ES2274781T3 - Empleo diagnostico y terapeutico de anticuerpos contra el receptor de la urocinasa. - Google Patents

Empleo diagnostico y terapeutico de anticuerpos contra el receptor de la urocinasa. Download PDF

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Abstract

Utilización de un anticuerpo, que está dirigido contra el epítopo 52-60 del receptor de la urocinasa (uPAR) y que se fija a un uPAR expresado por células tumorales con una afinidad por lo menos comparable con la de un uPAR expresado por células normales, o de un fragmento de éste que se fija a un antígeno, para la preparación de un agente de diagnóstico dirigido contra un uPAR en células tumorales para la elaboración de un pronóstico de la evolución en el caso de enfermedades malignas.

Description

Empleo diagnóstico y terapéutico de anticuerpos contra el receptor de la urocinasa.
El invento se refiere a la utilización de un anticuerpo, a polipéptidos recombinantes con propiedades de anticuerpo, así como a los ácidos nucleicos recombinantes que los codifican.
La detección fiable de células tumorales esparcidas y dispersas, que se han desprendido de la asociación tisular sólida, (micrometastásis), es de gran importancia para el diagnóstico y la terapia de tumores. En el transcurso de los pasados años se han desarrollado, por lo tanto, diferentes procedimientos, a fin de detectar tales células tumorales dispersas individuales en líquidos corporales o en muestras de tejidos. La detección se puede efectuar p.ej. mediante una marcación selectiva de las células infrecuentes por medio de métodos inmunocitoquímicos, empleándose con frecuencia grupos enzimáticos de marcación, tales como una fosfatasa alcalina. También se conocen técnicas de doble marcación.
La publicación de Schlimok y colaboradores (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 8.672-8.676) describe la detección de células tumorales micrometastásicas en una médula ósea mediante una técnica de doble marcación, utilizándose un anticuerpo contra citoqueratina 18 específico para células de origen epidérmico y un anticuerpo contra leucocitos. En este caso se emplean una fosfatasa alcalina y un grupo radiactivo de marcación (^{125}I). Puesto que la utilización de grupos radiactivos de marcación está vinculado con desventajas, este método no es adecuado para la práctica clínica.
Funke y colaboradores (Int. J. Cancer 65 (1996), 755-761) describen la detección de micrometástasis en una médula ósea por medio de una técnica de doble marcación mediando utilización de un anticuerpo contra citoqueratina 18 y de un anticuerpo para cadherina E. Los dos anticuerpos son detectados a través de una fosfatasa alcalina como grupo de marcación enzimático y de dos substratos cromógenos teñidos de manera diferente. La detección secuencial de los dos anticuerpos por medio de substratos cromógenos diferentes es, sin embargo, complicada y, por lo tanto, poco apropiada para la práctica clínica.
Heiss y colaboradores (Heiss y colaboradores, Nature Med. 1 (1995), 1.035-1.039 y Allgayer y colaboradores, J. Histochem. Cytochem 45 (1997), 203-212) detectan células tumorales dispersas en una médula ósea a través de un método de doble marcación, que se basa en la detección simultánea de citoqueratina 18 y del receptor de uPA (uPAR). Para ello, células inmovilizadas, fijadas a un portaobjetos, se incuban con un anticuerpo biotinilado, específico para citoqueratina, y a continuación se incuban con un conjugado a base de una fosfatasa alcalina y de estreptavidina. Por medio de la fosfatasa alcalina inmovilizada y de un substrato cromógeno, se lleva a cabo una reacción cromática enzimática, resultando una tinción de color rojo oscuro. Adicionalmente, se emplea un anticuerpo monoclonal dirigido contra el uPAR, que se marca con un anticuerpo secundario conjugado con oro, y a continuación se somete a una reacción de refuerzo con plata, resultando una tinción de color negro. Los portaobjetos se escrutan entonces en cuanto a las tinciones (roja oscura / negra), manual y visualmente bajo el microscopio, siendo extremadamente difícil detectar una tinción doble.
Todd y colaboradores ("CD87 Workshop Panel report" [Informe de equipo de taller de CD87] (páginas 1.016-1.020) en "Leucocyte Typing VI" [Tipificación VI de leucocitos], coordinadores de edición T. Kishimoto y colaboradores, 1997, Garland Publishing, Inc.) describen el anticuerpo IIIF10, que está dirigido contra el epítopo 52-60 del receptor de la urocinasa (uPAR), sin divulgar no obstante su secuencia polipeptídica ni tampoco la secuencia de ácido nucleico que la codifica.
La misión que se presenta como fundamento del presente invento consistió en poner a disposición un agente de diagnóstico para la elaboración de un pronóstico de la evolución en el caso de enfermedades malignas.
Un procedimiento para la detección de células en una muestra biológica puede comprender las siguientes etapas:
(a)
puesta disposición de una muestra que se ha de ensayar,
(b)
puesta en contacto de la muestra con por lo menos dos diferentes moléculas de fijación, que reconocen a las células que se han de detectar, siendo marcadas las moléculas de fijación con colorantes fluorescentes respectivamente diferentes, y
(c)
determinación de las marcaciones fluorescentes en la muestra fijada sobre una fase sólida.
