JP4420633B2 - 血管新生治療剤 - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子治療に使用される一酸化窒素合成酵素(NOS)遺伝子を含む医薬組成物、及び該組成物を用いて血管新生依存性疾患を処置または予防する方法に関する。
血管新生が起こるには、いくつかの必須の主要な過程が存在し、例えば、基盤の分解、内皮細胞の増殖及び移動、並びに管腔形成を伴う管への組織化を挙げることができる（Risau、Nature 386:671-4 (1997)）。一酸化窒素(NO)は、内皮細胞成長及び血管新生の重要な調節因子であることから、これらの全ての過程において何等かの役割を果たしていると考えられている。実際、NO合成の阻害により、角膜マイクロポケット分析において血管形成が阻止され(Zicheら、J.Clin.Invest. 94:2036-44 (1994))、腫瘍関連新脈管構造中の血流を抑制し（Jenkinsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4392-6 (1995)）、切除創傷が閉じるのを妨害する（Yamasakiら、J.Clin.Invest. 101:967-71 (1998)）。血管内皮増殖因子(VEGF)を含む多数の血管新生因子がeNOSの発現を上昇させ、内皮由来NOの放出を刺激する（Papapetropoulosら、J.Clin.Invest. 100: 3131-9 (1997);Parentiら、J.Biol.Chem. 273: 4220-6 (1998);Hoodら、Am.J.Physiol. 273: H1054-8 (1998)）。これらの因子によるNO放出は、その血管新生作用に重要な役割を果たしているものと考えられている。例えば、血管新生のウサギ角膜モデルでは、VEGFにより誘導される血管新生は、NO合成酵素阻害剤L-NAME(L-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル)により阻止される（Zicheら、J.Clin.Invest. 99: 2625-34 (1997)）。eNOS欠損マウスは、後肢虚血における血管新生反応を欠き、VEGFによっても血管新生反応を起こさせることができない（Muroharaら、J.Clin.Invest. 101: 2567-78 (1998)）。これらの事実から、NOは、VEGFにより誘導される内皮細胞の増殖及び移動をより下流で媒介しているものと考えられている（Zicheら、J.Clin.Invest. 99: 2625-34 (1997);Mayhan、Am.J.Physiol. 276: C1148-53 (1999);Scaliaら、FASEB J. 9: 1039-46 (1999)）。さらに、NOはVEGF発現をプラスに制御していると報告されている（Dulakら、Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 20: 659-66 (2000)）。しかしながら、NOがVEGF合成を抑制制御するとの他の研究者らによる報告もある（Ghisoら、Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 40: 1033-9 (1999);Tsurumiら、Nat.Med. 3: 879-86 (1997)）。VEGF発現におけるNOの役割についての研究の多くは、ニトロプルシドナトリウム(SNP)等のNO供与体を使用して行われている。この方法では、NO放出による影響がその誘導体の供与化合物によるNOとは無関係な作用によりマスクされている可能性もある。NOを内発的に産生させるよう処理することが望ましい。
その他のSIN-1、SNAP、DETA及びGSNO等のNO供与体についても、それらが種々の培養細胞におけるVEGF合成を誘導することが報告されている（Ankoma-Seyら、Hepathology 31: 141-8 (2000);Chinら、Oncogene 15:437-42 (1997);Frankら、Biochem.J. 338: 367-74 (1999);Gallacherら、J.Hypertens(abstract) 16(Suppl2): S68 (1998);Kimuraら、Blood 95: 189-96 (2000)）。NOは非常に酸化還元感受性が高いので、上述の報告における矛盾は、分析が行われた細胞環境の微妙な差違による可能性がある（Kimuraら、Blood 95: 189-96 (2000)）。さらに、SNPについて観察された効果の不一致は供与体NOとは無関係で、SNPがフェロシアン化物、フェリシアン化物、鉄イオン及びシアン化物等の様々な生物機能に影響する化合物に分解されることによるのかも知れない（Butler及びGlidewell、Chem.Soc.Rev. 16: 361-6 (1987)）。また、VEGFがeNOS遺伝子発現を上昇させ、NO量を増加させることが多数の証拠により明らかにされている（Papapetrppoulosら、J.Clin.Invest. 100: 3131-9 (1997);Parenti ら、J.Biol.Chem. 273: 4220-6(1998);Hoddら、Am.J.Physiol. 273: H1054-8 (1998);Jozkowiczら、Cardiovasc.Res. 51(4): 773-83 (2001)）。
重症な肢虚血の患者では、適切な薬理学的処置方法が存在しないため、罹患率及び死亡率の高さ、並びに機能的な影響にも拘らず、特に激しい痛みを伴う虚血の静止時疼痛等の症状に対する解決として切断法がとられる。従って、重症な肢虚血の患者を治療するための代替的な手法が強く望まれている。最近になって、虚血性疾患の治療法として側副動脈の発生を促進及び／または増大する血管新生を促す成長因子を用いた新しい手法が考えられている。VEGF遺伝子を利用した遺伝子治療の臨床的有用性が重症な肢虚血及び心筋虚血の処置において報告されている（特許文献1；非特許文献1〜4）。さらに、一酸化窒素合成酵素（NOS）遺伝子を用いて血管新生を増幅及び/または誘導する遺伝子治療法も提案されている（特許文献2）。また、血管新生については開示されていないものの、局所的に血管にNOS遺伝子を導入する方法として、超音波とマイクロバブルを併用して、nakedプラスミドDNAを血流を介して細胞や組織に導入する方法が非特許文献５に示されている。
近年、虚血性疾患の治療法として側副動脈の発生を促進及び／または増大する血管新生を促す成長因子を用いた新しい手法が考えられている。VEGF遺伝子を利用した遺伝子治療の臨床的有用性が重症な肢虚血及び心筋虚血の処置において報告されている（特許文献1；非特許文献1〜4）。さらに、一酸化窒素合成酵素（NOS）遺伝子を用いて血管新生を増幅及びまたは誘導する遺伝子治療法も提案されている（特許文献2）。
