JPH09509250A

JPH09509250A - マルチパラメータフローサイトメトリーによる充実性腫瘍の分析

Info

Publication number: JPH09509250A
Application number: JP7519606A
Authority: JP
Inventors: メリッサシーオブライエン; ウェイドイーボルトン
Original assignee: クールターコーポレイション
Priority date: 1994-01-21
Filing date: 1995-01-13
Publication date: 1997-09-16
Also published as: WO1995020054A1; EP0741798A4; EP0741798A1; AU1603395A

Abstract

(57)【要約】不均一試料中の選択した集団を単離し、同定し及び／又は分析するための方法及び試薬系を開示する。本発明の方法及び試薬系は、細胞の正確な研究及び／又は分析がその細胞の単離又は濃縮を必要とする任意の環境に適用することができる。本発明を有利に用いることができる環境の一例は、蛍光測定機器、例えばフローサイトメーターによる腫瘍細胞の分析である。

Description

【発明の詳細な説明】マルチパラメータフローサイトメトリーによる充実性腫瘍の分析本出願は、この出願と共に出願した、細胞の単離、同定及び／又は分析のための実行可能なプローブ(Viability Probes for Isolation，Identification and/ or Analysis of Cells)と題した、出願番号第139,647 号に関連する。参考のため、その出願を本出願と共に説明する。技術分野本発明は、生物学的試験、特に、不均一試料中の細胞の選択した亜集団の生物学的パラメータを同定し、及び分析する方法に関する。本発明の方法は、充実性腫瘍のような複雑な生物学的試料の分析を、細胞のパラメータとして有益な生物学的プローブ、例えば、生存力、組織の種類、腫瘍関連抗原の発現、増殖、及びデオキシリボ核酸(DNA)含量の組合せを用いて細胞を染色することにより、促進する。背景技術比較的最近導入されて以来、フローサイトメトリーは細胞の研究において非常に貴重な手段となった。目下、細胞等の粒子を検出するのに有用な、既知で且つ入手し得るフローサイトメーターには、一般に、蛍光及び光散乱を測定するための１種以上の光源（通常レーザー）及び光検出器が含まれる。光散乱パターン及び蛍光標識の蛍光放出は、連続的に流れる流れの中の細胞に入射する光により生じ、細胞混合物中の細胞の亜集団を識別するのに用いることができる。フローサイトメトリーを最初に用いた例は、細胞の DNA含量及び増殖能力の分析である。腫瘍学の分野では、これらのパラメータと疾病の予後及び処置との相関関係に多くの努力が払われてきた。例えば、Barranco，et al.の、Cancer Res earch, Vol．42，pgs．1 2894〜2898（1982）参照。フローサイトメトリーの他の初期の研究は、免疫表現型決定であり、蛍光色素結合抗体を用いた染色による細胞の同定は、特定の抗原決定基に対して向けられていた。最初の免疫表現型決定は、機器類、蛍光団の有用性、及び単一のマーカーのための抗体産生技術により制限を受ける。 DNA 含量及び単一マーカーの発現は、いずれも情報の重要な部分であるが、それらは充実性腫瘍のような複雑な生物学的試料の分析において有用性が制限される。第１の理由は、細胞機能が高度の相互作用プロセスであり、その知見が、分析されたマーカーの数に比例し、及び相関するからである。第２に、充実性腫瘍が、実際の腫瘍細胞、並びに多数の死細胞に加え、多数の正常細胞種を含むことがあるためである。十分な数量では、これらの”汚染”細胞は腫瘍細胞を完全に覆い隠すことができる。したがって、標的細胞の正確な分析は、標的集団、即ち生きた腫瘍細胞の、他の細胞種からの単離、又は濃縮に依存する。光散乱に基づく電気的なゲートでの制御は、標的細胞集団を単離するための、最も普通の技術である。異なる種類の細胞は、フローサイトメーター中のレーザー光線を通って流れる際に、入射光を異なって散乱させ、及び２、３の細胞種を含む試料において、光散乱の相違を用いて、一種の細胞種を他の細胞種から識別することができることが多い。次に、標的細胞集団を、電気的なゲートでの制御、即ち、光散乱ヒストグラムでの適切な集団をビットマッピングすることにより、分析のために単離することができる。ゲート制御についての概要は、Bauer et al.の、Clinic al Flow Cytometry，Principles and Applications 、第５章、87〜88頁（Willia m 及びWilkins、1993）を参照。しかし、光散乱に基づくゲートでの電気的制御により、細胞集団を分離する試みは、著しい多態性のため、充実性腫瘍において僅かに好結果がでるにすぎない。これらの技術的な困難性は、造血腫瘍よりも充実性腫瘍の分析においてより特徴的である。その理由は、一般的に、充実性腫瘍の一層大きな不均一性、及び充実性腫瘍を機械的及び化学的に分離し、フローサイトメトリーで必要とされる単一細胞懸濁液にすることにより生じる細胞の損傷のためである。最近のモノクローナル抗体及び蛍光色素の進歩により、機器類、マルチパラメータフローサイトメトリーが発達した。複数マーカーの同時分析及び相関関係は、標的細胞を濃縮する他の方法を提供する。また、マルチパラメータの相関関係は、我々の細胞生物学の知見を増し、遠大な診断及び予後の掛かり合いを有する。一旦、分析が単一のマーカーの発現又は DNA含量の測定に限られると、研究者は次に、抗原発現と細胞種、増殖、倍数性、生存力、等とを相関させることができる。