MXPA01010296A - Diagnostico y uso terapeutico de anticuerpos contra el receptor urocinasa. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un metodo y a un estuche de reactivos para detectar celulas en una muestra biologica mientras se usa un tecnica de doble fluorescencia, asi como para el diagnostico y uso terapeutico de anticuerpos especificos de secuencias de aminoacidos contra el receptor de urocinasa que muestra una alta afinidad a receptores que expresan celulas de tumor.

Description

DIAGNÓSTICO Y USO TERAPEUTICO DE ANTICUERPOS CONTRA EL RECEPTOR UROCINASA. Antecedentes de la invención. La invención se refiere a un método y un estuche reactivos para detectar células en una muestra biológica usando. un técnica de doble fluorescencia. La detección confiable de células de tumor diseminadas que se han escapado de una estructura de tejido sólido (ir.icrometastásis ) es de mayor importancia para el diagnóstico y tratamiento de tumores. Asi, se han desarrollado durante los últimos años varios métodos para detectar tales células de tumor individuales diseminadas en fluidos corporales o muestras de tejido. Estas pueden, por ejemplo, detectarse al etiquetar selectivamente las células raras por medio de métodos inmunocitoquimicos en cuyo caso se usan frecuentemente los grupos etiquetados enzimáticos tales como fosfatasa alcalina. También se conocen las técnicas de doble etiquetado. Una publicación por Schimok y colaboradores, (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84 (1987) 8672-8676) describe la detección de células de tumor micrometastáticas en la medula- ósea por medio de una técnica de doble etiquetado en la cual se usan un anticuerpo de citoqueratina 18 que es especifico para células de origen epidermal, y un anticuerpo de leucocito. En este método, se usan la REF: 133479 fosfatase alcalina y un grupo etiquetado radioactivo (125I) . Ya que estas son desventaj as asociadas con el uso de grupos de etiquetado radioactivos, este método no es apropiado para la práctica clínica. Funke y colaboradores (Int. J. Cáncer 65 (1996), 755-761) describen la detección de micrometastásis en la medula ósea por medio de una técnica de doble etiquetado usando un anticuerpo de citoqueratina 18 y un anticuerpo de E-cadherina. Amibos anticuerpos se detectan por 'medio de la fosfatasa alcalina como un grupo etiquetado enzimático y dos substratos cromogénicos diferentemente ¦coloreados. Sin embargo, la detección secuencial de ambos anticuerpos por diferentes substratos cromogénicos se complica y por lo tanto es menos apropiada para la práctica clínica. Heiss y colegas (Heiss y colaboradores, Nature Med. 1 (1995), 1035-1039 and Allgayer .y colaboradores, J. Histochem. Cytochem. 45 (1997), 203-212) detectan células de tumor diseminadas en la medula ósea por medio de un método de doble etiquetado basado en la detección simultánea de citoqueratina 18 y el receptor uPA (uPAR) . Para estas células ligadas y fijadas en un portaobjetos microscópico, se incuban con un anticuerpo específico de citoqueratina biotinilado y posteriormente con un conjugado de fosfatasa alcalina y estreptavidina . Una reacción de tinción enzimático se lleva a cabo usando la fosfatasa alcalina movilizada y un substrato cromogénico para formar una tinción rojo obscura. Además, se usa un anticuerpo monoclonal contra el uPAR que se etiqueta con un anticuerpo secundario conjugado en oro y posteriormente se somete a una reacción de incremento de plata que resulta en un tinción negro. Los portaobjetos del microscopio se seleccionan después por exclusión, manualmente y visualmente para las tinciones (rojo oscuro/negro) bajo el microscopio, pero es extremadamente difícil detectar un tinción doble. Descripción de la invención. El objeto de la presente invención es llevar a cabo un método para la detección de células, en particular en células que se presentan raramente, tales como células de tumor en una muestra biológica, por ejemplo, medula ósea, que elimine al menos parcialmente las desventajas del arte previo. En particular, el método deberá ser al mismo tiempo altamente sensible y capaz, de una evaluación libre de problemas. Este objeto se realiza por un método para detectar células en una muestra biológica,. que comprende las siguientes etapas: (a) Preparar una muestra a probarse, (b) Poner en contacto la muestra con al menos dos diferentes células de enlace que reconocen las células a detectarse, las moléculas de enlace siendo cada una etiquetadas con diferentes tintes fluorescentes, y (c) Determinar las etiquetas de fluorescencia en la muestra fijada en una fase sólida. El método de conformidad con la invención es apropiado para detectar células que se presentan raramente en una muestra biológica fija. En esta conexión 'que ocurre raramente" en el sentido de la presente invención, significa que la frecuencia esperada de las células a detectarse está en el rango de 1:104 hasta 1:107 del número total de células presentes en la muestra a detectarse. Los ejemplos de tales células que se presentan raramente son células de tumor en una muestra de sangre o medula ósea. Otros tipos de células que se presentan