JP2024506001A - 幹細胞及び膵島細胞を含む細胞クラスター、当該細胞クラスターを作製する方法、並びに当該細胞クラスターを用いた糖尿病の治療 - Google Patents

Abstract

膵島ドナーのプール及び安全性を実質的に増加させ、拒絶反応抑制薬の必要性も取り除く、耐糖能障害を治療する組成物及び方法が提供される。膵島細胞を増殖させることと、増殖させた膵島細胞及び間葉系／脂肪幹細胞を含む細胞クラスターを形成することとを含む、細胞クラスターの作製方法が記載される。膵島細胞の増殖は、５回以上の集団倍加を含み得る。膵島細胞は、８０未満の北米膵島ドナースコア（ＮＡＩＤＳ）を有する成人の非糖尿病ドナーから得られた初代膵島細胞であり得る。これらの方法によって作り出される細胞クラスターが記載される。更に、多数の間葉系幹細胞と、増殖させた膵島細胞とから構成される膵島サイズの細胞クラスターの腹腔内投与による治療方法は、低血糖を起こすことなく、ストレプトゾトシン誘発性及び自発性の両方の１型糖尿病、２型糖尿病、並びに他のタイプのインスリン依存性糖尿病、又は耐糖能障害を持続的かつ可逆的に治療する。

Description

本出願は、バイオテクノロジー、医学、及び細胞培養の分野に関する。本出願は、具体的には、例えば、幹細胞及び膵島細胞（ＩＣ）を含む細胞クラスター（「ネオ膵島（Ｎｅｏ－Ｉｓｌｅｔ）」又は「ＮＩ」とも特定される）の組成物及び当該細胞クラスターを含む組成物を作り出す方法に関する。また、例えば、インスリン依存性糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、又は耐糖能障害の治療のための幹細胞及び膵島細胞を含む細胞クラスターの利用に関する。

インスリン産生β細胞は、ドナーの膵臓から単離されると、一般に、エクスビボでは増殖が非常に不十分であり、すなわち、インスリン依存性糖尿病の治療に適した細胞数を生成するのに十分ではない。この不足を克服し、糖尿病患者に長期持続する生理学的に放出されるインスリン補充療法（膵島及び膵臓移植、前駆細胞由来療法など）を提供するように設計された現在の技術及び多くの前臨床療法は、ドナー細胞の不足と患者の免疫系を抑制する必要性との両方によって妨げられ、日和見感染症及び悪性腫瘍などの患者に対する新たな一連の副作用をもたらす。適切な膵臓ドナーの大幅な不足と、一回当たり最大５人のドナーを必要とする膵臓移植の繰り返しの必要性とが相まって、これらの高価な療法の一般的な利用ができない状態が続いている。インスリン産生細胞のマイクロ及びマクロカプセル化システムが、免疫分離を促進し、この問題を克服するために試験される。しかしながら、利用されるカプセル化材料は異物であり、カプセル化デバイスが開いていると、療法の失敗が生じるか、又は拒絶反応抑制薬の使用を必要とする異物反応を誘発する可能性がある。

本明細書に記載されるのは、細胞クラスターを作製する方法であって、この方法は、膵島細胞を増殖させることと、増殖させた膵島細胞と、間葉系幹細胞及び／又は脂肪幹細胞とを含む細胞クラスターを形成することとを含む。

実施形態では、膵島細胞の増殖は、細胞クラスターを形成する前に、少なくとも５回の集団倍加を含む。

実施形態では、膵島細胞は、成人ドナーから得られる初代膵島細胞であり、成人ドナーの膵島は、８０未満の北米膵島ドナースコア（Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｓｌｅｔ Ｄｏｎｏｒ Ｓｃｏｒｅ）（ＮＡＩＤＳ）を有していた。

本明細書に更に記載されるのは、本明細書に記載される方法によって作り出される細胞クラスターである。

対象を治療する方法も記載され、この方法は、本明細書に記載される細胞クラスターを対象に提供することを含む。更に、例えば、本明細書に記載される細胞クラスターを、１型糖尿病又は２型糖尿病に罹患している対象に提供することによって、その対象を治療する方法が記載される。

本特許又は出願書類には、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラーの図面を含む本特許又は特許出願公開の複写は、請求及び必要な料金の支払いに応じて、庁によって提供されるであろう。

インスリン依存性糖尿病又は非インスリン依存性糖尿病の治療における細胞クラスター形成及びそれらの使用の図式的概観を示す。 培養した膵島細胞の増生及び上皮から間葉系への移行。全ての画像は１０倍の倍率で表示される。パネルＡ：緑色蛍光タンパク質遺伝子（ｇｆｐ）がインスリン１（ｉｎｓ１）遺伝子プロモーターのコントロール下にあるトランスジェニックＣ５７Ｂｌ／６ ｉｎｓ１ｇｆｐマウスから新しく単離された全膵島［１］。膵島ベータ細胞は緑色にレンダリングされる。パネルＢ：培養６日後のＩｎｓ１ｇｆｐ＋全膵島。有意なインスリン遺伝子発現が依然として明らかであり（緑色細胞）、細胞は膵島から増生し増殖している。これらの増生した細胞では、インスリン遺伝子発現は下方制御され、細胞はもはや緑色ではなくなる。パネルＣ：解離したｉｎｓ１ｇｆｐ＋マウス膵島細胞を１日間培養し、モルモット抗インスリン抗体、及びｃｙ^３コンジュゲート抗モルモット抗体を使用してインスリンタンパク質（赤色）を可視化し、インスリンタンパク質の免疫細胞化学によって固定及び解析した。画像から、ｇｆｐ＋細胞は非常に少数であるが、約半数の細胞はインスリンを含有しており、まだ緑色ではないことがわかる。これは、ベータ細胞が上皮間葉系移行によりインスリン遺伝子の発現を失うと結合し増殖することを示している。パネルＤ：解離したＩｎｓ１ｇｆｐ＋膵島細胞を、ＥｄＵの存在下で２日間培養した。細胞を固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（核、青色、非有糸分裂性核を同定するため）及びＥｄＵ（赤色、有糸分裂性核を同定するため）で染色した。分裂していない細胞は明るい緑色であり、丸い上皮形態を有しているが、分裂している細胞（赤い核）は細長い間葉系の外観を呈しており、うっすらとのみ緑色であり、インスリン遺伝子発現の下方制御を示し、それらの上皮間葉系移行を示す。 ＮＩ出発物質の比較、継代（Ｐ）依存性遺伝子発現プロファイル。マウス、イヌ及びヒト培養膵島細胞（左）並びにＭ／ＡＳＣ（右）の継代１、２及び３（それぞれＰ１、Ｐ２、及びＰ３）の遺伝子発現プロファイル（Ｌｏｇ１０ＲＱ）。両方の細胞型の全ての遺伝子発現プロファイルを、種特異的で新しく単離された膵島の遺伝子発現プロファイルと正規化した。全体として、マウス、イヌ、及びヒトにおいて、Ｍ／ＡＳＣの遺伝子発現プロファイルは、継代された膵島細胞の遺伝子発現プロファイルとは異なり、膵島細胞の継代は、膵島細胞関連遺伝子の発現を徐々に減少させる。データ：９５％信頼区間の平均値、６つの独立した実験の代表値。ΨはｈＡＳＣで発現しているが、ヒト膵島細胞では発現しておらず、それぞれの正規化を妨げている。＊は発現していない。 マウス（図４Ａ）及びイヌ（図４Ｂ）ＡＳＣ表現型解析。図４Ａ及び４Ｂ、左上のパネル：培養皿接着性、コンフルエントＡＳＣ培養物の明視野像；右上のパネル：骨形成分化（アリザリンレッドによるカルシウム染色）；左下のパネル：脂肪形成分化（オイルレッドＯ染色）；右下のパネル：軟骨原性分化（アルシアンブルー染色）。赤のスケールバー＝５０μｍ。図４Ｃ：ＩＦＮγに曝露したイヌＡＳＣのＩＤＯ－１遺伝子発現を、曝露していないｃＡＳＣの発現に正規化した（４つの独立した実験値の平均±ＳＥＭ）。ＩＤＯ－１遺伝子発現は、イヌＡＳＣがＩＦＮγに曝露されると３．４倍刺激される。図４Ｄ：培養したマウス及びイヌＡＳＣをＦＡＣＳによって、ＣＤ４４のそれらの陽性発現、並びにＣＤ４５、ＣＤ３４及びＩ－Ａ［ｂ］並びにＤＬＡ－ＤＲ移植抗原の陰性発現について調べた。全てのＭ／ＡＳＣは、培養皿接着及び三系統分化を受ける能力を特徴とするが、全ての非ヒトＭ／ＡＳＣが、ヒト由来のものと同じ細胞表面エピトープのセットを発現するわけではなく、ほとんどのＭ／ＡＳＣはＣＤ４４を発現するが、ＣＤ９０の発現は可変的である。ＣＤ９０のイヌＭ／ＡＳＣ発現は可変的である。 細胞クラスターの形成及びイメージング。図５は、１）緑色蛍光タンパク質陽性（ｇｆｐ＋）マウスＭＳＣを培養増殖する、２）マウス膵島細胞を培養増殖する、３）細胞を超低接着プレート中で共培養し、容易に細胞クラスターを形成する、細胞クラスター形成を受けるマウス細胞の画像及び概略図を示す。その後、細胞クラスターを再分化培地（ＲＤＭ）中で培養することができる。 左、中央、及び右のパネル：マウス（左）、イヌ（中央）及びヒト（右）の細胞クラスターの画像（６３倍の倍率）；ＡＳＣ（緑）、膵島細胞（赤）及び核（青）。形態及び細胞組成は、マウス、イヌ及びヒトの細胞クラスター間で有意差はない。 Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで染色されたイヌＡＳＣ及び染色されていないイヌ膵島細胞の、形成前及び形成後のｃＮＩ中での割合。図７Ａ：代表的なＦＡＣＳ散布図（ｘ＝前方散乱、ｙ＝蛍光）は、（ｉ）ＡＳＣ単独（左端のパネル）、（ｉｉ）ＩＣ単独（左中央のパネル）（ｉｉｉ）共培養開始時の細胞（右中央のパネル）、（ｉｖ）共培養２４時間後に採取し、単一細胞調製物に解離した、（ｉｉｉ）における共培養から得られた解離したＮＩ（右端のパネル）の割合を示している。ＡＳＣの９６．９％が共培養前に効果的に緑色に染色され、染色されていないＩＣの０．１％のみが自己蛍光であった。共培養開始時には、細胞の約４７％がＡＳＣであり、５３％がＩＣであり、共培養後、ＮＩ中では、細胞の約５１％がＡＳＣであり、４９％がＩＣである。図７Ｂ：図７Ａで行った実験のｎ＝１２の独立した繰り返しの、共培養２４時間後のＮＩ中のＡＳＣ及びＩＣの割合（平均±ＳＥＭ）の棒グラフは、一貫して、ＮＩが約５０％のＩＣと５０％のＡＳＣとで構成されていることを示す。バー間の差異は統計的に有意ではない。 マウス、イヌ、及びヒト細胞クラスターの遺伝子発現プロファイル。全てのデータは、２つのハウスキーピング遺伝子、β－アクチン、及びβ２マイクログロブリンに正規化される。図８Ａ：マウス（上）及びイヌ（下）細胞クラスターにおける膵島関連遺伝子の遺伝子発現プロファイル。再分化されたマウス細胞クラスター（左上）、新しく単離されたマウス膵島（右上）、及び新しく形成されたマウス細胞クラスター（マウス膵島に対する正規化）から、以下の１４個の膵島関連遺伝子についての遺伝子発現プロファイルを得た：インスリン１（ｉｎｓ１）、インスリン２（ｉｎｓ２）、グルカゴン（ｇｃｇ）、ソマトスタチン（ｓｓｔ）、膵十二指腸ホメオボックス－１（ｐｄｘ１）、インスリン転写因子ｍａｆＡ（ｍａｆａ）、ｎｋ６ホメオボックス１（ｎｋｘ６．１）、膵ポリペプチド（ｐｐｙ）、ｇｌｕｔ－１、ｇｌｕｔ－２、ｕｃｎ３、ｋｃｊ１１、ｓｕｒ２及びｇｌｐ１受容体（ｇｌｐ１ｒ）。再分化されたイヌ細胞クラスター（左下）、新しく単離されたイヌ膵島（右下）、及び新しく形成されたイヌ細胞クラスター（イヌ正規化）から、以下の６個の膵島関連遺伝子についての遺伝子発現プロファイルを得た：インスリン（ｉｎｓ）、ｇｃｇ、ｓｓｔ、ｎｋｘ６．１、ｓｕｒ１、及びｇｌｐ１ｒ。新しく形成されたマウス及びイヌの両方の細胞クラスターは、全ての試験された膵島関連遺伝子を低レベルで発現し、再分化を受けてこれらの遺伝子のより高いレベルをもたらす能力を有する。図８Ｂ：上：インスリン１（ｉｎｓ１）、インスリン２（ｉｎｓ２）、グルカゴン（ｇｃｇ）、ソマトスタチン（ｓｓｔ）、膵ポリペプチド（ｐｐｙ）、膵十二指腸ホメオボックス－１（ｐｄｘ１）、インスリン転写因子ｍａｆＡ（ｍａｆａ）、グルコース輸送体２（ｇｌｕｔ－２）、血管内皮増殖因子α（ｖｅｇｆ－α）及び間質細胞由来因子１（ｃｘｃｌ－１２）の遺伝子発現プロファイルを、Ｐ１マウス膵島細胞及びＰ５マウスＭＳＣ（左）、又はＰ２マウス膵島細胞及びＰ５マウスＭＳＣ（右）のいずれかから生成される新しく形成されたマウス細胞クラスターから得られ、新しく単離されたマウス膵島に正規化された。中央：Ｐ１イヌ膵島細胞及びＰ２イヌＡＳＣ（左）又はＰ２イヌ膵島細胞及びＰ２イヌＡＳＣ（右）のいずれかから作り出され、新しく単離されたイヌ膵島に正規化された新しく形成されたイヌ細胞クラスターにおける膵島細胞関連遺伝子、インスリン（ｉｎｓ）、ｇｃｇ、ｐｄｘ１及びスルホニル尿素受容体１（ｓｕｒ１）、並びにＡＳＣ関連遺伝子ｖｅｇｆ－α、ｃｘｃｌ１２、及び形質転換成長因子β１（ｔｇｆβ－１）の遺伝子発現プロファイル。下：新しく単離されたヒト膵島に正規化されたＰ１ヒト膵島細胞及びＰ３ヒトＡＳＣ（左）又はＰ２ヒト膵島細胞及びＰ３ヒトＡＳＣ（右）のいずれかから生成される新たに形成されたヒト細胞クラスターにおける、ｉｎｓ、ｇｃｇ、ｓｓｔ、ｐｐｙ、ｐｄｘ１、ｍａｆａ、ｎｋ６ホメオボックス１（ｎｋｘ６．１）、ウロコルチン３（ｕｃｎ３）、ｓｕｒ１、ｖｅｇｆ－α、ｃｘｃｌ１２、ｔｇｆβ－１、及びｉｇｆ－１の遺伝子発現プロファイル。このパネルは、種（マウス、イヌ、ヒト）にわたって、（ａ）脱分化され、継代された膵島細胞から作製された細胞クラスターが膵島細胞遺伝子を低レベルで発現し、（ｂ）膵島細胞遺伝子発現が継代とともに減少することを示している。図８Ｃ：脱分化されたＰ１膵島細胞及びＰ５ ＭＳＣ（クロスハッチバー）を含む５０個の新しく形成されたＣ５７Ｂｌ／６マウス細胞クラスターと、５０個の新しく単離されたＣ５７Ｂｌ／６マウス膵島（空白のバー）とを対比させたグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）。実験は２連で実施した。細胞クラスターは、２５ｍＭのグルコースへの６０分間の曝露に応答して新たに単離された膵島が放出するインスリンの約１％を放出する（インスリン約０．５ｎｇ対インスリン約５０ｎｇ）。これは、パネルＢに見られる継代にわたるインスリン遺伝子発現の減少に類似している。 同種ＮＩ処置により、糖尿病自然発症ＮＯＤマウスにおいて正常血糖（ｅｕｇｌｙｃｅｍｉａ）が確立された。ＮＯＤマウスの血中グルコースレベル（平均±ＳＥＭ）は、皮下（ｓ．ｃ．）インスリン放出性Ｌｉｎｂｉｔペレット（Ｌｉｎｂｉｔ）（０日目）で正規化し、次いで、Ｌｉｎｂｉｔ療法後２０日目に、２×１０^５個のＣ５７Ｂｌ／６ ＮＩ／ｋｇ（ｎ＝６、空白のバー）又はビヒクル（ｎ＝６、黒色のバー）でｉ．ｐ．注入した。ビヒクル処置マウスの血中グルコースレベルは、Ｌｉｎｂｉｔが失効すると増加したが（約３５日目）、ＮＩ処置マウスでは正常血糖が長期間維持され、インスリン産生細胞へのＩＣ再分化並びに同種及び自己免疫攻撃からのＮＩ媒介性免疫保護を示唆している。正常な血中グルコースレベル、ハッシュライン。＊、Ｐ＜０．０５対ビヒクル処置群。 処置されたＮＩ及びクラスターの血中グルコースレベル、ＳＴＺ糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウス並びにＮＩに含有される内分泌細胞へのＩＣのインビボ再分化。図１０Ａ：経時的な血中グルコースレベルが、（ｉ）ビヒクル、（ｉｉ）２×１０^５個のＡＳＣクラスター／ｋｇ．ｂ．ｗｔ、（ｉｉｉ）２×１０^５個のＩＣクラスター／ｋｇ．ｂ．ｗｔ、又は（ｉｖ）２×１０^５個のＮＩ／ｋｇ．ｂ．ｗｔで７日目にｉ．ｐ．処置した全てのＳＴＺ糖尿病マウスの群に示されている。＊、Ｐ＜０．０５対ビヒクル処置群。黒塗りの星印、Ｐ＜０．０５対ＡＳＣ－クラスター処置群。図１０Ｂ：左、ＮＩ注入後２１週目のＮＩ処置された正常血糖マウスからの代表的な腹膜網の蛍光画像（スケールバー＝２００μｍ）（緑色、ｅＧＦＰ＋細胞）。右、投与前のＮＩの遺伝子発現に正規化された腹膜網遺伝子発現（平均±ＳＥＭ）であり、ＮＩ生着、及び有意な内分泌再分化が示される。図１０Ｃ：非糖尿病マウスの発現プロファイルに正規化されたＡＳＣクラスター、ＩＣクラスター、及びＮＩ処置対ビヒクル処置した糖尿病マウスの膵臓全体からのＩｎｓ１及びＩｎｓ２発現プロファイル（平均±ＳＥＭ）。膵臓インスリン遺伝子発現レベルは、高血糖のビヒクル処置マウスの遺伝子発現レベルに対して、全ての処置群で同様に低下していたことから、ＮＩ処置マウスで見られる血中グルコースのコントロールは、腹膜網ＮＩからのインスリン分泌によって達成されたことになる。 図１０Ａ～１０Ｃのマウスを処置するために使用されるＣ５７Ｂｌ／６ＩＣ及びＡＳＣクラスターの形態及び生存率。Ｐ１ ＩＣ単独（左）及びＰ１ ＡＳＣ単独（右）のクラスター形成後、生存率のためにＰＩ（赤）及びＦＤＡ（緑、方法を参照）で染色した蛍光画像。ＡＳＣ単独及びＩＣ単独のクラスターは、ｉ．ｐ．注入前に９５％超生存可能である。スケールバー（赤）＝１５０μｍ。 ＳＴＺ誘発性高血糖の３週間後にビヒクル又はイヌ細胞クラスターを用いてｉ．ｐ．処置したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける血中グルコースプロファイル及び用量設定試験。２×１０^５個（黒色のバー）及び８×１０^４個の細胞クラスター／ｋｇ ｂｗ（クロスハッチバー）の両方の用量は、ビヒクル処置（空白のバー）と比較して長期的に血中グルコースレベルを低下させる。しかしながら、２×１０^５個の細胞クラスター／ｋｇ体重（「ｂｗ」）がより有効な用量である。 イヌ細胞クラスターの除去による正常血糖の逆転。イヌ細胞クラスター（黒色のバー）によるＳＴＺ糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのｉ．ｐ．処置は、ビヒクル処置動物（空白のバー）と比較して持続的な正常血糖を引き起こすが、かかる処置動物からのイヌ細胞クラスターの除去は、高血糖の再発をもたらす。 ＳＴＺ糖尿病マウスの血中グルコースレベルを正規化する、同種及び異種ＮＩのＩ．Ｐ．投与。図１４Ａ：２×１０^５個の同種移植ＮＩ／ｋｇ ｂ．ｗｔ（黒色のバー、Ｎ＝６）又はビヒクル（空白のバー、Ｎ＝６）でｉ．ｐ．処置したＳＴＺ糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの経時的な血中グルコースレベル。図１４Ｂ：２×１０^５個のイヌＮＩ／ｋｇ ｂ．ｗｔ（黒色のバー、Ｎ＝５）又はビヒクル（空白のバー、Ｎ＝５）のいずれかで処置したＳＴＺ糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの血中グルコースレベル。図１４Ａ及び１４Ｂの両方において、ＮＩ投与前に、Ｌｉｎｂｉｔペレットを用いて血中グルコースレベルを０日目にまず正規化した。ビヒクル処置マウスは、インスリンがＬｉｎｂｉｔから枯渇すると高血糖になるが（移植後３０～４０日目）、ＮＩ処置マウス（同種及び異種）は正常血糖（ｎｏｒｍｏｇｌｙｃｅｍｉｃ）のままであり、ＮＩが長期的に血中グルコースレベルをコントロールすることを示す。＊、Ｐ＜０．０５対ビヒクル処置群。 イヌ細胞クラスター又はビヒクルで糖尿病の発症後早期に処置されたＳＴＺ糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのカプラン・マイヤー生存プロット。２×１０^５個（正方形）又は８×１０^４個（円形）細胞クラスター／ｋｇ ｂｗの用量で処置された糖尿病動物は、ビヒクル処置動物（三角形）よりも、又は驚くべきことに、非糖尿病対照（ダイヤモンド形）動物よりも有意に長く生存する。 細胞クラスター処置ＳＴＺ糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腹腔内グルコース耐糖能試験（ＩＰ ＧＴＴ）及びイヌインスリンＥＬＩＳＡ。上：ＩＰ ＧＴＴ実験プロトコル。左下：２×１０^５個の細胞クラスター／ｋｇ ｂｗ処置（正方形、ｎ＝５）対ビヒクル処置ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（円形、ｎ＝３）のＩＰ ＧＴＴ。ＩＰ ＧＴＴは、２×１０^５個の細胞クラスター／ｋｇ ｂｗ処置ＳＴＺ糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて正常であるが、ビヒクル処置動物の血中グルコースレベルは有意に上昇したままである。右下：ビヒクル（左のバー、ｎ＝３）及びイヌ細胞クラスター処置マウス（中央、クロスハッチバー、ｎ＝５）、耐糖能試験中に採取されたＳＴＺ糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスからの血清、並びに非糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（中央の黒色のバー、ｎ＝２、ＥＬＩＳＡ特異性の陰性対照）及び健康なイヌ（空白のバー、ＥＬＩＳＡ特異性の陽性対照）からの血清の二重サンプルを用いて行ったイヌ特異的インスリンＥＬＩＳＡ。イヌ細胞クラスター処置されたが、ビヒクル処置マウスではない場合、血中グルコースレベルの上昇はイヌインスリンの放出を伴い、イヌ細胞クラスターからのインスリン放出が正常なＩＰ ＧＴＴの役割を担っていることを示す。 ＮＩ処置ＮＯＤマウスに膵島炎が残存する。処置後１１週目の正常血糖のＮＩ処置ＮＯＤマウスからヘマトキシリン・エオジン染色された膵切片の代表的な画像（４０倍）であり、持続性の高悪性度膵島炎（黒い円）の存在を示す。スケールバー（白）＝２００μｍ。 ＮＯＤマウスにおける腹膜網ＮＩ生着、生存、及びインスリン発現。図１８Ａ：１０週前にＤｉＲ標識されたｅＧＦＰ＋ＮＩで処置したＮＯＤマウスのインビボでのバイオ蛍光イメージングは、上腹部にｅＧＦＰ＋ＮＩがあることを示している。図１８Ｂ：ｉ．ｐ．投与されたｅＧＦＰ＋Ｃ５７Ｂｌ／６マウスＮＩは、処置後１１週時点で腹膜網内に生着されたままであり、糖尿病自然発症ＮＯＤマウスにおいて正常血糖を維持した（図９を参照）。左画像（１０倍）：Ｃ５７Ｂｌ／６ ｅＧＦＰ＋ＮＩで処置したＮＯＤマウスの代表的な腹膜網（緑色、赤い矢印を参照）。この画像は、ＮＩが腹膜網に生息し、生着していることを示し、ＮＩの拒絶反応がないことを示している。右画像（１０倍）：単一の生着したＮＩの拡大画像。毛細血管（黄色い矢印）に近いその位置が示されている。図１８Ｃ：左のパネル、メイン画像：ＤＮＡ（Ｄａｐｉ、青色）、及びインスリンタンパク質（赤色）について免疫組織化学によって染色された、図１８Ｂに示される腹膜網の切片（１０倍画像）。インスリンタンパク質が明確に検出された。挿入図、一次抗インスリン抗体が省略された陰性対照。右のパネル、メイン画像：ＤＮＡ（青色）、及びインスリンタンパク質（赤色）について染色された、ビヒクル処置した糖尿病ＮＯＤマウスの腹膜網の切片（１０倍）。挿入図：同じ切片の４０倍の倍率（スケールバー＝１０μｍ）。いずれの倍率でもインスリンは検出されなかった。これらの画像は、生着したＮＩによる腹膜網の位置及びインスリン合成を示している。別段の指示がない限り、スケールバー＝１００μｍ。 イヌ細胞クラスター処置ＳＴＺ糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの血中グルコースレベル。糖尿病の発症から３ヵ月後に、動物を細胞クラスターでｉ．ｐ．処置し、長期にわたって追跡した。糖尿病が確立した動物は、イヌ細胞クラスター（黒色のバー）による処置後に正常血糖を示すが、ビヒクル（空白のバー）で処置された動物は、Ｌｉｎｂｉｔによるインスリン放出が約３６日目に失効した後にも高血糖のままである。これは、細胞クラスターが発症後期（ｒｅｍｏｔｅ ｏｎｓｅｔ）糖尿病において正常血糖を確立するのに有効であることを示している。 同種細胞クラスターで処置した自己免疫Ｔ１ＤＭ ＮＯＤマウスの血中グルコースレベル。雌の糖尿病自然発症ＮＯＤマウスを徐放性インスリンペレット（Ｌｉｎｂｉｔ、ｓ．ｃ．）で処置して、高血糖をコントロールした。Ｌｉｎｂｉｔ療法後２０日目に、マウスを、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｐ２膵島細胞及びＰ５ ｇｆｐ＋ＭＳＣ、ｎ＝５、黒色のバー）又はビヒクル（ｎ＝３、空白のバー）由来の同種細胞クラスターで処置した。これらのデータは、同種及び自己免疫攻撃の両方に対する細胞クラスター誘発免疫単離の結果として、正常血糖が維持されることを明確に実証している。 細胞クラスターは、非糖尿病マウスにおいて低血糖を誘発しない。上のパネル：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに由来する２×１０^５個の細胞クラスター／ｋｇ ｂｗを、０日目に非糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにｉ．ｐ．投与した。処置された動物を最大１２週間追跡した。血中グルコースレベルを毎週評価した。いずれの時点においても低血糖は観察されず、マウス細胞クラスターによる生理学的インスリン放出を示した。細胞クラスターは生着されたままであり、拒絶されなかった。下のパネル：（ａ）２×１０^５個の新しく形成されたＤｉＲ標識されたイヌ細胞クラスター（Ｐ２イヌ膵島細胞＋Ｐ４イヌＡＳＣ、灰線、ｎ＝６）又は（ｂ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２（対照、黒線、ｎ＝３）のいずれかで、ｉ．ｐ処置したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの血中グルコースレベル。細胞クラスターは生着されたままである（図１８Ａを参照）。いずれの時点においても低血糖は観察されなかった。これらのデータは、イヌ細胞クラスターによる生理学的インスリン放出を更に実証している。 同種細胞クラスターに含有されるＭＳＣも培養膵島細胞も抗体形成を誘発しない。全てのパネルにおいて、細胞を対照又は処置マウスの血清とともにインキュベートし、次いでフィコエリトリン標識（ＰＥ）抗マウスＩｇＧとともにインキュベートし、次いでＦＡＣＳによって解析した。パネルＡ及びＢは、細胞クラスター処置によって持続的に正常血糖にされたＮＯＤマウスから、又はビヒクル処置若しくは未処置の対照ＮＯＤマウスから採取された（処置後１２週目）血清からのデータを示す。図２２Ａ：細胞クラスターからのＣ５７Ｂｌ／６ Ｇｆｐ＋ＭＳＣのＦＡＣＳ解析。上の列は、アイソタイプ抗体（陰性対照、左上）で染色したＭＳＣ、及び未処置のＮＯＤマウス（中央及び右）の血清とともにインキュベートしたＭＳＣのヒストグラムを示している。下の列は、同種細胞クラスター処置した（左の３つのパネル）又はビヒクル処置した（右のパネル）ＮＯＤマウス由来の血清とともにインキュベートしたＭＳＣのＦＡＣＳヒストグラムを示している。同種ＭＳＣに対する抗体応答の証拠はない。図２２Ｂ：細胞クラスターからのＣ５７Ｂｌ／６培養膵島細胞のＦＡＣＳ解析。上の列は、アイソタイプ抗体（陰性対照、左上）で染色された膵島細胞、及び未処置のＮＯＤマウス（中央及び右）の血清とともにインキュベートした膵島細胞のヒストグラムを示している。下の列は、同種細胞クラスター処置した（左の３つのパネル）又はビヒクル処置した（右パネル）ＮＯＤマウス由来の血清とともにインキュベートした膵島細胞のＦＡＣＳヒストグラムを示している。これらのデータは、同種培養膵島細胞に対する抗体応答がないことを実証している。図２２Ｃ：陽性対照。上のヒストグラム：ＮＯＤマウス血清とともにインキュベートしたイヌＡＳＣを、ビヒクル処置の１４日後に採取し、続いてＰＥ標識された抗マウスＩｇＧとともにインキュベートした。下のヒストグラム：ＮＯＤマウス血清とともにインキュベートしたイヌＡＳＣを、イヌＡＳＣを用いたｉ．ｐ．処置の１４日後に採取し、続いてＰＥ標識された抗マウスＩｇＧとともにインキュベートした。これらのデータは、ＮＯＤマウスが異種細胞に対して強固な免疫応答を示すことを実証している。 ＮＯＤマウスを処置したＮＩ（ＭＳＣ及びＩＣ）を生成するために使用される細胞に対するＩｇＧ応答。血清及びｃｙ３標識抗マウスＩｇＧ抗体とともにインキュベートした、Ｐ１ Ｃ５７Ｂｌ／６ ＭＳＣ及びＰ５ Ｃ５７Ｂｌ／６培養ＩＣのＦＡＣＳ結果の要約を示している。血清は、図２に示される実験からのビヒクル処置及びＮＩ処置ＮＯＤマウスからのものであった。血清を屠殺時（７７日目）に採取した。陽性対照として、無傷の全膵島をｉ．ｐ．投与した１４日後に、無傷のＣ５７Ｂｌ／６（同種）膵島処置ＮＯＤマウスからも血清を採取し、上記のようにＦＡＣＳによって評価した。Ｃｙ３＋：血清とのインキュベーション時に検出されたＣｙ３＋細胞の割合（平均±ＳＥ）。７％未満の応答は陰性とみなされた。（ｉ）ＮＯＤマウスは依然として正常血糖であり（図２参照）、（ｉｉ）ＦＡＣＳデータは、さもなければ免疫能力のあるＮＯＤマウスにおいてこれらの細胞に対するＩｇＧ応答を示さないため、ＮＩの抗体媒介性拒絶反応は起こりにくいと思われる。＊、Ｐ＜０．０５対他の処置。 ｉ．ｐ．投与した後１４日後に、膵島処置（Ｎ＝３）対ＮＩ処置ＮＯＤマウス（Ｎ＝３）の脾臓（ａ～ｄ）及び腹膜網（ｅ）からのヘルパー細胞、細胞傷害性細胞及び制御性Ｔ細胞の割合。（ａ）及び（ｂ）については、（ａ）ＣＤ４＋又は（ｂ）ＣＤ８＋でもあるＣＤ３＋細胞の割合が示されている。（ｃ）及び（ｄ）については、（ｃ）ＣＤ２５＋又は（ｄ）ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋でもあったＣＤ４＋細胞の割合が示されている。ヘルパーＴ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞のパーセンテージは、ＮＩ処置マウスでは、膵島処置マウスよりも低かったが、制御性Ｔ細胞のパーセンテージは有意に増加し、ＮＩが部分的に強固な免疫調節を介してＮＯＤマウスの正常血糖を回復させるのを助けたことを示唆している（図２を参照）。（ｅ）ＮＩ処置ＮＯＤマウスの腹膜網におけるＦｏｘｐ３陽性細胞の割合は、膵島処置動物と比較して著しく増加した。腹膜網をＦｏｘｐ３について染色し、陽性細胞の割合を補足情報に記載されているようにカウントした。＊、Ｐ＜０．０５対膵島処置群。 ヒト膵島細胞（ｈＩＣ）及びイヌ膵島細胞（ｃＩＣ）の集団倍加（ＰＤＬ）。図２５Ａは、ｈＩＣの特定の数の集団倍加に必要な時間を示す。図２５Ｂ ヒトドナー１～６から得られたｈＩＣの特定の数の集団倍加に必要な時間。図２５Ｃは、ｃＩＣの特定の数の集団倍加に必要な時間を示す。図２５Ｄ イヌドナー１～６から得られたｃＩＣの特定の数の集団倍加に必要な時間。 集団倍加（ＰＤＬ）当たり８人の別個のヒトドナーからのヒト膵島細胞の較正サンプルと比較した相対発現（ＲＱ）の倍率変化。図２５Ａは、インスリン（ＩＮＳ）遺伝子の発現における倍率変化を示す。図２５Ｂは、グルカゴン（ＧＣＧ）遺伝子の発現における倍率変化を示す。図２５Ｃは、ソマトスタチン（ＳＳＴ）遺伝子の発現における倍率変化を示す。図２５Ｄは、膵ポリペプチド（ＰＰＹ）遺伝子の発現における倍率変化を示す。 集団倍加（ＰＤＬ）当たり６匹の別個のイヌドナーからのイヌ膵島細胞の較正サンプルと比較した相対発現（ＲＱ）の倍率変化。図２６Ａは、インスリン（ＩＮＳ）遺伝子の発現における倍率変化を示す。図２６Ｂは、グルカゴン（ＧＣＧ）遺伝子の発現における倍率変化を示す。図２６Ｃは、ソマトスタチン（ＳＳＴ）遺伝子の発現における倍率変化を示す。図２６Ｄは、膵ポリペプチド（ＰＰＹ）遺伝子の発現における倍率変化を示す。 ヒト膵島及び培養ヒト膵島細胞のグルコース感受性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）。図２８Ａは、５ｍＭ及び２５ｍＭグルコースでチャレンジしたときのヒト膵島及び継代０（Ｐ０）ヒト膵島細胞のインスリン分泌を示す。図２８Ｂは、５ｍＭ及び２５ｍＭグルコースでチャレンジしたときの５～７回の集団倍加（ＰＤＬ）を受けた培養膵島細胞のインスリン分泌を示す。図２８Ｃは、５ｍＭ及び２５ｍＭグルコースでチャレンジしたときの８～１１回の集団倍加（ＰＤＬ）を受けた培養膵島細胞のインスリン分泌を示す。グルコース刺激に応答してインスリンを分泌する能力はドナーによって異なり、培養増殖はインスリン分泌のレベルを低下させるが、ｈＩＣはグルコースに応答してインスリンを分泌し続けており、これは以前に培養増殖されたマウス及びイヌのＩＣについて報告したものと同様である［２、３］。 継代Ｐ０～Ｐ４及びＰ３ヒトＭＳＣにおけるヒト膵島細胞の一晩共培養によって形成される細胞クラスター。スケールバー（赤）＝１００μｍ。各試験継代における形成された細胞クラスターの表現型及びサイズ分布は、同等であると思われる。単一の非凝集細胞が少数しか存在せず、細胞クラスター形成の高い効率を実証している。 ｃ５７Ｂｌ／６マウスＩＣの脱分化によって誘発された膵島特異的内分泌遺伝子発現レベルの減少を、全親膵島のものに正規化し、インビトロ及び投与後２１週目の正常血糖のＳＴＺ糖尿病マウスからの細胞クラスター回収時のＰＤＬの関数としてプロットした。マウス膵島を単離し、培養増殖し、方法に記載したように、ｒｔＰＣＲによって膵島特異的内分泌ホルモン遺伝子発現レベルを評価した。約６回のＰＤＬ（約３週間）のマウスＩＣを、マウス間葉系幹細胞とともに、糖尿病マウスを処置するために使用された細胞クラスターから共凝集させた。ＳＴＺ糖尿病マウス（ｎ＝６）の細胞クラスター（５，０００／ｋｇ ｂ．ｗｔがｉ．ｐ．投与され、６週目までに持続的な正常血糖を達成した）を用いたｉ．ｐ．処置後２１週目で、マウス腹膜網から取り出された細胞クラスターの遺伝子発現レベルは、新たに単離された膵島の発現レベル（時点ＰＤＬ０）に正規化され、インビボ再分化が有効であることが示された（調べられた遺伝子を表す矢印及び記号を参照）。これらのデータは、膵島細胞の培養増殖がＰＤＬの関数として内分泌遺伝子発現を減少させるが、細胞クラスター内へのＩＣの組み込み及び糖尿病対象への移植は、ＩＣの再分化、正常血糖の再確立、及び膵島ホルモン遺伝子発現の回復をもたらすことを実証している。 継代１（Ｐ１）におけるドナー７及び８からのヒト膵島細胞（ＩＣ）について示される較正サンプルと比較した、目的の遺伝子の相対発現（ＲＱ）の倍率変化。黒色のバーは、ドナー８からの細胞のＰ１における発現に正規化されたドナー７からの細胞のＰ１における発現を示す。緑色のバーは、ドナー７からの新たな膵島における発現に正規化されたドナー７からの細胞のＰ１における発現を示す。オレンジ色のバーは、ドナー８からの新たな膵島における発現に正規化されたドナー８からの細胞のＰ１における発現を示す。発現が測定された遺伝子は、インスリン（ＩＮＳ）、グルカコン（ＧＣＧ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、膵ペプチド（ＰＰＴ）、インスリンプロモーター因子１（ＰＤＸ１）、ウロコルチン－３（ＵＣＮ３）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）、形質転換増殖因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）、及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）である。 継代１（Ｐ１）におけるドナー７及び８からの親ヒト膵島細胞（ＩＣ）と比較した、細胞クラスター（ＮＩ）について示される較正サンプルと比較した、目的の遺伝子の相対発現（ＲＱ）の倍率変化。緑色のバーは、ドナー７からの細胞のＰ１における発現に正規化されたドナー７からの細胞で作り出された細胞クラスターにおける発現を示す。オレンジ色のバーは、ドナー８からの細胞のＰ１における発現に正規化されたドナー８からの細胞で作り出された細胞クラスターにおける発現を示す。発現が測定された遺伝子は、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、膵ペプチド（ＰＰＴ）、インスリンプロモーター因子１（ＰＤＸ１）、ウロコルチン－３（ＵＣＮ３）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）、形質転換増殖因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）、及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）である。 継代１（Ｐ１）におけるドナー７及び８からのヒト膵島細胞（ＩＣ）について示される較正サンプルと比較した、目的の遺伝子の相対発現（ＲＱ）の倍率変化。灰色のバーは、ドナー８からの細胞を使用して生成された細胞クラスター（ＮＩ）に正規化されたドナー７からの細胞を使用して生成された細胞クラスター（ＮＩ）の発現を示す。緑色のバーは、ドナー７からの新たな膵島における発現に正規化されたドナー７からの細胞を使用して生成された細胞クラスター（ＮＩ）の発現を示す。赤色のバーは、ドナー８からの新たな膵島における発現に正規化されたドナー８からの細胞を使用して生成された細胞クラスター（ＮＩ）の発現を示す。発現が測定された遺伝子は、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、膵ペプチド（ＰＰＴ）、インスリンプロモーター因子１（ＰＤＸ１）、ウロコルチン－３（ＵＣＮ３）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）、形質転換増殖因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）、及び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）である。 ヒト細胞クラスター（ＮＩ処置、白色のバー）で処置されたＳＴＺ誘発性糖尿病を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスと対照（ビヒクル処置対照、黒色のバー）との間の経時的な血中グルコースの差を示す。 ヒト細胞クラスターで処置した糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（青線上の黒い円、ヒトＮＩ処置）、ビヒクルのみで処置した糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（赤線上の黒い正方形）、及び非糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（緑線上の黒い三角形）の耐糖能試験の結果を示す。 ＮＩ遺伝子発現プロファイル。糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへのｉ．ｐ．投与前に新しく調製したヒトのネオ膵島（ｈＮＩ）の遺伝子発現プロファイルを示し、培養されていない全ヒト膵島の発現レベルに正規化した。Ｌｏｇ１０（ＲＱ）値をＮＩについて計算し、平均±ＳＥＭとしてグラフ化した。Ｌｏｇ１０（ＲＱ）±２（破線）は、統計的に有意とみなされた。膵島関連遺伝子（ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰＹ、ＰＤＸ１、及びＵＣＮ３）は、投与前にヒトＮＩで発現されるが、新しく単離されたヒト膵島のものと比較して有意に低下したレベルで発現される。 ＳＴＺ糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに投与されるｈＮＩの単回投与及び反復投与の治療有効性。図３７Ａ ｉ．ｐ．投与されたヒトのネオ膵島は、血中グルコースレベル及びｉ．ｐ．耐糖能試験（右）を一過性にのみ改善する。図３７Ｂ 同じ数のｈＮＩをｉ．ｐ．再投与すると、血中グルコースレベル、及びｉ．ｐ．耐糖能試験（ｉｐ ＧＴＴ、右）は、非糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるものと比較して正規化され、図３７Ｃ及びＤは、ｈＮＩ再処置ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるヒトインスリンの排他的分泌によって媒介される応答である（図３７Ｅ）。以前に報告されたように、非糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤにおけるｉｐ ＧＴＴ中のマウスインスリン分泌は生理学的であった。

