JP2000514654A

JP2000514654A - 下垂体分化因子およびその使用方法

Info

Publication number: JP2000514654A
Application number: JP10506128A
Authority: JP
Inventors: ミクスニカプラティカ; オヴィディウプラティカ; ジェイムズエフ．ホランド
Original assignee: ジェイムズエフ．ホランド; ミクスニカプラティカ; オヴィディウプラティカ
Priority date: 1996-07-11
Filing date: 1997-07-09
Publication date: 2000-11-07
Also published as: WO1998002525A1; EP0970187B1; CA2259136A1; AU3796297A; EP0970187A1; ATE295874T1; EP0970187A4; US5888817A; US5795740A; DE69733320D1; DE69733320T2; AU737913B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、下垂体分化因子（ＰＤＦ）、すなわち乳癌及び前立腺癌細胞を含む細胞を分化することができる下垂体因子に関する。ＰＤＦをコードする単離された核酸及び関連するベクター及び宿主細胞も提供される。悪性にトランスフォームされた細胞の分化能力の回復は、癌治療のモダリティーを提供する。単離され精製された本発明のＰＤＦは、従って乳癌及び前立腺癌の処置に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】下垂体分化因子およびその使用方法発明の背景悪性のトランスフォーメーションは、増殖と分化の非連携を特徴とし、分化の進行能力を消失した細胞の連続的増幅をもたらす。従って、癌細胞の分化能力を回復し得る薬剤は、癌治療に潜在的に有用である。様々な抽出物、タンパク質および化学薬品が、インビトロおよびインビボで特定の癌細胞の分化を誘導することが示されてきた。例えば、Sachsら(1987)Cance r Research 47：1981は、骨髄性白血病細胞が正常な分化タンパク質によりインビトロおよびインビボで分化を誘導できる観察を含む、白血病骨髄造血細胞の分化誘導の概説を提供する。Tallmanら(1992)J.Clin.Pharmacol. 32：868は、癌治療におけるレチノイドの役割を概説している。レチノイドは、膀胱と乳房の癌および白血病の予防ならびに治療のための分化剤として調べられてきた。Platicaら(1992)Endocrinology 131：2573は、ウシの下垂体およびラットのプロラクチン・成長ホルモン産生細胞腫瘍の抽出物がラット乳房腫瘍細胞の分化を誘導することを報告している。インビトロ研究およびインビボでの齧歯類研究で同定された分化剤は、臨床的にも評価された。例えば、ヘキサメチレンビスアセトアミドおよびレチノイン酸を含む分化剤は、癌治療および予防の臨床試験に入り、Linskeyら(1995)Neurosu rgery 36：１によって概説されている。急性前骨髄性白血病の治療ための分化剤の成功した使用は、Warrellら(1993)New Engl.J.Med ．329：177によって報告された。レチノイドは、Lippmanら(1993)J.Natl.Cancer Inst.85：499によって、予宮頸癌の処置に治療的に有用であることが示された。癌細胞を分化誘導させ、従って、より正常な特性を仮定する分化剤の臨床的使用は、分化治療と名付けられている。分化治療は、細胞障害性化学療法のような慣用されている癌治療への代替的アプローチを提供する。従って、当分野において、癌細胞の分化を促進し得る新しい薬剤の同定および単離または合成に対する要請がある。発明の概要本発明は、乳癌および前立腺癌細胞を含む細胞を分化し得る下垂体因子である、下垂体分化因子(PDF)に関する。１つの実施態様において、本発明は、PDFをコードする単離された核酸を提供する。PDFをコードする単離された核酸を含むベクターおよび宿主細胞が、さらに提供される。本発明の他の実施態様は、単離され精製されたPDFおよびその生物学的に活性なアナローグとフラグメント、並びにPDFおよびその生物学的に活性なアナローグとフラグメントを作製する方法を提供する。本発明はさらに、乳房または前立腺の癌細胞を分化促進有効量のPDFと接触させることを包含する、乳癌または前立腺癌細胞の分化を促進する方法を提供する。本発明の他の実施態様は、そのような治療を必要としている患者に治療的有効量のPDFを投与することを包含する、乳癌または前立腺癌の治療方法を提供する。本発明の他の実施態様では、PDFまたはその生物学的に活性なアナローグもしくはフラグメントを薬学的に許容される担体と混合して含む薬学的組成物が提供される。図面の簡単な説明図１は、PDFの存在しない馴化培地でのMCF-7ヒト乳癌細胞を示す。図２は、PDFをコードするcDNAを注入された卵母細胞のライゼートで処理されたMCF-7ヒト乳癌細胞を示し、PDFで誘導された凝集を示す。図３は、PDFの非存在下に培養されたDU145前立腺癌細胞を示す。図４は、DU145細胞上でPDFにより誘導された、凝集およびスフェロイド(spher oid)形成を含む、形態学的変化を示す。図５は、配列番号：１のヌクレオチド配列を提供する。図６は、MCF-7細胞中のスフェロイド形成に対する、PDF含有卵母細胞ライゼートの効果を示すグラフである。図７は、DU-145細胞中のスフェロイド形成に対する、PDFの効果を示すグラフである。発明の詳細な説明本発明は、下垂体分化因子(PDF)に関する。PDFは、哺乳動物の下垂体から、およびMtTW10を含む下垂体腫瘍から得られ得るポリペプチドである。PDFは、乳癌および前立腺癌細胞を含む細胞の分化を促進する。１つの実施態様では、本発明は、PDFをコードする単離された核酸を提供する。PDFをコードする2.2kB cDNAを含むpBS-PDF1と名付けたプラスミドは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)、12301パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド20852に寄託され、利用番号ATCC 97648を与えられた。好ましい実施態様では、PDFをコードする単離された核酸は、図５に示される配列番号：１のヌクレオチド配列を含む。