El procedimiento es apropiado para la detección de células que se presentan infrecuentemente en una muestra biológica fijada. El concepto de que "se presentan infrecuentemente" significa, en este caso, que la frecuencia esperada de las células que se han de detectar se sitúa en el intervalo de 1 : 10^{4} hasta 1 : 10^{7} de todas las células que están presentes en la muestra que se ha de ensayar. Ejemplos de tales células que se presentan infrecuentemente, son células tumorales en una muestra de sangre o de médula ósea. En el caso de una correspondiente elección de determinantes específicos para células y de moléculas de fijación dirigidas contra ellos, se pueden detectar, por supuesto, también otros tipos de células que se presentan infrecuentemente.
El procedimiento hace posible, basándose en la técnica de tinción por fluorescencia doble, una identificación rápida y exacta de las células que se han de detectar. Además, en el caso de la utilización de diferentes marcaciones fluorescentes, preferiblemente detectables una junta a otra, se pueden analizar antígenos localizados concomitantemente en, así como sobre, la célula (tales como p.ej. citoqueratina 8/18, p53, PAI-2 y en particular el receptor de la urocinasa uPAR). Esto ha sido muy difícil hasta ahora con métodos conocidos, en particular en el caso de muestras de tejidos tales como materiales aspirados de médula ósea. Una gran ventaja adicional del método que se acaba de desarrollar es la posibilidad de determinar cuantitativamente el número y la intensidad de células fluorescentes, por ejemplo, con un microscopio confocal de barrido con láser.
La etapa (a) del procedimiento comprende la puesta a disposición de una muestra biológica que se ha de ensayar. Para ello, se extrae una muestra del paciente, p.ej. a partir de un líquido corporal, tal como ilustrativamente sangre, o a partir de un tejido, tal como ilustrativamente médula ósea. De manera especialmente preferida, el procedimiento se utiliza para la detección de células tumorales dispersas de origen epidérmico en una médula ósea. En este caso, se puede extraer la médula ósea desde el hueso de la cresta ilíaca. En la muestra se enriquecen entonces preferiblemente células mononucleares, inclusive células tumorales. Este enriquecimiento se puede efectuar según métodos conocidos, por ejemplo mediante centrifugación en un gradiente de densidades, p.ej. según Ficoll, teniendo lugar una separación de eritrocitos y granulocitos.
La muestra que se ha de ensayar contiene preferiblemente por lo menos 10^{6} células, a fin de hacer posible una detección fiable de células infrecuentes. De manera especialmente preferida, la muestra contiene de 10^{6} a 10^{9}, en particular de 5 x 10^{6} a 5 x 10^{7} células.
De acuerdo con la etapa (b), la muestra se pone en contacto con por lo menos dos moléculas de fijación diferentes, dirigidas contra las células que se han de detectar. Las moléculas de fijación son preferiblemente anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, en particular anticuerpos o fragmentos de anticuerpos monoclonales. Además de esto, se pueden utilizar, sin embargo, también ligandos de receptores que están presentes específicamente en las células que se han de detectar, p.ej. el receptor de uPA. Ejemplos de tales ligandos son péptidos lineales o/y cíclicos o sustancias miméticas de tales péptidos, que pueden llevar una marcación por fluorescencia.
La puesta en contacto de la muestra con las moléculas de fijación marcadas por fluorescencia se efectúa preferiblemente después de una fijación de las células sobre una fase sólida. Esta fijación se puede efectuar según métodos conocidos, p.ej. con formaldehído o dialdehído glutárico. Como fase sólida se puede utilizar, por ejemplo, un portaobjetos.
Siempre y cuando que sea necesario, las células presentes en la muestra que se ha de ensayar se pueden permeabilizar mediando utilización de un detergente, p.ej. de una saponina. De esta manera, las moléculas de fijación se pueden fijar también a determinantes localizados intracelularmente.
En el caso de la detección de células tumorales, las moléculas de fijación están dirigidas contra determinantes, que se presentan en la muestra que se ha de ensayar solamente o en una concentración elevada en células tumorales, pero no, o solamente en una concentración pequeña, en células normales. Preferiblemente, como primer determinante se escoge una estructura procedente del interior de las células, p.ej. una citoqueratina. Las citoqueratinas son componentes del citoesqueleto específicos para células epiteliales, y no son expresadas en células mononucleares de la sangre o de la médula ósea, que son de origen mesenquimal. La presencia de citoqueratinas en células, que se habían extraído de la sangre y de la médula ósea, apunta, por consiguiente, a la presencia de células tumorales epiteliales. Ejemplos de apropiados anticuerpos contra citoqueratinas son el anticuerpo A45B/B3 (de Micromet GmbH, Munich, Alemania) o el anticuerpo CK2 (de Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Alemania). Otros anticuerpos de detección, dirigidos contra antígenos intracelulares asociados a tumores, son conocidos y se pueden obtener comercialmente de diferentes entidades.
Como segundo determinante se escoge preferiblemente una estructura situada sobre la superficie celular, p.ej. un receptor situado en membranas. Un determinante específico para tumores, especialmente preferido, es el receptor de la urocinasa (uPAR). La detección de este receptor se puede efectuar, por ejemplo, mediando utilización de anticuerpos contra uPAR, tales como ilustrativamente IID7 y IIIF10 (Luther y colaboradores, Am. J. Path. 150 (1997), 1.231-1.244). Preferiblemente, se escogen los anticuerpos contra uPAR que tienen una afinidad para un uPAR específico para células tumorales, que por lo menos es comparable con la de un uPAR procedente de células "normales". Ejemplos de tales anticuerpos contra uPAR, que se fijan con una alta afinidad también a células tumorales, son unos anticuerpos, que reconocen al epítopo 52-60 de uPAR, tal como ilustrativamente el anticuerpo IIIF10 que ya se ha mencionado anteriormente.