この技術の分析能力は膨大であり、その理由は、事実上無数の利用可能なマーカーの組合せによるためである。 Zarbo et al.の、Analytical and Quantitative Cytology and Histology，11 ：391〜402(1989)は、組織特異マーカーを用いて、DNA 分析のための充実性腫瘍細胞を単離することが開示されている。しかし、その技術は、一般に、比較的少ないマーカーの同時分析に限られる。その理由は、機器の制限、蛍光団の有用性、及び技術的困難性、例えば、低い生存力及び結合表面並びに細胞内染色と関連するもののためである。したがって、不均一試料、特に、充実性腫瘍のような、生物学的プローブに非特異的に結合することにより著しく結果を歪ませる、多数の死細胞を含む試料の中の細胞の内、選択した亜集団の存在及び生物学的特性を測定する優れた方法の必要性が存在する。本発明は上記問題を、次のようにして解消する。(1)分析を著しく妨害することがある非標的細胞及び死細胞の排除により、分析の精度を十分に改善し、及び (2)５種のマーカーの相関関係分析によりフローサイトメトリーの分析力を高める。発明の開示概して、本発明は標的細胞集団、即ち、生きた腫瘍細胞を単離するために、種々のマーカーを用いた異なる染色に基づき、死細胞及び非標的細胞集団を電気的にゲートで制御して排出し、又は排除する方法である。次いで、生きた腫瘍細胞集団を、増殖状態、DNA 含量、及び腫瘍関連抗原の発現について分析することができる。したがって、本発明の目的は、複雑な生物学的組織を分析するために、細胞を単離するか、又は濃縮する方法を提供することにある。本発明の他の目的は、複雑な生物学的組織を分析するために、細胞を単離し、又は濃縮する方法であって、その細胞が生存力のある腫瘍細胞である方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、非腫瘍細胞及び死細胞を生物学的試料から除去する新規な方法を提供することにある。本発明の他の目的は、不均一試料の細胞におけるDNA 含量及び増殖を測定することにある。本発明の他の目的は、生物学的試料の細胞を染色する際に有用なマーカーのパネルを提供することにある。そのうえに、本発明の他の目的は、５種のマーカーの相関関係によりフローサイトメトリーの分析能力を拡大するための方法を提供することにある。本発明の他の目的は、５種の蛍光団を同時に測定するためのフローサイトメトリー技術を提供することにある。なおそのうえに、本発明の他の目的は、本発明のマーカーを用いる異なる染色及び”連続的なゲート制御”、並びに一連の連続したゲートでの制御を用いる異なる光散乱の少なくとも一方により、不均一試料中の死細胞及び非標的細胞集団を、電気的にゲートで制御して排出するための方法を提供する。本発明の他の目的は、不均一試料中の標的細胞を単離し及び濃縮することにより、分析の精度を十分に向上させることに関する。本発明の他の目的は、本発明のパラメータと薬物療法の処置及び応答の少なくとも一方とを相関させることに関する。本発明の他の目的は、本発明のパラメータとガン療法の処置及び応答の少なくとも一方とを相関させることに関する。本発明の他の目的は、複雑な生物学的組織の分析のために、細胞を単離するか、又は濃縮するキットを提供することにあり、このキットは、(1)生存マーカー、(2)腫瘍関連抗原、(3)組織特異抗原、(4)増殖関連抗原、及び(5)DNA 含量色素を含む各マーカーの容器を有する。本発明の他の目的、利点及び新規な特徴は、以下の説明で一部述べ、一部は以下の試験により当業者に明らかとなるか、又は本発明の実施により知ることができる。本発明の目的及び利点は、添付した請求の範囲で、特に指摘した手段及び組合せにより実現し及び達成することができる。図面の簡単な説明次に、本発明の好適例を、本明細書に添付した、以下に説明する図面を参照して、実施例により説明する：図１には、複数のゲートの連続した適用を示す、”連続的なゲートでの制御” の概念を図示する。図２Ａ〜Ｈには、細胞の混合物（25％の生きたMDA、25％の死んだMDA、25％の CEM、及び25％のリンパ球）並びにMC5-RDI、CK-ECD、PCNA-APCN、EMA（生存プローブ）、及びDAPIのカクテルを用いて染色した細胞から取得したすべてのパラメータの、ゲートで制御していないヒストグラム表示が含まれる。図３Ａ〜Ｈには、図２Ａ〜Ｈで規定した細胞混合物及び図２Ａ〜Ｈで規定したカクテルを用いて染色したものの、生存EMA −ゲート制御した表示が含まれる。図４Ａ〜Ｈには、図２Ａ〜Ｈで規定した細胞混合物及び図２Ａ〜Ｈで規定したカクテルを用いて染色したものの、生存−及びサイトケラチン−ゲート制御した表示が含まれる。図５Ａ〜Ｈには、図２Ａ〜Ｈで規定した細胞混合物及び図２Ａ〜Ｈで規定したカクテルを用いて染色したものの、生存−、サイトケラチン−、腫瘍関連抗原(M C5)−ゲート制御した表示が含まれる。図６Ａ〜Ｈには、図２Ａ〜Ｈで規定した細胞混合物及び図２Ａ〜Ｈで規定したカクテルを用いて染色したものの、生存−、サイトケラチン−、腫瘍関連抗原(M C5)−ゲート制御、及び集合表示が含まれる。図７Ａ〜Ｈには、MC5-RDI、CK-ECD、PCNA-FITC、7-AAD（生存プローブ）、及びDAPIのカクテルを用いて染色した、胸部腫瘍から取得したすべてのパラメータの、ゲートで制御していないヒストグラム表示が含まれる。図８Ａ〜Ｈには、図７Ａ〜Ｈで規定した腫瘍及び図７Ａ〜Ｈで規定したカクテルを用いて染色したものの、生存(7-AAD)−ゲート制御した表示が含まれる。