JP4623719B2

JP4623719B2 - 血管形成依存性症状を治療または予防する方法

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Publication number: JP4623719B2
Application number: JP2004556884A
Authority: JP
Inventors: 和也平岡; 誠司山本; 安史金田; 竜一森下; 俊男荻原
Original assignee: Anges MG Inc
Current assignee: Anges Inc
Priority date: 2002-12-02
Filing date: 2003-12-02
Publication date: 2011-02-02
Anticipated expiration: 2023-12-02
Also published as: EP1567197A2; EP1567197B1; DE60333476D1; WO2004050126A2; CN1717254A; AU2003302590A1; AU2003302590B2; ATE474604T1; JP2006511515A; US7259149B2; CA2507534A1; US20060135452A1; WO2004050126A3

Description

技術分野
本発明は、例えば筋肉内の圧力増大または高圧酸素などの特定の条件下で、裸プラスミドDNAの筋肉内注射剤を投与することにより、血管形成依存性症状を治療および／または予防する方法に関する。

背景技術
分子生物学の近年の進展により、心血管疾患に対する新規な治療戦略として、遺伝子療法が開発された。標的となる疾患は、単一遺伝子欠損疾患から、末梢動脈疾患のような、成人性のより複雑な疾患に及ぶ。例えば、重症下肢虚血は、1年間に、100万人あたり500例〜1000例が発症していると推定される（“Second European Consensus Document on Chronic Critical Leg Ischemia.”、Circulation 84(別冊4): IV 1-26（1991))。重症下肢虚血の患者においては、罹患率、死亡率および機能的関係に関連するにもかかわらず、不能症状（disabling sympton）に対する解決策として、切断が推奨されることが多い（M.R. Tyrrellら、Br. J. Surg. 80: 177-180（1993); M. Enerothら、Int. Orthop. 16: 383-387（1992))。重症下肢虚血に対する最適な医学的療法は存在しない（Circulation 84（別冊4）:IV 1-26（1991))。

近年、血管内皮増殖因子（VEGF）の遺伝子導入による治療的血管形成の効力が、重症下肢虚血（I. Baumgartnerら、Circulation 97: 1114-1123（1998); J.M. Isnerら、J. Vasc. Surg. 28: 964-973（1998); I. Baumgartnerら、Ann. Intern. Med. 132: 880-884（2000)）および心筋虚血（D.W. Losordoら、Circulation 98: 2800-2804（1998); P.R. Valeら、Circulation 102: 965-974（2000); T.K. Rosengartら、Circulation 100: 468-474（1999); T.K. Rosengartら、Ann. Surg. 230: 466-470（1999)）のヒト患者で有効であることが報告された。VEGFに加えて、線維芽細胞増殖因子（FGF)、肝細胞増殖因子（HGF）および低酸素症誘導因子（HIF）を含む他の血管形成増殖因子の遺伝子導入も、側枝形成（collateral formation）を刺激することが報告されている（Y. Taniyamaら、Gene Ther. 8: 181-189（2000); H. Tabataら、Cardiovasc. Res. 35: 470-479（1997); H. Uenoら、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17: 2453-2460（1997); K.A. Vincentら、Circulation 102: 2255-2261（2000); F.J. Giordanoら、Nat. Med. 2: 534-539（1996); M. Aokiら、Gene Ther. 7: 417-427（2000); H. Uedaら、Ann. Thorac. Surg. 67: 1726-1731（1999); E.R. Schwarzら、J. Am. Coll. Cardiol. 35: 1323-1330（2000))。

末梢動脈疾患を処置するために血管形成増殖因子を使用する遺伝子療法の実行可能性は、組換えタンパク質療法よりも優れていると考えられる。例えば、遺伝子療法によって、一定期間、最適な高さの濃度を局所的に維持できる可能性がある。したがって、治療的血管形成の場合、副作用を回避するためには、単回または複数回のボーラス（bolus）用量の組換えタンパク質を投与するよりも、数日間またはそれ以上の期間、動脈中で活発に発現される導入遺伝子を介して低用量のタンパク質を送達することが望ましい可能性がある。興味深いことに、血管形成増殖因子を使用して末梢動脈疾患を治療する臨床試験で最も成功したものは、裸プラスミドDNAの筋肉内トランスフェクションを含む（I. Baumgartnerら、Circulation 97: 1114-1123（1998); J.M. Isnerら、J. Vasc. Surg. 28: 964-973（1998); I. Baumgartnerら、Ann. Intern. Med. 132: 880-884（2000); D.W. Losordoら、Circulation 98: 2800-2804（1998); P.R. Valeら、Circulation 102: 965-974（2000))。しかし、骨格筋内への「裸」プラスミドDNAの直接注射によるこのようなインビボ遺伝子導入は、非効率的であることが知られている。

