CN1958075A

CN1958075A - 含腺伴随病毒介导的抗血管生成因子的组合物及其应用

Info

Publication number: CN1958075A
Application number: CNA2006101403471A
Authority: CN
Inventors: 林李家宓; 沈赞; 孔祥复
Original assignee: 林李家宓
Priority date: 2006-11-27
Filing date: 2006-11-27
Publication date: 2007-05-09
Also published as: WO2008064540A1

Abstract

本发明提供腺伴随病毒载体以及腺病毒载体介导的表达抗血管生成因子HGFK1的构建体AAV－HGFK1及Adv－HGFK1，本发明还提供含有构建体AAV－HGFK1与腺病毒载体介导表达抗癌基因、抑癌基因或细胞因子的构建体的组合物。本发明的构建体或组合物可用来治疗、控制或预防原发性癌症与转移性癌症。本发明还涉及所述的构建体或组合物在制备用于预防或治疗癌症的药物中用途。

Description

含腺伴随病毒介导的抗血管生成因子的组合物及其应用

发明领域

本发明涉及用于预防或治疗癌症的构建体或组合物，特别涉及腺伴随病毒载体或腺病毒载体介导的表达抗血管生成因子HGFK1的构建体AAV-HGFK1或Adv-HGFK1，以及含有构建体AAV-HGFK1与腺病毒载体或表达抗癌基因、抑癌基因或细胞因子基因的腺病毒载体的构建体的组合物。

技术背景

在实体肿瘤的生长、浸润和转移中，持续的血管生成是影响该进程的关键因素之一，因为新生血管为肿瘤细胞提供增殖所必需的营养物质、氧气及各种生长因子。

据此，Folkman在1971年首次提出抑制肿瘤的血管形成可作为治疗肿瘤的一种手段(Folkman J.et al.，J Exp Med，1971，133：275-88.)。临床前期研究显示系统地全身应用纯化的重组抗血管生成因子，如angiostatin和endostatin，能够抑制肿瘤的生长和转移(Hoffmann S.etal.，JCell Biochem，2006；98：954-65./Kurup A et al.，Ann Oncol，2006；17：97-103)。

HGFK1为人肝细胞生长因子的Kringle 1结构域(Kringle 1domain ofHGF，简称HGFK1)，包含HGF第127至214位氨基酸序列。HGFK1是最近发现的一种新的抗血管生成因子，体外实验证实重组HGFK1蛋白的抗血管生成的作用明显强于angiostatin(Xin L.et al.，Biochem Biophys Res Commun，2000；277：186-190)。

然而，重组抗血管生成因子在临床应用上存在一定的限制，例如静脉给药后，抗血管生成因子在体内的稳定时间只有数小时，而要达到抗肿瘤作用则需要在体内长期地保持有效浓度的抗血管生成因子。因此，如何长期保持抗血管生成因子在体内的有效浓度是其进入临床应用前亟待解决的问题。

基因治疗是解决这一问题的有效方法。自1990年首次进行对于人类疾病的基因治疗试验以来，基因疗法作为一种全新的医疗手段日益引起人们的重视，特别是那些不能用传统医疗手段彻底治愈的疾病，如糖尿病、癌症和艾滋病等。目前使用的基因治疗载体主要包括病毒和非病毒两类载体。一般来说，病毒类载体在表达强度和时空性方面比非病毒类载体更优越。

目前，在基因治疗中最常用的病毒载体为腺病毒载体。腺病毒(Adv)是一种DNA双链无包膜病毒，基因组DNA约长36kb，可编码14种蛋白。腺病毒载体也是一种理想的病毒类载体，初期使用的病毒株存在较强的免疫原性，有引起强烈的过敏反应的可能。令人鼓舞的是，近来Adv经过改良，其免疫原性已经大大降低。一般来说，目前的腺病毒载体的主要优点有：(1)性质稳定，能高效表达，对人类相对安全；(2)感染的宿主细胞范围广，可感染分裂期及静止期细胞；(3)腺病毒感染细胞时无需整合到宿主细胞基因组中，不存在激活致癌基因或插入突变等风险；(4)是缺陷型病毒，不能自主复制；(5)容易制备，重组病毒可通过静脉注射、喷雾、气管内滴注或制备成胶囊口服经肠道吸收等方法进入体内，可获得高效价病毒载体。

最近，也有人利用腺伴随病毒(adeno associated virus，AAV)作为表达载体来进行癌症、白血病和艾滋病的治疗研究，并取得了满意的结果(Buning H et al.，Curr Opin Mol Ther，2003；5：367-75)。但是，AAV存在产量低、辅助病毒污染及野生型AAV污染等缺陷。虽然目前对其上述缺陷进行了改进，但是同Adv比较，仍存在AAV对外源基因的传输与表达的效率不理想等问题。

面对如此之多的表达载体，选择出能够成功地与HGFK1基因重组形成构建体，其能够稳定高效表达，有效介导HGFK1在肿瘤组织中发挥抗血管生成作用，从而实现预防或治疗原发性癌症、转移性癌症和复发性癌症的目的，亟需进行深入的研究与探索。

此外，目前已知的抑癌基因、抗癌基因和细胞因子众多，在癌症的基因治疗中哪些基因或因子能够与抗血管生成因子联合应用，以及选择何种载体来表达这些因子，使它们能够发挥协同的预防或治疗癌症的作用，目前还没有相关的报道。

p53是一种抑癌基因表达的蛋白质产物，具有抑制细胞分裂、诱导细胞凋亡、上调多种抑癌基因和下调多种癌基因的活性，并有抑制血管内皮生长因子(VEGF)基因和多药抗药性(MDR)基因表达的作用(Sherr CJ，Cell，2004；116：235-46.)。Adv介导的p53(Adv-p53)已经应用于大量的临床病例，其安全性和有效性已经得到检验(Peng Z，HumGene Ther，2005，16(9)：1016-27)。

hTERTC27是我们研究组发现的一种抗癌基因，编码人端粒酶C端的一段分子量为27kDa的氨基酸序列，能够在肿瘤细胞内特异性地表达，具有肿瘤细胞特异性的细胞毒作用。它能引起肿瘤细胞的生长抑制和细胞凋亡，而对正常细胞则没有抑制和凋亡作用。体内试验证实hTERTC27能抑制肿瘤的形成和生长(Huang J.et al.，BiochemBiophys Res Commun，2003Feb 14；301：627-32./Huang J.et al.，CancerRes，2002Jun 1；62：3226-32.)。hTERTC27的研究成果已经申请美国专利(美国专利申请号No.10/449,565filed 30May 2003)。

细胞因子IL-2能够显著地增强T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞的免疫功能，又能诱导杀伤细胞LAK细胞和激活肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。IL-2与其它多种细胞因子之间有协同增强免疫功能的作用，因此IL-2具有显著的免疫增强及抗肿瘤作用(Waldmann TA，AnnuRev Med，2006；57：65-81)。