raramente pueden, por supuesto, también detectarse si se seleccionan en consecuencia' las determinantes especificas de célula y las moléculas de enlace especificas. La técnica de tinción de fluorescencia doble del método de conformidad con la invención, permite una identificación rápida y precisa de las células a detectarse. Además, el uso de diferentes etiquetas fluorescentes que puedan preferiblemente detectarse concurrentemente, permite que los antígenos que se colocalizan en la célula se analicen también en la célula (tales como, por ejemplo, citoqueratina 8/18, p53, PAI-2 y en particular el receptor de urocinasa uPAR) . Esto previamente era muy difícil con los métodos conocidos, especialmente en el caso de muestras de tejido tales como aspirados de medula ósea. Una ventaja adicional principal del método recientemente desarrollado, es que permite una determinación cuantitativa del número e intensidad de células fluorescentes, por ejemplo con un microscopio de barrido láser confocal . La etapa (a) del método de conformidad con la invención, comprende la condición de una muestra biológica a probarse. Para esto, se toma una muestra del paciente, por ejemplo de un fluido corporal tal como sangre o de un tejido tal como medula ósea. El método de conformidad con la invención es particularmente usado preferiblemente para detectar células de tumor diseminadas de origen epidermal en la medula ósea. La medula ósea puede tomarse del hueso de la cresta iliaca. Las células mononucleares que incluyen células de tumor se concentran entonces preferiblemente en la muestra. Esta concentración puede llevarse a cabo por métodos conocidos, por ejemplo por centrifugación de gradiente de densidad, por ejemplo, Ficol , en él cual ocurre una separación de eritrocitos y granulocitos . La muestra a probarse preferiblemente contiene al menos 106 células con objeto de permitir una detección confiable de células raras. La muestra preferiblemente contiene particularmente 106 hasta 109 y en particular 5xl06 hasta 5xl07 células. De conformidad con la etapa (b) , la muestra se pone en contacto con al menos dos' diferentes moléculas de enlace que se dirigen contra las células a detectarse. Las moléculas de enlace preferiblemente son anticuerpos o fragmentos de anticuerpo y en particular anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos. Sin embargo, también es posible el uso de ligandos de receptores tales como el receptor de uPA que se presenta específicamente en las células a detectarse. Los ejemplos de tales ligandos son péptidos lineales y/o_ cíclicos o péptidos miméticos que pueden formar una etiqueta fluorescente. La muestra se pone preferiblemente en contacto con las moléculas de enlace etiquetadas fluorescentes después de que las células, se han fijado en una fase sólida. Este fijado puede llevarse a cabo por métodos conocidos por ejemplo, usando formaldehído o glutardialdehído . Un portaobjetos microscópico puede por ejemplo usarse como la fase sólida.

Si es necesario, las células presentes en la muestra pueden probarse para ser permeabilizadas usando un detergente tal como saponina. Esto permite que las "moléculas de enlace también se enlacen a determinantes intracelulares . Para la detección, de células de tumor, las moléculas de enlace se dirigen contra los . determinantes que sólo se presentan en células de tumor o están presentes en una concentración incrementada en las células de tumor en la muestra a probarse, pero no se presentan en células normales o de solamente baja concentración. Una estructura del interior de la célula por ejemplo una citoqueratina, se selecciona preferiblemente como el primer determinante. Las citoqueratinas son componentes específicos del citoesqueleto de las células epiteliales y no se expresan en células mononucleares de sangre o medula ósea, que son de origen mesenquimatoso . De esta manera, la presencia de citoqueratinas en las células que se han tomado de la sangre y medula ósea indican la presencia de células de tumor epitelial. Los ejemplos de anticuerpos antí-citoqueratina apropiados son el anticuerpo A45B/B3 (Micromet GMBH, Munich, Alemania) o el anticuerpo CK2 (Boehringer Mannheim GMBH, Mannheim, Alemania) . Otros anticuerpos de detección dirigidos contra los antígenos intracelulares asociados al tumor son conocidos y están comercialmente disponibles de diferentes compañías. ¦Una estructura en la superficie de la célula tal como un receptor de membrana, se selecciona preferiblemente como el segundo determinante. El receptor de urocinasa (uPAR) es un determinante especifico de tumor particularmente preferido. Este receptor puede, por ejemplo, detectarse usando anticuerpos anti-uPAR tales como IID7 y IIF10 (Luther y colaboradores, Am. J. Path. 150 (1997), 1231-1244). Aquellos anticuerpos anti-uPAR se seleccionan preferiblemente para que tengan una afinidad para un uPAR específico de célula de tumor que es al menos comparable con aquel para uPAR de células normales. Los' ejemplos de anticuerpos anti-uPAR que también ligan a células de tumor con una alta afinidad, son anticuerpos que reconocen el epítope 52-60 de uPAR tal como el anticuerpo IIIF10 arriba mencionado. - En contraste, otros anticuerpos anti-uPAR frecuentemente reconocen solamente de manera muy pobre el uPAR en células de tumor. Por otro lado, el uPAR también puede detectarse con ligandos de receptor etiquetados fluorescentes, por ejemplo, urocinasa, fragmentos de urocinasa o péptidos de urocinasa. Tales métodos de detección se describen, por ejemplo, por Chucholowski y colaboradores, ( Fibrinolysis 6., Suppl. 