MXPA04007192A - Uso de melagatrana para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de diabetes mellitus tipo i. - Google Patents

Abstract

Uso de melagatrana para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de diabetes mellitus tipo ILa presente invencion se refiere al uso de melagatrana o un derivado aceptable farmaceuticamente de la misma, para la elaboracion de un medicamento para el tratamiento de diabetes mellitus tipo I.

Description

USO DE MELAGATRANA PARA LA MANUFACTURA DE UN MEDICAMENTO PARA EL TRATAMIENTO DE DIABETES MELLITUS TIPO I DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente con un nuevo uso de un inhibidor de trombina de bajo peso molecular. El transplante combinado de riñon - páncreas se ha convertido en una opción terapéutica valida para el tratamiento de diabetes tipo I (dependiente de insulina) con nefropatia diabética de etapa final, en vista del hecho de que restaura el control metabólico, mejora la calidad de vida y reduce la alta proporción de mortandad encontrada usualmente en este grupo de pacientes. El 80% de los pacientes sometidos al transplante del riñon - páncreas están todavía vivos después de 10 años, en contraste agudo con la proporción de sobrevivencia del 20% de aquellos que reciben solamente un riñon. Sin embargo, en vista del riesgo quirúrgico que está involucrado, también como las complicaciones post-operativas que frecuentemente resultan, el transplante de páncreas solamente es ofrecido comúnmente a pacientes con nefropatia diabética de etapa final. En vista de esta carencia de disponibilidad, se ha desarrollado un método alternativo para reducir potencialmente la dependencia a la insulina que involucra el transplante de isletas aisladas de Langerhans. Aunque varios sitios de transplantes han sido evaluados en modelos experimentales, solamente el transplante intraportal. ha sido establecido hasta ahora para el transplante de isletas en la instalación clínica. El transplante de isletas es fácil de llevar a cabo y seguro, aunque por muchos años el resultado clínico fue marcadamente inferior cuando se compara con el transplante de páncreas completo, que solamente el 8% de los pacientes eran dependientes de la insulina un año después del transplante., en contraposición a aproximadamente del 70% con el transplante completo de riñon - páncreas. Estos resultados deficientes sirven para demostrar que solamente una pequeña proporción de la masa de isleta procede a la injertación efectivamente enseguida de esta clase de transplante. Un descubrimiento reciente de Shapiro et al (N. Engl. J. Med., 343, 230 (2000)) demostró que la independencia a la insulina podría ser obtenida bastante más fácilmente mediante tratamiento del paciente con transplantes repetidos de isletas de más de un donador. Por medio de investigación a las razones posibles por los resultados deficientes observados en el caso de transplantes de un solo donador, se ideó un sistema de perfusión de isletas in vitro, que imita la situación in vivo inmediatamente después del transplante de células de isleta a la vena portal (Bennet et al, Diabetes, 48, 1907 (1999) ) . Este estudio demostró que la exposición de las isletas humanas a sangre ABO compatible in vitro induce una serie de largo alcance de eventos inflamatorios, es decir activación de la coagulación y sistemas de complemento, enlace rápido y activación de plaquetas y enlace de leucocitos, conjuntamente dan como resultado la disrupción de la integridad de la isleta. Se demostró que el transplante intraportal de isletas alogénicas provoca una cadena similar de eventos in vivo en el puerco. Los efectos perjudiciales de esta reacción inflamatoria instantánea moderada por sangre (IBMIR) podría proporcionar una explicación de la proporción de éxito relativamente baja del procedimiento de transplante de isletas y/o la necesidad de isletas de varios donadores con el fin de obtener normoglucemia . Bennet et al también reportaron una combinación de heparina y CR1 recombinante soluble (inhibidor de complemento) , pero interesantemente no las sustancias individuales solas, impedían la mayor parte de la disrupción de la morfología de isleta normal e ~ infiltración de las isletas. A pesar de este efecto preventivo, todavía se podría observar una capa delgada de plaquetas y febrina sobre la superficie de la isleta. Véase también la solicitud de patente internacional WO 00/45837.