本发明人通过创造性的劳动，选择出能够与HGFK1联合应用的抑癌、抗癌或细胞因子，并利用不同的表达载体使其能够充分发挥协同的预防或治疗癌症作用。

发明内容

为了更有效地预防或治疗癌症，克服现有技术中肿瘤血管生长抑制剂作用时间短，效果不理想的缺陷，本发明提供了一种不仅能够抑制肿瘤血管生长而且能够抑制癌症细胞生长、转移的重组构建体。尤其是，发明人通过创造性劳动，选择了表达如p53的抑癌基因，如hTERT C27的抗癌基因或者如IL-2的细胞因子基因的构建体，与表达抗血管生成因子的构建体组成组合物，来发挥协同预防或治疗癌症作用。本发明的构建体与组合物不易降解，作用时间长，效果稳定，从而能够有效预防和/或治疗癌症的生长、浸润、转移以及复发。

本发明的第一个方面，提供一种预防或治疗癌症的构建体，其包含抗血管生成因子HGFK1的核酸序列与腺伴随病毒表达载体或腺病毒表达载体，并称为AAV-HGFK1或Adv-HGFK1，该HGFK1的核酸序列为SEQ ID NO：1或其同源序列。

本发明的第二个方面，提供预防或治疗癌症的组合物，其中包括有效剂量的：

第一构建体，其包含抗血管生成因子基因与腺伴随病毒表达载体；

腺病毒表达载体或第二构建体，所述第二构建体包括选自抑癌基因、抗癌基因和细胞因子或其组合和腺病毒表达载体。

本发明的第三方面，提供本发明的构建体或组合物在制备预防或治疗癌症药物中的用途，其中所述药物中包括预防或治疗有效剂量的所述构建体或组合物。

本发明的第四方面，提供HGFK1蛋白的特异性抗体。此抗体可以用于HGFK1蛋白的免疫组化染色和Western Blot检测。因此，所述抗体也可用于相关试剂盒的制备中。

本发明的第五方面，提供检测HGFK1蛋白或基因的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的HGFK1蛋白的特异性抗体，或检测HGFK1基因的探针或引物。

本发明的再一方面提供预防或治疗个体癌症的方法，包括对所述个体以预防或治疗有效剂量的本发明的构建体或组合物给药。

本发明中所使用的抗血管生成因子基因可选自angiostatin(血管他丁)、endostatin(内皮他丁)和人HGFK1基因。所述的抗血管生成因子基因优选为包含人HGFK1基因，其编码包含HGF第127至214位氨基酸序列，核酸序列为SEQ ID NO：1。

在本发明的一个实施方案中，所述抗血管生成因子HGFK1基因优选编码SEQ ID NO：5或其同源序列的氨基酸序列。

在本发明的优选实施方案中，所述抗血管生成因子HGFK1的氨基酸序列，除SEQ ID NO：5外，还含有6个组氨酸序列，即为SEQ IDNO：6的氨基酸序列。

本发明中所使用的抑癌基因优选为p53；抗癌基因优选hTERTC27；细胞因子则优选为IL-2的编码基因。

在本发明的一个实施方案中，所述组合物可以含任意的药物学上可接受的载体。

在本发明的一个实施方案中，所述的癌症为实体肿瘤，优选肝细胞癌、直肠结肠癌和神经胶质细胞，优选原发性及转移性肝癌。

本发明的构建体或组合物可用于预防或治疗原发性癌症、转移性癌症。优选治疗转移性癌症。

在本发明中，利用腺病毒或腺伴随病毒载体构建的表达HGFK1的构建体，与现有技术中采用普通载体的表达效果比较，能在体内持续、稳定表达抗血管生成基因HGFK1蛋白。尤其是，本发明的组合物中的含有抗血管生成的构建体与腺病毒表达载体或含抑制肿瘤细胞生长基因的腺病毒载体的构建体能够发挥协同作用，比单独使用含有抗血管生成的构建体的能够显著增强抑制肿瘤的效果。

附图说明

图1A所示为含有HGFK1基因的腺伴随病毒载体的构建体AAV-HGFK1。

图1B所示为包含p53，hTERTC27，HGFK1或IL-2基因的腺病毒载体(Adv)的构建体pAd-X的示意图，其中X为p53，hTERTC27，HGFK1或IL-2基因中的任何一个。

图2所示为腺病毒载体Adv显著增强腺伴随病毒AAV载体的构建体的转染效率的柱状图。腺病毒Adv显著增强腺伴随病毒AAV重组载体的转染效率达到10倍以上。图中所用简写Adv为腺病毒(Adenovirus)；LD-AAV-EGFP为低剂量(low dose)AAV-EGFP(MOI为1×10³)；HD-AAV-EGFP为高剂量(high dose)AAV-EGFP(MOI为1×10⁴)；EGFP为增强绿色荧光蛋白。

图3所示为AAV-HGFK1显著抑制肿瘤生长、转移、引起肿瘤细胞凋亡以及显著延长实验动物生存时间的基因治疗结果。图中缩写：PBS为PBS缓冲液；EGFP为增强绿色荧光蛋白。图3A所示为治疗后不同的时间点各组肝细胞癌动物模型的肿瘤体积。图3B所示为各组肝细胞癌模型动物死亡时腹水、肝内转移、肺转移、腹腔转移和原发肿瘤体积的病理解剖特点。图3C所示为治疗后21天时TUNEL染色分析各组肝细胞癌模型的肿瘤细胞凋亡情况，箭头所示为凋亡细胞。图3D所示为各组肝细胞癌模型的生存情况。^**表示与对照组相比较P值＜0.01。

图4所示为皮下种植人恶性神经胶质瘤的裸鼠模型的基因治疗的生存曲线。分成七组：Adv-hTERTC27、Adv-HGFK1或者AAV-HGFK1单独治疗组；AAV-HGFK1+Adv-hTERT C27的组合物或者AAV-HGFK1+Adv-IL-2的组合物治疗组；对照组为PBS或AAV-EGFP注射组。图中显示治疗后不同时间(天)，动物存活百分比的变化。^*表示Adv-hTERTC27、Adv-HGFK1或者AAV-HGFK1单独治疗组的生存时间比对照组显著延长，P值＜0.01；^**表示AAV-HGFK1+Adv-hTERTC27或者AAV-HGFK 1+Adv-IL-2的组合物治疗组的生存时间比Adv-hTERTC27、Adv-HGFK1或者AAV-HGFK1单独治疗组的生存时间显著延长，P值＜0.01。图中缩写：PBS为PBS缓冲液；Adv-C27为Adv-hTERTC27。

图5所示为大肠癌肝转移动物模型的基因治疗组合物的治疗结果。图5A所示为，AAV-HGFK1组、AAV-EGFP组、AAV-EGFP+Adv-p53组和AAV-HGFK1+Adv-p53组在不同时间的生存百分比；图5B所示为：AAV-HGFK1组、AAV-EGFP组、AAV-EGFP+Adv-p53组和AAV-HGFK1+Adv-p53组的生存时间、平均生存时间、以及肝转移和原发肿瘤发生的动物数量。^**表示AAV-HGFK1+Adv-p53治疗组比AAV-EGFP对照组的生存时间显著延长，P值＜0.01。图中缩写EGFP为增强绿色荧光蛋白。

