WO2012014911A1 - 細胞分離用酵素溶液及び細胞分離方法、並びに膵島分離方法 - Google Patents
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Abstract
Description
しかし、いずれの方法も十分に満足のいくものとは言えず、膵島に対するダメージを低減する新たなアプローチが望まれていた。
本発明の第1の態様における細胞分離用酵素溶液は、塩化物イオンチャネル阻害剤を含有することを特徴とする。
塩化物イオンチャネル阻害剤の濃度は0.05~1mMが好ましく、0.1~0.5mMがより好ましい。
例えば、細胞分離用酵素溶液の組成中の塩化ナトリウムをグルコン酸ナトリウムで置換することにより、塩化物イオン濃度を低下させることができる。
本発明に係る細胞分離方法は、上述した本発明に係る細胞分離用酵素溶液を用いて、組織又は臓器から、特には摘出された組織又は臓器から、単個細胞又は細胞集団を分離する工程を含むものである。この細胞分離方法は、従来、細胞分離用酵素溶液を用いて組織又は臓器から単個細胞又は細胞集団を分離している領域に広く適用可能である。このような適用領域としては、例えば、膵臓からの膵島の分離、肝臓、神経、血管等の再生医療、組織からの癌細胞の分離、組織からの幹細胞の分離、生殖医療における卵巣からの卵母細胞の分離等が挙げられる。以下では一例として、膵臓からの膵島を分離する膵島分離方法について説明する。
ヒトを含む動物の場合、膵臓を分解するには、まず、摘出された膵臓の膵菅を介して本発明に係る細胞分離用酵素溶液を注入し、膵臓を膨化させる。細胞分離用酵素溶液の注入は、例えば、ポンプを用いて注入圧力調節下に、細胞分離用酵素溶液を主膵菅に注入することにより行うことができる。
膵臓に細胞分離用酵素溶液を注入した後、適当な装置を用いて細胞分離用酵素溶液の温度を37℃程度に上昇させて酵素を活性化させることにより、分解を開始することができる。例えば酵素としてコラゲナーゼを用いる場合、温度の上昇によりコラゲナーゼが活性化し、結合組織を形成するコラーゲンを溶解することにより、膵組織が分解する。
分解の停止は、細胞分離用酵素溶液の温度を低下させることにより行うことができる。また、血清蛋白(アルブミン等)を加えて酵素を不活化することにより分解を停止させることもできる。
分解を停止した後は、膵組織を回収する。回収した膵組織は、純化工程の前に遠心分離を行って濃縮しておくことが好ましい。
膵島の純化は、膵島が膵外分泌組織に比べて比重が軽いことを利用して行うことができる。具体的には、回収した膵組織を用いて密度勾配遠心を行うことにより、膵島と膵外分泌組織とを分離し、膵島を回収することができる。
なお、以下の実施例では9~10週齢のラットを膵島のドナーとして用いた。また、レシピエントとして、9~10週齢のSCIDマウスを用いた。このSCIDマウスに対して、ジエチルエーテルでの麻酔下にストレプトゾシン(STZ;250mg/kg)の腹腔内投与を行い、β細胞を破壊することで糖尿病を誘導した。2日連続して随時血糖値が350mg/dLを超えたマウスを糖尿病マウスとみなし、レシピエントとした。
ラットを8匹ずつの3群(対照群、DIDS群、低Cl-群)に分けた後、各ラットにエーテル麻酔を施して開腹し、十二指腸への入口付近で総胆管をクランプし、カニューレを挿入した。そして、そのカニューレから膵菅を介して膵臓に、コラゲナーゼ(2mg/mL)を含有する12mLのハンクス液(NaCl:8000mg/mL,KCl:400mg/mL,MgSO4:48.8mg/mL,MgCl2:46.8mg/mL,CaCl2:140mg/mL,KH2PO4:60mg/mL,Na2HPO4:47.9mg/mL,グルコース:1000mg/mL)を注入した。ただし、DIDS群については、塩化物イオンチャネル阻害剤であるDIDS(200μM)をさらに添加し、低Cl-群については、ハンクス液中の塩化ナトリウムをグルコン酸ナトリウムで置換した。
膵島のダメージの程度は、細胞膜のバリア機能が保持できているか否かで評価することができる。そこで、実施例1にて分離した各群の膵島(各群ともにn=8)を、蛍光色素であるアクリジンオレンジ(AO)及びヨウ化プロピジウムを用いて染色した。なお、AOは生細胞においても細胞に取り込まれて緑色の蛍光を発し、PIは細胞膜のバリア機能の破綻によって細胞に取り込まれ、DNAと結合することで赤色の蛍光を発する。具体的には、AO(10μM)及びPI(15μM)をPBSに溶かし、その液中にて膵島を10分間インキュベーションした後、膵島を蛍光顕微鏡観察した。そして、画像解析ソフト(Image J free software)を用いて、緑色蛍光の面積と赤色蛍光の面積とを求め、赤色蛍光の面積を除いた緑色蛍光の面積の割合(%)を膵島のバイアビリティ(%)とした。