Otros anticuerpos contra uPAR frecuentemente reconocen, por el contrario, sólo mal a los uPAR en células tumorales.
Por otra parte, la detección del uPAR se puede efectuar también con ligandos de receptores marcados por fluorescencia, p.ej. urocinasa, fragmentos de urocinasa o péptidos de urocinasa. Tales métodos de detección son descritos, por ejemplo, por Chucholowski y colaboradores (Fibrinolysis 6, Suplemento 4 (1992), 95-102), Ciccocioppo y colaboradores (J. Histochem. Cytochem. 45 (1997), 1.307-1.313), y Luther y colaboradores (Am. J. Pat. 150 (1997), 1.231-1.242).
En el procedimiento se utilizan por lo menos dos diferentes grupos de marcación por fluorescencia. Favorablemente, se emplean aquellos grupos de marcación por fluorescencia que poseen unos espectros de emisión diferenciables unos de otros (p.ej. rojo/verde). Ejemplos de colorantes fluorescentes apropiados son fluoresceína y sus derivados, ficoeritirina, rodamina, aminas TRITC, aminas Texas Red®, CY3 y CY5, así como Alexa© 488 y Alexa® 568 (de Molecular Probes). Los colorantes fluorescentes se pueden conjugar directamente, p.ej. por enlaces covalentes, con las moléculas de fijación primarias, que son específicas para las células que se han de detectar. En este caso, se habla de una marcación directa. Por otra parte, los colorantes fluorescentes se pueden conjugar con moléculas de fijación secundarias, que por su parte están dirigidas contra las moléculas de fijación primarias. En este caso, se habla de una marcación indirecta. Ambos métodos de marcación, y respectivamente combinaciones de ellos, se pueden utilizar en el procedimiento.
Las diferentes moléculas de fijación se pueden incubar con la célula de una manera secuencial o paralela. Una incubación paralela con varias moléculas de fijación (moléculas de fijación primarias y eventualmente moléculas de fijación secundarias, en el caso de una marcación indirecta) conduce a un considerable ahorro de tiempo.
La evaluación de la muestra se efectúa mediante determinación de la fluorescencia después de haber excitado a los grupos de marcación por fluorescencia. De manera especialmente preferida, se utiliza para ello un microscopio confocal de barrido con láser o un microscopio de fluorescencia, que hace posible una evaluación de la muestra mediante una determinación paralela o/y secuencial de los diferentes grupos de marcación por fluorescencia.
La técnica de marcación por fluorescencia doble hace posible, además de esto, una caracterización de las células identificadas como positivas, mediante una reacción con las moléculas de fijación. Esta caracterización puede comprender una evaluación específica para un sitio o/y cuantitativa de la marcación. Así, se puede efectuar una exploración (un "escaneo") de células individuales mediante determinación de la marcación en varios, p.ej. 10 a 50, planos de corte a través de la célula en unas distancias de, por ejemplo, 0,1 a 1 \mum. Adicionalmente, con ayuda de una curva patrón, que se había establecido mediante la medición de micropartículas con un tamaño definido y de una cantidad definida de un colorante fluorescente, se puede llevar a cabo una determinación cuantitativa de los determinantes que reaccionan con las moléculas de fijación en la célula.
El procedimiento permite la obtención de datos diagnósticos valiosos en pacientes de tumores y hace posible, por lo tanto, una elaboración sensible de un pronóstico para el paciente después de una operación quirúrgica de un tumor primario.
Un estuche de reactivos para la detección de células en una muestra biológica comprende
(a)
una primera molécula de fijación, que reconoce a las células que se han de detectar, y un primer grupo de marcación por fluorescencia,
(b)
una segunda molécula de fijación, que reconoce a las células que se han de detectar, y un segundo grupo de marcación por fluorescencia, siendo diferentes las moléculas primera y segunda de fijación y los grupos primero y segundo de marcación por fluorescencia, y
(c)
agentes para la fijación de células sobre una fase sólida.
Sorprendentemente, se comprobó que unos anticuerpos contra uPAR, que están dirigidos contra el epítopo 52-60 de uPAR, reconocen a un uPAR con una glico - estructura que se presenta en células tumorales, es decir que se fijan a un uPAR expresado por células tumorales con una afinidad por lo menos comparable con la de un uPAR expresado por células normales. Otros anticuerpos contra uPAR, p.ej. el HD13.1 (Todd y colaboradores, CD87 workshop panel report. En: Kishimoto T. y colaboradores, coordinadores de edición, Leucocyte Typing VI, Nueva York y Londres, Garland Publishing, Inc. 1997; 1.016-1.020) poseen, por el contrario, una afinidad solamente pequeña para un uPAR procedente de células tumorales.