图6所示为Buffalo大鼠原发性肝细胞癌的基因治疗组合物的生存曲线治疗结果。图中显示治疗后不同时间(天)，动物存活百分比的变化。图中缩写：PBS为PBS缓冲液；HD-AAV-HGFK1为高剂量AAV-HGFK1。

图7所示为毒性实验结果。图中缩写：ALT为谷丙转氨酶；AST为谷草转氨酶；TB为总胆红素；LDH为乳酸脱氢酶；CK为肌酸激酶；PBS为PBS缓冲液。

发明详述

定义

本发明所以用术语“人肝细胞生长因子Kringle 1结构域(HGFK1)”包括不改变其抑制细胞生长和血管生成功能的其保守氨基酸的替代变体。

本发明所用术语“严格杂交条件”指基因的杂交和洗涤条件，与该基因具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的核苷酸序列互补性时，仍能够与该基因杂交。该杂交条件是本领域公知，例如参见Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6；Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1982)，pp.387-389。

本发明所用术语基因的“同源序列”指与该基因具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的核苷酸序列一致性，而且基本上不影响所编码蛋白的功能。基因的同源序列也可以是该基因的片段，只要其编码的蛋白功能基本没有改变。

本发明所用术语氨基酸序列的“同源序列”指与该序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的氨基酸序列一致性，而且基本上不影响具有该氨基酸序列的蛋白的功能。

本发明所述术语“预防或治疗癌症”指所用构建体或组合物可以预防癌症的转移或复发，减轻、缓解、控制、改善或治愈原发性癌症或转移性癌症或其相关的症状；也可以延长癌症患者的寿命或活存时间，降低死亡率。

本发明所述术语“对照组”指由绿色荧光蛋白(EGFP)与腺伴随病毒载体(AAV)组成的构建体的给药组和/或施用PBS缓冲液组。

1.含有抗血管生成因子基因与腺伴随病毒载体的第一构建体

多种抗血管生成因子基因，例如，angiostatin和endostatin(Hoffmann S.et al.，J CellBiochem.2006；98：954-65；Kurup A et al.，Ann Oncol，2006；17：97-103)，以及HGFK1(Xin L.et al.，BiochemBiophys Res Commun，2000；277：186-190)基因的核酸序列，可用于本发明的构建体中。本发明优选的核酸序列为SEQ ID NO：1的HGFK1基因及其同源序列。该SEQ ID NO：1核酸序列编码HGF的第127至214位的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。所述HGFK1的核酸序列还包括在严格杂交条件下，与SEQ ID NO：1杂交的核酸序列或其同源序列。本发明所用的腺伴随病毒载体(adeno associated virus，AAV)，包括所有类型的AAV，例如AAV1，AAV2，AAV5，AAV8，AAV11，优选AAV2(Choi VW et al.Curr.Gene Ther.2005；5：299-310.)。本发明选择的AAV能够有效传输HGFK1基因的并提高表达效率。同时，由所述AAV，尤其是AAV2构建的表达本发明的HGFK1基因的构建体，能够在本发明的组合物中，与由腺病毒表达载体构建的构建体，发挥协同作用，显著提高治疗或预防癌症的效果。

根据分子生物学常规方法以及DNA重组技术，可获得抗血管生成因子基因序列，并与腺伴随病毒载体重组构成本发明的构建体。相关的文献与方法例如参见Sambrook et al(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，NY；Marston，F(1987)DNA Cloning Techniques：A Practical Approach Vol III IRL Press，Oxford UK；DNA Cloning：F M Ausubelet al，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.(1994)。

2.HGFK1基因的核酸序列与腺病毒载体的构建体

除用腺病毒载体替换腺伴随病毒载体外，根据本领域公知的常规方法和第一构建体的方法来构建含HGFK1基因与腺病毒载体的构建体。

用于构建的腺病毒载体包装系统包括，Adeno-X^TM包装系统、AdEasyTM包装系统、AdMax ^TM包装系统、Ad5/F35Max^TM包装系统、pAd/CMV/V5-DEST^TM包装系统等，优选pAd/CMV/V5-DEST^TM包装系统。本发明所选择的腺病毒表达载体，特别是pAd/CMV/V5-DEST^TM包装系统可有效传输HGFK1因子，并在单独与联合使用时均具有预防和治疗癌症的作用。例如，参见本发明的实施例所述。

3.含有抑癌基因、抗癌基因或细胞因子的核酸序列与腺病毒载体的第二构建体

能够用于构建第二构建体的外源基因，包括如p53的抑癌基因，如hTERT C27的抗癌基因或如IL-2的细胞因子基因的核酸序列。可将这些因子的基因与腺病毒载体组成第二构建体。在基因治疗中，这些含抑癌基因、抗癌基因或细胞因子与腺病毒载体的第二构建体与含有抗血管生成因子基因和腺伴随病毒载体的第一构建体联合应用，产生意想不到的预防或治疗癌症的效果。本发明用于第二构建体的外源基因优选p53、hTERT C27或IL-2的核酸序列。编码p53、hTERT C27和IL-2的基因分别具有SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4的核酸序列。

用于构建的腺病毒载体包装系统包括，Adeno-X^TM包装系统、AdEasyTM包装系统、AdMax ^TM包装系统、Ad5/F35Max^TM包装系统、pAd/CMV/V5-DEST^TM包装系统等，优选pAd/CMV/V5-DEST^TM包装系统。可通过上述2中的方法来构建含有抑癌基因、抗癌基因或细胞因子基因与腺病毒载体的构建体。

构建含外源基因与腺病毒载体的构建体的技术是本领域公知的，例如参见上述HGFK1基因与腺病毒载体的构建体的构建方法。

4.预防与治疗癌症的组合物

本发明的用于预防与治疗癌症的组合物包括预防或治疗有效剂量的含有抗血管生成因子基因与腺伴随病毒载体的第一构建体；腺病毒载体，或含有抑癌基因、抗癌基因或细胞因子与腺病毒载体的第二构建体；及任意地，药学上可接受的载体。

可使用常规的制药方法来制备适合的制剂从而对癌症患者进行本发明所述构建体或组合物的给药。可以采用任意适合的、例如非肠道的、静脉的、皮下的、肌肉的、颅内的、眶内的、眼的、心室内的、囊内的、脊柱内、脑池内、腹膜内的、鼻内的、气雾剂或口服给药方法。给药剂型可以是液体溶液或悬液；片剂或胶囊；粉末，滴鼻剂或气雾剂形式。