しかしながら、上述のNOS遺伝子を用いた遺伝子治療においては、アデノウイルスを利用したベクターが使用されている。ウイルスを利用したベクターについては、感染毒性、免疫系の低下、変異原性、発ガン性等の潜在的な危険性が指摘されている（例えば、非特許文献５、第1104頁左欄第15行〜右欄第6行参照）。それらの危険を回避するため、上記NOS遺伝子を用いた遺伝子治療においては、組織灌流処理をすることが前提とされている。特許文献2に記載されるような虚血部位に限定して遺伝子を投与するための組織灌流処理をするには、外科的な処置が必須とされ患者への負担が大きいという問題が存在する。また、適用できる疾患もそのような灌流処理をすることができるものに限定されてしまうこととなる。
NOが抗血小板凝集活性により血管細胞の生長を阻害し、血管を拡張することは知られている。本発明者らは、血管内皮型NO合成（eNOS）遺伝子を用いた遺伝子治療の末梢動脈疾患に対する有効性について検討した。より具体的には、本発明者らは、血管細胞におけるVEGF合成に対するNOの効果がeNOS遺伝子導入により発揮されるかどうかを、eNOS遺伝子のラット後肢虚血モデルにおける過剰発現させ検討した。さらに、内因性NO産生を増幅させた場合と、血管細胞を外因性NO供与体に曝露した場合とを比較した。その結果、NOがVEGF制御に関わっていることが強く示された。eNOSプラスミドの注入によりVEGF産生が増幅され血管新生が誘導されることが示された。さらに、eNOS遺伝子導入により誘導される血管新生のみで、十分にラット後肢虚血モデルにおける末梢動脈疾患が処置され得ることが証明された。
NOが血管壁等の生理的条件下、及び炎症性疾患等の病理学的状況においてVEGF合成の重要な調節因子として機能している可能性が示唆された。さらに、本発明により、NOS遺伝子を"ネイキッド（naked）"DNAの形で遺伝子治療に用いた、重篤な肢虚血を簡便な方法により処置するための新しい手法が確立された。NOS遺伝子"naked"DNAの投与によって、投与した組織内の亜硝酸及び硝酸レベルは上昇するものの、血清中の亜硝酸及び硝酸濃度はNOSベクターを投与しなかった場合と比べて変化しなかった。即ち、このような"naked"DNAの投与により全身におけるNOレベルを変化させることなく局所的NO濃度の上昇を達成し得ることが本発明により示された。nakedDNAを用いた方法は従来から提案されてはいたものの、その低いトランスフェクション効率及び一過性の発現しか得られない等の欠点により遺伝子治療における有効な手段とは考えられていなかった（例えば、非特許文献５、左欄第5〜12行参照）。それにも拘らず、本発明により、たった一回のNOSプラスミドの筋内注射によってラット虚血モデルにおいて血管新生が誘導されることが示された。このような実験結果に基づき、本発明者らは、NOS遺伝子を"naked"DNAの形で投与することにより、副作用を引き起こすことなく、より簡便な手法により、血管新生により症状が緩和、改善、または治療される体の様々な部位における症状を治療または予防できることに着目し、本発明を完成した。即ち、本発明は、
(1)一酸化窒素合成酵素遺伝子を含有するネイキッドDNA医薬組成物、
(2)一酸化窒素合成酵素遺伝子が内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子である、上記(1)記載の医薬組成物、
(3)一酸化窒素合成酵素遺伝子がマクロファージ由来一酸化窒素合成酵素遺伝子または誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)遺伝子である、上記(1)記載の医薬組成物、
(4)一酸化窒素合成酵素遺伝子が脳由来一酸化窒素合成酵素(nNOS)遺伝子である、上記(1)記載の医薬組成物、
(5)血管新生依存性症状を処置または治療するのに使用される、上記(1)記載の医薬組成物、並びに
(6)血管新生依存性症状が、床ずれ及び皮膚潰瘍を含む創傷治癒、炎症性疾患、重症性肢虚血、心筋梗塞、狭心症及び心不全を含む虚血性心疾患、脳梗塞、糖尿病ニューロパシー、並びに血管狭窄から選択される、上記(5)記載の医薬組成物
を提供するものである。
(1)一酸化窒素合成酵素遺伝子を含有するネイキッドDNA医薬組成物、
(2)一酸化窒素合成酵素遺伝子が内皮型一酸化窒素合成酵素遺伝子である、上記(1)記載の医薬組成物、
(3)一酸化窒素合成酵素遺伝子がマクロファージ由来一酸化窒素合成酵素遺伝子または誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)遺伝子である、上記(1)記載の医薬組成物、
(4)一酸化窒素合成酵素遺伝子が脳由来一酸化窒素合成酵素(nNOS)遺伝子である、上記(1)記載の医薬組成物、
(5)血管新生依存性症状を処置または治療するのに使用される、上記(1)記載の医薬組成物、並びに
(6)血管新生依存性症状が、床ずれ及び皮膚潰瘍を含む創傷治癒、炎症性疾患、重症性肢虚血、心筋梗塞、狭心症及び心不全を含む虚血性心疾患、脳梗塞、糖尿病ニューロパシー、並びに血管狭窄から選択される、上記(5)記載の医薬組成物
を提供するものである。
上記(1)〜(6)記載の医薬組成物は、床ずれ及び皮膚潰瘍を含む創傷治癒、炎症性疾患、重症性肢虚血、心筋梗塞、狭心症及び心不全を含む虚血性心疾患、脳梗塞、糖尿病ニューロパシー、並びに血管狭窄等の血管新生依存性症状を処置または予防するのに用いることができることから、本発明はさらにこれらの症状を処置または予防する方法を提供するものである。
本発明により、虚血モデルにおいて、eNOS遺伝子移入によりin vivoにおける治療的血管新生が誘導されることが証明された。たった一回のeNOSプラスミドの筋内注射によってラット後肢虚血モデル中で治療的な血管新生が誘導されたことは注目すべきことである。L-NAME処理されたラットにおける、虚血及び正常な肢についてのドップラー式測定による血流比により内因性NO阻害により虚血後肢の灌流回復が有意に阻害されたことが示された。おそらく、内因性NOは虚血後の自然な血流回復と関わっていると考えられる。また、今回得られたeNOSによる結果とは対照的に、誘導性NOS(iNOS)等の他のNOSアイソフォームは、eNOSと同じような血管新生機能を有さないとの報告もある（Fukumuraら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98: 2604-9 (2001)）。しかしながら、本発明によると、NOS活性、特にeNOS活性の選択的な改変がin vivoにおける血管新生を変化させるのに有効な手段であることが証明された。よって、本発明は、これまでの低効率及び/または毒性を示す等の欠点を有するトランスフェクション法、及びVEGFを用いた方法にかわるeNOSを利用した、重症肢虚血の患者の処置のための遺伝子治療による治療的な血管新生の手段を提供するものである。