図９Ａ〜Ｈには、図７Ａ〜Ｈで規定した腫瘍及び図７Ａ〜Ｈで規定したカクテルを用いて染色したものの、生存−及びサイトケラチン−ゲート制御した表示が含まれる。図１０Ａ〜Ｈには、図７Ａ〜Ｈで規定した腫瘍及び図７Ａ〜Ｈで規定したカクテルを用いて染色したものの、生存−、サイトケラチン−、腫瘍関連抗原(MC5) −ゲート制御した表示が含まれる。図１１Ａ〜Ｈには、図７Ａ〜Ｈで規定した腫瘍及び図７Ａ〜Ｈで規定したカクテルを用いて染色したものの、生存−、サイトケラチン−、腫瘍関連抗原(MC5) −ゲート制御及び集合表示が含まれる。図１２Ａ〜Ｄには、パネルＩ〜ＩＶ（以下に記載）のためのレーザー及び光学フィルタ配置を示す。発明を実施するための形態本発明は多くの異なる形態の例を満足するが、本明細書では、以下の記載が本発明の原理を例示するものであり、添付した請求の範囲及びその均等物により規定されるような、本発明の範囲を限定するものではないという条件の下に、本発明の特定例を詳細に説明する。本発明は、種々のマーカーを含むパネルを用いた、生物学的試料のマルチパラメータ分析を用いる方法を規定する。”連続的な”電気的ゲート制御の使用により、生存カマーカー、組織特異的マーカー及び疾病関連マーカーについてゲートで制御されたヒストグラムの生成により、生きた腫瘍細胞に対するDNA 及び増殖状態の分析に限定がもたらされる。本発明にかかるパネルには、(1)生存マーカー、(2)腫瘍関連抗原（例えば、上皮ムチン抗原[MC5]）、(3)組織特異抗原（例えば、サイトケラチン[CK]）、(4) 増殖関連抗原（例えば、増殖細胞核抗原[PCNA]）、及び(5)DNA 含量色素（例えば、DAPI）が含まれる。本発明の方法には、蛍光測定機器、好ましくは、フローサイトメーターにおける測定のために細胞を調製する工程が含まれる。かかる工程は本質的に次のものである： (a)細胞のアリコートを、遠心分離して分離する； (b)生存プローブを用いて細胞を染色し、次いで洗浄し； (c)生存色素が間接的な標識を必要とする場合、例えば、パネルＩＩ及びＩＶにおいて、二次抗体で染色し、洗浄し、次いで非結合型マウス抗体を用いて細胞を染色し、洗浄し； (d)腫瘍関連抗原を用いて細胞を染色し、２回洗浄し； (e)透過／固定剤、好ましくは、リゾルシチン／１％パラホルムアルデヒド中で、２分間インキュベーションし、遠心分離して分離し； (f)脱水剤、好ましくは、メタノール中で、10分間インキュベーションし、遠心分離して分離し； (g)洗浄剤、好ましくは、NP40中で、５分間インキュベーションし； (h)遠心分離して分離し； (i)増殖関連抗原マーカーを用いて細胞を染色し、洗浄し； (j)DNA 色素中に試料を再懸濁させ、約20分間インキュベーションし；及び (k)フローサイトメーターにより分析する。フローサイトメーターの原理及び操作は、よく知られており、本発明に用いるのに適切な種々のフローサイトメーターが市場で入手しうる。Flow Cytometry a nd Sorting 、Melamed et al.、第２版、（John Wiley 及び Sons，ニューヨーク、1990）参照。サイトメーターのようなフローサイトメトリー機器で用いられる。かかる機器は、シース流体の流れにより制限される円柱形の流れにおいて細胞を移動させる原理を用いている。細胞は、一列でレーザー光線を通って流れる。次に、細胞からの蛍光シグナル及び光散乱の少なくとも一方は、細胞集団の分類に用いられる。マルチパラメータ分析のための機器類及び蛍光団の発達は、さらに、Melamed et al.の、上記文献、第１、２及び１２章に説明されている。ゲート制御の技術を用いて、選択した細胞集団を分析することができる。本発明でのゲート制御の好ましい方法は、次のようである：生きた細胞を、生存色素に基づいて、最初にゲートで制御する。次に、腫瘍を起こさせる組織の種類に特異的な抗原を発現する生きた細胞をゲート制御する。次いで、腫瘍関連抗原を発現する組織の種類の生きた細胞をゲート制御する。最後に、これらの生きた腫瘍細胞だけのDNA 含量及び増殖状態を分析することができる。このようにして、分析の精度が著しく高められる。材料リン酸緩衝溶液、リゾホスファチジルコリン、Nonidet P-40(NP40)、7-AAD、及びDAPIをSigma Chemical Co.（米国、ミズーリ州、セントルイス所在）から得た。ウシ胎児血清及び無水メタノールをHyClone 社（米国、ユタ州、ローガン所在）及びJT Baker，Inc.（米国、ニュージャージー州、フィリップスバーグ所在）からそれぞれ購入した。フィコール−ハイパックは、ファルマシアLKB バイオテクノロジー（米国、ニュージャージー州、ピスカタウェイ所在）から購入した。パラホルムアルデヒドは、Fluka Chemie A．G.（スイス国、ブック所在）から得た。抗サイトケラチンモノクローナル抗体（RDI 又はECD と結合した）、抗MC -5抗体（RDI 又はAPC と結合した）、抗PCNA抗体（FITC、APC 又はCY5 と結合した）、及び適合するアイソタイプ対照は、Coulter Corporation（米国、フロリダ州、マイアミ所在）により提供された。抗αチューブリンをZymed Laboratori es，Inc.（米国、カリフォルニア州、サンフランシスコ所在）から購入した。FI TC結合ヒツジ抗マウスF(ab′)₂フラグメント(SAM-FITC)をSilenus Laboratories 社（オーストラリア国、ビクトリア所在）から得た。エチジウムモノアジドブロミド(EMA)は、Molecular Probes，Inc.（米国、オレゴン州、ユーゲニー所在）から購入した。RPMI及びダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)を、Biowhittaker 社（米国、メリーランド州、ウォーカースビル所在）から購入した。