适合肠道外给药的组合物中包括无菌水性或非水性的本发明的组合物制剂，其优选与受者的血液等张。根据公知的方法使用适合的分散剂或润湿剂及悬浮剂作为药物载体来制备制剂。无菌的注射用制剂还可以是在非毒性肠道外可接受稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的载体和溶剂包括水、林格氏(Ringer′s)溶液及等张氯化钠溶液。此外，无菌不易挥发的油类可作为溶剂或悬浮介质常规使用。为实现此目的，可使用任何温和的非挥发油，包括合成的单或二甘油脂。此外，诸如油酸的脂肪酸可用于注射制剂中。

也可以采用生物匹配的、生物可降解的交酯聚合物、交酯/乙交酯聚合物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物来控制所述化合物的释放。其它潜在的用于调节本发明构建体或组合物的非肠道传递的系统包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的灌注系统以及脂质体。适于吸入的配方可包括药物载体，例如乳糖，或可以是含有例如聚氧乙烯-9-月桂酸酯、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或可以是以滴鼻剂形式给药的油状溶液或作为凝胶。

适合口服、皮下、静脉内、肌肉内等等给药的组方可参见Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA。

基于本发明构建体或组合物的“有效剂量”包括治疗有效剂量或预防有效剂量。“治疗有效剂量”是指在剂量上的有效剂量，并且在必需的时间阶段内，达到所需要的治疗结果，例如癌症细胞生长的抑制、病灶缩小、复发率降低、存活时间延长等等。根据诸如患者疾病状态、年龄、性别和体重的因素以及所述构建体或组合物在患者体内引起所需要反应的能力不同，所述构建体或组合物的治疗有效剂量也会发生变化。可对剂量方案进行调节从而提供最适的治疗反应。治疗有效剂量也可以是所述治疗有效效果超过了所述化合物的任意毒性或有害效果的量。“预防有效剂量”是指在剂量上的有效剂量，并且在必需的时间阶段内，达到所需要的预防结果，例如预防癌症的转移与复发。构建体或组合物的优选治疗或预防有效剂量范围可以是从MOI(感染复数)为1×10³至1×10⁶中的任意整数，例如，本发明的第一构建体的预防或治疗的有效剂量为4×10¹¹v.g/kg至1×10¹⁴v.g/kg；第二构建体的预防与治疗的有效剂量为；1×10¹⁰v.p/kg至1×10¹¹v.p/kg；Adv-HGFK1构建体的预防与治疗的有效剂量亦为；1×10¹⁰v.p/kg至1×10¹¹v.p/kg。本发明组合物的优选的有效剂量为AAV-HGFK1：4×10¹¹v.g/kg至1×10¹³v.g/kg；Adv-X：1×10¹⁰v.p/kg至1×10¹¹v.p/kg。

需要注意的是所述剂量可随欲被预防或治疗的癌症的的严重程度不同而变化。对任意具体的患者而言，可根据个体的需要对具体的剂量进行配置，并根据给药或监督给药的职业人员判断进行调节。在此设定的剂量范围仅仅是示例性的，而并非对医疗人员选定的剂量范围进行限制。根据诸如所述个体的疾病状态、年龄、性别和重量的因素，在所述组合物中的构建体的量可以改变。可对剂型进行调节从而提供最适的治疗效果。

5.本发明构建体或组合物效用

发明人通过研究发现，Adv载体系统与AAV载体系统同时应用能够显著增强AAV载体系统的效用达十倍以上(图2、图4)。为此，发明人设计了AAV-HGFK1和Adv(如Adv-p53、Adv-hTERTC27、Adv-IL-2或Adv本身)的组合物，并且将所述的组合物施用于原发性和转移性癌症模型，取得了令人鼓舞的效果。所述的组合物的治疗效果显著优于单独应用AAV-HGFK1，Adv-p53，Adv-hTERTC27或Adv-IL-2中任何一种的治疗效果。

在大鼠的原位肝细胞癌中，通过包括门静脉和肿瘤内注射的注射途径，用AAV-HGFK1进行预防与治疗。结果显示，AAV-HGFK1能引起肿瘤细胞的凋亡、坏死，明显延长肝细胞癌动物模型的生存时间(从对照组的平均30天到治疗组的49天)，以及完全抑制癌症的转移(图3)。

在大肠癌肝转移中，AAV-HGFK1以及AAV-EGFP+Adv-p53的治疗效果显著优于对照治疗组；而AAV-HGFK1+Adv-p53的组合物治疗组的平均生存时间显著长于AAV-HGFK1组以及AAV-EGFP+Adv-p53组，P值小于0.001；AAV-HGFK1+Adv-p53组合物的治疗甚至达到了完全治愈，使得实验动物长期无瘤生存的效果(图5)。

在人的恶性神经胶质瘤裸鼠模型中，通过包括肿瘤旁注射以及尾静脉注射的给药途径实施预防与治疗。Adv-hTERTC27，Adv-HGFK1和AAV-HGFK1单独施用将平均生存时间从28.3天分别延长至42.8、47.5和60.6天；而AAV-HGFK1+Adv-hTERTC27的组合物和AAV-HGFK1+Adv-IL-2的组合物的疗效更加显著：到治疗后80天时，施用AAV-HGFK1+Adv-hTERTC27的组合物的治疗组无一死亡，施用AAV-HGFK1+Adv-IL-2的组合物的治疗组仅有一列死亡(图4)。

鉴于以上的研究结果，可知本发明可涵盖其它的癌症。其依据如下：1、所选用的几种原发性和转移性癌症模型是癌症中的比较常见的类型，具有一定的代表性；2、所有的癌症的侵袭和转移都有赖于血管生成，而本发明能够提供持久的、高水平的抗血管生成的预防与治疗；3、本发明中所选用的抑癌基因具有广谱抗癌性；4、本发明的组合物可以预防癌症的复发和转移。

因此，本发明的构建体或组合物可用于预防或治疗实体肿瘤的生长、浸润、转移以及复发中。

6.毒性研究

本发明提供了检测AAV-HGFK1重组表达构建体以及Adv-p53和/或Adv-hTERTC27表达构建体组成的组合物对于机体的毒性的评价。我们施用高剂量的所述的组合物于实验动物，然后检测其血清中反映肝功能的指标：谷丙转氨酶、谷草转氨酶以及总胆红素；反映心肌有无损害的指标：乳酸脱氢酶、肌酸激酶以及Tn-T，未检测出肝功能和心肌受损害的迹象。另外，心肌组织的H&E染色也未发现明显损害。

7.HGFK1蛋白抗体的制备

使用标准技术制备方法(Harlow，E.，和Lane，D.(1988)Antiodies：a laboratory manual(抗体：实验室手册).Cold Spring Harbor，NY：ColdSpring Harbor Laboratory)或本领域公知的方法，可将本发明的构建体或其表达的蛋白用来制备针对本发明蛋白的抗体。