El invento se refiere, por consiguiente, a la utilización de un anticuerpo o de un fragmento de éste que se fija a antígenos (preferiblemente de un anticuerpo monoclonal o de un fragmento de éste que se fija a antígenos), que está dirigido contra el epítopo 52 a 60 de uPAR, y que se fija a un uPAR expresado por células tumorales con una afinidad por lo menos comparable con la de un uPAr expresado por células normales, para la preparación de un agente de diagnóstico dirigido contra uPAR en células tumorales, para la elaboración de un pronóstico de la evolución en el caso de enfermedades malignas. Anticuerpos de este tipo, tales como ilustrativamente el conocido anticuerpo monoclonal IIIF10 (Luther y colaboradores (1997), véase más arriba) o anticuerpos con una equivalente especificidad de fijación, tales como ilustrativamente anticuerpos quimerizados o humanizados, o correspondientes fragmentos de anticuerpos recombinantes o proteolíticos, p.ej. fragmentos de anticuerpos monocatenarios, reconocen a un uPAR expresado por células tumorales con una afinidad suficiente para finalidades diagnósticas y terapéuticas.
Se comprobó sorprendentemente que tales anticuerpos, o fragmentos de los mismos, se pueden emplear como un agente de diagnóstico para el pronóstico de la evolución en el caso de enfermedades malignas, en particular en el caso de tumores, p.ej. carcinomas de mama. En muestras de tumores de más de 200 pacientes de carcinoma de mama que se habían investigado, se encontró que la fijación del anticuerpo IIIF10 o de un anticuerpo correspondiente con una capacidad de fijación equivalente, tiene una relevancia pronóstica significativa para la evolución de la enfermedad, es decir para la ausencia de recidivas y respectivamente para la mortalidad. En este caso, unos altos valores de antígenos significan una ausencia más breve de recidivas y respectivamente una mortalidad más temprana. Con anticuerpos, que están dirigidos contra otras regiones de uPAR, no se pudo encontrar ninguna importancia pronóstica de esta índole.
A causa de la alta afinidad para uPAR de tumores, estos anticuerpos, o fragmentos de ellos, pueden ser apropiados también como agentes de diagnóstico para la detección de células tumorales en una muestra biológica, en particular para la detección de células tumorales dispersas en una médula ósea. Tales procedimientos de detección se pueden llevar a cabo, por ejemplo, como un ELISA o como un procedimiento de detección por fluorescencia doble - explicado detalladamente con anterioridad -.
Además de esto, los anticuerpos, que están dirigidos contra el epítopo 52 a 60 de uPAR, o sus fragmentos, se podrían adecuar para la preparación de un agente terapéutico, que puede producir, por ejemplo, un bloqueo funcional selectivo en el caso de células tumorales. Además de esto, los anticuerpos o sus fragmentos se podrían emplear en forma de conjugados con un grupo citotóxico para la inhibición del crecimiento o la aniquilación de células tumorales. Ejemplos de grupos citotóxicos apropiados son grupos radiactivos, toxinas e inhibidores del crecimiento celular. Para finalidades terapéuticas se podrían emplear preferiblemente anticuerpos quiméricos con dominios constantes humanizados, cuya preparación se ha descrito, por ejemplo, en el documento de patente europea EP-B-0.120.694.
Todavía otro objeto del invento son ácidos nucleicos recombinantes, que codifican un polipéptido con propiedades de anticuerpo y que comprenden la secuencia CDR3-VH y la secuencia CDR3-VL del anticuerpo IIIF10. La región CDR3 del ADNc (cromosomal) de VH se representa en las SEQ ID n^{os} 1/2 de los nucleótidos desde 295 hasta 321 (correspondientes a los aminoácidos desde 99 hasta 107). La región CDR3 del ADNc de VL se representa en las SEQ ID n^{os} 3/4 de los nucleótidos desde 265 hasta 291 (aminoácidos desde 89 hasta 97). Además, los ácidos nucleicos contienen los segmentos de los ADNc de VH y VL que codifican las regiones CDR1 y/o CDR2. Las secuencias para la región CDR1-VH se representan en las SEQ ID n^{os} 1/2 de los nucleótidos desde 91 hasta 105 (correspondientes a los aminoácidos desde 31 hasta 35, es decir SYDIN). En las SEQ ID n^{os} 3/4, la región CDR1 del ADNc de VL se extiende desde los nucleótidos 70 hasta 102 (correspondientes a los aminoácidos desde 24 hasta 34, es decir KAS....TVA). La región CDR2 del ADNc de VH se extiende desde los nucleótidos 148 hasta 198 (los aminoácidos desde 50 hasta 66, es decir WIF...FKD) en las SEQ ID n^{os} 1/2. La región CDR2 del ADNc de VL se extiende desde los nucleótidos 148 hasta 168 (correspondientes a los aminoácidos desde 50 a 56, es decir LASNRHT) en las SEQ ID n^{os} 3/4.
El invento se refiere, por consiguiente, en particular a un ácido nucleico recombinante, que codifica un polipéptido con propiedades de anticuerpo, y que comprende:
(a)
una secuencia CDR-3-VH que codifica la secuencia de aminoácidos:
DGSMGGFDY,
(b)
una secuencia CDR-2-VH que codifica la secuencia de aminoácidos:
WIFPGDGSTNYNEKFD,
(c)
una secuencia CDR-1-VH que codifica la secuencia de aminoácidos:
SYDIN,
(d)
una secuencia CDR-3-VL que codifica la secuencia de aminoácidos:
LQHWNYPYT,
(e)
una secuencia CDR-2-VL que codifica la secuencia de aminoácidos:
LASNRHT, y
(f)
una secuencia CDR-1-VL que codifica la secuencia de aminoácidos:
KASQNVRTTVA.
