JP2005535345A - 遺伝子療法のために有用なｅＮＯＳ変異体 - Google Patents

Abstract

本発明は、遺伝子療法のために有用な、内皮酸化窒素シンターゼ（eNOS）ポリペプチド変異体、及びそのようなポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、哺乳類eNOSの機能的ドメインに対応するアミノ酸配列に１又は複数の突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体を提供する。より特定には、本発明は、哺乳類細胞においてリン酸化されるカルモジュリン−結合部位におけるアミノ酸残基に対応する位置に少なくとも１つの突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体（ここで前記突然変異は、リン酸化部位に存在する単一の突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体におけるAla又はAspへのアミノ酸置換ではない）；及びそのようなポリヌクレオチド変異体をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、そのようなeNOSポリペプチド変異体及びポリヌクレオチドを用いての予防、診断及び治療方法に関する。

Description

発明の分野：
本発明は、遺伝子療法のために有用な、内皮酸化窒素シンターゼ（endothelial nitric oxide synthase)（eNOS）ポリペプチド変異体、及びそのようなポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、哺乳類eNOSの機能的ドメインに対応するアミノ酸配列に１又は複数の突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体を提供する。より特定には、本発明は、哺乳類細胞においてリン酸化されるカルモジュリン−結合部位におけるアミノ酸残基に対応する位置に少なくとも１つの突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体に関し、ここで前記突然変異は、リン酸化部位に存在する単一の突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体におけるAla又はAspへのアミノ酸置換ではない。本発明はさらに、そのようなeNOSポリペプチド変異体及びポリヌクレオチドを用いての予防、診断及び治療方法に関する。

発明の背景：
内皮酸化窒素シンターゼ（eNOS, ecNOS又はNOS3とも呼ばれる）、及びeNOS酵素活性により生成される酸化窒素（NO）は、種々の生理学的工程、例えば脈管形成、血管拡張、免疫調節、血小板凝固の阻害、及び平滑筋の弛緩において重要な役割を演じる。eNOSの調節は、種々の第２メッセンジャー分子の関与、及びポリペプチド上の種々の機能的領域とのそれらの相互作用を包含する（例えば、Marletta, M. Trends in Biochem. Sciences (2001) 26: 519-521を参照のこと）。

eNOSの種々の機能的ドメインの機能及び位置は十分に特徴づけられており、そして例えばN−末端からC−末端の方に、ミリストイル化のためのコンセンサス部位；パルミトイル化のための部位；オキシゲナーゼドメイン；カルモジュリン−結合部位；及びレダクターゼドメインを含む（例えば、図１；及びStuehr, D. J. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. (1997) 37: 339-359を参照のこと）。種々の種からeNOS配列の比較は、個々の機能的ドメイン内で高い程度の配列同一性を示す。さらに、多くの機能的ドメインのためのコンセンサス配列は知られている。種々の生物学的刺激（例えば、細胞刺激）に応答して、野生型eNOSは、多くの特異的キナーゼ又はホスファターゼにより、カルモジュリン−結合部位及びレダクターゼドメイン内のアミノ酸残基で、インビトロ又はインビボで、リン酸化されるか又は脱リン酸化される。

さらに、それらの部位のリン酸化レベルは、eNOS酵素活性の調節に寄与する（例えば、Fulton など. Nature (1999) 399: 597-601を参照のこと）。ヒト野生型eNOS（配列番号１）においては、ヒト野生型eNOS（配列番号１）のレダクターゼドメインに位置するアミノ酸残基Ser−1177でのセリン酸置換は、リン酸化に対して（及び、従って、eNOS活性の活性化に対して）耐性であるか、又は構成的に活性であるeNOSポリペプチドをもたらす（例えば、WO00/62605号を参照のこと）。類似する結果が、対応するアミノ酸残基のアミノ酸置換が他の種のeNOSにおいて行われる場合に見出される（例えば、WO00/62605号を参照のこと）。

カルボジュリン（CaM）及びカルシウム（Ca²⁺）の複合体は、eNOSカルモジュリン−結合部位に効果的に結合し、そしてeNOS活性（例えば、NO生成）を刺激する。さらにeNOSへのCaM-Ca²⁺複合体の結合は、カルモジュリン−結合部位内の特定のアミノ酸残基のリン酸化のレベルによりもたらされる。例えば、Thr−495がリン酸化される場合、カルモジュリン−結合が阻害され、そして/又はeNOSのカルモジュリン活性化のCa²⁺依存性が阻害され得る。Thr-495でのリン酸化が、例えば特異的キナーゼインヒビター又はThr−495のAlaへの変更により妨げられる場合、eNOS活性は刺激され得る（例えば、Busseなど、を参照のこと）。

内皮NOシンターゼは、本明細書に記載されるような種々の活性に包含され、そしてそれらのeNOSポリペプチドの異常発現及び/又は活性、及び/又はそれらの酵素により生成される異常量のNOが種々の疾病状態に関与している。従って、細胞におけるeNOSポリペプチドレベル及び活性の調節は明らかに、有用な治療標的物を提供する。

発明の要約：
本発明は、遺伝子療法のために使用される、単離された内皮酸化窒素シンターゼ（eNOS）ポリペプチド変異体、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びその変異体を提供する。特に、本発明は、哺乳類内皮酸化窒素シンターゼ（eNOS）の機能的ドメインに対応するアミノ酸配列に１又は複数の突然変異を有する単離されたeNOSポリペプチド変異体を提供し、ここで少なくとも１つの前記突然変異は、哺乳類細胞においてリン酸化されるカルモジュリン−結合ドメインにおけるアミノ酸残基に対応する位置で存在し；そしてリン酸化部位で存在する単一の突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体におけるAla又はAspへのアミノ酸置換ではない。

１つの観点において、本発明は、ヒトeNOSポリペプチド、好ましくは配列番号１によりコードされるヒトeNOSの位置495に対応する位置で突然変異を有する、単離されたヒトeNOSポリペプチド変異体を提供し、ここで前記突然変異はカルモジュリン−結合部位のリン酸化部位で存在する単一の突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体におけるAla又はAspへのアミノ酸置換ではない。ある観点においては、位置495に対応する突然変異は、Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Met, Ser, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg, 又は Hisへのアミノ酸置換にあり、そして好ましくはVal, Leu又はIleへのアミノ酸置換であり、そして最も好ましくは、Valへのアミノ酸置換である。ある観点においては、eNOSポリペプチド変異体が１つよりも多くの突然変異を有する場合、位置495に対応する突然変異は、好ましくはAla又はValへのアミノ酸置換である。

もう１つの観点においては、本発明は、哺乳類細胞においてリン酸化される、哺乳類eNOSのカルモジュリン−結合部位におけるアミノ酸残基に対応する位置で少なくとも１つの突然変異を有する単離されたヒトeNOSポリペプチド変異体を提供し；そしてさらに、哺乳類細胞においてリン酸化される、哺乳類eNOSのレダクターゼドメインにおけるアミノ酸残基に対応する位置で少なくとも１つの突然変異を含んで成る。いくつかの観点においては、カルモジュリン−結合ドメインにおける突然変異は、ヒトeNOSのアミノ酸残基495に対応する位置で存在し、そしてGly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Met, Ser, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg, 又は His、好ましくはVal, Leu又はIle及び最も好ましくはValへのアミノ酸置換であり；そしてレダクターゼドメインにおける突然変異は、ヒトeNOSのアミノ酸残基1177に対応する位置で存在し、そして好ましくはAspへのアミノ酸置換である。いつつかの観点においては、eNOSポリペプチド変異体が１つよりも多くの突然変異を有する場合、位置495に対応する突然変異は好ましくは、Ala又はValへのアミノ酸置換である。好ましくは、ヒトeNOSは、配列番号１によりコードされるヒトeNOSである。

もう１つの観点においては、本発明は、哺乳類細胞においてリン酸化される、哺乳類eNOSのカルモジュリン−結合部位におけるアミノ酸残基に対応する位置で少なくとも１つの突然変異を有する単離されたヒトeNOSポリペプチド変異体を提供し；そしてさらに、哺乳類eNOSのミリストイル化部位でのアミノ酸残基に対応する位置で少なくとも１つの突然変異を含んで成る。いくつかの観点においては、カルモジュリン−結合ドメインにおける突然変異は、ヒトeNOSのアミノ酸残基495に対応する位置で存在し、そしてGly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Met, Ser, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg, 又は His、好ましくはVal, Leu又はIle及び最も好ましくはValへのアミノ酸置換であり；そしてミリストイル化部位での突然変異は、ヒトeNOSのアミノ酸残基２に対応する位置で存在し、そして好ましくはAlaへのアミノ酸置換である。いつつかの観点においては、eNOSポリペプチド変異体が１つよりも多くの突然変異を有する場合、位置495に対応する突然変異は好ましくは、Ala又はValへのアミノ酸置換である。好ましくは、ヒトeNOSは、配列番号１によりコードされるヒトeNOSである。

もう１つの観点においては、本発明は、１）哺乳類細胞においてリン酸化される、哺乳類eNOSのカルモジュリン−結合部位におけるアミノ酸残基に対応する位置で少なくとも１つの突然変異を含んで成る単離されたヒトeNOSポリペプチド変異体を提供し；そしてさらに、２）哺乳類eNOSのミリストイル化部位でのアミノ酸残基に対応する位置で少なくとも１つの突然変異を含んで成り；そして３）さらに、哺乳類細胞においてリン酸化される、哺乳類eNOSのレダクターゼドメインにおけるアミノ酸残基に対応する位置で突然変異を含んで成る。いくつかの観点においては、カルモジュリン−結合ドメインにおける突然変異は、ヒトeNOSのアミノ酸残基495に対応する位置で存在し、そしてGly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Met, Ser, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg, 又は His、好ましくはVal, Leu又はIle及び最も好ましくはValへのアミノ酸置換であり；そしてミリストイル化部位での突然変異は、ヒトeNOSのアミノ酸残基２に対応する位置で存在し、そして好ましくはAlaへのアミノ酸置換であり；そして、レダクターゼドメインのける突然変異がヒトeNOSアミノ酸1177に対応する位置で存在し、そして好ましくは、Aspへのアミノ酸置換である。いつつかの観点においては、eNOSポリペプチド変異体が１つよりも多くの突然変異を有する場合、位置495に対応する突然変異は好ましくは、Ala又はValへのアミノ酸置換である。好ましくは、ヒトeNOSは、配列番号１によりコードされるヒトeNOSである。

もう１つの観点においては、本発明のeNOSポリペプチド変異体のリン酸化は、対照eNOSポリペプチドに比較して、高められるか又は低められる。
もう１つの観点においては、本発明のeNOSポリペプチドのCa²⁺依存性が、対照eNOSポリペプチドに比較して、ポリペプチドのCa²⁺−カルモジュリン介在性刺激において低められる。
もう１つの観点においては、本発明のeNOSポリペプチド変異体は、対照eNOSポリペプチドに比較して、高められた活性を有する。

１つの観点においては、本発明のeNOSポリペプチド変異体は、対照eNOSポリペプチドに比較して、高められたNO生成を有する。
１つの観点においては、本発明のeNOSポリペプチド変異体は、対照eNOSポリペプチドに比較して、高められたレダクターゼ活性を有する。
１つの観点においては、対照eNOSポリペプチドは、ヒトeNOS、好ましくは配列番号１によりコードされるヒトeNOSのアミノ酸配列であるか又はそれから誘導される。

もう1つの観点においては、本発明は、野生型又は変異体eNOSポリペプチドのアミノ酸配列に対して実質的に相同であるアミノ酸配列を有する単離されたeNOSポリペプチド変異体を提供する。１つの観点においては、本発明は、野生型eNOS又は本発明の変異体eNOSポリペプチドのアミノ酸配列に対して95〜99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する単離されたeNOSポリペプチド変異体を提供する。好ましくは、出発eNOSポリペプチドは、ヒトeNOSポリペプチドであり、そして最も好ましくは、ヒト野生型eNOSポリペプチド、例えば配列番号１によりコードされるヒトeNOSであるか、又はそれから誘導される。

もう１つの観点においては、本発明は、本発明のeNOSポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。１つの観点においては、本発明は、本発明のeNOSポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドを有する組換えベクターを提供し、ここで前記ポリヌクレオチドは、コードされるポリペプチドが細胞において発現されるよう、少なくとも１つの調節配列に作用可能に結合される。
もう1つの観点においては、本発明は、本発明のeNOSポリペプチド変異体を含んで成る医薬組成物を提供する。もう１つの観点においては、本発明は、本発明のeNOSポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んで成る医薬組成物を提供する。

もう１つの観点においては、本発明は、本発明のeNOSポリペプチド変異体の結合パートナーを提供する。１つの観点においては、結合パートナーは、ポリペプチドである。さらなる観点においては、結合パートナーは、抗体又は抗体−特異的フラグメントである。
もう１つの観点においては、本発明は、本発明のeNOSポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドを細胞に投与することを含んで成る、細胞におけるeNOS活性の調節方法を提供する。もう１つの観点においては、本発明は、本発明のeNOSポリペプチド変異体を細胞に投与することを含んで成る、細胞におけるeNOS活性の調節方法を提供する。

もう1つの観点においては、本発明は、異常eNOS活性に関連する状態の診断方法を提供し、ここで１）本発明のeNOSポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドと患者の細胞とを接触せしめ；そして２) 前記状態の表示であるeNOS活性のレベルを検出することを含んで成る。
もう１つの観点においては、本発明は、有効量の本発明のeNOSポリペプチド変異体を、処理の必要な患者に投与することを含んで成る、異常eNOS活性に関連する状態を処理するための予防又は治療方法を提供する。

もう１つの観点においては、本発明は、異常eNOS活性に関連する状態の処理のための予防又は治療方法を提供し、ここで前記方法は、有効量の本発明のeNOSポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドを、前記ポリペプチド変異体が患者において発現されるよう、処理の必要な患者に対応することを含んで成る。
もう１つの観点においては、本発明の予防及び治療方法はさらに、eNOSポリペプチド変異体又はeNOSポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与の前、その間又はその後、処理の必要な患者に1又は複数の脈管形成因子を投与することを含んで成る。

発明の特定の記載：
本発明は、遺伝子療法のために有用な、内皮酸化窒素シンターゼ（eNOS）ポリペプチド変異体、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びその変異体を提供する。特に、本発明は、哺乳類eNOSの機能的ドメインに対応するアミノ酸配列に１又は複数の突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体を提供し、ここで少なくとも１つの突然変異は哺乳類細胞においてリン酸化されるカルモジュリン−結合部位におけるアミノ酸残基に対応する位置で存在し；そしてカルモジュリン−結合部位のリン酸化部位で存在する単一の突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体におけるAla又はAspへのアミノ酸置換ではない。

本発明者は、ヒトeNOSのカルモジュリン−結合部位におけるThr−495残基での特定のアミノ酸置換が、単独で（Ala又はAspではない）、又はSer−1177での第２の突然変異と組合して、野生型ヒトeNOSに比較して、細胞におけるeNOS活性（例えば、NO生成）を高めることができ（例えば、例２を参照のこと）；そして遺伝子療法へのそのようなeNOSポリペプチド変異体の使用は、eNOS活性に関係する状態を改善することができる（引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許出願第60/403,637号に記載されるように）ことを発見した。

従って、本発明のeNOSポリペプチド及び方法は、細胞におけるeNOS活性のレベルを調節するために使用され、それにより、eNOS活性に関連する疾病及び状態を処理するための新規治療的アプローチを提供する。例えば、この新規アプローチは、複数の機構、例えば１）脈管形成の刺激；２）微細血管機能不全の改善；３）存在する血管の血管運動（血管拡張）活性の修復；及び４）存在する側副枝（動脈形成）を通して、決定的な脚虚血（CLI）の根本的な病理生理学を標的化する。皮膚及び筋肉への血流及び酸素供給のその得られる改良姓は、残る痛みを軽減し、そして虚血性潰瘍を治療することが予測される。

さらに、本発明のeNOSポリペプチド変異体は、変異体eNOS酵素の有意に高い比活性のために、野生型eNOSよりも効果的であり得る。さらに、eNOSポリペプチドの活性は、カルシウム、及びoxLDL及び年齢に対する耐性により調節され得る。結果的に、成長因子に比較して、“過剰投与”による毒性は、遺伝子療法への本発明のeNOS組成物の使用の場合、無視できる。
本明細書に引用される文献は、引例により組込まれる。

定義：
本明細書において使用される技術的及び科学的用語は、特にことわらない限り、当業者により通常理解される意味を有する。本明細書においては、当業者に知られている種々の方法が言及される。言及されるそのような既知の方法を示す文献及び他の材料は、引例により本明細書に組込まれる。組換えDNA技法の一般的原理を示す標準の参照研究は、次のものを包含する：Sambrook, J., など. (1989) Molecular Cloning, : A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, N. Y.; McPherson, M. J. , Ed. (1991) Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; Jones, J. (1992) Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford Science Publications, Oxford; Austen, B. M. and Westwood, O. M. R. (1991) Protein Targeting and Secretion, IRL Press, Oxford。当業者に知られているいずれかの適切な材料及び/又は方法は、本発明の実施に使用され得るが；しかしながら好ましい材料及び/又は方法が記載される。次の記載及び例に言及される、材料、試薬及び同様のものは、特にことわらない限り、市販源から入手できる。