4 (1992), 95-102), Ciccocioppo y colaboradores, (J. Histochem. Cytochem. 45 (1997), 1307-1313) y Luther y colaboradores, (Am. J. Pat. 150 (1997), 1231-1242). Al menos dos diferentes grupos de etiquetado fluorescentes se usan en el método de conformidad con la invención. Es ventajoso el uso de grupos de etiquetado fluorescentes que tengan un espectro de emisión (por ejemplo, rojo/verde) que puedan distinguirse uno del otro. Los ejemplos de tintes fluorescentes apropiados son fluoresceina y derivados de los mismos, ficoeritrina, rodamina, aminas-TRITC, aminas Texas Red®, CY3 y CY5 asi como Alexa® 488 y Alexa® 568 (sondas moleculares) . Los tintes fluorescentes pueden conjugarse directamente, por ejemplo covalentemente, con las moléculas de enlace primarias que son especificas para las células a detectarse. Esto se refiere como un etiquetado directo. Por otro lado, los tintes fluorescentes pueden conjugarse a moléculas de enlace secundarias que son nuevamente dirigidas contra las moléculas de enlace primarias. Esto se refiere como un etiquetado indirecto. Ambos métodos de etiquetado o combinaciones de los mismos, pueden usarse en el -método de conformidad con la invención. Las diferentes moléculas de enlace puede incubarse secuencialmente o concurrentemente con la célula. Una incubación con varias moléculas de enlace en paralelo (moléculas de enlace primarias y opcionalmente moléculas de enlace secundarias en el caso de un etiquetado indirecto), conduce a un ahorro de tiempo considerable. La muestra se evalúa para determinar la fluorescencia después de excitar los grupos de etiquetado fluorescente. Un microscopio de barrido láser confocal o un microscopio fluorescente, se usan particularmente de manera preferible para que esto, lo que permite evaluar la muestra por determinación concurrente y/o secuencial de los diferentes grupos de etiquetado fluorescentes. La técnica de etiquetado de fluorescencia doble de conformidad con la invención, permite adicionalmente una caracterización de las células identificadas como positivas por la reacción con las moléculas de enlace. Esta caracterización puede comprender una evaluación de sitio especifico y/o cuantitativa de la etiqueta. Asi, las células individuales pueden "barrerse" determinando la etiqueta en varios planos de secciones, por ejemplo, 10 hasta 50 a través de la célula a distancias de por ejemplo 0.1 hasta 1 µ?a. Además, las determinantes en las células que han reaccionado con las moléculas de enlace, pueden determinarse cuantitativamente con base en una curva estándar ' que se construye midiendo las microparticulas de un tamaño definido y una cantidad definida de tinte fluorescente.

El método de conformidad con la invención permite datos de diagnóstico valiosos obtenidos de pacientes con tumor y por lo tanto permite una prognosis sensible a elaborarse para pacientes después de la operación de un tumor primario . Finalmente, la, invención se refiere a un estuche de reactivos para la detección de células en una muestra biológica, que comprende (a) una primera molécula de enlace que reconoce las células a detectarse y un primer grupo de etiquetado fluorescente, (b) . una segunda molécula de enlace que reconoce las células a. detectarse y un segundo grupo de etiquetado fluorescente, la primera y la segunda molécula de enlace y el primer y segundo grupo de etiquetado fluorescente siendo diferentes, y . (c) medios para fijar las células en una fase ? · sólida. Sorprendentemente se ha encontrado que los anticuerpos uPAR que se dirigen contra el epitope 52-60 del uPAR reconocen un uPAR que tiene una glicoestructura que se presenta en células de tumor, esto es, ligadas a un uPAR expresado por células de tumor con al menos una afinidad comparable al uPAR expresado por células normales. En contraste, otros anticuerpos anti-uPAR, por ejemplo HD13.1 (Todd y colaboradores, CD87 reporte de panel de taller. En: Kishirnoto T. y colaboradores, publ . Leucocyte Typing VI, New York & London, Garland Publishing, Inc. 1997; 1016-1020) solamente tienen una baja afinidad para el uPAR de células de tumor. De esta manera, la invención se refiere al uso de un anticuerpo o de un fragmento de enlace al antigeno del mismo, preferiblemente de un anticuerpo monoclonal o de un fragmento de enlace al antigeno del mismo, que se dirige contra el epitope 52 hasta 60 del uPAR para producir un agente de diagnóstico o terapéutico dirigido contra el uPAR en células de tumor. Tales anticuerpos son similares al anticuerpo monoclonal IIIF10 conocido (Luther y colaboradores (1997), supre) o anticuerpos que tienen un enlace equivalente de especificidad tal como anticuerpos quimerizados o humanizados o sus correspondientes