本発明により、重要な肢虚血の症状を緩和するNOS遺伝子移入を利用した新規な治療方法が提供される。さらに、NOにより誘導される新血管形成は、NOによりまずVEGFが誘導されて起こっている可能性も示唆された。本発明により示された、NOSによる新しい血管形成の誘導は、様々な血管新生依存性症状を治療または予防するための新しい手法となることが期待される。
本発明により、一酸化窒素合成酵素(NOS)遺伝子を活性成分の一つとして含有する医薬組成物が提供される。ここで、「一酸化窒素合成酵素（NOS）遺伝子を含有するネイキッドDNA医薬組成物」とはNOS遺伝子を"ネイキッド(naked)"DNAの形体で含有する遺伝子治療に用いられる組成物であり、「一酸化窒素合成酵素(NOS)遺伝子」とは、血管新生を誘導する能力を有する一酸化窒素合成酵素蛋白質またはポリペプチド、及びそれらの断片をコードする遺伝子を意味する。
NOSには幾つかのアイソフォームが知られている。例えば、脳から単離されたNOS(nNOS;Bredt及びSnyder、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87: 682-5 (1990))、内皮細胞から得られたNOS(eNOS;Fostermannら、Biochem.Pharmacol. 42: 1849-57 (1991))、マクロファージ由来NOS（iNOS;Hibbsら、Science 235:473 (1987);Stuehrら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 7773-7 (1991)）、肝細胞由来NOS（Knowlesら、Biochem.J. 279: 833-6 (1990)）、血管細胞由来のNOS（Woodら、Biochem.Biophys.Res.Commun. 170: 80-8 (1991)）、及び好中球由来のNOS(Yuiら、J.Biol.Chem. 266:12544-7 (1991);Yuiら、J.Biol.Chem. 266: 3369-71 (1991))が知られている。さらに、NOSは上記以外の組織からも単離されている（例えば、Hevelら、J.Biol.Chem. 266: 22789-91 (1991);Ohshimaら、Biochem.Biophys.Res.Commun. 183: 238-44 (1992);Hikiら、J.Biochem. 111: 556-8 (1992);Evansら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89: 5361-5 (1992);Shermanら、Biochemistry 32: 11600-5 (1993)参照）。上記NOSをコードする種々の臓器及び組織由来の遺伝子を本発明の「一酸化窒素合成酵素(NOS)遺伝子」として使用することができる。例えば、ヒトeNOSの塩基配列及びアミノ酸配列はデータベース上でも公開されており（GenBankアクセッション番号AF400594及び P29474;Janssens ら、J.Biol.Chem. 267: 14511-22 (1992)、Marsdenら、FEBSLett. 307:287-93 (1992)参照）、本発明で用いるNOS遺伝子は、該配列情報を元に取得することができる。また、eNOSには、その他、アイソフォームが存在することも知られており（Fischmanら、Nat.Struct.Biol. 6(3): 233-42 (1999)）、本発明では、それらのアイソフォームもNOS遺伝子に含まれる。その他にも、哺乳動物カルモジュリン依存性一酸化窒素合成酵素（nNOS;米国特許第5,268,465号）、ヒト誘導性一酸化窒素合成酵素（iNOS;米国特許第5,468,630号）、及びウシ内皮型一酸化窒素合成酵素（eNOS;米国特許第 5,498,539号）等についての配列情報も本発明において使用するNOS遺伝子の配列情報として使用することができる。当業者であれば、上述の公知の遺伝子情報を元に所望のNOSをコードするcDNAを、これらの情報に基づいて作成したプライマーを用いた逆転写(RT)-PCR（例えば、 Molecular Cloning 2nd ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);PCR:A Practical Approach、IRL Press、Oxford(1991)参照）等により、NOS遺伝子を含む試料中から得ることができる。NOS遺伝子を含む試料としては、種々の哺乳動物種由来のcDNAライブラリー、ゲノムライブラリー等を挙げることができる。しかしながら、免疫原性の観点から、遺伝子治療を行う動物の種と同じ種由来の遺伝子を使用することが好ましい。
本発明において使用するNOS遺伝子は、上記の遺伝子に限らず、血管新生活性を有すればよい。例えば、(1)上記各NOS遺伝子に対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド、並びに(2)上記各NOS遺伝子配列にコードされるアミノ酸配列中、1若しくはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、付加及び／または挿入等の変異により改変された蛋白質をコードするヌクレオチド等が含まれる。このようなNOSの変異体をコードするヌクレオチドは、部位特異的突然変異（Current Protocols in Molecular Biology、Ausubel et al.編(1987)、John Wiley& Sons発行、Sections8.1-8.5）、PCR等の遺伝子増幅方法（Current Protocols in Molecular Biology、Ausubel et al.編(1987)、John Wiley&Sons発行、Sections6.1-6.4）、及び一般的なハイブリダイゼーション法（Molecular Cloning 2nd ed.、J. Sambrook et al.編(1989)Cold Spring Harbor Press、Section9.47-9.58; Current Protocols in Molecular Biology、Ausubel et al.編(1987)、John Wiley&Sons発行、Sections 6.3-6.4）等により取得することができる。また、それらの方法に代えて、このような遺伝子またはその断片は、公知の配列情報に基づいて化学的に構築することもできる。