本明細書において使用される場合、“ポリペプチド”とは、全長のタンパク質又はそのフラグメント、又はペプチドを言及する。

本明細書において使用される場合、ポリペプチド又はポリヌクレオチオに関する“変異体”とは、それぞれ、対照ポリペプチド又はポリヌクレオチドに比較して（例えば、野生型ポリペプチド又はポリヌクレオチドに比較して）、一次、二次又は三次構造で変化できるポリペプチド又はポリヌクレオチドを言及する。例えば、アミノ酸又は核酸配列は、対照アミノ酸又は核酸配列とは異なる突然変異又は修飾を含むことができる。いくつかの態様においては、eNOS変異体は、異なったイソフォーム又は多形現象である。変異体は、当業界において良く知られてる方法を用いて単離されたか又は生成された、天然に存在し、合成、組換え又は化学的に修飾されたポリペプチド又はポリヌクレオチドであり得る。

本明細書において使用される場合、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関する“突然変異”とは、それぞれ、対照ポリペプチド又はポリヌクレオチドに比較して（例えば、野生型ポリペプチド又はポリヌクレオチドに比較して）、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの一次、二次又は三次構造への天然に存在し、合成、組換え又は化学的変化又は差異を言及する。そのような突然変異を有するポリペプチド及びポリヌクレオチドは、当業界において良く知られている方法を用いて単離されるか又は生成され得る。

本明細書において使用される場合、“eNOSポリペプチド変異体”又はその文法的同等物（例えば、eNOS変異体、変異体eNOS, eNOS変異体ポリペプチド、変異体eNOSポリペプチド）は、哺乳類eNOSの機能的ドメインにおける１つの位置に対応するアミノ酸残基において少なくとも１つの変動又は突然変異を有する、eNOSポリペプチド又はその変異体を言及する。好ましい態様においては、突然変異は、ヒトeNOSのアミノ酸残基495に対応する位置でのアミノ酸置換であり、ここで前記アミノ酸置換は、カルモジュリン−結合部位のリン酸化部位で存在する単一の突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体におけるAla又はAspへの置換ではない。他の好ましい態様においては、eNOSポリペプチド変異体が１つよりも多くの突然変異を有する場合、位置495に対応する突然変異は、好ましくはAla又はValへのアミノ酸置換である。

もう１つの好ましい態様においては、eNOSポリペプチド変異体の活性は、対照eNOSポリペプチドに比較して、高められるか又は低められる。
本明細書において使用される場合、eNOSポリペプチドの“機能的ドメイン”は、eNOS活性に関連するポリペプチドにおけるいずれかのアミノ酸残基、部位又は領域、例えばタンパク質−結合ドメイン（例えば、カルモジュリン−結合ドメイン、キナーゼ−結合ドメイン、又はリガンド−結合ドメイン）、リン酸化部位、ミリストイル化部位、レダクターゼドメイン又は活性化部位であるが、但しそれらだけには限定されない。

本明細書において使用される場合、“eNOS活性”とは、細胞における酵素に関連するいずれかの活性、例えばNO生成、カルモジュリン−結合、脈管形成の刺激、微小血管機能不全の軽減、存在する血管の血管運動（血管拡張）の修復、存在する側副枝の再造形/成熟（動脈形成）への寄与を言及するが、但しそれらだけには限定されない。eNOS活性はまた、ポリペプチドに関連するいずれか他の生物学的又は細胞活性、及びより特定には、eNOSの機能的ドメインに関連するいずれかのそのような活性であり得る。eNOS活性はまた、酵素に関連する活性の調節、例えば本明細書に記載されるか、又は当業界において知られているいずれかのeNOS活性の調節であり得るが、但しそれらだけには限定されない。

本明細書において使用される場合、eNOS活性に関する“調節”とは、そのような活性の上昇、低下、誘発又は抑制を言及する。いくつかの態様においては、eNOS活性のそのような上昇、低下、誘発又は抑制は、対照分子、例えばeNOS野生型又は変異体ポリペプチドに対してである。

本明細書において使用される場合、“疾病”、“状態”又は“障害”とは、患者の細胞、組織又は器官における所望しない状態を言及し、ここでeNOS活性が前記状態を軽減するために調節され得る。内皮NOSは、種々の生理学的工程、例えば脈管形成、血管拡張、免疫調節、血小板凝固の阻害及び平滑筋の弛緩に包含されるが、但しそれらだけには限定されない。従って、処理の必要な患者の細胞、組織又は器官におけるeNOS活性の調節は、本明細書に記載されるような疾病、状態又は阻害を軽減することができる。
本明細書において使用される場合、“患者”とは、哺乳類であり、そして好ましくはヒトである。

eNOSポリペプチド変異体：
本発明は、遺伝子療法のために有用な、eNOSポリペプチド変異体、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びその変異体を提供する。特に、本発明は、哺乳類のeNOSの機能的ドメインに対応するアミノ酸配列に１又は複数の突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体を提供し、ここで少なくとも１つの突然変異が、哺乳類細胞においてリン酸化されるカルモジュリン−結合部位におけるアミノ酸残基に対応する位置に存在し；そしてリン酸化部位で存在する単一突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体におけるAla又はAspへのアミノ酸置換ではない。いくつかの好ましい態様においては、eNOSポリペプチド変異体が１つより多くの突然変異を有する場合、位置495に対応する突然変異は、好ましくはAla又はValへのアミノ酸置換である。

哺乳類eNOSポリペプチドの機能的ドメインは、十分に特徴づけられており、そして例えばN−末端からC−末端の方に、ミリストイル化のためのコンセンサス部位；パルミトイル化のための部位；カルモジュリン−結合部位（例えば、ヒトeNOSのアミノ酸494−517）（リン酸化のためのコンセンサス配列（ヒトeNOSのThr-495）を含む）；レダクターゼドメイン；及びリン酸化のためのコンセンサス配列（例えば、Stuehr, D. J. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. (1997) 37: 339-359を参照のこと）（図１）。１つの態様においては、本発明のeNOSポリペプチド変異体は、好ましくはThr-495でカルモジュリン−結合ドメイン、及び好ましくはSer−1177でレダクターゼドメイン内に１又は複数の突然変異を有し、ここでThr−495での突然変異は、カルモジュリン−結合部位のリン酸化部位で存在する単一突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体におけるAla又はAspへのアミノ酸置換ではない。

１つの態様においては、本発明のeNOSポリペプチド変異体は、ヒトeNOSのThr-495残基に対応する位置で第１の突然変異を有し、ここで前記突然変異は、カルモジュリン−結合部位のリン酸化部位で存在する単一の突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体におけるAla又はAspへのアミノ酸置換ではない。もう１つの態様においては、本発明のeNOSポリペプチド変異体は、ヒトeNOSのThr-495残基に対応する位置での第1の突然変異；及びヒトeNOSのSer-1177残基に対応する位置での第２の突然変異を有する。もう１つの態様においては、本発明のeNOSポリペプチド変異体は、ヒトeNOSのThr-495残基に対応する位置での第１の突然変異；ヒトeNOSのSer-1177残基に対応する位置での第２の突然変異；及びヒトeNOSのGly-2に対応する位置での第３の突然変異を有する。

本発明の突然変異は、種々のタイプのいずれか、例えば１又は複数のアミノ酸の付加、置換、欠失、挿入、修飾、逆位、融合又は切断、又はそれらのいずれかの組合せであり得、そして合成的に、化学的に、組換え的に、又は既知方法により生成され得る。本発明のeNOSポリペプチド変異体の好ましい態様においては、ヒトeNOSのThr-495に対応する位置での突然変異は、Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Met, Ser, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg, 又は Hisへのアミノ酸置換であり、そして好ましくは、Val, Leu又はIle及び最も好ましくはValへのアミノ酸置換であり；ヒトeNOSのSer-1177に対応する位置での突然変異は、好ましくはAsp及びより好ましくはAlaへのアミノ酸置換であり；そしてヒトeNOSのGly-2に対応する位置での突然変異は、Alaへのアミノ酸置換である。いくつかの好ましい態様においては、eNOSポリペプチド変異体が１つよりも多くの突然変異を有する場合、位置495に対応する突然変異は、好ましくはAla又はValへのアミノ酸置換である。

１つの態様においては、本発明のeNOSポリペプチド変異体は、Thr-495部位での突然変異（下記に示される）の他に、カルモジュリン−結合部位における１又は複数の追加の突然変異誘発されたアミノ酸残基を含んで成る：DPWKGSAAKGTGITRKKTFKEVANAVKISASLMGTVMAKRVKATI（配列番号１、アミノ酸478−522）。他の種における比較できる配列は、特に、リン酸化部位側のN−末端である残基おいてわずかに異なる。このモチーフでの個々のアミノ酸は、それぞれ、他の19個の天然のアミノ酸のいずれか、又は非天然のアミノ酸に変更され得る。

いくつかの態様においては、次の突然変異は、保存性突然変異ではない：Gly/Ala, Val/Ile/Leu, Asp/Glu, Lys/Arg, Asp/Gln, Thr/Ser又は Phe/Trp/Tyr。１つの態様においては、eNOS、ポリペプチド（出発ポリペプチド）から出発して、第１の突然変異は、カルモジュリン−結合ドメインのリン酸化部位に対応する位置で導入され、そしてポリペプチド変異体が、対照eNOSポリペプチド（例えば、出発ポリペプチド又は他のeNOSポリペプチド、例えば野生型eNOSポリペプチド）に比較して、eNOS活性についてアッセイされる。例えば、出発eNOSポリペプチドに比較して、高い量のeNOS活性（例えば、NO生成）を示す単一の突然変異が選択され得る。この第１の突然変異が行われ、そして特徴づけられた後、その工程が反復され、二重突然変異を有するeNOSポリペプチドが生成され、そしてさらに反復され、本明細書に記載されるような追加の突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体が生成される。いずれかの数の突然変異が、既知方法を用いて行われ得る。

ポリペプチド変異体の生成方法（例えば、それらをコードする核酸を突然変異誘発する）は、標準であり、そして当業界において良く知られている。それらの方法は、例えば相同組換え、特定部位の突然変異誘発、カセット突然変異誘発及びPCRに基づく突然変異誘発を、包含する（例えば、Sambrook など., Molecular Cloning, CSH Press (1989); Kunkel など. (1985) PNAS 82, 488-492; 及び Lee など. (2001) J. Biol. Chem. Dec 21; 276 (51): 47930-6を参照のこと）。そのような突然変異のための出発材料は、例えばヒト、マウス、テンジュクネズミ、イヌ、ウシ、ブタ、ウサギ、ラット、羊、ウマ、非ヒト霊長類又は他の動物からのeNOS cDNAであり得る。

好ましい態様においては、本発明のeNOSポリペプチド変異体は、対照のeNOSポリペプチドに比較して（例えば、NO生成）、eNOS活性の上昇又は低下を示す。もう1つの態様においては、本発明のeNOSポリペプチド変異体は１又は複数のeNOS活性の上昇又は低下を示すことができ、そして活性の上昇又は低下のレベルは対照のeNOSポリペプチドに対してである。本発明の突然変異誘発されたポリペプチドは、標準のアッセイを用いて、本明細書に記載されるeNOS活性のいずれかについてアッセイすることにより特徴づけられ得る。

例えば、インビトロ又はインビボでの種々の刺激（例えば、細胞刺激）に応答して、eNOSは、ヒトeNOSのThr-495及び/又はSer-1177で（又は他の種についての相当の残基で）、特定のキナーゼ又はホスファターゼによりリン酸化されるか又は脱リン酸化される。好ましい態様においては、本発明のeNOSポリペプチド変異体は、高められたNO生成、eNOSのCaM結合部位のためのCaMの結合又は親和性を示し、そして/又はeNOSのCa²⁺ CaM−介在性活性化に対する低められた依存性を示す。本明細書に記載され、そして当業界において知られているそれらの及び他のeNOS活性のいずれか、例えば酵素により生成されるNOにより間接的に介在される活性は、本発明のeNOS粗生成物及び方法により調節され得る活性である。

eNOSは、例えば血管内皮、心筋、血液血小板、及び免疫系の種々の型の細胞（例えば、T細胞、好中球及び単球）に見出され、そしてL−ArgをNO、すなわち多くの生理学的応答に関与し、そして/又はそこにおける調節機能として作用する気体のメッセンジャー分子に転換する。さらに、eNOSは、Ca²⁺に関して、eNOS酵素活性を活性化するカルモジュリンに結合する。種々のeNOS−関連活性は、酵素により生成されるNOにより直接的に及び/又は間接的に介在されるそれらの活性を包含する。

そのようなeNOS活性は、脈管形成の刺激（虚血症の結果として、正常な又は損なわれた）；血管拡張の刺激；側副枝血管成長の刺激；末梢脚血流の増強；脚壊死の阻害（例えば、決定的な脚虚血、又はCLI）；増強される傷治癒；平滑筋収縮の阻害；血小板付着及び凝集の阻害又は予防（血栓形成の阻害を導くことができる）；心血管系に対する高められたHDLの保護効果の介在；内皮細胞増殖及び移動の刺激；白血球活性化及び付着、ケモカイン発現又は平滑筋増殖の阻害；心筋収縮の抑制；免疫応答の調節；及びスーパーオキシドアニオンの除去を包含する。それらの及び他のeNOS活性についてアッセイするための方法は、当業者により良く知られている。

例えば、eNOSポリペプチドのリン酸化及び/又はリン酸化の程度をアッセイするための標準の方法は、タンパク質（例えば、E.コリにおいて組換え的に生成されるか、又は天然源から部分的に又は完全に精製される）がキナーゼ、例えばAMP−活性化されたキナーゼ（AMPK）又はタンパク質キナーゼC（PKC）、又はホスファターゼと共にインキュベートされるインビトロ方法を包含する。次に、eNOSポリペプチド又はそのトリプシン消化物が、標準の方法、例えばオートラジオグラフィーにより結合されたゲル電気泳動又はカラムクロマトグラフィー、又は所定のリンペプチドに対して特異的な抗体によるイムノブロットを用いて分析され得る。それらの及び他のアッセイに関しては、例えばWO00/28076号 ; WO00/62605号 ; WO00/62605号, Michell など. (2001) The Journal of Biological Chemistry 276, 17,625-628 ; 及び Fleming 等 (2001) Circulation Research 88,68e-75eを参照のこと。

インビトロ又はインビボで、eNOSの発現に直接的に又は間接的に依存する種々の活性を測定するための他の方法は、次の工程を包含する：
（１）カルモジュリン（CaM）の存在又は不在下でのL−[³H]−シトルリン生成の測定（例えば、Balligand など. (1995) J. Biol. Chem. 270,14, 582-586; Bredt など. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 682-685; 及び Fleming など. (2001) Circulation Research 88,68e-75eを参照のこと）；例えば、組換えeNOSが、CaMと共に同時発現され（例えば、Rodriguez-Crespo etal. (1996) Arch. Biochem. Biophys. 336,151-156を参照のこと）、そして種々の量の添加されるEGTAの存在下でアッセイされ（例えば、WO00/28076号に記載されるようにして）；

（２）カルモジュリンに結合する能力の測定（例えば、Fleming など. (2001) Circulation Research 88,68e-75eに記載されるようにして）；
（３）損なわれていない細胞において、cGMPの時間依存性及びN^ω−ニトロ−L−アルギニン−感受性蓄積の測定（例えば、Fleming など. (1998) Circ. Res. 82, 686-695を参照のこと）；
（４）のレダクターゼ活性、例えばNADPH−依存性レダクターゼ、チトクロームcレダクターゼ活性又は２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（DCIP）還元の測定（例えば、WO00/62605号 ; WO00/62605号 ; Martasek など (1999) Methods Enzymol. 301,70-78 ; Masters など. (1967) Methods Enzymol. 10,565-573を参照のこと）；

（５）平滑筋収縮に対する効果の測定（例えば、Furchgott and Zawadzki (1980) Nature 288: 373-376を参照のこと）；
（６）血小板機能に対する効果の測定；
（７）化学発光又はヘモグロブリン捕獲により決定される、細胞からのNO（亜硝酸塩、NO₂としてアッセイされる）の放出の測定（例えば、WO00/62605号 ; WO00/62605号 ; Sessa (1995) J. Biol. Chem. 270,17641-644 ; Kelm など. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 154,236-244を参照のこと）；

（８）側副枝血管−依存性虚血性脚において高められた毛細管密度又は血管運動反応性により明らかなように、脚壊死の阻害の測定（例えば、Murohara など. (1998) J. Clin. Invest., 101,2567-2568を参照のこと）；
（９）創傷治療、内皮細胞移動、増殖又は分化の増強の測定（例えば、Lee など, (1999) Am J. Physiol. 277, H 1600-1608を参照のこと）；又は
（10）拡張性機能不全の測定。
また、eNOS活性（例えば、NO生成）についてのアッセイを例示する本明細書における例も参照のこと。

eNOS活性を試験するための動物モデルは、標準であり、そして当業界において良く知られている。例えば、脈管形成及び再血管生成を試験するためには、Murohara など. (1998 ibia) ; Couffinhal など (1998) ; Am J. Pathol 152,1667-1669 ; Couffinhal など., (1999) Circulation99, 3188-3198及びそこにおけるにおける例を参照のこと。そのようなアッセイは、手術がeNOSノックアウトマウスにおいて行われる、手術による後脚虚血のマウス及びウサギモデルを包含する。後脚血流及び毛細管密度を測定するための方法はまた良く知られている（例えば、Muroharaなど. (前記) ; Couffinhal など (1998); Am J. Pathol 152, 1667- 1669; Couffinhalなど., (1999) Circulation 99, 3188-3198及びそこにおけるにおける例を参照のこと）。