Además, el invento se refiere a polipéptidos recombinantes con propiedades de anticuerpo, que comprenden:
(a)
una secuencia de aminoácidos CDR-3-VH:
DGSMGGFDY,
(b)
una secuencia de aminoácidos CDR-2-VH:
WIFPGDGSTNYNEKFD,
(c)
una secuencia de aminoácidos CDR-1-VH:
SYDIN,
(d)
una secuencia de aminoácidos CDR-3-VL:
LQHWNYPYT,
(e)
una secuencia de aminoácidos CDR-2-VL:
LASNRHT; y
(f)
una secuencia de aminoácidos CDR-1-VL:
KASQNVRTTVA.
Los ácidos nucleicos y polipéptidos recombinantes contienen las regiones CDR3 tanto de la secuencia VH como también de la secuencia VL. De manera especialmente preferida, los polipéptidos recombinantes son anticuerpos monocatenarios, p.ej. fragmentos de anticuerpos scFv. En el caso de los polipéptidos recombinantes, los dominios de armazón (en inglés framework), que no son directamente responsables de la fijación a antígenos, se reemplazan preferiblemente por correspondientes secuencias humanas, de tal manera que se forman fragmentos humanizados. Los polipéptidos recombinantes conformes al invento pueden estar acoplados con grupos efectores, es decir grupos citotóxicos para finalidades terapéuticas o/y grupos detectores para una reproducción en imágenes (en inglés imaging) de tumores.
Además, el invento se ilustra mediante las Figuras y los Ejemplos siguientes. Muestran:
La Figura 1: una representación esquemática de la exploración de una célula en el microscopio de láser.
a)
De una célula tumoral con un tamaño de aproximadamente 15 \mum se establecen en total 30 cortes en serie a una distancia respectiva de 0,5 \mum.
b)
La medición de la fluorescencia se lleva a cabo en cada plano de corte y luego se suman todos los valores de la fluorescencia.
c)
Con ayuda de una curva patrón (micropartículas de látex con una cantidad definida de fluorocromo) se efectúa un cálculo de la fluorescencia total.
La Figura 2: el resultado de la tinción fluorescente de una célula tumoral con el anticuerpo contra citoqueratina A45 B/B3 y con Alexa 488 como colorante fluorescente.
a)
La secuencia de imágenes muestra 24 fotografías de un proceso de exploración, en el que se midió una célula de carcinoma de mama (ZR75) con un tamaño de aproximadamente 12 \mum en unos planos de corte situados respectivamente a una distancia de 0,5 \mum.
b)
Se muestra una fotografía de foco prolongado (en inglés "extended focus", en la que la intensidad total de toda la exploración total (a) se había proyectado sobre un único plano de imagen.
La Figura 3: el resultado de una tinción fluorescente indirecta con el A45B/B3 como anticuerpo primario y con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa 488 (aumento x 63),
a)
una imagen de transmisión
b)
una célula positiva en cuanto a citoqueratina en el frotis de la médula ósea de una paciente con carcinoma de mama.
La Figura 4: el resultado de una tinción fluorescente directa con un conjugado del anticuerpo A45B/B3 y del colorante fluorescente Alexa 488 (aumento x 63),
a)
una imagen de transmisión
b)
detección de citoqueratina en una preparación mixta a base de células tumorales MCF7 y de linfocitos de sangre periférica (1:20)
La Figura 5: el resultado de una tinción fluorescente directa con un conjugado del anticuerpo contra uPAR IIIF10 y el colorante fluorescente Alexa 568 (aumento x 63),
a)
una imagen de transmisión
b)
detección del receptor de uPA en una preparación mixta de células tumorales MCF 7 y linfocitos de sangre periférica (1:20)
La Figura 6 el resultado de una tinción fluorescente doble directa con los conjugados de A45 B/B3 y de Alexa 488 (contra citoqueratina) y de IIIF10 y de Alexa 568 (contra uPAR)
a)
una imagen de transmisión
b)
detección de citoqueratina
c)
detección del receptor de uPA
La Figura 7 el resultado de la medición de una célula tumoral en una médula ósea (aumento x 63),
a)
una imagen de transmisión (sistema óptico de Nomarski)
b)
reacción de la célula con un conjugado de Alexa 488 y de un anticuerpo contra citoqueratina
c)
reacción de la célula con un conjugado de Alexa 568 y de un anticuerpo dirigido contra uPAR. El núcleo de la célula no está teñido. La reacción del anticuerpo contra uPAR se limita principalmente a la membrana celular. Más abajo, a la derecha, se representa una célula de médula ósea positiva en cuanto a uPAR, que es negativa para citoqueratina. Todas las otras células son negativas en cuanto a uPAR.
La Figura 8: la influencia del uPA sobre la determinación del uPAR
a)
la relación de uPA/uPAR en extractos tumorales de 599 pacientes de carcinoma de mama,
b)
la determinación de uPAR en presencia de diferentes cantidades de uPA
La Figura 9: el contenido de antígenos de uPAR en diferentes células, determinado por medio de diferentes procedimientos de ensayo:
IIIF10/HU277 negro, HD13.1/HU277: gris oscuro, ADI gris claro
a)
células normales
b)
células tumorales bien diferenciadas
c)
células tumorales mal diferenciadas
La Figura 10: la relevancia pronóstica del contenido del antígeno de uPAR, determinada por medio de diferentes procedimientos de ensayo en 203 pacientes de carcinoma de mama
a)
IIIF10/HU277
b)
HD13.1/HU277
c)
ADI
La Figura 11: la inhibición, dependiente de la dosis, del crecimiento de tumores de cáncer de mama humano en ratones desprovistos de inmunidad al administrarles el anticuerpo IIIF10.