ハイブリダイゼーションのためのストリンジェントな条件には、例えば、「37℃における1×SSC」による洗浄等の条件が含まれる。よりストリンジェントな条件としては、例えば、「42℃における0.5×SSC及び0.1％SDS」による洗浄、さらにストリンジェントな条件としては「65℃における0.1×SSC及び0.1％SDS」等の洗浄条件を挙げることができる。より高いストリンジェンシーの条件を選択することにより、プローブに対してより高いホモロジーを有するポリヌクレオチドを選ぶことができる。前述のハイブリダイズ条件は、単なる例示であり、当業者であれば使用するプローブ配列、プローブ濃度、及びプローブ濃度を勘案し、反応時間、反応温度、塩濃度等を適宜決定することができる。
上述のようなハイブリダイズ法により単離されたNOS遺伝子は、プローブとして用いた天然のNOS配列に対して高い相同性を有し、それらによりコードされるポリペプチドも互いに高い相同性を示す。「高い相同性」とは、例えば50％、好ましくは65％、さらに好ましくは75％、より好ましくは80％、さらに一層好ましくは90％、そして最も好ましくは95％よりも高い同一性を意味する。ポリヌクレオチド間の配列相同性を決定する手法は公知であり、BLASTサーチのアルゴリズム（Karlin及びAltschul、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 5873-7 (1993)）等に基づく相同性の決定が可能である。
蛋白質の変異は天然においても自然に起こり得る。上述したように、様々なNOSのアイソフォームが公知である。このようなNOSアイソフォームをコードする遺伝子も、血管新生活性を有する限り本発明の医薬組成物として使用することができる。
蛋白質を構成する1または複数のアミノ酸残基を欠失、置換、付加及び／または挿入等により改変した蛋白質が、元の蛋白質と同等の生物学的活性を示すことは周知である（Dalbadie-McFarlandら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79: 6409-13 (1982)）。
NOSの血管新生活性を維持するようにNOS中のアミノ酸残基を改変するためには、元のアミノ酸残基と同じ特性のアミノ酸側鎖を有するアミノ酸残基に改変することが望ましい。アミノ酸の特性は、一般的には次のように分類される：(1)疎水性アミノ酸(アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、バリン)；(2)親水性アミノ酸（アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリン、スレオニン）；(3)脂肪族側鎖を有するアミノ酸（アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、バリン）；(4)水酸基を含む側鎖を有するアミノ酸（セリン、スレオニン、チロシン）；(5)硫黄原子を含む側鎖を有するアミノ酸（システイン、メチオニン）；(6)カルボン酸またはアミド含有側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン）；（7）塩基含有側鎖を有するアミノ酸（アルギニン、ヒスチジン、リジン）；及び(8)芳香族側鎖を有するアミノ酸（ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）。
本発明において、NOSに対してアミノ酸残基が付加された蛋白質またはポリペプチドには、融合蛋白質が含まれる。融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを調製するためには、例えば、NOSをコードするDNAと、その他の蛋白質またはポリペプチドをコードするDNAをその読み枠が合うように連結することができる。NOSに融合される蛋白質またはポリペプチドは特に限定されず、目的に応じ適当な蛋白質またはポリペプチドをコードするDNAを連結させることができる。
上述の種々の変異体蛋白質が示す活性は、例えば、WO97/07824号等に記載の方法によって確認することができる。検出する蛋白質の活性としては、血管内皮細胞増殖活性、または実施例に記載のラット虚血後肢モデルにおける治療的血管新生を誘導する活性等が例示される。
本発明において、NOS遺伝子は単独で使用してもよく、また他の血管新生因子をコードする遺伝子と併用してもよい。NOS遺伝子と併用できる血管新生因子コード遺伝子として、例えば、肝細胞増殖因子(HGF)、血管内皮増殖因子（VEGF）、VEGF-2、酸性線維芽細胞増殖因子(FGF)、塩基性FGF、FGF-4、トランスフォーミング増殖因子(TGF)-α、TGF-β、血小板由来(PD)-内皮細胞増殖因子(ECGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、腫瘍壊死因子(TNF)-α、インスリン様増殖因子、アンジオポエチン-1等をコードするものが挙げられる。さらに、HIF-1、Ets-1等の血管新生因子の発現を調節する転写因子をコードする遺伝子を、本発明の医薬組成物においてNOS遺伝子と組み合せて使用してもよい。
本発明において、NOS遺伝子、及び、必要に応じそれと組み合せ用いられる遺伝子は、遺伝子のin vivoにおける発現を保証する適当なベクター中に組み込まれ、"naked"DNAの手法により患者の病変部位、またはその近傍へ投与される。適当なベクターとしては、pCAGGS（Gene 108: 193-200 (1991)）、pBK-CMV、pcDNA3.1、pZeoSV（Invitrogen;Stratagene）等を挙げることができる。ベクター中に挿入された遺伝子の発現のため、ベクターはプロモーター及びターミネーター等の遺伝子発現に必要とされる制御配列を含む。
本発明の医薬組成物は、血管新生依存性症状に対して用いることができる。ここで、「血管新生依存性症状」とは、血管新生により症状が緩和、改善または治療されるような疾病を指す。例えば、本発明の医薬組成物により治療され得る血管新生依存性症状として、床ずれ及び皮膚潰瘍を含む創傷、炎症性疾患、重症性肢虚血等の虚血性疾患、心筋梗塞、急性心筋梗塞、心筋症、狭心症、不安定狭心症、冠動脈硬化及び心不全を含む虚血性心疾患、末梢動脈疾患、閉塞性動脈硬化症（ASO）、バージャー病、血管損傷、動脈閉塞症、動脈血栓症、組織性動脈閉塞症、動脈瘤、脳血管閉塞症、脳梗塞、脳血栓症、脳塞栓症、脳卒中、脳出血、モヤモヤ病、脳血管性痴呆、アルツハイマー病、脳出血後遺症、脳梗塞後遺症、糖尿病ニューロパシー、並びに血管狭窄等を例示することができる。
NOS遺伝子を含有する本発明の医薬組成物は、in vivoにおける血管新生を活性化する能力を有する。従って、本発明の医薬組成物は、血管新生依存性症状を処置するための公知の医薬品の活性化剤として使用することもできる。
本発明の医薬組成物は慣用な手法に従って製剤化される。例えば、組成物を注射により投与用に、適当な溶液（例えば、PBS等の緩衝液、生理的食塩水、滅菌水等）中に溶解し、必要に応じ濾過等により滅菌し、無菌アンプル等の容器に満たすことができる。所望により、注射のための溶液に慣用の担体を溶液中に添加してもよい。また、徐放性製剤（例えば、小型ペレット剤等）として製剤化して、病変部の近傍に埋め込むことも可能である。浸透ポンプ等を用いて、製剤を連続的に病変部位へ輸送する方法を取ることも可能である。