本発明のeNOSポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド又は合成又は半合成のポリペプチド、又はその組合せ、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。
本発明のポリペプチドは好ましくは、単離された形で提供され、そして均質に精製され得る。用語“単離される”とは、例えばポリペプチド又はポリヌクレオチドに関する場合、材料がその元の環境（例えば、それが天然に存在する場合、天然の環境）から除去され、そしてそれが天然において結合される少なくとも１つの他の成分から単離されるか又は分離されることを意味する。例えば、その天然の生存宿主に存在する天然に依存するポリペプチドは単離されないが、しかし天然システムにおける同時存在する材料のいくらか又はすべてから分離される同じポリペプチドが単離される。そのようなポリペプチドは、組成物の一部であり、そしてさらに、そのような組成物がその天然の環境の一部でない場合、単離され得る。

本発明のeNOSポリペプチドのフラグメント又は変異体は好ましくは、実質的に少なくとも１つのeNOS活性を保持する。そのようなeNOS活性は、本明細書に記載されるそれらの活性のいずれかであり得、そして抗体と反応する能力を有する、すなわちエピトープ−担持のペプチド、特に本発明の１又は複数の突然変異を含んで成るペプチドを有することを包含する。

本発明のポリペプチドフラグメントは、本発明と適合でき、例えば遺伝子療法のために有用であるいずれのサイズのものでもあり得る。このフラグメントは、最小の特異的エピトープ（例えば、約６個のアミノ酸）〜ほぼ十分な長さの遺伝子生成物（例えば、十分な長さのポリペプチドよりも短い単一のアミノ酸）のサイズ範囲であり得る。例えば、本発明のポリペプチドは、少なくとも約10,25, 50, 100,200, 300,400, 500,600, 800,1000, 又は 1200個のアミノ酸を含んで成る。

本発明のポリペプチドのフラグメントは、ペプチド合成によりその対応する十分な長さのポリペプチドを生成するために、例えば十分な長さのポリペプチドを生成するための中間体として；抗体又は抗原−結合フラグメントの生成を誘発するために；公開のデータベースの調査のための“質問用配列”として、又は同様のもののために使用され得る。

さらに、本発明の突然変異を包含するポリペプチドフラグメントは、eNOSアンタゴニストとして使用され得る。いずれかの特定の機構に結合されることは所望しないが、そのような変異体包含ペプチドフラグメント、特に野生型eNOSの結合親和性に比較して、カルモジュリンに対する高められた親和性又は結合性を示すフラグメントは、細胞におけるカルモジュリンを“吸い取る”よう作用し、そして従って、細胞におけるeNOSのカルモジュリン−誘発された活性化を阻害するよう作用できると思われる。阻害の程度は、部分的阻害〜完全な阻害までの範囲であり得る。

本発明のポリペプチドの変異体（例えば、カルモジュリン−結合ドメインにおけるThr−495部位及び/又は他の部位における、すでに変更されてるヒトeNOSポリペプチドの変異体）は、例えば、
（ｉ）１又は複数のアミノ酸残基が保存された又は保存されていないアミノ酸残基（好ましくは、保存されたアミノ酸残基）により置換され、そしてそのような置換されたアミノ酸残基が遺伝子コードによりコードされる残基であっても又はそうでなくても良い変異体、又は
（ii）１又は複数のアミノ酸残基が置換基を包含する変異体、又は

（iii）前記ポリペプチドが、もう１つの化合物、例えばそのポリペプチドの半減期を高めるために化合物（例えば、ポリエチレングリコール）により融合されている変異体、又は
（iv）追加のアミノ酸が、細胞、例えば形質転換された細胞からの分泌に対して敏感であるタンパク質の遺伝子的に構築された形を創造するために、前記ポリペプチド、例えばリーダー又は分泌配列、又はそのポリペプチドの精製のために使用される配列に融合されている変異体であり得る。追加のアミノ酸は、異種源からであり得るか、又は天然の遺伝子に対して内因性であり得る。

上記タイプ（ｉ）に属する変異体ポリペプチドは、例えばムテイン、ポリペプチド変異体及び誘導体を包含する。変異体ポリペプチドは、例えば、１又は複数の付加、置換、欠失、挿入、逆位、融合及び切断、又はそれらのいずれかの組合せにより、アミノ酸配列において異なることができる。例えば、当業者に良く知られている保存性アミノ酸置換は一般的に、タンパク質機能の変化を導かない。

上記タイプ（ii）に属する変異体ポリペプチドは、例えば修飾されたポリペプチドを包含する。既知のポリペプチド修飾は次のことを包含するが、但しそれらだけには限定されない：グリコシル化、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジリノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メルチ化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーRNA介在性付加、例えばアルギニル化、及びユビキチン化。

そのような修飾は、当業者に良く知られており、そして科学文献に詳細に記載されている。いくつかの特に共通する修飾、すなわちグリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化及びADP−リボシル化は、多くの基本的テキスト、例えばProteins−Structure and Molecular Properties, 2nd ed. , T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993)に記載されている。多くの詳細な再考は、Wold, F., Posttranslationail Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed. , Academic Press, New York 1-12 (1983); Seifter et aL (1990) Meth. Enzymol. 182: 626-646 及び Rattan など. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 663: 48-62により入手できる。

タイプ（iii）に属する変異体ポリペプチドは、当業界において良く知れられており、そして例えばPEG化又は他の化学的修飾を包含する。
上記タイプ（iv）に属する変異体ポリペプチドは、例えば活性成熟ポリペプチドを生成するためにプロタンパク質部分の分解により活性化され得るプレタンパク質又はプロタンパク質を包含する。変異体は、種々のハイブリッドキメラ又は融合ポリペプチドを包含する。そのような変異体の典型的な例は、本明細書の他の部分に論じられている。

多くの他のタイプの変異体が当業者に知られている。例えば、良く知られているように、ポリペプチドは必ずしも完全に線状ではない。例えば、ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として、枝分かれであり得、そしてそれらは、後−翻訳現象、例えば天然のプロセッシング現象、及び天然に存在しないヒト操作によりもたらされた現象の結果として、枝分かれを伴って又はそれを伴わないで、環状であり得る。環状、枝分かれ及び枝分かれの環状ポリペプチドは、非翻訳の天然の工程により、及び合成方法により合成され得る。

修飾（modification）又は変動（variation）は、ポリペプチドのいずれかの部分、例えばペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端で生じ得る。同じタイプの修飾が、所定のポリペプチドにおけるいくつかの部位で同じ又は種々の程度、存在することができる。また、所定のポリペプチドは、１つのタイプよりも多くの修飾を含むことができる。共有修飾によるポリペプチドにおけるアミノ基又はカルボキシル基、又は両者の封鎖は、天然に存在するポリペプチド及び合成ポリペプチドにおいて通常である。例えば、タンパク質加水分解プロセッシングの前、E. コリにおいて製造されるポリペプチドのアミノ末端残基はしばしば、N−ホルミルメチオニンである。

修飾は、タンパク質がいかにして製造されるかの機能であり得る。組換えポリペプチドに関しては、修飾は、宿主細胞後翻訳修飾能力及びポリペプチドアミノ酸配列における修飾シグナルにより決定される。従って、グリコシル化が所望される場合、ポリペプチドはグリコシル化宿主、一般的には真核細胞において発現され得る。昆虫細胞はしばしば、哺乳類と同じ後翻訳グリコシル化を行い、そしてこの理由のために、昆虫細胞発現システムは、グリコシル化の生来のパターンを有する哺乳類タンパク質を効果的に発現するために開発されて来た。類似する考えが他の修飾に適用される。

変異体ポリペプチドは、対照eNOSポリペプチドの活性のレベルに対してである、１又は複数のeNOS活性の上昇又は低下を示すことができる。
言及されたように、本発明のeNOSポリペプチド変異体は、１又は複数のアミノ酸がカルモジュリン−結合ドメインにおけるThr−495残基及び/又は他の部位の他に、修飾されている変異体である。すなわち、追加の突然変異がeNOSポリペプチドの他の機能的ドメインに存在する。例えば、１又は複数の突然変異が、１又は複数の触媒ドメイン（例えば、オキシダーゼ又はレダクターゼドメイン）、又は調節領域（例えば、ミリストイル化部位、自動阻害ループ、又は分子のC−末端領域近くにあるSerリン酸化部位、又は本明細書のいずれか他の部分に記載される機能的ドメインのいずれか）中に導入され得る。追加の突然変異は、本明細書に記載されるいずれかのタイプの突然変異であり得る。

典型的な追加の突然変異は、ヒトeNOSの残基1177でのSerリン酸化部位のもう１つのアミノ酸、例えばAspによる置換（例えば、WO00/62605号を参照のこと）、又はヒトeNOSのミリストイル化部位での突然変異、例えば、もう１つのアミノ酸、例えばGlyによる残基２でのAlaの置換（例えば、Sessa など., (1993). Circulation Research 72,921-924を参照のこと）を包含する。

ミリストイル化部位で突然変異誘発されたeNOSポリペプチドは、膜でよりもむしろ細胞の細胞質に位置することができる。そのような変異体は、eNOS NO生成をダウンレギュレートする病理学的刺激（例えば、oxLDL）に対して耐性であり得る（野生型eNOSに比較して）。この性質は、そのような外部的病理学的刺激が存在する状態、例えば動脈硬化、末梢脚虚血症又はCLIの処理へのeNOSポリペプチド変異体（又はそれをコードするポリヌクレオチド）の使用のために好都合であり得る。

好ましい態様においては、本発明のヒトeNOSポリペプチドは、対照eNOSポリペプチド（例えば、野生型eNOS、又は他のeNOSポリペプチド変異体）に比較して、Thr−495での位置（例えば、Ala, Val, Leu又はIle, 好ましくはAla又はVal）に対応するアミノ酸置換；及び/又はSer-1177での位置（例えば、好ましくはAsp）に対応するアミノ酸置換；及び/又はGly-2での位置（例えば、Ala）に対応するアミノ酸置換を包含し、ここで二重又は三重変異体は、より高いeNOS活性を示す。

本発明のeNOSポリペプチド変異体はまた、野生型eNOS又は本発明の変異体eNOSポリペプチドに対して種々の程度の配列相同性（同一性）を有するポリペプチドを包含する。１つの態様においては、ポリペプチドは、本発明のeNOSポリペプチドに対して実質的に相同であるか、又はそれらに対する実質的な配列相同性（配列同一性）を示す。従って、本発明内のポリペプチド及びそのフラグメントは、野生型eNOS又は本発明の変異体eNOSポリペプチドに対して少なくとも65−70％の配列相同型（同一性）、好ましくは約70−75％、75−80％、又は80−85％、それに対する85−90％の配列相同性（同一性）、及び最も好ましくは、それに対する約90−95％又は95−99％の配列相同性（同一性）を示すアミノ酸配列を含むことができる。本発明はまた、低い程度の配列同一性を有するが、しかし１又は複数のeNOS活性を示すために十分な類似性を有するポリペプチドを包含する。

本発明によれば、用語“％同一性”とは、配列に関する場合、配列が、記載されるか又は請求項の配列（“対照配列”）と比較される配列の一列整列の後、その請求項の又記載される配列に比較されることを意味する。次に、％同一性は、次の式に従って決定される：
％同一性＝100［１−（C/R）］

式中、Cは対照配列と比較される配列との間の一列整列の長さにわたっての対照配列と比較される配列との間の差異の数であり、ここで（ｉ）比較される配列における対応する一列整列された塩基又はアミノ酸を有さない、対照配列における個々の塩基又はアミノ酸、及び（ii）対照配列における個々のギャップ、及び（iii）比較される配列における一列整列された塩基又はアミノ酸とは異なる、対照配列における個々の一列整列された塩基又はアミノ酸が差異を構成し；そしてRは、対照配列において創造されるいずれかのギャップと共に、比較される配列との一列整列の長さにわたっての対照配列における塩基又はアミノ酸の数であり、それは塩基又はアミノ酸としても計数される。

一列配列が比較される配列と、上記で計算されるような％同一性が特定される最少％同一性にほぼ等しいか又はそれ以上である対照配列との間に存在する場合、その比較される配列は、上記で計算された％同一性が特定される％同一性以下である一列整列が存在する場合でさえ、対照配列に対するその特定される最少％同一性を有する。

好ましい態様においては、比較目的のために一列整列される対照配列の長さは、対照配列の長さの少なくとも30％、好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも50％、さらにより好ましくは少なくとも60％、及びさらにより好ましくは、少なくとも70％、80％又は90％である（例えば、91個のアミノ酸残基を有する本明細書におけるアミノ酸配列に対して第２配列を一列整列する場合、少なくとも30、好ましくは少なくとも35、より好ましくは少なくとも45、さらにより好ましくは少なくとも55、及びさらにより好ましくは少なくとも65、70、80及び90個のアミノ酸残基が一列整列される）。
％同一性又は％相同性についての本明細書における記載は、ヌクレオチド又はアミノ酸配列に同等に適用できるものである。

配列の比較、及び２種の配列間の％同一性及び類似性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。（Computational Molecular Biology, Lesk, A. M. , ed. , Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genome Projects, Smith, D. W. , ed. , Academic Press, New York, 1993; ComputerAnalysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M. , and Griffin, H. G. , eds. , Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press, 1987; 及び Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds. , M Stockton Press, New York, 1991）。

そのような数学的アルゴリズムの非制限的な好ましい例は、Karlin など. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877に記載されている。そのようなアルゴリズムは、Altschul など. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されるように、NBLAST及びXBLASTプログラム（バージョン2.0）中に導入される。BLAST及びGapped BLASTプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（例えば、NBLASST）のデフォールトパラメーターが使用され得る。１つの態様においては、配列比較のためのパラメーターは、評点＝100、ワード長＝12で設定され得るか、又は変更され得る（例えば、W＝5又はW＝20）。

好ましい態様においては、２種のアミノ酸配列間の％同一性は、BLOSUM62マトリックス又はPAM250マトリックスのいずれか、及び16, 14, 12, 10, ８, ６又は４のギャップ重量及び１, ２, ３, ４, ５又は６の長さ重量を用いて、GCGソフトウェアパッケージにおけるGAPプログラム中に組込まれたNeedleman など. (1970) (J. Mol. Biol. 48: 444-453)を用いて決定される。さらにもう１つの好ましい態様においては、２種のヌクレオチド配列間の％同一性は、NWSgapdna, CMPマトリックス及び40, 50, 60, 70又は80のギャップ重量、及び１，２，３，４，５又は６の長さ重量を用いるGAPプログラムI, GCGソフトウェアーパッケージ（Devereux など. (1984) Nucleic Acids Res. 12 (1): 387)を用いて決定される。

配列の比較のために使用される数学的アルゴリズムのもう１つの好ましい非制限的例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、CGC配列一列整列ソフトウェアーパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）中に組込まれる。アミノ酸配列の比較のためにALIGNプログラムを用いる場合、PAM120重量残基表、12のギャップ長さペナルティー及び４のギャップペナルティーが使用され得る。配列分析のための追加のアルゴリズムは、当業界に知られており、そしてTrellis など. (1994) Comput. Appl. Biosci. 10: 3-5に記載されるようなADVANCE及びADAM;及びPearson など. (1988) PNAS 85: 2444-8に記載されるような FASTAを包含する。

本発明によれば、用語“実質的に相同”とは、タンパク質配列について言及する場合、アミノ酸配列が少なくとも約90−95％又は97−99％又はそれ以上同一であることを意味する。実質的に相同のアミノ酸配列は、本発明の変異体ポリペプチドをコードする配列の核酸配列又はその一部に対して、高い緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされ得る。

“高い緊縮性”の条件とは、本明細書において使用される場合、例えば５×SSC、0.5％SDS、100μg/mlの変性されたサケ精子DNA及び50％ホルマミドを含むハイブリダイゼーション溶液中において42℃で長いポリヌクレオチドプローブと共にブロットを一晩（例えば、少なくとも12時間）、インキュベートすることを意味する。ブロットを、５％以下のbpミスマッチを可能にする高い緊縮条件下で洗浄し（例えば、0.1×SSC及び0.1 SDSにおいて65℃で30分間、２度の洗浄）、それにより、例えば95％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を選択する。

高い緊縮条件の他の非制限的例は、30mMのNaCl及び0.5％SDSを含む水性緩衝液による65℃での最終洗浄を包含する。高い緊縮条件のもう１つの例は、７％SDS、0.5MのNaPO₄、ｐH7.1, 1mMのEDTAにおける50℃での一晩のハイブリダイゼーション、続いて、42℃での１％SDS溶液による１又は複数回の洗浄である。高い緊縮洗浄は５％以下のミスマッチを可能にするが、低められた又は低い緊縮条件は、20％までのヌクレオチドミスマッチを可能にする。低い緊縮性でのハイブリダイゼーションは、上記のようにして、但しより低いホルマミド条件、より低い温度及び/又はより低い塩濃度、並びにより長いインキュベーション時間を用いて達成され得る。

本発明のポリペプチド（及びポリヌクレオチド）に関して使用される場合、用語フラグメントは、大きな配列のサブセットである配列（すなわち、大きな配列内の残基の連続した又は切断されていない配列）を言及する。

本発明のポリペプチドは、いずれかの種の哺乳類、例えばマウス、ラット、テンジュクネズミ、ウサギ、家畜、例えばウシ、羊又はブタ、ペット、例えばイヌ、ネコ、非ヒト霊長類、又は他の動物、又はヒトの細胞及び組織に起因するが、好ましくはヒト細胞に起因する。eNOSの配列は、多くの種、例えばヒト（Janssens など. (1992) J. Biol. Chem. 267,14, 519-522）、ウシ（USP5,498,539号の配列番号２）、イヌ（ジーンバンク受託番号AF143503号）及びテンジュクネズミ（ジーンバンク受託番号AF146041号）に関して知られている。