本発明によれば、PDFをコードする単離された核酸は、発現クローニングにより哺乳動物の下垂体から得られ得る。哺乳動物の下垂体cD NAライブラリーは、例えば、Sambrookら(1989)Molecular Cloning：A Laborator y Manual ，第２版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,コールドスプリングハーバー，ニューヨーク州に記載されるような当業者に公知の方法によって調製され得る。さらに、哺乳動物の下垂体cDNAライブラリーは、例えば、Clonetech 、パロアルト、カリフォルニア州から市販されている。ヒト下垂体ライブラリーが、好ましい。 PDFをコードする単離された核酸は、ライブラリーのｃDNAクローンを発現し、発現産物をPDF活性について機能性アッセイで評価することによって、哺乳動物c DNAライブラリーから得られた。様々な発現システムが、当業者に公知である。好ましい実施態様では、アフリカツメガエル卵母細胞を、下垂体cDNA発現のための宿主として使用する。外因性核酸の発現のためのアフリカツメガエル卵母細胞の使用は、当業界で公知であり、例えば、Gurdonら(1983)Methods in Enzymolog y 101：370に記載されている。強力なプロモーター制御下に下垂体cDNAを含む発現ベクターは、卵母細胞の核に注入され得、その後で卵母細胞は１〜数日間インキュベートされ、卵母細胞ライゼートまたは馴化培地(CM)をPDF活性について評価する。或いは、mRNAは、下垂体cDNAからインビトロで合成され、卵母細胞に注入され、その後、下記のようにPDF活性について卵母細胞またはCMが評価され得る。下垂体cDNAは、プールに分割され得、それからRNAが合成され、卵母細胞に注入され、機能性活性についてテストされる。陽性プールはサブグループに分割され、PD Fをコードする単一のcDNAが同定されるまで該プロトコールを繰り返す。 PDFの同定に有用なバイオアッセイは、乳房および前立腺の癌細胞の分化を促進するPDFの能力に基づく。ここに記載されるようにPDFの分化誘導活性に反応するあらゆる乳房および前立腺の癌細胞は、本発明のバイオアッセイにおける使用に好適である。様々な培養された乳房および前立腺の癌細胞は、ATCCから入手される。好ましい非制限的実施態様では、バイオアッセイに使用される乳癌細胞は、D．Sirbascu、テキサス大学医学部、ヒューストン、テキサス州から入手されるラット乳房腫瘍細胞系MTW9/P1またはATCCから入手されるMCF-7ヒト乳癌細胞である。他の好ましい実施態様では、前立腺癌細胞は、ATCCから入手されるヒト前立腺細胞系DU145である。乳房または前立腺の癌細胞をPDFで処理すると、未分化癌細胞の分化を引き起こす。分化は、正常な乳房または前立腺の構造への分化と一致する形態学的および生化学的パラメーターによって測定され得る。通常、単一細胞懸濁液として培地中で増殖する癌細胞は、PDF処理から２４時間以内に凝集し、スフェロイドを形成する。凝集は、懸濁された単一細胞を取り出してカウントし、次に残っている凝集した接着細胞を剥がしてカウントし、次に凝集した全細胞のパーセンテージを測定することにより、測定され得る。未処理細胞と比較して、処理細胞の凝集の統計的に有意な増加は、PDF活性の証拠である。従って、凝集の測定は、PDF活性に関する単純で好都合なバイオアッセイを提供する。凝集バイオアッセイは、下記のように行われ得る。約１×10⁵個の乳癌細胞、例えばMTW9/P1細胞を、血清を含まないダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)1ml中で、約10ng/ml〜約10μｇ/mlの濃度の下垂体cDNAの発現産物の存在下または非存在下に増殖させる。培養物を、37℃で５％ CO₂雰囲気で約72時間インキュベートする。血清を含まないDMEMでリンスすることにより、懸濁された単一細胞を取り出し、次にカウントする。残りの凝集した接着細胞を、トリプシン-EDTAによるトリプシン処理を５分間して剥がし、次にカウントする。細胞は、好都合には、格子状(gridded)の培養皿上で光学顕微鏡下に細胞を観察してカウントされる。下垂体cDNA発現産物による処理に応答した、凝集の用量反応性増加は、cDNAがPDFをコードすることを示す。スフェロイド形成アッセイは、下記のように行なわれ得る。約１×10⁵個の前立腺癌細胞、例えばDU145細胞を、10％ウシ胎児血清(FBS)(Bio Whittacker、ウォーカーズヴィル、メリーランド州）、10IUペニシリン/mlおよび50mgストレプトマイシン/mlを補足したRPMI 1640培地(Sigma)で、37℃にて５% CO₂雰囲気で増殖させる。培養物を、様々な濃度のPDF、例えば、50-300ug/ml培養物で処理する。72時間後、スフェロイドの形成に関して、培養物をスコア化する。スフェロイドは、個々の判別可能な細胞形態を有さない多細胞性凝集物(multicellular agg regates)として定義される。培養物は、好都合には、格子状培養皿を光学顕微鏡で観察し、スフェロイドをカウントしてスコア化する。スフェロイド形成の用量依存性増加は、PDF生物学的活性の指標である。上記の凝集バイオアッセイを修飾したものでは、凝集およびスフェロイド形成は、固定切片の光学顕微鏡または電子顕微鏡観察によって検出され得る。上記のような細胞の培養および処理の後、培養細胞を固定し、当分野で公知の方法により顕微鏡用に切片化する。例えば、培養細胞を、0.1Mカコジル酸緩衝液中1.5％グルタルアルデヒド中で１時間固定する。低速遠心分離で得られるペレットを、コリジン緩衝液中1.5％四酸化オスミウム中で30分間、次にマレイン酸緩衝液中酢酸ウラニル中で30分間、後固定し、続いて、Epon 812中で脱水し包埋する。光学顕微鏡用に、１μｍ切片をメチレンブルー、アズールIIおよび塩基性フクシン(basic fuchsin )で染色する。電子顕微鏡用に、60〜90nm切片を切り出し、酢酸ウラニル−クエン酸鉛で染色する。続いて、凝集およびスフェロイド形成は、光学または電子顕微鏡により可視化され得る。未処理細胞と比較した、処理細胞の凝集およびスフェロイド形成の統計的に有意な増加は、PDFの生物学的活性の証拠である。乳癌細胞のPDF処理は、顕微鏡で観察され得る他の効果を生じ、従って、更なるPDFアッセイを提供する。光学顕微鏡によって、PDF処理細胞は未処理細胞よりもサイズが小さく、腺形成と一致する類器官(organoid)構造にクラスター化されることが観察され得る。