La Figura 12: la fijación de scFv IIII10 a antígenos inmovilizados.
La Figura 13: la inhibición de la fijación de IIIIF10 (anticuerpo monoclonal/moab y scFv) a uPAR mediante péptidos.
Las SEQ ID n^{os} 1/2: la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la cadena VH de IIIIF10 y la correspondiente secuencia de aminoácidos.
Las SEQ ID n^{os} 3/4: la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la cadena VL de IIIF10 y la correspondiente secuencia de aminoácidos.
Ejemplos 1. Determinación por fluorescencia doble de células tumorales 1.1 Material
El anticuerpo monoclonal de ratón A45B/B3 (Kaspar y colaboradores, Eur. J. Cancer Clin. Oncol 23, (1987), 137-147) está dirigido contra los filamentos de citoqueratina 8, 18 y 19 (CK 8, 18, 19). Este anticuerpo se conjugó directamente con el fluorocromo ALEXA 488 de Molecular Probes. El receptor de uPA es detectado específicamente por el anticuerpo monoclonal de ratón IIIF10 (Luther y colaboradores (1997), véase más arriba) (epítopo 52 a 60). Como otros anticuerpos adicionales contra el receptor de uPA están a disposición los anticuerpos monoclonales HD 13.1 y II D7 (Luther y colaboradores (1997), véase más arriba) (epítopo 125 a 132), así como el anticuerpo policlonal de conejo #399 R (Stahl y colaboradores, Cancer Res. 54 (1994), 3.066-3.071) y el anticuerpo de gallina HU277 (Magdolen y colaboradores, Electrophoresis 16 (1995), 813-816). Todos los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor de uPA se conjugaron directamente con el colorante fluorescente ALEXA® 568.
TABLA 1 Anticuerpos conjugados directamente, utilizados
1
1.2 Preparaciones de médula ósea
En la sala de operaciones se lleva a cabo una punción de Jamshidi. Por ambos lados se extraen en cada caso 4-6 ml de médula ósea desde el hueso de la cresta ilíaca. El enriquecimiento de las células tumorales en la fracción de las células mononucleares se efectúa a través de un gradiente de Ficoll. Se realizan de 8 a 12 citocentrifugaciones (10^{6} células por cada citocentrifugación) por paciente. Después de una desecación al aire, se fijan y permeabilizan las preparaciones.
1.3 Fijación y permeabilización
1.
Se fija en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 30 min.
2.
Se lava tres veces en una mezcla de solución salina tamponada con fosfato y albúmina de suero bovino (PBS/BSA) al 1%.
3.
Se permeabiliza en saponina al 0,025% durante 45 min.
4.
Se lava tres veces en PBS/BSA al 1%.
1.4 Doble marcación de citoqueratina y del receptor de uPa 1.4.1 Método indirecto
1.
Se incuba durante una noche con el anticuerpo primario de ratón A 45 B/B3 (concentración final 0,004 mg/ml) diluido en PBS/BSA al 1%.
2.
Se lava tres veces en PBS/BSA al 1%.
3.
Se incuba con el segundo anticuerpo primario de conejo #399 R diluido en PBS/BSA al 1% (concentración final 0,05 mg/ml) durante 2 horas.
4.
Se lava tres veces en PBS/BSA al 1%.
5.
Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra - Alexa 488 (concentración final 0,02 mg/ml) diluido en PBS/ BSA al 1%, tiempo de incubación 30 min.
6.
Se lava tres veces en PBS/BSA al 1%.
7.
Anticuerpo secundario anti-conejo de cabra - Alexa 568 (concentración final 0,02 mg/ml) diluido en PBS/BSA al 1%, tiempo de incubación 30 min.
8.
Se lava tres veces en PBS/BSA al 1%.
9.
Se cubre con 5 \mul de PBS/BSA al 1% y se observa en un microscopio.
1.4.2 Método directo
1.
Se incuba durante 1 hora con el anticuerpo A 45 B/B3 - Alexa 488 (concentración final 0,0014 mg/ml) diluido en PBS/BSA al 1%.
2.
Se lava tres veces en PBS/BSA al 1%.
3.
Se incuba durante 1 hora con el anticuerpo III F 10-Alexa 568 (concentración final 0,003 mg/ml) en PBS/BSA al 1%.
4.
Se lava tres veces en PBS/BSA al 1%.
5.
Se cubre con 5 \mul de PBS/BSA al 1% y se observa en un microscopio.
1.5 Cuantificación
Los antígenos que reaccionan con el anticuerpo fluorescente se visualizan en el microscopio confocal de barrido con láser en una región de excitación de 488 nm o bien de 568 nm. Mediante exploración de la célula en el microscopio de láser, es decir mediante tomografía de secciones de capas en etapas de 0,5 \mum, se distribuyen las células tumorales en 20 a 30 planos de corte. Se registran todas las fluorescencias, y se calcula la suma de estas mediciones. Con ayuda de una curva patrón, que se había elaborado anteriormente mediante medición de perlas de látex con una cantidad definida de colorante fluorescente, es posible realizar una cuantificación de los antígenos, que han reaccionado con el anticuerpo, en la célula tumoral.