それゆえ、当技術分野において、遺伝子導入のためのより効率的な方法が、治療用途のために必要とされる。したがって、多くの研究者が、アデノウイルス遺伝子導入法などの代替的な方法に注目している（H. Uenoら、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17: 2453-2460（1997); F.J. Giordanoら、Nat. Med. 2: 534-539（1996); D.F. Lazarousら、Cardiovasc. Res. 44: 294-302（1999); L.Y. Leeら、Ann. Thorac. Surg. 69: 14-23（2000); L.H. Gowdakら、Circulation 102: 565-571（2000); O. Varenneら、Hum. Gene Ther. 10:1105-1115（1999); E. Barrら、Gene Ther. 1: 51-58（1994))。アデノウイルスベクターは効率的であるが（H. Uenoら、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17: 2453-2460（1997); F.J. Giordanoら、Nat. Med. 2: 534-539（1996); D.F. Lazarousら、Cardiovasc. Res. 44: 294-302（1999); L.Y. Leeら、Ann. Thorac. Surg. 69: 14-23（2000); L.H. Gowdakら、Circulation 102: 565-571（2000); O. Varenneら、Hum. Gene Ther. 10:1105-1115（1999); E. Barrら、Gene Ther. 1: 51-58（1994))、これらは、宿主中で強い免疫原性を誘導するなどの、いくつかの理論的な欠点を有する（V.J. Dzauら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11421-11425（1996))。効率に加え、安全性もまた、遺伝子導入法には重要な問題である。最近、アデノウイルスの注入が、有害な副作用を引き起こすことが報告された（E. Marshall、Science 286: 2244-2245（1999))。したがって、安全性の観点から、末梢動脈疾患の理想的な治療を行なうために非ウイルス媒介性プラスミドDNAをより効率的にすることが、より望ましいと考えられる。プラスミドDNAに基づく遺伝子導入におけるこのような新機軸は、重篤な副作用を伴うことなく、トランスフェクション効率の高い方法を提供するであろう。

裸プラスミドDNAのトランスフェクション効率を高めるために、本発明者らは、以前、超音波およびエコーコントラスト微小気泡（echo contrast microbabble）（Optison（登録商標）（FS069）; Molecular Biosystems）の使用を試験した。その結果として、本発明者らは、エコーコントラスト微小気泡を使用して、超音波を介したプラスミドDNAトランスフェクションにより、高いトランスフェクション効率を達成できることを発見した（Y. Taniyamaら、Circulation 105: 1233-1239（2002); Y. Taniyamaら、Gene Therapy 9: 372-380（2002))。微小気泡エコーコントラスト剤の存在下で超音波曝露を使用して、裸DNAトランスフェクション後に導入遺伝子発現が約300倍増加したことが、インビトロの実験で報告された（A. Lawrieら、Gene Ther.9: 372-380（2002))。さらに、本発明者らは、ラット骨格筋およびラット頸動脈への、Optison（登録商標）を用いた、超音波を介したプラスミドDNAトランスフェクションの有用性を確認した（Y. Taniyamaら、Circulation 105: 1233-1239（2002); Y. Taniyamaら、Gene Therapy 9: 372-380（2002))。気泡の広がりによって細胞膜に一過的に穴が生じるため、この方法により、トランスフェクション効率が高くなった。

発明の開示
裸プラスミドDNAの筋肉内注射を介した、血管形成増殖因子のトランスフェクションによる血管形成の刺激の臨床試験は成功したが、トランスフェクション効率および安全性の低さを含む、ヒト遺伝子療法における問題が依然として未解決である。この観点から、裸プラスミドDNAのより高いトランスフェクション効率を達成する方法が、当技術分野において望ましい。

本発明の目的は、裸プラスミドDNAを高いトランスフェクション効率で投与することにより、血管形成依存性症状を治療および／または予防する方法を提供することである。上記のように、本発明者らは、以前に、エコーコントラスト微小気泡を使用して、超音波を介したプラスミドDNAトランスフェクションの使用を調べた。この方法により達成される効率的なトランスフェクションに基づいて、発明者らは、細胞膜を高浸透圧により不安定化することにより、裸プラスミドDNA法のトランスフェクション効率が高まると考えた。したがって、本発明者らは、インビボで、裸プラスミドDNAのトランスフェクション効率に対する、様々な薬剤および注射部位への圧力の効果について調べた。

まず、本発明者らは、骨格筋細胞への裸プラスミドDNAトランスフェクションの効率に対する、注射量の効果を調べた。様々な量の溶媒に溶解したルシフェラーゼプラスミドDNAを、ラット後肢への筋肉内注射に使用した。本発明のデータによると、裸プラスミドDNAのトランスフェクション効率は、プラスミドDNA量および骨格筋に注射された溶液の注射量により決定されると考えられ、この現象は、細胞表面上への圧力増大により引き起こされるようであった。しかし、（例えば、後肢に血圧計のマンシェットを使用して）生体外から注射部位へ圧力を加えても、トランスフェクション効率は増加しなかった。これに対し、プラスミドDNA注射の30分後にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を注射することにより、プラスミドDNAのトランスフェクション効率が増加したが、5時間後にPBS溶液を追加注射しても増加しなかった。これらのデータにより、高い筋肉内圧力は、トランスフェクション効率を増加させるのに重要であることが明らかに示される。

さらに、本発明者らは、高圧酸素（HBO）療法と組み合わせたプラスミドDNAの筋肉内注射により、裸プラスミドDNAのトランスフェクション効率が増強されることを発見した。さらに、プラスミドDNAを溶解させるための溶液の種類の影響も決定された。高いトランスフェクション効率が、生理食塩水およびPBSにより達成されたが、水では達成されなかった。興味深いことに、グルコース溶液よりもショ糖溶液の方が、高いルシフェラーゼ活性が得られた。

総合して、プラスミドDNAの筋肉内注射のトランスフェクション効率が、注射量および浸透圧の増大により高められた。血管形成増殖因子の裸プラスミドDNAを使用した遺伝子療法とHBO療法の併用により、ウイルスベクターを使用しない動脈疾患の安全な臨床的遺伝子療法が提供され得る。

