 제조용 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체의 용도.
제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 멜라가트란의 유도체가 멜라가트란의 프로드러그인 것인 용도.
제10항에 있어서, 상기 프로드러그가 화학식 R¹0₂C-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab-OH이며, 상기 화학식에서 R^l은 직쇄 또는 분지쇄 C_l-6알킬을 나타내고, OH기는 Pab의 아미디노 수소 중 하나를 대체하는 것인 용도.
제11항에 있어서, 상기 R^l은 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필 또는 t-부틸을 나타내는 것인 용도.
제12항에 있어서, 상기 R^l은 에틸을 나타내는 것인 용도.
약학적으로 유효한 양의 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체를 유형 I 당뇨의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 유형 I 당뇨의 치료 방법.
약학적으로 유효한 양의 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체를 세포 이식이 될, 되는, 또는 된 환자에게 투여하는 것을 포함하는 세포의 이식 방법.
제15항에 있어서, 상기 세포가 인슐린 생산 세포 또는 이의 전구체인 것인 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 세포가 랑게르한스 섬인 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 인슐린 생산 세포의 전구체가 줄기 세포인 것인 방법.
약학적으로 유효한 양의 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체를 랑게르한스 섬의 이식이 될, 되는, 또는 된 환자에게 투여하는 것을 포함하는 랑게르한스 섬의 접목 방법.
제19항에 있어서, 상기 섬을 간에 접목하는 것인 방법.
약학적으로 유효한 양의 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체를 인슐린 비의존성 개선을 필요로 하는 유형 I 당뇨를 갖는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 유형 I 당뇨를 갖는 환자의 인슐린 비의존성 개선 방법.
약학적으로 유효한 양의 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체를 즉각적 혈액 매개 염증성 반응의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 즉각적 혈액 매개 염증성 반응의 치료 방법.
제14항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에서, 상기 멜라가트란의 유도체가 멜라가트란의 프로드러그인 것인 방법.
제23항에 있어서, 상기 프로드러그가 화학식 R¹0₂C-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab-OH이며, 상기 화학식에서 R^l은 직쇄 또는 분지쇄 C_l-6알킬을 나타내고, OH기는 Pab의 아미디노 수소 중 하나를 대체하는 것인 방법.
제24항에 있어서, 상기 R^l은 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필 또는 t-부틸을나타내는 것인 방법.
제25항에 있어서, 상기 R^l은 에틸을 나타내는 것인 방법.
유효한 양의 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체를 포함하는 유형 I 당뇨 치료에 사용하기 위한 약학적 제제.
멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체를 환자에게 투여하여 유형 I 당뇨를 치료하기 위한 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체의 용도.
(a) 멜라가트란 또는 이의 약학적으로 허용되는 유도체를 포함하는 제1 성분; 및 (b) 세포를 포함하는 제2 성분을 포함하는 부분들의 키트로서, 상기 성분 (a) 및 (b)는 서로 함께 투여하기 적합한 형태로 각각 제공되는 것인 키트.
제29항에 있어서, 상기 세포가 인슐린 생산 세포 또는 이의 전구체인 것인 키트.
제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 세포가 랑게르한스 섬인 것인 키트.
제30항에 있어서, 상기 인슐린 생산 세포의 전구체가 줄기 세포인 것인 키트.
(I) 제29항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에서 정의된 성분 (a) 및 (b) 중 하나를 (II) 두 성분들을 서로 함께 사용하기 위한 지시서와 함께 포함하는 부분들의 키트.
제27항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에서(적절한대로), 상기 멜라가트란의 유도체가 멜라가트란의 프로드러그인 것인 제제, 용도 또는 키트.
제34항에 있어서, 상기 프로드러그가 화학식 R¹0₂C-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab-OH이며, 상기 화학식에서 R^l은 직쇄 또는 분지쇄 C_l-6알킬을 나타내고, OH기는 Pab의 아미디노 수소 중 하나를 대체하는 것인 제제, 용도 또는 키트.
제35항에 있어서, 상기 R^l은 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필 또는 t-부틸을 나타내는 것인 제제, 용도 또는 키트.
제36항에 있어서, 상기 R^l은 에틸을 나타내는 것인 제제, 용도 또는 키트.
제29항 내지 제32항, 또는 제34항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에서 정의된 성분 (a)를 제29항 내지 제32항, 또는 제34항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에서 정의된 성분 (b)와 함께 제공하여, 서로 함께 투여하기 적합한 두 성분들이 되게 하는 제29항 내지 제32항, 또는 제34항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에서 정의된 부분들의 키트의 제조 방법.