開示される方法、細胞、及び細胞クラスターは、単一の膵臓ドナーから十分な治療用量の単離及び培養された膵島細胞を生成し、膵島細胞を必要とする対象に膵島細胞を提供する能力の限界を克服するものである。

本明細書で使用される場合、膵島は、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ガンマ細胞、及びイプシロン細胞を含むがこれらに限定されない、哺乳類膵島に見出される細胞のいずれかを含み得る。一実施形態では、膵島は、少なくともベータ細胞を発現するインスリンを含む。

本明細書で使用される場合、細胞クラスターは、骨髄由来間葉系幹細胞及び／又は脂肪由来幹細胞、及び増殖させた膵島細胞を含み得る。増殖させた膵島細胞は、脱分化された膵島細胞及び／又は再分化された膵島細胞であり得る。再分化された膵島細胞は、限定されないが、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ガンマ細胞、及びイプシロン細胞を含むがこれらに限定されない、哺乳類膵島に見出される細胞のいずれかを含み得る。したがって、この細胞クラスターは、とりわけ、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵十二指腸ホメオボックス－１、インスリン転写因子ｍａｆＡ、ｎｋ６ホメオボックス－１などを好ましくは産生し、これは、グルコースレベルをより良好に調節し、ひいては本明細書で達成される驚くほど良好な結果を説明するのに役立つ。一実施形態では、細胞クラスターは、少なくともインスリン発現ベータ細胞を含む。本開示の細胞クラスターは、非限定的な例として、１０００：１、１００：１、５０：１、２５：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：２５、１：５０、１：１００、又は１：１０００の脂肪幹細胞及び／又は間葉系幹細胞に対する脱分化された膵島細胞及び／又は再分化された膵島細胞の比を含み得る。

実施形態は、膵島のおおよそのサイズである、インビトロで生成される細胞クラスターを含む。かかる細胞クラスターは、骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及び／又は脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）、並びに増殖させた膵島細胞を含み得る。増殖させた膵島細胞は、脱分化された膵島細胞及び／又は再分化された膵島細胞であり得る。培養増殖は、上皮間葉移行（ＥＭＴ）を介して膵島細胞を脱分化し得、得られた細胞は、ＭＳＣ及び／又はＡＳＣとともに細胞クラスターに凝集され得、これは、対象に投与されるときに自発的に再分化し、調節されたインスリン分泌を再開する。膵島は、全ての臓器と同様に、少数のＭＳＣ及び／又はＡＳＣを有しており、これらのＭＳＣ及び／又はＡＳＣは、本来、周辺細胞として、強固な抗炎症作用、複合免疫防御作用、血管新生促進作用、生存及び組織修復支援作用を発揮する。脱分化された細胞を含有する細胞クラスターは、再分化を引き起こすように処置されてもよく、再分化は、インスリンを発現する再分化された膵島細胞を含む細胞クラスターをもたらす。培養増殖した膵島細胞と、生理学的な数よりもはるかに多い数の健常なＭＳＣ及び／又はＡＳＣとで構成される細胞クラスターのインビトロ作製により、ＭＳＣ及び／又はＡＳＣの多面的な作用によって媒介されるこれらの細胞クラスターが、１型糖尿病、２型糖尿病、及び他のタイプのインスリン依存性糖尿病、又は耐糖能障害に見られるような血糖コントロール障害を有する対象に投与されるときに、炎症性、免疫性及び他の障害に耐えることを可能にする。

単離された膵島細胞（初代膵島細胞）は、任意の適切なドナー（例えば、げっ歯類、イヌ、ヒト、又は他の哺乳動物）由来であり得る。実施形態では、ドナーは、成人ドナーである。

膵島細胞は、本明細書において「研究グレード」の膵島細胞と呼ばれる、医学界で使用されている現在の基準の下では治療用途に適していない人口統計学的に多様な膵臓／膵島ドナー又は単離された膵島から得られることができる。かかるドナーからの膵島細胞は、膵島移植に適していないと判断されるため、一般的に廃棄される。しかしながら、かかるドナーからの細胞は、本明細書に記載される細胞クラスターに形成された場合、治療用途に適している。要するに、本明細書に記載される方法及び細胞クラスターは、多様な人口統計学的起源（イヌ及びヒト）からのドナープールのサイズの大幅な拡大、並びに膵島移植を成功させるための現在の品質基準を満たさない（例えば、細胞生存率の低下）かかるドナーからの単離された膵島を提供する。

態様において、本明細書で使用される膵島細胞は、「研究グレード」、すなわち、治療用途に意図されていないものとして分類され得る。追加の実施形態では、膵島細胞は、Ｇｏｌｅｂｉｅｗｓｋａ，ｅｔ ａｌ、及びＹｅｈ，ｅｔ ａｌ．［４、５］によって定義されるように、８０未満、７５未満、７０未満、６５未満、６０未満、５５未満、５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、又は１０未満の北米膵島ドナースコア（ＮＡＩＤＳ）を有するドナーから得ることができる。本明細書に具体的に含まれるのは、１型糖尿病、２型糖尿病、及び他のタイプのインスリン依存性糖尿病などの血糖コントロール障害を有する対象、又は本明細書に記載される細胞クラスターのｉ．ｐ．投与による耐糖能障害を有する対象の治療方法であり、ここで、クラスターは、研究グレードとして分類された細胞、又は上記のようにＮＡＩＤＳスコアを有する細胞から増殖させた膵島細胞を含有する。