電子顕微鏡によって、処理細胞がより小さく、未処理細胞よりも小さい核を有することが観察され得る。さらに、細胞質は、細胞質に液胞を形成した未処理細胞とは反対に、リソソームおよび小胞体のような分極化オルガネラに富み、ミトコンドリア以外のオルガネラは殆どない。 PDF処理した乳癌細胞も、PDFのための更なるバイオアッセイを提供する生化学的変化を受ける。特に、分化した乳房細胞でのみ分泌されるラクトアルブミンは、PDF処理したMTW9/P1細胞によって産生されるが、未処理細胞によってはされない。従って、例えば慣用されているノーザンもしくはウェスタンブロット、組織化学的技術、またはイムノアッセイで検出されるようなラクトアルブミンの合成は、PDFに関する別のバイオアッセイを提供する。上記のクローニング法およびバイオアッセイによって、PDFをコードする単離されたcDNAが同定された。従って、本発明によると、単一ポリペプチドをコードする単一の核酸が下垂体分化活性を指示することが発見された。 PDFをコードする単離された核酸は、更に、そのヌクレオチド配列によって特徴付けられ得る。ヌクレオチド配列決定は、例えば、Sangerら(1977)Proc.Natl. Acad.Sci.74 ：5463のジデオキシ鎖終結法を含む、当業者に公知の方法で達成され得る。本発明によるPDFをコードする単離された核酸は、図５の配列番号：１に示される配列を含む。本発明は、任意の上記のバイオアッセイで測定されるような乳癌細胞の分化を促進する能力を有するポリペプチドである、PDFをコードする哺乳動物の下垂体および下垂体腫瘍から得られ得る単離された核酸を包含する。好ましい実施態様では、該核酸は、プラスミドpBS-PDF1に含まれ、図５の配列番号：１に示される配列を含む、2.2kB核酸である。別の好ましい実施態様では、単離された核酸は、フラグメントが生理学的に活性なPDFをコードする2.2kB挿入切片の連続的フラグメントである。当業者は、慣用されている分子生物学的技術によって2.2kB挿入切片のフラグメントを得、該フラグメントを含む発現ベクターを調製し、核酸を発現し、PDFをコードするフラグメントを同定するために上記のようなPDF活性について得られた産物をアッセイすることができる。 PDFをコードする単離された核酸はまた、配列番号：１の配列またはそのフラグメントを有する合成核酸を、下垂体核酸のプールから所望の核酸を単離するためのプローブとして用いることにより得られ得る。好適な方法は、例えば、Samb rookらによって記載されている。本発明の好ましい実施態様では、PDFをコードする単離された核酸は、プラスミドpBS-PDF1の2.2kB挿入切片に含まれている。本発明はさらに、プラスミドpBS -PDF1の2.2kB挿入切片に含まれている核酸のアナローグを包含し、ここで該アナローグはPDFをコードする。例えば、遺伝暗号の同義性の知識を有する当業者は、プラスミドpBS-PD F1の挿入切片にコードされているアミノ酸配列をコードする核酸配列を決定できる。さらに、配列は、選択した宿主生物に関する公知の好ましいコドンを利用して特定の宿主生物で発現を最適化するために選択され得る。さらに、アナローグは、生物学的活性には必要でない残基の置換または欠失を作ることによって作製され得る。そのようなアナローグは、上記のバイオアッセイによって同定され得る。本発明は、更に、哺乳動物の下垂体または下垂体腫瘍から単離され得る、および中度または高度のストリンジェンシー条件下でプラスミドpBS-PDF1の2.2kB挿入切片あるいは配列番号：１の配列を有する単離された核酸もしくはその相補体にハイブリダイズ可能であり更に生物学的に活性なPDFをコードし得る核酸を包含する。中度または高度のストリンジェンシー条件は、当業者に公知であり、例えば、SambrookらおよびBeltzら(1983)Methods Enzymol. 100：226に記載されている。高いストリンジェンシー条件は、例えば、緩衝水溶液中で68℃で又は50％ホルムアミド中42℃でのハイブリダイゼーションを含む。中度のストリンジェンシー条件は、代表的には、水溶液の温度を低くし、ホルムアミドの量を減少し、イオン強度を増大させることによって達成される。本発明の単離された核酸の生物学的活性PDFをコードする能力は、上記の機能性アッセイによって測定され得る。本発明は更に、本発明の単離された核酸を含むベクターに関する。ベクターは、PDFをコードする核酸の増幅および／または発現に有用である。１つの実施態様では、本発明のベクターは、好適な宿主細胞でPDF発現を起こさせるように、好適な転写および／または翻訳調整エレメントと作動可能に連結されたPDFをコードする核酸を含む。調整エレメントは、哺乳動物、細菌、ウイルスまたは昆虫の遺伝子に由来し得、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳開始配列、終止配列、複製起点、並びにリーダーおよび輸送配列をコードする配列を含む。好適な調整エレメントは、望ましい宿主細胞での最適な発現のために選択される。有用な発現ベクターは、当業者に公知の方法によって構築され得、また市販されてもいる。レトロウイルス、パルボウイルス、デンソウイルス(denso virus)およびバキュロウイルスを含む組換えウイルス・ベクターが特に好ましい。好ましい実施態様では、発現ベクターは、PDFをコードする核酸に作動可能に連結された強力な構成性または誘導性プロモーターを含む。好適なプロモーターは、当業者に周知であり容易に入手され、例えば、細菌、酵母、ウイルス、哺乳動物、および昆虫のプロモーターを含む。昆虫および哺乳動物細胞と適合性の発現ベクターが、特に好ましい。本発明の別の実施態様は、PDFをコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。該核酸を含む宿主細胞は、PDFをコードする核酸を複製し発現するのに有用である。宿主細胞は、原核生物または真核生物であって良く、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物の細胞を含む。昆虫および哨乳動物の細胞が好ましい。特に好ましい宿主細胞は、例えば、Spodoptera frugiperdaおよびTrichoplusia ni細胞を含む昆虫細胞系である。単離された核酸または発現ベクターは、形質転換、トランスフェクションおよび感染を含む、当業者に公知の方法によって宿主細胞に導入され得る。