したがって、本発明は、投与部位における高い圧力の下で、またはHBO療法と組み合わせて、裸プラスミドDNAを投与することにより、血管形成依存性症状を治療および／または予防する方法を提供する。より具体的には、本発明は以下を提供する：
（１）筋肉内の圧力が増大する条件下で、適切な裸プラスミドDNAを筋肉内に注射する段階を含む、血管形成依存性症状を治療または予防する方法；
（２）注射量を多くすることにより、筋肉内の圧力が増大する、(1)の方法；
（３）プラスミドDNA投与後にPBSを注射することにより、筋肉内の圧力が増大する、(1)の方法；
（４）裸プラスミドDNAが、生理食塩水、PBS、ショ糖溶液、またはグルコース溶液で希釈される、(1)の方法；
（５）裸プラスミドDNAが血管形成増殖因子をコードする、(1)の方法；
（６）血管形成増殖因子が、肝細胞増殖因子（HGF）；血管内皮増殖因子（VEGF）；線維芽細胞増殖因子（FGF）；ならびに、マクロファージ由来一酸化窒素合成酵素、誘導性一酸化窒素合成酵素、および脳由来一酸化窒素合成酵素を含む、一酸化窒素合成酵素からなる群より選択される、(5)の方法；
（７）血管形成依存性症状が、褥瘡および皮膚潰瘍を含む創傷；炎症性疾患；重症下肢虚血；心筋梗塞、狭心症、および心不全などの虚血性心疾患；脳梗塞；糖尿病性神経障害；ならびに脊柱管狭窄症からなる群より選択される、(1)の方法；
（８）高圧酸素（HBO）療法と組み合わせた、裸プラスミドDNAの筋肉内注射により、血管形成依存性症状を治療または予防する方法；
（９）HBO療法が、100%酸素の曝露により実施される、(8)の方法；
（１０）治療対象の被験者を、プラスミドDNA投与直後にHBO療法に供する、(8)の方法；
（１１）裸プラスミドDNAが、生理食塩水、PBS、ショ糖溶液、またはグルコース溶液で希釈されている、(8)の方法；
（１２）裸プラスミドDNAが血管形成増殖因子をコードする、(8)の方法；
（１３）血管形成増殖因子が、肝細胞増殖因子（HGF）；血管内皮増殖因子（VEGF）；線維芽細胞増殖因子（FGF）；ならびに、マクロファージ由来一酸化窒素合成酵素、誘導性一酸化窒素合成酵素、および脳由来一酸化窒素合成酵素を含む、一酸化窒素合成酵素からなる群より選択される、(12)の方法；ならびに
（１４）血管形成依存性症状が、褥瘡および皮膚潰瘍を含む創傷；炎症性疾患；重症下肢虚血；心筋梗塞、狭心症、および心不全などの虚血性心疾患；脳梗塞；糖尿病性神経障害；ならびに脊柱管狭窄症からなる群より選択される、(8)の方法。

発明を実施する最良の形態
本明細書で使用される「ある」、「一つの」、および「その」という用語は、特記しない限り、「少なくとも1つの」を意味する。

骨格筋へのプラスミドDNAの導入に最適な条件を見出すために、本発明者らは、プラスミドDNA遺伝子導入法を改変した。まず、本発明者らは、プラスミドDNA溶液の注射量が、トランスフェクション効率に与える影響を調べた。次に、プラスミドDNAを溶解させるための溶液の種類の影響を調べた。さらに、プラスミドDNA導入法と高圧酸素（HBO）療法の併用を調べた。

結果として、裸プラスミドDNAのトランスフェクション効率は、筋肉内の高い圧力により増大すると考えられた。したがって本発明は、筋肉内の圧力が増大するような条件下で、適切な裸プラスミドDNAを筋肉内注射することにより、血管形成依存性症状を治療または予防する方法を提供する。本発明は、被験者における血管形成依存性症状を軽減するための方法、症状の進行を阻害する方法、または症状を抑制する方法を提供する。

本発明によると、「血管形成依存性症状」という用語は、血管形成により予防、軽減、改善または治療されうる疾患の症状を意味する。本発明により治療または予防されうる症状には、褥瘡および皮膚潰瘍を含む創傷；炎症性疾患；重症下肢虚血；心筋梗塞、狭心症、および心不全などの、虚血性心疾患；脳梗塞；糖尿病性神経障害；ならびに脊柱管狭窄症が含まれる。

宿主への導入時に発現可能な様式で血管形成増殖因子をコードする遺伝子を含むプラスミドDNAである限り、いかなるプラスミドDNAも本発明に使用され得る。血管形成依存性症状を軽減、改善または抑制するか、または、症状の進行を予防する能力を有する限り、本発明の血管形成増殖因子をコードする遺伝子は何ら制限されることなく、タンパク質、ポリペプチド、およびその一部をコードするものを含む。本発明の好ましい遺伝子の例には、肝細胞増殖因子（HGF）；血管内皮増殖因子（VEGF）；酸性FGF、塩基性FGFおよびFGF-4などの線維芽細胞増殖因子（FGF）；一酸化窒素合成酵素（NOS）；VEGF-2；形質転換増殖因子（TGF）-α；TGF-β；血小板由来（PD）内皮細胞増殖因子（ECGF）；血小板由来増殖因子（PDGF）；腫瘍壊死因子（TNF）-α；インスリン様増殖因子ならびにアンジオポエチン-1が非制限的に含まれる。