分化された膵島細胞は、例えば、インスリンを発現するが、増殖しないか、又はインビトロでは最小限にしか増殖しない。単離された膵島細胞は、インビトロで脱分化するように誘発され得る。本明細書で使用される場合、「脱分化された」膵島細胞又は膵島細胞核は、グルコースでチャレンジしたときに、もはや生理学的レベルのインスリンを発現又は産生しない細胞又は核である。特定の実施形態では、グルコースでチャレンジしたときの脱分化された膵島細胞によるインスリンの発現は、一次単離された膵島細胞と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれを超えて低減され得る。脱分化のプロセスは、本明細書では上皮間葉移行又は「Ｅ－Ｍ」移行とも呼ばれる脱分化された膵島細胞は、分化された膵島細胞よりも優れた速度で培養において増殖し得る。膵島細胞の脱分化は、これらの細胞におけるインスリン発現、インスリン合成、インスリン貯蔵、及び／又はグルコース誘発性インスリン分泌を直ちに低減又は沈黙させ得る。

脱分化された膵島細胞をインビトロで増殖させて、他の細胞型と共培養及び／又は細胞クラスターに形成され得る大きな細胞プールを形成させてもよい。

増殖関連の脱分化は、膵島細胞に対して接着性の条件下で膵島細胞を培養することによって達成され得る。種々の実施形態では、膵島細胞は、ラミニン５１１又はラミニン４１１でコーティングされているか、又はコーティングされていない表面上で培養されてもよい。脱分化は、任意選択で、脱分化培地中で実施してもよい。脱分化培地は、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）受容体アゴニストを含んでもよい。特定の実施形態では、ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、ＧＬＰ－１、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、タスポグルチド、及び／又はエクセンディン－４であり得る。ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、脱分化培養培地中に、０．１～１００ｎＭ、１～５０ｎＭ、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ｎＭの濃度で存在し得る。

実施形態では、脱分化された膵島細胞は、細胞クラスターに含める前に、少なくとも１回の集団倍加のために培養において増殖されてもよい。受けることができる集団倍加の数には、細胞クラスターに含める前に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、及び５０回の集団倍加が含められるが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、本明細書に記載される細胞クラスターに含める前に、脱分化された膵島細胞を再分化してもよい。

単離された膵島及び／又は膵島細胞を、ラミニン（例えば、ラミニン４１１及び５１１）上で培養し、適切な培地を添加することにより、培養における細胞接着を改善し、細胞生存をサポートし、増殖を適度に高めることができる。脱分化のために、膵島細胞を、付着を可能にする適切な基質上にプレーティングしてもよい。特定の実施形態では、基質は、ラミニン４１１及び／又はラミニン５１１を含み得る。より具体的な実施形態では、膵島細胞を、ラミニン－４１１及び／又はラミニン－５１１でコーティングされた組織培養フラスコ又はウェル上にプレーティングし、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、アルファＭＥＭ、ＣＭＲＬ、ＰＩＭ、又は他の適切な培養培地中に置き、１０％～２０％のウシ胎児血清又は他の種特異的血清若しくは血小板溶解物、及びグルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシンを補充してもよい。培養培地はまた、少なくとも１０ｎＭのエクセンディン－４を補充してもよい。

細胞クラスターが培養され得る血清の例としては、ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍから入手可能な血清が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な非限定的な例としては、ウシ胎児血清、仔ウシ血清、成ウシ血清、ニワトリ血清、ヤギ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ヒツジ血清、ウマ血清、イヌ血清、ヒヒ血清、コヨーテ血清、ガチョウ血清、マウス血清、ラット血清、アカゲザル血清、代替血清、及びヒト血清が挙げられる。

細胞クラスターを作製する方法が含まれ、当該方法は、本明細書に記載される膵島細胞を増殖させることと、増殖させた膵島細胞と、間葉系幹細胞及び／又は脂肪幹細胞とを含む細胞クラスターを形成することとを含む。

細胞クラスターのＭＳＣ／ＡＳＣ成分は、膵島由来成分（脱分化された膵島細胞又は再分化された膵島細胞）の免疫隔離、保護、及び生存の増加を提供し、それによって拒絶反応を妨げ、細胞クラスターの生着を増強する。細胞クラスター中の正常なＭＳＣ及び／又はＡＳＣの強力な免疫調節活性の有意に増加した細胞数を介した増幅は、膵島細胞の自己免疫隔離及び同種免疫単離を提供し、それによって拒絶反応抑制薬又はカプセル化デバイスの必要性を排除する。その結果、本明細書に記載される細胞で対象を治療する特定の実施形態では、拒絶反応抑制薬は、患者に投与されない。更なる実施形態では、本明細書に記載される細胞は、カプセル化されておらず、かつ／又はカプセル化デバイスに関連付けられていない。更に、細胞クラスターのＭＳＣ／ＡＳＣ成分は、肝細胞増殖因子及び他の因子の放出を介して、上皮から間葉系への移行の逆転を誘発し得、したがって、脱分化された膵島細胞をインビボでインスリン及び他の膵島ホルモン産生細胞へ再分化することを促進し得る。

更なる実施形態では、細胞クラスターは、腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与される。哺乳類の腹膜網が異物及び様々な細胞型を取り込む能力は、細胞クラスターの耐久性及び自発的な生着を促進し、細胞クラスターは、次いで、対象に生理学的に、すなわち、肝臓の門脈にインスリンを送達し、これは更に皮下及び門脈空間におけるインスリンよりも優れた腹膜グルコース感知及び酸素圧によって最適化される（Ｄ．Ｒ．Ｂｕｒｎｅｔｔ，Ｌ．Ｍ．Ｈｕｙｅｔｔ，Ｈ．Ｃ．Ｚｉｓｓｅｒ，Ｆ．Ｊ．Ｄｏｙｌｅ，ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｍｅｎｓｈ，“Ｇｌｕｃｏｓｅ ｓｅｎｓｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｓｐａｃｅ ｏｆｆｅｒｓ ｆａｓｔｅｒ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｔｈａｎ ｓｅｎｓｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｓｐａｃｅ，”Ｄｉａｂｅｔｅｓ ６３：２４９８－５０５（２０１４）を参照、この参照［６］により本明細書に組み込まれる）。インスリン送達の生理学的な経路は、インスリン抵抗性、インスリン増強脂肪生成及び高濃度のインスリンに末梢組織がさらされる潜在的な有害性を低減する可能性がある。これらの理由から、腹膜網は、細胞クラスターの移植に独自に適しており、更に、必要が生じた場合には、細胞クラスターを腹膜網切除術（腹膜網の一部又は全部の外科的除去）によって対象から除去することができる。

更なる実施形態では、細胞クラスターの早期拒絶の証拠がある場合、細胞クラスターの生存及び機能を改善するために、ラパマイシン又は他の適切な拒絶反応抑制薬による短期の初期コースを対象に投与することができる。この療法のレシピエントが腹膜網を欠くか、又は損傷している場合には、門脈内移植、他の位置、又は適切なカプセル化デバイスを利用することができる。

上記の方法の各例において、細胞クラスターは、ヒドロゲルでコーティングされてもよい。かかるコーティングは、細胞クラスターが形成される任意のステップの後に、又は対象に細胞クラスターを注入若しくは提供する前に行ってもよい。

上記の方法の各例において、細胞クラスターは、カプセル化デバイス内に含有されてもよい。かかるカプセル化は、細胞クラスターが形成される任意のステップの後、又は対象に細胞クラスターを注入若しくは提供する前に行ってもよい。

種々の実施形態では、細胞クラスターは、免疫特権があり得る。本明細書で使用される場合、「免疫特権がある」とは、免疫特権がない細胞又は細胞クラスターよりも強固な免疫応答を引き起こさないか、又は免疫応答を惹起しない、本明細書に記載される細胞クラスターを指す。種々の実施形態では、「免疫特権がある」細胞又は細胞クラスターに対する免疫応答は、免疫特権がない細胞又は細胞クラスターに対する免疫応答の０、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５％又は１００％以下であり得る。

ＭＳＣ及びＡＳＣは、よく増殖する間質細胞としても知られる、未分化の多能性成体幹細胞であり、インスリンを産生しない。ＭＳＣ及びＡＳＣは、任意の適切なドナー（例えば、げっ歯類、イヌ、ヒト、又は他の哺乳類）由来であり得る。

脱分化された膵島細胞はよく増殖するが、インスリンを発現又は分泌しないか、又は最小限にしか発現若しくは分泌しない。いくつかの実施形態では、脱分化された膵島細胞を増殖させて、その後の操作のための十分な数を生成させる。特定の実施形態では、十分な脱分化された膵島細胞が生成されたら、細胞を膵島細胞又はベータ細胞特異的再分化培地で処置する。膵島細胞の再分化は、インスリン産生を回復させ、生理学的インスリン発現、合成、貯蔵、及びグルコース感受性インスリン放出の再発現をもたらす。

脱分化された膵島細胞を再分化して、再分化された膵島細胞を生成することが記載される。本明細書で使用される再分化とは、生理学的インスリン発現、合成、貯蔵、及びグルコース感受性インスリン放出の回復した発現を有する再分化された膵島細胞を生成するための脱分化された膵島細胞の処置を指す。特定の実施形態では、再分化は２ステップのプロセスであり得る。

第１のステップでは、脱分化された膵島細胞を、低レベルのグルコースを含有する培養培地にさらしてもよい。低レベルのグルコースは、１、２、３、４、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、及び６ｍＭのＤ－グルコースから選択され得る。培地は、インスリン／トランスフェリン／セレン（ＩＴＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、イヌ血清、又はヒト血小板溶解物などの他の成分を含有し得る。第１のステップは、脱分化された膵島細胞を、低レベルのグルコースを含有する培養培地中で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１～１４、２～１３、３～１２、４～１０、又は５～９日間培養することを含み得る。

第２のステップでは、脱分化された膵島細胞を、高レベルのグルコースを含有する培養培地にさらしてもよい。高レベルのグルコースは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、及び３５ｍＭのＤ－グルコースから選択され得る。培地は、インスリン／トランスフェリン／セレン（ＩＴＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、イヌ血清、又はヒト血小板溶解物、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、ニコチンアミド、アクチビンＡ、Ａｌｋ－５阻害剤ＩＩ、トリヨードチロニン、及びグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）受容体アゴニストなどの他の成分を含有し得る。ニコチンアミドは、０．１～１００ｍＭ、１～５０ｍＭ、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ｍＭの濃度で培養培地中に存在し得る。アクチビンＡは、０．１～１００ｍＭ、１～５０ｍＭ、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ｍＭの濃度で培養培地中に存在し得る。ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、０．１～１００ｎＭ、１～５０ｎＭ、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ｎＭの濃度で培養培地中に存在し得る。Ａｌｋ－５阻害剤ＩＩは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０μＭの濃度で培養培地中に存在し得る。トリヨードチロニンは、０．１～１００μＭの濃度で培養培地中に存在し得る。ＧＬＰ－１受容体アゴニストは、エクセンディン－４であり得る。第２のステップは、脱分化された膵島細胞を、高レベルのグルコースを含有する培養培地中で１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、１０～２８、１１～２７、１２～２６、１３～２５、又は１４～２９日間培養することを含み得る。

いくつかの実施形態では、増殖性ＭＳＣ又はＡＳＣとのその後の培養のために、出発物質（脱分化された膵島細胞）の量の実質的な拡大を通じてインスリン産生細胞を生成するための方法が提供される。

本明細書に記載される細胞クラスターの形成方法が開示される。かかる細胞クラスターは、膵臓中に見出される膵島の大きさとほぼ等しいものであり得る。細胞クラスターは、例えば、当該技術分野で知られている任意の方法によって形成され得る。非限定的な例では、細胞クラスターは、疎水性の超低接着表面上で細胞を培養することによって形成される。

疎水性及び／又は超低接着性表面の例としては、未処理のポリスチレン、低付着性ヒドロゲル層、及び非荷電表面が挙げられるが、これらに限定されない。

また記載されるのは、インスリンを必要とする対象、及び／又は１型糖尿病（「Ｔ１ＤＭ」）若しくは２型糖尿病（「Ｔ２ＤＭ」）に罹患している対象、又は耐糖能障害若しくは糖尿病前症に罹患している対象を、記載された細胞クラスターを用いて処置する方法が開示される。いくつかの実施形態では、細胞クラスターは、腹腔内（ｉ．ｐ．）及び／又は対象の腹膜網に投与される。特定の実施形態では、細胞クラスターは、ｓ．ｃ．、又は他の方法で、非経口的に対象に投与される。特定の実施形態では、対象への細胞クラスターの投与は、インスリン産生、分泌、及びグルコース応答性を増加及び／又は回復させる。特定の実施形態では、細胞クラスターは、投与前にヒドロゲル又は他のＦＤＡが承認した材料でコーティングされて、インビボでの細胞クラスター、例えばゲルフォーム、又はトロンビンクロットの生存を更に増強してもよい。細胞クラスターが脱分化された膵島細胞を含有する実施形態では、これらの細胞は、対象を細胞クラスターで治療した後、対象において再分化を受けることができる。

細胞クラスターで対象を治療する方法は、治療的に十分な数の細胞クラスターを含む細胞クラスターの用量を、Ｔ１ＤＭ、Ｔ２ＤＭ、又は耐糖能障害に罹患している対象に提供して、インスリン産生、分泌、及びグルコース応答性を増加及び／又は回復させることを含む。この用量は、当業者であれば、投与経路、対象の体重、治療される対象における病態の程度、及び療法に対する対象の応答に応じて変化することが理解されるであろう。特定の実施形態では、療法に対する最初の応答に応じて、細胞クラスターのその後の用量が対象に投与され得る。実施形態では、治療的に十分な数の細胞クラスターは、インスリン産生、分泌、及びグルコース応答性を増加及び／又は回復させるのに十分な増殖させた膵島細胞を含む。特定の実施形態では、治療的に十分な数の細胞クラスターは、少なくとも１．００Ｅ＋０１、１．００Ｅ＋０２、１．００Ｅ＋０３、１．００Ｅ＋０４、１．００Ｅ＋０５、１．００Ｅ＋０８、２．００Ｅ＋０８、３．００Ｅ＋０８、４．００Ｅ＋０８、５．００Ｅ＋０８、７．００Ｅ＋０８、８．００Ｅ＋０８、９．００Ｅ＋０８、１．００Ｅ＋０９、２．００Ｅ＋０９、３．００Ｅ＋０９、４．００Ｅ＋０９、５．００Ｅ＋０９、７．００Ｅ＋０９、８．００Ｅ＋０９、９．００Ｅ＋１０、１．００Ｅ＋１０、２．００Ｅ＋１０、３．００Ｅ＋１０、４．００Ｅ＋１０、５．００Ｅ＋１０、７．００Ｅ＋１０、８．００Ｅ＋１０、９．００Ｅ＋１０、１．００Ｅ＋１１、１．００Ｅ＋１２、１．００Ｅ＋１３、１．００Ｅ＋１４、１．００Ｅ＋１５、１．００Ｅ＋１６、１．００Ｅ＋１７、１．００Ｅ＋１８、１．００Ｅ＋１９、又は１．００Ｅ＋２０個の増殖させた膵島細胞を含む。

本明細書に記載される方法の高効率（すなわち、生存細胞の非常に小さな損失）は、現在の従来の治療よりも単一の膵臓から得ることができる用量の数の顕著な増加も提供する。例えば、単一のヒト膵臓から得ることができる膵島の平均数に基づいて、本明細書に記載される膵島細胞を増殖させることは、単一のドナーから、インスリン産生、分泌、及びグルコース応答性を増加及び／又は回復させるのに十分な細胞クラスターの１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００又はそれを超える用量の十分な膵島細胞を提供し得る。対照的に、現在のヒト膵島移植は、単一のヒト用量に対して約３～５つの膵臓を必要とする。更に、インスリンの独立性を再確立するために、反復投与がしばしば必要とされる。

「治療する」又は「治療」は、完全な治癒を必要としない。これは、基礎疾患の症状が少なくとも軽減されること、及び／又は症状を引き起こす根本的な細胞的、生理学的、又は生化学的な原因若しくはメカニズムのうちの１つ以上が軽減及び／又は除去されることを意味する。インスリンの必要量は低減し得る。末端臓器の損傷が低減し得る。拒絶反応抑制薬の必要性が低減又は排除され得る。この文脈で使用される低減は、疾患の生理学的状態だけでなく、疾患の分子状態を含む疾患の状態との相対的な関係を意味することが理解される。

治療（特に初期段階で）は、インスリン及び／又は経口血糖降下薬（又は薬物）の投与によって補助され得る。かかる薬物としては、ビグアナイド（例えば、メトホルミン）、スルホニル尿素（例えば、グリメピリド、グリブリド、又はグリピジド）、メグリチニド（例えば、レパグリニド）、ジフェニルアラニン誘導体（例えば、ナテグリニド）、チアゾリジンジオン（例えば、ピオグリタゾン）、ＤＰＰ－４阻害剤（例えば、シタグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン）、α－グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース又はミグリトール）、胆汁酸再吸収抑制剤（例えば、コレスベラム）などが挙げられる。かかる薬物、アジュバント及び／又は中間治療の投与量及び投与は、当業者によって容易に決定され、治療される対象に依存し、ここで繰り返す必要はない。

また、投与前の細胞クラスターの生存を確保し、投与後のインビボでの細胞クラスターの生存を更に高めながら、治療される対象から遠隔で細胞クラスターを調製できるようにするために、当該技術分野で知られている細胞クラスターの調製方法及び包装方法も記載される。例えば、種々のインプラントが当業者に周知である。カプセル化及びマイクロカプセル化デバイス、並びに方法も周知である。

包装は、例えば、対象又は医療従事者に送達するために、例えば、注射器、滅菌バッグ、注入バッグ、ボトルなどに新鮮な又は凍結した細胞クラスターを包装するなど、当該技術分野で知られている手段によって達成され得る。Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ ｐＨ７．４が、細胞クラスターを包装するのに非常に有用であり得る。

げっ歯類及びイヌモデルを含む動物モデルの使用は、ヒト糖尿病の治療法を開発するのに有用なツールを提供するために、当業者によってよく理解されている［７］。実際、Ｋｉｎｇが指摘するように、本明細書に開示されているように、ヒト糖尿病の多様性をよりよく表すために複数の動物モデルを提供することが理想的である。提供される説明は、当業者が、過度の実験なしに、ヒトにおけるＴ１ＤＭ、Ｔ２ＤＭ、及び耐糖能障害を治療するために細胞クラスターを作製し、使用することを可能にするであろう。

いくつかの実施形態では、対象は、例えば、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、又はヒトなどの哺乳類であり得る。更なる実施形態では、細胞クラスター内の細胞は、対象又は細胞クラスター内の他の細胞に関連して、同種細胞、異種細胞、又は同種細胞と異種細胞との組み合わせであってもよい。

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「によって特徴付けられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ）」、及びそれらの文法的等価物は、追加の列挙されていない要素又は方法ステップを除外しないが、より限定的な用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を含む包括的又はオープンエンドな用語である

以下の実施例は、例示のみを目的として提供され、本開示を本明細書に具体的に開示される実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。

膵島は、全ての組織と同様に、免疫調整作用、抗炎症作用及び他の保護栄養作用を局所的に発揮する少数の間葉系幹細胞を周皮細胞として有していることから［８－１４］、本発明者は、ＭＳＣ／ＡＳＣの数がはるかに多い内分泌膵島細胞を含む細胞クラスター（ネオ膵島（ＮＩ））が形成され得るかどうか、また、かかる細胞クラスターが効果的に提供されるかどうかの仮説を立て、試験した：（ｉ）カプセル化デバイスを用いない自己免疫隔離及び／又は同種免疫隔離、（ｉｉ）同種細胞クラスターのインビボでの生存利益、それによる拒絶反応抑制薬の必要性の低減又は排除、（ｉｉｉ）膵体細胞のインビボでの再分化、及びそれによる（ｉｖ）Ｔ１ＤＭのげっ歯類における十分かつ生理学的なインスリン分泌及び持続的な正常血糖の維持。

骨髄由来間葉系間質細胞（ＭＳＣ）又は脂肪組織由来脂肪幹細胞（ＡＳＣ）の独自のかつ文書で十分に立証された多面的作用及びほぼ同等の作用は、膵島サイズの細胞クラスター又は「細胞クラスター」（ＮＩ）において等しい数の膵島細胞と組み合わされた場合、同種及び自己免疫攻撃並びに炎症性損傷からβ細胞を投与し、β細胞生存を高め、血管新生を誘発するために利用される。生理学的には、膵島の総細胞数の約２％のみがＭＳＣであり、微小血管ニッチの末梢細胞様細胞として存在している。膵島内の細胞保護機能は、骨髄及び他の臓器、すなわち、血管保護及び安定化、抗炎症、栄養及び免疫調節活性の細胞保護活性と同様であると考えられる。かかるおおよその膵島サイズのＮＩは、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの上皮間葉移行（ＥＭＴ）及び関連する脱分化、膵島細胞及び骨髄由来ＭＳＣを介して増殖された培養からインビトロで生成した。各々が約５００個の膵島細胞と約５００個のＭＳＣとで構成される５×１０^３個のＮＩを、主にヒトＴ１ＤＭに似た自己免疫形態のＴ１ＤＭを発症する糖尿病自然発症の免疫能力のあるＮＯＤマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。この同種処置プロトコルは、膵臓又は膵島移植のレシピエントにおける最も一般的な臨床状況をモデル化するために選択された。拒絶反応抑制薬又はカプセル化デバイスを使用しないことにより、ＮＩにおける多数のＭＳＣが膵島細胞の生存を可能にし、正常に機能する内分泌細胞に再分化し、それによって自己免疫Ｔ１ＤＭを有するＮＯＤマウスにおいて血糖コントロールを持続的に確立することを厳密に試験した。ＮＩ処置糖尿病ＮＯＤマウスは正常に成長したが、ビヒクル処置した、糖尿病ＮＯＤマウスは高血糖のままであり、死に至った。これらの初期データは、ＮＩが生存し、腹膜網に生着し、インビボで機能的内分泌細胞に再分化し、同種及び自己免疫保護の両方が達成されることを示唆した。重要なことに、ｉ．ｐ．投与後、ＮＩは腹膜網に取り込まれ、そこで長期的に生着し、生理学的にインスリン及び他の膵島ホルモン産生細胞に再分化された。ＮＯＤマウスは、ＮＩを形成するために使用されるＭＳＣ及び膵島細胞に対して体液性の同種免疫応答を示さなかった。ＮＩ処置糖尿病動物は、膵島で処置された動物と比較して、その腹膜網及び脾臓における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）数の顕著な増加を示した。ＮＩを非糖尿病動物に注入すると、ＮＩはまた低血糖を引き起こすことなく腹膜網に生着し、生存し、インスリン分泌の調節が更に実証された。腹膜網からのインスリン分泌は、膵臓からのものと同様に肝臓の門脈系に起こり、これは生理学的なものであり、送達されたインスリンの約５０％が不活性化されることになる。これにより、筋肉、脂肪組織、血管系及び他の臓器が、インスリンが皮下投与されたときに生成される、超生理学的で低血糖を誘発する可能性があり、さもなければ有害なインスリンレベルに肝後さらされることが制限される。ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）糖尿病マウスを、ＭＳＣ又は膵島細胞のみで構成される同様のサイズの細胞クラスターで処置した場合、ＮＩ処置された正常血糖の動物と比較して、血中グルコースレベルは、ビヒクル処置対照と比較して最小限に低下しただけであった。このことから、ＮＩの治療有効性が、ＭＣＳと膵島細胞との協働に決定的に依存することが明確に実証された。最後に、ＳＴＺ糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスをイヌＮＩ（ｃＮＩ）と同一のプロトコルによってｉ．ｐ．処置したとき、正常血糖が容易かつ持続的に誘発され、腹腔内耐糖能試験（ＩＰ ＧＴＴ）が正規化された。重要なことに、ＩＰ ＧＴＴ中に放出されたインスリンはイヌ特異的であり、ｃＮＩが外科的に除去されると、高血糖が再発した。以上より、本データは、ＭＳＣ又はＡＳＣ（Ｍ／ＡＳＣ）の複雑な多面的作用が、仮説どおり、培養された膵島細胞を保護するために容易に利用することができ、ＮＩにそれらを組み込んでｉ．ｐ．投与すると、自己免疫Ｔ１ＤＭを有するマウスにおける長期的な血糖コントロールを促進にすることを実証している。したがって、本発明者は、これらの観察結果がＴ１ＤＭの治療に有意な翻訳的関連性を持つものと結論付ける。