いずれかの所定の哺乳類において、eNOSポリペプチドは、種々の組織に見出され得る。そのようなポリペプチドの組織又は細胞位置を決定するための方法は、標準であり、そして例えば免疫組織化学の標準方法を包含する。eNOSポリペプチドは、例えば血管内皮、心筋、血液血小板、及び免疫系の種々の細胞、例えばT−細胞、好中球及び単球に見出される。

eNOSポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチド：
本発明は、本発明のeNOSポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチド及びそのフラグメントを包含する。本発明はまた、本発明のeNOSポリペプチド変異体を、中断しないでコードするポリヌクレオチドを包含する。“中断しないでコードする”ポリヌクレオチドは、イントロン又は他の非コード配列により中断される読み取り枠（“ORF”）に比較して、連続ORFを有するポリヌクレオチドを言及する。

本発明のポリヌクレオチドは、組換えポリヌクレオチド、天然ポリヌクレオチド又は合成又は半合成ポリヌクレオチド、又はそれらの組合せであり得る。本明細書において使用される場合、用語ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、オリゴマー及び核酸は、交換できる。従って、“ポリヌクレオチド”とは、十分な長さのポリヌクレオチドのフラグメント、例えばオリゴヌクレオチドを包含する。

本明細書において使用される場合、用語“遺伝子”とは、ポリペプチド鎖の生成に包含されるDNAのセグメントを意味し；それは、コード領域（リーダー及びトレイラー）及び個々のコードセグメント（エキソン）間の介在性配列（イントロン）の前及び後の領域を含むことができる。もちろん、cDNAはその対応するイントロンを欠いている。本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離された遺伝子（例えば、ゲノムクローン）を包含する。

本発明のポリヌクレオチドは、RNA, PNA又はDNA、例えばcDNA、ゲノムDNA及び合成又は半合成DNA、又はそれらの組合せであり得る。DNAは、三本鎖、二本鎖又は一本鎖であり得、そして一本鎖である場合、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であり得る。それは、ヘアーピン又は他の二次構造を含んで成る。RNAは、オリゴマー（センス又はアンチセンス鎖を有するそれらを包含する）、mRNA、ポリアデニル化されたRNA、全RNA、一本鎖又は二本鎖RNA、又は同様のものを包含する。DNA/RNA重複体もまた、本発明により包含される。

本発明のポリヌクレオチド及びそのフラグメントは、本発明に適合できるいずれかのサイズのものでもあり得、例えばプローブとして使用される場合、所望する特異性を達成するのに効果的であるいずれかのサイズのものであり得る。ポリヌクレオチドは、最小の特異的プローブ（例えば、10〜12個のヌクレオチド）〜十分な長さ以上のcDNA（例えば、融合ポリヌクレオチド、又はゲノム配列の一部であるポリヌクレオチドの場合）のサイズ範囲であり；フラグメントは、十分な長さのcDNAよりも短いヌクレオチドであり得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも約8, 10, 12, 14又は15個の連続したヌクレオチド、例えば約15個の連続したヌクレオチドを含んで成る。

本発明のポリヌクレオチドのフラグメントは、本明細書の他の部分で論じられるように、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。ポリヌクレオチドのフラグメントは、カセット突然変異誘発のための出発点としても有用である。カセット突然変異誘発（例えば、Leeなど. (2001)前記を参照のこと）は、配列中への多の突然変異の同時導入を可能にする。次に、個々のクローンが発現され、そして所望する表現型がスクリーニング方法により選択され、そして生成物が配列決定される。例えば、十分な長さのeNOS変異体は、E. コリにおいて発現され、そして変異体がカルモジュリン親和性カラム上への吸着により選択され、溶離され、そして次にウェスターンブロットされる。

次に、結合する変異体の配列が標準の配列決定プロトコールを用いて決定され得る。同様に、突然変異誘発された配列が、例えばファージ表示上でエピトープとしてそのモチーフを発現するシステム中に導入され得る。ファージがカルモジュリン親和性カラムに結合され、選択され、そして配列決定され得る。ペプチドライブラリーアプローチはまた、eNOSカルモジュリン−結合ドメインの配列が全体の合成に基づいて分析できるので、使用され得る。

次の多くのタイプのポリヌクレオチド変異体が本発明により包含される：（ｉ）１又は複数のヌクレオチドにより置換されているか、又は他方では、突然変異誘発されている変異体；又は（ii）１又は複数のヌクレオチドが修飾されている、例えば置換基を含む変異体；又は（iii）ポリヌクレオチドがもう１つの化合物、例えばポリヌクレオチドの半減期を高めるための化合物により融合されている変異体；又は（iV）の追加のヌクレオチド、例えば、リーダー又は分泌配列、又はポリヌクレオチドの精製のための使用される配列をコードする配列に共有結合されている変異体。追加のヌクレオチドは、異種源からあり得るか、又は天然の遺伝子に対して内因性であり得る。

本発明のポリヌクレオチドは、野生型eNOSの配列により包含されるコード配列の天然に存在するか又は天然に存在しない対立遺伝子変異体であるコード配列を有することができる。当業界において知られているように、対立遺伝子変異体は、一般的にコードされるポリペプチドの機能を実質的に変更しない、1又は複数のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を有することができるポリヌクレオチド配列の他の形である。
コード配列又は調節配列に位置する他の変異体配列は、本発明のeNOSポリペプチド変異体の生成、又はその変異体の機能又は活性に影響を及ぼすことができる（例えば、増強するか又は低める）。

上記タイプ（ii）に属するポリヌクレオチド変異体は、例えば修飾、例えば検出マーカー（アビジン、ビオチン、放射性元素、蛍光標識及び色素、エネルギー移行ラベル、エネルギーを放すラベル、結合パートナー、等）又は発現；摂取、カタログ化、標識、ハイブリダイゼーション、検出、及び/又は安定性を改良する成分の結合を包含する。ポリヌクレオチドはまた、固体支持体、例えばニトロセルロース、磁気又は常磁性微小球（例えば、アメリカ特許第5,411,863号、第5,543,289号に記載されるように、強磁性、超磁性、常磁性、超常磁性、酸化鉄及びポリサッカリドを包含する）、ナイロン、アガロース、ジアゾ化されたセルロース、ラテックス固体微小球、ポリアクリルアミド、等に、所望する方法に従って結合され得る。例えば、アメリカ特許第5,470,967号、第5,476,925号、第5,478,893号を参照のこと。

上記タイプ（iii）に属するポリヌクレオチド変異体は、当業界において良く知られており、そして例えば種々の長さのポリA+末端、5’キャップ構造及びヌクレオチドポリペプチド変異体、例えばイノシン、チオヌクレオチド又は同様のものを包含する。
上記タイプ（iv）に属するポリヌクレオチド変異体は、例えば種々のキメラ、ハイブリッド又は融合ポリヌクレオチドを包含する。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、コード配列及び追加の天然に存在しないか又は異種コード配列（例えば、リーダー、シグナル、分泌、標識、酵素、蛍光、抗生物質耐性及び他の機能的又は診断性ペプチドをコードする配列）：又はコード配列及び非コード配列、例えば5’又は3’末端のいずれかでの、又はコード配列、例えばイントロンに分散された未翻訳配列を含んで成ることができる。

より特定には、本発明は、ポリヌクレオチドを包含し、ここでeNOSポリペプチド変異体のためのコード配列が、融合eNOSポリペプチド変異体を生成するために、前記ポリヌクレオチドによりコードされるもう１つのポリペプチド配列に同じ読み取り枠において融合される。この態様で融合され得るポリペプチド配列は、宿主細胞からのポリペプチドの発現及び分泌を助ける配列、例えば細胞からのポリペプチドの輸送を調節するための分泌配列として機能するリーダー配列、及び/又は細胞膜へのポリペプチドの結合を促進するトランスメンブランアンカー配列である。

リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、そしてポリペプチドの成熟形を形成するために、宿主細胞により分解されるリーダー配列を有することができる。ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質であるプロタンパク質及び追加のN−末端アミノ酸残基をコードすることができる。プロ配列を有する成熟タンパク質はプロタンパク質であり、そして一般的に、不活性形のタンパク質であり、そしてプロ配列が分解されると、活性タンパク質が残存する。

本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの同定及び/又は精製を可能にするマーカー配列に整合して融合されるコード配列を有することができる。マーカー配列は、細菌宿主の場合、マーカーに融合される成熟ポリペプチドの精製を提供するヘキサ−ヒスチジン標識（例えば、pQE−９ベクターにより供給されるような）であり得るか、又はマーカー配列は、哺乳類宿主、例えばCOS−７細胞が使用される場合、赤血球凝集素（HA）標識であり得る。HA標識は、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する（例えば、Wilson, I., など., Cell, 37: 767 (1984)を参照のこと）。

他のタイプのポリヌクレオチド変異体は、当業者に明らかであろう。例えば、ポリヌクレオチドのヌクレオチドが所望する目的、例えばヌクレアーゼ、例えばRNアーゼHに対する耐性、改良されたインビボ安定性に依存して、種々の既知の結合、例えば、エステル、スルファメート、スルファミド、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、メチルホスホネート、カルバメート、等を通して連結され得る（例えば、アメリカ特許第5,378,825号を参照のこと）。いずれかの所望のヌクレオチド又はヌクレオチドポリペプチド変異体、例えば６−メルカプトグアニン、８−オキソ−グアニンが組込まれ得る。
また、本発明のポリヌクレオチドは、生物のもう１つの遺伝子座に由来するコード配列を有することができる、但しそれは哺乳類野生型eNOSポリペプチド、又はもう１つの生物からのポリペプチドに対して実質的に相同性を有する（例えば、オルト体）。

本発明のポリヌクレオチドは、いずれかの所望する方法に従ってラベルされ得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、放射性トレーサー、例えば³²P, ³⁵S, ³H又は¹⁴Cを用いてラベルされ得る。放射性ラベリングは、いずれかの方法、例えば放射性ラベルされたヌクレオチド、ポリヌクレオチドキナーゼ（ホスファターゼによる脱リン酸化を伴って又はそれを伴わないで）、又はリガーゼ（ラベルされるポリヌクレオチドの末端に依存して）を用いて、3’又は5’末端での末端ラベリングにより行われ得る。本発明のポリヌクレオチドと、免疫学的性質（抗原、ハプテン）、一定の試薬（リガンド）に対する特異的親和性、検出できる酵素反応の完結を可能にする性質（酵素又は補酵素、酵素基質、又は酵素反応に包含される他の物質）、又は特徴的な物性、例えば蛍光、又は所望する波長での光の発光又は吸収、等を有する残基とを組合す非放射性ラベリングがまた使用され得る。

本発明のポリペプチドは、野生型eNOS又は本発明の変異体eNOSポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも約65−100％（例えば、少なくとも約70−75％、80−85％、90−95％又は97−99％）の配列同一性を有するが、又は実質的に相同であるか、又は高い緊縮性の条件下でハイブリダイズする配列を含んで成ることができる。
用語“実質的に相同”とは、ポリヌクレオチド配列に関して言及する場合、ヌクレオチド配列が本発明の野生型又は変異体eNOSポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも約90−95％又は97−99％又はそれ以上、同一であることを意味する。

eNOSポリペプチドの発現及びeNOS活性についてのアッセイ：
本発明はまた、ベクター及び本発明のポリヌクレオチドを含む組換え構造体にも関する。そのような構造体は、本発明のポリヌクレオチド配列が前方向又は逆方向の配向で挿入されているベクター、例えばプラスミド又はウィルスベクターを含んで成る。

多数の適切なベクターが、当業者に知られており、そして多くは市販されている。次のベクターが例により提供される：細菌：pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); 真核生物: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia)。しかしながら、いずれかの他のプラスミド又はベクターが、それが宿主において複製でき且つ生存できる限り、使用され得る。

好ましい態様においては、ベクターは、本発明のポリヌクレオチド配列が、mRNA合成を指図する適切な発現制御（調節）配列（例えば、プロモーター及び/又はエンハンサー）に作用可能に連絡されるよう挿入されている発現ベクターである。適切な発現制御配列、例えば原核又は真核細胞又はそれらのウィルスにおいて遺伝子の発現を制御することが知らされている調節できるポロモーター又は調節配列が、原核生物（例えば、細菌）、酵母、哺乳類細胞又は他の細胞における発現のために選択され得る。

好ましい発現制御配列は、高度に発現された遺伝子、例えば解糖酵素、例えば中でも３−ホスホグリセレートキナーゼ（PGK）、α−因子、酸ホスファターゼ、又は熱ショックタンパク質をコードするオペロンから誘導される。そのような発現制御配列は、選択マーカーと共に、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター又は他のベクターを用いて、いずれかの所望する遺伝子から選択され得る。そのような選択のための２種の適切なベクターは、pKK232-8及びpCM7である。

使用され得る特定の命名された細菌プロモーターは、lacI, lacZ, T3, T7, gpT, λP_R, P_L及びtrpを包含する。アデノウィルスプロモーター、レトロウィルスからのLTR及びマウスメタロチオネイン−Ｉを包含する。適切なベクター及びプロモーターの選択は、当業者のレベルの範囲内である。

より高等の真核生物による本発明のポリペプチドをコードするDNAの転写は、発現ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより高められ得る。エンハンサーは、その転写を高めるためにプロモーターに対して作用する、通常的10〜300bpのDNAのシス−作用要素である。代表的な例は、100〜270塩基対の複製起点の後期側上のSV40エンハンサー、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウィルスエンハンサーを包含する。

一般的に、組換え発現ベクターはまた、複製の起点を含む。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、転写終結配列、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及び受容体部位、及び/又は5’フランキング又は非転写配列を含むことができる。SV40スプライス及びポリアデニル化部位に由来するDNA配列は、必要とされる非転写遺伝子要素を供給するために使用され得る。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列も含むことができる。さらに、発現ベクターは好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性、例えば真核細胞培養物のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性、又はE. コリにおけるテトラサイクリン又はアンピシリン耐性を提供するための１又は複数の選択マーカー遺伝子を含む。

多数の適切な発現ベクターは、当業者に知られており、そして多くは市販されている。適切なベクターは、染色体、非染色体及び合成DNA配列、例えばSV40の誘導体；細菌プラスミド；ファージDNA；バキュロウィルス；酵母プラスミド；プラスミド及びファージDNA、ウィルスDNA、例えばワクシニア、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、TMV、禽痘ウィルス、及び仮性狂犬病ウィルスの組合せに由来スルベクターを包含する。しかしながら、いずれの他のベクターでも、それが宿主において複製でき且つ生存する限り、使用され得る。

原核及び真核宿主と共に使用するための適切なクローニング及び発現ベクターは、例えばSambrook, など., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y. , (1989), Wu など, Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, New York, NY, 1997), Recombinant Gene Expression Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 62, (Tuan, ed. , Humana Press, Totowa, NJ, 1997), 及び Current Protocols in Molecular Biology, (Ausabel など, Eds.,), John Wiley & Sons, NY (1994-1999)により記載される。遺伝子療法のために適切であるベクター及び組織特異的調節配列のさらな議論は、下記に記載される。

適切なDNA配列が、種々の方法のいずれかにより、ベクター中に挿入され得る。一般的に、DNA配列は、当業界において知られている標準の方法により、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位中に挿入される。本明細書において論じられるこの及び他の分子生物学的技法についての標準の方法は、多くの容易に入手できる源、例えばSambrook, など, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y. , (1989)に見出される。また、例えばアデノウィルス遺伝子供給ビークルの構成のために有用な援助組換え技法についてのGrahamなど. (1988) Virology 63, 614-617を参照のこと。所望には、異種構造配列は、翻訳開始及び終結配列、及び好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔又は細胞外媒体中への分泌を指図できるリーダー配列と共に、適切な時期に発現ベクターにおいてアセンブリーされる。

本発明はまた、構造体、例えば上記に記載されるそれらにより形質転換され/トランスフェクトされ/トランスダクションされた宿主細胞、及び前記細胞の子孫にも関し、特にここで、そのような細胞は、例えばeNOS活性を調節する剤を同定するために、eNOS活性するアッセイのために、及び/又は本発明のポリペプチドの生成（例えば、分離生成）のために使用され得る安定した細胞系をもたらす。

適切な宿主の代表的な例として、次のものが言及され得る：細菌細胞、例えばE. コリ、ストレプトミセス、サルモネラ・チピムリウム、菌類細胞、例えば酵母；昆虫細胞、例えばドロソフィラS2及びスポドプテラSf9（及び他の昆虫発現システム）；動物細胞、例えば哺乳類細胞、例えばCHO, COS（例えば、Gluzman, Cell 23: 175（1981）により記載されるサル腎臓線維芽細胞のCOS-7系）、C127, 3T3, CHO, HeLa, BHK又はBowesメラノーマ細胞系；植物細胞。適切な宿主の選択は、本明細書に記載される教授に基づいて、当業者の知識の範囲内であると思われる。推定上の調節剤を試験するために使用される細胞系は、NOレベルが種々のeNOS活性の表示のためにモニターされる、通常の哺乳類細胞である。

宿主細胞中への構造体の導入（又は供給）は、例えばリン酸カルシウムトランスフェション、DEAE−Dextran介在性トランスフェクション、リポフェクチン、遺伝子ガン又はエレクトロポレーションにより達成され得る（Davis, L., Dibner, M. , Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)）。