HGFをコードする遺伝子の塩基配列は、文献に記載されている（Nature 342: 440（1989); 日本国特許第2577091号; Biochem. Biophys. Res. Commun. 163: 967（1989); Biochem. Biophys. Res. Commun. 172: 321（1990))。これらの開示された配列のいずれも、本発明において血管形成増殖因子をコードする遺伝子として使用されうる。

VEGF遺伝子については、4つのサブタイプが報告されている（VEGF121、VEGF165、VEGF189、およびVEGF206；Science 219: 983（1983); J. Clin. Invest. 84: 1470（1989); Biochem. Biophys. Res. Commun. 161: 851（1989))。これらのいずれか1つを、本発明において、血管形成増殖因子をコードする遺伝子として使用してもよい。しかし、4つの中では、VEGF165が、最も強力な生物活性を有することが知られており、したがって、本発明においてより好ましい。

NOSのいくつかのアイソフォームが単離されているが、これには、脳から単離されたNOS（nNOS; BredtおよびSnyder、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 682-685（1990)）; 内皮細胞から単離されたNOS（eNOS; Fostermannら、Biochem. Pharmacol. 42: 1849-1857（1991)）；マクロファージから単離されたNOS（iNOS; Hibbsら、Science 235:473（1987); Stuehrら、Proc. Natl. Aca. Sci. USA 88: 7773-7777（1991)）；肝細胞から単離されたNOS（Knowlesら、Biochem. J. 279: 833-836（1990)）；血管細胞から単離されたNOS（Woodら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 170: 80-88（1991); および好中球から単離されたNOS（Yuiら、J. Biol. Chem. 266: 12544-12547（1991); Yuiら、J. Biol. Chem. 266: 3369-3371（1991)）が含まれる。さらに、NOSは他の組織からも単離されている（例えば、Hevelら、J. Biol. Chem. 266: 22789-22791（1991); Ohshimaら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 183: 238-244（1992); Hikiら、J. Biochem. 111: 556-558（1992); Evansら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5361-5365（1992); Shermanら、Biochemistry 32: 11600-11605（1993)を参照されたい)。したがって、様々な臓器および組織に由来する上述のNOSをコードする遺伝子を、本発明の血管形成増殖因子をコードする遺伝子として使用できる。例えば、ヒトeNOSの塩基配列およびアミノ酸配列は、GenBankデータベースから公共的に入手可能である（それぞれGenBankアクセッション番号第AF400594号および第P29474号；また、Janssensら、J. Biol. Chem. 267(21): 14511-14522（1992); Marsdenら、FEBS Lett. 307(3): 287-293（1992)も参照されたい)。さらに、eNOSにはアイソフォームが存在することが知られており（Fischmanら、Nat. Struct. Biol. 6（3): 233-242（1999))、このようなアイソフォームもまた本発明のNOSに含まれる。本発明で使用できるNOSのさらなる配列情報には、哺乳動物カルモジュリン依存性NOS（nNOS；米国特許第5,268,465号)、ヒト誘導性NOS（iNOS；米国特許第5,468,630号)、およびウシ内皮NOS（eNOS；米国特許第5,498,539号）のものが含まれる。

当業者は、上述の遺伝子の公共的に入手可能な配列情報から構築されたプライマーを使用して（例えば、Molecular Cloning 2nd ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989); PCR: a Practical Approach、IRL Press、Oxford（1991)を参照されたい)、任意の哺乳動物種のcDNAライブラリーおよびゲノムライブラリーを含む、血管形成増殖因子をコードする遺伝子を含む供給源から、例えば逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により、血管形成増殖因子をコードするcDNAを得ることができる。しかし、免疫原性の点からは、その遺伝子で治療されべき動物と同じ供給源由来の遺伝子を使用することが好ましい。

本発明に使用される血管形成増殖因子をコードする遺伝子は、上述のしたものに限定されない。むしろ、血管形成活性を有するタンパク質をコードし、かつ、（1）ストリンジェントな条件下で、上述のcDNAの1つとハイブリダイズする塩基配列；および（2）1つまたは複数のアミノ酸が、置換、欠失、付加、および／または挿入された、上述のcDNAによりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を含む限り、本発明に適した遺伝子である。変異血管形成増殖因子をコードするこのようなヌクレオチドは、部位特異的突然変異誘発（Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、Section 8.1-8.5（1987)）；PCRなどの遺伝子増幅方法（Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、Section 6.1-6.4（1987)）；および一般的なハイブリダイゼーション法（J. Sambrookら、Molecular Cloning 2nd ed.、Cold Spring Harbor Press、Section 9.47-9.58（1989); Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、Section 6.3-6.4（1987)）により、容易に得ることができる。または、遺伝子またはその断片を、その配列情報に基づいて、化学的に構築してもよい。

ハイブリダイゼーションのためのストリンジェントな条件には、通常、「1×SSC、37℃」の洗浄条件が含まれる。よりストリンジェントな条件は、「0.5×SSC、0.1% SDS、42℃」の洗浄条件であり、さらによりストリンジェントな条件は、「0.1×SSC、0.1% SDS、65℃」である。ストリンジェントな条件になればなるほど、得られるポリヌクレオチドのプローブ配列に対する相同性が高くなる。しかし、上述のハイブリダイゼーション条件は単なる例示であり、当業者は、プローブの塩基配列、濃度、および長さ；反応時間；反応温度；試薬の濃度などを考慮して、適切なハイブリダイゼーション条件を選択することができることが理解されよう。