実施例１：膵島単離
げっ歯類由来：マウスを密封されたチャンバー内でイソフルラン（３～５％）で安楽死させ、直ちに外科用ボード上に置いて、無菌的に正中線切開を行った。膵臓を露出させ、膵管の位置を確認した。総胆管をクランプし、総胆管を介して解離緩衝液（ハンクス緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）、Ｃａ^＋＋、Ｍｇ^＋＋＋２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋ＮａＨＣＯ_３）中の５ｍｌ／マウス又は１５ｍｌ／ラット１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＰで膵臓を膨張させた。膨張した膵臓を、消化液（解離緩衝液中１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＰ）を含有する滅菌コニカルチューブに取り出した。チューブを３７℃の振動水浴（１２０ｒｐｍ）に入れ、内容物を１５分間消化した。消化は等容量の冷解離緩衝液で停止した。消化された組織を４００μｍスクリーンで濾過し、新しいチューブに移し、ブレーキをオフにした状態で１２００ｒｐｍにて４℃で２分間遠心分離した。ペレットを２０ｍｌの解離緩衝液で洗浄し、再度遠心分離した（ブレーキをオフにした状態で１２００ｒｐｍにて４℃で２分間）。膵島を更に精製するために、ペレットを１０ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７溶液に再懸濁し、１０ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２でオーバーレイして勾配を設定した。勾配を、ブレーキをオフにした状態で２０００ｒｐｍにて４℃で２０分間遠心分離し、膵島を培地とＨｉｓｔｏｐａｑｕｅとの間の界面で採取し、２０ｍｌの解離緩衝液を含有する５０ｍｌのコニカルチューブに入れた。次いで、膵島を１２００ｒｐｍで２分間遠心分離し、２０ｍｌの解離緩衝液で洗浄し、再度遠沈し、膵島培養培地中に再懸濁し、滅菌シャーレに入れた。膵島を３７℃、５％ＣＯ_２加湿インキュベーターで、ｐＨ７．４で一晩かけて回収した。

イヌ由来：新鮮な膵臓を、ＮＩＨ共有協定により安楽死させたイヌから入手し、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＰ溶液を使用して総胆管を介して膨張させた。イヌ膵島を、Ｖｒａｂｅｌｏｖａ，ｅｔ ａｌ及びＷｏｏｌｃｏｔｔ，ｅｔ ａｌ［１５、１６］に記載された技術の改訂版に従って、膨張した膵臓から単離した。簡潔に言えば、膨張したイヌの膵臓を１５～２０片に切断し、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＰ溶液２０ｍｌを含有する５０ｍｌチューブに入れた。チューブを３７℃の水浴に入れ、シェーカーを１２０ｒｐｍに設定した。溶液中の膵島内容物を、５分間隔で採取した少量のサンプルから得られたジチゾン染色サンプルの顕微鏡検査によってモニタリングした。消化は、膵島の約５０％が腺房組織を含まなくなるまで続け、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ＋１％のＢＳＡを補充した２０ｍｌのＨＢＳＳで停止した。次いで、組織を４００μｍのスクリーンを通して穏やかにふるいにかけ、１００×ｇで４℃にて１０秒間遠心分離した。ペレットを１回洗浄し、２００×ｇ（４℃）で１０秒間遠心分離した。ペレットを１０ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１．１１９に再懸濁し、その上にゆっくりとＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１．０７７を重層し、続いて１０ｍｌの無血清培地の別の層を形成することにより、３つの層密度勾配を作り出した。勾配を７５０×ｇでブレーキなしで４℃にて２０分間回転させた。膵島を上層の界面から採取し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ＋１％ＢＳＡを補充したＨＢＳＳを含有する５０ｍｌのチューブに移した。精製した膵島懸濁液を無血清培地で洗浄し、２００×ｇ（４℃）で１０秒間２回遠心分離し、４０μｍの細胞ストレーナーに通した。各調製物から５つの５０μｌアリコートを採取し、膵島収量を評価するために使用した。最後に、（腺房細胞内容物を除去するために）手で摘出した膵島を、２０％ＦＢＳ補充ＲＰＭＩ１６４０培地中、５％ＣＯ_２インキュベーターで３７℃にて培養した。

ヒト由来：ヒト膵島を、Ｐｒｏｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）から購入するか、又は他の合法的なヒトドナー組織の供給元から入手した。

実施例２：膵島細胞の培養及び脱分化
げっ歯類膵島細胞：回収したマウス膵島を手で摘出し、４０μｍフィルターストレーナーの上部で膵島を捕捉することによって更に精製した。膵島を次のように培養した：膵島細胞を、ラミニン－５１１コーティングされたウェル上に膵島全体を置き、膵島から膵島細胞がＲＰＭＩ１６４０＋２０％ＦＢＳ＋ＧＰＳで９０％コンフルエントになるまで増生させることにより培養し、これは可逆的ＥＭＴを介して膵島細胞の脱分化をもたらした。この方法で培養すると、膵島細胞が更に精製され、残りの外分泌細胞が除去される。継代：マウス膵島細胞を約９０％のコンフルエントになるまで成長させた。次いで、膵島細胞をトリプシン化し（１×トリプシン－ＥＤＴＡを５～１０分間）、６００×ｇで５分間遠心分離によってペレット化し、ＤＭＥＭＦ１２＋２０％ＦＢＳ＋ＧＰＳで洗浄し、Ｔ７５フラスコに播種した。継代された膵島細胞を、ＤＭＥＭ－Ｆ１２＋２０％ＦＢＳ＋ＧＰＳ中で培養した。この方法で培養すると、膵島細胞が更に精製され、腺房細胞及び管房細胞が除去される。

イヌ膵島細胞：初期培養：回収したイヌ膵島を手で摘出し、４０μｍのフィルターストレーナーの上部で膵島を捕捉することによって更に精製した。上記のマウスの場合と同様、細胞を膵島全体として培養した。継代：げっ歯類膵島細胞については上記を参照。

ヒト膵島細胞：細胞を膵島全体として培養し、上記のげっ歯類の場合と同様に継代した。

実施例３：ＡＳＣ及びＭＳＣの分離及び培養
ＡＳＣ（マウス及びイヌ）：無菌条件下で、安楽死させた非糖尿病マウス又は非糖尿病イヌ（ＮＩＨ組織共有協定）から約３～１５ｇの腹部脂肪サンプルを採取し、約３０ｍｌの１×ＰＢＳを含有する別個の滅菌５０ｍｌコニカルチューブに入れ、氷上に置いた。脂肪サンプルを細分し、３ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ１を含有するＰＢＳのチューブに入れ、３７℃の振盪水浴中で約１時間消化した。チューブを遠心分離し（６００×ｇ、１０分）、細胞内容物をペレット化した。上清を慎重に除去し、ペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した後、１０ｍｌのＤＭＥＭ Ｆ１２＋ＧＰＳ＋１０％ＦＢＳ中に再懸濁し、培養した。細胞を、３７℃加湿５％ＣＯ_２インキュベーター内でｐＨ７．４にて培養した。培養培地を週２回交換した。初代培養が７０～８０％のコンフルエントに達したら、付着した細胞を、１×トリプシン／ＥＤＴＡに３～５分間さらすことによって継代し、更に１０％ＤＭＳＯ中で継代又は凍結保存した。

非糖尿病ヒトＡＳＣをＬｏｎｚａ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からＰ１で購入し、上記のように培養した。

ＭＳＣ（げっ歯類由来）：安楽死させたマウスのフラッシュされた大腿骨から得られた細胞懸濁液を、ＤＭＥＭ－Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ＋ＧＰＳを含有するＴ２５フラスコにプレーティングした。細胞を、３７℃加湿５％ＣＯ_２インキュベーター内で培養した。培養培地を週２回交換した。初代培養が７０～８０％のコンフルエントに達したら、細胞を１×トリプシン／ＥＤＴＡで３～５分間剥離し、１０％ＤＭＳＯ中で継代又は凍結保存した。

細胞クラスター形成に先立ち、培養されたＭＳＣ又はＡＳＣは、（ｉ）ＣＤ４４及びＣＤ９０の発現、並びにＣＤ４５、ＣＤ３４及びＤＬＡ－ＤＲ抗原の陰性発現に対するＦＡＣＳ、並びに（ｉｉ）前述のように三系統分化（脂肪形成性、骨形成性、軟骨形成性）を受ける能力によって特徴付けられる［１７］。細胞クラスター形成に先立ち、培養され、脱分化されたイヌ膵島細胞は、（ａ）ＦＡＣＳによって調べられ、ＤＬＡ－ＤＲ、ＣＤ９０及びＣＤ１３３の発現が陰性であることが確認され、（ｂ）ｒｔＰＣＲによってインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド、ｐｄｘ－１、及びｎｋｘ６．１の残存膵島細胞遺伝子発現が調べられる。二酢酸フルオレセイン（ＦＤＡ）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて、次のとおり細胞生存率を評価した：１×染色溶液（１μＬの５ｍｇ／ｍｌ ＦＤＡ及び５μＬの１ｍｇ／ｍｌ ＰＩを１００μＬ ＰＢＳに溶解した）を１００μＬ ＰＢＳ中の細胞と混合し、室温で３０秒間インキュベートし、蛍光顕微鏡を用いて細胞を撮像した。赤、緑、総細胞数を４つのフィールドでカウントした。

実施例４：インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ－１）の誘導
イヌＡＳＣを、イヌインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）に応答するＩＤＯ－１の誘導について、次のとおりＰ２で試験した。８枚の３５ｍｍ培養皿に、各々０．５×１０^６個のイヌ由来ＡＳＣをＤＭＥＭ Ｆ１２＋１０％イヌ血清中に播種した。１０ｎｇ／ｍｌのイヌＩＮＦγを４枚の皿に加えた。３７℃加湿５％ＣＯ_２インキュベーター内で一晩かけて培養した後、全ての皿から細胞を採取し、ｒｔＰＣＲでＩＤＯ－１遺伝子発現についてアッセイした。ＩＦＮγ処置培養物からの結果を、同じ継代番号の非曝露細胞の結果に正規化し、Ｌｏｇ１０ＲＱで表した。

実施例５：細胞クラスター形成及びインビトロ特性決定
基本原理：（Ａ）（ｉ）脱分化した、培養増殖した膵島細胞と（ｉｉ）膵島に自然に存在するよりもはるかに多い数のＭＳＣ／ＡＳＣとを組み合わせたものを含む細胞クラスターが形成され得るかどうかを試験する。（Ｂ）かかる細胞クラスターが膵島細胞関連遺伝子を発現しているか、又は発現するように誘導することができるかどうか、そしてどの程度まで発現するかを決定する。

方法
膵島細胞の増生：膵島細胞を、（１）トリプシンで解離し、細胞をラミニン－５１１及び／又はラミニン－４１１（２０μｇ／ｍｌ）でプレコートした組織培養（ＴＣ）ウェル又はフラスコにプレーティングするか、又は（２）膵島全体をラミニン－５１１及び／又はラミニン－４１１でコートしたＴＣウェルにプレーティングした。図１を参照。いずれの場合も、細胞を培養し、サブコンフルエンスまで、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＰＳ）＋エクセンディン－４（げっ歯類細胞培養の場合、１０ｎＭのＧｌｐ－１）を補充したＲＰＭＩ又は他の適切な成長培地で増殖させた（全てのサプリメントは市販されている）。このプロセスには約１～２週間かかる。膵島細胞は、インスリン存在の免疫組織化学（ＩＨＣ）、インスリン酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、グルコース刺激インスリン放出アッセイ（ＧＳＩＳ）、遺伝子発現プロファイル（ｒｔＰＣＲ）、及びインスリン１遺伝子プロモーターのコントロール下で緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）をトランスジェニックしたマウス細胞株から判断して、数日以内に分化した［１］。図２及び図８Ａ～８Ｃを参照。

細胞クラスター形成：ＡＳＣ（Ｐ１～Ｐ４）又はＭＳＣ（Ｐ１～Ｐ５）及び膵島細胞（Ｐ１～Ｐ２）を、超低付着表面培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ，ＭＥ）で１：１の比で共培養し、一晩かけてＮＩを形成させた。対照ＡＳＣ及び膵島細胞クラスターを同じ方法によって形成した。インビボ投与に先立ち、ＮＩのサンプルを、膵島及びＭＳＣ関連遺伝子の発現についてｒｔＰＣＲで試験した（下記を参照）。

共焦点顕微鏡検査のための染色：ＡＳＣ又はＭＳＣをＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（緑色）で染色し、継代された膵島細胞を、製造元の指示に従うことによって、親油性トレーサーＤｉＩ（赤色）で染色した。細胞染色後、ＮＩを形成し、採取し、１０％ホルマリン中で固定し、その核を共焦点顕微鏡検査の前に、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）で染色した。

細胞クラスターの親油性トレーサーＤｉＲ標識は、製造者の指示に従って行った。

細胞クラスターの再分化：２ステップのプロセスで、市販の添加剤を用いてインビトロで細胞クラスターの再分化を達成した。ステップ１：げっ歯類、イヌ又はヒト起源の細胞クラスターを、５．６ｍＭのＤ－グルコースを含有し、（ａ）１％ＢＳＡ画分Ｖ、（ｂ）ＩＴＳ－Ｇ、（ｃ）ＧＰＳを補充した無血清ＤＭＥＭ中で６～８日間培養した。ステップ２：６～８日後、この培地を再分化培地（ＲＤＭ）に置き換え、２週間培養した。ＲＤＭは、２５ｍＭのグルコースを含有し、（ａ）Ｎ２サプリメントＡ（市販品）、（ｂ）ＳＭ－１サプリメント（市販品）、（ｃ）１０ｍＭのニコチンアミド（市販品）、（ｄ）１０ｎＭのエクセンディン４（市販品）、（ｅ）２ｎＭのアクチビンＡ（市販品）を補充したＤＭＥＭである。以下に記載されるように、再分化を試験し、膵島及びＭＳＣ関連遺伝子の発現をｒｔＰＣＲで確認した。

細胞クラスター細胞比の評価：各生物種（マウス、イヌ、ヒト）について、上記のようにＡＳＣ及びＩＣの接着性培養物を採取した。ＡＳＣをＩＣと区別することができるように、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで緑色に染色した。染色効率をＦＡＣＳで評価し、≧９５％と決定した。ＩＣは染色しないままにした。ＮＩを、２ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ中１ウェル当たり０．５×１０^６個のＡＳＣ及び０．５×１０^６個のＩＣを用いて、上記のように６ウェル超低接着プレート中で一晩かけて形成した。翌日、ＮＩを採取し、１ウェル当たり１ｍｌのＡｃｃｕｍａｘで３０分間インキュベーションすることにより、単一細胞調製物へと解離させた。次いで、単一細胞調製物を１×ＰＢＳ＋１％ＢＳＡに再懸濁し、ＦＡＣＳ （ＢＤ ＦＡＣＳｃａｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により、緑色（ＡＳＣ）対非染色（ＩＣ）細胞の割合について解析した。

ｒｔＰＣＲ：ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて、汚染ＤＮＡを除外するＤＮａｓｅ消化ステップを含み、製造元の指示に従って１ｘ１０^６個の細胞サンプルから抽出した。逆転写は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素を用いて、４２℃で６０分間行った。リアルタイムＰＣＲを、種特異的ＴａｑＭａｎプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＡＢＳ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、製造元の指示に従って２連で行った。全ての反応を、ＵＮＧ付きＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩを用いて、総容量２０μＬで行った。反応条件は、５０℃で２分間、続いて９５℃で１０分間開始し、９５℃で１５秒間誘拐し、６０℃で１分間アニーリングを４０サイクル行った。全てのサンプルを２連で行い、平均閾値サイクル（Ｃｔ）値を計算に用いたＡＢＳ７５００リアルタイムＰＣＲシステムを使用して、リアルタイムＰＣＲをモニタリングした。各標的遺伝子の相対定量（ＲＱ、正規化）は、機器に付属のＡＢＳソフトウェアを使用してＣｔ法で計算し、２つの内部ハウスキーピング遺伝子、ベータアクチン及びベータ２マイクログロブリン（Ｂ２ｍ）に正規化することによって計算した。ＲＱは、指示どおり外部コントロールに正規化し、装置に付属のソフトウェアを用いて計算した。結果をｌｏｇ１０（ＲＱ）±ｌｏｇ１０（ＲＱｍｉｎ及びＲＱｍａｘ）として提示する。ｌｏｇ１０（ＲＱ）２よりも大きい、又はｌｏｇ１０（ＲＱ）－２よりも小さい差を有意とみなした。利用したＰＣＲプライマーを次の表に列挙する。

結果
ＩＣ及びＭ／ＡＳＣの増殖及び特性評価：ＮＩの出発物質、すなわち、培養ＩＣ及びＭ／ＡＳＣを以下のように得た。非糖尿病マウス、イヌ、及びヒトからの新たに単離された膵島を生存率について試験し、培養し、上記の実施例に記載されるように成長及び継代した。ＩＣは膵島から成長し、ＥＭＴを受けるにつれて増殖し、分化し、これは可逆的なプロセスである。培養ＩＣは、継代とともに減少する残存ＩＣ関連遺伝子発現プロファイルを保持し、Ｍ／ＡＳＣの遺伝子発現パターンとは異なる遺伝子発現パターンを示す（図３）。全てのＩＣは、ＮＩ形成及び実験のためにＰ１～Ｐ２で使用した。ＭＳＣ及びＡＳＣを非糖尿病マウス、イヌ及びヒトから得て、実施例３に記載されるように培養及び特性決定した。全てのＭＳＣ及びＡＳＣは、培養皿接着、三系統分化を受ける能力、特徴的な細胞表面エピトープの発現、及び重要なことに、Ｉ－Ａ［ｂ］（マウス）／ＤＬＡ－ＤＲ（イヌ）／ＨＬＡ－ＤＲ（ヒト）移植抗原の発現がないという最小限の基準を満たした。ＩＦＮγへのイヌＡＳＣの曝露は、膵島炎などの炎症状態におけるＴ細胞応答の重要な阻害剤であるインドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ－１）遺伝子発現（図４Ａ～４Ｄ）を有意に誘導した。Ｍ／ＡＳＣは、ＮＩの形成及び実験のためにＰ１～Ｐ５で使用した。ＩＣ及びＭ／ＡＳＣはともに核型（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａ ＆ Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＴＸ）であり、正常であることが見出された。

細胞クラスターの形成及びイメージング：図１は、細胞クラスター形成及び提案された使用の概略図を示す。図に示すように、脱分化された膵島細胞及びＡＳＣ又はＭＳＣを使用して、Ｔ１ＤＭ又はＴ２ＤＭ；脱分化された膵島細胞及びＡＳＣ又はＭＳＣを処置するための膵島細胞特異的タンパク質を産生するように誘導され得る細胞クラスターを形成した。膵島細胞は、最初に膵島（マウス、イヌ又はヒト）から増生し、１つ以上の継代のために脱分化及び増殖させた。いったん脱分化されると、かかる細胞は、それぞれ、著しく減少した膵島細胞特異的遺伝子又はタンパク質を発現及び産生するか、又は全く発現及び産生しない。ＡＳＣ又はＭＳＣを、最大４つの継代までの標準方法によって培養した。各細胞型の十分な数が利用可能になると、２つの細胞型を低接着フラスコで共培養して、膵島サイズの細胞クラスターを形成することができる。

図２は、本明細書に記載される方法で膵島細胞を培養した結果生じた増生及び上皮間葉系移行を示す。この現象を説明するために、緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）がインスリン１（ｉｎｓ１）遺伝子プロモーターのコントロール下にあるトランスジェニックＣ５７Ｂｌ／６、ｉｎｓ１ｇｆｐ＋マウスを使用した［１］。膵島β細胞のみがインスリン１遺伝子を発現するため、この株から単離されたインスリン遺伝子発現β細胞は緑色に見え、ひいては容易に識別可能である。パネルＡは、ｉｎｓ１－ｇｆｐ＋マウスから単離された膵島全体を示す。これらの膵島を、上記のようにラミニン－５１１でコートしたプレート上で培養した。図２のパネルＢは、６日間の培養後のＩｎｓ１ｇｆｐ＋膵島全体である。膵島細胞が付着したインスリン遺伝子発現は依然として顕著であったが（緑色細胞）、細胞は膵島から分離して増殖しており、これらの細胞ではインスリン遺伝子発現が下方制御されている（細胞はもはや緑色ではない）。このことは図２のパネルＣにより完全に示されており、培養前に膵島を解離させるためにトリプシン化され、次に固定され、インスリンタンパク質（赤色）で染色されたＩｎｓ１ｇｆｐ＋膵島細胞が描写されている。細胞が緑色又は黄色である場合、ｉｎｓ１遺伝子は依然として活発に転写及び翻訳される。細胞が赤色のみに見える場合、インスリンタンパク質が存在するが、緑（又は黄）色の欠如は、遺伝子が下方制御されていることを示す。最後に、図２のパネルＤは、細胞分裂を追跡するためにＥｄＵの存在下で成長させたＩｎｓ１ｇｆｐ＋膵島細胞を示す。これらの細胞を固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ（核、青色）及びＥｄＵ（赤色）で染色した。ｉｎｓ１遺伝子翻訳が起こっている細胞は緑色に見える。分裂している細胞の核は赤く見える。画像で見てわかるように、分裂していない細胞は明るい緑色であり、円形の上皮形態を有するが、分裂している細胞（赤い核）は細長い間葉系の外観を呈しており、インスリン遺伝子発現の下方制御を示している。

おおよその膵島サイズのＮＩは、骨髄由来ＭＳＣ又はそれらの脂肪由来類似体ＡＳＣ（Ｍ／ＡＳＣ）を、超低細胞接着系において１：１の比（最適であることが判明）で培養増殖マウス膵島細胞（ＩＣ）とともに一晩共培養することによって調製した。マウス細胞を用いたこのプロセスの例を図５に示す。かかるマウスＮＩの潜在的な翻訳的関連性を更に評価するために、本発明者は、同等のＮＩがイヌ及びヒトＩＣ並びにＭ／ＡＳＣの両方から容易に生成され得ることを確認した。緑色蛍光タンパク質陽性（ｇｆｐ＋）Ｃ５７Ｂｌ／６マウスＭＳＣ及びＣ５７Ｂｌ／６マウス膵島細胞を成長させた。次いで、２つの細胞型を低接着プレート中で培養し、形成された細胞クラスターを形成した。ＡＳＣ（緑色）及び膵島細胞（赤色）の単一のマウス、イヌ及びヒト細胞クラスターの共焦点画像（６３倍）を、図６の左、中央、及び右の画像にそれぞれ示す。見てわかるように、マウス、イヌ、又はヒト起源のいずれかの細胞クラスターの場合、内分泌及び幹細胞は、細胞クラスター全体に均等に分布する。ＮＩにおける各細胞型の割合を以下のように更に評価した。イヌＡＳＣをＣｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎで染色し、上記のように１：１の比で未染色の膵島細胞と共培養した。ＮＩが形成された後、それらをＡｃｃｕｍａｘとともに単一細胞と解離し、オンライン法に記載されるようにＦＡＣＳによって解析したところ、形成後２４時間で、ＮＩは約５０％のＭ／ＡＳＣと５０％のＩＣとで構成されていることが明らかとなり（図７Ａ）、両方の細胞型が、形成後のＮＩ内で１：１の比率で維持されていることが更に示された。