De aquí, todavía hay necesidad clínica por medio de efectivos para incrementar la independencia a la insulina post-operativa enseguida del entrenamiento de pacientes diabéticos tipo I, por ejemplo mediante transplante de isletas de Langerhans y particularmente procedimientos que involucran transplantes individuales de isletas de un solo donador . La solicitud de patente internacional WO 94/29336 revela un grupo de compuestos que son útiles como inhibidores de proteasas de serinas, tales como trombina y/o quininogenasas . Así, compuestos inhibidores de trombina son indicados como anticoagulantes y los compuestos inhibidores de quininogenasa como agentes anti- inflamatorio. El uso de los compuestos en el tratamiento de diabetes y/o el transplante de células tales como isleta Langerhans no es ni revelado, ni sugerido. Uno de los compuestos inhibidores de trombina que es revelado específicamente en WO 94/29336 es HOOC-CH2 (R) Cgl-Aze-Pab-H (en donde Cgl representa ciclohexil glicinilo, Aze representa (S) -azet idin-2 -carboxilo y Pab representa para-amidino benzilamino) , que también es conocido como melagatrana (véase ejemplo 1 de WO 94/29336) . La solicitud de patente internacional WO 97/23499 revela profármacos de, inter alia, melagatrana. Otra vez, el uso de los compuestos en el tratamiento de diabetes y/o el transplante de células de isletas Langerhans no es ni revelado ni sugerido. La solicitud de patente internacional WO 00/41716 revela el uso de melagatrana y derivados de la misma en el tratamiento de la inflamación. El uso de melagatrana en el tratamiento de IBMIR, diabetes y/o el transplante de células, tales como isletas de Langerhans, no es ni mencionado ni sugerido . Se ha encontrado ahora que la melagatrana inhibe casi completamente de IBMIR, en lo que se incluyen la activación de complemento y la activación y enlace de plaquetas a isletas de Langerhans y que por consiguiente la melagatrana y derivados de la misma son potencialmente útiles en el tratamiento de diabetes. De acuerdo con un primer aspecto de la invención-, se proporciona el uso de melagatrana o un derivado aceptable farmaceticamente de la misma, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de diabetes mellitus tipo I . Se comprenderá por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica que el término "diabetes mellitus tipo I" incluye diabetes dependiente de la insulina (IDD) . La melagatrana y derivados de la misma pueden encontrar utilidad particular en los tratamiento de diabetes tipo I en los cuales esta involucrado el transplante. Tal transplante puede involucrar transplante de riñon, transplante de páncreas o un transplante combinado de riñon -páncreas, pero preferiblemente involucra el transplante de células, tales como células productoras de insulina o precursores de las mismas. Las células productoras de insulina preferidas incluyen isletas de Langerhans . Los percusores de células que producen insulina incluyen progenitores de tales células, tales como células del tallo, pueden ser indicadas al páncreas utilizando técnicas conocidas para aquellos experimentados en la técnica y después de esto desarrollarse a células productoras de insulina . Así, de acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de melagatrana o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma, para la manufactura de un medicamento para uso de un método para transplante de células, en las que se incluyen células productoras de insulina o precursoras, de las mismas, tales como isletas de Langerhans o células del tallo. Las isletas preferidas del Langerhans incluyen células beta (estos es, células productoras de insulina, pancreáticas) pero el uso de acuerdo - con la invención no está restringido al transplante de tales células. El transplante puede involucrar procedimientos aislados o múltiples y se pueden obtener células para uso el tal (es) procedimiento (s) de uno o más donadores. Los procedimientos preferidos pueden involucrar un transplante individual de un solo donador. Se ha encontrado que la melagatrana y derivados de la misma puede mejorar la injertación de isletas de Langerhans en el transplante enseguida del riñon (tal como transplante intraportal) , cuando se compara con la injertación enseguida del transplante en ausencia de melagatrana/derivados . Se proporciona así el uso de melagatrana o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma, del medicamento para uso de un método de: (a) injertación de isletas de Langerhans, por ejemplo en el hígado y (b) mejorar la independencia a la insulina (por ejemplo, obtener la normoglucemia) en pacientes que tienen diabetes tipo I . Se proporciona así el uso de melagatrana o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de IBMIR. El termino "IBMIR" (reacción inflamatoria moderada a la sangre, instantánea) . cuando se usa en este contexto incluye la serie de eventos inflamatorios que son conocidos que ocurren enseguida del transplante de isletas de Langerhans a la vena portal, es decir activación de los sistemas de coagulación y complemento, también como enlace rápido y activación de plaquetas y enlace de leucocitos, tales eventos pueden conducir a una alteración de la integridad de la isleta. Para evitar dudas, el término "tratamiento" incluye el tratamiento tanto terapéutico como profiláctico. El tratamiento profiláctico se incluye la prevención (inhibición) del avance de por ejemplo IBMIR. "Derivados aceptables farmacéuticamente" de melagatrana incluyen sales (por ejemplo, sales de adición de ácido orgánicas o inorgánicas no tóxicas aceptables farmacéuticamente) y solvatos . Se apreciará que el término incluye además derivados que tienen o proporcionan la misma función biológica y/o actividad como la melagatrana. Así, para los propósitos de esta invención, al término también incluye profármacos de melagatrana. "Profármacos" de melagatrana, incluyen cualquier composición de materia, que enseguida de la administración oral o parenteral es metabolizada en vivo para formar melagatrana en una cantidad detectable experimentalmente y dentro de un tiempo predeterminado (por ejemplo, dentro de un intervalo de especificación de entre seis y doce horas (esto es a cuatro veces al día )) . Para evitar dudas, al termino administración "parenteral" incluye todas las formas para administración además de la administración oral. Los profármacos de melagatrana que pueden ser mencionados incluyen aquellos revelados en la solicitud de patente internacional WO 97/23499. Los profármacos preferidos son aquellos de fórmula R102C-CH2- (R) Cgl -Aze-Pab-OH (véase la lista de abreviaturas anterior o en WO 97/23499) , en donde R1 representa alquilo de uno a diez átomos de carbono o bencilo, tal como alquilo lineal o ramificado uno a seis átomos de carbono (por ejemplo, alquilo de uno a cuatro átomos de carbono, especialmente metilo, n-propilo, i-propilo t-butilo y particularmente etilo) y el grupo OH representa uno de los hidrógenos de amidino en Pab. De acuerdo con la invención la melagatrana y derivados de la misma puede ser administrada oral, intraportal, intravenosa, subcutánea, bucal, rectal, dérmica, nasal, traqueal, bronqueal, tópicamente, mediante cualquier otra ruta parenteral o vía inhalación. La melagatrana y derivados de la misma pueden ser administrados en forma de una preparación farmacéutica que comprende melagatrana en una forma de dosificación aceptable farmacéuticamente. Dependiendo del paciente a ser tratado, también como la ruta de administración, tales composiciones pueden ser administradas a dosis variables. Los modos preferidos de administración son sistémicos. Para la melagatrana y derivados de la misma, los modos de administración preferidos son parenteral (más preferiblemente intravenosa y especialmente intraportal) u oral. Se puede encontrar que tales modos de administración proporciona la maximización de la constelación de melagatrana derivado en el hígado después de la administración. En el tratamiento de diabetes tipo I, la melagatrana y derivados de la misma son co-administrados preferiblemente junto con isletas de Langerhans en un proceso de transplante de isletas. De acuerdo todavía con un aspecto adicional de la invención se proporciona un kit de partes que comprenden componentes: (a) un primer componente que comprende la melagatrana o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma y (b) un segundo componente que comprende células, por ejemplo células que producen insulina o precusores de las mismas tales como isletas de Langerhans o células del tallo, tales componentes (a) (b) , son cada uno proporcionados en una forma que son apropiadas para administración en conjunción entre si y también apropiados para el uso separado, secuencial o simultaneo en el tratamiento de diabetes tipo I, y/o un método de transplante de células. - Los componentes (a) (b) pueden así ser provistos en forma de (como sea apropiado) melagatrana/derivado o células junto con un adyuvante, diluyente o portador aceptable farmacéuticamente.