上述のハイブリダイゼーション技術により単離された本発明の血管形成増殖因子をコードする遺伝子は通常、プローブとして使用した天然の血管形成増殖因子に対して、アミノ酸配列レベルで高い相同性を有するポリペプチドをコードする。本明細書における「高い相同性」とは、50%を上回る、好ましくは65%、より好ましくは75%、さらにより好ましくは80%、はるかにより好ましくは90%、最も好ましくは95%またはそれ以上の同一性を意味する。ポリヌクレオチド間の配列相同性を決定する方法は当技術分野で公知であり、以下のBLAST探索アルゴリズムに従って決定され得る（KarlinおよびAltschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877（1993))。

タンパク質の変異は天然でも同様に起こり得る。上述のように、それぞれの血管形成増殖因子の様々なアイソフォームが当技術分野で公知である。このようなアイソフォームもまた、天然タンパク質の血管形成活性を保持している限り、本発明で使用される、血管形成増殖因子をコードする遺伝子に含まれる。タンパク質の配列において1つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、付加および／または挿入により修飾されたタンパク質が、元の生物活性を保持できることは公知である（G. Dalbadie-McFarlandら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6409-6413（1982))。

血管形成増殖因子の血管形成活性を保存するためには、アミノ酸残基を、アミノ酸側鎖の特性の保存を可能にするものに変異させることが好ましい。アミノ酸の特性は一般に、以下に分類される：（1）疎水性アミノ酸（アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）；（2）親水性アミノ酸（アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリン、およびトレオニン）；（3）脂肪族側鎖を有するアミノ酸（アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリン）；（4）水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（セリン、トレオニン、およびチロシン）；（5）硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（システインおよびメチオニン）；（6）カルボン酸含有側鎖およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびグルタミン）；（7）塩基含有側鎖を有するアミノ酸（アルギニン、ヒスチジン、およびリジン）；ならびに（8）芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン)。

1つまたは複数のアミノ酸残基が付加されたタンパク質またはポリペプチドの例には、融合タンパク質が非限定的に含まれる。例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製するために、血管形成増殖因子をコードする第一のDNAと、別のタンパク質またはポリペプチドをコードする第二のDNAを、インフレームで連結する。血管形成増殖因子に融合できるタンパク質またはポリペプチドは、任意の特定のタンパク質またはポリペプチドに限定されるものではない。

変異タンパク質の活性は、周知のアッセイを使用して、慣用的な方法に従って確認できる。例えば、血管形成増殖因子の変異タンパク質およびポリペプチドの血管形成活性は、以下の実施例に記載された方法に従って確認でき、ここでは、ラットの虚血後肢モデルにおいてタンパク質が治療的血管形成を誘導する効果が検出される。または、国際公開公報第97/07824号に記載の方法に従って、変異NOSの活性を測定でき、ここでは、タンパク質の、血管内皮腫細胞の増殖を誘導する活性が検出される。

本発明によると、第一の血管形成増殖因子をコードする遺伝子を、単独で、または、他の血管形成増殖因子をコードする1つもしくは複数の遺伝子と組み合わせて使用できる。さらに、低酸素症誘導因子（HIF）-1αおよびEts-1などの、血管形成増殖因子の発現を調節する転写因子をコードする遺伝子も、本発明における、血管形成増殖因子をコードする遺伝子と組み合わせて使用できる。

血管形成増殖因子をコードする遺伝子、および、必要に応じて本発明における血管形成増殖因子をコードする遺伝子と組み合わせて使用されるその他の遺伝子を、遺伝子のインビボ発現を確実にし、かつ「裸」DNA法により患者の病変またはその周辺筋肉部位に投与され得るベクターに挿入することが好ましい。遺伝子を発現するために、目的の遺伝子のインビボ発現が可能である限り、あらゆる発現ベクターを使用できる。例えば、このような発現ベクターには、pCAGGS（Gene 108: 193-200(1991))、pBK-CMV（Stratagene)、pcDNA3.1（Invitrogen)、pZeoSV（Invitrogen）などが含まれるがこれに限定されない。発現ベクターはさらに、血管形成増殖因子遺伝子の発現に必要な、プロモーター、エンハンサー、および／またはターミネーターなどの調節遺伝子を含み得る。

血管形成増殖因子遺伝子を含む発現ベクターは、裸DNA法による遺伝子療法に適した医薬組成物として製剤化され得る。例えば、注射による投与のために、遺伝子を含むベクターを、適切な溶液に溶解する。その後、ベクターを含む溶液を、特定の必要に応じて、ろ過により滅菌し、無菌アンプルなどに充填できる。必要に応じて、注射溶液に、慣用的に使用される担体を添加してもよい。

血管形成増殖因子をコードする遺伝子を溶解するのに好ましい溶液には、緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（PBS)、生理食塩水、ショ糖溶液、グルコース溶液、滅菌水などが含まれる。本明細書で報告された実験結果により、生理食塩水およびPBSによって高いトランスフェクション効率が達成され得ることが示唆および実証される。さらに、ショ糖溶液と比べて、グルコース溶液を使用する場合に、高いトランスフェクション効率が得られた。したがって、本発明に関して特に好ましい溶液には、生理食塩水、PBS、およびグルコース溶液が含まれる。