本明細書及び請求の範囲で用いた略号は、他に示さないかぎり次の意味である： CK-ECK: サイトケラチン−エネルギー共役色素； PCNA-APC: 増殖細胞核抗原−アロフィコシアニン； EMA:エチジウムモノアジド； DAPI: ４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール； CK: サイトケラチン 7-AAD:７−アミノアクチノマイシンＤ； PBS:リン酸緩衝溶液； FBS:ウシ胎児血清； F(ab′)₂: 抗原結合部位フラグメント； PCNA-CY5: 増殖細胞核抗原−シアニン５； APC:アロフィコシアニン； RD1:レッド色素１ FITC: フルオレセインイソチオシアネート； ECD:エネルギー共役色素 PI: プロピジウムイオダイド： MEM:改変イーグル培地； MDA: M．D．Anderson、cancer center 由来の細胞系。方法細胞の調製３種類の細胞を、本発明の最適化及び適用に用いた： (1)MDA-MB-175-VII 胸部ガン細胞系の培養細胞の均一試料；(2)胸部腫瘍をシミュレーションするために設計した細胞混合物であり、MDA-MB-175-VII胸部ガン細胞系の生きた細胞及び死んだ細胞の同数、CEM Ｔ細胞の白血病細胞系、及び正常白血球からフィコール分離したリンパ球を含むもの、並びに(3)充実性胸部腫瘍であり、単一細胞懸濁液にまで機械的に分離したものである。 MDA-MB-175-VII胸部ガン細胞系（American Type Culture Collection、米国、メリーランド州、ロックビル所在）の単層培養物を、10％のウシ胎児血清を添加した高グルコースDMEM中で、37℃、５％二酸化炭素(CO₂)の加湿雰囲気下に増殖させた。これらの培養物を対数増殖期に維持した。CEM（American Type Culture Collection、米国、メリーランド州、ロックビル所在）の懸濁培養物は、10％のウシ胎児血清を添加したRPMI中で、37℃、５％CO₂の加湿雰囲気下に増殖させた。これらの培養物を、対数増殖期に維持した。死細胞を含む細胞混合物のために、収集した細胞を、固く蓋をし、37℃の５％CO₂の加湿雰囲気下に維持し、充実性腫瘍の内的な低酸素環境をシミュレーションすることにより、餓死を誘導した。リンパ球を、次の方法を用いて、全血から分離した。全血を等量のPBS で希釈し、ピペットにより混合した。８Mlまでの希釈した血液を、15Mlのポリスチレン試験管中で、４Mlの室温フィコールハイパック上に重層した。これらの勾配物を、約30分間、400×g で遠心分離した。単核層をピペットにより除去し、15Ml の清浄なポリスチレン試験管に配置した。これらの試験管をPBS 及び 2.5％FBS( PBSF)で満たし、約10分間、室温で 400×g の遠心分離にかけた。上清を移し、試験管を再びPBSFで満たし、４℃で約10分間、300×g で遠心分離した。最後の洗浄を繰り返した。これらの細胞を少量のPBS に再懸濁させ、計数した。次に、この容積を所望の細胞濃度を達成できるよう、PBS を用いて調整した。充実性腫瘍を、単一細胞懸濁液にまで、機械的に分離した。標準的な方法により、次のようにした：約10mLの等張培地〔例えば、改変イーグル培地(MEM)〕を含む培地皿上で、外科用メスを用いて標本をスライスし、得られた細胞懸濁液を、210 から 44までの、連続的に直径を減少させたナイロンメッシュフィルタで濾過した。この試験管を、室温で約10分間、400 ×g で遠心分離し、上清を除去した。次いで、試験管をMEM + 10％FBS で満たし、再び室温で約10分間、400 ×g で遠心分離し、上清を除去した。これらの細胞を少量のPBS で再懸濁し、計数した。次いで、PBS でその容量を調整して、所望の細胞濃度を得た。細胞染色細胞を、12×75mmのシリコーン処理したガラス製試験管に、試験当たり１×10⁶ 細胞で等分した。試料を室温で約５分間、500 ×g で遠心分離した。上清を移し、これらの試験管をブロッティングした。PBS + 2.5 ％ FBS（PBSF）中の、20 0μL のチューブリン（又は他の生存マーカー；投与量は滴定により決定した）の動作希釈物(working dilution)を各試験試料に添加し、対照には200μL のPBS Fを添加した。試料を、EMA-染色試料を除き、渦巻き混合し、室温及び室内光で約15分間インキュベーションした。これらのEMA-染色試料は、約20cmの距離で、約15分間、蛍光に曝した。２mLのPBS を各試験管に添加し、これらの試験管を室温で、約５分間、500 ×g で遠心分離した。上清を移し、これらの試験管をブロッティングした。PBSF中の、SAM-FITC（又は、生存マーカーが直接結合していない場合には、他の第２の標識；投与量は滴定により決定した）の200 μL の動作希釈物を各試験試料に添加し、対照には200μL のPBSFを添加した。試料を渦巻き混合し、光から保護して、室温で約15分間インキュベーションした。２mLのPB Sを各試験管に添加し、これらの試験管を室温で、約５分間、500 ×g で遠心分離した。上清を移し、これらの試験管をブロッティングした。200 μL の非結合アイソタイプ対照（製造者が推奨する投与量で）を各試験管に添加して、SAM-FI TC上に残る任意の遊離抗体結合部位をブロックした。これらの試料を渦巻き混合し、約15分間室温でインキュベーションした。２mLのPBS を各試験管に添加し、室温で約５分間、500 ×g で遠心分離した。上清を移し、これらの試験管をブロッティングした。