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método de fabricación del kit de partes como se define anteriormente, tal método comprende traer un componente (a) como se define anteriormente, en la asociación con un componente (b) , como se define anteriormente, volviendo así a los dos componentes, apropiados para la administración en conjunción entre si. Se proporciona así, un kit de partes que comprende: (I) uno de los componentes (a) (b) , como se define en la presente; junto con (II) instrucciones para usar aquel componente en conjunción con el otro de los dos componentes. Con respecto a los kits de partes como se describen en la presente, por "administración en conjunción con" se incluyen los componentes respectivos (a) y (b) son administrados secuencial, separada y/o simultáneamente en el curso del tratamiento. Además, al término "en conjunción con" incluye que uno u otro de los dos componentes (a) (b) pueden ser administrados antes, después y/o al mismo tiempo, la administración con el otro componente. Cuando se usan en este contexto, los términos "administrados simultáneamente" y "administrados al mismo tiempo" , incluyen que los dos componentes son administrados en 48 horas (por ejemplo, 24 horas) entre si. Cuando se administran componentes separados, la secuencia de los cuales puede ser administrado (esto es, si en aquel punto, toma lugar la administración secuencial, separada y/o simultanea) se puede determinar mediante el médico o persona experimentada. En el tratamiento terapéutico de mamíferos y especialmente humanos, la melagatrana/derivados será administrada como formulación de farmacéuticas en mezcla con adyuvantes diluyentes, o portadores aceptables farmacéuticamente que pueden ser dados con respecto a la ruta de administración propuesta y práctica farmacéutica estándar . Formulaciones apropiadas para el uso de administración melagatrana y derivados (en los que se incluyen profármacos) de la misma son descritas en la literatura, por ejemplo como se describe en Inter. Alia, solicitudes de patente internacional WO 94/29336, WO 96/14084 WO 96/16671, WO 97/23499, WO 97/39770, WO 97/45138, WO 98/16252, WO 99/27912, WO 99/27913, WO 00/12043 y WO 00/13671, las revelaciones de tales documentos son incorporadas en la presente por referencia. De otra manera la preparación de formulaciones apropiadas- se puede obtener de manera efectiva por la persona experimentada utilizando técnicas de rutina. De acuerdo con un aspecto adicional de la invención se proporciona una formulación farmacéutica para uso en el tratamiento de diabetes tipo I que comprende una cantidad efectiva de melagatrana o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma, en mezcla con un adyuvante, diluyente o portador aceptable farmacéuticamente. Las cantidades de melagatrana/derivado en la formulación efectiva dependerá de la severidad condición y del paciente a ser tratado, también como el (los) compuesto (s) que es /son empleados, pero pueden ser determinados de manera no inventiva por la persona experimentada. La dosis apropiada de melagatrana y sus derivados en el tratamiento de mamíferos, especialmente humanos, pueden ser determinadas sistemáticamente por el médico u otra persona experimentada e incluyen las dosis respectivas discutidas en los documentos de la técnica previa que son mencionados anteriormente la presente, las revelaciones relevantes de tales documentos son incorporadas en la presente por referencia. En el caso de melagatrana, las dosis apropiadas del compuesto activo, por fármacos y derivados de los mismos, en el tratamiento terapéuticos y/o profilácticos de paciente mamífero, especialmente humanos, incluyen aquellas que dan una concentración promedio en el plasma de hasta 5 µ?t??1ß3/1, por ejemplo en el intervalo de 0.001 a 5 µ????ß/?, en el curso de tratamiento de la condición relevante. Así, las dosis apropiadas pueden estar en el intervalo de 0.1 mg una vez al día a 25 mg tres veces al día y hasta 100 mg por infusión parenteralmente durante un período de 24 horas, para la melagatrana y en el intervalo de 0.1 mg una vez al día a 100 mg tres veces al día, para profármacos de melagatrana en los que se incluyen aquellos mencionados específicamente anteriormente en la presente. En cualquier caso, el médico o la persona experimentada será apto de determinar la dosis real que será más apropiada para un paciente individual, que es probable que varíe con la edad, peso, sexo, y respuesta del paciente particular a ser tratado. Las dosificaciones mencionadas anteriormente son ejemplares del caso promedio; pueden haber por ejemplo por supuesto instancias individuales en donde intervalos de dosificación más alta o más bajas son merecidas y tales están dentro del alcance de invención. El transplante de isletas de Langerhans se puede obtener por medio de técnicas sistemáticas, por ejemplo al suspenderlas en una solución reguladoras del pH apropiada, seguida por inyección y/o infusión de tal suspensión a la vena por tal vía una jeringa transhepatica o un catéter o como se describe por Boker et al en World J. Surg., 25, 481 (2001) (la revelación relevante de tal documento es incorporada en la presente por referencia) o como se describe posteriormente en la presente. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método de tratamiento de diabetes tipo I, que comprende administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de melagatrana o un derivado farmacéuticamente de la misma en un paciente en la necesidad de tal tratamiento. Los usos y métodos descritos en la presente pueden tener la ventaja de que, en el tratamiento de diabetes tipo I y en particular en el alivio de la dependencia a la insulina en pacientes con diabetes tipo I y por medio de transplantes de isletas de Langerhans, la melagatrana y derivados de la misma puede no poseer las desventajas de las terapias conocidas . La invención es ilustrada pero de ninguna manera limitada por el siguiente ejemplo en el cual: La figura 1 ilustra los cambios en varios marcadores biológicos en isletas humanas incubadas en el modelo de bucle de tubo hielo con sangre ABO-compatible que contiene melagatrana a concentraciones que fluctúan de 0 a 10 µ?. El panel A ilustra cambios en el conteo de partículas de plaquetas (cuadrados blancos) y la liberación de beta-TG (cuadros negros) el panel B ilustra cambios en el fragmento de protrombina (1 + 2) (cuadrados blancos), TAT (cuadrados negros) y FXIa-AT (triángulos negros) ; el panel C ilustra cambios en los conteos de lifoncitos (cuadrados negros) , monocitos (cuadrados blancos) y partículas PM (triángulos negros) . Los valores representan los datos menos el control medio (sin isletas o melagatrana) después de 60 minutos y son expresados como porcentaje de los valores para las isletas humanas que contienen control sin tratar pero no melagatrana. La figura 2 ilustra cambios en la generación de fragmentos C3a soluble (cuadrados blancos) y fragmentos c3 enlazados (cuadrados negros) en un modelo de suero sin isletas presentes y cambio C3a soluble (diamantes negros) en el modelo de bucle de tubería contiene isletas en sangre ABO-compatible con melagatrana a concentraciones de 0 a 10 µ?.