本発明によると、筋肉内の圧力が増大する条件下で、適切な裸プラスミドDNAを筋肉中に注射することにより、被験者において血管形成依存性症状を治療または予防できる。「筋肉内の圧力」の増大とは、筋肉細胞表面上の圧力の増大を意味する。このような圧力の増大は、大量の溶液を注射することにより、すなわち、大量の溶液に溶解した、または溶液の追加注射と一緒に、裸プラスミドDNAを注射することにより達成できる。または、トランスフェクション効率の増大をもたらす限り、裸プラスミドDNAの注射から十分な期間を置いた後に、裸プラスミドDNAを含まない追加の溶液を注射することができる。

さらに、本発明によると、被験者に導入された裸プラスミドDNAのトランスフェクション効率を、裸プラスミドDNAの投与と組み合わせて高圧酸素（HBO）療法を実施することによっても高めることができる。HBO療法は、被験者を圧縮酸素（1気圧を上回る、一般的には3気圧〜数気圧）に曝露する段階を含む。本発明によると、被験者を100%酸素に曝露することにより、HBO療法を実施することが好ましい。

HBO療法については、純粋な酸素と共に圧縮されたモノプレースチャンバー（monoplace chamber）（ヒト一人に適合された）を使用できる。または、被験者に、圧縮空気を含むマルチプレースチャンバー（multiplace chamber）においてマスク、ヘッドテント（headtent）（酸素テント）または気管内チューブを通して酸素を吸引させてもよい。HBO療法は、血漿、臓器、および組織中の酸素レベルを増大させることが知られている。

HBO療法は、裸プラスミドDNAの筋肉内注射と共に実施され得るが、注射直後に本療法を開始することが好ましい。

血管形成増殖因子をコードする遺伝子の用量は、患者の体重、年齢、性別および症状、投与遺伝子の種類、投与法などに応じて変化するが、当業者は、慣用的な計算および周知のアルゴリズムを使用して、血管形成依存性症状の治療的または予防的処置のための遺伝子の適切な用量を容易に選択できる。一般に、本遺伝子は、成人に（体重60kgとして計算）数日間または数ヶ月に1回、0.0001mg〜100mg、好ましくは0.001mg〜10mgの範囲で投与される。他の動物への投与については、体重60kgあたりの量に換算した遺伝子の量で投与できる。

以下の実施例は、本発明を例証するため、ならびに、本発明のの作製および使用において当業者を支援するために提示されるものである。本実施例は、如何なる形でも、本発明の範囲を別段に限定することを意図するものではない。

特記しない限り、本明細書において使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたのと類似するまたは同等の方法および物質を、本発明の実践または試験に使用できるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書において引用された全ての特許、特許出願、および公報は、参照として本明細書に組み入れられる。

[実施例1] 一般的方法
（1）直接的な筋肉内注射アプローチを使用したインビボ遺伝子導入
Sprague-Dawleyラット（400g〜500g：Charles River Breeding Laboratories）を、ペントバルビタールナトリウム（0.1ml/100mg）の腹腔内注射で麻酔した。裸ルシフェラーゼ遺伝子（500μl/動物）または対照（500μg/動物）ベクターを、27G（テルモ、厚木、日本）の針を用いて、ラットの右後肢の頸骨前筋肉の中心に直接、注意深く注射した（Y. Taniyamaら、Gene Ther. 8: 181-189（2000); M. Aokiら、Gene Ther. 7: 417-427（2000); Y. Taniyamaら、Circulation 104: 2344-2350（2001); R. Morishitaら、Circulation 105: 1491-1496（2002))。SV40プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼ遺伝子発現ベクター（Promega Corporation、Madison、WI）を、裸ルシフェラーゼ遺伝子ベクターとして使用した。
1）筋肉内の圧力を高めるために、トランスフェクション直後に、裸ルシフェラーゼプラスミドDNAを注射した筋肉に、血圧計のマンシェットを巻いた。
2）注射部位に圧力を加えるために、プラスミドDNAを含まないPBS溶液の追加筋肉内注射を、トランスフェクションの0.5時間後または5時間後に、裸ルシフェラーゼプラスミドDNAを注射した筋肉に投与した。

（2）ルシフェラーゼ活性の解析
ルシフェラーゼアッセイシステム（PicaGene（商標）；東洋インキ、東京、日本）を使用して、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。裸プラスミドを後肢に直接注射することによりルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクションした2日後に、ラットを屠殺した。組織試料（注射部位の周囲、200 mg）を液体窒素中で急速に凍結し、溶解緩衝液中でホモジナイズした。組織溶解物を、短時間遠心分離して（3000 rpm、10分間)、上清20μlを、ルシフェラーゼアッセイ試薬100μlと混合した。発光反応の測定は、試料添加の5秒後に開始した。計測を10秒間続け、10秒目の計数を、ルシフェラーゼ活性の指数として使用した（M. Aokiら、J. Mol. Cell. Cardiol. 29: 949-959（1997))。

（3）HBO療法（O ₂ 曝露）
ラットを、ケタミン（100 mg/kg）およびキシラジン（5 mg/kg）で麻酔した。プラスミドDNAの筋肉内注射を、上記のように実施した。曝露した朝に、動物を高圧チャンバーに入れた。チャンバーに100% O₂を1.5分間流し、O₂レベルを>99%まで上昇させた。動物を、トランスフェクション直後、2気圧の100% O₂に1時間曝露させた。

（4）統計学的解析
すべての値を、平均±SEMとして表現した。分散分析およびその後のDuncan試験を含むを使用して、複数回の比較における有意差を決定した。P値が0.05未満の差異を有意と考えた。