200 μL の蛍光団結合MC5（又は他の腫瘍関連抗原；投与量は滴定により決定した）の動作希釈物を各試験試料に添加し、及び同一の蛍光団に結合した 200μL のアイソタイプ対照（製造者が推奨する投与量で）をこれらの対照に添加した。これらの試料を渦巻き混合し、約15分間室温でインキュベーションした。２mLのPBS を各試験管に添加し、室温で約５分間、500 ×g で遠心分離した。上清を移し、これらの試験管をブロッティングした。洗浄を繰り返した。１％のパラホルムアルデヒド中の20μg/mLの室温のリゾホスファチジルコリンの１mLを各試験管に添加した。これらの試験管を渦巻き混合し、約２分間、室温でインキュベーションし、次いで、室温で、約５分間、500 ×g で遠心分離した。上清を移し、これらの試験管をブロッティングした。１mLの−20℃の無水メタノールを、各試験管に添加した。これらの試験管を渦巻き混合し、約10分間、氷上でインキュベーションし、次いで、室温で、約５分間、500 ×g で遠心分離した。上清を移し、これらの試験管をブロッティングした。１mLの４℃の0.1 ％NP40 を、各試験管に添加した。これらの試験管を渦巻き混合し、約５分間、氷上でインキュベーションし、次いで、室温で、約５分間、500 ×g で遠心分離した。上清を移し、これらの試験管をブロッティングした。50μg/mLの蛍光団結合PCNA（又は他の増殖関連抗原；投与量は滴定により決定した）の動作溶液、200 μL を各試験試料に添加し、及び同一の蛍光団に結合した 200μL のアイソタイプ対照（製造者が推奨する投与量で）をこれらの対照に添加した。これらの試料を渦巻き混合し、約15分間、室温でインキュベーションした。２mLのPBS を各試験管に添加し、これらの試験管を室温で、約５分間、500 ×g で遠心分離した。上清を移し、これらの試験管をブロッティングした。1.5 μg/mLのDAPIの動作溶液、１ mLを各試験管に添加した。これらの試験管を渦巻き混合し、室温で光から保護して、約20分間インキュベーションした。最後に、試料をフローサイトメトリーにより分析した。パネル本発明のパネルは、 (1)生存マーカー、(2)腫瘍関連抗原、(3)組織特異抗原、(4)増殖関連抗原、及び(5)DNA 含量色素からなる。本発明で用いるための好ましいパネルを、以下のパネルＩ〜ＩＶに示す。本発明に関連して、マーキング剤としてモノクローナル抗体が用いられる。標識剤(tagging agent)は、蛍光放出剤（蛍光団）を含み、単独か又はマーキング剤に結合して、細胞中か又は細胞上の構造を標識することができる。本発明で有用な蛍光団には、次のものに制限されないが、核酸特異色素、フィコビリンタンパク質、シアニン誘導体、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、又は上記物質の任意の組合せが含まれる。マーキング剤の例を、以下の表１に示す。フローサイトメトリーレーザー及び光学フィルタ配置試料は、５種の光電子増倍管と３種のレーザ：水冷の、５ワット(W)アルゴンレーザ、空冷の、15ミリワット(mW)で操作する488ナノメータ(nm)アルゴンレーザー、及び10mWの空冷の633nm のヘリウム−ネオンレーザー、とを配列したEPIC マイアミ所在）上で分析した。各パネルＩ〜ＩＶのためのレーザー及びフィルタ配置を、それぞれ、図１２のＡ〜Ｄに示す。パネルの１つを除き、すべてについて、励起のために３種のレーザーを用い；残りのパネルにおいて、２種のレーザーを用いた。これらのレーザーは、前述した概略図に示すように空間的に分けられた。これら図において２種のラインを互いに接近して引き、“＋”により結ばれた２種の波長で注釈付けられており、“ ＋”は同一線上のラインを示し、低い方のラインは40μ秒の距離により、上の方のラインと分けられている。すべての場合において、シグナルの時間−ゲート制御された増幅(time-gated amplification)を用いて、２種の蛍光チャネルのそれぞれについて、２種の蛍光団（各蛍光団は、２種の空間的に分けられたレーザーの１種により励起される）からデータを取得することができる。特に、DAPI及び FITCシグナルは、ゲート制御増幅を用いて、同一のチャネル（550nm の二色性ロングパスフィルタによる反射及び 525nmの帯域フィルタによる透過を用いること）により検出された；APC 及びエチジウムモノアジドは、ゲート制御された増幅を用いて、同一のチャネル（600nm の二色性ロングパスフィルタによる反射及び 635nmの帯域フィルタによる透過を用いること）により検出された；並びにAPC 及びCY5 は、ゲート制御増幅を用いて、同一のチャネル（650nm のロングパスフィルタによる反射及び 675nmの帯域フィルタによる透過を用いること）により検出された。RD1 の蛍光放出は、600 又は650nm の二色性ロングパスフィルタにより反射され、575nm の帯域フィルタにより透過された。ECD の蛍光放出は、600n m の二色性ロングパスフィルタにより透過され、610nm の帯域フィルタにより透過された。7-アミノアクチノマイシンＤの蛍光放出は、650nm の二色性ロングパスフィルタ及び675nm の帯域フィルタにより透過された。CY5 は、APC と混合しない場合、660nm の二色性ショートパスフィルタにより反射され、675nm の帯域フィルタにより透過された。染色していない対照の自己蛍光は、染色した試料と同様のフィルタ配置により測定した。このフィルタ配置はこの染色試料と調和させた。機器の較正フローサイトメーターを、機器のマニュアルに記載された方法に従って較正した。