例えば、トランスフェクションは、リポソーム仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション、裸のDNAトランスフェクション、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーションのような公知の方法によって達成され得る。原核細胞の形質転換法は、例えば、Cohenら(1972)Proc.Natl.Acad.Sci ．USA 69：2110に記載されている。真核宿主細胞の形質転換は、例えば、Sambro okらに記載されている。バキュロウイルス・ベクターおよび昆虫宿主細胞を利用する発現システムも、好ましい。鱗翅目の昆虫細胞を感染させるための組換え発現ベクターとしてのバキュロウイルスの使用は、当分野で公知であり、例えば、Luckowら(1988)BioTec hnology 6：47に記載されている。本発明は更に、単離され精製されたPDF並びにその生物学的活性なアナローグおよびフラグメントに関する。本発明の好ましい実施態様では、単離され精製されたPDFは、プラスミドpBS-PDF1中のDNAにコードされるアミノ酸配列を有する。単離され精製されたPDFは、例えば、形質転換、トランスフェクションまたは注入によってPDFをコードする核酸を好適な宿主細胞に導入し、発現に好適な条件下で宿主細胞を培養し、組換えPDFを回収することによって作製され得る。組換えPDFは、当分野で公知のタンパク質精製法によって細胞または培養培地から回収され得る。好ましい実施態様では、PDFをコードする核酸を好適なプロモーター制御下に含む発現ベクターを、昆虫または哺乳動物の宿主細胞に導入する。 PDFの生物学的活性なアナローグおよびフラグメントは、PDFの生物学的活性なアナローグまたはフラグメントをコードする核酸を利用して、同様に作製される。単離された組換えアナローグまたはフラグメントは、上記のバイオアッセイによって同定され得る。用語「アナローグ」は、PDFのアミノ酸配列の置換および改変を含み、その置換および改変はPDFの生物学的活性を維持する。アミノ酸挿入誘導体は、アミノおよびカルボキシ末端融合ならびに単一もしくは複数の配列内挿入を含む。欠失変異種は、配列から１以上のアミノ酸が除去されている。置換アミノ酸変異種では、少なくとも１個の残基が除去または他の残基で置換されている。生物学的活性なフラグメントは、PDFポリペプチドの全長を含まないが、PDFの生物学的活性を維持する、PDFまたはPDFアナローグのフラグメントである。生物学的活性アナローグおよびフラグメントは、例えばSambrookらに記載されている組換え法により、または固相ペプチド合成のような当分野で周知のペプチド合成技術によって作製され得る。本発明は、乳房または前立腺の癌細胞を、分化促進有効量のPDFまたはそのアナローグもしくはフラグメントと接触させることを包含する、乳癌または前立腺癌細胞の分化を促進する方法を提供する。分化促進有効量のPDFは、分化に関する任意の上記バイオアッセイによって、癌細胞の分化を促進する量である。本発明の他の実施態様は、治療的有効量のPDFまたはそのアナローグもしくはフラグメントを、そのような治療を必要としている患者に投与することを包含する、乳癌の治療方法を提供する。乳癌治療のためのPDFの治療的有効量は、形態学的または生化学的分化、腫瘍マーカーの減少、腫瘍退縮、アポトーシス、または腫瘍増殖もしくは侵襲の一部停止のような前哨(sentine l)腫瘍マスの挙動に変化をもたらす量である。PDFは、PDFまたはその生物学的活性なアナローグもしくはフラグメントおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物として投与される。本発明の他の実施態様は、治療的に有効量のPDFまたはそのアナローグもしくはフラグメントを、そのような治療を必要としている患者に投与することを包含する、前立腺癌の治療方法を提供する。前立腺癌治療のためのPDＦの治療的有効量は、前記のような前哨腫瘍マスの挙動に変化をもたらす量である。PDFは、PDF またはその生物学的活性なアナローグもしくはフラグメントおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物として投与される。薬学的組成物の剤型は、当分野で一般に公知であり、好都合にはRemington's Pharmaceutical Sciences，第１7版，Mack Publishing Co.，イーストン、ペンシルベニア州が参照できる。本発明で使用されるPDFまたはそのアナローグもしくはフラグメントの剤型は、製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対しても保護しなければならない。微生物混入に対する防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤の添加によって達成され得る。投与に好適なPDFの薬学的形態は、滅菌注射液または分散液の処方箋調合のための、滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末を含む。全ての場合において、形態は、滅菌性でなければならず、容易に注射器注入ができる程度まで流動性でなければならない。代表的な担体は、例えば、水緩衝化水溶液（即ち、生物学的適合性の緩衝液）、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールのようなポリオール、それらの好適な混合物、界面活性剤、または植物油を含む溶媒あるいは分散媒を含む。滅菌は、当分野で認められた技術によって遂行され得、濾過あるいは抗菌剤もしくは抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸またはチメロサールの添加を含むが、それに限定されない。さらに、糖または塩化ナトリウムのような等張化剤が、被験組成物に混入され得る。被験PDFを含む滅菌注射液の作製は、要求されるような先に挙げられた様々な成分とともに、適切な溶媒中に必要量のこれらの化合物を混入し、その後、好ましくは濾過滅菌で滅菌することにより達成される。滅菌粉末を得るために、必要に応じて、上記の溶液を真空乾燥または凍結乾燥する。従って、被験PDFまたはそのアナローグおよびフラグメントは、好都合で有効な投与のために、治療的に有効な用量中、好適な薬学的に許容される担体および／または希釈剤とともに、薬学的有効量で混合される。