適切な宿主株の形質転換及び適切な細胞密度への宿主株の成長に続いて、選択されたプロモーターが、所望には、適切な手段（例えば、温度シフト又は化学的誘発）により誘発され、そして細胞がさらにある期間、培養される。構築された宿主細胞が、プロモーターを活性化し（所望により）、形質転換体を選択し、又は本発明の遺伝子を増幅するために、標準の栄養培地において培養され得る。培養条件、例えば温度、pH及び同様のものは、発現のために選択される宿主細胞によりこれまで使用されて来た条件であり、そして当業者に明らかであろう。

細胞は典型的には、遠心分離により収穫され、物理的又は化学的手段により破壊され、そして得られる粗抽出物がさらなる精製のために保持される。他方では、異種ポリペプチドが宿主細胞から培養流体中に分泌される場合、その培養流体の上清液がタンパク質源として使用され得る。タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、いずれかの標準方法、例えば凍結−融解循環、音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用により破壊され得る。

ポリペプチドが、回収され、そして組換え細胞培養物から、標準の方法、例えば硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィー、又は同様の手段により精製され得る。高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）が最終精製段階のために使用され得る。

原核又は真核宿主からポリペプチドを組換え的に生成するための上記方法の他に、本発明のポリペプチドは、天然源から調製され得るか、又は化学的合成方法（例えば、合成又は半合成）により、例えば標準のペプチド合成機により調製され得る。細胞−フリー翻訳システムはまた、本発明のDNA構造体に由来するRNAを用いて、そのようなタンパク質を生成するためにも使用され得る。本発明のタンパク質はまた、トランスジュニック動物又は植物において発現され、そしてそれらから単離され、そして/又は精製され得る。そのようなトランスジェニック生物の製造及び使用方法は、当業界においては標準である。いくつかのそのような方法は、本明細書において他の場所に記載されている。

もちろん、組換えポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含んで成るベクター、及びトランスファービークル（例えば、遺伝子療法への使用のためのウィルストランスファービークル）はまた、標準の方法により調製され得る。例えば、本発明の組換えeNOS変異体ポリヌクレオチドを含んで成るアデノウィルスを調製するためには、トランスフェクトされた細胞が、遠心分離され、そして溶解され、そして細胞溶解物がさらに処理され、所望しない汚染物、例えば細胞成分からウィルスが単離される（例えば、精製され、分離される）。アデノウィルスを精製するための標準の方法に関しては、細胞残骸を除去し、そして/又はウィルスを濃縮するための遠心分離又は拡張された層吸着クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換（例えば、DEAE）クロマトグラフィー、超遠心分離、限外濾過、等が存在する。

本明細書に開示される発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１又は複数のコピーをそのゲノム内に含んで成る非ヒトトランスジェニック動物にも関する。本発明のトランスジェニック動物は、本発明のeNOSポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドの複数のコピーを、又はそのようなポリペプチドをコードする遺伝子の１つののコピーを、それらのゲノム内に含むことができ、ここで前記遺伝子はトランスジェニック動物の細胞のいくつか又はすべて内でeNOSポリペプチドの発現（好ましくは、過発見）を方向づけるであろうプロモーター（例えば、調節できるプロモーター）に連結されている。

好ましい態様においては、本発明のeNOSポリペプチド変異体の発現は、血管組織において選択的に発生する。本発明のeNOS変異体が所望する位置で選択的に発現されることを確認できる調節配列、例えば組織特異的プロモーター又はエンハンサーは、当業界において良く知られている。いくつかのそのような調節要素は、本明細書の他の場所で論じられている。種々の非ヒトトランスジェニック生物、例えばショウジョウバエ、C.エレガンス、ゼブラダニオ及び酵母が、本発明により包含される。本発明のトランスジェニックの動物は好ましくは、哺乳類、例えばウシ、ヤギ、羊、ウサギ、非ヒト霊長類、又はラット、最も好ましくはマウスである。

トランスジェニック動物の生成方法は、当業者に良く知られており、そして例えば相同組換え、突然変異誘発（例えば、ENU, Rathkolb など., Exp. PhysioL, 85 (6): 635-644,2000を参照のこと）、及びテトラサイクリン−調節された遺伝子発現システム（例えば、アメリカ特許第6,242,667号；Wu など, Methods in Gene Biotechnology, CRC 1997, pp. 339-366; Jacenko, O., Strategies in Generating Transgenic Animals, in Recombinant Gene Expression Protocols, Vol. 62 of Methods in Molecular Biology, Humana Press, 1997, pp 399-424を参照のこと）を包含する。

トランスジェニック生物は、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドの源を提供するために、又はそのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現及び/又は活性を調節する剤を同定し、そして/又は特徴づけるために有用である。トランスジェニック動物はまた、本発明の変異体ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現に関連する疾病状態についてのモデルとしても有用である。

本発明はまた、ゲノムが、前記ポリペプチドをコードする哺乳類遺伝子の代わりに、本明細書に開示される変異体eNOSをコードする１又は複数の遺伝子を含んで成るトランスジェニック非ヒト動物にも関する。eNOS遺伝子をノックアウトし、そしてそれを変異体遺伝子により置換するための方法は知られている（例えば、eNOS遺伝子がノックアウトされているマウスの記載については、Murohara 1998前記を参照のこと）。好ましくは、トランスジェニック動物は、マウス又はラットである。

上記に言及される方法の他に、トランスジェニック動物（トランスジーンがノックアウトされた遺伝子を置換するために挿入されているノックアウト動物）は、胚幹細胞中に人工酵母染色体を組込む組換え遺伝子の前核を１つの細胞の胚の前核中に注入することによる既知方法、遺伝子標的化方法、胚幹細胞方法、クローニング方法、核トランスファー方法により調製され得る。

また、アメリカ特許第4,736, 866号; 第4,873, 191号; 第4,873, 316号; 第5,082, 779号; 第5,304, 489号; 第5,174, 986号; 第5,175, 384号; 第5,175, 385号; 第5,221, 778号; Gordon など., Proc. Natl. Acad. Sci., 77: 7380-7384,1980 ; Palmiter など., Cell, 41: 343-345,1985 ; Pa, miter など., Ann. Rev. Genet., 20: 465-499,1986 ; Askew など., Mol. Cell. Bio., 13: 4115-4124,1993 ; Games など. Nature, 373: 523-527,1995 ; Valancius and Smithies, Mol. Cell. Bio., 11: 1402-1408,1991 ; Stacey など., Mol. Cell. Bio., 14: 1009-1016,1994 ; Hasty など., Nature, 350: 243-246,1995 ; Rubinstein など., Nucl. Acid Res., 21: 2613-2617,1993 ; Cibelli など., Science, 280: 1256-1258,1998も参照のこと。

組み換え酵素切除システムに対する案内については、例えばアメリカ特許第5,626, 159号；第5, 527,695号及び第 5,434, 066号を参照のこと。

また、Orban, P. C., など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6861-6865 (1992); O'Gorman, S., など, Science, 251: 1351-1355 (1991); Sauer, B., など., Polynucleotides Research, 17 (1) : 147-161 (1989); Gagneten, S. など. (1997) Nucl. Acids Res. 25: 3326-3331; Xiao and Weaver (1997) Nucl. Acids Res. 25: 2985-2991; Agah, R. など. (1997) J. Clin. Invest. 100: 169-179; Barlow, C. など (1997) Nucl. Acids Res. 25: 2543-2545; Araki, K. など. (1997) Nucl. Acids Res. 25: 868-872; Mortensen, R. N. など. (1992) Mol. Cell. Biol. 12: 2391-2395 (G418段階的拡大方法); Lakhlani, P. P. など. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 9950-9955 ("hit and run"); Westphal and Leder (1997) Curr. Biol. 7: 530-533 (トランスポゾン-生成された"ノック−アウト"及び "ノック-イン") ; Templeton, N. S. など (1997) Gene Ther. 4: 700-709 (例えば、選択マーカーを伴わないで、高い頻度の相同組換え現象を可能にする効果的遺伝子標的化方法); PCT International Publication WO 93/22443 (機能的に破壊された)を参照のこと。

トランスジェニック動物の生成のためには、本発明のeNOSポリヌクレオチドが、トランスジェニック動物を生成するために、いずれかの非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳類、例えばマウス（例えば、Hogan など., Manipulating the Mouse Embryo : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1986）、ブタ（例えば、Hammer など., Nature, 315: 343-345,1985）、羊（例えば、Hammer など., Nature, 315: 343-345,1985）、ウシ、ラット、又は霊長類（例えば、Church, 1987, Trends in Biotech. 5: 13-19; Clark など., Trends in Biotech. 5: 20-24, 1987）中に導入され得る。トランスジェニック動物は、アメリカ特許第5,994,618号に記載される方法により生成され（又は繁殖され）、そして本明細書に記載される効用のいずれかのために使用され得る。

eNOSポリペプチド結合パートナー：
本発明のeNOSポリペプチド変異体、又はその変異体又はそれらを発現する細胞がまた、特異的結合パートナー、例えば本発明のeNOSポリペプチド変異体に対して特異的に結合するタンパク質及び核酸についてアッセイするためにも使用され得る。そのような結合パートナーは、例えばキナーゼ、ホスファターゼ及びカルモジュリンを包含する。さらに、本発明のeNOSポリペプチド変異体は、特異的抗体、又は抗原−結合フラグメントを生成するための免疫原として使用され得る。本明細書に記載されるか又は当業界において知られている標準方法が、eNOSポリペプチド変異体のそのような特異的結合パートナーについてアッセイし、そしてそれを単離するために使用され得る。

“特異的”抗体又は抗原−結合フラグメントとは、本発明のeNOS、又はそのフラグメント又は変異体、特に本発明の突然変異誘発された配列に選択的に結合するものである。ポリペプチドに対して“特異的な”抗体とは、抗体がポリペプチド内の又はそれを包含するアミノ酸の定義された配列を認識することを意味する。
本発明の抗体は、例えばポリクローナル又はモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ、組換え、一本鎖及び部分的に又は完全にヒト適合された抗体、及びFabフラグメント、又はFab発現ライブラリーの生成物、及びそれらのフラグメントを包含する。抗体は、IgM, IgG, サブタイプ、IgG2A, IgG1, 等であり得る。当業界において知られている種々の方法が、そのような抗体及びフラグメントの生成のために使用され得る。

本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、例えば動物中へのポリペプチドの直接的な注入により、又は動物、例えばヤギ、ウサギ、マウス、ニワトリ、等、好ましくは非ヒトへのポリペプチドの投与により得られる。そのようにして得られる抗体は、ポリペプチド自体を結合するであろう。この態様においては、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえ、完全な生来のポリペプチドを結合する抗体を生成するために使用され得る。そのような抗体は、ポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。抗体はまた、裸DNAを投与することによっても生成され得る。例えば、USP第5,703,055号；第5,589,466号及び第5,580,859号を参照のこと。

モノクローナル抗体の調製に関しては、連続細胞系培養により生成される抗体を供給するいずれかの技法が使用され得る。その例は、例えば次のものを包含する：ハイブリドーマ技法（Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497）、トリオーマ技法、ヒトB−細胞ハイブリドーマ技法（Kozbor など., 1983, Immunology Today 4: 72）及びヒトモノクローナル抗体を生成するためのEBV−ハイブリドーマ技法（Cole, など., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）。

一本鎖抗体の生成について記載される技法（例えば、アメリカ特許第4,946,778号）は、本発明の免疫原性ポリペプチド生成物に対する一本鎖抗体を生成するために適合され得る。また、トランスジェニック動物は、本発明の免疫原性ポリペプチド生成物に対する部分的に又は十分にヒト適合された抗体を発現するために使用され得る。
本発明はまた、アプタマー及びPNAを包含する他の特異的結合パートナーにも関する。

eNOSポリペプチド変異体及びそのようなeNOSポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの診断、予防及び治療使用：
内皮NOシンターゼは、例えば本明細書に記載されるように種々の機能及び活性に関与し：そしてそれらのeNOSポリペプチドの異常発現及び/又は活性、及び/又はそれらの酵素により生成される異常量のNO生成物は種々の疾病状態に関連している。従って、本発明のポリペプチド変異体及びポリヌクレオチド、及びそれらの変異体は、そのような状態を改善するために細胞におけるeNOS活性を調節するために使用され得る。

いくつかの態様においては、eNOSの高められた発現及び/又は活性、及びeNOSによるNOの生成における同時上昇は、所望しない細胞増殖、腫瘍増殖又は種々の新形成疾患を可能にする所望しない脈管に関連している。NOの高められた生成に関連する状態に関しては、例えば種々の神経性疾患（例えば、発癌、腫瘍増殖及び転移増殖）、放射性又は化学療法に対する悪性新形成腫瘍の耐性、膀胱癌転移性又は非転移性（嚢胞腺癌）、脈管肉腫、及び増殖性網膜症が存在する。

いくつかの態様において、eNOSの低められた発現及び/又は活性、及びeNOSによるNO生成の量の同時低下は、次の種々の状態に関している：疾病状態、例えば過度の血管収縮及び/又は不適切な血管拡張に関連する状態、例えば末梢脚虚血、末梢動脈閉塞性疾患（PAOD）及び決定的脚虚血（CLI）、動脈硬化又は血管血栓症；心筋虚血、例えば血流制限性冠動脈狭窄に起因する虚血；例えばバルーン血管形成に続く再狭窄；高血圧、肺高血圧、閉塞性気道疾患、移植片アテローム硬化症、大動脈癌、高コレステロール血症、老化、炎症、喫煙の効果、うっ血性心不全、妊娠性毒血症、糖尿病、欠陥性脈管形成の疾患、レーノー現象、プリンズメタル型狭心症（冠状血管痙攣）、大脳血管痙攣、溶血性尿素症、勃起性機能不全及び不良な創傷治療。

異常低量のNOに関連する他の状態は、次の病状、を包含する：心不全、心代償障害、虚血性心筋障害、膨張されたか又は移殖後の心筋障害、狭心症(不安定狭心症を包含する)、冠動脈れん縮、移植後の冠状動脈血栓症、高コレステロール血症、高脂血症、血清トリグリセリド値上昇、糖尿病の血管の副作用(インシュリノーマ依存するか又はしない)、慢性腎機能不全の血管の副作用(尿毒症症候群)、 様々な起源の内皮機能不全(アテローム性動脈硬化、煙嗜癖、X症候群、肥満治療、高血圧症、異常脂血症、インスリンへの耐性)、全身性又は自己免疫性脈管炎、高ホモシスチン血症、バーガー血管炎、血栓塞栓病、深いか又は表在静脈血栓症、血管領域に動脈の機能不全症を有するアテローム性動脈硬化症(大脳虚血か冠状動脈の虚血症を包含する虚血症)、肺動脈の高血圧症、副作用、血液透析又は腹膜透析。

不十分なNOはまた、子宮平滑筋の所望しない収縮又は子宮頸の弛緩に関係し；従って、本発明の変異体eNOSの投与は、例えば子宮への投与により早期分娩を妨げ、又は子宮頸への投与により分娩を刺激するか又は誘発するために有用である。不十分なNOにより特徴づけられる他の状態は、子癇前症、月経困難症及び失禁を包含する。
本発明のeNOSポリペプチド変異体の投与はまた、免疫応答の調節のためにも有用である。例えば、本発明のeNOSポリヌクレオチドは、T−細胞、血小板、好中球、単球、又はNK細胞中に、それらの活性を調節するために導入され得る。そのような方法により有益である疾病状態は、アテローム硬化症、免疫疾患又は自己免疫疾患を包含する。

特定の理論又は機能に結びつけることは所望しないが、本発明のeNOSポリペプチド変異体は、グルコース及び脂肪酸代謝を促進することにより、及び筋細胞への改良された栄養物及び酸素供給により、虚血性心疾患の処理において有用である。

本発明は、eNOSポリペプチドの合成及び/又は活性を調節するそれらの剤を同定するために、インビトロ又はインビボで（例えば、細胞に基づくアッセイ又は動物モデルにおいて）、前記剤をスクリーニングするための方法を提供する。そのような方法は、本発明の変異体eNOSポリペプチド又はポリヌクレオチド、又はそれらの変異体を使用することができる。そのような合成及び/又は活性（アンタゴニスト）を阻害する剤は、例えば患者の細胞内のNOの低められたレベル及びそれに起因する生理学的変更をもたらす。そのような合成及び/又は活性（アンタゴニスト）を増強する剤は、例えば対象細胞内のNOの高められたレベルをもたらすことができる。例えば、本発明は、例えばカルモジュリン及び/又はカルシウム濃度の機能として、又は本明細書に開示されるいずれかのeNOS活性を調節するために、本発明のeNOSポリペプチドのリン酸化又は活性を高めるか又は低めるそれらの能力について推定上のモジュレーターを試験することがを含んで成る、eNOS発現のモジュレーターの同定方法に関する。そのような活性をモニターするためのアッセイ方法は標準であり、そして当業者に良く知られている。

eNOS発現及び/又は活性を阻害する剤は、eNOSの過発現又は高められた活性に関連する状態の症状を処理するか、予防するか、そして/又は改善するために使用され得；そしてそのような活性を増強する剤は、eNOSの過少発現又は低められた活性に関連する状態の症状を処理するか、予防するか、そして/又は改善するために使用され得る。eNOSポリペプチドのインヒビター（例えば、eNOS活性又は発現のインヒビター）は、例えばeNOSの過剰生成又はその高められた活性に関連する、本明細書の他の部分に記載されるいずれかの状態を処理するために使用され得る。本発明のeNOSポリヌクレオチド又はポリペプチド変異体の刺激剤は、例えばeNOSの過少生成又はその低められた活性に関連する、本明細書に他の部分に記載されるいずれかの状態を処理するために使用され得る。