例如，可将本发明的构建体纯化至免疫动物例如兔子的必须程度。为了防止抗血清的低亲和性或低特异性的潜在问题，可对抗血管生成因子制备2或3种构建体，并将每种构建体注射到至少2只动物中。可通过一系列，优选为包括至少三次加强注射的注射来产生抗血清。可采用弗氏完全佐剂进行初次免疫，然后采用弗氏不完全佐剂进行加强免疫。可采用Western Blot和使用所述纯化蛋白的免疫沉淀分析对抗体滴度进行监测。可使用CNBr-葡聚糖偶联蛋白对免疫血清进行亲和纯化。可使用不相关的蛋白板测定抗血清的特异性。可选择地，或除此之外，可以产生对应于本发明抗血管生成因子相对唯一的免疫原性区域的多肽，并通过引入的C-末端赖氨酸与钥孔戚血蓝素(KLH)偶联。对这些多肽中每一种的抗血清都可通过轭合于BSA的多肽进行亲和纯化，使用多肽轭合物在ELISA和Western Blot并通过Western Blot和免疫沉淀测定特异性。

可选择地，可根据标准杂交瘤方法制备与本发明的抗血管生成因子特异性结合的单克隆抗体。一旦产生出来，可通过Western杂交或免疫沉淀对单克隆抗体的特异性识别进行测定。可认为那些与本发明所述因子结合的抗体是有用的；这样的抗体可用作，例如，免疫分析。

在一些实施方案中，可使用具有免疫原性的多肽片段，制备抗体。例如，使用从羧基末端至氨基末端方向的至少75％、至少50％、至少25％或至少5％的本发明的SEQ ID NO：5氨基酸序列作为免疫原性多肽片段进行免疫以产生抗体。本发明优选氨基酸序列RSY KGT VSI TKS GIKC(SEQ ID NO：7)作为HGFK1的免疫原。

8.试剂盒

本发明还涉及用于检测抗血管生成因子HGFK1蛋白或其基因的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的抗血管生成因子HGFK1蛋白的抗体，或根据抗血管生成因子HGFK1基因序列、优选根据SEQ ID NO：1或其同源序列设计的引物或探针。

在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒用于ELISA、West blot、免疫共沉淀等等的检测分析。在另一实施方案中，所述试剂盒用于Northern Blot、Southern Blot、PCR等等的检测分析。因此，在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒还包括指导检测的说明书和其它用于所述检测的常用试剂，例如标记试剂。

据此，本发明还涉及所述的抗血管生成因子HGFK1蛋白的抗体在制备所述试剂盒中的用途。

实施例

实施例1编码人HGFK1多肽的AAV表达载体的构建体

将人的HGFK1的cDNA(SEQ ID NO：1核酸序列)，插入已经预先用相同的内切酶消化过的pAM/CAG/EGR-1-pL-WPRE-BGH-polyA的AAV包装载体，构成AAV-HGFK1重组载体。再采用三载体辅助病毒缺陷包装系统(AAV、H22和pFD6)进行包装，即采用碳酸钙法将重组载体AAV-HGFK1和辅助质粒H22和pFD6共同转染HEK-293细胞，转染60-72小时后，收获细胞，分离出的重组病毒颗粒经HiTrap Heparin亲和层析纯化后，以实时(real-time)PCR确定其最终滴度。

体外以AAV-HGFK1感染小鼠微血管内皮细胞及大鼠肝细胞癌细胞后，用免疫组化方法对感染的细胞进行染色。结果显示，HGFK1能在细胞浆内高表达。将培养感染后细胞的培养液浓缩后，用WesternBlot方法对浓缩物的检测结果显示，该培养液中存在HGFK1，表明HGFK1能被分泌到细胞外。

经Balb/C小鼠的尾静脉注射AAV-HGFK1重组病毒后，收集该小鼠的血清并浓缩。以Western Blot方法对浓缩血清进行检测发现了HGFK1在血清中的存在，表明HGFK1被表达并分泌入血。在Buffalo大鼠门静脉注射AAV-HGFK1重组病毒后，以Western Blot方法同样在该大鼠的浓缩血清中检测到HGFK1的表达。利用免疫组化方法也检测到大鼠肝细胞内有HGFK1高表达。

实施例2编码p53，hTERTC27、IL-2或HGFK1基因的腺病毒载体(Adv)的构建体pAd-X

本发明提供编码人p53，hTERTC27、IL-2或HGFK1基因的重组缺陷型腺病毒表达载体的构建体的制备、包装方法，包括以下步骤：将人p53基因，hTERTC27基因、IL-2基因或HGFK1基因分别连接到穿梭质粒pENTR^TM2B中，然后将重组的穿梭质粒pENTR-p53，pENTR-hTERTC27、pENTR-IL-2或pENTR-HGFK 1以及pAd/CMV/V5-DEST通过同源重组得到表达载体pAd-p53，pAd-hTERTC27、pAd-IL-2或pAD-HGFK1，将所得表达载体用Lipofectamine^TM 2000Reagent(Invitrogen)分别转染293A细胞，裂解细胞、过氯化铯柱浓缩、纯化。将纯化的携带人p53，hTERTC27、IL-2或HGFK1基因的重组腺病毒(Adv-p53，Adv-hTERTC27、Adv-IL-2或Adv-HGFK1)转染兔颈动脉，并用携带LacZ报告基因的重组腺病毒(Adv-LacZ)作为对照，3天后RT-PCR、ELISA法检测人p53，hTERTC27或IL-2基因mRNA、蛋白的表达。结果得到了滴度高于3×10¹⁰pfu/ml的分别携带人p53基因，hTERTC27基因和IL-2基因的重组腺病毒Adv-p53，Adv-hTERTC27和Adv-IL-2(图1B)。

实施例3试验模型的建立

(1)肝细胞癌动物模型

用大鼠的肝细胞癌细胞株McA-RH-7777细胞通过手术注射于Buffalo大鼠的肝左叶包膜下(1×10⁶个细胞/只，一次性注射)。7天以后通过手术打开大鼠腹腔观察，可见肝左叶表面有一个3×3mm²的肿瘤组织，即确认模型建立。

(2)大肠癌肝转移模型

采用小鼠的大肠癌细胞株CT26细胞注射于BALB/c小鼠的脾脏内(5×10⁵/只，一次性注射)。十天后取12只小鼠，通过手术发现每只鼠的肝脏均有多个大小不一的肿瘤灶，即确认出现肝转移。因此可以说明此方法建立肝转移模型的成功率为100％。

(3)神经胶质细胞瘤动物模型

采用人神经胶质瘤细胞株U87细胞(5×10⁶/只，一次性注射)种植于裸鼠皮下。7天后可见注射部位有一约5×5mm²的隆起，即确认成瘤。

实施例4对原发性肝细胞癌的治疗作用

按照实施例3中所述建立原发性肝细胞癌模型。

大鼠的肝细胞癌模型建立以后，即确认成瘤后，立即开始治疗，随机分为三组，每组六只：1、PBS缓冲液组；2、AAV-EGFP组(1.2×10¹²v.g./只)；3、AAV-HGFK1组(1.2×10¹²v.g./只)。其中PBS组和AAV-EGFP组作为对照组，AAV-HGFK1作为治疗组。注射途径包括门静脉和肿瘤内注射两种，其中肿瘤内的注射剂量为0.2×10¹²v.g./只，门静脉内的注射剂量为1×10¹²v.g./只，均为确认肿瘤模型建立以后即时一次性注射。