本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容される担体および／または希釈剤」は、活性成分と非相溶性ではない任意の全ての溶媒、分散媒、抗菌剤および抗真菌剤、マイクロカプセル、リポソーム、カチオン脂質担体、等張化および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質ためのそのような媒体および薬剤の使用は、当分野で周知である。補助的活性成分も、組成物に混入され、本発明方法で使用され得る。本発明方法で使用されるPDF、そのアナローグまたはフラグメントの、ヒトに適用される正確な治療的有効量は、患者の年齢、体重、疾患の程度および状態の個々の相違を考慮して、当業者により決定され得る。一般に、本発明のPDF薬学的製剤は、好ましくは、注入用量当り少なくとも約1mgの量で、より好ましくは用量当り約10mgまでの量で、或いは約10^-9Ｍ〜10^-6Ｍの局所的乳房または前立腺組織濃度を達成する用量で、投与されるべきことが言及され得る。非経口組成物を、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、投与単位形態で剤型化することが特に有利である。本明細書で使用される投与単位形態は、治療される哺乳動物被験体のための単位投与量に好適な物理的に非連続の単位を指し、それぞれの単位は、必要とされる薬学的担体と組合せて所望の治療的効果を生じるために計算された予め決められた量の活性物質を含む。本発明の新規な投与単位形態に関する仕様書は、活性物質（即ち、PDF、そのアナローグもしくはフラグメント）のユニークな特性、および乳房または前立腺細胞癌の治療のためにそのような活性物質を混合する当分野に固有の限定に指図され直接依存する。主要な活性成分は、先に開示されたような投与単位形態で好適な薬学的に許容される担体とともに、有効量の好都合で有効な投与のために混合される。補助的活性成分を含む組成物の場合、投与量は、成分の通常の用量および投与様式を参照して決定される。本発明による治療方法では、PDF、そのアナローグまたはフラグメントは、治療的に有効であるような量で、および乳房および前立腺細胞癌の治療に医学的に許容される任意の方法で、投与剤型と適合可能な様式で投与され得る。可能な投与経路は、脈管内、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、脳室内または硬膜内外(intraepidural)のような非経口的経路による注射を含む。組成物はまた、例えば手術中に組織表面に直接適用され得る。徐放性投与も、特にデポー注射剤または浸食可能なインプラントのような手段によって、本発明に含められる。本発明は更に、いかなる意味でも本発明の範囲の限定を意図しない下記の具体的な実施例によって例示される。実施例１乳癌細胞及び前立腺癌細胞の下垂体抽出物誘導分化ウシ下垂体及びプロラクチン・成長ホルモン産生細胞下垂体腫瘍から調製された抽出物を乳癌細胞の分化を誘導する能力について評価した。プロラクチン・成長ホルモン産生細胞腫瘍MtTW10及びウンタエキム(UntaeKim )博士、ロズウェルパークメモリアルインスティテュート，バッファローニューヨークから得た下垂体腫瘍MTW9-OMのアルカリ性下垂体抽出物をPlaticaら(1992)Endocrinology 131：2573により記載されたように調製した。ウシ下垂体抽出物をCollaborative Research，Bedford，MAから商業的に入手した。下垂体抽出物をMTW9/P1ラット乳房腫瘍細胞、MCF-7ヒト乳癌細胞、正常上皮乳房細胞、並びに骨髄性及びリンパ性白血病細胞の血清を含まない培地に加えた。２４時間後、通常単一細胞懸濁液として増殖する乳癌細胞が凝集し、スフェロイドを形成した。電子顕微鏡は、オルガネラの分極、ルーメン様形成、接合部形成及び細胞内分泌顆粒の出現を含む正常乳腺構造への分化を示す変化を実証した。標準的方法により行われたノーザン及びウェスタンブロットは、下垂体抽出物が乳癌細胞中のラミニン、カゼイン及びラクトアルブミンの発現、およびＥ−カドヘリン(E-cadherin)の過剰発現を誘導することを実証した。正常上皮細胞並びに骨髄性及びリンパ性白血病細胞は、下垂体抽出物で処理することにより影響されない。前立腺癌細胞は、ＡＴＣＣから入手した。前立腺癌細胞の血清を含まない培地は、上記のようにPlaticaらにより調製された下垂体抽出物で処理し、分化の証拠について形態学的及び生化学的に評価した。下垂体抽出物は、バイオアッセイにより測定されるように前立腺癌細胞の分化を誘導した。抽出物は、ラット肝及び腎から同様に調製され、上記のように細胞培養物に加えた。ラット肝及び腎抽出物は、乳癌細胞または前立腺癌細胞の分化に影響しなかった。表皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）−Ｉ及び−ＩＩ、エストラジオール、成長ホルモン及びブロラクチンを含む各種のホルモン及び成長因子は、乳癌細胞の培養物に加えられ、上記のように分化活性について評価された。該ホルモン及び成長因子のいずれも分化誘導能を示さなかった。実施例２下垂体分化活性に関するクロ−ニングシステムの同定発現クローニング法が、下垂体分化活性をさらに特徴付けるために考案された。アフリカツメガエル卵母細胞が適当な発現システムであるかどうかを決定するために、アフリカツメガエル卵母細胞を下垂体分化様活性の欠如、選択された機能性アッセイにおける乳癌細胞への毒性および下垂体分化活性を破壊または妨害する因子の存在について評価した。下垂体分化活性についての凝集バイオアッセイで、MCF-7乳癌細胞のスフェロイド形成を測定した。MCF-7細胞は、下垂体抽出物の下垂体分化活性に応答して凝集し、スフェロイドを形成する。スフェロイドは、光学顕微鏡により可視化された。卵母細胞ライゼートは、0.15M NaCl中で卵母細胞をホモジナイズし、次いで４ ℃、15,000×ｇで３０分間遠心分離し上清を集めることにより得られた。50〜40 0μｇの蛋白質及び卵母細胞が２４時間維持された馴化培地を含む卵母細胞ライゼートの各種量を、１×10⁵MCF-7細胞を含む１ｍｌの培地に加え、次いで３７℃ で７２時間インキュベートした。MCF-7細胞についてのいかなる形態学的変化ないし毒性作用も、あらゆる濃度のライゼートまたは培地について観察されず、アフリカツメガエル卵母細胞は下垂体分化様活性を含まず、卵母細胞ライゼートは乳癌細胞に対し毒性がないことを示す。