有能なアンタゴニスト又はアゴニストのアッセイにおいては、eNOSに関連する種々の機能及び/又は酵素活性が使用され得る。典型的な機能及び活性は、本明細書の他の部分において論じられている。アッセイはインビトロ、エクスビボ又はインビボで行われ、そしていずれかの適切な細胞又は組織を用いて行われ得る。インビボアッセイは、すでに記載されたようなトランスジェニックマウス、又は本明細書に開示される変異体ヒトeNOSをコードするヒト遺伝子がそのようなポリペプチド変異体をコードするマウス遺伝子の代わりに存在するヒト適合されたマウスを用いて行われ得る。

もちろん、本明細書に記載されるいずれかのアッセイが、推定上の阻害又は刺激剤の生成、同定及び特徴化として、種々の高処理量方法論のいずれかに適合され得る。eNOS発現又は活性を調節するそれらの能力に基づいて同定される剤はまた、他のeNOS野生型又は変異体ポリペプチドの調節のために、及び/又は１又は複数のeNOS活性に関連する疾病状態の診断又は処理のためにも使用され得る。

本発明の有能なモジュレーター、例えばインヒビター又は活性剤は、小さな化合物（例えば、無機能又は有機分子）、ポリペプチド、ペプチド又はペプチドポリペプチド変異体、ポリヌクレオチド、本発明のポリペプチドに対して特異的に結合する抗体、又は同様のものを包含する。他の阻害又は刺激物質は、細胞に侵入し、そして本発明のポリペプチドをコードする配列に隣接するDNAに直接的に結合し、それにより、それらの発現を低め、そして従って、NOの細胞内レベルを低めるか、又はそれらの発現を高め、そして従ってNoの細胞内レベルを高める。

本発明は、疾病又は病状と有するか、又は従って危険性があると思われる動物（例えば、“処理の必要な患者”）において、本発明のeNOSポリペプチド変異体の量（例えば、存在又は不在、又は量）、又はそれらの活性レベルを決定することにより、NOの変更されたレベルに関連する実際の又は可能性ある疾病又は状態（例えば、eNOS生成又は活性により介在されるか又はそれに関連する）を診断するか又は段階を調べるための手段を提供する。例えば、本発明は、疾病を有する動物におけるその疾病を診断するか、又は疾病の危険性での動物におけるその疾病に対する感受性を診断するための方法を提供し、ここで前記疾病は、好ましくは、動物が哺乳類、より好ましくはヒトである場合、細胞、組織又は器官におけるNOレベルの所望しない上昇又は下降を導く、本発明の突然変異の特定の細胞、組織又は器官における存在に関連している。

そのような診断方法は、本明細書の別の部分に記載されるアッセイのいずれかを使用することができる。例えば、本発明の抗体又は抗原特異的フラグメントに基づく方法を用いて、突然変異誘発されたポリペプチドを検出することができる。免疫学的アッセイは、ELISA, RIA及びFACSアッセイを包含する。診断目的のためのサンプルをアッセイする場合、サンプルは、患者からのいずれか適切な細胞、組織、器官又は体液、例えば尿、唾液、組織生検及び剖検材料（但し、それらだけには限定されない）から得られる。

本発明のeNOSポリペプチド変異体の検出はまた、例えば突然変異を含んで成るそれらの細胞を同定するために、そのような突然変異を担持するプラスミドによりトランスフェクトされた細胞をスクリーニングする場合、研究目的のために有用である。
本発明によれば、抗体又は抗原−結合フラグメントがキットに存在し、ここでキットは、例えば１又は複数の抗体又は抗原−結合フラグメント、所望する懸濁液、検出組成物、対象として使用されるタンパク質（例えば、本発明のeNOS変異体）を含む。

ポリヌクレオチドを包含するアッセイは、サンプルにおける本発明の変異体eNOS核酸の存在又は不在を決定し、そして/又はそれを定量化するために使用され得る。そのようなアッセイは、例えば診断、研究又は法廷で用いる目的のために使用され得る。アッセイは、膜に基づくか、溶液に基づくか、又はチップに基づくことができる。

次のいずれかの適切なアッセイが使用されるが、但しそれらだけには限定されない：サザンブロットアッセイ、ノザンブロットアッセイ、ポリメラーゼ鎖反応（“PCR”）（例えば、Saiki など., Science, 241: 53,1988 ; アメリカ特許第 4,683, 195号,第4, 683,202号, and 第6,040, 166号; PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Innis など, eds. , Academic Press, New York, 1990）、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（“RT−PCR”）、固定されたPCR, cDNA末端の急速増幅（“RACE”）（例えば、Schaefer in Gene Cloning and Analysis : Current Innovations, Pages 99-115, 1997）、リガーゼ鎖反応（“LCR”）（EP320308号）、片側PCR（Ohara など., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 5673-5677, 1989）、インデックス方法（アメリカ特許第5,508,169号）、現場ハイブリダイゼーション、示差表示（Liang など., Nucl. Acid. Res. , 21: 3269-3275,1993 ; アメリカ特許第5,262, 311号,第5, 599,672号 及び第 5,965, 409号; W097/18454 合; Prashar and Weissman, Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 659-663, 及びアメリカ特許第6,010, 850号 及び第 5,712, 126号; Welsh など., Nucleic Acid Res., 20: 4965-4970,1992, 及びアメリカ特許第5,487, 985号）、及び他のRNAフィンガープリント方法、核酸配列に基づく増幅（“NASBA”）及び他の転写に基づく増幅システム（例えば、アメリカ特許第5,409, 818号 及び第5,554, 527号; WO 88/10315号）、ポリヌクレオチドアレイ（アメリカ特許第5,143, 854号；第5, 424,186号 ; 第5,700, 637号；第5, 874,219号及び第 6,054, 270号; PCT WO 92/10092号; PCT WO 90/15070号）、QBetaレプリカーゼ（PCT/US87/00880号）、鎖置換増幅（“SDA”）、修復鎖反応（“PCR”）、ヌクレアーゼ保護アッセイ、控除に基づく方法又はRapid−Scan^TM。

追加の有用な方法は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：鋳型に基づく増幅方法、競争PCR（例えば、アメリカ特許第5,747,251号）レッドクスに基づくアッセイ（例えば、アメリカ特許第3,871,918号）、Taqmanに基づくアッセイ（例えば、Holland など., Proc. Natl. Acad, Sci., 88: 7276-7280,1991 ; アメリカ特許第5,210, 015号 及び第5,994, 063号）、分子エネルギートランスファーラベル（例えば、アメリカ特許第5,348, 853号,第5, 532,129号, 第5,565, 322号,第 6,030, 787号, 及び第 6,117, 635号; Tyagi and Kramer, Nature Biotech., 14: 303-309,1996）。

遺伝子又はタンパク質発現の単一細胞分析のために適切ないずれかの方法、例えば現場ハイブリダイゼーション、免疫細胞化学、MACS、FACS、流動細胞計測法、等が使用され得る。単一細胞アッセイに関しては、発現生成物は、抗体、PCR、又は他のタイプの核酸増幅を用いて測定され得る（例えば、Brady など., Methods MoL & Cell. Biol. 2,17-25, 1990; Eberwine など., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., 89,3010-3014, 1992; アメリカ特許第5,723, 290号）。それらの及び他の方法は、引用され得る文献に記載されるように、従来通りに行われ得る。

本発明はまた、疾病を有する動物におけるその疾病を診断するか、又は疾病の危険性がある動物におけるその疾病に対する敏感性を診断するための方法も提供し、ここで前記疾病は、例えばeNOSポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に関連し、ここで前記方法は、動物、好ましくは哺乳類及び最も好ましいヒトからの細胞における前記ポリヌクレオチドの量を決定することを含んで成る。本明細書に記載されるか、又は他方では、当業界において知られているいずれかのアッセイ方法が、そのようなポリヌクレオチドの存在を決定し、そして/又は定量化するために使用され得る。

本発明のeNOSポリペプチド変異体の一部又はすべてをコードするポリヌクレオチド配列は、疾病の危険性があると思われるか、又はそのような疾病を有する動物のゲノムをプローブするために、又は突然変異を含んで成るそれらの細胞を同定するためにそのような変異体を担持するプラスミドによりトランスフェクトされた細胞をスクリーニングする場合、研究目的のためのそのようなポリヌクレオチドの存在を検出するために使用され得る。30〜45個の、又はそれよりも長いヌクレオチドのプローブの開発のための対照として作用することができる。

このタイプのハイブリダイゼーションプローブは、好ましくは少なくとも７又は８個の塩基、より好ましくは約10, 11, 12, 13, 14又は15個の塩基、及び最も好ましくは少なくとも30個の塩基を有し、そして本発明のeNOSポリペプチド変異体をコードする配列の一部又はすべてに対して約65〜100％配列同一性を示す。ハイブリダイゼーションプローブは、選択されたポリヌクレオチドに対して特異的である。用語、ポリヌクレオチド“に対して特異的な”とは、プローブがサンプルにおける１又は複数の標的遺伝子又はポリヌクレオチド配列の存在を同定するために使用され得る機能的意味を有する。プローブは、それがバックグラウンドノイズ（“非特異的結合”）以上のポリヌクレオチドを検出するために使用され得る意味において特異的である。

本発明によれば、ポリヌクレオチドはキットに存在することができ、ここで前記キットは、例えば１又は複数のポリヌクレオチド（例えば、ハイブリダイゼーションプローブ）、所望の緩衝液（例えば、リン酸、トリス、等）、検出組成物、対照として使用されるRNA又はcDNA（例えば、本発明の変異体を含んで成る）、ライブラリー、等を包含する。ポリヌクレオチドは、当業界において知られているような放射性ラベルによりラベルされても又はされなくても良い。

本発明はまた、eNOSの生成及び/又は活性に影響を及ぼす剤を投与することにより、又は剤、例えば本発明の変異体eNOSポリペプチド又はポリヌクレオチドを投与することにより、本明細書に記載される疾病又は状態により介在されるか又は関係するeNOSを攻撃するための治療又は予防方法にも関する。そのような処理は、そのような疾病又は状態を改善することができる。
そのような剤は、標準の方法により、その必要な疾病に投与され得る。投与経路は、当業者に良く知られており、そして静脈内、筋肉内、腹腔内、皮膚内、動脈内及び経口方法を包含するが、但しそれらだけには限定されない。

そのような剤は、医薬的に許容できる賦形剤、キャリヤー、等を含んで成る医薬組成物中に、標準の方法を用いて配合され得る。細胞膜を通しての剤の移行を増強し（侵入を促進し）、又は分解を保護する配合物及び賦形剤は、当業界において良く知られている。例えば、供給ビークル（例えば、ポリヌクレオチドのインビボ又はエクスビボトランスファーのための）は、種々の標準方法のいずれか、たとえばリポソームがコレステロース誘導体、例えばSF−chol又hDC-cholを含むカチオン性リポソームであるリポソーム介在トランスフェクション；リポフェクタミンによるトランスフェクション、又は同様の方法により、標準細胞に供給され得る。典型的な方法は、USP第5,656,565；Mannino など. (1988) BioTechniques 6, 682-690 及びそこにおける引例; 及びGao など. (1991) Biochem Biophys Res Comm 179,280-285に記載されている。

１つの態様においては、eNOS活性に関連する状態を有する患者に投与される剤は、疾病状態が発現される部位に局部的に投与される。そのような局部供給は、例えば非疾病関連の細胞又は組織におけるNOの誘発に起因する所望しない効果（例えば、副作用）を回避できる。

例えば、分子は、心臓又は骨格筋、例えば心筋及び骨格筋に直接的に供給され得る。本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、非常に効果的な治療を可能にする程度へのトランスジーンの発現を十分にする量で、X線透視案内下で標準の経皮カテーテル基材の方法を用いて、直接的な冠状動脈（又は移植片血管）注射により心筋層中に供給され得る。注射は、冠状動脈（又は移植片血管）の内腔（例えば、動脈内腔内の約1cm）中に深く行われ得、そして好ましくは、側副枝血管の成長は個々の患者内で変動するので、両冠状動脈において行われ得る。

冠状カテーテルにより冠状動脈の内腔中に前記材料を直接的に注射することにより、遺伝子を効果的に標的化し、そして注射の間、近位大動脈への組換えベクター又はポリペプチドの損失を最少にすることが可能である。遺伝子発現は、この状態で供給される場合、肝細胞において発現せず、そしてウィルスRNAは、いずれの時点でも尿において見出され得ない。いずれかの種類の冠状動脈カテーテル、又はStack灌流カテーテルが、本発明に使用され得る。さらに、当業者に知られている他の技法が、動脈壁への本発明の変異体eNOSのトランスファーのために使用され得る。Giordano など., (1994) Clin Res 42,123Aを参照のこと。

末梢血管疾患、すなわち脚への不十分な血液供給により特徴づけられる疾病の処理に関しては、本発明のポリヌクレオチドが大腿動脈の近位部分中に挿入されるカテーテルにより供給され、それにより、大腿動脈からの血流を受ける骨格筋の細胞中へのトランスファーをもたらす。例えば、アメリカ特許第5,792,453号を参照のこと。
本発明の剤はまた、標準の方法を用いて、脳又は脊髄、子宮又は子宮外頸（例えば、クリーム又は坐剤において）、又はいずれかの所望する位置に直接的にトランスファーされ得る。

もう１つの態様においては、治療用分子（例えば、本発明の変異体ポリペプチド又はポリヌクレオチド）は、全身的に投与されるが、しかしそれらが興味ある細胞、組織又は器官に標的化されるよう、標準の方法を用いて修飾される。例えば、ポリヌクレオチドは、組織特異的調節要素、例えばプロモーター又はエンハンサー要素の制御下に配置され得る。

１つの構造体、例えばアデノウィルス構造体内のトランスジーン、例えばeNOS遺伝子に、左心室ミオシンL鎖−２（MLC［２V］又はミオシンH鎖（MHC）の組織特異的転写制御配列を融合することにより、トランスジーン発現は、心室心筋に制限される。遺伝子発現効率及びlazを有するMLC［２V］及びMHCプロモーターにより提供される特異性の程度は、組換えアデノウィルスシステムを用いて決定されている。心臓−特異的発現は、Lee など(J. Biol. Chem. 267: 15875-15885 (1992) )により報告されている。MLC［2V］プロモーターは、250bpから構成され、そして例えばアデノウィルス−５パッケージング強制内に容易に適合する。転写の活性プロモーターであることが知られているミリオンH鎖プロモーターは、適切な他の心臓−特異的プロモーターを提供し、そして300bp以下から構成される。

骨格筋特異的プロモーターもまた使用され得る（例えば、Hauser など. (2000) Mol. Therapy 2: 16-26; Li など. (1999) Nature Biotech. 17: 241-245; 及び WO 99/02737号を参照のこと）。平滑筋細胞プロモーター、例えばSM22αプロモーター（Kemp など., (1995) Biochem J 310 (Pt3): 1037- 43）及びSMαアクチンプロモーター（Shimizu など. (1995) J Biol Chem 270 (13): 7631-43）もまた利用できる。そのような組織特異的プロモーターを使用し、そしてトランスジーンをインビボで供給することにより、例えば、心筋のみ（心臓内の内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞において同時発現を伴わない）が、本発明のeNOSポリペプチド変異体の適切な発現を提供するであろうと思われる。

心筋又は骨格筋への制限発現はまた、臨床的心筋虚血症又は末梢虚血症の処理のための遺伝子トランスファーの利用に関して好都合である。心臓又は骨格筋への発現を制限することにより、組織、例えば網膜における脈管形成の潜在的に有害な効果を回避する。さらに、心臓における細胞のうち心筋はたぶん、その細胞は急速なターンオーバーを受けないので、最長のトランスジーン発現を提供し；従って、発現は、内皮細胞に関して生じるように、細胞分裂及び死により低められない。

内皮−特異的プロモーターは、この又は他の目的のためにすでに入手できる。内皮特異的プロモーターの例は、Tie−２プロモーター（Schlaeger など. (1997) Proc Natl Acad Sci 1; 94 (7): 3058-63）、内皮プロモーター（Lee など. (1990) J. Biol. Chem. 265: 10446-10450）、及びeNOSプロモーター（Zhang など. (1995) J Biol. Chem 270 (25): 15320-6)及び(Bu and Quertermous (1997) J. Biol. Chem. 272: 32613-32622）を包含する。

本発明の１つの態様においては、eNOSポリペプチド変異体、又はその変異体は、そのような治療の必要な患者に投与され、そしてそのようなポリペプチドは、例えば患者の細胞、組織又は器官におけるeNOSの低められた又は異常発現又は活性、例えばNOの異常に低いレベルを補正する。もう1つの態様においては、本発明の方法は、本発明のeNOSポリペプチド変異体を供給することを含んで成る、欠失性内因性脈管形成に関する虚血性疾患、特に末梢血管疾患、心筋虚血症又は決定的な脚虚血症（CLI）における側副枝血管成長を刺激するための方法に関する。