データの取得及び表示８種又は９種のパラメータが必要であり、どのカクテルを用いたかによる：前方の光散乱、側方の光散乱、５種又は６種の蛍光シグナル（いくつかの配置で、両ピークシグナル及び積分シグナルをDAPIのために収集した）、及びPRISM。少なくとも５千の結果を、各試料について、前方及び側方散乱の線形増幅、並びに DAPIを除くすべての蛍光シグナルの40の対数増幅を用いて、リストモードフォーマット中に収集し、DAPIは、積分シグナル、及びいくつかの配置では、またピークシグナルとしても獲得した。取得及び分析は、Elite ソフトウエアを用いて行った。Elite フローサイトメーターは、８種のヒストグラムの最大表示が可能である。８種の１−及び２−パラメータヒストグラムの組合せを、各パラメータが少なくとも１種のヒストグラムに表示されるように表示する。ゲート制御フローサイトメーターの共通の特徴は、コンピュータで処理したデータ表示及び分析を“ゲートで制御する”能力である。ゲート制御（２パラメータヒストグラム中の直線領域若しくはビットマップ又は１パラメータヒストグラム中の直線領域、選択した集団を含む）は、ヒストグラム表示に描かれ、蛍光及び光散乱（並びに、他に用いた任意のパラメータの少なくとも１種）の少なくとも１種のシグナル振幅の上限及び下限に対応するチャネル限界を確立する。データ取得を再スタートする際、ゲートを出た後、ゲート内のデータ（又はゲート外で、ゲートの平行状態に依存するデータ）のみが獲得され、表示される。本出願では、本発明者は”連続的なゲート制御”の技術を実行した。これによると、一連のゲートを使用し、アイソタイプ対照（及び生存プローブの場合には、未染色細胞）を用いて、背景を確立する。第１のゲートは、生存能力のある細胞だけを含むような生存ヒストグラムを描く（図３Ａ〜Ｈ及び図８Ａ〜Ｈ）。次いで、生存ゲートを残りのヒストグラム表示に適用し、及びデータ取得を再スタートした後、サイトケラチン陽性細胞（即ち、上皮起源の細胞で、胸部腫瘍細胞を生じさせるもの）だけを含むように、ゲートにサイトケラチンヒストグラム（図４Ａ〜Ｈ及び図９Ａ〜Ｈ）を描かせる。このゲートは、生存ゲートに加え、次に、残りのヒストグラム表示に適用し、及びデータ取得を再スタートした後、MC 5 染色について陽性の細胞だけを含むように、ゲートにMC5 ヒストグラム（図５Ａ〜Ｈ及び図１０Ａ〜Ｈ）を描かせる。次に、このゲートを、生存ゲート及びサイトケラチンゲートに加え、DAPI（適用できる場合、両ピークシグナル及び積分シグナル）及びPCNAの残りのヒストグラム表示に適用した。両ピーク及び積分DA PIシグナルを収集するこれらの配置において、４分の１のゲートがこれらの２種のシグナルを並べるヒストグラムを描き、主要な集団の約45°の角度の外部にある結果（即ち、集合体）を排除する。（図６Ａ〜Ｈ及び図１１Ａ〜Ｈ）。次に、このゲートを、生存ゲート、サイトケラチンゲート、及びMC5 ゲートに加え、残りのヒストグラム（即ち、１−パラメータDAPI及び２−パラメータDAPI／PCNAヒストグラム）に適用し、及び取得を再スタートさせた。図２Ａ〜Ｈ及び図７Ａ〜Ｈには、ゲートで制御していないヒストグラムを示す。ゲート制御の概要は、Ba uer et al.の、Clinical Flow Cytometry，Principles and Applications、第５章、87〜88頁（Williams and Wilkins、1993）に見出すことができる。ヒストグラム分析 Elite のソフトウエアにより、両ゲート制御及び分析領域（ゲート制御領域のように、分析領域は直線領域若しくは２−パラメータヒストグラム中のビットマップ又は１−パラメータヒストグラム中の直線領域であり、選択した集団を含む）により規定される集団について、統計学的データの計算が行える。計算された統計値には、これらの領域内の結果の数、及び平均チャネル、ピーク位置及びピーク高さ、標準偏差、並びに選択した集団（両ヒストグラム軸において、それらを適用できる）の変動係数、領域により規定されるすべてのヒストグラム結果の百分率が含まれる。免疫蛍光及び生存分析のための用途に用いられる統計値には、”陽性”の百分率（即ち、分析領域により規定されるすべてのヒストグラム結果の百分率であり、分析領域はアイソタイプ対照により確立される背景蛍光より高く設定され、及びアイソタイプ対照ヒストグラムのそれぞれにおけるすべての結果の約２％が含まれる）及び各パラメータについての、陰性集団に対する陽性集団の平均チャネルの比率が含まれる。DNA 分析のために本出願で用いる統計値には、平均チャネル及び分析領域内のすべての結果が含まれる。これらの領域には、G₀/G₁ピーク、G₂/Mピーク、又はこれら二種の間の結果（Ｓ期）が含まれるて行った。このプログラムは、Phoenix Flow Systems，Inc.（米国、カリフォルニア州、サンジエゴ所在）から購入した。本明細書に引用したすべての出版物は、本出願に関係する当業者のレベルを示すものである。各出版物は、引用した個所で参考のために個々に組み入れる。当業者は、所定の試薬及び条件が、その後の調製物及び方法において概要を示されているが、それらは変更することができ、それらの変更は、本発明の精神及び範囲に含まれることを意味すると認めるであろう。したがって、これらの調製物及び方法は、本発明を例示するために提供する。かかる代用手段は、次の請求の範囲に規定されているように、本発明の目的及び精神の内に含まれるものと解釈すべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年２月５日【補正内容】請求の範囲１．