下垂体分化活性がアフリカツメガエル卵母細胞ライゼートの存在下に活性を残存するかどうかを測定するために、１×１０⁵MCF-7細胞を含む培養物を各種量の卵母細胞ライゼート（50〜400μｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下に150μg/ml の下垂体抽出物と37℃で72時間インキュベートした。下垂体抽出物により誘導される凝集効果は、卵母細胞ライゼートの存在により影響されなかった。これらの結果は、下垂体分化活性は、アフリカツメガエル卵母細胞ライゼートの存在下でも活性なままであることを示した。凝集バイオアッセイによる検出に十分な量の下垂体分化活性を発現するためのアフリカツメガエル卵母細胞の能力が、測定された。ラット下垂体腫瘍MtTW10由来のポリ(A)⁺ＲＮＡをRNAseを含まない環境下でSambrookらにより記載されたグアニジニウム／セシウムクロライド(CsCl)遠心分離法により調製した。簡単に述べると、１ｇの組織を4Mグアニジニウム・チオシアネート、0.1Tris-HCl(pH7.5) 及び１％2-ME中、室温でホモジナイズした。次いで、9.7mlホモジネートを5.7M CsCl及び4mM EDTA pH7.5の3.3mlパッド上に層状に重ね、30,000rpmで24時間室温で遠心分離した。チューブの底にペレット状になったRNAを10mM Trls pH7.4，1m M EDTA及び0.1％ SDS中に溶解し、次いでエタノール沈殿させた。ポリ(A)⁺ＲＮＡをオリゴdTセルロースカラム上に全RNAを２回通すことにより得た。17マイクログラムのポリ(A)⁺ＲＮＡを900μｇの全RNAから得た。次いで、滅菌MBS溶液中1 9℃で維持された２０個の十分に成熟した卵母細胞（ステージV及び VI）を、自動シリンジを用いて卵母細胞あたり５０ngのmRNAを含む５ｍｌを注入した。次いで卵母細胞は、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むMBS溶液中に置かれ、１９℃でインキュベートされた。３日後（上記のように調製した）卵母細胞ライゼートからの上清及びＲＮＡを注入した卵母細胞からの馴化培地（ＣＭ）を下垂体分化活性について試験した。１×１０⁵ＭＣＦ−７細胞を１ｍｌの血清を含まないRPMI中に含む培養物を各種蛋白質濃度の卵母細胞ライゼート（１０−３００μｇ）またはＣＭ（５０−２００μｌ／培養物）の存在下に３７℃、 5% CO₂雰囲気でインキュベートした。７２時間後、卵母細胞ライゼートで処理したMCF-7培養物中に凝集が見られたが、ＣＭ処理されたMCF-7細胞中には見られなかった。得られた凝集の数とライゼート蛋白質濃度には、図６に示されるように直線的な関係が見られた。同様な実験が、ラット肝ポリ(A)⁺ＲＮＡを用いて行われた。馴化培地も、肝ｍＲＮＡを注入された卵母細胞由来のライゼートもMCF-7細胞にいかなる効果も有しなかった。これらの結果は、下垂体分化活性は、下垂体ｍＲＮＡの全集団がアフリカツメガエル卵母細胞において発現されたときでさえ、凝集バイオアッセイにより検出できることを示した。上記の結果は、アフリカツメガエル卵母細胞は下垂体分化様活性を含まず、MC F-7細胞に対し毒性でなく、下垂体分化活性を破壊しないことを示す。さらに、下垂体ｍＲＮＡを注入されたアフリカツメガエル卵母細胞は、凝集バイオアッセイにより検出できるレベルの下垂体分化活性を発現した。実施例３下垂体分化活性の特徴付けヒト下垂体cDNAライブラリーをClontech，Palo Alto，CAから入手し、下垂体分化活性をコードするcDNAの存在について試験した。cDNAライブラリーを、Ｔ３またはＴ7 RNAポリメラーゼを用いたDNA挿入断片のいずれかの鎖の転写を可能にするラムダブルーミッドファージのEcoRI-HindIII部位に指向的にクローン化した。ファージライブラリーの連続的希釈物５μｌを２００μｌ K802E ．coli(OD₆₀₀ ＝0.25)と混合し、３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、４８℃で融解した０．７％寒天３ｍｌを加え、混合物を１．５％ＬＢ寒天を含む１００ｍｍプレートの上にまいた。３７℃で一夜インキュベーション後、ブラークを各ファージ希釈物についてカウントし、ライブラリー力価を１×１０¹⁰pfu／mlと決定した。次いで、該ライブラリーからの400,000pfuのプールを２０プレート上にプレートし（プレートあたり20,000pfu）、プラークが直径約１ｍｍに達するまで３７℃でインキュベートした。寒天上部をＳＭバッファー（0.1M NaCl，10mM MgSO₄・7H₂O，10mM Tr is-HCl，pH7.5，2%ゼラチン）中に採集し、バクテリア細胞をクロロホルムで溶菌した。寒天及びバクテリア破砕物を８０００×ｇで２０分間遠心分離してペレット化した。上清を１μｇ／ｍｌ DNaseI及び５μｇ／ｍｌRNase Aと１時間３７ ℃で処理し、次いで８０００×ｇで２０分間再度遠心分離した。ファージ粒子を含む上清を、２５０００ｒｐｍ(Beckman，SW27 ROTOR)で２時間、２０℃で遠心分離した。ペレット化されたファージを次いで０．５ＭＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８に再懸濁し、１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫと３７℃で３０分間インキュベートし、次いで３フェノール、１フェノール／クロロホルム、及び１クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行った。このライブラリーにおいて、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼは（＋）鎖のクローン化挿入断片を合成するので、T3RNAポリメラーゼプロモーターと逆の挿入断片部位のポリクローニング領域を切断するSal Iで消化することによりファージDNAを直線化した。効率的な翻訳のために、CAP部位を転写物の５’末端に加えた。転写は、プラスミドDNAの各μｇあたり30-50μｇのキャップされたRN Aを生じるAmbionからのmMessage mMachine kitを用い、Regecら，（1995）Blood 85：2711により記載されたように少し変更を加えたMeltonのプロトコール(Krie gら，1987，Methods Enzymol．155：397)に従った。反応は、５μｇ直線化ファージDNAを用い２０μｌ容量中で行われ、プロトコール及び試薬は製造元により提供された。