投与する用量は、患者の体重、年齢、性別、及び症状、投与方法等によって変化するが、当業者であれば、必要な用量を適宜設定することができる。一般的に、遺伝子は成人（体重60kg）に対して数日または数ヶ月に1回、0.0001〜100mgの範囲内、好ましくは0.001〜10mgの範囲内で投与される。その他の動物に対しては、60kgの体重に対して換算した用量を投与することが望ましい。
本発明は、さらに、血管新生依存性症状を上述の医薬組成物を用いて処置または予防する方法を提供するものである。本発明により、NOSトランスフェクションによるNO産生の増加により、in vivoにおけるVEGFの発現が増加する。これは、NOS以外のNO誘導化合物もまた、NOS同様に血管新生依存性症状を処置または予防するのに使用できることを意味する。従って、本発明は、そのような化合物を投与することをも含む血管新生依存性症状の処置または予防方法をも提供するものである。このようなNO誘導化合物として、一酸化窒素合成酵素刺激剤、一酸化窒素合成酵素増幅剤、一酸化窒素供与体、一酸化窒素放出促進剤等が含まれる。より具体的には、L-アルギニン、アンギオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤、アンギオテンシン受容体アンタゴニスト、ニトロプルシドナトリウム（SNP）、S-ニトロソ-N-アセチルペニシラミン（SNAP）、S-ニトロソグルタチオン（SNOG、GSNO）、ジエチルアミンNONOエート（DEA/NO）、DETA/NO（NOC-18）、3-モルフォリノシドノイミン（morpholinosydnoimine;SIN-1）及びスペルミンNONOエート（Sper/NO）等の化合物を例示することができる。これらの化合物を用いた治療または予防を、NOS遺伝子を含むネイキッドDNA医薬組成物による治療または予防処理と組み合せて行うことも可能である。
上記、「発明の実施の形態」の項目において、特許請求の範囲に係る発明についての一般的な説明を行ったが、さらに以下の「実施例」の項目において本発明の具体的な例を示す。しかしながら、本発明は先の「発明の実施の形態」に記載された例、或いは以下の実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された事項に基づき判断されるものであり、特許請求の範囲に記載された事項と均等と判断される事項をも包含するものである。また、特に明記されない限り、本明細書において使用される用語は、本発明が属する分野における一般的な意味を有するものである。そして、本明細書中に参考文献として挙げられた特許文献、特許明細書及び一般文献に記載される内容も本明細書の一部として参照されるものである。
[実施例１]プラスミドの構築
eNOS発現ベクターを製造するため、ウシ構成的内皮型NOSの全長cDNA(3.7kb)をβ‐アクチンプロモーター及びサイトメガロウイルス(CMV)エンハンサーを利用した真核生物発現プラスミド(pUC-CAGGS；Gene 108: 193-200 (1991))中に挿入した。eNOS cDNAを含まないCAGGS発現ベクタープラスミドをコントロールとして用いた。
eNOS発現ベクターを製造するため、ウシ構成的内皮型NOSの全長cDNA(3.7kb)をβ‐アクチンプロモーター及びサイトメガロウイルス(CMV)エンハンサーを利用した真核生物発現プラスミド(pUC-CAGGS；Gene 108: 193-200 (1991))中に挿入した。eNOS cDNAを含まないCAGGS発現ベクタープラスミドをコントロールとして用いた。
[実施例２]直接注入法によるin vivo遺伝子移入
Sprague-Dawleyラット(体重400〜500g；Charles River Breeding Lab.)をペントバルビタールナトリウム塩(0.1ml/100mg)の腹腔内注射により麻酔した。身体部分の長軸方向に沿って、腹側を鼡径靱帯から膝蓋骨付近まで切開した。切開部より、手術用ループを用い、右大腿動脈の全長、並びに、下腹壁動脈、大腿深動脈、外側大腿回旋動脈及び浅腹壁動脈を含む全ての一次分枝を自由に切り離した（Morishitaら、Circulation 105: 1491-6 (2001);Leyenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92: 1137-41 (1995);Matsumotoら、J.Vasc.Surg. 27: 125-44 (1998)）。遠位膝窩動脈及び伏在動脈を切り離した後、外腸骨動脈及び上記全ての動脈を4-0外科用絹糸(Ethicon)で結紮した。最後に、外腸骨動脈の分枝の近位起点から伏在動脈及び膝窩動脈に分岐する遠位点まで右大腿動脈を完全に切除し、虚血肢モデルを作成した。大腿動脈の切除により血栓の逆行性増殖、及び外腸骨動脈閉塞が起こる。腹膜下の大腿動脈を1cm切除することにより虚血モデルが形成された。その結果、虚血肢の血流は、内腸骨動脈から発生する側副血管に依存していた。手術直後、"naked"ウシNOS(500μg/匹)またはコントロールベクター(500μg/匹)を慎重に直接、ラットの右虚血肢へ27G注射針(Terumo)を用いて注射した。プラスミドの注射量は100μlであった。NOS阻害の効果を評価するため、新たに調製したL-NAME(0.5g/ｌ)を飲み水に加えて随意与えた(Zicheら、J.Clin.Invest. 99: 2625-34 (1997))。処置終了時にL-NAME投与の効力を評価した。
Sprague-Dawleyラット(体重400〜500g；Charles River Breeding Lab.)をペントバルビタールナトリウム塩(0.1ml/100mg)の腹腔内注射により麻酔した。身体部分の長軸方向に沿って、腹側を鼡径靱帯から膝蓋骨付近まで切開した。切開部より、手術用ループを用い、右大腿動脈の全長、並びに、下腹壁動脈、大腿深動脈、外側大腿回旋動脈及び浅腹壁動脈を含む全ての一次分枝を自由に切り離した（Morishitaら、Circulation 105: 1491-6 (2001);Leyenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92: 1137-41 (1995);Matsumotoら、J.Vasc.Surg. 27: 125-44 (1998)）。遠位膝窩動脈及び伏在動脈を切り離した後、外腸骨動脈及び上記全ての動脈を4-0外科用絹糸(Ethicon)で結紮した。最後に、外腸骨動脈の分枝の近位起点から伏在動脈及び膝窩動脈に分岐する遠位点まで右大腿動脈を完全に切除し、虚血肢モデルを作成した。大腿動脈の切除により血栓の逆行性増殖、及び外腸骨動脈閉塞が起こる。腹膜下の大腿動脈を1cm切除することにより虚血モデルが形成された。その結果、虚血肢の血流は、内腸骨動脈から発生する側副血管に依存していた。手術直後、"naked"ウシNOS(500μg/匹)またはコントロールベクター(500μg/匹)を慎重に直接、ラットの右虚血肢へ27G注射針(Terumo)を用いて注射した。プラスミドの注射量は100μlであった。NOS阻害の効果を評価するため、新たに調製したL-NAME(0.5g/ｌ)を飲み水に加えて随意与えた(Zicheら、J.Clin.Invest. 99: 2625-34 (1997))。処置終了時にL-NAME投与の効力を評価した。