混合された細胞集団内の選択した細胞集団を同定し及び分析するにあたり、 (a)生物学的なプローブのパネルであって、組織の種類に特異的なマーカー、疾病状態に関連するマーカー、増殖マーカー、DNA 特異色素、及び生存マーカーより成るパネルを用いて、細胞試料を染色し； (b)この試料を蛍光測定機器に通し； (c)フローサイトメーターの結果からヒストグラムを得て；及び (d)非標的細胞及び死細胞を除去するために、電気的に連続してゲートで制御することを特徴とする、混合細胞集団内の選択した細胞集団の同定及び分析方法。２．細胞を染色するにあたり、さらに、 (a)細胞を単離し； (b)生存プローブを用いて染色し； (c)腫瘍関連抗原マーカーを用いて染色し； (d)透過／固定剤中でインキュベーションし； (e)脱水剤中でインキュベーションし； (f)洗浄剤中でインキュベーションし； (g)増殖関連抗原マーカーを用いて染色し；及び (i)試料を DNA色素中に再懸濁することを特徴とする、請求項１記載の方法。３．細胞の染色にあたり、さらに、 (a)細胞を単離し； (b)生存プローブを用いて染色し； (c)非結合型マウス抗体を用いて染色し、次に二次抗体を用いて染色し； (d)腫瘍関連抗原マーカーを用いて染色し； (e)透過／固定剤中でインキュベーションし； (f)脱水剤中でインキュベーションし； (g)洗浄剤中でインキュベーションし； (h)増殖関連抗原マーカーを用いて染色し；及び (j)試料を DNA色素中に再懸濁することを特徴とする、請求項１記載の方法。４．前記集団が新生物細胞であることを特徴とする、請求項１記載の方法。５．前記集団が充実性腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１記載の方法。６．前記集団が非付着腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１記載の方法。７．前記細胞が胸部腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項４記載の方法。８．生存マーカーが核酸特異色素であることを特徴とする、請求項１記載の方法。９．生存マーカーが細胞内抗原であることを特徴とする、請求項１記載の方法。１０．細胞内抗原がチューブリンであることを特徴とする、請求項９記載の方法。１１．生存マーカーが細胞骨格抗原であることを特徴とする、請求項１記載の方法。１２．細胞骨格抗原がサイトケラチンであることを特徴とする、請求項１１記載の方法。１３．パネルが、MC5-レッド色素１、サイトケラチン−エネルギー共役色素、増殖細胞核抗原−アロフィコシアニン、エチジウムモノアジド、及び４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールであることを特徴とする、請求項１記載の方法。１４．パネルが、MC5-レッド色素１、サイトケラチン−エネルギー共役色素、増殖細胞核抗原−フルオレセインイソチオシアネート、７−アミノアクチノマイシンＤ、及び４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールであることを特徴とする、請求項１記載の方法。１５．パネルが、MC5-アロフィコシアニン、サイトケラチン−レッド色素１、増殖細胞核抗原−シアニン５、チューブリン−ヒツジ抗マウス−フルオレセインイソチオシアネート、及び４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールであることを特徴とする、請求項１記載の方法。１６．パネルが、MC5-レッド色素１、サイトケラチン−エネルギー共役色素、増殖細胞核抗原−シアニン５、チューブリン−ヒツジ抗マウス−フルオレセインイソチオシアネート、及び４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールであることを特徴とする、請求項１記載の方法。１７．連続したゲートでの制御を、標的細胞の所望のパラメータの分析ができるように、ゲートで連続して適用することを特徴とする、請求項１記載の方法。１８．標的細胞が新生物細胞であることを特徴とする、請求項１７記載の方法。１９．標的細胞が充実性腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１７記載の方法。２０．標的細胞が非付着腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１７記載の方法。２１．標的細胞が胸部腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１７記載の方法。２２．ガン治療における薬物療法を監視するにあたり、蛍光測定機器により、適切な腫瘍関連マーカー及び DNA含量を測定することを特徴とする、ガン治療における薬物療法の監視方法。２３．不均一試料の細胞中の DNA含量及び増殖を測定するにあたり、 (a)生物学的なプローブのパネルであって、組織の種類に特異的なマーカー、疾病状態に関連するマーカー、増殖マーカー、DNA 特異色素、及び生存マーカーより成るパネルを用いて、細胞試料を染色し； (b)この試料を蛍光測定機器に通し； (c)フローサイトメーターの結果からヒストグラムを得て；及び (d)非標的細胞及び死細胞を除去するために、電気的に連続してゲートで制御することを特徴とする、不均一試料の細胞中の DNA含量及び増殖の測定方法。２４．透過／固定剤がリゾレシチン／パラホルムアルデヒドであることを特徴とする、請求項２又は３記載の方法。２５．脱水剤がメタノールであることを特徴とする、請求項２又は３記載の方法。２６．洗浄剤がNP40であることを特徴とする、請求項２又は３記載の方法。２７．