EJEMPLO Efecto de melagatrana sobre IBMIR Materiales y métodos Aislamiento de isletas Se obtuvieron pancreasas a partir de donadores cadáveres después del consentimiento ya sea del registro de donador de órganos o de parientes. Los órganos fueron obtenidos de tres donadores hembra y dos donadores macho normoglucemicos (de edad de 59 - 85 años, tres con un grupo de sangre cero y dos con grupo de sangre A) . Las isletas fueron aisladas en la División for Clinical Immunology, en la Universidad de Uppsala, utilizando una modificación de los métodos de digestión- filtración semiautomatizados descritos previamente (Brandhorst et al, Cell Transplant . , 7, 489 (1988) y Ricordi et al, Diabetes, 37, 413 (1988)) . Este procedimiento de aislamiento fue seguido por purificación adicional en un gradiente de densidad continua en una centrifuga refrigerada COBE 2991 (COBE Blood Component Technology, Lakewood, CO, USA) . Las isletas fueron colocadas en matraces de cultivo sin tratar y mantenidas en cultivo de suspensión a 37°c (5% C02) durante 1 a 5 días.- El medio de cultivo (CMRL 1066; ICN Biomedicals, Costa, Mesa, CA) fue cambiado un día si y otro no. El volumen y la pureza de las isletas fueron determinados mediante dimensionamiento microscópico sobre una rejilla después de teñido con defeniltiocarbazona . Las purezas de las preparaciones de isleta utilizadas en este estudio fluctúa de 40% y 95% (70 ± 6.3%) (cantidad de endocrino en comparación con tejido exócrino/conducto en la preparación; media + SD) . La viabilidad fue determinada en términos de secreción de insulina en respuesta a un desafío de glucosa en un sistema de perfusión dinámico (en 1.67 milimoles/litro de glucosa, luego 16.7 milimoles/litro y finalmente otra vez a 1.7 milimoles/litro) .