[実施例３]eNOS蛋白質測定
eNOSまたはコントロールベクターの後肢への"naked"プラスミド注入によるトランスフェクションから1週間後にラットを殺した。組織試料を液体窒素により即時に凍結し、溶解バッファー中でホモジェナイズした。血管中のeNOS蛋白質濃度は抗eNOS抗体(1:100;Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)を用いたウエスタンブロットにより測定した。定量及び各蛋白質量を比較するため、各バンドの濃度を濃度計を用いて測定した。抗チューブリン抗体(Calbiochem)を用いたウエスタンブロットによりロードした蛋白質量が均等であることを確認した。
結果を図１に示す。図1に示されるように、コントロールベクターと比べeNOSベクターを後肢にトランスフェクトした場合、eNOS蛋白質の有意な増加が観察された(p<0.01)。
図中の全ての値は、平均±SEMで示される。続いて、Duncan’sテストによる分散分析により複数の比較における有意差を決定した。P値が0.05よりも少ない差違を有意とした。
eNOSまたはコントロールベクターの後肢への"naked"プラスミド注入によるトランスフェクションから1週間後にラットを殺した。組織試料を液体窒素により即時に凍結し、溶解バッファー中でホモジェナイズした。血管中のeNOS蛋白質濃度は抗eNOS抗体(1:100;Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)を用いたウエスタンブロットにより測定した。定量及び各蛋白質量を比較するため、各バンドの濃度を濃度計を用いて測定した。抗チューブリン抗体(Calbiochem)を用いたウエスタンブロットによりロードした蛋白質量が均等であることを確認した。
結果を図１に示す。図1に示されるように、コントロールベクターと比べeNOSベクターを後肢にトランスフェクトした場合、eNOS蛋白質の有意な増加が観察された(p<0.01)。
図中の全ての値は、平均±SEMで示される。続いて、Duncan’sテストによる分散分析により複数の比較における有意差を決定した。P値が0.05よりも少ない差違を有意とした。
[実施例４]亜硝酸レベル測定
試料中の硝酸を測定に先立ち還元することなく測定を行った。eNOS遺伝子でトランスフェクトした筋肉からのNOの放出を、以前報告されたGriess法（Guevaraら、Clin.Chim.Acta 274: 177-88 (1998)）を利用した亜硝酸蓄積の測定により確認した。亜硝酸濃度は、感度が10nMから10μM以上の蛍光測定法（Miskoら、Anal.Biochem. 214: 11-6 (1993)）により測定した。
図2に示されるよう、eNOSベクターの虚血後肢への注入により、トランスフェクションから1〜2週間後に亜硝酸及び硝酸の組織内濃度が有意に上昇した(p<0.01)。eNOSのトランスフェクションの成功は、L-NAME投与により亜硝酸及び硝酸の組織内レベルの増加が減少することにより確認した(p<0.01)。重要なことに、トランスフェクションからの1及び2週間後の亜硝酸及び硝酸の血清濃度は、eNOSベクターをトランスフェクトしたラットと、コントロールベクターを与えたラットとで相違しなかった(図3)。コントロールベクターと比べてeNOS遺伝子のトランスフェクションにより最大血圧に有意な変化は見られず（図4）、eNOS遺伝子はラットの全身性血行力学に影響しなかった。それに対し、L-NAMEを投与すると、eNOSベクターを導入したラット及びコントロールベクターを導入したラットの両方で、処置から1〜2週間後に最大血圧が増加した（図4；p<0.01）。これらの結果は、eNOS遺伝子の投与により、全身におけるNOレベルを変化させることなく局所的NO濃度が増加されたことが明白に示された。
試料中の硝酸を測定に先立ち還元することなく測定を行った。eNOS遺伝子でトランスフェクトした筋肉からのNOの放出を、以前報告されたGriess法（Guevaraら、Clin.Chim.Acta 274: 177-88 (1998)）を利用した亜硝酸蓄積の測定により確認した。亜硝酸濃度は、感度が10nMから10μM以上の蛍光測定法（Miskoら、Anal.Biochem. 214: 11-6 (1993)）により測定した。
図2に示されるよう、eNOSベクターの虚血後肢への注入により、トランスフェクションから1〜2週間後に亜硝酸及び硝酸の組織内濃度が有意に上昇した(p<0.01)。eNOSのトランスフェクションの成功は、L-NAME投与により亜硝酸及び硝酸の組織内レベルの増加が減少することにより確認した(p<0.01)。重要なことに、トランスフェクションからの1及び2週間後の亜硝酸及び硝酸の血清濃度は、eNOSベクターをトランスフェクトしたラットと、コントロールベクターを与えたラットとで相違しなかった(図3)。コントロールベクターと比べてeNOS遺伝子のトランスフェクションにより最大血圧に有意な変化は見られず（図4）、eNOS遺伝子はラットの全身性血行力学に影響しなかった。それに対し、L-NAMEを投与すると、eNOSベクターを導入したラット及びコントロールベクターを導入したラットの両方で、処置から1〜2週間後に最大血圧が増加した（図4；p<0.01）。これらの結果は、eNOS遺伝子の投与により、全身におけるNOレベルを変化させることなく局所的NO濃度が増加されたことが明白に示された。
[実施例５]レーザー・ドップラー式血流画像化装置による血流測定
上述の"naked"eNOSプラスミドを用いたトランスフェクションの有利な効果を受け、eNOS遺伝子を用いた遺伝子治療の可能性を、ヒト遺伝子治療の前臨床的研究としてさらにラット虚血モデルで試験した。