fragmentos de anticuerpos recombinantes o 'proteoliticos, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos de cadena lateral, reconocen al uPAR expresado por células de tumor con una adecuada afinidad para propósitos de diagnóstico y terapéuticos. Adicionalmente, se ha encontrado de maneta sorprendente que tales anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden usarse como un agente de diagnóstico para predecir el curso de enfermedades malignas, especialmente en el caso de tumores, por ejemplo, carcinomas de pecho. En muestras de tumor ¦ de más de 200 pacientes con carcinoma de pecho femeninos examinados, se encontró que el enlace del anticuerpo IIIF10 o de un anticuerpo correspondiente con una capacidad de enlace equivalente, tiene una relevancia prognóstica importante para el curso de la enfermedad, esto es, ausencia de reincidencia o muerte. En esta conexión, los . valores elevados de antigeno, indican una ausencia más corta de reincidencia o de muerte prematura. Tal importancia de la -prognosis no se ha encontrado con los anticuerpos qué se dirigen contra otras regiones de uPAR. Debido a su alta afinidad para el tumor uPAR, estos anticuerpos o fragmentos de los mismos también son apropiados como agentes de diagnóstico para detectar células de tumor en una muestra biológica y en particular para detectar células de tumor diseminadas en la médula ósea. Tales métodos de detección pueden, por ejemplo, llevarse a cabo con un ELISA o como se obtienen previamente en métodos de detección de fluorescencia doble al detalle.- Por otro lado, los anticuerpos que se dirigen contra el epitope 52 hasta 60 del uPAR o fragmentos de los mismos, . son apropiados para preparar un agente terapéutico con, por ejemplo, actividad bloqueadora de la función selectiva en células de tumor. Además, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden usarse en forma de conjugados con un grupo citotóxico para inhibir el crecimiento de, ' o para eliminar las células de tumor. Los ejemplos de grupos citotóxicos apropiados son grupos radioactivos, toxinas e inhibidores del crecimiento de células. Para aplicaciones terapéuticas, es preferible el uso de anticuerpos quiméricos con dominios constantes humanizados, la producción de los cuales se describe, por ejemplo, en EP-B-0 120 694. Todavía una materia objeto adicional de la invención, son los ácidos nucleicos recombinantes que codifican un polipéptido con propiedades de anticuerpo y que contienen las secuencias CDR3-VH y/o las secuencias CDR3-VL del anticuerpo IIIF10. La región CDR3 del VH del cADN se muestra en la SEQ ID NO. 1/2 de los nucleótidos 295 hasta 321 (correspondiente al aminoácido .99 hasta 107) . La región CDR3 del VL de . cADN se muestra en la SEQ ID NO. 3/4 de los nucleótidos 265 hasta 291 (aminoácidos 89 hasta - 91) .. Además, los ácidos nucleicos preferiblemente contienen las secciones del VH y/o VL de cADN que codifican las regiones CDR1 y/o CDR2. Las secuencias para la región CDR1-VH se muestran en la SEQ ID NO. : 1/2 de los nucleótidos 91 hasta 105 (correspondientes al aminoácido 31 hasta 35, esto es, SYDIN) . En la SEQ ID NO.: 3/4, la región CDR1 del VL de cADN se extiende desde 'el' nucleótido 70 hasta 102 (correspondiente al aminoácido 24 hasta 34, esto es KAS...TVA). La región CDR2 del VH de cADN se extiende desde el nucleótido 148 hasta 198 (aminoácido 50 hasta 66, esto es WIF...FKD) en la SEQ ID NO. 1/2. La región CDR2 del VL de cADN se extiende desde el nucleótido 148 hasta 168 . (correspondiente al aminoácido 50 hasta 56, esto es LASNRHT) en la SEQ ID NO. 3/4. De esta manera, la invención se refiere en particular a ácidos nucleicos recombinantes que codifican a un polipéptido que tiene propiedades de anticuerpo que comprende (a) una secuencia CDR3-VH que codifica para la secuencia de aminoácido (I) : D G S M G G F D Y y/o (b) una secuencia CDR3-VL que codifica para la secuencia de aminoácido (II) : L Q H N Y P Y T Adicionalmente, la invención se refiere a polipéptidos recombinantes que tienen propiedades de anticuerpo que comprenden (a) una secuencia de aminoácido CDR3-VH (I): D G S M G G F D Y y/o (b) una secuencia de aminoácido CDR3-VL - ( II ) : L Q H W N Y P Y T Los ácidos nucleicos recombinantes y polipéptidos preferiblemente contienen las regiones CDR3 del VH asi como de la secuencia VL. Los polipéptidos recombinantes son. particularmente anticuerpos, preferiblemente de cadena simple, por ejemplo, fragmentos de anticuerpo ScFv. En los polipéptidos recombinantes, los dominios de estructura que no son directamente responsables para el enlace del antigeno, se reemplazan preferiblemente por sus correspondientes secuencias humanas de tal manera que se forman fragmentos de anticuerpo humanizados. Los polipéptidos recombinantes de conformidad con la invención, pueden acoplarse con grupos efectores, esto es, grupos citotóxicos para aplicaciones terapéuticas y/o grupos de detección para formación de imágenes de tumor. 1 La invención además se aclara por las siguientes figuras y ejemplos. Figura 1: Muestra una vista diagramática de la exploración de una célula en un microscopio láser. a) Se preparan un total de 30 secciones en serie con un espaciado de 0.5 um a partir de una célula de tumor de ca . 