Tratamiento con heparina Todos lo materiales que se pusieron en contacto con sangre entera fueron proporcionados con una superficie de heparina de Corline (Corline, Uppsala, Suecia) de acuerdo con la recomendación del fabricante (véase J. Clin. Immunol . , 16, 222 (1996) ) . La concentración de heparina en la superficie puede ser 0.5 µg/cm2, correspondiente aproximadamente 0.1 U/cm2, con una capacidad de enlace de antitrombina de 2-4 pmol/cm2.

Preparación de la sangre Sangre humana fresca, obtenida de voluntarios saludables que no habían recibido ninguna medicación por al menos 14 días, fue recolectada en jeringas de 60 mi con heparina en la superficie (calibre 18, Microbalance ; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . Las cánulas de las jeringas fueron conectadas a la tubería de silicio con heparina en la superficie. Durante la toma de muestras, las jeringas se hicieron girar continuamente.

Bucles de tubo como modelo Se utilizo una modificación del modelo descrito previamente (véase Bennet et al, Diabetes, 48, 1907 (1999), Gong et al, J. Clin. Immunol., 16, 222" (1996) y Larsson et al, Immunopharmacology, 38, 119 (1997)) . Este dispositivo consistía de bucles fabricados de PVC (diámetro 6.3 mm; longitud 390 mm) cuya superficie interna fue provista con heparina inmovilizada. El tubo fue mantenido conjuntamente con un conector con heparina diseñado especialmente. Un bucle circular fue formado cuando los extremos del conector fueron empujados fuertemente al lumen de los extremos del tubo. Un aparato agitador, colocado en una incubadora a 37%°C, fue usado para generar el flujo de sangre al interior de los bucles. Los bucles fueron agitados a un ajuste que impedía que la sangre se ponga en contacto con los conectores . Hasta doce dispositivos podrían ser agitados al mismo tiempo. Se efectuaron diez experimentos de isletas de 60 minutos, con isletas aisladas de cinco donadores diferentes. elagatrana (AstraZeneca R&D Mólndal, Suecia) , disuelta en solución reguladora del pH de citrato 5 mM, que contiene NaCl 0.15 , pH 5.5, fue probada a 0, 0.4 µ?, 1 µ?, 4 µ? y 10 µ?. Para cada experimento, dos bucles de sangre humana fresca sin isletas, una que contiene CMRL 1066 (GibcoRBL, USA) y una que contiene melagatrana 10 µ?, fueron incluidos como controles. Sangre humana ABO-compatible fresca del mismo donador (5 mi) fue agregada a cada bucle. Los bucles fueron colocados en el dispositivo oscilante para una preincubación de 10 minutos con melagatrana o solución reguladora del pH de citrato. Después de esto, los bucles fueron abiertos y se agregaron 150 µ? de CMRL 1066 con o sin 4 µ? de isletas (aproximadamente 4000 IEQ) a los bucles, seguido por otra incubación de 60 minutos en el dispositivo oscilante a 37 °c. Los niveles de glucosa de sangre fueron medidos con un glucómetro (Glucometer Elite; Bayer Diagnostics, Leverkusen, Alemania) antes de la perfusión. Después de cada perfusión el contenido del bucle fue filtrado a través de filtros de 70 µp? de diámetro (Filcons, Cutype; DAKO, Dinamarca). Tanto coágulos de sangre macroscópicos como el tejido recuperado sobre los filtros fueron congelados en nitrógeno líquido para el teñido inmunohistoquímico . Para la comparación inmunohistoquímica, también se congelaron isletas sin perfusión y se tiñeron mediante el mismo procedimiento. La sangre filtrada restante fue recolectada en EDTA 4.1 mM (concentración final) y se utilizó para análisis hematológico (plaquetas, linfoncitos, monocitos y granulocitos) y análisis de activación de coagulación (fragmentos de protombina 1 + 2, trombina - antitrombina [TAT] y complejos de factor Xla-antitrombina [Fxia-at] , activación de complemento (C3a y sC5b-9) , activación de plaqueta (beta-tromboglobulina - [beta-TG] e insulina. Las muestras tomadas a 0 minutos fueron también incluidas. En estas muestras, la sangre no fue agregada al bucle de tubo sino que fue en lugar de esto transferida inmediatamente a los tubos que contienen EDTA. Las muestras de sangre fueron centrifugadas a 4°C a 3290 x g durante 20 minutos y el plasma fue recolectado y guardado a -70°C antes del análisis.

Activación de complemento en cavidades de placas de microtítulo El efecto directo de la melagatrana sobre el sistema de complemento fue estudiado utilizando un método en el cual el . suero fue incubado en las cavidades de placas de microtítulo (Nilsson et al, Mol Immunol . , 30, 211 (1993)) . Se agrega suero (100 µ?) a cada cavidad de una placa de microtítulo de 96 cavidades junto con melagatrana a una concentración final de 0, 0.4, 1 o 10 µ?. Después de una incubación de 30 minutos a 37 °C, el suero fue transferido a los tubos que contienen EDTA (concentración final, 10 mM) . Estas muestras fueron almacenadas a -70°C antes del análisis del fragmento de complemento C3a (veáse posteriormente la presente) . Con el fin de detectar fragmentos de C3 enlazados, las cavidades de las placas de microtítulo fueron lavadas con PBS que contiene TWEEN al 0.05% (v/v) e incubadas con 100 µ? de anti-C3c (HRP) -conjugado de peroxidasa de rábano (DAKO AS, Glostrup, Dinamarca) durante 60 minutos a 37°C. El enlace del anticuerpo fue detectado mediante la adición de diclorhidrato de 1,2 fenilendiamina (Fluka, Suiza) y el teñido fue verificado a 492 nm.