好ましい態様においては、eNOSポリペプチド変異体は、細胞に侵入するその能力を増強するために修飾される。例えば、興味あるポリペプチドのN−末端でのHIV−TATポリペプチドの融合ポリペプチドYGRKKRRQRRR（また、タンパク質トランスダクションドメイン、PTDとも呼ばれる）が、E.コリにおいて製造され、そしてそのタンパク質の変性形が精製される。この融合ポリペプチド（例えば、PTD−eNOS）が、治療のために患者に導入され得る。変性された十分な長さのタンパク質を細胞中にトランスダクションするための方法は、当業界において記載されている（例えば、Nature Medicine (1998) Vol. 4 (12): 1449を参照のこと）。

もう１つの態様においては、本発明は、本発明の変異体eNOSポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを供給することを含んで成る、eNOSの異常に低い活性又は量を有する細胞又は組織により特徴でけられる状態の処理方法、すなわち本発明のポリヌクレオチドが遺伝子供給ビークルにおいて供給される遺伝子療法に関する。そのような方法は、本明細書の他の部分に記載されるいずれかの状態を処理するために使用され得る。例えば、本発明の方法は、本発明の変異体eNOSポリペプチドをコードするトランスジーンを供給することを含んで成る、患者における欠失性内因性脈管形成を有する虚血性疾患、特に末梢血管疾患及び/又は心筋虚血症における側副枝血管成長を刺激するための方法に関する。

遺伝子供給ビークルは、ウィルス又は非ウィルス起源のものであり得る（一般的には、Jolly, Cancer Gene Therapy 1: 51-64 (1994) Kimura, Human Gene Therapy 5: 845-852 (1994); Connelly, Human Gene Therapy 1 : 185-193 (1995); 及び Kaplitt, Nature Genetics 6: 148-153 (1994)を参照のこと）。本発明の治療剤のコード配列を含む構造体の供給のための遺伝子療法ビークルは、局部的に又は全身的に投与され得る。それらの構造体は、ウィルス又は非ウィルスベクターアプローチを利用することができる。そのようなコード配列の発現は、内因性哺乳類又は異種プロモーターを用いて、誘発され得る。コード配列の発現は、構成的であるか、又は調節され得る。

本発明は、興味ある選択された核酸分子を担持するか又はそれを発現するよう構成された組換レトロウィルスを使用することができる。使用され得るレトロウィルスベクターは、EP 0 415 731号; WO 90/07936号; WO 94/03622 合; WO 93/25698号; WO 93/25234号; アメリカ特許第5,219, 740号; WO 93/11230号; WO 93/10218号; Vile and Hart, Cancer Res. 53: 3860-3864 (1993); Vile and Hart, Cancer Res. 53: 962-967 (1993); Ram など., Cancer Res. 53: 83-88 (1993); Takamiya など., J. Neurosci. Res. 33: 493-503 (1992); Baba など., J. Neurosurg. 79: 729-735 (1993); アメリカ特許第4,777, 127号;イギリス特許第 2,200, 651号, EP 0 345 242 合及び WO 91/02805号に記載されるそれらのベクターを包含する。

上記レトロウィルスベクター構造体と共に使用するために適切なパッケージング細胞系は、容易に調節され得（例えば、PCT 公開WO 95/30763号及び WO 92/05266号を参照のこと）、そして組換えベクター粒子の生成のための生成体細胞系（また、ベクター細胞系とも呼ばれる）を創造するために使用され得る。本発明の好ましい態様においては、パッケージング細胞系は、ヒト（例えば、HT1080細胞）又はミンク親細胞系から製造され、それにより、ヒト血清における不活性化を生存することができる組換えレトロウィルスの生成を可能にする。

本発明の方法はまた、遺伝子供給ビークルとして機能することができるαウィルス基材のベクターを使用することができる。そのようなベクターは、広範囲の種類のαウィルス、例えばシンドビスウィルスベクター、セムリキ森林熱ウィルス（ATCC VR-67; ATCC VR-1247）、Ross Riverウィルス（ATCC VR-373; ATCC VR-1246）、及びベネズエラウマ脳炎ウィルス（ATCC VR-923 ; ATCC VR-1250 ATCC VR-1249 ; ATCC VR-532）から構成され得る。そのようなベクターシステムの代表的な例は、アメリカ特許第5,091, 309号;第 5,217, 879号; 及び第 5,185, 440号; 及び PCT公開番号WO 92/10578号; WO 94/21792号; WO 95/27069号; WO 95/27044号; 及び WO 95/07994号に記載されるそれらを包含する。

本発明の遺伝子供給ビークルはまた、パルボウィルス、例えばアデノ−関連ウィルス（AAV）ベクターも使用することができる。代表的な例は、WO 93/09239号, Samulski など., J. Vir. 63: 3822-3828 (1989); Mendelson など., Virol. 166: 154-165 (1988); 及び Flotte 等., P. N. A. S. 90: 10613-10617 (1993)により開示されるAAVベクターを包含する。

好ましい態様においては、アデノウィルスベクターが使用される。種々の修飾されたアデノウィルスベクター（例えば、Ad5又はAd2）、特に非複製ベクター及び/又はヘルパー無関係ウィルスは、当業界において良く知られている。アデノウィルスベクターの代表的な例は、Berkner, Biotechniques 6: 616-627 (Biotechniques); Rosenfeld など., Science 252: 431-434 (1991); WO 93/19191号; Kolls など., P. N. A. S. 215-219 (1994); Kass-Eisler など., P. N. A. S. 90: 11498-11502 (1993); Guzman など, Circulation 88 : 2838-2848 (1993); Guzman など, Cir. Res. 73: 1202-1207 (1993); Zabner など., Cell75 : 207-216 (1993); Li など., Hum. Gene Ther. 4: 403-409 (1993); Cailaud など., Eur. J. Neurosci. 5: 1287-1291 (1993); Vincent など., Nat. Genet. 5: 130-134 (1993); Jaffe など., Nat. Genet. 1: 372-378 (1992); 及び Levrero など., Gene 101 : 195-202 (1992)により記載されるそれらを包含する。

本発明において使用できる代表的なアデノウィルス遺伝子療法ベクターはまた、WO 94/12649号, WO 93/03769号; WO 93/19191号; WO 94/28938号; WO 95/11984号 及び WO 95/00655号に記載されるそれらを包含する。Curiel, Hum. Gene Ther. 3: 147-154 (1992)に記載されるような殺害されたアデノウィルスに結合されるDNAの投与が使用され得る。

次の他の遺伝子供給ビークル及び方法が使用され得る：殺害されたアデノウィルスのみに結合されるか又はそれに結合されないポリカチオン性縮合DNA、例えばCuriel, Hum. Gene Ther. 3: 147-154 (1992)を参照のこと：リガンド−結合されたDNA、例えばWu, J. BioL Chem. 264: 16985-16987 (1989)を参照のこと；真核細胞の供給ビークル細胞、例えば1994年５月９日に出願されたアメリカ出願番号08/240,030号, 及び アメリカ出願番号08/404,796号を参照のこと；光重合されたヒドロゲル材料の沈着；アメリカ特許第5,149,655号に記載されるような手動式遺伝子トランスファー粒子ガン：アメリカ特許第5,206,152号及びWO92/11033号に記載されるような電離線；細胞膜による核電荷中和又はその膜との融合。追加のアプローチは、Philip, Mol. Cell Biol. 14: 2411-2418 (1994) 及び Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 1581-1585 (1994)に記載されている。

裸DNAもまた使用され得る。典型的な裸DNA導入方法は、WO 90/11092 号及びアメリカ特許第5,580, 859号に記載されている。摂取効率は、生分解性ラテックスビーズを用いて改良され得る。DNA被覆されたラテックスビーズは、ビーズによるエンドサイトーシス開始の後、細胞中に効果的に輸送される。前記方法は、疎水性を高め、そしてそれにより、エンドソームの破壊及び細胞質中へのDNAの開放を促進するために、ビーズの処理により改良され得る。遺伝子供給ビークルとして作用することができるリポソームは、アメリカ特許第5,422, 120号, PCT 特許公開番号WO 95/13796号, WO 94/23697号 及び WO 91/14445号, 及び EP 0 524 968号に記載されている。

さらに、使用のために適切な非ウィルス供給は、機械的供給システム、例えばWoffendin など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (24): 11581-11585 (1994)に記載されるアプローチを包含する。さらに、そのようなもののコード配列及び発現生成物は、光重合されたヒドロゲル材料の沈着を通して供給され得る。コード配列の供給のために使用され得る遺伝子供給のための他の標準方法は、例えば、アメリカ特許第5,149,655号に記載されるような手動遺伝子トランスファー粒子ガンの使用；アメリカ特許第5,206, 152号 及び PCT 特許公開番号WO 92/11033号に記載されるような、トランスファーされた遺伝子を活性化するための電離線の使用を包含する。

処理の必要な患者にポリヌクレオチドを供給するための遺伝子療法は、インビボで（患者にポリヌクレオチを直接的に投与する）、又はエクスビボで（細胞、例えば処理される患者から採取された細胞、又は処理される患者からではない細胞に、ポリヌクレオチドを導入し、そして次に、そのトランスフェクトされた細胞を患者に導入することを包含する細胞に基づく治療）、行われ得る。

本発明の変異体eNOSポリペプチド又はポリヌクレオチドは、単独で、又は他の剤、例えば脈管形成因子、例えばFGF, HGF, VEGF 及び bFGF,特に VEGF 又は bFGFと組合して、eNOSの投与の前、その間、又はその後に投与され得る。そのような成長因子を調製し、投与し、そしてその因子の投与の効果を試験するための方法は、標準である。例えば、Papapetropoulos など, (1997) J Clin Invest 100, 3131-3139, Brock など, (1991) Am J Pathol 138, 213-221, 及び Ku など., (1993) Am J Physiol. 265, H 586-592、及びそこにおける引例を参照のこと。

そのような成長因子は、標準の方法を用いて、適切な発現ベクター（独立して、又は本発明のeNOSポリヌクレオチドを発現するベクター中に）中にクローン化され得。例えば、VEGFによる筋肉内遺伝子療法により脈管形成を誘発するための方法についてはRivard など., (1999) Am J Pathol 154, 355-363を参照のこと。
前述において、及び次の例において、すべての温度は℃で補正されないで示されており；そして特にことわらない限り、すべての部及び％は重量によってである。
次の例は、例示目的により示され、そして本発明を制限するものではない。

例１．eNOSポリペプチド変異体及び組換えプラスミド及びウィルスベクター
単一又は二重突然変異を有するeNOSポリペプチドをコードするプラスミドベクターを、インビトロ及びインビボで、細胞におけるeNOS野生型及びポリペプチド変異体のプラスミドベクター供給及び発現のために生成した。変異体を、eNOSポリペプチド配列において直接的に、KunKel特定部位の突然変異誘発（Kunkel, T. A. PNAS 1985; 82: 488-492）を用いて生成した。突然変異を、配列決定により確めた。野性型変異体構造体のcDNAを、プラスミドベクター、pShuttle-CMV中にクローン化し、CMV発現カセット内にeNOSポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを配置した。従って、それらの構造体においては、ポリヌクレオチドは、プロモーターが細胞においてコードされるeNOSポリペプチド変異体の発現を駆動するよう、CMVプロモーターに作用可能に連結されている。

単一のアミノ酸置換を有するeNOSポリペプチド変異体においては、ヒトeNOSのカルモジュリン−結合部位における位置495に対応するThr（図１を参照のこと）を、Ala、Asp又はValに置換した（それぞれ、変異体T495A、T495D、T495Vと命名された）。二重アミノ酸置換を有するeNOSポリペプチド変異体においては、位置1177に対応するSerをAspに置換し、そしてさらに、位置495に対応するThrをAla、Asp又はValに置換した（それぞれ、T495A + S1177D, T495D + S1177D, T495V + S1177Dと命名した）。それらの突然変異は、配列決定により確められ、そしてHEK293細胞におけるNO生成について試験された（例２及び図２）。

上記単一及び二重突然変異を有するeNOSポリペプチドをコードするアデノウィルスベクターを、He など (1998) PNAS 95 (5), 2509-2514により記載される方法に従って生成し、そしてインビトロ及びインビボでのeNOS野生型及びポリペプチド変異体のウィルスベクター供給のために使用した。eNOSポリペプチド変異体（上記のような）をコードするポリヌクレオチドを担持するpShuttleベクター、及びE1及びE1−欠失Ad5ゲノムを含むプラスミドを用いて、E.コリBJ5183を同時形質転換した。

アデノウィルスベクターを主鎖は、アデノウィルス５に由来した。このベクター主鎖においては、アデノウィルス配列のE1領域は、ヌクレオチド454と3333との間で欠失されており、そして部分E3欠失（ヌクレオチド30004〜30750）が645bpの外来性DNAにより置換されている。ポリヌクレオチドを、E1−欠失の部位で挿入し、その結果、CMVプロモーター（−632〜＋７での）及びSV40ポリアデニル化シグナルを、前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現のために、前記ポリヌクレオチドに作用可能に連結する。

eNOSポリペプチド変異体をコードする、その得られる組換えアデノウィルスプラスミドを選択し、そして制限エンドヌクレーアーゼ分析により確めた。その対応するウィルスを、プラスミドから切除された組換えアデノウィルスゲノムによる293細胞のトランスフェクションにより救援し、そして次に、ウィルスを、293細胞において増幅し、標準のCsClグラジエント精製により精製し、そしてHAECにおけるNO生成についての試験のために使用した（例３及び図３）。

さらに、eNOSポリペプチド変異体NOS1177D（Sessaなど., Yale Universityにより提供される）は、配列番号１のレダクターゼドメインにおけるアミノ酸残基に1177に対応する位置でAspへのアミノ酸置換を有する。細胞におけるこのeNOSポリペプチドの活性を試験するために、この変異体をコードするポリヌクレオチドを、E1位置が欠失されている位置でアデノウィルス主鎖（上記に記載されるような）中に挿入した。得られる組換えベクターAd5NOS1177Dは、eNOSポリペプチド変異体NOS1177Dをコードする。

前記組換えベクターAd5NOS1177Dを、パッケージング細胞中にトランスフェクトし、そしてその得られるウィルスをプラーク精製し、そして２回の精製にゆだねた。第２精製からのウィルスを用いて、3LのバイオリアクターにおけるHEK293細胞の大規模感染体を接種した。次に、その得られるウィルスを、２回のCsClグラジエント分離により精製し、そして10mMのトリス、pH8.0, 2mMのMgCl₂及び４％スクロースに対して透析した。精製された組換えウィルスのアリコートをまた用いて、HAECにおけるNO生成について試験した（例３，５及び７を参照のこと）。

Ad4EGFPは、対照であり、そしてレポーター遺伝子、すなわち緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするアデノウィルスベクターであり、そしてCollateral Therapeuticsにより調製され、次にHEK293細胞において増幅され、そしてFPLCにより精製された。次に、精製されたウィルスを、PBS, pH7.2及び２％スクロースに対して透析した。精製された対照ウィルスのアリコートを、続く実験において対照として使用するために−80℃で貯蔵した（例５及び７を参照のこと）。

例２．HEK293細胞におけるeNOSポリペプチド変異体の活性の検出及び測定
HEK293細胞におけるeNOSポリペプチド変異体の活性を試験し、そして測定するために、eNOSポリペプチド変異体をコードするプラスミドベクター（上記例１に記載される）を用いて、HEK293細胞におけるポリペプチド変異体を供給し、そして発現した。第１に、HEK293細胞を、10％FBS（SeraCare）、2mMの追加のL−グルタミン及び50μg/mlのゲンタマイシンを含む増殖培地（αMEM（Gibco 12561-056））のウェルに当たり2mlで、６−ウェルプレートにプレートした。細胞が約75％集密性に達する場合、それらを、T495A, Thr495D, 又は T495V eNOSポリペプチド変異体（上記例１に記載されるような）、又は野生型ヒト（WT）eNOS（配列番号１）、又は両者をコードするプラスミドシャトルベクターによりトランスフェクトした。

トランスフェクションは、WT eNOS又は変異体eNOSをコードするプラスミドシャトルベクター8μg、60μlのリポフェクタミン2000（Invitrogen）及び200μlのOptiMEM（Gibco）を混合し、そして室温での30分間インキュベーションの後、111μlの前記混合物及び420μlのOptiMEMを、HEK293細胞を含む個々のウェルに添加することによって行われた。37℃での2.5時間のインキュベーションの後、2mlの増殖培地を個々のウェルに添加した。

２日後（細胞は37℃、５％CO₂かでインキュベートされた）、細胞によるNO生成を、化学発光を用いて測定し、この後、細胞を溶解し、そして溶解物を、下記に記載のようにして、ELISAアッセイを用いて、eNOSタンパク質含有物についてアッセイした。NO生成を、異なったプラスミド間でのトランスフェクション効率の変動を補正するために、eNOSタンパク質の量に対して標準化した。