15 de largo. b) Se mide la fluorescencia en cada uno de los planos de la sección y entonces todos los valores de fluorescencia se agregan. c) La fluorescencia total se calcula a partir de una curva estándar (microparticulas de látex que contienen una cantidad definida de fluorocromo) . Figura 2: Muestra el resultado del tinción fluorescente de una célula de tumor con el anticuerpo anti-citoqueratina A45 B/B3 y Alexa 488 como un tinte fluorescente. a) La secuencia de imágenes muestra 24 fotografías de un procedimiento de exploración en el cual una célula de carcinoma de pecho de casi 12 um (ZR75) se mide en secciones planas en un espaciado de 0.5 um en cada uno de los casos . b) Muestra una fotografía de foco ampliado en la cual la intensidad total de la exploración completa (a) se proyecta en un plano de imagen simple. Figura 3: Muestra ios resultados de- un tinción fluorescente indirecto con A45B/B3 como el anticuerpo primario y un anticuerpo secundario conjugado con Alexa 488 (ampliación x63), a) Imagen de Transmisión b) Una célula positiva de citoqueratina en la frotis de la médula ósea de un paciente femenino con carcinoma de pecho. Figura 4: Muestra los resultados de un tinción fluorescente directo con un conjugado del anticuerpo A45B/B3 y el tinte fluorescente Alexa 488 (alargada x63) , a) Imagen de Transmisión b) Detección de citoqueratina en una preparación mezclada de células de tumor MCF7 y linfocitos de sangre periférica (1:20) . Figura 5: Muestra los resultados de un tinción fluorescente directo con un conjugado del anticuerpo anti-uPAR IIIF10 y el tinte fluorescente Alexa 568 (alargado x63) , a) Imagen de Transmisión b) Detección del receptor uPAR en una preparación mezclada de células de tumor MCF7 y linfocitos de sangre periférica (1:20). Figura 6: Muestra los resultados de un tinción de doble fluorescencia directo con los conjugados A45B/B3-Alexa 488 (anti-citoceratina) y IIIFIO-Alexa 568 (anti-uPAR) , a) Imagen de Transmisión b) Detección de la citoqueratina c) Detección del receptor uPAR Figura 7: Muestra los resultados de la medición de una célula de tumor en la medula ósea (ampliación x63), a) Imagen de Transmisión (ópticos Nomarski) b) Reacción de la célula con un conjugado de Alexa 488 y un anticuerpo anti-citoqueratina c) Reacción de la célula con un conjugado de Alexa 568 y un anticuerpo uPAR. No se tinción el núcleo de la célula. La reacción del anticuerpo anti-uPAR principalmente se limita por las membranas de la célula. La célula de la medula ósea positiva de uPAR que es negativa para la citoqueratina, se muestra abajo a la derecha. Todas las otras células son negativas a uPAR. Figura 8: Muestra la influencia de la uPA en la determinación de la uPAR a) La relación UPA/uPAR en tumores extraídos de 599 pacientes con carcinoma de pecho, b) La determinación del uPAR en la presencia de diferentes cantidades de uPA. Figura 9: Muestra el contenido de antígeno uPAR en diferentes células determinadas por diferentes procedimientos de prueba: IIIF10/HU277 negro, HD13.1/HU277 : gris oscuro, ADI gris claro a) Células normales b) Células de tumor bien diferenciadas c) Células de tumor pobremente diferenciadas Figura 10: Muestra la relevancia prognóstica del contenido de antigeno uPAR determinado por diferentes procedimientos de prueba en 203 pacientes con carcinoma de pecho.. a) IIIF10/HU277 b) HD13.1/HU277 c) ADI Figura 11: Muestra la inhibición dependiente de la dosis de crecimiento de tumor del cáncer de pecho humano en ratones desnudos por la administración del anticuerpo IIIF10. Figura 12: Muestra el enlace del scFv IIIF10 para antigenos inmovilizados. Figura 13: Muestra la inhibición del enlace del IIIF10 (anticuerpo monoclonal/moab y scFv) para uPAR por péptidos. SEQ ID NO 1/2: Muestra la secuencia' de nucleótido del cADN que codifica para la cadena VH del IIIF10 VH y la correspondiente secuencia de aminoácido. SEQ ID NO 3/4: Muestra la secuencia de nucleótido del cADN que codifica para la cadena VL del IIIF10 y la correspondiente secuencia de aminoácido.

Ejemplos 1. Determinación de l fluorescencia doble de células de tumor. 1.1 Material El anticuerpo de ratón monoclonal A45B/B3 (Kaspar y colaboradores, Eur. J. Cáncer Clin. Oncol 23, (1987), 137-147) se dirige contra los filamentos de citoqueratina 8, 18 y 19 (CK 8, 18, 19) . Este anticuerpo se conjuga directamente con el fluorocromo ALEXA 488 de sondas moleculares. El receptor uPA se detecta específicamente por el anticuerpo de ratón monoclonal IIIF10 (Luther y colaboradores, (1997), supra) (epítope 52 hasta 60). Los anticuerpos monoclonales HD13.1 y IID7 (Luther y colaboradores (1997), supra) (epítope 125 hasta 132), así como el anticuerpo de conejo policlonal #399R (Stahl y colaboradores, Cáncer Res. 54 (1994), 3066-3071), el anticuerpo de pollo HU277 (Magdol-en y colaboradores, Electrophoresis 16 (1995), 813-816). están disponibles como anticuerpos adicionales del receptor uPA. Todos los anticuerpos monoclonales contra el receptor uPA se conjugan directamente con el tinte fluorescente ALEXA® 568.