试验结果如图3所示。

图3A示出了治疗后不同的时间点各组肝细胞癌动物模型的肿瘤体积。第7天以及第14天时治疗组(AAV-HGFK1注射)和对照组(PBS或AAV-EGFP注射)的肿瘤体积无明显差别(P＞0.05)，而治疗后第21天时治疗组的肿瘤体积明显小于对照组(P＜0.01)。

图3B显示了各组肝细胞癌模型动物死亡时的病理解剖特点其中对腹水、肝内转移、肺转移、腹腔转移以及原发性肿瘤体积进行观察。结果显示，腹水：两个对照组的各6只动物都有腹水(100％)，而治疗组只有2只有腹水(33％)；肝内转移：两个对照组的各6只动物都有肝内转移(100％)，而治疗组所有动物都未见肝内转移；肺转移：PBS对照组有5只有肺转移(83.3％)，AAV-EGFP对照组6只都有肺转移(100％)，而治疗组所有动物未见肺转移；腹腔转移：两个对照组的各6只动物都有腹腔转移(100％)，而治疗组所有动物都未见腹腔转移。原发肿瘤体积：治疗组明显小于对照组(P＜0.05)。

图3C示出了治疗后21天时TUNEL染色分析各组肝细胞癌模型的肿瘤细胞凋亡情况。箭头所示为凋亡细胞。治疗组的肿瘤细胞凋亡指数显著低于两个对照组(P＜0.01)。

图3D则示出了各组肝细胞癌模型的生存情况。AAV-HGFK1治疗组的平均生存时间(49天)显著长于两对照组的平均生存时间(均为30天)。

上述结果显示，用AAV-HGFK1治疗能引起肿瘤细胞的凋亡、坏死，明显延长肝细胞癌动物模型的生存时间(从对照组的平均30天到治疗组的49天)，以及完全抑制癌症的转移。这说明AAV-HGFK1显著抑制肿瘤生长、转移、引起肿瘤细胞凋亡以及显著延长实验动物生存时间。

实施例5对神经胶质细胞瘤的预防或治疗作用

按照实施例3中所述建立人的恶性神经胶质瘤裸鼠模型。

模型建立后，随机分成七组，每组六只：

1、PBS缓冲液组；

2、AAV-EGFP组(1.5×10¹¹vg/只)；

3、AAV-HGFK1组(1.5×10¹¹vg/只)；

4、Adv-HGFK1组(2.5×10⁹vp/只)；

5、Adv-IL-2+AAV-HGFK1组(1.5×10¹¹vg/只+2.5×10⁹vp/只)；

6、Adv-hTERTC27组(2.5×10⁹vp/只)；

7、Adv-hTERTC27+AAV-HGFK1组(1.5×10¹¹vg/只+2.5×10⁹vp/只)。

确认成瘤后立即给药，给药途径为肿瘤旁注射以及尾静脉注射，均为一次性注射。

试验结果如图4所示。Adv-hTERTC27，Adv-HGFK1，AAV-HGFK1单独施用将平均生存时间从28.3天分别延长至42.8，47.5和60.6天(^*表示与AAV-EGFP对照组相比Adv-hTERTC27，Adv-HGFK1，AAV-HGFK1三个治疗组的生存时间显著延长，P＜0.01)；而AAV-HGFK1+Adv-hTERTC27的组合物和AAV-HGFK1+Adv-IL-2的组合物的疗效更加显著(^**表示AAV-HGFK1+Adv-hTERTC27和AAV-HGFK1+Adv-IL-2的组合物治疗组的生成时间比Adv-hTERTC27，Adv-HGFK1，AAV-HGFK1单独施用的治疗组的生存时间显著延长，P＜0.01)，到治疗后80天时，施用AAV-HGFK1+Adv-hTERTC27的组合物的治疗组无一死亡，施用AAV-HGFK1+Adv-IL-2的组合物的治疗组仅有一列死亡。

实施例6对大肠癌肝转移的预防或治疗作用

按照实施例3中所述建立大肠癌肝转移模型。

小鼠出现大肠癌肝转移后，随机分为四组，每组六只：

1、AAV-EGFP组(1.5×10¹¹vg/只)；

2、AAV-HGFK1组(1.5×10¹¹vg/只)；

3、AAV-EGFP+Ad-P53(1.5×10¹¹vg/只+2.5×10⁹vp/只)；

4、AAV-HGFK1+Ad-P53(1.5×10¹¹vg/只+2.5×10⁹vp/只)。

立即给于治疗，动物的给药方法为尾静脉内一次性注射。试验结果如图5所示。

图5A显示，大肠癌肝转移的动物模型中，AAV-HGFK1组以及AAV-EGFP+Adv-p53组的治疗效果显著优于AAV-EGFP治疗组；而AAV-HGFK1+Adv-p53的组合物治疗组的平均生存时间又显著长于AAV-HGFK1组和AAV-EGFP+Adv-p53组，P值小于0.001。图5B示显示，AAV-HGFK1+Adv-p53治疗组的平均生存时间超过61天，而其它各组的平均生存时间为AAV-EGFP组21天、AAV-HGFK1组30天、AAV-EGFP+Adv-p53组30天。此动物模型中，AAV-HGFK1+Adv-p53的组合物治疗组的六只动物中有一只达到长期无瘤生存；而且肝转移肿瘤全部消除，部分原发肿瘤消除。

上述结果表明，AAV-HGFK1组以及AAV-EGFP+Adv-p53组的治疗效果显著优于AAV-EGFP治疗组；而AAV-HGFK1+Adv-p53的组合物治疗组的平均生存时间显著长于AAV-HGFK1组以及AAV-EGFP+Adv-p53组，P值小于0.001；AAV-HGFK1+Adv-p53组合物的治疗甚至达到了完全治愈，使得实验动物长期无瘤生存的效果。

实施例7组合物对原发性肝细胞癌的治疗效果

在Buffalo大鼠的肝脏上建立原位的肝细胞癌模型，同实施例3中的肝细胞癌动物模型。模型建立以后，随机分为五组：

1、PBS缓冲液作为对照组；

2、Adv-p53(2.5×10⁹vp/只)；

3、AAV-HGFK1(3×10¹¹vg/只)；

4、高剂量AAV-HGFK1(3×10¹²vg/只)；

5、AAV-HGFK1+Adv-p53的组合物(AAV-HGFK1为3×10¹¹vg/只；Adv-p53为2.5×10⁹vp/只)。

确认成瘤后立即给药。给药途径包括门静脉和肿瘤内注射两种，均为一次性注射。试验结果如图6所示。

结果表明，与对照组相比较，AAV-HGFK1+Adv-p53的组合物能够将平均生存时间从30天延长到61天，甚至超过用10倍的高剂量AAV-HGFK1(3×10¹²vg/只)来治疗的53天。单用Adv-p53治疗组的平均生存时间为37天。AAV-HGFK1(3×10¹¹vg/只)治疗组的平均生存时间为39天。