NO生成の測定：
培地を除去し、そして個々のウェルを、2mlのNO Analyzer Buffer (5mMのNa HEPES, 140mMのNaCl、5mMのKcl、1mMのMgCl₂, 10mMのグルコース、10mMのCaCl₂, 5mMのL−アルギニン、pH7.5)により２度、洗浄した。次に、緩衝液を、100U/mlのスーパーオキシドジスムターゼ及び40ng/mlのVEGFを含む、1mlのNO Analyzer Bufferにより置換した。ウェルをパラフィンにより被覆し、そして37℃での30分間のインキュベーションの後、細胞上の緩衝液0.8mlを、Science NOA280化学発光検出器中に、その製造業者の説明書に従って注入した。NO測定が完結した後、細胞上の残存する緩衝液を除去し、そして細胞を、0.6mlの溶解緩衝液（0.5％NP-40, 50mMのトリス−HCl、pH7.5、1μg/mlのペプスタチンA, 1μg/mlのロイペプチン、5μg/mlのアプロチニン、24μg/mlのPetabloc SC (Boehringer Mannheim)）に溶解し、そして−20℃で貯蔵した。

eNOSタンパク質の測定：
96−ウェルELISAプレート（Costar3590）を、50mMの炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.5）中、5μg/mlのCoating Antibody (ウサギポリクローナル抗−eNOS) 100μl（ウェル当たり）により被覆し、そして４℃で一晩インキュベートした。ポリクローナル抗体（Babco）をキーホールカサガイヘモシアニンに結合されたヒトeNOSの残基599−614に対応するペプチドにより免疫化されたウサギから集め、そしてProtein G Sepharose (Amersham)を用いて精製した。

プレートを、PBS＋0.01％ Tween29中、0.5％I−Block (Tropix)の溶液200μl（ウェル当たり）によりブロックし、そして4℃で一晩インキュベートした。プレートを、PBS＋0.5ml/lのTween20の溶液350μl（ウェル当たり）により３度、洗浄した。eNOSを含むHEK293細胞溶解物を、プレートに添加し、溶解緩衝液により、５又は10倍に希釈し、ウェル当たり60μlの最終体積にし、そして室温で1.5〜２時間インキュベーションした。次に、プレートを、PBS＋0.5ml/lのTween20の溶液350μl（ウェル当たり）により３度、洗浄した。

検出抗体、すなわち引例２に記載されるようにしてユーロプラム−ラベルされたモノクローナル抗−eNOS抗体（Trnnsduction Labs N30020）を次の通りに添加した：Wallac Assay Buffer (Wallac/PerkinElmer 1244-111)中、125ng/mlのユーロプラム−ラベルされた抗体（100μl/ウェル）。プレートを、室温で1.5時間インキュベートした。次に、プレートを、PBS＋0.5ml/lのTween20の溶液350μl（ウェル当たり）により３度、洗浄した。次にWallac Enhancement Solution (Wallac/PerkinElmer 1244-105)を、ウェル当たり100μlで添加した。プレートを、プレート封止剤により被覆し、そして4℃で一晩、貯蔵し、そして次に、10分間の混合の後、プレートを、615nmで時間−分離された蛍光モニターするWallac 1420 VICTOR2 マルチラベル カウンター (PerkinElmer Life Sciences)において読み取った。Aberle S.など., Nitric Oxide 1,226 (1997); Meurer J など., Methods in Enzymology 359, 433-444 (2002)を参照のこと。

その結果は、eNOSポリペプチド変異体がHEK293細胞においてNOの生成を刺激し、そして単一変異体、T495A及びT495V、及び二重変異体、T495A＋S1177D及びT495A＋S1177Dが、野生型eNOSに比較して、上昇したレベルのNO生成を刺激したことを示す。

例３．HAE細胞におけるeNOSポリペプチド変異体の活性の検出及び測定
ウェル当たり350,000個のヒト大動脈内皮細胞（HAEC）を、10％のFBSを含むEGM増幅培地（Cambrex）4mlを有する6ウェルプレートにプレートした。細胞を、５％CO₂下で37℃で培養した。次の日、野生型又は変異体eNOS（Thr495Ala, Thr495Asp, Thr495Val 又は Ser1177Asp）をコードするアデノウィルス（ウェル当たり２×10⁹個の合計のウェル粒子、ウェル当たり約２×10⁷個の感染性粒子）を、個々のウェルに添加した。ウェルと共に４時間インキュベートした。

培地を除去し、そして0.1％のゼラチン及び30μMのセピアプテリン（Sigma）により補充されたEBM増幅培地（Cambrex）2mlにより置換した。20時間後、細胞によるNO生成を、化学発光を用いて測定し、この後、細胞を溶解し、そして溶解物を、下記に記載のようにして、ElISAを用いて、eNOSタンパク質含有量についてアッセイした。NO生成を、異なったeNOS変異体を担持する異なったアデノウィルス構造体によるトランスフェクション効率の差異の結果として発現レベルの変動について補正するために、eNOSタンパク質の量に対して標準化した。

この結果は、eNOSポリペプチド変異体がHEK293細胞におけるNOの生成を刺激し、そして単一変異体T495A及びT495Dが、野生型eNOSに比較して、高められたレベルのNO生成を刺激したことを示す（図３）。この研究の結果は、細胞がNO開放を刺激するためにVEGFにより刺激されたことにおいて、例２に記載されるそれらの結果とは異なるが、ところが、カルシウムイオノフォアが、例２に記載される研究に使用された。さらに、アデノウィルス感染は、プラスミドDNAによるトランスフェクションよりも細胞当たりよりeNOSタンパク質（及びよりNO）を生成した。結果的に、この研究におけるeNOSの過剰発現が、eNOSポリペプチド変異体について観察されるNO活性のレベルに寄与したかも知れない。

ヒト大動脈内皮細胞は内因性野生型eNOSを含むが、しかし過剰発現された変異体eNOsから生成されたNOの量は、内因性eNOSの量の約20倍である。例２及び３に記載されるデータにおいては、NO生成はeNOSタンパク質の量に対して標準化され、その結果、eNOSポリペプチド変異体は同じ範囲で活性を有する。アデノウィルスベクター及びプラスミドベクター、及び異なった細胞を用いての、異なったeNOSポリペプチド変異体による検出されるNO生成のレベル間の差異は、細胞における他の制限因子、例えば補因子有効性のためである。

従って、HAECにおけるeNOSポリペプチド変異体のさらなる試験はさらに、異なった細胞型におけるeNOS発現活性の効果を解明することができる。

例４．異なったeNOSイソフォームの決定のためのマウス骨格筋溶解物のウェルターンブロット
eNOSの異なったイソフォームを、ウェスターンブロット分析を用いて検出し、そして当業界において知られている標準の方法により単離することができる。この例においては、マウス骨格筋溶解物が、異なったネズミeNOSイソフォームを検出するために使用された。

SDS−PAGE：
個々のサンプルのために、30μlの筋肉ホモジネートを、100mMのジチオトレイトールを含む４倍サンプル緩衝液（Invitrogenカタログ番組NP0007）10μlに添加した。100℃での７〜８分間の加熱後、個々のアンプルを、10％トリス−グリシンSDS−PAGEゲル（BMA PAGErカタログ番号59102）上に負荷した。必要とされる場合、組換えヒトeNOSを含むHEK細胞溶解物（40μlの１×サンプル衝動液中）1μlを、正の対照として添加した。予備染色されたタンパク質マーカー（10μlのInvitrogen LC5725）をまた、ゲルの１つのレーン負荷した。ゲルを、Berlex培地調製部門により提供される１×Laemmli Running Bufferにおいて、130V（一定電圧）で1.5時間、走行せしめた。

ニトロセルロース上へのブロット：
タンパク質を、Hovex/Invitrogen装置（装置はトランスファー緩衝液によりプレソーキングされた）を用いて、20Vで２時間、ニトロセルロース上にトランスファーした。（トランスファー緩衝液＝100mlの10×トランスファー緩衝液；Berlex培地調製物＋200mlのメタノール＋700mlの水により供給される）。ブロットの後、ニトロセルロースを、20mlのTBS＋5％脱脂粉乳に4℃で一晩、貯蔵した。（TBS＝0.02Mのトリス−HCl、0.12MのNaCl、pH7.5）。

抗体を用いてのタンパク質の検出（室温でのすべての段階）：
プロットを、第１抗体（TBS＋0.1％Tween20＋５％脱脂粉乳により１：2000に希釈された、抗−eNOS又は抗−bNOSマウスモノクローナルBD/トランスフェクションLabs）において、１時間15分インキュベートした。次に、ブロットを次の通りに洗浄した：TBS＋0.1％Tween20による１回の10分間及び２回の５分間の洗浄。ブロットを、第２抗体（TBS＋0.1％Tween20＋５％脱脂粉乳により１：3000に希釈された、ペルオキシダーゼ−接合されたヤギ抗−マウスIgG、Chemicon inti. AP308P 又は Roche 1814168）において１時間インキュベートした。上記に記載のような洗浄、及びTBS（Tweenを含まない）における追加の５分間の洗浄の後、ブロットを、ECL試薬（Amersham Pharmacia RPN2106）において１分間インキュベートした。ブロットを、Saran Wrapにより被覆し、そしてAmersham Pharmacia Hyperfilm ECL (RPN 1674A)に対して１〜５分間、照射し、そしてフィルムを現像した。

図１は、哺乳類NOSの種々の機能的ドメインを示す図である。機能的ドメインは、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：N−末端からC−末端の方に、ミリストイル化のためのコンセンサス部位；パルモイル化のための２つの部位；オキシダーゼドメイン；リン酸化のためのコンセンサス配列（例えば、ヒトeNOSのThr-495）を含んで成るカルモジュリン−結合部位（例えば、ヒトeNOSのアミノ酸494−517）；及びレダクターゼドメイン。NOSポリペプチドの機能的ドメインはまた、例えば自己阻害性ループ及びヘム−結合部位も含む。 図２は、配列番号１（WT）によりコードされる野生型ヒトeNOSに比較して、単一又は二重突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体によるHEK293細胞におけるNO生成のシミュレーションを示すヒストグラムである。単一突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体は、配列番号１によりコードされるヒトeNOSのThr−495に対応する位置でのAsp（T495D）、Ala（T495A）又はVal（T495V）へのアミノ酸置換を有する。二重突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体は、Ser-1177に対応する位置でのAspへの第１のアミノ酸置換、及び配列番号１によりコードされるヒトeNOSのThr-495に対応する位置でのAsp (T495D + S1177D), Ala (T495AV + S1177D), 又は Val (T495V + S1177D)への第２のアミノ酸置換を有する。 図３は、配列番号１によりコードされる野生型ヒトeNOS（野生型）に比較して、単一突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体によるヒト大動脈内皮細胞（HAEC）におけるNO生成のシミュレーションを示すヒストグラムである。単一突然変異を有するeNOSポリペプチド変異体は、配列番号１によりコードされるヒトeNOSのThr-495に対応する位置でAsp (T495D), Ala (T495A), 又は Val (T495V)へのアミノ酸置換を有する。

Claims (41)

1. 哺乳類内皮酸化窒素シンターゼ（endothelial nitric oxide synthase)（eNOS）の機能的ドメインに対応するアミノ酸配列に１又は複数の突然変異を有する単離されたeNOSポリペプチド変異体であって、少なくとも１つの前記突然変異が、
   ｉ）哺乳類細胞においてリン酸化されるカルモジュリン−結合ドメインにおけるアミノ酸残基に対応する位置で存在し；そして
   ii) Ala又はAspへのアミノ酸置換ではなく、ここで前記eNOSポリペプチド変異体が１つの突然変異を有し、そして前記１つの突然変異が前記位置で存在することを特徴とするeNOSポリペプチド変異体。
2. 前記アミノ酸残基が、ヒトeNOSのアミノ酸残基495である請求項１記載のeNOSポリペプチド変異体。
3. 前記ヒトeNOSのアミノ酸配列が配列番号１である請求項２記載のeNOSポリペプチド変異体。
4. アミノ酸残基495に対応する位置での前記突然変異が、Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Met, Ser, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg, 又は Hisへのアミノ酸置換である請求項３記載のeNOSポリペプチド変異体。
5. アミノ酸残基495に対応する位置での前記突然変異が、Val, Leu, 又はIleへのアミノ酸置換である請求項４記載のeNOSポリペプチド変異体。
6. アミノ酸残基495に対応する位置での前記突然変異が、Valへのアミノ酸置換である請求項５記載のeNOSポリペプチド変異体。
7. 前記ポリペプチド変異体が、前記カルモジュリン−結合ドメイン以外の１又は複数の機能的ドメインに少なくとも１つの突然変異をさらに含んで成る請求項３記載のeNOSポリペプチド変異体。
8. アミノ酸残基495に対応する位置での前記突然変異が、Ala, Val, Leu, 又はIleへのアミノ酸置換である請求項7記載のeNOSポリペプチド変異体。
9. アミノ酸残基495に対応する位置での前記突然変異が、Ala, 又はValへのアミノ酸置換である請求項８記載のeNOSポリペプチド変異体。
10. アミノ酸残基495に対応する位置での前記突然変異が、Valへのアミノ酸置換である請求項９記載のeNOSポリペプチド変異体。
11. 前記ポリペプチド変異体が、前記ヒトeNOSのミリストリル化部位に対応するアミノ酸配列に少なくとも１つの突然変異をさらに含んで成る請求項８記載のeNOSポリペプチド変異体。
12. 前記ポリペプチド変異体が、前記ヒトeNOSのアミノ酸残基２に対応する位置に突然変異を含んで成る請求項11記載のeNOSポリペプチド変異体。
13. アミノ酸残基２に対応する位置での前記突然変異が、Alaへのアミノ酸置換である請求項12記載のeNOSポリペプチド変異体。
14. 前記ポリペプチド変異体が、前記ヒトeNOSのレダクターゼ部位に対応するアミノ酸配列に少なくとも１つの突然変異をさらに含んで成る請求項８記載のeNOSポリペプチド変異体。
15. 前記ポリペプチド変異体が、前記ヒトのeNOSのアミノ酸残基1177に対応する位置に突然変異を含んで成る請求項14記載のeNOSポリペプチド変異体。
16. 前記ヒトeNOSのアミノ酸残基1177に対応する位置での前記突然変異が、Aspへのアミノ酸置換である請求項15記載のeNOSポリペプチド変異体。
17. 前記ポリペプチド変異体がさらに前記ヒトeNOSのアミノ酸残基２に対応する位置に突然変異を含んで成る、そして前記突然変異がAlaへのアミノ酸置換である請求項16記載のeNOSポリペプチド変異体。
18. 前記ポリペプチド変異体のリン酸化が、対照のeNOSポリペプチドに比較して、高められるか又は低められる請求項１記載のeNOSポリペプチド変異体。
19. 前記ポリペプチドが、対照eNOSポリペプチドに比較して、カルモジュリンに対する高められた結合親和性を有する請求項１記載のeNOSポリペプチド変異体。
20. Ca²⁺依存性が、対照eNOSポリペプチドに比較して、前記ポリペプチドのCa²⁺−カルモジュリン介在性刺激において低められる請求項１記載のeNOSポリペプチド変異体。
21. 前記ポリペプチド変異体が、対照eNOSポリペプチドに比較して、高められたeNOS活性を有する請求項１記載のeNOSポリペプチド変異体。
22. 前記活性が、NOの発生である請求項21記載のeNOSポリペプチド変異体。
23. 前記活性が、レダクターゼ活性である請求項21記載のeNOSポリペプチド変異体。
24. 前記対照ポリペプチドのアミノ酸配列が、ヒトeNOSのアミノ酸配列であるか、又はヒトeNOSのアミノ酸配列から誘導される請求項18, 19, 20, 21, 22又は23記載のeNOSポリペプチド変異体。
25. 前記対照ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１であるか、又は配列番号１から誘導される請求項24記載のeNOSポリペプチド変異体。
26. 単離されたeNOSポリペプチド変異体であって、前記ポリペプチド変異体のアミノ酸配列が、請求項１記載のeNOSポリペプチド変異体のアミノ酸配列に対して実質的に相同であるeNOSポリペプチド変異体。
27. 単離されたeNOSポリペプチド変異体であって、前記ポリペプチド変異体のアミノ酸配列が、請求項26記載のポリペプチド変異体のアミノ酸配列に対して95〜99％の配列同一性を有するeNOSポリペプチド変異体。
28. 請求項１記載のポリペプチド変異体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
29. 少なくとも１つの調節配列に対して作用可能に結合される請求項29記載のポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクター。
30. 請求項１記載のポリペプチド変異体を含んで成る医薬組成物。
31. 請求項29記載のポリヌクレオチドを含んで成る医薬組成物。
32. 請求項１記載のポリペプチド変異体の結合パートナー。
33. 前記結合パートナーが、ポリペプチドである請求項33記載の結合パートナー。
34. 前記結合パートナーが、抗体又は抗原−特異的抗体フラグメントである請求項34記載の結合パートナー。
35. 請求項１記載のポリペプチド変異体を、細胞に投与することを含んで成る、細胞におけるeNOS活性を調節するための方法。
36. ポリペプチド変異体が細胞において発現されるよう、請求項29記載のポリペプチドを、前記細胞に投与することを含んで成る、細胞におけるeNOS活性を調節するための方法。
37. 異常eNOS活性に関連する状態の診断方法であって、
    ｉ）請求項29記載のポリヌクレオチドと患者の細胞とを接触せしめ；そして
    ii) 前記医学的状態の表示であるeNOS活性のレベルを検出することを含んで成る方法。
38. 異常eNOS活性に関連する状態の処理のための予防又は治療方法であって、有効量の請求項１記載のポリペプチドを、処理する必要な患者に投与することを含んで成る方法。
39. 異常eNOS活性に関連する状態の処理のための予防又は治療方法であって、有効量の請求項１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、前記ポリペプチド変異体が患者において発現されるよう、処理の必要な患者に対応することを含んで成る方法。
40. 前記ポリペプチド変異体の投与の前、その間又は後、１又は複数の脈管形成因子を前記患者に投与することをさらに含んで成る請求項39記載の方法。
41. 前記ポリヌクレオチドの投与の前、その間又は後、１又は複数の脈管形成因子を前記患者に投与することをさらに含んで成る請求項40記載の方法。

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