Tabla 1 Anticuerpos directamente conjugados que se usaron (*CLS = Microscopio de barrido láser confocal) . 1.2 Preparaciones de medula ósea Se lleva a cabo una punción Jamshidi en el teatro de operaciones. Se toman 4-6 mi de medula ósea de ambas crestas iliacas. Las células de tumor en la fracción de célula mononuclear se concentran por medio de un gradiente Ficoll. Se preparan de 8 hasta 12 citospinas (106 células por citospina) por paciente. Después de secar al aire, las preparaciones se fijan y se permeabilizan . 1.3 Fijación y permeabilizacion 1. Fijación en paraformaldehido al 4% (PFA) durante 30 minutos. 2. Lavado tres veces en solución- amortiguadora salina de fosfato-albúmina de suero de bovino al 1% (PBS/BSA) . 3. Permeabili zar en saponina al 0.025% durante 45 minutos . 4. Lavar tres veces en PBS/BSA al 1%. 1.4 Etiquetado doble de la citogueratina y el receptor uPA. 1.4.1 Método indirecto 1. Incubar durante la noche con el anticuerpo de ratón primario A45B/B3 (concentración final 0.004 mg/ml) en PBS/BSA al 1%.' 2. Lavar tres veces con PBS/BSA al 1%. 3. Incubar durante dos horas con el segundo anticuerpo de ratón primario #399 R (concentración final 0.05 mg/ml) diluido en PBS/BSA al 1%. 4. Lavar tres veces en PBS/BSA al 1%. 5·. De manera secundaria," el anticuerpo antiratón-Alexa 488 de cabra (concentración final 0.02 mg/ml) se diluye en PBS/BSA al 1%, periodo de incubación de 30 minutos. 6. Lavar tres veces con PBS/BSA al 1%.. 7. De manera secundaria, el anticuerpo antiratón-Alexa 568 de cabra (concentración final 0.02 mg/ml) se diluye en PBS/BSA al 1%, periodo de incubación de 30 minutos. 8. Se lava tres veces con PBS/BSA al 1%. 9. Se cubre con 5 µ? de PBS/BSA al 1% y se examina bajo un microscopio. 1.4.2 Método directo 1. Se incuba durante 1 hora con el anticuerpo A45B/B3- Alexa 488 (concentración final 0.0014 mg/ml) diluido en PBS/BSA al 1%. 2. Se lava tres veces en PBS/BSA al 1%. 3. Se incuba durante 1 hora con el anticuerpo IIIFIO-Alexa 568 (concentración final 0.003 mg/ml), diluyendo en PBS/BSA al 1%. 4. Se lava tres veces en PBS/BSA al. 1%. 5. Se cubre con 5 µ? de PBS/BSA al 1% y se examina bajo un microscopio. 1.5 Cuantificación .

Los antigenos que reaccionan con el anticuerpo fluorescente se visualizan en un microscopio de barrido láser confocal a un rango de excitación de 488 nm y 568 nm. Las células de tumor se dividen de 20 hasta 30 planos de sección explorando la célula en un microscopio láser, esto es, en etapas de colocar capas de 0.5 µt?. Todas las fluorescencias se detectan y la suma de estas medidas se calcula. Los antigenos en la célula de tumor que se hacen reaccionar con el anticuerpo, pueden cuanti ficarse con base en una curva estándar que se ha construido previamente midiendo perlas de látex que contienen una cantidad definida de tinte fluorescente. La figura 1 muestra un diagrama del principio del procedimiento de barrido usado para localizar y cuantificar la etiqueta fluorescente. Las figuras 2N hasta 7 muestran ejemplos de los resultados para la aplicación práctica del método de conformidad con la invención. 2. Especificidad del tumor del anticuerpo monoclonal IIIF10. Se desarrollaron dos diferentes sistemas ELISA para la detección del antigeno uPAR: 1) Anticuerpo de captura: anticuerpo de pollo policlonal HU277 (Magdolen y colaboradores (1995), supra; anticuerpo de detección: anticuerpo monoclonal IIIF10 (Lether y colaboradores (1997), supra). , _ 2) Anticuerpo de .captura: anticuerpo de pollo policlonal HU277; anticuerpo monoclonal HD13.1 (Todd y colaboradores (1997), supra). Estos sistemas ELISA se comparan con un ELISA comercialícente disponible (ADI) para uPAR (American Diagnostica Inc. Greenwich, CT, USA) . Los sistemas ELISA probados se igualan usando uPAR humano purificado por afinidad recombinante (rec-uPAR) expresado en células CHO. Todos los tres sistemas ELISA exhiben una linealidad y sensibilidad comparables hacia el rec-uPAR. En experimentos adicionales, se demuestra que el antigeno uPAR actual contenido en la célula también puede determinarse en presencia de excesos de hasta seis veces de uPAR. La recuperación fue de > 95% en el caso de IIIF10/HU277 y el HD13.1/HU277 prueba y > 80% en el caso de la prueba ADI. La relación uPA uPAR en - 599 tumores extraídos analizados típicamente es de < 3' en 95% de los casos (pruebas con ADI-UPA y ADI -uPAR-ELISA) . Estos resultados se muestran en la figura 8. Posteriormente, los contenidos de antígeno uPAR se determinan lisando varios tipos de células. Esto muestra que la determinación del antígeno uPAR en células no malignas (por ejemplo, queratinocitos [HaCaT], células endoteliales del cordón umbilical [HUVEC] , células epiteliales del pecho [ HMEC ] dan resultados comparables en los tres sistemas ELISA . En contraste, la situación fue completamente diferente en el caso . de las lineas de célula de tumor. En células de carcinoma de pecho bien diferenciadas, solamente el IIIF10/HU277 ELISA detectó cantidades significantes de uPAR asociado al tumor, mientras que en lineas de célula de carcinoma de pecho pobremente diferenciadas, el IIIF10/HU277 y el ADI -ELISA dieron valores comparables. El HD13.1/HU277-ELISA detectó muy poco uPAR en células de carcinoma bien diferenciadas asi como pobremente diferenciadas. Los datos se muestran en la figura 9. 3. Relevancia prognostica del anticuerpo monoclonal IIIF10. En un estudio clínico, el' contenido del antígeno uPAR se determina usando los tres sistemas ELISA descritos en el ejemplo 1, en muestras de tumor de 200 pacientes con carcinoma de pecho. Esto muestra que los valores de antígeno medidos con el- IIIF10/HU277-ELISA tienen ¦ una relevancia prognostica importante para el curso de la enfermedad, esto es, para la ausencia de reincidencia o muerte. Tal relevancia- prognostica no se encuentra con los otros dos sistemas ELISA. Los datos se muestran en la figura 10.