En la Figura 1 se representa gráficamente el principio del proceso de exploración utilizado para la localización y la cuantificación de la marcación por fluorescencia. Las Figuras 2 a 7 muestran resultados ilustrativos de la aplicación práctica del procedimiento.
2. Especificidad para tumores del anticuerpo monoclonal IIIF10
Se desarrollaron dos diferentes sistemas de ELISA para la detección de un antígeno del uPAR:
1)
Anticuerpo captador: anticuerpo policlonal de gallina HU277 (Magdolen y colaboradores (1995), véase más arriba); anticuerpo detector: anticuerpo monoclonal IIIF10 (Luther y colaboradores (1997), véase más arriba).
2)
Anticuerpo captador: anticuerpo policlonal de gallina HU277; anticuerpo monoclonal HD 13.1 (Todd y colaboradores (1977), véase más arriba).
Estos sistemas de ELISA se compararon con un ELISA obtenible comercialmente (ADI) para un uPAR (de American Diagnostica Inc. Greenwich, CT, EE.UU.).
Los sistemas de ELISA ensayados se ajustaron uno respecto al otro con un uPAR humano, recombinante, purificado por afinidad (rec-uPAR), expresado en células CHO. Los tres sistemas de ELISA mostraron frente al rec-uPAR una linealidad y una sensibilidad comparables.
En investigaciones avanzadas se pudo mostrar que el contenido real del antígeno de uPAR en células se puede determinar también en presencia de un exceso hasta séxtuple de uPAR. El hallazgo renovado fue > 95% en los casos del ensayo con IIIF10/HU277 y del ensayo con HD 13.1/HU277, así como > 80% en el caso del ensayo con ADI. La relación de uPA/uPAR en 599 extractos tumorales analizados es típicamente < 3 en un 95% de los casos (ensayos con ADI-UPA- y ADI-uPAR-ELISA). Estos resultados se muestran en la Figura 8.
A continuación se determinaron los contenidos de antígeno de uPAR en materiales lisados de diferentes tipos de células. Aquí se mostró que la determinación del antígeno de uPAR en células no malignas (p.ej. queratinocitos [HaCaT], células endoteliales procedentes del cordón umbilical [HUVEC], células epiteliales junto a la mama [HMEC]) aportó unos resultados comparables con los tres sistemas de ELISA. En el caso de linajes de células tumorales se estableció, por el contrario, una imagen manifiestamente diferente. En el caso de células de carcinoma de mama bien diferenciadas, solamente el IIIF10/HU277- ELISA reconoció a cantidades significativas del uPAR asociado a un tumor, mientras que en linajes de células mal diferenciadas de carcinoma de mama, el IIIF10/HU277- y el ADI-ELISA proporcionaron unos valores comparables. El HD13.1/HU277-ELISA detectó en las células de carcinoma, tanto bien diferenciadas como también mal diferenciadas, demasiada poca cantidad de uPAR. Los datos se muestran en la Figura 9.
3. Relevancia pronóstica del anticuerpo monoclonal IIIF10
En un estudio clínico se determinó el contenido de antígeno de uPAR con los tres sistemas de ELISA descritos en el Ejemplo 2 en muestras de tumores de más de 200 pacientes de carcinoma de mama. Aquí se mostró que los valores de antígenos medidos con el ELISA con IIIF10/HU277 tienen una relevancia pronóstica significativa para la evolución de la enfermedad, es decir para la ausencia de recidivas y respectivamente para la mortalidad. Con los otros dos sistemas de ELISA no se pudo encontrar tal relevancia pronóstica. Los datos se muestran en la Figura 10.
4. Efecto in vivo del anticuerpo monoclonal IIIF10
A ratones desprovistos de inmunidad Balb/C/3 con una edad de 4 a 6 semanas se les inyectaron en el flanco derecho 6 x 10^{6} células de cáncer de mama humano MDA-MB231 (Price y colaboradores, Cancer Res. 50 (1990), 717-721) en un volumen total de 300 \mul. Antes de la inyección, las células de cáncer se mezclaron en cada caso con 200 \mug del anticuerpo monoclonal de múrido IIIF10 en PBS, de pH 7,4. A continuación, se trataron los ratones cada tres días con anticuerpos monoclonales IIIF10 en una dosis de 2 mg/kg de peso corporal, o bien de 10 mg/kg de peso corporal, por vía intraperitoneal en un volumen de inyección de 300 \mul. El volumen en cm^{3} de los tumores primarios que aparecieron en los ratones, se determinó después de cuatro semanas mediante medición de los dos diámetros mayores de los tumores. A los ratones testigos se les administró una PBS de pH 7,4, cada grupo se componía de seis ratones.
Los resultados se muestran en la Figura 11. Se puede reconocer que la administración del anticuerpo disminuyó fuertemente el crecimiento de tumores primarios. La inhibición del crecimiento estaba pronunciada, en el caso de una administración de 10 mg/kg de peso corporal, de manera todavía más manifiesta que en el caso de una administración en una dosis de 2 mg/kg de peso corporal.