Análisis de sangre y plasma Los conteos de plaquetas y conteos de leucocitos diferenciales fueron analizados en un analizador Coulter ACT-diff (Beckman Coulter, FL, USA) utilizando sangre tratada con EDTA.

Inmunoanálisis de enzima (EIA) A. fragmento de protombrina 1 + 2 y trombina-antitrombina (TAT) Niveles en el plasma de fragmento de protombrina 1 + 2 TAT fueron cuantificados utilizando kits EIA disponibles comeréialmente (Enzygnost Prothrombin, fragments, 1 + 2; TAT, Behringswerke, arburg, Alemania) . Los valores son dados como nmol/1 y µ?/?, respectivamente.

B. Factor Xla- antitrombina (FXIa-AT) Complejos entre FXIa y AT fueron medidos en el plasma de acuerdo con el método de Sánchez et al, Thromb. Res., 89, 41 (1998) . Los valores son expresados como µt???/?.

C. beta- tromboglobulina (beta-TG) . Beta-TG fue analizada en EDTA-plasma utilizando (Diagnostica Otago, Asniéres-sur-Seine, Francia) . Los valores son expresados como IU/ml .

D. C3a EDTA-plasma fue analizado como se describe previamente (Nilsson Ekdahl et al, Scand. J. Immunol . , 35, 85 (1992)) . Anticuerpo monoclonal 4SD17.3 fue usado como anticuerpo de captura. C3a enlazado fue detectado con anti-C3a policlonal bioestañado, seguido por estreptavidina HRP-conjugada (Amersham, Buckinghamshire , UK) . Suero activado con zymosan, calibrado contra una solución de C3a purificado, sirvió como estándar y los valores son dados como ng/ml.

E. sC5-9 Se analiza plasma utilizando una modificación del EIA descrito por Mohines et al (véase Scand. J. Iramunol . , 35, (1992) y Artif. Organs, 19, 909 (1995)). Se agrega EDTA-plasma a placas de microtítulo recubiertas con mAb anti-neo C9. Se detectó sC5b-9 mediante anticuerpos policlonales anti -C5 (DAKO) , seguido por inmunoglobulina anticonejo HRP-conjugada (DAKO) . Suero zymosan-activado, que se define que contiene 40,000 unidades arbitrarias (AU/ml) sirvió como el estándar. Los valores son dados como AU/ml.

F. Insulina Concentraciones de insulina en el plasma fueron analizadas antes y después de la perfusión de isletas con un kit EIA comercial (DAKO) . Los valores son dados como pmol/1.

Teñido inmunohistoquímico Isletas y coágulos mascroscópicos recuperados sobre filtros después perfusión con sangre y varias concentraciones de la melagatrana fueron recolectados en un medio de imbibición (Tissue-Tek; Miles, Eckhart, IN, USA) y congelados en nitrógeno líquido. Las isletas fueron seccionadas y teñidas consecuentemente con CD41a anti -humano de ratón HRP-conjugado (R&D Systems, Abingdon, U ) y anti-CDllb (Clon 2LPM 19c, DAKO) .

Análisis estadísticos Debido a la variación individual en los conteos de células de sangre y en los parámetros del plasma, los cambios fueron ya sea calculados como un porcentaje de los valores obtenidos en el bucle de control del medio (para células de sangre) o como una proporción de los valores obtenidos en el bucle experimental y en el bucle de isleta sin melagatrana. Todos los resultados son expresados como media ± SEM. Los valores de la media fueron comparados utilizando A OVA de Friedman (Anayse-It, versión 1.44, Software Ltd, UK) . La significancia fue determinada a a = 0.05. Los datos presentados en las figuras IB, C y 2 representan los valores netos después de la sustracción de los datos para las muestras a 0 minutos.