. Efecto in vivo del anticuerpo monoclonal IIIFIO .

Se inyectaron ratones desnudos de 4 a 6 semanas de edad Balb/C/3 en el costado derecho con 6xl06 células de cáncer de pecho humano MDA- B231 (Price y colaboradores, Cáncer Res. 50 (1990), 717-721) en un volumen total de 300 µ? . Antes de la inyección, las células de cáncer .se mezclaron en cada uno de los casos con 200 µg del anticuerpo monoclonal de murina IIIFIO en PBS, pH 7.4. Posteriormente, los ratones se trataron intraperitonealmente con el anticuerpo monoclonal IIIFIO a una dosis de 2 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal en un volumen de inyección de 300 µ? . El volumen de los tumores primarios en cm3 que se presentan en los ratones, se determinó después de cuatro semanas midiendo los dos diámetros más grandes de los tumores. Se administró PBS a un pH de 7.4 a los ratones de control, cada uno de los grupos consistía de seis ratones. Los resultados se muestran en la figura 11. Puede observarse que la administración del anticuerpo reduce de forma importante el crecimiénto de tumores primarios. La inhibición del crecimiento fue aún más pronunciada cuando se administraron 10' mg/kg de peso corporal que cuando se administró una dosis de 2 mg/kg de peso corporal.

. Preparación .de anticuerpo monoclonal recombinante IIIF10. Se aisló mARN de células de hibridoma que producen IIIF10 y se transcribieron en cAD . Los fragmentos de cADN que codifican a las regiones variables de la cadena pesada (VH) y la cadena ligera (VL) , se amplificaron por RT-PCR usando cebadores específicos de genes. Los segmentos de gen VH y VL se clonaron en un vector fagémido para habilitar la expresión de las regiones variables como un anticuerpo de cadena simple (scFv) . Las moléculas svFv se presentaron por exhibición de fagos en la superficie de los fagos filamentosos como una proteína de fusión que contenia la proteína de recubrimiento de fago pequeño pIII. Los fagos que exhiben una expresión funcional del scFv-FIIHO se seleccionan por enlace específico del uPAR. Los fagos seleccionados se usan para infectar células de E. coli que permiten la producción y secreción de moléculas scFv solubles en el medio de cultivo. La figura 12 muestra el enlace del sobrenadante scFv para uPAR inmovilizado en una fase sólida. La capacidad de enlace de los anticuerpos scFv-anti-X y scFv-antí-Y también se prueba para propósitos de control.

Con objeto de probar adicionalmente la especificidad de enlace, los péptidos se usaron de tal manera que se usan para mapear el epítope del anticuerpo IIIF10 (Luther y colaboradores, J. Pathol 150 (1997), 1231-1244. Como c puede observarse en la figura 13, sólo un péptido, la secuencia del cual contiene el epitope IIIF10 completo en uPAR (51-65) , puede prevenir- el enlace del anticuerpo monoclonal y del scFvIIIFlO al uPAR. Otro péptido con una secuencia epitope incompleta (48 hasta 59) es > 100 veces menos efectivo. Ninguno de los péptidos puede prevenir el enlace, de un anticuerpo de control scFv-anti-X para su proteína objetivo X. La secuencia de nucleótido del VH de cADN y la correspondiente secuencia de aminoácido se muestran en la SEQ ID NO. 1/2. La secuencia de nucleótido del.VL de cADN y la correspondiente secuencia de aminoácido, se muestran en la SEQ ID NO. 3/4. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el -que resulta claro de la presente descripción de la invención.

PROTOCOLO DE SECUENCIA <110> Wilex 3iotechnology GmbH < i 20 > Diagnostico y uso terapéutico de anticue rpos contra el receptor de urocinasa <130> 19116P£? . <140> <141>' <160> 2 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 354 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia fago <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 1 cag gtg caa ctg cag cag tca gga cct gag ttg gtg aag cct ggg gct 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 - 10 15 tta gtg aag ata tcc tgc aag gct tct ggt tac agt tcc acá age tac 96 Leu Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 gat ata aat tgg gtg aag cgg agg cct gga cag gga ctt gag tgg att 144 Asp lie Asn Trp Val Lys Arg Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie 35 40 4S gga tgg att ttt cct gga gat ggt agt acc aat tac aat gag aaa tt 192 Gly Trp lie Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr.Asn Glu Lys ?he 50 55 60 aag gac aag gcc acá ctg act gct gac aaa tcc tcc age acá g c tac 240 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 SO a-g cag ctc aac age ctg act tet gag aac tet gca gtc car ttc tg 2 ~ Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asn Ser Ala al Tyr ?he Cys 85 90 35 g a aga gat gga age atg ggg ggg ttt gac tac tgg ggc caá ggg acc 325 Ala Arg As? Gly Ser Mee Gly Gly Phe As ^ Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 acg gtc acc gtc tec tea 35·) Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Secuencia artificial <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia fago <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Leu Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp lie Asn Trp Val Lys Arg Axg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45 Gly Trp lie Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asn Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala A g Asp Gly Ser Met Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 324 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <22l> CDS <222> (1) .. (324) <220 <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia fago <400> 3 gat gtt ttg atg acc caa act cca aaa .ttc atg tcc ac tea gta gga 43 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 gac. agg gtc age ate acc tgc aag gcc agt cag aat gtt cgt act act 96 Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Thr 20 25 30 gta gcc tgg tat caa gag aaa cca ggg cag tct ect aaa gca ctg att 144 Val Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu lie 35 40 45 tac ttg gca tcc aac cgg cae act gga gtc ect gat cgc tt acá ggc 192 Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt gga tct gga acá gat ttc act etc acc att age aat gtg caa tct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 30 gaa gac ctg gca gat tat ttc tgt ctg caa cat tgg aat tat ccg tac 288 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro Tyr 35 - 90 95 acg ttc gga ggg ggc acc aag ctg gaa ate aaa cgg 324 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Secuencia artificial <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia fago <400> 4 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly i 5 - 10 15 Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Thr 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu lie 35 40 45 Tyr Leu Ala Se Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 . 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 ¦ 105