レーザー・ドップラー式血流画像化装置(LDI)を用いた血流測定は公知である（Morishitaら、Circulation 105: 1491-6 (2002);Leyenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92: 1137-41 (1995);Matsumotoら、J.Vasc.Surg. 27: 125-44 (1998)）。レーザー・ドップラー流速は、毛細血管密度と相関していることが知られている（Morishitaら、Circulation 105: 1491-6 (2002);Leyenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92: 1137-41 (1995);Matsumotoら、J.Vasc.Surg. 27: 125-44 (1998)）。そこで、発明者らはレーザー・ドップラー式血流画像化装置（Laser Doppler Imager(LDI),Moor Instruments,England）を用いて心血流を測定した。その結果、LDIにより測定された血流は毛細血管密度とよく相関していることが示された(データ示さず)。画像化する前に、ラットの肢の毛を除毛クリームを用いて除き、温度変差を最小にするために37℃の加熱プレートに載せた。所望の領域(下肢及び足)の同じ部分について連続的に測定を行った。LDIは、12-mWヘリウム-ネオンレーザー光により5×5cmの表面領域を極高速で連続的にスキャンし、虚血後肢における血流を測定する。表面から1mmの深さにある血流が測定される。スキャンしている間、ドップラー原理により投射される光の振動数に応じ血液細胞の動きはシフトする。スキャンが終わると、モニター上に血流分布を表す色分けされた画像が表示される。灌流シグナルは異なる14インターバルに細分され、各インターバルは別々の色により表示される。低いインターバル、またはインターバルが無い場合は濃い青で表示され、最も高い灌流インターバルは白で表示される。蓄積された色分けされた画素に対応した灌流値をデータ分析に用いることができる。測定前、ラットを麻酔し、挿管し、人工呼吸装置につなげた。灌流分析は連続的に行った：(a)虚血後肢をコントロールベクターでトランスフェクト、(b)虚血後肢をeNOSベクターでトランスフェクト。これらのレーザー画像は、X軸にトレースした領域の血流量を、Y軸にトレースした領域の画素数を表す柱状グラフに定量的に変換した。各柱状グラフで示される平均血流を評価のため算出した。
図5及び6に示されるよう、eNOSベクターの虚血後肢への注射により、トランスフェクションから1週間後では血流に有意な変化が見られなかったのに対し、局所NO濃度の増加に続いてトランスフェクションから2週間後に血流が有意に増加した(p<0.01)。コントロールベクターをトランスフェクトした後肢についてのレーザー・ドップラー画像値は、トランスフェクトしていないラットの結果と変らなかった。eNOS遺伝子トランスフェクションによる血流増加は、L-NAME投与により完全に抑制された(p<0.01)。興味深いことに、L-NAME投与により基底血流も手術から1及び2週間後に有意に減少した(p<0.01)。NOの基底レベルが、手術後の血流の回復を調節しているのかもしれない。
上述の"naked"eNOSプラスミドを用いたトランスフェクションの有利な効果を受け、eNOS遺伝子を用いた遺伝子治療の可能性を、ヒト遺伝子治療の前臨床的研究としてさらにラット虚血モデルで試験した。
レーザー・ドップラー式血流画像化装置(LDI)を用いた血流測定は公知である（Morishitaら、Circulation 105: 1491-6 (2002);Leyenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92: 1137-41 (1995);Matsumotoら、J.Vasc.Surg. 27: 125-44 (1998)）。レーザー・ドップラー流速は、毛細血管密度と相関していることが知られている（Morishitaら、Circulation 105: 1491-6 (2002);Leyenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92: 1137-41 (1995);Matsumotoら、J.Vasc.Surg. 27: 125-44 (1998)）。そこで、発明者らはレーザー・ドップラー式血流画像化装置（Laser Doppler Imager(LDI),Moor Instruments,England）を用いて心血流を測定した。その結果、LDIにより測定された血流は毛細血管密度とよく相関していることが示された(データ示さず)。画像化する前に、ラットの肢の毛を除毛クリームを用いて除き、温度変差を最小にするために37℃の加熱プレートに載せた。所望の領域(下肢及び足)の同じ部分について連続的に測定を行った。LDIは、12-mWヘリウム-ネオンレーザー光により5×5cmの表面領域を極高速で連続的にスキャンし、虚血後肢における血流を測定する。表面から1mmの深さにある血流が測定される。スキャンしている間、ドップラー原理により投射される光の振動数に応じ血液細胞の動きはシフトする。スキャンが終わると、モニター上に血流分布を表す色分けされた画像が表示される。灌流シグナルは異なる14インターバルに細分され、各インターバルは別々の色により表示される。低いインターバル、またはインターバルが無い場合は濃い青で表示され、最も高い灌流インターバルは白で表示される。蓄積された色分けされた画素に対応した灌流値をデータ分析に用いることができる。測定前、ラットを麻酔し、挿管し、人工呼吸装置につなげた。灌流分析は連続的に行った：(a)虚血後肢をコントロールベクターでトランスフェクト、(b)虚血後肢をeNOSベクターでトランスフェクト。これらのレーザー画像は、X軸にトレースした領域の血流量を、Y軸にトレースした領域の画素数を表す柱状グラフに定量的に変換した。各柱状グラフで示される平均血流を評価のため算出した。
図5及び6に示されるよう、eNOSベクターの虚血後肢への注射により、トランスフェクションから1週間後では血流に有意な変化が見られなかったのに対し、局所NO濃度の増加に続いてトランスフェクションから2週間後に血流が有意に増加した(p<0.01)。コントロールベクターをトランスフェクトした後肢についてのレーザー・ドップラー画像値は、トランスフェクトしていないラットの結果と変らなかった。eNOS遺伝子トランスフェクションによる血流増加は、L-NAME投与により完全に抑制された(p<0.01)。興味深いことに、L-NAME投与により基底血流も手術から1及び2週間後に有意に減少した(p<0.01)。NOの基底レベルが、手術後の血流の回復を調節しているのかもしれない。
[実施例６]毛細血管密度測定