5. Preparación del anticuerpo monoclonal recombinante IIIF10
El ARNm (mensajero) de células de hibridoma que producen el IIIF10 se enriqueció y se transcribió en un ADNc. Los fragmentos de ADNc, que codifican las regiones variables de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL), se amplificaron mediante una RT-PCR (reacción en cadena de la transcriptasa inversa) mediando utilización de cebadores específicos para un gen. Los segmentos del gen para VH y VL se clonaron en un vector fagémido, a fin de hacer posible la expresión de las regiones variables como un anticuerpo monocatenario (scFv). Las moléculas del scFv fueron presentadas mediante visualización de fagos junto a la superficie de fagos filamentosos como una proteína pIII de fusión con la proteína pequeña de envoltura de fagos. Los fagos, que mostraron una expresión funcional de scFv-FIII10, se seleccionaron mediante una fijación específica de uPAR. Los fagos seleccionados se utilizaron para la infección de células de E.coli, lo cual hizo posible la producción y la secreción de moléculas solubles de scFv en el medio de cultivo. La Figura 12 muestra la fijación del material sobrenadante de scFv junto a un uPAR inmovilizado sobre una fase sólida. Se registró conjuntamente la capacidad de fijación de los anticuerpos scFv-anti-X y scFv-anti-Y para finalidades de testigo de control.
A fin de ensayar adicionalmente la especificidad de la fijación, se emplearon unos péptidos que se habían utilizado para el cartografiado del epítopo del anticuerpo IIIF10 (Luther y colaboradores, J. Pathol 150 (1997), 1.231-1.244). Como se puede observar a partir de la Figura 13, solamente un péptido, cuya frecuencia comprende el epítopo completo IIIF10 sobre uPAR (51-65), puede impedir la fijación del anticuerpo monoclonal y del scFvIIIF10 al uPAR. Otro péptido con un epítopo incompleto de secuencia (48-59) es menos eficaz en un factor > 100. Ninguno de los péptidos puede impedir la fijación de un anticuerpo testigo (de control) scFv-anti-X a su proteína diana X.
La secuencia de nucleótidos del ADNc de VH y la correspondiente secuencia de aminoácidos se representan en las SEQ ID n^{os} 1/2. La secuencia de nucleótidos del ADNc de VL y la correspondiente secuencia de aminoácidos se representan en las SEQ ID n^{os} 3/4.
<110> Wilex Biotechnology GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Empleo diagnóstico y terapéutico de anticuerpos dirigidos contra el receptor de la urocinasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 19116 PEP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 354
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial:
\vskip0.800000\baselineskip
Secuencia del fago
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(354)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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2
3 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 118
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial:
\vskip0.800000\baselineskip
Secuencia del fago
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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4 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 324
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(324)
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial:
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Secuencia del fago
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<400> 3
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5 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 108
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial:
\vskip0.800000\baselineskip
Secuencia del fago
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
6

Claims (11)

1. Utilización de un anticuerpo, que está dirigido contra el epítopo 52-60 del receptor de la urocinasa (uPAR) y que se fija a un uPAR expresado por células tumorales con una afinidad por lo menos comparable con la de un uPAR expresado por células normales, o de un fragmento de éste que se fija a un antígeno, para la preparación de un agente de diagnóstico dirigido contra un uPAR en células tumorales para la elaboración de un pronóstico de la evolución en el caso de enfermedades malignas.
2. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizada porque
se detectan células tumorales en una muestra biológica.
3. Utilización de acuerdo con la reivindicación 2,
en la que la muestra biológica representa una médula ósea.
4. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 a 3 en un ELISA.
5. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 a 3 en un procedimiento de detección por fluorescencia doble.
6. Utilización de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizada porque
el anticuerpo se escoge entre el anticuerpo monoclonal IIIF10, fragmentos de éste, o anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con una especificidad equivalente de fijación.
7. Ácido nucleico recombinante, que codifica un polipéptido con propiedades de anticuerpo, que comprende
(a)
una secuencia CDR-3-VH que codifica la secuencia de aminoácidos:
DGSMGGFDY,
(b)
una secuencia CDR-2-VH que codifica la secuencia de aminoácidos:
WIFPGDGSTNYNEKFKD,
(c)
una secuencia CDR-1-VH que codifica la secuencia de aminoácidos:
SYDIN,
(d)
una secuencia CDR-3-VL que codifica la secuencia de aminoácidos:
LQHWNYPYT,
(e)
una secuencia CDR-2-VL que codifica la secuencia de aminoácidos:
LASNRHT, y
(f)
una secuencia CDR-1-VL que codifica la secuencia de aminoácidos:
KASQNVRTTVA.
8. Polipéptido recombinante con propiedades de anticuerpo, que comprende:
(a)
una secuencia de aminoácidos de CDR-3-VH:
DGSMGGFDY,
(b)
una secuencia de aminoácidos de CDR-2-VH:
WIFPGDGSTNYNEKFKD,
\newpage
(c)
una secuencia de aminoácidos de CDR-1-VH:
SYDIN,
(d)
una secuencia de aminoácidos de CDR-3-VL:
LQHWNYPYT,
(e)
una secuencia de aminoácidos de CDR-2-VL:
LASNRHT, y
(f)
una secuencia de aminoácidos de CDR-1-VL:
KASQNVRTTVA.
9. Polipéptido recombinante de acuerdo con la reivindicación 8,
caracterizado porque
es un fragmento de un anticuerpo scFv.
10. Polipéptido recombinante de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9,
caracterizado porque
es un anticuerpo humanizado.
11. Polipéptido recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 a 10,
caracterizado porque
está acoplado con un grupo efector.
ES00917083T 1999-04-13 2000-04-13 Empleo diagnostico y terapeutico de anticuerpos contra el receptor de la urocinasa. Expired - Lifetime ES2274781T3 (es)

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