マウス、イヌ及びヒト細胞クラスター遺伝子発現プロファイル及びグルコース刺激インスリの分泌：これらの細胞クラスターは有意なレベルのインスリンを発現しないが、培養された膵島細胞は培養時に上皮から間葉系への移行を受けるので、膵島細胞遺伝子を再発現するように、上記の再分化プロトコルを使用してインビトロで再分化することができる。図５に示す２つの細胞型（ＩＣ及びＭ／ＡＳＣ）を組み合わせてＮＩを形成すると、ＮＩ遺伝子発現パターンは両方の細胞型の特徴を示した。図８Ａは、再分化培地（左側）に曝露してから１４日後のマウス（上）及びイヌ（下）細胞クラスターの膵島遺伝子発現プロファイルを、新しく単離されたマウス又はイヌの膵島（右側）のものと比較して示す。遺伝子発現プロファイルの両方のセットを、新しく形成された脱分化マウス（上）又はイヌ（下）細胞クラスターのものに正規化した。これらの結果は、新しく形成されたマウス及びイヌ細胞クラスターが、試験された全ての低レベルの膵島関連遺伝子を発現し、これらの遺伝子のより高いレベルを発現するために再分化を受ける能力を有することを示している。新しく形成されたＮＩは、インビトロでグルコースに応答してインスリンを分泌することができたが、無傷の膵島の約１００分の１であった。図８Ｂは、それらの種から新しく単離された膵島と比較して、ＭＳＣ又はＡＳＣから作製された新しく形成されたマウス（上）、イヌ（中央）及びヒト（下）細胞クラスター、並びにＰ１（左）又はＰ２（右）のいずれかの膵島細胞の遺伝子発現プロファイルを示す（正規化）。このパネルで見てわかるように、新しく形成されたマウス、イヌ、及びヒト細胞クラスターは全て、低レベルの膵島関連遺伝子、並びにＡＳＣ／ＭＳＣ（ｖｅｇｆ－α、ｃｘｃｌ１２、ｔｇｆβ１及びｉｇｆ１）に関連する遺伝子を発現し、これらの種のそれぞれについて、膵島細胞遺伝子の発現は、膵島細胞の継代数が増えるにつれて減少する。図８Ｃに示されるように、２５ｍＭのグルコースへの曝露に応答して、５０個の新しく形成されたＣ５７Ｂｌ／６マウス細胞クラスター（Ｐ１膵島細胞及びＰ５ ＭＳＣ、クロスハッチバー）によるグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）は、５０個の新しく単離されたＣ５７Ｂｌ／６マウス膵島（空白のバー）の約１％である。これは、図８Ｂに見られるインスリン遺伝子発現の減少に類似する。

結論：以上より、これらの結果は、（ｉ）培養された膵島細胞及びＭＳＣ又はＡＳＣのいずれかの細胞クラスターがインビトロで容易に形成され得ること、（ｉｉ）生物種間（マウス、イヌ、ヒト）において、かかる細胞クラスターが外観及び遺伝子発現プロファイルについて類似しており、低レベルの膵島関連遺伝子を発現すること、（ｉｉｉ）生物種間（マウス、イヌ、ヒト）においてかかる細胞クラスターがインビトロで再分化されて膵内分泌関連遺伝子を再発現することが可能であることを示している。更に、これらの結果は、これらの細胞クラスターが、インスリン依存性及び非インスリン依存性糖尿病ヒト又は動物の治療における治療的用途であり得ることを示唆している。

実施例６：糖尿病自然発症ＮＯＤマウス及びＳＴＺ糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにげっ歯類、イヌ、ヒトの細胞クラスターをＩ．Ｐ．投与した場合のインビボ、用量試験及び原理研究
動物モデル
動物を含む全ての研究は、実験動物の管理及び使用に関するＮＩＨ指針（ｔｈｅ ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）を遵守して行われ、施設の獣医師及びＩＡＣＵＣのメンバーによって監督及び承認されたマウス及びラットを、ジャクソン研究所（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）又はハーラン（Ｈａｓｌｅｔｔ，ＭＩ）のいずれかから購入し、恒温恒湿、通常の靴箱型ケージ内で１２：１２時間の明暗サイクルで収容した。別段の指示がない限り、全てのマウス及びラットは、標準的な食餌及び水道水を自由に摂取できた。全てのマウス実験は、体重が１５～３５ｇの雌のＣ５７Ｂｌ／６、雌のＮＯＤ又は雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを使用して実施した。全てのラット実験は、体重が５３８～６５０ｇの雄のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット上で行った。

ポリデキストラン粒子腹膜網取り込みプロトコル
５３８～６５０ｇの体重の４匹の２歳のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットを麻酔し、正常生理食塩水中に１：１懸濁された５ｍｌのポリデキストラン粒子（ＰＤＰ；滅菌ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ－２５、粒径８７～５１０μｍ）でｉ．ｐ．処置した。投与後７日目に、動物を屠殺し、その腹膜網及び他の臓器を採取し、ＰＤＰの存在について調べた。

糖尿病モデル
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）：非肥満型糖尿病／重症複合免疫不全症（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）及びＣ５７Ｂｌ／６マウスを、５０～７５ｍｇ／ｋｇ ｂ．ｗを３～５回（１日１用量）ｉ．ｐ．投与して糖尿病にした。ＳＴＺ、２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に新たに溶解した。非空腹時血中グルコースレベルが３つの別々の日に３００ｍｇ／ｄＬを超えた時点でマウスは糖尿病であるとみなした。

自然発症：雌のＮＯＤマウスは、１２～２０週齢の間にＴ１ＤＭを自然発症する。非空腹時血中グルコースレベルが３つの別々の日に３００ｍｇ／ｄＬを超えた時点でマウスは糖尿病であるとみなした。インスリン処置：結果及び図面に示すように、インスリンを、徐放性皮下インスリンペレット（Ｌｉｎｂｉｔ）を介して糖尿病動物に投与した。動物をイソフルランで麻酔し、１～３個のＬｉｎｂｉｔペレットを製造元の指示に従って皮膚の直下に挿入した。尾静脈血中グルコース濃度を数日間モニタリングし、動物が高血糖でも低血糖でもないことを確認した。

血中グルコースモニタリング：全ての動物研究において、血中グルコース濃度を、尾静脈サンプリングを介して週２回、ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ ２グルコメータ（検出レベル、２０～６００ｍｇグルコース／ｄＬ）を用いて評価した。麻酔：動物を、吸入げっ歯類麻酔システム（Ｅｕｔｈａｎｅｘ、Ｐａｌｍｅｒ，ＰＡ）を用いて、１～５％のイソフルランで麻酔した。直腸温度を、加熱された外科用ウォーターベッド（Ｅｕｔｈａｎｅｘ、Ｐａｌｍｅｒ，ＰＡ）を用いて３７℃に維持した。

Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの同種ＮＩによる糖尿病ＮＯＤマウスの処置：糖尿病ＮＯＤマウスの血中グルコースレベルをＬｉｎｂｉｔで正規化し、Ｌｉｎｂｉｔ投与後２０日目に軽度のイソフルオラン麻酔を用いて、Ｐ５ ｅＧＦＰ＋ＭＳＣとＰ１膵島細胞とで構成されたＮＩ（０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地中に懸濁された２×１０^５個のＮＩ／ｋｇ ｂ．ｗｔ、Ｎ＝６）又はビヒクル（０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地中、Ｎ＝６）を無菌的にｉ．ｐ．投与した。その後、いずれの群にも外因性インスリンの投与は行われなかった。ＮＩ投与後１０週目で、マウスを安楽死させ、それらの腹膜網、肝臓、脾臓、肺、腎臓、及び膵臓を採取し、蛍光顕微鏡によってｅＧＦＰ＋ＮＩの存在について調べた。また、ＮＩを構成する細胞に対する同種ＩｇＧ応答を試験するために、血清を採取した。この試験のための陽性対照として、３匹のＮＯＤマウスの追加群にＬｉｎｂｉｔを投与し、０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２中に懸濁された２×１０^５個の新しく単離された同種膵島／ｋｇ ｂ．ｗｔでｉ．ｐ．処置した。これらのマウスを、膵島投与１４日後に安楽死させ、血清を採取し、上記のように調べた。

同種移植ＮＩ、ＡＳＣクラスター又はＩＣクラスターによるＳＴＺ糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウス処置：（Ｌｉｎｂｉｔを介して）１０週齢、ＳＴＺ糖尿病、血中グルコースコントロール（Ｃ５７Ｂｌ／６マウス）の４つの群に、（ｉ）０．５ｍｌのビヒクル（無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２、Ｎ＝６）、又は２×１０^５／ｋｇ ｂ．ｗｔ、（ｉｉ）新しく形成されたＮＩ（Ｐ５ ｅＧＦＰ＋ＭＳＣ及びＰ１ ＩＣ、Ｎ＝６）、（ｉｉｉ）Ｐ１ ＡＳＣのみで構成されるクラスター（Ｎ＝５）、又は（ｉｖ）Ｐ１ ＩＣのみで構成されるクラスター（Ｎ＝５）をｉ．ｐ．投与した。指示どおりにマウスを追跡した。安楽死させたら、腹膜網、膵臓、脾臓、肝臓、肺及び腎臓を採取し、ｅＧＦＰ＋ＮＩの存在を透視検査した。更に、膵島関連遺伝子発現プロファイルが、全ての腹膜網及び膵臓において得られた。

マウス又はイヌＮＩによる非糖尿病マウスの処置：マウスＮＩ：２～４匹の、１２週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスの６つの群に、各々、（ｉ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２中に懸濁された２×１０^５／ｋｇ ｂ．ｗｔの新しく形成された同種移植ＮＩ（Ｐ５ ＭＳＣ及びＰ１ ＩＣ）、又は（ｉｉ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２（ビヒクル）のいずれかをｉ．ｐ．投与した。マウスを最大１２週間追跡した。イヌＮＩ：９週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの２群を、（ｉ）０．５ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｎ＝６）中に懸濁された２×１０^５／ｋｇ ｂ．ｗｔの新しく形成されたｃＮＩ、又は（ｉｉ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２（ビヒクル、Ｎ＝３）でｉ．ｐ．処置した。マウスを１０週間追跡した。

結果
臨床的に非常に有益な自己免疫ＴＩＤＭモデルにおける中心的仮説を検証するために、本発明者はまず、インビトロで生成された同種ＮＩのｉ．ｐ．投与が、（ｉ）その生存、（ｉｉ）ＮＩに含有される膵島細胞のインビボでの機能的インスリン産生細胞への再分化、及び（ｉｉｉ）移植された細胞クラスターのＭＳＣ媒介性細胞保護、同種免疫保護及び自己免疫保護の反映として、糖尿病自然発症ＮＯＤマウスにおける正常血糖を再確立できるかどうかを調べた。

同種ＮＩによる糖尿病自然発症ＮＯＤマウスの処置他の研究者は、膵島前駆細胞及び脱分化された膵島β細胞がインビボで機能的内分泌細胞に分化できることを見出したので、本発明者は、Ｔ細胞媒介の自己免疫形態のＴ１ＤＭを発症する糖尿病自然発症ＮＯＤマウスにｉ．ｐ．投与した本明細書に記載される同種マウスＮＩが、正常血糖を再確立するかどうかを試験した。このプロトコルは、Ｔ１ＤＭ患者が同種膵臓又は膵島移植を受ける最も一般的な臨床状況によく似ているために選択された。インビボ追跡と死後局在化との両方を容易にするために、投与されたＮＩをＤｉＲで二重標識し、全ての組織で構成的に発現されるｅＧＦＰ遺伝子をトランスジェニックしたＣ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＰ５ ＭＳＣと、野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスのＰ１ ＩＣとから構成されていた（図５を参照）。他の研究者は、インスリンによる血中グルコースレベルの正規化が、インビボで膵島細胞からインスリン産生細胞への再分化を促進し、同時に移植細胞に対する糖毒性作用を低下させることを実証している。したがって、移植されたＮＩに対する潜在的な糖毒性作用を回避し、移植されたＩＣの内分泌再分化を刺激するために、１２匹の雌の糖尿病自然発症ＮＯＤマウスの血中グルコースレベルを、投与後３０～４０日間持続する効果であるインスリン放出ペレット（Ｌｉｎｂｉｔ）の皮下投与で正規化した。

次いで、これらのマウスを２つの群に分け、いずれかを２×１０^５／ｋｇ．ｂ．ｗｔでｉ．ｐ．処置した。同種Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｎ＝６）又はビヒクル（Ｎ＝６；図９）からのＮＩ。予想どおり、Ｌｉｎｂｉｔ処置後３５～４０日目までに、ビヒクル処置ＮＯＤマウスにおいて高血糖が再発したが、驚くべきことに、ＮＩ処置動物における血中グルコースレベルは正常に近いままであった（図９）。ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを同種移植（イヌ）ＮＩで、ＳＴＺ糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを異種移植（イヌ）ＮＩで処置したとの並行実験において、同様の正常血糖の回復が達成された（図１４Ａ及び１４Ｂ）。

合わせて、これらのデータは、（ｉ）ＮＩが生着して生存し、（ｉｉ）ＮＩ内のＩＣがインビボで再分化し、マウスに新たな内因性のインスリン源を提供し、（ｉｉｉ）ＮＩに含有されるＭＳＣが、ＮＯＤマウスにおけるインスリン産生細胞の細胞保護並びに同種及び自己免疫分離を効果的に提供し、この臨床的に非常に関連性の高いＴ１ＤＭモデルにおける血糖コントロールを明らかに確立したことを示している。

ＮＩにおける膵島細胞とＭ／ＡＳＣとの協働が、糖尿病動物における正常血糖の確立に不可欠である。ＮＩにおけるＩＣとＭ／ＡＳＣとの協働を更に探求するために、２つの実験を行い、図１０Ａ～１０Ｃに要約する。これらにおいて、免疫能力のあるＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＴ１ＤＭの容易にコントロール可能なストレプトゾトシン（ＳＴＺ）モデルを使用した。第１の群では、ＳＴＺ糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、２×１０^５／ｋｇ．ｂ．ｗｔの同種移植ＮＩ又はビヒクルでＩ．Ｐ．処置した。第２の群では、ＳＴＺ糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＡＳＣ（Ｐ１）又は継代されたＩＣ（Ｐ１）のいずれか単独で構成される２×１０^５／ｋｇ．ｂ．ｗｔの対照クラスターでＩ．Ｐ．処置した（図１１）。重要なことに、各々生成された細胞クラスターにおける細胞の総数は、ＮＩにおける細胞の総数と同一であった（１個のクラスター当たり約１，０００個の細胞）。ＮＩ処置群からの３匹のマウス、及び対照群からの全てのマウスを、１２週目に安楽死させた。残りの３匹のＮＩ処置マウスを２１週間追跡した。長期（２１週間）の正常血糖が、同種移植ＮＩでＩ．Ｐ．処置したＳＴＺ糖尿病Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて得られた。重要なことに、ＡＳＣ又は培養ＩＣ単独のいずれかで構成される同一に生成された対照クラスターによる処置は、ＩＣクラスターが与えられたときに血中グルコースレベルを最小限に低減させただけであり（図１０Ａ）、インスリン産生細胞の最適な再分化を促進するために、ＩＣ及び幹細胞の両方がＮＩ内に存在しなければならないことを実証している。

インビボ再分化。ＮＯＤマウス実験（図９）並びに回収された腹膜網（図１８Ｂ）からのデータは、ＮＩがインビボで再分化して、マウスを正常血糖にするのに十分なインスリン及び他の膵島ホルモンを産生することを示唆している。実際、２１週目にＣ５７Ｂｌ／６ ＮＩ処置された正常血糖のマウスから回収された腹膜網は、ＮＩの生着と、それらを処置したＮＩと比較して有意に増加したインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及びＰｄｘ１遺伝子発現との両方を示した（図１０Ｂ）。これは、膵島ホルモンを発現する膵島細胞のインビボでの再分化が効果的であることを明確に示している。更に、ＳＴＺ糖尿病マウスの全膵臓におけるＩｎｓ１及びＩｎｓ２の発現は、予想されるように、全ての動物において有意に低減し（図１０Ｃ）、ＮＩ処置マウスにおける正常血糖は、腹膜網に生着されたＮＩによって提供される生理学的インスリン分泌によって達成され、残存膵臓インスリンによっては達成されなかったことを示す。

実施例７：ＳＴＺ－糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにイヌ細胞クラスターをＩ．Ｐ．投与した場合のインビボ、用量試験及び原理研究
基本原理：実施例５において、ＡＳＣ及び脱分化された膵島細胞の新しく形成された細胞クラスターは、低レベルの膵島関連遺伝子、並びにＡＳＣ／ＭＳＣ関連遺伝子を発現することが示された。また、かかる細胞クラスターの内分泌由来成分は、インビトロで再分化して、より高いレベルの膵島関連遺伝子を再発現する能力を有することが観察された。他の研究者は、内分泌前駆細胞がインビボで再分化してインスリンを産生できることを示している。したがって、本発明者は、（ｉ）イヌＡＳＣ及び脱分化された膵島細胞を含む細胞クラスターが高血糖を用量依存的に逆転させ、動物の生存に影響を及ぼすことができるかどうか、そして（ｉｉ）細胞クラスターの除去が高血糖の再発をもたらすかどうかを試験し、細胞クラスターがＴ１ＤＭの得られる治療に専ら関与していることを確認した。

方法
細胞クラスター：細胞クラスターは、イヌＡＳＣ（継代２）及びイヌ培養膵島細胞（継代１）から形成された。

糖尿病モデル：非肥満型糖尿病／重症複合免疫不全症（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスを、クエン酸緩衝液中の５回のｉ．ｐ．用量の５０ｍｇ／ｋｇ体重ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で糖尿病にした。血中グルコースレベルが３つの別々の日に３００ｍｇ／ｄＬを超えたら、血中グルコースレベルをコントロールし、それによって糖毒性細胞損傷を回避するために、マウスに０日目に各々１つの徐放性インスリンペレット（Ｌｉｎｂｉｔ、Ｌｉｎｓｈｉｎ，Ｃａｎａｄａ）をｓ．ｃ．で与えた。これらのペレットは約３６日間で失効する（図１２参照）。動物を、（ａ）２００，０００又は（ｂ）８０，０００個の新しく形成された、再分化されていないイヌ由来の細胞クラスター／ｋｇ体重、又は（ｃ）ビヒクル（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）でｉ．ｐ．処置した。いくつかの研究では、ＮＩを７６日目に外科的に除去し、マウスを更に２週間追跡した（図１３を参照）。

腹腔内耐糖能試験（ＧＴＴ）：処置後５５日目に、３匹のビヒクル処置マウス及び５匹のイヌ細胞クラスター処置マウスを５時間絶食させ、ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ ２グルコメータ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ；２０～６００ｍｇグルコース／ｄＬの検出限界レベル）を用いてベースライン血中グルコースレベルを評価した。次いで、動物を麻酔し、２ｇのグルコース／ｋｇ ｂｗ（無血清培地に溶解し、滅菌されたフィルター）を、イソフルラン麻酔下でｉ．ｐ．注入によって投与した。血中グルコースレベルを、グルコース投与後３０分、６０分及び１２０分で評価した。

処置プロトコル
ＮＯＤ同種処置：雌のＮＯＤマウスが高血糖（３つの別々の日に非空腹時血中グルコースが３００ｍｇ／ｄＬを超える）であることが確認されたら、マウスをＬｉｎｂｉｔペレットでｓ．ｃ．処置した。動物の血中グルコースレベルが正規化されたら、それらを麻酔し（イソフルラン）、Ｐ５ ｇｆｐ＋ＭＳＣ及びＰ１膵島細胞（０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地に懸濁された２×１０^５個の細胞クラスター／ｋｇ ｂｗ、ｎ＝６）又はビヒクル（０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地、ｎ＝３）で構成された細胞クラスターをｉ．ｐ．投与した。その後、いずれの群の動物にも外因性インスリンは投与されなかった。血中グルコースレベル及び体重を週２回評価し、マウスを１０週間追跡した。細胞クラスター投与後１０週目で、動物を屠殺し、それらの血清、腹膜網、肝臓、脾臓、肺及び腎臓並びに膵臓を採取し、細胞クラスター及びインスリンの存在について調べた。腹膜網以外はどこにも見出せなかった。

ＳＴＺ糖尿病動物のＣ５７Ｂｌ／６同種移植処置：（Ｌｉｎｂｉｔにより）ＳＴＺ糖尿病の血中グルコースがコントロールされたＣ５７Ｂｌ／６マウスに麻酔をかけ、（ａ）ＤｉＲで染色し、０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２（ビヒクル、ｎ＝３）中に懸濁された２×１０^５個の新しく形成されたｇｆｐ＋マウス細胞クラスター（Ｐ５ ｇｆｐ＋ＭＳＣ及びＰ１膵島細胞）、又は（ｂ）ＤｉＲで染色し、ゲルフォームに埋め込まれた２×１０^５個の新しく形成されたｇｆｐ＋マウス細胞クラスター（ｎ＝３）のいずれかをｉ．ｐ．投与した。対照群動物を麻酔し、０．５ｍｌのビヒクル（ｎ＝３）でｉ．ｐ．処置した。血中グルコースレベル及び体重をベースラインで評価し、次いで、全ての動物において１８週間にわたって週２回評価した。週に１回、Ｌｉｃｏｒ社製Ｐｅａｒｌ Ｉｍｐｕｌｓｅイメージャを用いて、イソフルオラン麻酔下で動物を調べ、細胞クラスターを追跡した。屠殺時に、腹膜網、膵臓、脾臓、肝臓、肺及び腎臓を採取し、細胞クラスターの存在について調べた。腹膜網以外はどこにも見出せなかった。

非糖尿病マウスの処置：マウス細胞クラスター投与：２～４匹の非糖尿病、１２週齢の雌のＣ５７Ｂｌ／６マウス（平均体重２１．９ｇ）の６つの群を各々麻酔し、（ａ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２（追跡目的のために異なる時点で５つの群を屠殺した）中に懸濁された２×１０^５個の新しく形成されたマウス細胞クラスター（Ｐ５ ｇｆｐ＋ＭＳＣ及びＰ１膵島細胞）、又は（ｂ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２（ビヒクル、１つの群）のいずれかをｉ．ｐ．投与した。血中グルコースレベル及び体重をベースラインで評価し、次いで、最大１２週間にわたって週２回評価した。イヌ細胞クラスター投与：体重１９．７～２４．８ｇの非糖尿病、９週齢の雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの２群に、（ａ）０．５ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｎ＝６）中に懸濁された２×１０^５個の新しく形成された、ＤｉＲ染色されたイヌ細胞クラスター、又は（ｂ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２（ビヒクル、ｎ＝３）のいずれかでｉ．ｐ．麻酔投与した。血中グルコースレベル及び体重をベースラインで評価し、次いで１０週間にわたって週２回評価した。週に１回、Ｌｉ－ｃｏｒ社製Ｐｅａｒｌ Ｉｍｐｕｌｓｅイメージャを用いて、イソフルオラン麻酔下で動物を調べ、細胞クラスターを追跡した。屠殺時に、腹膜網、膵臓、脾臓、肝臓、肺及び腎臓を採取し、細胞クラスターの存在について調べた。腹膜網以外はどこにも見出せなかった。

ＮＯＤ／ＳＣＩＤ発症早期（ｒｅｃｅｎｔ ｏｎｓｅｔ）糖尿病、異種処置：血中グルコースレベルをＬｉｎｂｉｔペレットでコントロールした体重１７～２９ｇ（１群当たりｎ＝５）のＳＴＺ糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの雌マウス群を麻酔し、（ａ）２×１０^５又は（ｂ）８×１０^４のゲルフォームに埋め込まれた新しく形成された未再分化イヌ細胞クラスター／ｋｇ ｂｗ、又は（ｃ）ビヒクル（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）でｉ．ｐ．処置した。細胞クラスターは、Ｐ１膵島細胞とＰ２イヌＡＳＣとで構成された。血中グルコースレベル及び体重を週２回評価し、マウスを１３週間追跡した。ＩＰ ＧＴＴを、処置後５５日目に高用量群で実施し、１０週目にマウスの高用量群から細胞クラスターを外科的に除去した。

ＮＯＤ／ＳＣＩＤ発症後期糖尿病、異種処置：体重１８．４～２２．８ｇの１１週齢の雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、クエン酸緩衝液中に７５ｍｇ／ｋｇ体重ＳＴＺの３回のｉ．ｐ．用量で糖尿病にした。糖尿病状態は、３つの別々の日に３００ｍｇ／ｄＬを超える血中グルコースレベルによって確認された。動物が糖尿病であることが確認されたら、それらの血中グルコースレベルを、ｓ．ｃ．ｌｉｎｂｉｔペレットを用いたインスリン療法により約３ヵ月間コントロールした。全ての動物が細胞クラスター又はビヒクル投与前に依然として糖尿病であることを確認するために、Ｌｉｎｂｉｔを失効させ、マウスに高血糖を再発症させた。再度、マウスをＬｉｎｂｉｔ（０日目）で処置して、血中グルコースレベルをコントロールし、糖毒性細胞クラスター損傷を防止した。次に、麻酔したマウスを、（ｉ）ゲルフォームに埋め込まれた２×１０^５個の細胞クラスター／ｋｇ ｂ．ｗ．又は（ｉｉ）ビヒクル（０．５ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２）のいずれかでｉ．ｐ．処置した。細胞クラスターは、Ｐ１膵島細胞とＰ２イヌＡＳＣとで構成された。血中グルコースレベル及び体重を週２回評価し、マウスを１１週間追跡した。ＩＰ ＧＴＴ：処置後５５日目に、３匹のビヒクル処置マウス及び５匹の細胞クラスター処置マウスを５時間絶食させ、ベースライン血中グルコースレベルを評価した。次いで、動物を麻酔し、２ｇのグルコース／ｋｇ ｂｗ（０．５ｍｌの無血清培地に溶解し、滅菌したフィルター）を麻酔下でｉ．ｐ．注入により投与した。尾静脈血中グルコースレベルは、グルコース投与後３０分、６０分及び１２０分で評価した。