[実施例2] インビボにおけるラット筋肉へのトランスフェクション効率の比較
最初に、ルシフェラーゼ遺伝子を含む裸プラスミドDNAのトランスフェクション効率に対する、注射量の効果を調べた。期待したように、ルシフェラーゼ活性は、用量依存的なプラスミドDNAにより増大した（図1；p<0.01)。興味深いことに、図1に示したように、裸プラスミドDNAのトランスフェクションは、溶液（PBS）の注射量の増加に関連して増大した（p<0.01)。別々に注射する（４部位に25mlまたは8部位に12.5ml）よりも、注射量の増加（1部位に100μl）により、高いトランスフェクション効率が得られた（図2、p<0.01)。したがって、裸プラスミドDNAのトランスフェクション効率は、浸透圧に関連すると考えられた。

この仮説を明らかにするために、本発明者らは、注射後に後肢で血圧計のマンシェットを使用して、外部からの圧力を増大させた。意外なことに、150 mmHgおよび300 mmHgにおけるマンシェットによる圧力のどちらも、トランスフェクション効率を高めなかった（図3)。さらに、マンシェットを繰り返し押しても、トランスフェクション効率は影響を受けなかった（図3)。

したがって、内部圧力を増大するために、プラスミドDNAを含まないPBSを、プラスミドDNAトランスフェクションと同じ部位に筋肉内注射した。図4aに示したように、プラスミドDNAを最初に注射してから30分後（0.5時間）にPBSを追加注射することにより、ルシフェラーゼ活性が増加した（p<0.01)。にもかかわらず、最初のトランスフェクションの5時間後にPBSのみを同様に追加注射しても、ルシフェラーゼ活性は増加しなかった。プラスミドDNAを800μg使用して、類似の結果が得られた（図4b)。これに対し、注射速度の変化は、トランスフェクション効率に影響を及ぼさなかった（データは示さず)。

さらなる確認のために、HBO療法を使用した。HBO療法では、高圧下で純粋な酸素の環境に、動物を曝露した。2気圧における1時間のHBO療法により、100μlおよび300μlの注射量を注射された両方の動物において、ルシフェラーゼ活性は有意に増加した（図5、p<0.01)。これらの結果により、裸プラスミドDNAの筋肉内注射のトランスフェクション効率は、細胞表面での圧力に依存することが実証された。

または、浸透圧の増大が、トランスフェクション効率に影響を及ぼし得る。したがって、プラスミドDNAの注射ビヒクルとしての様々な溶液の使用がトランスフェクション効率に与える影響を調べた。図6aに示したように、生理食塩水およびPBSは、他の緩衝液よりもトランスフェクション効率が高かった。意外にも、注射ビヒクルとして水を使用すると、ルシフェラーゼ活性が消失した。インビボでの浸透圧を増大させるために、グルコース溶液およびショ糖溶液の効果についても試験した。ショ糖溶液およびグルコース溶液の両方がルシフェラーゼの発現を増加させ、グルコース溶液よりもショ糖溶液の方が、水と比べて、ルシフェラーゼ活性を有意に増加させた（p<0.01)。しかし、30%ショ糖溶液の使用は、筋肉注射部位において損傷を引き起こすので、特に好ましくない。

産業上の利用可能性
本発明は、従来の方法と比べてより安全かつトランスフェクション効率のより高い、プラスミドDNAに基づく遺伝子を骨格筋に送達するための変法を提供する。具体的には、本発明は、筋肉内の圧力が増大する条件下で、適切な裸プラスミドDNAを筋肉内注射することにより、疾患を治療または予防する方法を提供する。さらに、本発明の方法は、高圧酸素（HBO）療法と組み合わせて、適切な裸プラスミドDNAを筋肉内注射することにより、疾患を治療または予防する方法を提供する。

本発明の方法によると、投与されるプラスミドDNAの量を低減でき、したがって、裸プラスミドDNA療法の潜在的コストも低減できる。さらに、これらの方法は、アデノウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用することなく、効率的なトランスフェクションを達成する。特に、本発明の方法は、ウイルスベクターを使用する方法と比べてより安全であり、多種多様な疾患における遺伝子療法の可能性をもたらす。さらに、本発明の裸プラスミドDNA投与とHBO療法の組合せは、創傷治癒、炎症性疾患、虚血性心疾患、心筋梗塞、および末梢動脈疾患などの、血管形成依存的状態のヒト臨床的遺伝子療法における血管形成増殖因子の有用性を拡大し得る。

本発明を、その特定の態様を参照して詳細に記載してきたが、当業者には、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および改変を行なうことができることは明らかであろう。