アルカリホスファターゼを内皮細胞の特異的マーカーとして利用し、従来法（Morishitaら、Circulation 105: 1491-6 (2002);Leyenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92: 1137-41 (1995);Matsumotoら、J.Vasc.Surg. 27: 125-44 (1998)）に従いパラフィン埋没切片をアルカリホスファターゼ染色した。NOSベクターまたはコントロールベクターでトランスフェクトされた虚血右後肢の血管数を調べるためにラットを殺し、筋肉を得た。トランスフェクトした筋肉の真中部分の異なる3つの切片について分析を行った。光学顕微鏡下(倍率×100)で血管数をブライドで計測した。各切片中の血管総数を総計し、各切片当たりの数として表現した。各筋肉について少なくとも10の異なる切片を評価した。血管数を定量した領域は、注射部位及び注射部位の周辺からランダムに選択した。各動物に番号を振り、個々の動物がどのような処置を受けたか判らないようにして分析を行った。結果の再現性について評価した。同一観察者についての変数は、全ての切片について一人の観察者により行われた3回の測定により決定された。同一観察者により行われた測定の結果の平均±SD偏差は1.8±0.2％であった。異なる観察者間の変数は、10のランダムに選択された切片について第一及び第二の観察者により行われた測定の結果に基づいて決定された。二人の観察者間における測定値の数字上の差は2.1±0.8％であった。これらの観察者は、ラットの受けた処理等についてのデータと同様、もう一方の観察者による結果も知らされないようにし、ブライドで計測を行った。
虚血後肢の注射部位周辺におけるアルカリホスファターゼ(内皮細胞マーカー)染色により示されたように、コントロールベクターをトランスフェクトした後肢と比べeNOSベクターのトランスフェクションにより毛細血管密度が、トランスフェクションから4週間後に上昇した（図7、p<0.01）。これらの結果は、ウシNOSベクターの虚血後肢へのトランスフェクションが治療的血管新生を誘導し、末梢動脈性疾患処置に役立つ可能性を明確に示すものである。
アルカリホスファターゼを内皮細胞の特異的マーカーとして利用し、従来法（Morishitaら、Circulation 105: 1491-6 (2002);Leyenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92: 1137-41 (1995);Matsumotoら、J.Vasc.Surg. 27: 125-44 (1998)）に従いパラフィン埋没切片をアルカリホスファターゼ染色した。NOSベクターまたはコントロールベクターでトランスフェクトされた虚血右後肢の血管数を調べるためにラットを殺し、筋肉を得た。トランスフェクトした筋肉の真中部分の異なる3つの切片について分析を行った。光学顕微鏡下(倍率×100)で血管数をブライドで計測した。各切片中の血管総数を総計し、各切片当たりの数として表現した。各筋肉について少なくとも10の異なる切片を評価した。血管数を定量した領域は、注射部位及び注射部位の周辺からランダムに選択した。各動物に番号を振り、個々の動物がどのような処置を受けたか判らないようにして分析を行った。結果の再現性について評価した。同一観察者についての変数は、全ての切片について一人の観察者により行われた3回の測定により決定された。同一観察者により行われた測定の結果の平均±SD偏差は1.8±0.2％であった。異なる観察者間の変数は、10のランダムに選択された切片について第一及び第二の観察者により行われた測定の結果に基づいて決定された。二人の観察者間における測定値の数字上の差は2.1±0.8％であった。これらの観察者は、ラットの受けた処理等についてのデータと同様、もう一方の観察者による結果も知らされないようにし、ブライドで計測を行った。
虚血後肢の注射部位周辺におけるアルカリホスファターゼ(内皮細胞マーカー)染色により示されたように、コントロールベクターをトランスフェクトした後肢と比べeNOSベクターのトランスフェクションにより毛細血管密度が、トランスフェクションから4週間後に上昇した（図7、p<0.01）。これらの結果は、ウシNOSベクターの虚血後肢へのトランスフェクションが治療的血管新生を誘導し、末梢動脈性疾患処置に役立つ可能性を明確に示すものである。
[実施例７]VEGF蛋白質測定
最後に、NO誘導血管新生の機構を解明するため、VEGF蛋白質を測定した。
"naked"プラスミドとしてeNOSまたはコントロールベクターを後肢へトランスフェクションしてから1週間後にラットを殺した。組織試料を液体窒素中で迅速に凍結し、溶解バッファー中でホモジェナイズした。血管内のVEGF蛋白質濃度を抗VEGF抗体（1:100;Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA）を用いたウエスタンブロット法により測定した。蛋白質を定量し、その発現レベルを比較するために濃度計により各バンドの濃度を測った。抗チューブリン抗体(Calbiochem)を用いたチューブリンについてのウエスタンブロットにより、ロードした蛋白質量が等しいことを確認した。
図8に示されるよう、後肢中のラットVEGF165蛋白質をウエスタンブロットにより検出することができた。興味深いことに、eNOS遺伝子をトランスフェクトすることにより、トランスフェクションの1週間後にVEGF蛋白質の有意な増加が起こった（p<0.01）。それに対して、L-NAME投与は、完全にeNOS遺伝子移入により誘導されたVEGF蛋白質の増加を消失させたが、基底VEGF蛋白質はさらにL-NAME処置により減ることはなかった。
最後に、NO誘導血管新生の機構を解明するため、VEGF蛋白質を測定した。
"naked"プラスミドとしてeNOSまたはコントロールベクターを後肢へトランスフェクションしてから1週間後にラットを殺した。組織試料を液体窒素中で迅速に凍結し、溶解バッファー中でホモジェナイズした。血管内のVEGF蛋白質濃度を抗VEGF抗体（1:100;Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA）を用いたウエスタンブロット法により測定した。蛋白質を定量し、その発現レベルを比較するために濃度計により各バンドの濃度を測った。抗チューブリン抗体(Calbiochem)を用いたチューブリンについてのウエスタンブロットにより、ロードした蛋白質量が等しいことを確認した。
図8に示されるよう、後肢中のラットVEGF165蛋白質をウエスタンブロットにより検出することができた。興味深いことに、eNOS遺伝子をトランスフェクトすることにより、トランスフェクションの1週間後にVEGF蛋白質の有意な増加が起こった（p<0.01）。それに対して、L-NAME投与は、完全にeNOS遺伝子移入により誘導されたVEGF蛋白質の増加を消失させたが、基底VEGF蛋白質はさらにL-NAME処置により減ることはなかった。
Claims (1)
- ウシ構成的内皮型NOSをコードするcDNAが挿入された真核生物発現プラスミドを含有し、重症性肢虚血を処置または治療するために使用される、ネイキッドDNA医薬組成物。
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