イヌインスリン用ＥＬＩＳＡ：耐糖能試験中に採取されたビヒクル及び細胞クラスター処置マウスからの血清を、製造元の指示に従って、マウスインスリン（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）と交差反応しないイヌ特異的インスリンの存在についてＥＬＩＳＡによって調べた。イヌ及びＣ５６Ｂｌ／６マウス由来の血清も、それぞれ交差反応性の陽性及び陰性対照として解析した。

抗体応答試験：約５×１０^４個の細胞（投与した細胞クラスターを作製するために使用したＭＳＣ、ＡＳＣ、又は膵島細胞）のアリコートを、細胞クラスター又はイヌＡＳＣ処置ＮＯＤマウスから得られた約５００μｌの血清とともに、細胞クラスター又はＡＳＣ投与の１４日以上後に各々インキュベートした。細胞を、血清とともに、３０分間、室温でインキュベートした。３０分後、細胞を６００×ｇで５分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ｃｙ３コンジュゲートヤギ抗マウス（希釈）ＩｇＧ抗体でインキュベートした。細胞を室温の暗所で更に２０分間インキュベートした。次いで、１ｍｌの１×ＰＢＳ＋１％ＢＳＡを添加し、細胞をボルテックスし、遠心分離し、４００μｌの固定緩衝液（１％ホルムアルデヒド）中に再懸濁し、ＦＡＣＳ（ＢＤ ＦＡＣＳｃａｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって解析した。細胞の７％を超えるシフトを陽性反応とみなし、血清に試験細胞に対する抗体が含有されていることを示した。ゲルフォームへの細胞クラスターの埋め込み：細胞クラスターの個々の用量を１５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに採取し、２００×ｇで２分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを各々０．２ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２に再懸濁した。次いで、細胞クラスター懸濁液を、０．５×０．５×０．５ｃｍの滅菌ゲルフォームブロックに充填し、マウスへのｉ．ｐ．投与前に３７℃のインキュベーター内で３時間インキュベートした。ゲルフォームに埋め込まれた細胞クラスターを、無菌条件下及び麻酔下で、レシピエントマウスの腹膜脂肪パッド及び腹膜網上に外科的に移植した。腹部切開を２層の縫合で閉じた。

インビボイメージング：ＤｉＲ染色された細胞クラスターのインビボイメージングを、Ｌｉ－Ｃｏｒ社製Ｐｅａｒｌ Ｉｍｐｕｌｓｅイメージャを用いて麻酔したマウスで実施した。

結果
ＳＴＺ後１ヵ月目に２×１０^５個の細胞クラスター／ｋｇ ｂｗを投与すると、正常血糖が達成され、維持され、動物の生存が促進される。３つの群で５匹ずつのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、ＳＴＺ誘発性Ｔ１ＤＭ糖尿病発症の約１ヵ月後に、（ａ）０．５ｍｌの無血清培地（ＤＭＥＭ－Ｆ１２）中に懸濁された２００，０００個又は（ｂ）８０，０００個の新しく形成された再分化されていないイヌ由来細胞クラスター／ｋｇ体重、又は（ｃ）ビヒクル（０．５ｍｌの無血清培地）をｉ．ｐ．処置した。ＳＴＺ投与の約１ヵ月後（図１２、１３、１４Ａ、及び１４Ｂの０日目）にＬｉｎｂｉｔを１回投与し、血中グルコースレベルが安定化したら、Ｌｉｎｂｉｔ投与の１２日後に細胞クラスター又はビヒクルを投与した。ビヒクル処置動物は、インスリン療法にもかかわらず、２１日目までに死亡し始めた（図１５参照）。図１２、１３、及び１４Ｂに示すように、Ｌｉｎｂｉｔが消耗すると、ビヒクル（空白のバー）で処置された残りの動物は再び高血糖になった。細胞クラスター処置糖尿病動物（黒色のバー及びクロスハッチバー）は、正規化された血中グルコースレベルを示し、２００，０００個の細胞クラスター／ｋｇ ｂｗの用量は、８０，０００個の細胞クラスター／ｋｇ ｂｗの用量よりも効果的に高血糖をコントロールした。図１５が示すように、処置群（正方形及び円形）の死亡率は、ビヒクル処置糖尿病群（三角形）又は驚くべきことに健常対照の非糖尿病群（ダイヤモンド形）のいずれかよりも有意に低かった。

腹腔内耐糖能試験（ＩＰ ＧＴＴ）は、２×１０^５個の細胞クラスター／ｋｇ ｂｗ処置動物において正常であり、血中グルコースの上昇は、イヌインスリンの放出を伴った：ＩＰ ＧＴＴ（２ｇグルコース／ｋｇ ｂｗ）を、方法に記載の２×１０^５個のイヌ細胞クラスター／ｋｇ体重の用量又はビヒクルのいずれかで処置したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスについて、イヌ細胞クラスター処置後５４日目（Ｌｉｎｂｉｔ療法後６６日目）で実施した。図１６に見られるように、細胞クラスター処置動物のＩＰ ＧＴＴは正常であったが、ビヒクル処置マウスの血中グルコースレベルは、グルコース投与の２時間後も上昇したままであった。

耐糖能試験中に採取したビヒクル及び細胞クラスター処置マウスからの血清を、方法に記載したように、マウスインスリンと交差反応しないイヌ特異的インスリンの存在についてＥＬＩＳＡで調べた。図１６で見てわかるように、イヌインスリンは、ビヒクル処置マウスではなく、細胞クラスター処置マウス（クロスハッチバー）の血清中で検出された。健常なＣ５７Ｂｌ／６マウスの血清も同様に試験して、イヌとマウスのインスリンとの間に有意な交差反応性がなかったことを確認した。有意な交差反応性は観察されなかった。

イヌ細胞クラスターを回収すると高血糖が再発する：７６日目に、細胞クラスターを２×１０^５個の細胞クラスター／ｋｇ ｂｗの処置群から除去した。図１３が示すように、イヌ細胞クラスターの除去は、ビヒクル処置動物（空白のバー）のものと同様の、この動物群（黒色のバー）における高血糖の再発をもたらした。

結論：実施例６に提示された結果は、発症早期糖尿病動物にｉ．ｐ．投与した新しく形成されたイヌ細胞クラスターが、インビボで再分化して、Ｔ１ＤＭを有するげっ歯類における適切で生理学的なインスリン分泌及び耐久性があるが可逆的な正常血糖の維持を提供することを示している。更に、臨床的に保証されている場合、腹膜網の除去を介してクラスターを除去できる能力も、この技術の安全性の特徴である。

実施例８：細胞クラスターの追跡及び血管新生
基本原理：（Ａ）腹膜網が様々なサイズの細胞及び異物を蓄積することはよく知られている。したがって、本発明者は仮説を立て、ｉ．ｐ．送達したときに細胞クラスターが腹膜網に取り込まれ、生着されるかどうかを試験した。かかる場所には２つの利点がある：（ｉ）膵臓の場合と同様に、腹膜網からの血液は門脈系を介して肝臓に直接排出される。したがって、細胞クラスターによって作製されたインスリン及び他の膵島ホルモンは、生理学的な様式で送達される。（ｉｉ）細胞クラスターが除去されることが安全性又は他の理由で望まれる場合、腹膜網は重大な悪影響を受けることなく除去することができる。（Ｂ）ＭＳＣ及びＡＳＣは強力な血管新生及び生存因子を発現するため、生着された細胞クラスターの幹細胞成分が細胞クラスターの血液供給の発達を促進するかどうかも調べた。

方法
野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＰ２膵島細胞と、ＧＦＰ^＋遺伝子をトランスジェニックしたＣ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＰ５ ＭＳＣとの低接着性血管内での共培養からマウス細胞クラスターを生成して、インビボでの細胞クラスターの追跡を容易にした。以下に示されるように、一群の実験において、形成後、細胞クラスターを、赤外線励起可能なカルボシアニンプローブＤｉＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で染色して、インビボでの追跡を可能にした。

ＤｉＲで染色されたＰ２イヌの膵島細胞とＰ４イヌＡＳＣとの低接着性血管での共培養からイヌ細胞クラスターを形成して、生きた動物での追跡を可能にした。

糖尿病モデル及び同種処置：雌の非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスは、約１２～２０週齢でＴ１ＤＭを自発発症する。雌のＮＯＤマウスが高血糖であることが確認されたら（３つの別々の日に３００ｍｇ／ｄＬを超える血中グルコース）、マウスをＬｉｎｂｉｔペレットでｓ．ｃ．処置した。動物の血中グルコースレベルが正規化されたら、細胞クラスター（０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地中に懸濁された２×１０^５個の細胞クラスター／ｋｇ ｂｗ）又はビヒクル（０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地）を、５匹ずつの動物の群にｉ．ｐ．投与した。その後、いずれの群の動物にも外因性インスリンは投与されなかった。血中グルコースレベル及び体重を週２回評価し、マウスを１０週間追跡した。細胞クラスター投与後１０週目で、動物を屠殺し、それらの血清、腹膜網、肝臓、脾臓、肺及び腎臓並びに膵臓を採取した。

イヌ細胞クラスター投与：ＤｉＲ標識されたイヌ細胞クラスターを６匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにｉ．ｐ．投与し、Ｌｉ－Ｃｏｒ社製Ｐｅａｒｌ Ｉｍｐｕｌｓｅ（商標）イメージャを用いて、イソフルラン麻酔下で１０週間毎週マウスを調べて、細胞クラスターを追跡した。

同種移植細胞クラスター投与：２つの同種移植投与実験を実施したが、１つは非糖尿病動物で、もう１つは糖尿病動物であった。

Ａ）非糖尿病動物：非糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの６つの群に、（ａ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２中に懸濁された２×１０^５個の新しく形成されたｇｆｐ＋マウス細胞クラスター（５つの群）、又は（ｂ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２（ビヒクル、１つの群）のいずれかをｉ．ｐ．投与した。血中グルコースレベル（ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ ２グルコメータ）及び体重をベースラインで評価し、次いで、全ての動物で週２回評価した。１２週間までの様々な時点で、動物群を屠殺し、それらの血清、腹膜網、肝臓、脾臓、肺、腎臓及び膵臓を採取した。

Ｂ）糖尿病動物：ＳＴＺ糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの２つの群に、（ａ）ＤｉＲで染色し、０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２中に懸濁された２×１０^５個の新しく形成されたｇｆｐ＋マウス細胞クラスター、又は（ｂ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２（ビヒクル）のいずれかをｉ．ｐ．投与した。血中グルコースレベル（ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ（商標）２グルコメータ）及び体重をベースラインで評価し、次いで、全ての動物において１３週間にわたって週２回評価した。週に１回、Ｌｉｃｏｒ社製Ｐｅａｒｌ Ｉｍｐｕｌｓｅイメージャを用いて、イソフルオラン麻酔下で動物を調べ、細胞クラスターを追跡した。

免疫組織化学：腹膜網及び他の臓器を、前述のように採取し、固定し、埋め込んだ［１８］。腹膜網切片を脱パラフィン化し、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いてＤＮＡについて、モルモット抗インスリン抗体（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）及びｃｙ^３コンジュゲート抗モルモット抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を用いてインスリンタンパク質について、製造元の指示に従って免疫組織化学的に染色した。

結果
細胞クラスターは自発的にマウス腹膜網に生着し、インスリンを産生する。本発明者は、注入されたＮＩが、マウスの血管に富んだ腹膜網に場所を決め、付着し、生着し、これにより肝臓の門脈系への生理学的インスリン分泌の利点を提供するであろうと仮説を立てた。実際、図１８Ａに示すように、１０週間前にＤｉＲ標識ＮＩで処置された正常血糖ＮＯＤマウスの蛍光インビボイメージングは、上腹部にそれらが持続的に存在することを示している。

図１８Ａで検出されたＤｉＲ標識ｅＧＦＰ＋ＮＩの腹腔内生着パターン及び機能を更に評価するために、図９に示される実験からのＮＩ処置ＮＯＤマウスの安楽死時に、本発明者は、ｅＧＦＰ＋ＮＩの存在について、網膜、膵臓、脾臓、肝臓、肺及び腎臓を組織学的に調べた。ＮＩは、動物の腹膜網においてのみ検出された（図１８Ｂ）。更に、腹膜網の切片がインスリンで陽性に染色された（図１８Ｃ、左パネル）が、陰性対照（図１８Ｃ、挿入図）及びビヒクル処置糖尿病ＮＯＤマウスからの腹膜網は、インスリン染色を示さなかった（図１８Ｃ、右パネル）。膵臓は、予想されるように、高悪性度膵島炎を有することが示され（図１７）、これは、正常血糖が、膵島の回復によってではなく、むしろ、腹膜網に生着されたＮＩによる生理学的インスリン分泌によって達成されたことを示した。重要なことに、調べられた臓器のいずれにおいても、腫瘍形成又は異所性分化不良（ｍａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）（脂肪性、骨性、軟骨性）の組織学的証拠はなかった。

結論：以上より、前述の結果は、生物種を超えて、（ｉ）ｉ．ｐ．投与された細胞クラスターが、腹膜網に生着し、そこで長期間維持され、再分化し、生理的様式でインスリンを分泌し、拒絶されないことと、（ｉｉ）細胞クラスターの幹細胞成分の血管新生特性が、細胞クラスターの血管新生を助け、細胞クラスターに必要な酸素と栄養とを供給し、細胞クラスターから肝臓の門脈へのインスリンの最適な送達を可能にすることとを示している。

実施例９：発症後期糖尿病の細胞クラスター処置
基本原理：本発明者は、実施例５において、細胞クラスターが、発症早期Ｔ１ＤＭの処置に有効であることを示した。ここでは、細胞クラスターが発症後期Ｔ１ＤＭの処置にも有効であるかどうかを試験した。

方法
細胞クラスター：イヌＡＳＣ（継代２）及びイヌ培養膵島細胞（継代１）から細胞クラスターを形成した。

糖尿病モデル：非肥満型糖尿病／重症複合免疫不全症（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスを、クエン酸緩衝液中の３回のｉ．ｐ．用量の７５ｍｇ／ｋｇ体重ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で糖尿病にした。糖尿病状態は、３つの別々の日に３００ｍｇ／ｄＬを超える血中グルコースレベルによって確認された。動物が糖尿病であることが確認されたら、それらの血中グルコースレベルを、ｓ．ｃ．ｌｉｎｂｉｔペレットを用いたインスリン療法により約３ヵ月間コントロールした。全ての動物が細胞クラスター又はビヒクル投与前に依然として糖尿病であることを確認するために、Ｌｉｎｂｉｔを失効させ、マウスに高血糖を再発症させた。再度、マウスをＬｉｎｂｉｔ（図１９の０日目）で処置して、血中グルコースレベルをコントロールし、糖毒性細胞クラスター損傷を防止した。

ＩＰ ＧＴＴ及びインスリンＥＬＩＳＡを実施例５に記載されるとおり行い、結果を実施例６（発症早期）の動物のものと組み合わせ、図１６に提示した。

結果
２つの群で５匹ずつのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、ＳＴＺ誘発性Ｔ１ＤＭの３ヵ月後に、（ａ）０．５ｍｌの無血清培地（ＤＭＥＭ－Ｆ１２）中に懸濁された２００，０００個の新しく形成された再分化されていないイヌ由来細胞クラスター／ｋｇ体重、又は（ｂ）ビヒクルをｉ．ｐ．処置した。実験設計の概要を図１９に示す。図１９に示されるように、発症後期糖尿病を有する動物は、イヌ細胞クラスター（黒色のバー）による処置後に正常血糖を示すが、ビヒクル（空白のバー）で処置された動物は、インスリンペレットが失効したら高血糖のままである。

結論：上記のデータは、発症早期糖尿病の場合のように、細胞クラスターが発症後期糖尿病における正常血糖の確立にも有効であることを示している。

実施例１０：同種マウス細胞クラスターによる糖尿病自然発症ＮＯＤマウスの処置
基本原理：本発明者は、実施例５及び７において、イヌ細胞クラスターが、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＳＴＺ誘発性糖尿病を逆転させることができることを示した。上記のＮＯＤ／ＳＣＩＤデータは、イヌ由来細胞から生成された細胞クラスターがインビボで安全かつ効果的に再分化してインスリンを産生し、それを生理学的な様式で長期間分泌することができることを提示しているが、ＮＯＤ／ＳＣＩＤモデルは、糖尿病原性自己免疫及び同種免疫攻撃からの移植細胞の保護の問題に対処していない。ＡＳＣ及びＭＳＣは強力な免疫調節特性を示す［１９］。本発明者は、細胞クラスターの幹細胞成分が局所免疫単離を提供すると仮説を立て、細胞クラスターが糖尿病自然発症ＮＯＤマウスに同種投与されたときに正常血糖を回復できるかどうかを試験した。

方法
野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＰ２細胞と、ＧＦＰ^＋遺伝子をトランスジェニックしたＣ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＰ５ ＭＳＣとの低接着性血管内での共培養からマウス細胞クラスターを生成した。

糖尿病自然発症モデル及び同種処置：雌のＮＯＤマウスが高血糖（３つの別々の日に非空腹時血中グルコースが３００ｍｇ／ｄＬを超える）であることが確認されたら、マウスをＬｉｎｂｉｔペレットでｓ．ｃ．処置した。動物の血中グルコースレベルが正規化されたら、細胞クラスター（０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地中に懸濁された２×１０^５個の細胞クラスター／ｋｇ ｂｗ）又はビヒクル（０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地）を、５匹ずつの動物の群にｉ．ｐ．投与した。その後、いずれの群の動物にも外因性インスリンは投与されなかった。血中グルコースレベル及び体重を週２回評価し、マウスを長期にわたって追跡した。

結果
２００，０００個の同種細胞クラスター／ｋｇ ｂｗの用量をｉ．ｐ．投与すると、糖尿病自然発症ＮＯＤマウスにおいて正常血糖が達成され、維持する。ビヒクル及び細胞クラスター処置ＮＯＤマウスの血中グルコースレベルを図２０に示す。要約すると、血中グルコースレベルは、同種細胞クラスター（黒色のバー）で処置したマウスで正規化されたが、ビヒクル処置マウス（空白のバー）は高血糖のままであった。

結論：これらのデータは、イヌ細胞クラスターと同様に、マウス細胞クラスターが（ｉ）インビボで再分化して、正常血糖を再確立及び維持するために十分なインスリン分泌を提供し、重要なことに、（ｉｉ）仮説どおり、カプセル化なしで同種及び自己免疫攻撃の両方に対して免疫単離をもたらすことを示している。

実施例１１：細胞クラスターは、非糖尿病マウスにおいて低血糖を誘発しない
基本原理：前述の実施例から、細胞クラスターが腹膜網に生着し、そこで再分化してインスリンを産生及び分泌することは明らかである。しかしながら、インスリンの分泌が構成的かつ非生理学的である場合、これは潜在的に低血糖のエピソードにつながる可能性がある。したがって、本発明者は、非糖尿病動物への細胞クラスターの投与が低血糖をもたらすかどうかを試験した。

方法
野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＰ２細胞と、ＧＦＰ^＋遺伝子をトランスジェニックしたＣ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＰ５ ＭＳＣとの低接着性血管内での共培養からマウス細胞クラスターを生成した。

Ｐ２イヌ膵島細胞とＰ４イヌＡＳＣとの低接着性血管内での共培養からイヌ細胞クラスターを形成した。

マウス細胞クラスター投与：６つの群で２～４匹ずつの非糖尿病Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、（ａ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２中に懸濁された２×１０^５個の新しく形成されたマウス細胞クラスター（５つの群）、又は（ｂ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２（ビヒクル、１つの群）のいずれかをｉ．ｐ．投与した。血中グルコースレベル（ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ ２グルコメータ）及び体重をベースラインで評価し、次いで、最大１２週間にわたって週２回評価した。

イヌ細胞クラスター：２つの群のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、（ａ）２×１０^５個の新しく形成されたイヌ細胞クラスター（Ｎ＝６）又は（ｂ）０．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ－Ｆ１２（ビヒクル、Ｎ＝３）のいずれかをｉ．ｐ．投与した。血中グルコースレベル（ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ ２グルコメータ）及び体重をベースラインで評価し、次いで、１０週間にわたって週２回評価した。

結果
細胞クラスターは、非糖尿病マウスにおいて低血糖を引き起こさない。実施例８及び図１８Ｂに示すように、ｉ．ｐ．投与されたマウス又はイヌ細胞クラスターは、腹膜網に生着する。図２１で見てわかるように、上部パネルでは、マウス細胞クラスターで処置したＣ５７Ｂｌ／６マウスの血中グルコースレベルは正常のままであり、ビヒクル処置マウスの血中グルコースレベルと同等である。イヌ細胞クラスターで処置したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスについても同様の結果を得た（図２１、下部パネル）。

結論：これらのデータは、マウス又はイヌ細胞のいずれかから形成された生着した細胞クラスターが、構成的ではなく生理学的にインスリンを放出することを示している。

実施例１２：細胞クラスターに含有される同種ＭＳＣ及び培養膵島細胞は、レシピエントにおいて抗体応答を引き起こさない
基本原理：前述の実施例は、本明細書に記載される細胞クラスターが、拒絶反応なしに糖尿病動物における正常血糖を再確立するために同種的に使用され得ることを示す。以下の研究は、細胞クラスターで同種処置された動物が、細胞クラスターを構成するいずれかの細胞型に対する抗体を産生するかどうかを更に試験するために行われた。

方法
野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＰ２膵島細胞とＣ５７Ｂｌ／６マウスに由来するＰ５ ＭＳＣとの低付着血管内での共培養からマウス細胞クラスターを生成した。

抗体応答試験：試験血清を、（ａ）１×１０^５個のｇｆｐ＋Ｃ５７Ｂｌ／６ ＭＳＣ、又は（ｂ）１×１０^５個の培養Ｃ５７Ｂｌ／６膵島細胞のいずれかとともに３０分間インキュベートした。陽性対照血清を、１×１０^５個のイヌＡＳＣとともにインキュベートした。血清とともにインキュベートした後、細胞を遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）でインキュベートした。細胞を室温の暗所で更に２０分間インキュベートした。次いで、１ｍｌの１×ＰＢＳ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）＋１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えた。細胞をボルテックスし、次いで遠心分離し、固定緩衝液（１％ホルムアルデヒド）中に再懸濁し、ＦＡＣＳ（ＢＤ ＦＡＣＳｃａｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ；１０，０００個の細胞をカウントした）によって解析した。

結果
血清は、以下のものから入手した：
（ｉ）細胞クラスター処置の１２週間後に２×１０^５個の細胞クラスター／ｋｇ ｂｗでｉ．ｐ．処置したＮＯＤマウス（実施例８を参照）、
（ｉｉ）ビヒクル処置の１２週間後にビヒクルでｉ．ｐ．処置したＮＯＤマウス（実施例８を参照）、及び
（ｉｉｉ）注入されていないＮＯＤマウス（ナイーブマウス）。

細胞クラスターからのマウスＭＳＣ及び細胞クラスターからのマウス膵島細胞を、採取した血清とともに、次いで、フィコエリトリン（ＰＥ）抗マウスＩｇＧ抗体とともにインキュベートした。次いで、血清曝露細胞を、上記の方法に記載されるようにＦＡＣＳによって解析して、投与されたＭＳＣ又は膵島細胞に対する任意のＩｇＧ抗体が処置マウスの血清中に存在するかどうかを決定した。

ＡＳＣの異種投与は免疫応答を惹起することが知られているため、イヌＡＳＣ投与の１４日後にＮＯＤマウスからの血清に曝露されていたイヌＡＳＣを、ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体とともにインキュベートし、ＦＡＣＳによって解析し、陽性対照として使用した。