３７℃で１時間インキュベーション後、１ＵのRNaseを含まないDNa seIを各DNA μｇについて加え、インキュベーションを１５分間継続した。次いで、反応混合物をフェノール／クロロホルム抽出し、次いで半分の容量の7.5M N H₄アセテート及び３倍容量のエタノールで沈殿させた。その様な連続的エタノール沈殿を３回行い、９９％の非組み込みヌクレオチドを除去した。２０個の卵母細胞を、上記のように卵母細胞あたり50ng RNAで注入し、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むMBS溶液中に置き、１９℃で３日間インキュベートした。上記のように調製された卵母細胞ライゼートを、次いで上記のバイオアッセイを用い、MCF-7細胞の分化活性について試験した。処理された細胞はスフェロイドを形成し、これは下垂体抽出物の存在下でのこれらヒト乳癌細胞により形成されたものと同様であった。形成されたスフェロイドの数とバイオアッセイに使用した蛋白質ライゼートの間の直線的な関係が見られた。これらのデータは、Clontechヒト下垂体cDNAライブラリーは、下垂体分化活性をコードする１以上のクローンを含むことを示す。下垂体cDNAライブラリーからの上記の400,000pfuのプールは、同胞選択に用いられた。400,000pfuプールから、各々約40,000プラークの１０個のサブプールを別々にプレートし、それらが約１ｍｍのサイズに達するまで増殖した。各プールからのファージDNAを調製し、キャップされた転写物を既述のようにＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した。各サブプールからのRNAは、２０のカエル卵母細胞(50ng/卵母細胞)に注入され、ライゼートはMCF-7細胞の分化活性について試験された。各バイオアッセイについて、下垂体腫瘍由来のｍＲＮＡ、非注入卵母細胞由来のライゼート、および下垂体抽出物を用いたコントロールを調製した。１０の分析されたサブプールのうち、３つはバイオアッセイにおいて凝集活性を示した。サブプール＃２は最も強い生物活性を示し、さらなる同胞選択のために選ばれた。このサブプールは、約4,000p fuの１０のサブプールに分割され、それらは上記のように処理された。これらのサブプールから、サブプール＃６は最も強い分化活性を有することが示され、さらに（各々約400pfuを含む）１０のサブプールに分割され、それらは同様に処理された。サブプール＃４は最も高い分化特異的活性を含むことが見出され、さらなる同胞選択に使用された。このプロセスを、下垂体分化因子（ＰＤＦ）をコードする単一の陽性クローンが同定されるまで、さらに陽性のプールを分割し分化活性をスクリーニングすることにより継続した。同定されたＰＤＦｃＤＮＡファージクローンはclontechの手順に従いプラスミドクローンに変換された。ファージDNAはNotIで消化され、cDNA挿入断片を含むp BLUESCRIPTプラスミドDNAを遊離した。フェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿後、消化されたプラスミドDNAをライゲートし、コンピテントＤＭ５アルファ大腸菌(Gibco，BRL)をトランスフォームするために使用した。コロニーは、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを用いて寒天プレート上で増殖され、クローン化ＰＤＦｃＤＮＡを有するBLUESCRIPTプラスミドを含んでいた。該プラスミドクローンがＰＤＦをコードするcDNAを含むことを確認するため、 cDNA由来の転写物をＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成し、アフリカツメガエル卵母細胞において翻訳した。卵母細胞ライゼートは、上記のようにＰＤＦ活性について試験された。図１は、コントロールＣＭとともにインキュベートしたMCF-7細胞を示す。図２は、cDNA 転写物を含む卵母細胞のライゼートで処理されたMCF-7細胞を示す。処理された細胞は凝集し、スフェロイドを形成し、このことは該cDNAクローンがＰＤＦをコードすることを確認した。該プラスミドDNAは次いで配列決定のために調製された。ＰＤＦｃＤＮＡを含むプラスミドを含む大腸菌の０．５ｍｌストック懸濁液で接種された５００ｍｌのアンピシリン／ＬＢ培地を振とうしながら３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を８０００×ｇで２０分間４℃でペレット化し、プラスミドDNAをBirnboim及びDolly（1979）Nucleic Acid Res. 7：1573のアルカリ溶菌法により調製した。バクテリアのペレットを１０ｍｌの５０ｍＭグルコース、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に再懸濁した。リゾチームで処理後、バクテリア細胞を0.2N NaOH ，1% SDSで１０分間室温で溶菌した。次いで、１５ｍｌの３Ｍ冷酢酸カリウムを加えた。混合物を氷上で１０分間たくわえ、４０００×ｇで１５分間４℃で遠心分離した。主にプラスミドDNAを含む上清を濾過し、０．６容量のイソプロパノールで沈殿した。核酸は５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することにより沈降し、７０％エタノールで洗浄し、ＴＥ緩衝液に溶解した。 CsCl/エチジウムブロミドのグラジエントをSambrookら(1989)Molecular Cloni ng:A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Col d Spring Harbor，NYに従い調製した。１ｇのＣｓＣｌをプラスミド調製物各ｍｌに溶解し、８０μｌのエチジウムブロミド(10mg/ml)をCsCl DNA溶液各ｍｌに加えた。Ｔｉ６５ローター中、６０，０００ｒｐｍで２４時間２０℃で遠心分離後、バクテリアDNAを２つのバンドに分離した：上のバンドは直線の染色体及びニック環状プラスミドDNAを含み、下のバンドは閉鎖環状スーパーコイルプラスミドDNAからなる。プラスミドDNAは回収され、エチジウムブロミドは１−ブタノールで抽出され、ＣｓＣｌを透析で除いた後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させた。