Claims (23)

1. Reivindicaciones . Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido' en las siguientes reivindicaciones. 1. Un método para la detección cuantitativa de células de tumor epiteliales en una muestra biológica, caracterizado porque la muestra biológica contiene las células a detectarse en un rango de 1:104 hasta 1:107 del total de células presentes en la muestra, que comprende las etapas de: . (a) preparar una muestra a probarse, (b) poner en contacto la muestra con al menos dos diferentes moléculas de enlace que reconocen las células a detectarse, las moléculas de enlace están cada una etiquetadas con diferentes tintes fluorescentes y una de las moléculas de enlace es especifica para el receptor de urocinasa, y (c) determinar las etiquetas fluorescentes en la muestra fijada en una fase sólida.
2. 2. El método de' conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la detección se lleva a cabo en una muestra de medula ósea.
3. 3. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 2, caracterizado porque los anticuerpos o. fragmentos de anticuerpo y/o los ligandos del receptor se usan como moléculas de enlace especificas para la célula.
4. 4. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 2 hasta 3/ caracterizado ¦¦ porque se usa una segunda molécula de enlace especifico de citoqueratina .
5. 5. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 4, caracterizado porque las moléculas de enlace se etiquetan indirectamente.
6. 6. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 4, caracterizado porque las moléculas de enlace se etiquetan directamente.
7. 7. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 6, caracterizado porque la muestra se evalúa cuantitativamente por un microscopio de barrido láser confocal o por un microscopio fluorescente.
8. 8. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7, caracterizado porque la muestra se evalúa por una determinación en paralelo y/o secuencial de la fluorescencia de los diferentes grupos de etiquetado.
9. 9. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 8, caracterizado porque comprende adicionaliaente una caracterización de las células identificadas por la reacción con las moléculas de enlace. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la caracterización comprende una determinación de sitio especifico de la etiqueta fluorescente. 11. Un estuche de reactivos para la detección cuantitativa de células en una muestra biológica, caracterizado porque comprende (a) una primera molécula de enlace que reconoce las células a detectarse, y un primer grupo de etiquetado fluorescente, . la molécula de enlace siendo especifica para el receptor de urocinasa, (b) una segunda molécula de enlace que reconoce las células a detectarse y un segundo grupo de etiquetado fluorescente, la primera y segunda moléculas de enlace y el primer y segundo grupo de etiquetado fluorescentes son diferentes, y (c) medios para fijar las células en una fase sólida. 12. El uso del método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 10, o el estuche de reactivos de conformidad con la reivindicación 11, para detectar micrometástasis en muestras biológicas. 13. El uso de un anticuerpo que se dirige contra el epitope - 52-60 del receptor de urocinasa (uPAR) o del fragmento de enlace al antigeno del mismo para producir un agente de diagnóstico dirigido contra el uPAR en células de tumor para elaborar una prognosis del curso de las enfermedades malignas. 14. El uso de conformidad con la reivindicación 13, como un agente de diagnóstico para detectar células de tumor en una muestra biológica. 15. El uso de conformidad con la reivindicación 14, para detectar células de tumor diseminadas en la medula ósea. 16. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 14 hasta 15, en un ELISA. 17. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 14 hasta 15, en un método de detección de fluorescencia doble. 18. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 13 hasta 17, en donde el anticuerpo se selecciona del anticuerpo monoclonal IIIF10, fragmentos de los mismos o anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que tienen una especificidad de enlace equivalente. 19. El ácido nucleico recombinante que codifica a un péptido · que tiene unas propiedades de anticuerpo, caracterizado porque comprende (a) una secuencia CDR3-VH que codifica la secuencia de aminoácido (I) : D G S M G G F D Y y/o 5 (b) una secuencia CDR3-VL que codifica para la secuencia de aminoácido (II): L Q H W N Y P Y T. 20. Un polipéptido recombinante que tiene propiedades de anticuerpo, ' caracterizado porque
10. 10. comprende : ' (a) una secuencia de aminoácido CDR3-VH (I): D G S G G F D Y y/o (b) una secuencia de aminoácido CDR3-VL (II): 15 L Q H W N Y P Y T. 21. El polipéptido recombinante de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque es un fragmento de anticuerpo scFv. 22. El polipéptido recombinante de conformidad con 20 la reivindicación 20 o 21, caracterizado porque es un fragmento de anticuerpo humanizado. 23. El polipéptido recombinante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 20 hasta 22, caracterizado porque se acopla a un grupo efector. 25