インビボで、様々な注射量の裸プラスミドDNAを骨格筋にトランスフェクションした2日後に検出されたルシフェラーゼ活性の比較を示すグラフである。100μl、200μl、300μl、および400μlのPBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（200μgまたは800μg）をラットにトランスフェクションした。各群には、6匹の動物が含まれていた。^**p<0.01 対 100μl。インビボで、様々な注射量の裸プラスミドDNAを異なる骨格筋部位にトランスフェクションした2日後に検出されたルシフェラーゼ活性の比較を示すグラフである。200μg/100×1：1部位において、100μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（200μg）でトランスフェクションしたラット；200μg/25×4：4部位において、25μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（200μg）でトランスフェクションしたラット；200μg/12.5×8：8部位において、12.5μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（200μg）でトランスフェクションしたラット；および、400μg/25×4：4部位において、25μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（400μg）でトランスフェクションしたラット。各群には、10匹の動物が含まれていた。^**p<0.01 対 200μg/100×1。マンシェット巻き（wrapping）を使用して、裸プラスミドDNAを骨格筋にトランスフェクションした2日後に検出されたルシフェラーゼ活性の比較を示すグラフである。トランスフェクション直後に、血圧計のマンシェットを、裸ルシフェラーゼプラスミドDNAでトランスフェクションした筋肉上で巻いた。200/100：マンシェットで巻くことなく、100μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（200μg）でトランスフェクションしたラット；10s/10（300）：300 mmHgで10秒間、マンシェットにより10回圧縮した200μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（200μg）でトランスフェクションしたラット；10s/30（300）：300 mmHgで10秒間、マンシェットにより30回圧縮した200μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（200μg）でトランスフェクションしたラット；1 m/10（150）：150 mmHgで1分間、マンシェットにより10回圧縮した200μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（200μg）でトランスフェクションしたラット；1 m/10（300）：300 mmHgで1分間、カフにより10回圧縮した200μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（200μg）でトランスフェクションしたラット；5 m/1（150）：150 mmHgで5分間、マンシェットにより1回圧縮した200μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（200μg）でトランスフェクションしたラット；および、5 m/1（300）：300 mmHgで5分間、マンシェットにより1回圧縮した200μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（200μg）でトランスフェクションしたラット。各群には、4匹の動物が含まれていた。^*p<0.05 対 200/100。更にPBS溶液を注射して、裸プラスミドDNA（200μg）を骨格筋にトランスフェクションした2日後に検出されたルシフェラーゼ活性の比較を示すグラフである。裸ルシフェラーゼプラスミドDNAをトランスフェクションした0.5時間後または5時間後に、プラスミドDNAを含まないPBS溶液を同じ筋肉部位にさらに筋肉内注射した。200μg/100：100μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（200μg）でトランスフェクションしたラット；200μg/100+300（0.5時間）：100μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（200μg）でトランスフェクションし、その後、トランスフェクションの30分後に300μlのPBSを注射したラット；200μg/100+300（5時間）：100μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（200μg）でトランスフェクションし、その後、トランスフェクションの5時間後に300μlのPBSを注射したラット；および、200μg/400：400μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（200μg）でトランスフェクションしたラット。各群には、4匹の動物が含まれていた。^**p<0.01 対 200μg/100。更にPBS溶液を注射して、裸プラスミドDNA（800μg）を骨格筋にトランスフェクションした2日後に検出されたルシフェラーゼ活性の比較を示すグラフである。裸ルシフェラーゼプラスミドDNAをトランスフェクションした0.5時間後または5時間後に、プラスミドDNAを含まないPBS溶液を同じ筋肉部位にさらに筋肉内注射した。800μg/100：100μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（800μg）でトランスフェクションしたラット；800μg/100+300（0.5時間）：100μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（800μg）でトランスフェクションし、その後、トランスフェクションの30分後に300μlのPBSのみを注射したラット；800μg/100+300（5時間）：100μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（800μg）でトランスフェクションし、その後、トランスフェクションの5時間後に300μlのPBSを注射したラット；および、800μg/400：400μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（800μg）でトランスフェクションしたラット。各群には、4匹の動物が含まれていた。^**p<0.01 対 800μg/100。裸プラスミドDNA（200μg）を骨格筋にトランスフェクションした2日後の、ルシフェラーゼ活性に対するHBO療法の効果を示すグラフである。200μg/100：100μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（200μg）でトランスフェクションしたラット；および、200μg/300：300μl PBSで希釈した裸ルシフェラーゼプラスミドDNA（200 μg）でトランスフェクションしたラット。通常：通常条件；HBO：2気圧の100% O₂による1時間のHBO療法。各群には、3匹の動物が含まれていた。**p<0.01 対 200μg/100。裸プラスミドDNA（200μg）を骨格筋にトランスフェクションした2日後の、ルシフェラーゼ活性に対する様々な溶液の効果を示すグラフである。様々な溶液（注射量200μl）で希釈したルシフェラーゼプラスミドDNA（200μg）の筋肉内注射を実施した。PBS：リン酸緩衝生理食塩水；BSS：平衡塩類溶液；およびTE：Tris-HCl EDTA緩衝液。各群には、6匹の動物が含まれていた。^**p<0.01 対水。裸プラスミドDNA（200μg）を骨格筋にトランスフェクションした2日後の、ルシフェラーゼ活性に対するグルコースおよびショ糖の濃度の効果を示すグラフである。グルコース（5%、20%、および50%）またはショ糖（10%、30%、および50%）を含む溶液（注射量200μl）を用いた、ルシフェラーゼプラスミドDNA（200μg）の筋肉内注射を実施した。各群には、6匹の動物が含まれていた。^**p<0.01 対水。

Claims

その投与直後に治療対象の被験者を高圧酸素（HBO）療法に供することをと特徴とする、筋肉内投与するための、肝細胞増殖因子（HGF）、血管内皮増殖因子（VEGF）、または線維芽細胞増殖因子（FGF）をコードする裸プラスミドDNAを有効成分として含有する、重症下肢虚血、または、心筋梗塞、狭心症、および心不全を含む虚血性心疾患の治療または予防剤。
裸プラスミドDNAが、生理食塩水、PBS、ショ糖溶液、またはグルコース溶液で希釈されている、請求項1記載の治療または予防剤。