実施例1にて分離した各群の膵島について、低濃度(3.3mM)及び高濃度(20mM)のグルコース刺激に対するインスリン分泌能を測定した。測定の前段階として、直径150~200μmの膵島(各群ともにn=10)を12穴トランスウェルマイクロプレート(Corning Transwell 3403;ポアサイズ12μm)上で24時間培養した。培地としては、3.3mMグルコース及び0.1%牛胎仔血清を含有するRPMI1640培地を用い、37℃、5%CO2/95%大気条件とした。
測定に際しては、膵島が置かれているトランスウェルの培地を3.3mMグルコース及び0.1%牛胎仔血清を含有するRPMI1640培地で置き換え、60分間、前培養を行った。なお、培養は全て37℃、5%CO2/95%大気条件で実施した。その後、膵島が置かれているトランスウェルを、同様の培地の入った新たなウェルに移して60分間静置した(サンプルA)。さらに、膵島が置かれているトランスウェルを、20mMグルコースを含有する培地の入った新たなウェルに移して60分間静置した(サンプルB)。その後、サンプルA、サンプルBの培地を回収し、ELISA法を利用したインスリン測定キット(森永生化学工業製)を用いて、培地に含まれているインスリンを測定した。そして、サンプルBのインスリン濃度をサンプルAのインスリン濃度で割った値をインスリン分泌刺激インデックスとした。結果を下記の表1に示す。
実施例1にて分離した各群の膵島を、4%パラホルムアルデヒドを用いて4℃で1日間固定し、パラフィン包埋した。その後、5μm厚の切片を作成してプレパラートにマウントし、In Situ Apoptosis Detection Kit(タカラバイオ製)を用いてTUNEL染色を行った。対照群、DIDS群、低Cl-群におけるTUNEL染色の結果をそれぞれ図3(A),(B),(C)に示す。
また、実施例1にて分離した各群の膵島を、4%パラホルムアルデヒドを用いて4℃で1日間固定し、パラフィン包埋した。その後、5μm厚の切片を作成してプレパラートにマウントし、HE染色を行った。対照群、DIDS群、低Cl-群におけるHE染色の結果をそれぞれ図4(A),(B),(C)に示す。
このことから、膵島分離中に起こる細胞死は、細胞膨化から生じるネクローシスであると考えられる。本発明に係る細胞分離用酵素溶液を用いることで、そのような細胞死を抑制することができる。
実施例1にて分離した各群の膵島(200IEQ)を、STZ処理による糖尿病モデルSCIDマウス(各群ともにn=5)の腎皮膜下に移植した。糖尿病モデルSCIDマウスの選別については、採血により2日連続して随時血糖値が350mg/dLを超えるものを採用した。移植に際しては、マウスにエーテル麻酔を施し、左腎の腎皮膜下に250μLピペットチップを用いて膵島を注入した。移植後、最初の7日間は毎日採血を行って血糖値を測定し、その後は週に3回、血糖値を測定した。そして、移植後30日目に膵島移植腎を摘出した。なお、糖尿病の治癒の定義は、血糖値が3日連続して150mg/dL未満であり、腎摘後に血糖値が250mg/dL超まで上昇した場合とした。対照群、DIDS群、低Cl-群における血糖値の測定結果をそれぞれ図5(A),(B),(C)に示す。
なお、移植後に正常血糖となった全てのマウスは、腎摘後に高血糖に戻った。
膵島の機能をさらに調べるため、実施例5における膵島移植後25日目のマウスに対して腹腔内グルコース負荷試験を行った。試験の前8時間は絶食として、体重kg当たり2.5gのグルコースを生理食塩水に加えてマウスの腹腔内に注入した。マウスとしては、膵島移植を行った糖尿病モデルSCIDマウス(対照群、DIDS群、低Cl-群;各群ともにn=5)と膵島移植を行っていないSCIDマウス(正常群;n=5)とを用いた。そして、グルコース投与前、及び投与後10,30,60,90,120分の時点で血糖値を測定した。結果を図6に示す。
Claims (6)
- 塩化物イオンチャネル阻害剤を含有する細胞分離用酵素溶液。
- 前記塩化物イオンチャネル阻害剤の濃度が0.05~1mMである請求項1記載の細胞分離用酵素溶液。
- 塩化物イオン濃度が10mM以下である細胞分離用酵素溶液。
- 塩化物イオンがハロゲン化物イオン以外の陰イオンによって置換されている請求項3記載の細胞分離用酵素溶液。
- 請求項1から4のいずれかに記載の細胞分離用酵素溶液を用いて、組織又は臓器から単個細胞又は細胞集団を分離する工程を含む細胞分離方法。
- 膵菅を介して請求項1から4のいずれかに記載の細胞分離用酵素溶液を注入し、膵臓を分解する工程を含む膵島分離方法。
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