Resultados La función de la isleta no es afectada por melagatrana Para confirmar que la melagatrana no tuvo ningún efecto adverso sobre la función de isleta, se probo este inhibidor a la concentración más alta utilizada en los experimentos de bucle (10 µ ) en un sistema de perfusión de isleta. La perfusión de isletas con melagatrana 10 µ? no induce la liberación de insulina y la estimulación de glucosa subsecuente (16.7 milimoles/1) también fue normal. Perfusión de isletas humanas con sangre ABO-compatible humana fresca en el modelo de bucle de tubo Con referencia a la tabla 1. Las concentraciones de glucosa en la sangre antes de la percusión de isleta fluctuaron de 4.5-7.4 mmol/1. Después de una incubación de 60 minutos de sangre humana no anti-coagulada fresca sin isletas en los bucles de tubos de control, se noto una ligera caída en los conteos de células de sangre cuando se comparan con las muestras a 0 minutos. Además, también se vieron incrementos (3 a casi 50 veces) en la coagulación (TAT, fragmento de protrombina 1 + 2 y FXIa-AT) , plaquetas (ß-TG) y complemento (C3a y sC5b-9) . Sin embargo, todas estas alteraciones fueron en valores absolutos pequeños y se consideran cambios de fondos normales resultantes de interacciones de la sangre con la superficie del tubo y la interfase fluido-aire. En los bucles de tubos sin melagatrana, casi todas las plaquetas fueron consumidas después de 60 minutos, concurrentemente con una secreción pronunciada de beta-TG. Los granulocitos y monocitos fueron también consumidos después de 60 minutos, mientras que los linfocitos estuvieron esencialmente sin afectar. Además, en ausencia de melagatrana, se vio la formación macroscópica de coágulos y estaba acompañado por una elevación significativa en TAT, fragmento de protombina 1 + 2 y niveles de complejo FXAIa-AT. También se observaron incrementos marcados con el producto de activación de complemento C3ca y en los niveles de insulina en el plasma, también se incrementó sC5b-9 pero una extensión menor. Tabla 1 Conteos de células en la sangre, parámetros de coagulación y complemento antes y después de 60 minutos de perfusión de isletas humanas con sangre nueva ABO-compatible . 0 rnin 60 min Isletas Sin isletas4 Sin isletas* Sin melagatrana 10 µ? melagatrana n 10 10 10 10 Plaquetas (xlO'/L) 240+11 160+7.6 2.411.1* 17018.2* Linfocitos (xlO'/L) 2.2±0.1 2.010.1 1.710.1 2.0+0.1* Monocitos (XlO'/L) 0.4±0.0 0.5+0.1 0.110.0† 0.610.1* Granulocitos (xlO'/L) 4.0+0.3 3.810.3 1.0+0.1* 3.710.3* TAT O-g/mL) 9.4±2.2 470+87 16000+2900* 8901160* Protrombina Fl+2 1.510.2 2515.1 iOÚOilSO1 110128* (iunol/L) FXIa-AT (µ????/L) 0.02±0.0 0.4+0.1 1412.6 0.910.6* ß-TG (IU/mL) 520±130 13001180 40001450 13001200* C3a (ng/mL) 120±15 530+62 9501140* 510150* sC5b-9 (AU/mL) 24+3.4 130+16 180131 140117.0 lnsulina(mU L) 12±4.3 1014.0 460+140' 1500+350* * Control que contiene sangre y el medio pero no isletas. † Diferencia significativa cuando se compara con el bucle de control después de 60 minutos de perfusión. F Diferencias significativas que se compara con los bucles de isletas sin melagatrana.

La melagatrana inhibe IBMIR de una manera dependiente de la dosis La melagatrana disminuyo el consumo de células y la activación del sistema de cascada de una manera dependiente de la dosis (Tabla 1, figuras 1 A-C) . Un efecto sobre la mayoría de los parámetros fue observado ya a concentraciones tan bajas como 0.4 µ?. Los conteos de células fueron plenamente restaurados a > 4 µ? (figuras 1A, 1C) . La liberación de ß-TG fue también normalizada a la misma dosificación (figura 1A) . Los parámetros de coagulación TAT y fISA-AT disminuyeron a casi al mismo nivel como el medio de control a 4 µ? de melagatrana, pero la inhibición de la formación del fragmento de protrombina 1 + 2 requirió dosis más altas de melagatrana (figura IB) . En paralelo con los complejos FISA-AT y TAT, el producto de activación de complemento C3c fue también inhibido por melagatrana (figura 2) . Con el fin de investigar si la melagatrana tenía algún efecto directo sobre el sistema de complemento, sus efectos fueron probados en suero humano en el cual el complemento fue activado sobre la superficie de poliestireno de las cavidades de placas de microtítulo (figura 2). La melagatrana no tuvo ningún efecto sobre el enlace de los fragmentos C3 a la superficie de poliestireno o sobre la generación C3a indicando que no afecta directamente las proteasas de serina del complemento.

Teñido inmunohistoquímico de isletas humanas después de perfusión en el modelo de bucle de tubo Después de 60 minutos de perfusión, se encontró que las isletas se imbibían en los coágulos. El teñido inmunohistoquímico con anticuerpo monoclonal anti-CD41a mostró una cápsula de fibrina y plaquetas que rodean las isletas. Además, hubo una acumulación CD llb+ PMN y monocitos en los trombos, notándose que muchos de los cuales penetran a las isletas. En contraste, las isletas que habían sido incubadas con sangre humana fresca en presencia melagatrana 10 µ? no mostraban signos de formación de coágulos. Casi no hubo plaquetas de CD41+ rodeando la superficie de isleta y se encontró solamente que pocas células de CDllb+ habían penetrado a las isletas. No se observo teñido de CD41* o CDllb+ en las isletas de control que no habían sido expuestas a la sangre. Estos resultados demuestran que la melagatrana abroga IBMR in vitro y es por consiguiente potencialmente de uso en el transplante de isletas de Langerhans y así en el tratamiento de diabetes.