細胞クラスター処置マウスが、細胞クラスター内のＭＳＣ又は膵島細胞に対する同種免疫応答を起こした場合、ＰＥ標識α－マウスＩｇＧ抗体は、血清に曝露された細胞に結合し、細胞は、ＦＡＣＳ解析でシフトした（ＰＥ陽性）ように見えるであろう。ＦＡＣＳで細胞の７％超のシフト（ＰＥ陽性細胞に対する％）は、同種抗体陽性応答とみなされた。

図２２Ａ～２２Ｃに示すように、同種細胞クラスター処置マウスからの血清は、同種マウスＭＳＣ（図２２Ａ）又は膵島細胞（図２２Ｂ）に対するＩｇＧ抗体を含有しなかった。更に、これらのデータは、ビヒクル処置したＮＯＤマウスからの血清が、ＭＳＣ又は脱分化された膵島細胞に対する事前形成ＩｇＧ抗体を含有しなかったことを示唆している。予想どおり、イヌＡＳＣ（陽性対照）で処置したマウス由来の血清は、細胞の９５％におけるシフトによって証明されるように、イヌＡＳＣに対する高レベルのＩｇＧ抗体を含有した（図２２Ｃ）。

ＮＯＤマウスは、ＮＩのＭＳＣ及び島細胞に対して同種免疫ＩｇＧ応答を示さない。ＮＩに含有される膵島細胞及びＭＳＣが体液性免疫発作から保護されているかどうかを調べるために、本発明者は、投与されたＮＩを生成するために使用されたＭＳＣ又は培養ＩＣのいずれかに対するＩｇＧ抗体を含有していた正常血糖、ＮＩ処置ＮＯＤマウス由来の血清を評価した。ＮＩで処置された正常血糖ＮＯＤマウス由来の血清は、ＭＳＣ又は培養ＩＣを対象としたＩｇＧ抗体を含有せず、一方で、陽性対照として使用される新しく単離された同種膵島（Ｃ５７Ｂｌ／６）のｉ．ｐ．投与は、強固な抗体応答を惹起した（図２３）。同種ＮＩを形成するために使用される細胞に対するＩｇＧ抗体応答の欠如は、長期正常血糖の達成とともに、本明細書に記載されるＮＩもまた、それらの膵島細胞及びＭＳＣ成分に体液性の同種免疫保護を提供することを更に示している。

自己免疫応答の阻害。インスリン産生細胞で自己免疫Ｔ１ＤＭを効果的に治療するために重要なのは、これらの細胞の自己免疫単離であり、図９に提示される結果は、ＮＩ内のＩＣが、処置されたＮＯＤマウスの自己免疫攻撃から保護されることを示唆している。ＮＯＤマウスにおけるβ細胞の自己免疫破壊は、ヒトＴ１ＤＭのように、自己反応性ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞によって媒介され、マクロファージ、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞による膵島浸潤を伴う膵島炎によって特徴付けられる。同種ＡＳＣ単独での投与又は膵島との併用投与が、糖尿病動物及びヒトにおいて、制御性Ｔ細胞の増殖を促進し、イヌではここで確認されるＴｇｆｂ１発現（図３、８Ａ及び８Ｂ）並びにＩＤＯ上方制御（図４Ｃ）を介して免疫細胞の増殖を抑制することによって、高血糖を部分的に緩和又は予防することが以前に示されている。ＮＩのＭ／ＡＳＣ成分が、同様のメカニズムを介してＮＯＤマウスの自己免疫攻撃から膵島細胞を保護している可能性を探索するために、ここでは、以下のような既知のＭＳＣ免疫調節メカニズムの選択セットを調べた。本発明者は、別の糖尿病ＮＯＤマウス群に、同種Ｃ５７Ｂｌ／６膵島（Ｎ＝３）又は同種ＮＩ（Ｎ＝３）をｉ．ｐ．処置した。１４日後、かかるマウスを安楽死させ、その血液、膵臓、腎臓、肺、脾臓及び腹膜網を採取した。膵臓を組織学的に調べ、予想どおり膵島炎を示すことが実証された。脾臓を採取し、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦＯＸＰ３、ＣＤ２５陽性細胞のパーセンテージをＦＡＣＳによって試験した。採取した腹膜網をＩＨＣで調べ、Ｆｏｘｐ３＋細胞の存在を確認した。ＣＤ３／ＣＤ４及びＣＤ３／ＣＤ８二重陽性細胞（ヘルパー及び細胞傷害性Ｔリンパ球）の割合は、ＮＩ処置対膵島処置ＮＯＤマウスの脾臓細胞において有意に低く、一方、ＣＤ４／ＣＤ２５二重陽性及びＣＤ４／ＣＤ２５／Ｆｏｘｐ３三重陽性Ｔｒｅｇの割合は、ＮＩ処置対膵島処置ＮＯＤマウスの脾臓において有意に増加した（ＦＡＣＳ解析、図２４、パネルａ～ｄ）。同様に、ＮＩ処置マウスの腹膜網のＩＨＣ解析は、Ｆｏｘｐ３陽性細胞の割合が、ビヒクル処置マウスの割合と比べて有意に増加した（図２４、パネルｅ）。試験した動物の数は少ないが、これらの結果は他の研究者の知見と一致しており、ＮＩ、特にそのＭ／ＡＳＣ成分が、糖尿病原性自己免疫応答の調節を通じてＴ１糖尿病マウスの正常血糖を促進するという本発明者の仮説とも一致している。上記マウスからの腹膜網もＫｉ６７で染色し、ＮＩ移植片に関連する有意な細胞分裂があったかどうかを調べた。何も見つからなかった。

結論：上記のデータは、細胞クラスターの投与が、細胞クラスターを含むいずれかの細胞型に対しても抗体応答を惹起しないことを示しており、細胞クラスターが免疫単離を提供し、拒絶反応抑制薬及びカプセル化デバイスの必要性を排除するという仮説を更に裏付ける。

今日までの本発明者の広範なインビトロ及びインビボデータは、マウスにおける実験的Ｔ１ＤＭの処置において、同種移植及び同種の細胞クラスター、並びに複数の生物種由来の細胞クラスターを用いることで、正常血糖を効果的に再確立でき、すなわち、Ｔ１ＤＭを治療でき、これを長期追跡調査においても可能であることを実証している。細胞クラスターの発がん性形質転換又は異所性分化不良などの有害イベントは観察されなかった。この新しい治療法は、コンパニオン動物（イヌ、ネコ）及び１型糖尿病のヒトの両方で、インスリン依存性糖尿病の治療として使用することができる。

実施例１３：ＳＴＺ糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの処置に使用されるヒト由来細胞クラスター
ヒト細胞を含有する細胞クラスターは、健常であり、インスリン依存性糖尿病に罹患していないと同定されたヒト対象からのＡＳＣ及び／又はＭＳＣと、同種源からの膵島細胞とを用いて、上記の実施例に記載されているように生成される。

この研究の目的は、本発明者が以前にイヌ細胞由来の細胞クラスター（ｃＮＩ）で見出したように、ヒト細胞由来の細胞クラスター（ｈＮＩ）が糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるインスリンの必要性を低減又は排除できるかどうかを決定することであった［３］。具体的には、本発明者が提示するのは、（ａ）継代されたヒト膵島細胞（ｈＩＣ）が、遺伝子発現及びサイトカインへの応答の両方において、イヌ膵島細胞（ｃＩＣ）と特徴的に同等であるかどうかを決定すること、並びに（ｂ）ヒトｈＮＩが、ｃＮＩ及びｍＮＩが行うことが示されているように、インスリンの必要性を持続的に低減又は排除できるかどうかを決定することである［３］。

８人の非糖尿病ヒトドナーからの研究グレードのヒト膵島（人口統計学及び膵島生存率については表Ａを参照）を、Ｐｒｏｄｏ Ｌａｂｓ（Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ、ＣＡ）から約５，０００個の膵島当量のロットで購入した。この不均一な群の膵島ドナーに由来する膵島細胞を、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）＋１０％ヒト血小板溶解物（ｈＰＬ；Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ）＋１×Ｌ－グルタミン－ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（ＧＰＳ；Ｓｉｇｍａ Ｇ１１４６）を用いて、組織培養フラスコ内で膵島全体を約９０％コンフルエントになるまで増殖させた。継代のために、細胞を、２×トリプシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で放出し、６００×ｇで５分間の遠心分離によってペレット化し、ＤＭＥＭ ５ｍＭグルコース（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ｈＰＬ＋ＧＰＳ（完全培地）で洗浄し、２×１０ｅ５個の細胞の密度で完全培地中のＴ７５フラスコに再播種した。ｈＩＣを、ＩＣ特異的遺伝子の発現についてｒｔＰＣＲによって特徴付けた。ｈＩＣ及びｃＩＣ倍加時間及び集団倍加（ＰＤＬ）を、標準方法によって計算した。

ＭＳＣ培養：ヒト骨髄由来ＭＳＣを、Ｌｏｎｚａ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から予め特性決定されたもの（三系統分化、ＨＬＡ抗原及び表面ＣＤマーカー）を購入し、前述のように完全培地で培養し［２、２０、２１］、継代３でＮＩの形成に使用した。

イヌ膵島及び細胞株：鼠径部脂肪から利用されたイヌ膵島及び脂肪幹細胞（ＡＳＣ）は、現在進行中のパイロット研究（ＩＮＡＤ ０１２－７７６）［３］で使用したものと同一であり、全てのイヌの細胞株は前述のように培養した［３］。全てのイヌは非糖尿病雑種であったが、一部はペースメーカ誘発性うっ血性心不全を有していた（詳細については表Ｂを参照）。膵島及び脂肪組織の両方が、ユタ大学のＮＩＨ臓器共有協定によって得られた。

膵島及び細胞生存率を、それぞれの製造元の指示に従って、二酢酸フルオレセイン（ＦＤＡ，Ｓｉｇｍａ Ｆ７３７８）及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐ３５６６）染色を使用して評価した。膵島の生存率をパーセントで、約４００個のヒト及びイヌの膵島を均質に分散させた１０個の異なるフィールドで定量化した。この方法では、潜在的なアポトーシス細胞の損失は検出されない。

ヒトＭＳＣ及びイヌＡＳＣ並びにそれぞれのＩＣを、超低接着表面培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ，ＭＥ）で１：１の比で完全培地中で共培養し、これまで報告されているように、一晩で高効率の細胞クラスター（ｈＮＩ）及び（ｃＮＩ）の形成をもたらした［２、３］。

集団倍化時間：本発明者は以前に、異なるドナー間の培養マウス及びイヌ膵島細胞のＰＤＬが有意に異なることを観察した。しかしながら、このドナー間のばらつきは、インビボでのマウス又はイヌ細胞クラスターのいずれの後続機能にも影響を及ぼさなかった。本研究において、４～１２回の集団倍加（ＰＤＬ）を超えるｈＩＣ及びｃＩＣＳの倍加時間が、ｈＩＣについては図２５Ａ及び２４Ｂに、ｃＩＣについては図２５Ｃ及び２５Ｄに示される。倍加時間は２９～１７０時間の範囲であり、平均して約７０時間であった。倍加時間のかかるばらつきは、以前にマウス及びイヌの両方のＩＣで観察されたものと同様である。

集団倍加（ＰＤＬ）の関数としてのインスリン及び他の膵島特異的ホルモンのＧＳＩＳ及び遺伝子発現プロファイル：糖尿病イヌの進行中の細胞クラスター処置のために、インスリン及び他の膵島ホルモン遺伝子発現レベルは、細胞クラスター形成前に培養されたｃＩＣにおいて評価され、インスリン遺伝子発現は、力価の尺度として使用され、ｃＩＣ及びイヌ細胞クラスターの放出基準として機能する。同一のプロトコルに従って培養増殖されているｈＩＣ（ｎ＝６）及びｃＩＣ（ｎ＝６）が機能的に同等であるかどうかを決定するために、本発明者は、両方の種の細胞株において、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、及び膵ポリペプチド（ＰＰＹ）の遺伝子発現レベルを、ｒｔＰＣＲによって系統的に評価し（ｒｔＰＣＲプライマーについては表Ｃを参照）、これらをＰＤＬの関数としてプロットした（詳細については表Ｄを参照）。図２６及び２７に示されるように、ヒトＩＣ（図２６Ａ～２６Ｄ）及びイヌＩＣ（図２７Ａ～２７Ｄ）の両方について、ＰＤＬの関数として表されるＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、及びＰＰＹのレベルは、一貫したままであり、少なくとも１０回のＰＤＬを通して検出可能であり、これらはドナーに依存しないことが顕著であった。培養増殖されたｈＩＣ及びｃＩＣにおけるインスリン及び他の膵島ホルモン遺伝子発現レベルの漸減は線形であり（Ｒ２乗値＞０．９１）、これらの結果は、マウスＩＣで観察されたものと同等であった（図３０を参照）。イヌのＳＳＴは例外として、評価した遺伝子のいずれについても、ドナー間の勾配間の変化に有意差はなかった。同様に、発現レベル及び外挿されたライン上昇は、ドナー間で互いに有意差はなかった。生物種間で培養されたＩＣ挙動の類似性を更に裏付けるために、マウスＩＣのようなイヌＩＣは、インビボで生理学的レベルのインスリン及び他の膵島ホルモンを産生するように容易に再分化することが示されている。糖尿病自然発症ペット用イヌへのイヌ細胞クラスターの投与は、インスリンの必要性を長期的に低減し、インビボでのＩＣ再分化の現象がイヌにも起こることを実証している。最後に、ＩＣを細胞クラスターに組み込み、糖尿病マウスにｉ．ｐ．投与したところ、マウス（図３０）及びイヌＩＣは、インビボで再分化し、生理学的レベルのインスリンを産生することが示された。図２６Ａ及び２７Ａで観察された、培養増殖したヒト対イヌＩＣについての同様の結果は、糖尿病マウス及びイヌにおけるインスリンの必要性をそれぞれ排除又は低減することが既に実証されている細胞クラスター技術が、ヒトＴ１ＤＭの臨床試験及びその後の治療のための実質的な応用可能性を有するという仮説を裏付けている。

本発明者は以前、培養増殖したマウス及びイヌのＩＣ並びに細胞クラスターが、グルコース刺激に応答してインスリンを分泌するが、新たに単離された膵島全体と比較して有意に低減したレベルであることを報告した［２、３］。更に、ストレプトゾトシン－糖尿病ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに移植されたイヌ細胞クラスターは、持続的に正常血糖を誘発した。９週間後に回収したとき、これらのイヌ細胞クラスターは、グルコース刺激に応答して、新しく形成されたイヌ細胞クラスターよりも１５倍高い濃度のイヌインスリンを分泌し、インビボで再分化したことを明確に示していた。培養増殖したヒトＩＣもまた、グルコースに応答してインスリンを分泌するかどうかを評価するために、表Ａのドナーからの培養増殖ｈＩＣを、異なる継代でＧＳＩＳごとに試験し、それらのインスリン分泌を、それらの親膵島のインスリン分泌と比較した（図２８Ａ～２８Ｃ）。イヌ及びマウスのＩＣと同様に、培養増殖したｈＩＣは、８～１１回のＰＤＬを介してグルコース刺激インスリン分泌を示すが、やはり新たに単離されたネイティブ膵島と比較してレベルは低減した（図２８Ａ～２８Ｃ）。

細胞クラスター形成：表Ａに列挙されるヒトドナーからの膵島細胞を、方法に記載したように、ヒトＭＳＣ（Ｐ３）と共培養したときに細胞クラスターを形成する能力について、継代Ｐ０～Ｐ４で試験した。かかる新しく形成された細胞クラスターの代表的な画像を図２９に示す。全てのドナー及びこれらの継代からの膵島細胞は、表現型的に同等の細胞クラスターを容易に形成したことから、ヒトドナーのばらつきが、細胞クラスター技術のこの態様の重要な因子であるとは考えにくいことが示された。

ヒト細胞クラスターによるマウスの処置
糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを処置するために使用されたヒト細胞クラスターにおける継代ｈＩＣ。インビボ試験のために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスをＳＴＺで糖尿病にし、インスリンペレット（Ｌｉｎｂｉｔ）で処置し、安定化したら、約２×１０ｅ５個のＮＩ／ｋｇ ｂｗ又はビヒクルのいずれかでｉ．ｐ．処置し、次いで７週間追跡した。ドナーのばらつきの役割を評価するのに役立つように、異なるドナー（表Ａのドナー７及び８）からのｈＩＣを使用する２組のＮＩ及びｈＭＳＣを形成した。７週目の初めに、全ての動物及び健常対照群が腹腔内耐糖能試験（ＩＰ ＧＴＴ）を受けた。

ｃＮＩで以前に見出されたように［２、３］、１ｋｇ ｂｗ当たり約２×１０ｅ５個のＮＩで投与されたｈＮＩは、正常なＩＰ ＧＴＴによって実証されたように正常血糖を持続的に回復し、糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるインスリンの必要性を排除する。

結果：
Ｐ３臨床グレードのｈＭＳＣ［２０］と、表Ａに列挙した研究グレードドナーのドナー７及び８からのＰ１膵島細胞とを組み込んだ２組のｈＮＩを形成した。

ｈＭＳＣは、三系統分化を受け、ＭＳＣ特異的エピトープ及び遺伝子を発現することが示された［２０、２１］。

ドナー７及びドナー８からの膵島細胞とｈＭＳＣとで構成される継代１（Ｐ１）膵島細胞及びＮＩを、目的の膵島特異的遺伝子の発現についてｒｔＰＣＲによって特徴付け、新たな膵島と同様に互いに比較した（図２６Ａ～２６Ｄ）。マウス及びイヌ細胞を用いて行われた以前の実験から予想されるように［２、３］、かつ図３１に示されるように、両方のドナーからの継代１（Ｐ１）膵島細胞はＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰＹ、ＰＤＸ１、及びＵＣＮ３ ｍＲＮＡを発現したが、両方のドナーからのＰ１膵島細胞は、新たに単離された膵島（緑色及びオレンジ色のバー）と比較して、全てのアッセイされた膵島細胞遺伝子のレベルを有意に低減させた。ドナーのばらつきを反映してか、ドナー７のＰ１膵島細胞は、ドナー８のＰ１膵島細胞よりも有意に低いレベルのｍＲＮＡを発現した（図３１の黒色のバー）。

図３１には、表Ａに列挙したドナー７及び８の各々の膵島から培養したＰ１ ＩＣの遺伝子発現レベルが示されている。黒色のバーは、それらが互いに正規化されていることを示す。緑色及びオレンジ色のバーは、Ｐ１細胞が培養された新しく単離された膵島に正規化されていることを示している。Ｌｏｇ１０ ＲＱが±２のとき、有意差ありとみなされる。ドナー７由来のＰ１ ＩＣは、ドナー８のＰ１ ＩＣよりも有意に低いレベルのＩＣ関連遺伝子を発現する。

いずれかのドナーからのＰ１ ＩＣの細胞クラスターへの組み込みは、任意のアッセイされた遺伝子の発現に有意に影響しなかった（図３２を参照）。

図３２に示すように、ドナー７及びドナー８のＰ１ ＩＣから作製された細胞クラスターの遺伝子発現レベルは、各場合において、組み込み前のドナーのＰ１ ＩＣの発現レベルに正規化された。細胞クラスターへのＩＣの組み込みは、細胞の組み込み前の遺伝子発現レベルを有意に変化させない（図３１）。

ＩＣが細胞クラスターに組み込まれると、ドナー７のＮＩからの膵島特異的遺伝子発現レベルは、ドナー８のＮＩのものと比較して依然として低減したが、有意ではなかった（図３３、灰色のバー）。

図３３は、２つのドナー間の膵島関連遺伝子発現において図３１に見られる有意差が、ＩＣを細胞クラスター（灰色のバー）に組み込むと除去されることを示す。したがって、処置に使用される細胞クラスターは、ほぼ同等である。

また、図３３には、ドナーの元の膵島（緑色及び赤のバー）のものと比較した細胞クラスターの遺伝子発現レベルが示されている。予想どおり、膵島関連遺伝子発現レベルは、ＮＩにおいて有意に低減しているが、依然として検出可能である。

ＳＴＺ誘発性糖尿病の処置のためのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるｈＮＩの使用：雌１２匹、１３週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、方法に記載されるように、１回又は２回の用量のＳＴＺ、２００ｍｇ ｉ．ｐ．で糖尿病にした。血中グルコースレベルを週２回モニタリングし、かかるレベルが３００ｍｇ／ｄＬ超を３日間連続した場合、マウスを糖尿病とみなし、その時点で、マウスを皮下インスリン（Ｌｉｎｂｉｔ）ペレットで処置した。血中グルコースレベルが２００ｍｇ／ｄＬ未満にコントロールされたら、マウスを２つの群で６匹ずつのマウスに分け、（ｉ）約２×１０ｅ５個のＮＩ／ｋｇ ｂｗ又は（ｉｉ）ビヒクル（５００ｕＬ αＭＥＭ）のいずれかでｉ．ｐ．処置した。６匹のｈＮＩ処置マウスについて、３匹をドナー７のＩＣを組み込んだＮＩで処置し、他の３匹はドナー８のＩＣを使用した。いずれかのドナーからの細胞による処置でも、同等の応答が得られた。図３４に示すように、ｈＮＩでの処置は、持続的な正常血糖をもたらし、ビヒクルでの処置ではインスリンの必要性を排除しなかった。ＩＰ ＧＴＴは、細胞クラスター処置動物では本質的に正常であったが、ビヒクル処置動物では正常ではなかった（図３５）。重要なことに、ＩＰ ＧＴＴ中の細胞クラスター処置マウスで産生されたインスリンの種は、排他的にヒト由来であった。

実施例１４：間葉系間質細胞と膵島細胞との３次元オルガノイドである「ネオ膵島」の腹腔内投与は、ストレプトゾトシン糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの血中グルコースレベルを正規化する
研究設計
現在の前臨床研究は、２つの目的を持つ第１相臨床試験を見越して行われたもので、（ａ）ヒトＮＩ（ｈＮＩ）も正常血糖を回復させることができるかどうか、及び（ｂ）ストレプトゾトシン（ＳＴＣ）糖尿病非肥満型糖尿病／重症複合免疫不全マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ、Ｈａｒｌａｎ）において、以前にマウス細胞由来のＮＩ（ｍＮＩ）及びイヌ細胞由来のＮＩ（ｃＮＩ）について示されているように［３］、準最適にコントロールされている糖尿病動物の再投与が完全に正常血糖を回復させることができるかどうかを決定することである。これらのＮＩはヒト細胞で構成されているため、ヒトＭＳＣは異種環境で免疫回避能力を維持しないため（未発表の結果）、ＮＯＤ／ＳＣＩＤモデルを使用した。それは、同種バイオ療法のレシピエントが強力な拒絶反応抑制薬を永続的に服用しなければならず、これにより同様に生涯にわたって免疫不全状態を作り出す臨床状況を部分的に再現している。糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを処置するために使用されることになっていた継代ｈＩＣ及びｈＮＩを、ｒｔＰＣＲによって遺伝子発現プロファイルについて特徴付けた。インビボ試験のために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスをＳＴＺで糖尿病にし、次いで、血中グルコースレベルに基づいて各６つの群に無作為化した。無作為化後、マウスにインスリンペレット（Ｌｉｎｂｉｔ、Ｌｉｎｓｈｉｎ Ｃａｎａｄａ）を投与して、血中グルコースレベルをコントロールし、糖毒性を防ぎ、移植片内のｈＩＣのインビボ再分化を高めた。血中グルコースレベルが正常に近い状態で安定化すると、動物を約２×１０ｅ５個のヒト細胞由来ＮＩ／ｋｇ ｂｗ（ｎ＝６）又はビヒクル（ｎ＝６）のいずれかでｉ．ｐ．処置し、その後８週間追跡した。群に割り当てられた後、エンドポイント又は人道的理由による安楽死が行われるまで、全ての動物からのデータを後続の解析に含めた。外因性インスリンの投与を伴わない対照と比較して血中グルコースレベルがもはや有意に改善されないことが決定されたら、各群のマウスを２×１０ｅ５個のＮＩ／ｋｇ ｂｗ又はビヒクルのいずれかで再び処置し、更に６週間追跡した。