实施例8毒性试验

本发明提供了检测AAV-HGFK1重组表达构建体以及Adv-p53、Adv-hTERTC27组成的组合物对于机体的毒性的评价试验。对实验动物施用高剂量的所述的组合物。

取成年雄性Buffalo大鼠12只，随机分为四组，每组3只：

1.PBS缓冲液注射组，作为对照；

2.AAV-HGFK1(4.8×10¹²Vg/只)注射组；

3.AAV-HGFK1+Adv-p53(4.8×10¹²vg/只+1×10¹⁰vp/只)注射组；

4.AAV-HGFK1+Adv-hTERTC27(4.8×10¹²vg/只+1×10¹⁰vp/只)注射组。

给药方法为门静脉注射以及肝脏内注射，均为一次性注射，肝脏内注射剂量为门静脉注射剂量的三分之一。试验结果如图7所示。

在给药后第7天和第60天分别检测其血清中反映肝功能的指标：谷丙转氨酶、谷草转氨酶以及总胆红素，结果未发现有肝功能受损害的迹象(图7A)。

近来有报道称肿瘤的抗血管生成治疗能造成心肌损害，因此我们还通过常规方法检测了反映心肌有无损害的指标：乳酸脱氢酶、肌酸激酶以及Tn-T。前两项在正常范围内，TnT也属正常(痕量，测不出)。这些都表明心肌无受损害的迹象(图7B)。给药后120天取心肌组织，做H&E染色也未发现明显损害(图7C)。

并且，所有受试的动物模型中都未见因为免疫反应而死亡的现象。

实施例9HGFK1蛋白抗体的制备

材料与试剂

1).合成多肽：RSY KGT VSI TKS GIKC，其序列与HGFK1羧基末端的氨基酸序列一致

2).弗氏完全佐剂

3).青霉素和链霉素

4).实验动物：兔

5).其它材料及试剂

操作方法

1).免疫方法

采用淋巴结注射法：①在兔的两后足跖部皮下(或皮内)注射活卡介苗50mg(每侧约0.30ml)。7～10天后，兔跖及腘肌淋巴结肿大；②于肿大的两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的所述的合成多肽乳化液0.50ml(含合成多肽5mg/ml、青霉素1000U/ml、链霉素1000μg/ml)；③必要时，14天后，重复步骤②一次；④再过7天后，于两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的所述的合成多肽乳化液0.50ml(含合成多肽5mg/ml、青霉素1000U/ml、链霉素1000μg/ml)；⑤5～7天后，耳静脉采血。测定血清效价。

2).效价测定采用琼脂扩散法。

(1)将血清倍比稀释，加入外周孔。

(2)中间孔加所述的合成多肽。

(3)37℃湿盒琼扩24小时，观察结果。

结果判定

抗HGFK1抗体的效价测定琼脂扩散效价达1∶16或1∶32者为合格。

虽然本发明已通过上述详细描述和具体实施方式进行了说明，但本发明并不受此限制。本领域技术人员可根据本申请的公开结合公知常识对本发明的方案进行等同修饰和变换，它们都应属于本发明的范围。

SEQUENCE LISTING

<110>林李家宓

<120>含腺伴随病毒介导的抗血管生成因子的组合物及其应用

<130>06F1109-HXN

<160>7

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>270

<212>DNA

<213>HGFK1 cDNA

<400>1

atgaactgca tcattggtaa aggacgcagc tacaagggaa cagtatctat cactaagagt 60

ggcatcaaat gtcagccctg gagttccatg ataccacacg aacacagctt tttgccttcg 120

agctatcggg gtaaagacct acaggaaaac tactgtcgaa atcctcgagg ggaagaaggg 180

ggaccctggt gtttcacaag caatccagag gtacgctacg aagtctgtga cattcctcag 240

tgttcagaag ttgaatgcat gacctgctaa 270

<210>2

<211>2508

<212>DNA

<213>p53 cDNA

<400>2

ccagggagca ggtagctgct gggctccggg gacactttgc gttcgggctg ggagcgtgct 60

ttccacgacg gtgacacgct tccctggatt ggcagccaga ctgccttccg ggtcactgcc 120

atggaggagc cgcagtcaga tcctagcgtc gagccccctc tgagtcagga aacattttca 180

gacctatgga aactacttcc tgaaaacaac gttctgtccc ccttgccgtc ccaagcaatg 240

gatgatttga tgctgtcccc ggacgatatt gaacaatggt tcactgaaga cccaggtcca 300

gatgaagctc ccagaatgcc agaggctgct ccccgcgtgg cccctgcacc agcagctcct 360

acaccggcgg cccctgcacc agccccctcc tggcccctgt catcttctgt cccttcccag 420

aaaacctacc agggcagcta cggtttccgt ctgggcttct tgcattctgg gacagccaag 480

tctgtgactt gcacgtactc ccctgccctc aacaagatgt tttgccaact ggccaagacc 540

tgccctgtgc agctgtgggt tgattccaca cccccgcccg gcacccgcgt ccgcgccatg 600

gccatctaca agcagtcaca gcacatgacg gaggttgtga ggcgctgccc ccaccatgag 660

cgctgctcag atagcgatgg tctggcccct cctcagcatc ttatccgagt ggaaggaaat 720

ttgcgtgtgg agtatttgga tgacagaaac acttttcgac atagtgtggt ggtgccctat 780

gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact acaactacat gtgtaacagt 840