Claims (1)

1. REI VIDICACIONES 1. El uso de melagatrana o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma, para la manufactura de un medicamento de diabetes mellitus tipo I. 2. El uso de melagatrana o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma, para la manufactura de un medicamento para uso de un método de transplante de células. 3. El uso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque las células son células productoras de insulina o percusores de las mismas. . El uso de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizado porque las células son isletas de Langerhans . 5. El uso de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque los precursores de las células productoras de insulina son células del tallo. 6. El uso de melagatrana o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma, para la manufactura de un medicamento para uso de un método de injertación de isletas de Langerhans . 7. El uso de conformidad con -la reivindicación 6, caracterizado porque las isletas se injertan en el hígado. 8. El uso de melagatrana o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma, para la manufactura de un medicamento para uso de un método para mejorar la independencia a la insulina en pacientes que tienen diabetes mellitus tipo I. 9. El uso de melagatrana o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de reacción inflamatoria instantánea moderada por la sangre. 10. El uso de conformidad de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracter zado porque el derivado de melagatrana es un profármaco de melagatrana. 11. El uso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el profármaco es de fórmula: R^C-CHz- (R) Cgl -Aze- Pab-OH en donde R1 representa alquilo lineal o ramificado de 1 a 6 átomos de carbono y el grupo OH reemplaza uno de los hidrógenos de amidino en Pab. 12. El uso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque R1 representa metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, t-butilo. 13. El uso de conformidad con la reivindicación 12 caracterizado, porque R1 representa etilo. 14. Un método de tratamiento de diabetes mellitus tipo I, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de melagatrana o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma a un paciente en necesidad de tal tratamiento. 15. Un método de transplante de células, caracterizado porque comprende a la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de melagatrana o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma a un paciente que esta a punto de ser, que es o que ha sido sometido a tal transplante. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado con las células son células productoras de insulina o precusores de las mismas. 17. El método de conformidad con la reivindicación 15 o la reivindicación 16, caracterizado porque las células son isletas de Langerhans. 18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque los precursores de células productoras de insulina son células del tallo. 19. Un método para injertar isletas de Langerhans, el método está caracterizado, porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de melagatrana o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma a un paciente que esta a punto de ser, que es o que ha sido sometido a transplante de tales isletas. - 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque las isletas se injertan en el hígado . 21. Un método para mejorar la independencia a la insulina en pacientes que tienen diabetes mellitus tipo I, el método esta caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de melagatrana o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma a un paciente en necesidad de tal mejora. 22. Un método de tratamiento de la reacción inflamatoria instantánea moderada por la sangre, el método está caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de melagatrana o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma a un paciente en necesidad de tal tratamiento. 23. El método de conformidad cualquiera de las reivindicaciones 14 a 22, caracterizado porque el derivado de melagatrana es un profármaco de melagatrana. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el profármaco es de fórmula: R^ sC-CH;,- (R) Cgl-Aze-Pab-OH en donde R1 representa alquilo lineal o ramificado de 1 a 6 átomos de carbono y el grupo OH reemplaza uno de los hidrógenos de amidino en Pab. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque R1 representa metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, t-butilo. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado, porque R1 representa etilo. 27. Una formulación farmacéutica para uso en el tratamiento de diabetes mellitas tipo I, la formulación está caracterizada porque comprende una cantidad efectiva de melagatrana o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma. 28. El uso de melagatrana o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma, para el tratamiento de diabetes mellitus tipo I, caracterizado porque comprende de la administración de melagatrana o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma a un paciente. 29. Un kit de partes caracterizado comprende como componentes : (a) un primer componente que comprende melagatrana o un derivado aceptable farmacéuticamente de la misma y (b) un segundo componente que comprende células, los componentes (a) (b) son cada uno provistos en una forma que es apropiada para administración en conjunción entre sí. 30. El kit de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque las células son células productoras de insulina o precusores de las mismas. 31. El kit de conformidad con la reivindicación 29 o 30, caracterizado porque las células son isletas de Langerhans . 32. El kit de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque los precusores de células productoras de insulina son células del tallo. 33. Un kit de partes, caracterizado porque comprende : . (I) uno de los componentes (a) y (b) como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32; junto con (II) instrucciones para usar aquel componente en conjunción con el otro de los dos componentes. 34. Una formulación, uso o kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33 (como sea apropiado) , caracterizado porque el derivado de melagatrana es un profármaco de melagatrana. 35. Una formulación, uso o kit de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el profármaco es de fórmula: F^OaC-CHz- (R) Cgl-Aze-Pab-OH en donde R1 representa alquilo lineal o ramificado de 1 a 6 átomos de carbono y el grupo OH reemplaza uno de los hidrógenos de amidino en Pab. 36. La formulación, uso o kit de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque R1 representa metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, t-butilo. 37. La formulación, uso o kit de conformidad con la reivindicación 36, porque R1 representa etilo. 38. Un método de fabricación del kit de partes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 o 34 a 37, caracterizado porque comprende traer un componente (a) , como se define en cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 o 34 a 37, a una asociación con un componente (b) , como se define en cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 o 34 a 37, volviendo así a los dos componentes apropiados para administración en conjunción entre sí.