ＰＤＦｃＤＮＡの配列決定は、Sangerら（1977）Proc.Natl.Acad.Sci. 74：54 63のジデオキシ鎖終結法を用い、マウント・シナイ・メディカル・スクールニューヨークのコア・ファシリティ（Core Facility of Mount Sinai Medical Sch ool，New York）で行われた。クローンの各部分は、前方向及び逆方向の両方から配列決定された。２．２ｋｂ挿入断片の５３０ヌクレオチドをＭ１３−２０およびBLUESCRIPTプラスミド配列からの逆プライマーを用いて配列決定した。ＰＤＦｃＤＮＡの５３０塩基対は配列番号1(SE Q ID No.1)に記載されるヌクレオチド配列を有する。配列はDNASISプログラム(H itachi Software Engineering Co.)を用いてGENBANK及びEMBLからの他の配列との相同性について分析された。GENBANKデータベースからのいかなる配列ともこの配列との単純な相同性は見出されなかった。見出された最大のマッチングは、９８塩基対の範囲にわたる７２．５％であり、ＰＤＦが新規ポリペプチドであることを示す。実施例４前立腺癌細胞に対するＰＤＦの効果ヒト前立腺癌細胞系DU145をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）(BioWhittacker，Walkersville MC. )、10ＩＵペニシリン／ｍｌ５０ｍｇストレプトマイシン／ｍｌを補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃、５％CO₂を含む湿潤雰囲気中で増殖した。これら細胞に対するＰＤＦの効果を検討するため、血清を含まないRPMI 1640培地中１×１０⁵DU-145細胞を含む培養物を各種濃度のＰＤＦ（50-300μｇ/ml培地）で処理した。３日後、培養物をスフェロイドの形成についてスコア化した。ＰＤＦ濃度と形成されたスフェロイドの数の間の関係が、図７のグラフに示されるように見出された。図３は、ＰＤＦの非存在下で培養されたDU-145細胞を示す。図４は、７２時間後にDU145前立腺癌細胞について、１５０μｇＰＤＦ／ｍｌにより誘導された形態学的変化を示す。ＰＤＦ処理された細胞は、ＰＤＦで処理された乳癌細胞により産生されたものと同様に凝集しスフェロイドを形成した。実施例５ＰＤＦの配列決定及び発現実施例３に記載されたＰＤＦcDNAの完全なヌクレオチド配列は、例えばSambro okらによるプライマー伸長戦略により決定された。完全な配列から、開始及び終止コドン、オープンリーディングフレーム、及び推定アミノ酸配列が決定される。ＰＤＦをコードするcDNAを含むバキュロウイルス発現ベクターを調製する。ＰＤＦcDNAはバキュロウイルスベクターAcNPvにクローン化され、組換えバキュロウイルスベクターは昆虫細胞系Ｓｆ２１の細胞を形質転換するのに使用する。バキュロウイルス／昆虫システムは、組換えＰＤＦを発現するために培養され、次いで培養培地または細胞抽出物から精製される。組換えＰＤＦの生物学的活性は、インビトロ凝集アッセイにより確認される。実施例６腫瘍増殖についての組換えＰＤＦの効果乳房腫瘍ＭＴＷ９を担持するヌードマウスをDiamondら（1976）Cancer Resear ch 36：77に記載されたように移植により得る。組換えＰＤＦは１日あたり５０ μｇ／ｋｇの投与量で２１日間腹腔内注入により腫瘍担持マウスに投与される。ＰＤＦ処理に応答した腫瘍サイズの縮小は、一定の間隔で腫瘍の長さ、幅及び高さをカリパスで測定し、腫瘍体積を計算することにより評価される。各種の文献が本明細書で引用され、その内容は全体として参考として本明細書に援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/24 (71)出願人オヴィディウプラティカアメリカ合衆国 10021 ニューヨークニューヨークイーストシックスティフィフスストリート 315 アパートメント 11ビー (72)発明者プラティカミクスニカアメリカ合衆国 10021 ニューヨークニューヨークイーストシックスティフィフスストリート 315 アパートメント 11ビー (72)発明者プラティカオヴィディウアメリカ合衆国 10021 ニューヨークニューヨークイーストシックスティフィフスストリート 315 アパートメント 11ビー (72)発明者ホランドジェイムズエフ. アメリカ合衆国 10583 ニューヨークスカースデールママロネックロード 31

Claims

【特許請求の範囲】１．下垂体分化因子をコードする単離された核酸。２．配列番号１(SEQ ID NO.1)のヌクレオチド配列を含む請求項１の単離された核酸。３．下垂体分化因子をコードするプラスミドｐＢＳ−ＰＤＦ１の連続的なフラグメントからなる単離された核酸。４．プラスミドｐＢＳ−ＰＤＦ１に含まれる２．２キロ塩基の核酸であって、下垂体分化因子をコードする核酸。５．請求項４の２．２キロ塩基の核酸にハイブリダイズする単離された核酸であって、下垂体分化因子をコードする単離された核酸。６．配列番号１(SEQ ID NO.1)の配列を有する核酸または配列番号１(SEQ ID N O.1)の配列に相補的な核酸にハイブリダイズする単離された核酸であって、下垂体分化因子をコードする単離された核酸。７．請求項１の単離された核酸を含むベクター。８．請求項５の単離された核酸を含むベクター。９．ＡＴＣＣＮｏ．９７６４８を有するプラスミドｐＢＳ−ＰＤＦ１。１０．請求項１の単離された核酸を含む宿主細胞。１１．請求項５の単離された核酸を含む宿主細胞。１２．単離され精製された下垂体分化因子。１３．配列番号１(SEQ ID NO.1)の配列を有する核酸によりコードされるアミノ酸配列を含む請求項１２の単離され精製された下垂体分化因子。１４．請求項１の核酸を宿主細胞に導入し、該宿主細胞を前記核酸が発現される条件下に培養し、下垂体分化因子を回収することを含む下垂体分化因子の製造法。１５．請求項５の核酸を宿主細胞に導入し、該宿主細胞を前記核酸が発現される条件下に培養し、下垂体分化因子を回収することを含む下垂体分化因子の製造法。１６．乳癌細胞を分化促進有効量の下垂体分化因子と接触させることを含む乳癌細胞の分化を促進する方法。１７．前立腺細胞を分化促進有効量の下垂体分化因子と接触させることを含む乳癌細胞の分化を促進する方法。１８．治療的有効量の下垂体分化因子をその様な治療を必要とする患者に投与することを含む乳癌の治療方法。１９．治療的有効量の下垂体分化因子をその様な治療を必要とする患者に投与することを含む前立腺癌の治療方法。２０．下垂体分化因子及び担体を含む組成物。