tcctgcatgg gcggcatgaa ccggaggccc atcctcacca tcatcacact ggaagactcc 900

agtggtaatc tactgggacg gaacagcttt gaggtgcgtg tttgtgcctg tgctgggaga 960

gaccggcgca cagaggaaga gaatctccgc aagaaagggg agcctcacca cgagctgccc 1020

ccagggagca ctaagcgagc actgcccaac aacaccagct cctctcccca gccaaagaag 1080

aaaccactgg atggagaata tttcaccctt cagatccgtg ggcgtgagcg cttcgagatg 1140

ttccgagagc tgaatgaggc cttggaactc aaggatgccc aggctgggaa ggagccaggg 1200

gggagcaggg ctcactccag ccacctgaag tccaaaaagg gtcagtctac ctcccgccat 1260

aaaaaactca tgttcaagac agaagggcct gactcagact gacattctcc acttcttgtt 1320

ccccactgac agcctcccac ccccatctct ccctcccctg ccattttggg ttttgggtct 1380

ttgaaccctt gcttgcaata ggtgtgcgtc agaagcaccc aggacttcca tttgctttgt 1440

cccggggctc cactgaacaa gttggcctgc actggtgttt tgttgtgggg aggaggatgg 1500

ggagtaggac ataccagctt agattttaag gtttttactg tgagggatgt ttgggagatg 1560

taagaaatgt tcttgcagtt aagggttagt ttacaatcag ccacattcta ggtaggggcc 1620

cacttcaccg tactaaccag ggaagctgtc cctcactgtt gaattttctc taacttcaag 1680

gcccatatct gtgaaatgct ggcatttgca cctacctcac agagtgcatt gtgagggtta 1740

atgaaataat gtacatctgg ccttgaaacc accttttatt acatggggtc tagaacttga 1800

cccccttgag ggtgcttgtt ccctctccct gttggtcggt gggttggtag tttctacagt 1860

tgggcagctg gttaggtaga gggagttgtc aagtctctgc tggcccagcc aaaccctgtc 1920

tgacaacctc ttggtgaacc ttagtaccta aaaggaaatc tcaccccatc ccacaccctg 1980

gaggatttca tctcttgtat atgatgatct ggatccacca agacttgttt tatgctcagg 2040

gtcaatttct tttttctttt tttttttttt tttctttttc tttgagactg ggtctcgctt 2100

tgttgcccag gctggagtgg agtggcgtga tcttggctta ctgcagcctt tgcctccccg 2160

gctcgagcag tcctgcctca gcctccggag tagctgggac cacaggttca tgccaccatg 2220

gccagccaac ttttgcatgt tttgtagaga tggggtctca cagtgttgcc caggctggtc 2280

tcaaactcct gggctcaggc gatccacctg tctcagcctc ccagagtgct gggattacaa 2340

ttgtgagcca ccacgtccag ctggaagggt caacatcttt tacattctgc aagcacatct 2400

gcattttcac cccacccttc ccctccttct ccctttttat atcccatttt tatatcgatc 2460

tcttatttta caataaaact ttgctgccaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2508

<210>3

<211>696

<212>DNA

<213>hTERT C27 cDNA

<400>3

atgacagtgg tgaacttccc tgtagaagac gaggccctgg gtggcacggc ttttgttcag 60

atgccggccc acggcctatt cccctggtgc ggcctgctgc tggatacccg gaccctggag 120

gtgcagagcg actactccag ctatgcccgg acctccatca gagccagtct caccttcaac 180

cgcggcttca aggctgggag gaacatgcgt cgcaaactct ttggggtctt gcggctgaag 240

tgtcacagcc tgtttctgga tttgcaggtg aacagcctcc agacggtgtg caccaacatc 300

tacaagatcc tcctgctgca ggcgtacagg tttcacgcat gtgtgctgca gctcccattt 360

catcagcaag tttggaagaa ccccacattt ttcctgcgcg tcatctctga cacggcctcc 420

ctctgctact ccatcctgaa agccaagaac gcagggatgt cgctgggggc caagggcgcc 480

gccggccctc tgccctccga ggccgtgcag tggctgtgcc accaagcatt cctgctcaag 540

ctgactcgac accgtgtcac ctacgtgcca ctcctggggt cactcaggac agcccagacg 600

cagctgagtc ggaagctccc ggggacgacg ctgactgccc tggaggccgc agccaacccg 660

gcactgccct cagacttcaa gaccatcctg gactga 696

<210>4

<211>462

<212>DNA

<213>IL-2cDNA

<400>4

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60

gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 120

ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 180

acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 240

gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 300

agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 360

acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 420

tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactgactt ga 462

<210>5

<211>88

<212>PRT

<213>HGFK1 protein

<400>5

Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile

1 5 10 15

Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His

20 25 30

Glu His Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn

35 40 45

Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu

50 55 60

Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys

65 70 75 80

Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr

85

<210>6

<211>94

<212>PRT

<213>HGFK1 protein containing 6 histidines

<400>6

Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile

1 5 10 15

Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His

20 25 30

Glu His Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn

35 40 45

Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu

50 55 60

Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys

65 70 75 80

Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr His His His His His His

85 90

<210>7

<211>16

<212>PRT

<213>HGFK1 polypeptide fragment

<400>7

Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys

1 5 10 15

Claims

1.用于预防或治疗癌症的构建体，所述构建体含有编码人抗血管生成因子HGFK1的基因与腺病毒表达载体，其中所述抗血管生成因子HGFK1基因的核酸序列为SEQ ID NO：1的核酸序列或其同源序列。

2.用于预防或治疗癌症的构建体，所述构建体含有编码抗血管生成因子HGFK1基因与腺伴随病毒表达载体，其中所述抗血管生成因子HGFK1基因的核酸序列为SEQ ID NO：1的核酸序列及其同源序列。

3.用于预防或治疗癌症的组合物，所述组合物包括有效剂量的：

第一构建体，其含有编码抗血管生成因子的基因与腺伴随病毒表达载体；以及

腺病毒表达载体或第二构建体，所述第二构建体包含选自抑癌基因、抗癌基因和细胞因子的基因或其组合的基因与腺病毒表达载体。

4.如权利要求3所述的组合物，其中所述抗血管生成因子基因选自具有SEQ ID NO：1核酸序列的人抗血管生成因子HGFK1核酸序列或其同源序列。

5.如权利要求3或4所述的组合物，其中所述抗血管生成因子基因编码选自具有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6及其同源序列的氨基酸序列的人抗血管生成因子HGFK1。

6.如权利要求3-5中任一权利要求所述的组合物，其中所述腺伴随病毒表达载体为AAV。

7.如权利要求3-6中任一权利要求所述的组合物，其中所述抑癌基因选自核酸序列为SEQ ID NO：2的p53基因及其同源序列。

8.如权利要求3-7中任一权利要求所述的组合物，其中所述抗癌基因选自核酸序列为SEQ ID NO：3的hTERT C27基因及其同源序列。

9.如权利要求3-8中任一权利要求所述的组合物，其中所述细胞因子基因选自核酸序列为SEQ ID NO：4的IL-2基因及其同源序列。

10.权利要求3-9中任一权利要求所述组合物在制备用于预防或治疗癌症药物中的用途，所述癌症为实体肿瘤。

11.如权利要求10所述用途，其中所述癌症选自肝细胞癌、直肠结肠癌和神经胶质细胞癌。

12.如权利要求10或11所述的用途，其中所述癌症为原发性癌症或转移性癌症。

13.权利要求1中所述的构建体Adv-HGFK1在制备用于治疗癌症以及预防癌症复发和转移的药物中的用途。

14.权利要求2中所述的构建体AAV-HGFK1在制备用于治疗癌症以及预防癌症复发和转移的药物中的用途。

15.如权利要求13和14所述用途，其中所述癌症选自肝细胞癌、直肠结肠癌和神经胶质细胞癌。

16.由选自抗血管生成因子HGFK1及其免疫原性片段的多肽产生的抗所述抗血管生成因子HGFK1的抗体。