動物モデル
動物研究は、実験動物の管理及び使用に関するＮＩＨ指針を遵守して行われ、施設の獣医師及びＩＡＣＵＣのメンバーによって監督及び承認された。

管理。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを無菌環境に維持し、無菌の寝具、食餌及び水を提供した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、温度及び湿度がコントロールされた環境で１２時間の明暗サイクルで飼育され、食餌及び水を自由に摂取できた。動物の健康及び行動は、勤務時間中に少なくとも１日１回目視で観察され、スタッフによって少なくとも週２回の血中グルコース及び体重チェックによって観察され、各スタッフは、げっ歯類の管理に関するＣＩＴＩトレーニングを修了しており、マウス及び本明細書に記載される手順について少なくとも２年の経験を有していた。

糖尿病の誘発及び処置１２匹の雌、１３週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、１～２回のｉ．ｐ用量のストレプトゾトシン（ＳＴＺ、Ｓｉｇｍａ）、クエン酸緩衝液に溶解した２００ｍｇのｉｐ（ｐＨ４．５、Ｓｉｇｍａ）を用いて糖尿病にし、以下に記載するように軽麻酔下で投与した。尾静脈血中グルコースレベルを週に２回モニタリングし、かかるレベルが３日間連続して３００ｍｇ／ｄＬを超えた場合、マウスを糖尿病とみなし、その時点で、マウスを軽麻酔し、皮下の徐放性インスリン（Ｌｉｎｂｉｔ）ペレットで処置した。血中グルコースレベルが２００ｍｇ／ｄＬ未満にコントロールされたら、２つの群で６匹ずつのマウスを軽麻酔し、（ｉ）２×１０ｅ５個のヒト細胞由来のＮＩ（ｈＮＩ／ｋｇ ｂ．ｗｔ、５００ｕＬのＤＭＥＭ（５ｍＭのグルコース）（Ｇｉｂｃｏ）中）又は（ｉｉ）ビヒクル（５００ｕＬのＤＭＥＭ（５ｍＭのグルコース））のいずれかでｉ．ｐ．処置した。

麻酔。吸入げっ歯類麻酔システム（Ｅｕｔｈａｎｅｘ）を用いて、マウスを１～５％のイソフルラン（Ｂａｘｔｅｒ）で麻酔した。直腸の温度を、加熱された外科用ウォーターベッド（Ｅｕｔｈａｎｅｘ）を用いて３７℃に維持した。

血中グルコース及び体重のモニタリング血中グルコース濃度を、２７～３０ゲージの針で１滴の血液を採取し、ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ ２グルコメータ（検出レベル、２０～６００ｍｇグルコース／ｄＬ；ＬｉｆｅＳｃａｎ）を用いて、滅菌尾静脈サンプリングにより週２回評価した。採血後、出血が止まるまでマウスを観察し、その後しばらくの間、尾の打撲又は疼痛の徴候（円背、頭部の押し付け）を観察した。麻酔は血中グルコースレベルの上昇をもたらすため、血糖モニタリングに麻酔は用いなかった。グルコースモニタリングのためのハンドリング及び採血によって必要とされるマウスに引き起こされる疼痛及び苦痛を最小限に抑えるように配慮し、尾静脈サンプリングからの疼痛の徴候を示す任意の動物について、以下の疼痛管理に記載されているように鎮痛剤が利用可能であった。動物の体重を、血糖モニタリングと併せて週２回評価した。

腹腔内耐糖能試験（ｉ．ｐ．ＧＴＴ）及びヒトインスリンのアッセイ。ｈＮＩの１回目及び２回目の投与後の示された時点で、ビヒクル処置及びｈＮＩ処置ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、並びに年齢をマッチさせた非糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤ対照マウスの追加群（ｎ＝６）を５時間絶食させ、そこでベースライン血糖レベルを測定した。動物を麻酔し、２ｇグルコース／ｋｇ ｂ．ｗｔ（０．５ｍｌの無血清培地に溶解し、フィルターを滅菌した；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をｉ．ｐ．注入によって投与した。グルコース投与後３０分、６０分、及び１２０分で尾静脈血中グルコースレベルを決定した。マウスのｈＮＩ及びビヒクル処置群の血清中のヒトインスリンレベルを、製造元の指示（Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に従って、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。

疼痛管理。ｉ．ｐ．ＳＴＺ投与、ＮＩ投与、ｉ．ｐ．耐糖能試験、又は尾静脈サンプリングの後に疼痛に苦しむように見える任意の動物に対して、ブプレノルフィン０．０５ｍｇ／ｋｇ ｂｗ ＩＭが必要に応じて利用可能であった。

エンドポイント基準。本研究の全てのマウスについて、以下の基準を使用して、苦痛を防ぐために、それらをプロトコルから除外するか、又は安楽死させるかを決定した。２０％を超える体重減少、過度の衰弱（年齢／性別が一致した同腹仔と比較して２０％超）、手入れされていない外観、不十分な活動レベル、呼吸困難又は食欲不振／水分摂取の喪失、新生物、昏迷、ケージメイトとの喧嘩による重度の怪我、怪我を負わせるようなハンドラー又はケージメイトに対する重度の攻撃性を含む異常行動の徴候、身体的又は精神的な警戒心の欠如、又は重度の苦痛に陥っているように見える動物を含む、健康状態の不良が認められた動物。苦痛の徴候を示し始めた動物は毎日モニタリングされ、一般的な外観、行動及び体重減少について注意深く観察した。深刻な苦痛にあるか、又は２０％以上の体重減少若しくは筋肉低下を有するように見える任意の動物を、更なる苦痛を防ぐために直ちに安楽死させた。

エンドポイント基準又は研究エンドポイントを満たす前に死亡した動物はいなかったが、ビヒクル処置群の４匹のマウスは安楽死の基準を満たし（４匹のマウスは全て過度の衰弱及び食欲不振を示し、手入れされていない外観を伴った）、以下の「安楽死」に詳述されているように４６日目（３匹のマウス）及び５６日目（１匹のマウス）に、それらの基準を満たし次第、安楽死させた。

安楽死。研究エンドポイント（本研究の１２匹のマウスのうち８匹に適用）では、ＳＴＺによる最初の処置の１５週間後に、必要に応じてエンドポイント基準（ビヒクル処置群の４匹のマウスに適用）によって定義されるように、マウスをＣＯ２ガス／４～５Ｌを用いて２～４分間にわたって安楽死させた。死亡は、少なくとも１０分間の観察による呼吸器及び心血管運動の停止の保証によって確かめられた。

細胞
ＮＩは、共培養時に自発的にクラスターを形成する同数の培養増殖ヒトＭＳＣとヒト膵島細胞とで構成される。培養及びＮＩ形成を以下に詳述する。

膵島細胞培養。成人の非糖尿病ドナーからの研究グレードのヒト膵島をＰｒｏｄｏ Ｌａｂｓから購入した。膵島細胞は、組織培養フラスコに膵島全体を入れ、それらをＲＰＭＩ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋１０％ヒト血小板溶解物（ｈＰＬ；Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）＋ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン（ＧＰＳ；Ｓｉｇｍａ）中で９０％コンフルエントになるまで培養することによって培養した。継代のために、細胞を１×トリプシンＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いてトリプシン化し、６００ｘｇで５分間遠心分離によってペレット化し、ＤＭＥＭ（５ｍＭグルコース）＋１０％ｈＰＬ＋ＧＰＳで洗浄し、２×１０ｅ５個の細胞の密度でＣｅｌｌ ＢｉｎｄコートされたＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に再播種した。培養膵島細胞（ＩＣ）を継代１で使用した。

ＭＳＣ培養。ヒト骨髄由来ＭＳＣをＬｏｎｚａ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入し、前述のように培養した。ＭＳＣを、ＮＩ形成のためにＰ３で使用した。

ネオ膵島（ＮＩ）形成。ＭＳＣ及び膵島細胞を、ＤＭＥＭ（５ｍＭ グルコース）＋１０％ｈＰＬで１：１の比で、超低接着性表面培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で共培養し、ＮＩを前述のように一晩かけて形成した。

ｒｔＰＣＲ
インビボ投与に先立ち、ＮＩを、膵島関連遺伝子ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰＹ、ＰＤＸ１、及びＵＣＮ３の発現についてｒｔＰＣＲによって試験した。ｒｔＰＣＲを、列挙される試薬及びプライマーを用いて、前述のように行った。簡単に説明すると、相対定量（ＲＱ；２－ΔΔＣＴを標準とし、ＣＴはサイクル閾値と定義）は、内部対照（デルタＣＴ、ベータアクチン及びベータ２マイクログロブリン）並びに外部対照（デルタ－デルタＣＴ、親細胞）への正規化によって計算され、いずれもＡＢＳ ７５００リアルタイムＰＣＲシステム及びソフトウェアを用いて達成された。結果をｌｏｇ１０（ＲＱ）±ｌｏｇ１０（ＲＱｍｉｎ及びＲＱｍａｘ）として提示し、アップ・ダウンの遺伝子制御が等しく表されるようにする。ｌｏｇ１０（ＲＱ）２又はｌｏｇ１０（ＲＱ）－２よりも大きい発現レベルの差を有意とみなした。

統計解析
データは、指示どおり平均±ＳＥＭ又は平均±９５％信頼区間として表される。一次データは、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）を用いて収集し、統計解析は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて行った。両側ｔ検定を用いて、データ平均値間の差を評価した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。ｒｔＰＣＲについては、データをＬｏｇ１０ＲＱとして提示し、統計学的有意性を±２と定義した。

結果
ｈＮＩでは膵島関連遺伝子の発現量が低減している
ｈＮＩを、非糖尿病成人ヒトドナーからのＰ３ ｈＭＳＣ及びＰ１膵島細胞を各セット組み込んで形成した。ｈＭＳＣを、ＭＳＣ特異的エピトープ及び遺伝子の発現、並びに三系統分化（脂肪形成性、骨形成性及び軟骨形成性）を受ける能力（Ｌｏｎｚａ）について予め特徴付けられた状態で得た。

遺伝子発現解析を、新しく形成されたＮＩに対してｒｔＰＣＲを用いて行い、膵島内分泌遺伝子の発現レベルを膵島全体のものと比較して測定した。マウス及びイヌ細胞を用いた以前の実験から予想されるように、かつ図３６に示すように、Ｐ１膵島細胞を含有するＮＩは、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰＹ、ＰＤＸ１、及びＵＣＮ３ ｍＲＮＡを発現した。また、マウス及びイヌ細胞について以前に見出されたように、これらの膵島細胞遺伝子のそれぞれの発現レベルは、新しく単離されたヒト膵島と比較して有意に低減した。言い換えれば、膵島関連遺伝子（ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰＹ、ＰＤＸ１、及びＵＣＮ３）は、投与に先立ってヒトＮＩで発現されるが、新しく単離されたヒト膵島のＮＩと比較して有意に低減し、イヌ及びマウスの培養増殖膵島細胞について以前に見出されたものに匹敵する。

ｈＮＩの治療的有効性
単回用量のｈＮＩは、糖尿病マウスにおける血糖コントロールを改善する。インスリン依存性ＤＭの治療に対するｈＮＩの治療効果を評価するために、１２匹の雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて糖尿病を発症させ、その後、それらを２つの群で６匹ずつに無作為化し、それらの血糖レベルを徐放性インスリンペレット（Ｌｉｎｂｉｔ）でコントロールした。血中グルコースレベルがコントロールされたら、マウスを、方法に記載されるように、ビヒクル又はｈＮＩのいずれかで処置した。この処置の後、マウスを８週間追跡し、その時点で、ヒトインスリンの存在を検出するために、ＥＬＩＳＡアッセイと併せて、方法に記載されているように、ｉ．ｐ ＧＴＴを行った。

図３７及び３８に示すように、糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの単回用量のｈＮＩの投与は、血清グルコース測定及びｉ．ｐ．ＧＴＴによって評価されるように、血糖コントロールを改善し、この改善は、ヒトインスリンの排他的分泌によって媒介される。

ｈＮＩの第２の用量の投与は、以前に処置された血糖異常マウスにおいて正常血糖を確立する。処置群のマウスは死亡しなかったが、ビヒクル処置対照群では４匹が死亡し、ｈＮＩ療法はビヒクル群に対して７週間有意に血糖コントロールを改善したが、正常血糖は維持されなかった（図３７及び３８）。

第１の投与後５９日目に、図３７Ａ及び３７Ｂ及び３８に示される不完全にコントロールされたマウスにおいて、第２の用量のｈＮＩが正常血糖を達成することができるかどうかを試験するために、全ての生存マウス（処置群ではｎ＝６、ビヒクル群ではｎ＝２）をインスリンペレット（Ｌｉｎｂｉｔ）で再度処置し、血糖レベルが正規化されたら、初回処置後６４日目に、１ｋｇ ｂｗ当たり２×１０ｅ５個のｈＮＩ（青色）又はビヒクル（赤色）で前と同様にｉ．ｐ．再投与した。第２のｉ．ｐ．ＧＴＴを、ｈＮＩの第２の用量の４１日後に投与した。第２の用量後、血中グルコースレベル及びｉ．ｐ．ＧＴＴ（図３７Ｄ及び３７Ｅ）を、ｈＮＩ処置群において、非糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスで観察されたパターンに正規化したが、ビヒクル処置群におけるｉ．ｐ．ＧＴＴは異常のままであった。

ヒトインスリンは、ビヒクル処置マウスではなく、ｈＮＩからの血清中で検出される。図３７Ｄに示されるｉ．ｐ．ＧＴＴ中に採取した血清を、方法に記載されるように、ヒトインスリンの存在についてＥＬＩＳＡによってアッセイした。ｈＮＩ処置したが、ビヒクル処置しなかったマウスからの血清のみが、ヒトインスリンを含有した（図３７Ｅ）。以前に報告されたように、非糖尿病ＮＯＤ／ＳＣＩＤにおけるｉｐ ＧＴＴ中のマウスインスリン分泌は生理学的であった（図示せず）。

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１３．ＬｅＢｌａｎｃ Ｋ，Ｄａｖｉｅｓ ＬＣ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．２０１５；１６８：１４０－１４６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｌｅｔ．２０１５．０５．００４
１４．Ｐｌｏｃｋ ＪＡ，Ｓｃｈｎｉｄｅｒ ＪＴ，Ｚｈａｎｇ Ｗ，Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ Ｒ，Ｔｓｕｊｉ Ｗ，Ｋｏｓｔｅｒｅｖａ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｄｉｐｏｓｅ－ａｎｄ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｒａｆｔ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ａｌｌｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２０１５；９９：１７６５－１７７３．ｄｏｉ：１０．１０９７／ＴＰ．０００００００００００００７３１
１５．Ｖｒａｂｅｌｏｖａ Ｄ，Ａｄｉｎ ＣＡ，Ｋｅｎｚｉｇ Ａ，Ｇｉｌｏｒ Ｃ，Ｘｕ Ｆ，Ｂｕｓｓ ＪＬ，ｅｔ ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｉｇｈ－ｙｉｅｌｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｄｅｃｅａｓｅｄ ｃａｎｉｎｅ ｄｏｎｏｒｓ．Ｄｏｍｅｓｔ Ａｎｉｍ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２０１４；４７：１１９－１２６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｄｏｍａｎｉｅｎｄ．２０１３．０１．００６
１６．Ｗｏｏｌｃｏｔｔ ＯＯ，Ｂｅｒｇｍａｎ ＲＮ，Ｒｉｃｈｅｙ ＪＭ，Ｋｉｒｋｍａｎ ＥＬ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＬＮ，Ｉｏｎｕｔ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ Ｉｓｏｌａｔｅ Ｈｉｇｈｌｙ Ｐｕｒｅ Ｃａｎｉｎｅ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｉｓｌｅｔｓ．Ｐａｎｃｒｅａｓ．２０１２；４１：３１－３８．ｄｏｉ：１０．１０９７／ＭＰＡ．０ｂ０１３ｅ３１８２２１ｆｄ０ｅ
１７．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ ＭＦ，Ｍａｃｋａｙ ＡＭ，Ｂｅｃｋ ＳＣ，Ｊａｉｓｗａｌ ＲＫ，Ｄｏｕｇｌａｓ Ｒ，Ｍｏｓｃａ ＪＤ，ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９；２８４：１４３－７．Ａｖａｉｌａｂｌｅ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／１０１０２８１４
１８．Ｔｏｇｅｌ Ｆ，Ｈｕ Ｚ，Ｗｅｉｓｓ Ｋ，Ｉｓａａｃ Ｊ，Ｌａｎｇｅ Ｃ，Ｗｅｓｔｅｎｆｅｌｄｅｒ Ｃ．Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ａｃｕｔｅ ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００５；２８９：Ｆ３１－４２．ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｒｅｎａｌ．００００７．２００５
１９．Ｃｒｏｐ ＭＪ，Ｂａａｎ ＣＣ，Ｋｏｒｅｖａａｒ ＳＳ，ＩＪｚｅｒｍａｎｓ ＪＮＭ，Ａｌｗａｙｎ ＩＰＪ，Ｗｅｉｍａｒ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｄｏｎｏｒ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｓｕｐｐｒｅｓｓ Ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｋｉｄｎｅｙ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２００９；８７：８９６－９０６．ｄｏｉ：１０．１０９７／ＴＰ．０ｂ０１３ｅ３１８１９ｂ３ｄ７２
２０．Ｔｏｇｅｌ ＦＥ，Ｗｅｓｔｅｎｆｅｌｄｅｒ Ｃ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ａ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ＡＫＩ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０１０；６：１７９－１８３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｎｅｐｈ．２００９．２２９
２１．Ｔｏｇｅｌ ＦＥ，Ｗｅｓｔｅｎｆｅｌｄｅｒ Ｃ．Ｋｉｄｎｅｙ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｃｕｔｅ ｉｎｊｕｒｙ：ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．２０１２；６０：１０１２－２２．ｄｏｉ：１０．１０５３／ｊ．ａｊｋｄ．２０１２．０８．０３４
１７．Ｗｅｓｔｅｎｆｅｌｄｅｒ Ｃ，Ｇｏｏｃｈ Ａ，Ｈｕ Ｚ，Ａｈｌｓｔｒｏｍ Ｊ，Ｚｈａｎｇ Ｐ．Ｄｕｒａｂｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ Ａｃｈｉｅｖｅｄ ｂｙ Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ“Ｎｅｏ－Ｉｓｌｅｔｓ，”Ｔｈｒｅｅ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｏｆ Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ Ｉｓｌｅｔ ａｎｄ“Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ”．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．２０１７ Ｊｕｌ；６（７）：１６３１－４３．Ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／２８４６７６９４
１８．Ｔｏｇｅｌ ＦＥ，Ｗｅｓｔｅｎｆｅｌｄｅｒ Ｃ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ａ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ＡＫＩ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｐｈｒｏｌ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．２０１０ Ｍａｒ［ｃｉｔｅｄ ２０１３ Ｓｅｐ ３］；６（３）：１７９－８３．Ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／２０１８６２３３
１９．Ｔｏｇｅｌ ＦＥ，Ｗｅｓｔｅｎｆｅｌｄｅｒ Ｃ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ａｃｕｔｅ Ｉｎｊｕｒｙ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．２０１２ Ｄｅｃ［ｃｉｔｅｄ ２０１３ Ａｕｇ １０］；６０（６）：１０１２－２２．Ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／２３０３６９２８

Claims (34)

1. 細胞クラスターを作製する方法であって、前記方法は、
   膵島細胞を少なくとも５回の集団倍加のために増殖させることと、
   細胞クラスターであって、
   増殖させた前記膵島細胞と、
   間葉系幹細胞又は脂肪幹細胞と、を含む、細胞クラスターを形成することと、を含む、方法。
2. 膵島細胞を少なくとも５回の集団倍加のために増殖させることが、前記膵島細胞を少なくとも１０回の集団倍加のために増殖させることを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記膵島細胞が、ヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
4. 前記膵島細胞が、成人ドナーから得られる初代膵島細胞である、請求項１に記載の方法。
5. 前記膵島細胞が、増殖前に研究グレードとして分類される、請求項１に記載の方法。
6. 前記成人ドナーが、８０未満の北米膵島ドナースコア（ＮＡＩＤＳ）を有した、請求項４に記載の方法。
7. 前記成人ドナーが、６５未満のＮＡＩＤＳを有した、請求項６に記載の方法。
8. 前記膵島細胞が、２人以上のドナーから得られる、請求項１に記載の方法。
9. 前記膵島細胞が単一のドナーから得られ、糖尿病の治療に十分な１００回を超える用量の細胞クラスターが形成される、請求項１に記載の方法。
10. 前記糖尿病の治療に十分な１，０００回を超える用量の細胞クラスターが形成される、請求項９に記載の方法。
11. 前記糖尿病の治療に十分な１０，０００回を超える用量の細胞クラスターが形成される、請求項９に記載の方法。
12. 前記糖尿病の治療に十分な細胞クラスターの単回用量が、少なくとも７．００Ｅ＋０９個の増殖させた膵島細胞を含む、請求項９に記載の方法。
13. 糖尿病の治療に使用するための、請求項１に記載の方法によって得られる細胞クラスター。
14. 糖尿病を治療する方法であって、前記方法が、
    糖尿病に罹患している対象に、治療的に十分な数の請求項１３に記載の細胞クラスターを投与することを含む、方法。
15. 糖尿病に罹患している対象に２回用量の細胞クラスターを投与することを更に含む、請求項１４に記載の方法。
16. ２回用量の細胞クラスターを投与された前記対象が、持続的な正常血糖を達成する、請求項１５に記載の方法。
17. 前記治療的に十分な量の前記細胞クラスターが、少なくとも７．００Ｅ＋０９個の増殖させた膵島細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
18. 細胞クラスターを作製する方法であって、前記方法は、
    膵島細胞を増殖させることと、
    細胞クラスターであって、
    増殖させた前記膵島細胞と、
    間葉系幹細胞又は脂肪幹細胞と、を含む、細胞クラスターを形成することと、を含み、
    前記膵島細胞は、成人ドナーから得られた初代膵島細胞であり、
    前記成人ドナーは、８０未満の北米膵島ドナースコア（ＮＡＩＤＳ）を有した、方法。
19. 前記膵島細胞を増殖させることが、前記膵島細胞を少なくとも５回の集団倍加のために増殖させることを含む、請求項１に記載の方法。
20. 前記膵島細胞を増殖させることが、前記膵島細胞を少なくとも１０回の集団倍加のために増殖させることを含む、請求項１に記載の方法。
21. 前記膵島細胞が、ヒト細胞である、請求項１８に記載の方法。
22. 前記初代膵島細胞が、研究グレードとして分類される、請求項１８に記載の方法。
23. 前記成人ドナーが、６５未満のＮＡＩＤＳを有した、請求項１８に記載の方法。
24. 前記初代膵島細胞が単一のドナーから得られ、糖尿病の治療に十分な１００回を超える用量の細胞クラスターが形成される、請求項１７に記載の方法。
25. 前記糖尿病の治療に十分な１，０００回を超える用量の細胞クラスターが形成される、請求項２４に記載の方法。
26. 前記糖尿病の治療に十分な１０，０００回を超える用量の細胞クラスターが形成される、請求項２４に記載の方法。
27. 前記糖尿病の治療に十分な細胞クラスターの単回用量が、少なくとも７．００Ｅ＋０９個の増殖させた膵島細胞を含む、請求項２４に記載の方法。
28. 糖尿病の治療に使用するための、請求項１８に記載の方法によって得られる細胞クラスター。
29. 糖尿病を治療する方法であって、前記方法は、
    糖尿病に罹患している対象に、治療的に十分な数の請求項１３及び／又は請求項２８に記載の細胞クラスターを投与することを含む、方法。
30. 前記治療的に十分な数の前記細胞クラスターが、少なくとも７．００Ｅ＋０９個の増殖させた膵島細胞を含む、請求項２９に記載の方法。
31. 糖尿病に罹患している対象に２回用量の細胞クラスターを投与することを更に含む、請求項２９に記載の方法。
32. ２回用量の細胞クラスターを投与された前記対象が、持続的な正常血糖を達成する、請求項３１に記載の方法。
33. 前記対象が、拒絶反応抑制薬を投与されない、請求項２９に記載の方法。
34. 前記細胞クラスターが、カプセル化されていないか、又はカプセル化デバイスに関連付けられていない、請求項２９に記載の方法。