複雑な生物学的組織を分析するために、マーカーのパネルから成り、各マーカーの容器を含む、細胞を単離するか又は濃縮するキットであって、前記パネルが： (a)生存マーカー； (b)腫瘍関連抗原； (c)組織特異抗原； (d)増殖関連抗原；及び (e)DNA 含量色素であることを特徴とする、複雑な生物学的組織の分析用の細胞の単離又は濃縮キット。２８．パネルが、MC5-レッド色素１、サイトケラチン−エネルギー共役色素、増殖細胞核抗原−アロフィコシアニン、エチジウムモノアジド、及び４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールであることを特徴とする、請求項２７記載のキット。２９．パネルが、MC5-レッド色素１、サイトケラチン−エネルギー共役色素、増殖細胞核抗原−フルオレセインイソチオシアネート、７−アミノアクチノマイシンＤ、及び４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールであることを特徴とする、請求項２７記載のキット。３０．パネルが、MC5-アロフィコシアニン、サイトケラチン−レッド色素１、増殖細胞核抗原−シアニン５、チューブリン−ヒツジ抗マウス−フルオレセインイソチオシアネート、及び４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールであることを特徴とする、請求項２７記載のキット。３１．パネルが、MC5-レッド色素１、サイトケラチン−エネルギー共役色素、増殖細胞核抗原−シアニン５、チューブリン−ヒツジ抗マウス−フルオレセインイソチオシアネート、及び４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールであることを特徴とする、請求項２７記載のキット。３２．生存マーカーが、核酸特異色素であることを特徴とする、請求項２７記載のキット。３３．生存マーカーが細胞内抗原であることを特徴とする、請求項２７記載のキット。３４．細胞内抗原がチューブリンであることを特徴とする、請求項３３記載のキット。３５．生存マーカーが細胞骨格抗原であることを特徴とする、請求項２７記載のキット。３６．細胞骨格抗原がサイトケラチンであることを特徴とする、請求項３５記載のキット。

Claims

【特許請求の範囲】１．混合された細胞集団内の選択した細胞集団を同定し及び分析するにあたり、 (a)生物学的プローブのパネルを用いて、細胞試料を染色し； (b)この試料を蛍光測定機器に通し； (c)蛍光測定機器の結果からヒストグラムを得て；及び (d)非標的細胞及び死細胞を除去するために、電気的に連続してゲートで制御することを特徴とする、混合細胞集団内の選択した細胞集団の同定及び分析方法。２．細胞を染色するにあたり、さらに、 (a)細胞を単離し； (b)生存プローブを用いて染色し； (c)腫瘍関連抗原マーカーを用いて染色し； (d)透過／固定剤中でインキュベーションし； (e)脱水剤中でインキュベーションし； (f)洗浄剤中でインキュベーションし； (g)増殖関連抗原マーカーを用いて染色し；及び (i)試料を DNA色素中に再懸濁することを特徴とする、請求項１記載の方法。３．細胞の染色にあたり、さらに、 (a)細胞を単離し； (b)生存プローブを用いて染色し； (c)二次抗体を用いて染色し、次に非結合型マウス抗体を用いて染色し； (d)腫瘍関連抗原マーカーを用いて染色し； (e)透過／固定剤中でインキュベーションし； (f)脱水剤中でインキュベーションし； (g)洗浄剤中でインキュベーションし； (h)増殖関連抗原マーカーを用いて染色し； (j)試料を DNA色素中に再懸濁することを特徴とする、請求項１記載の方法。４．前記集団が新生物細胞であることを特徴とする、請求項１記載の方法。５．前記集団が充実性腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１記載の方法。６．前記集団が非付着腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１記載の方法。７．前記細胞が胸部腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項４記載の方法。８．パネルが、組織の種類に特異的なマーカー、疾病状態に関連するマーカー、増殖マーカー、DNA 特異色素、及び生存マーカーであることを特徴とする、請求項１記載の方法。９．生存マーカーが核酸特異色素であることを特徴とする、請求項８記載の方法。 10．生存マーカーが細胞内抗原であることを特徴とする、請求項８記載の方法。 11．細胞内抗原がチューブリンであることを特徴とする、請求項１０記載の方法。 12．生存マーカーが細胞骨格抗原であることを特徴とする、請求項８記載の方法。 13．細胞骨格抗原がサイトケラチンであることを特徴とする、請求項１２記載の方法。 14．パネルが、MC5-レッド色素１、サイトケラチン−エネルギー共役色素、増殖細胞核抗原−アロフィコシアニン、エチジウムモノアジド、及び４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールであることを特徴とする、請求項８記載の方法。 15．パネルが、MC5-レッド色素１、サイトケラチン−エネルギー共役色素、増殖細胞核抗原−フルオレセインイソチオシアネート、７−アミノアクチノマイシンＤ、及び４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールであることを特徴とする、請求項８記載の方法。 16．パネルが、MC5-アロフィコシアニン、サイトケラチン−レッド色素１、増殖細胞核抗原−シアニン５、チューブリン−SAM −フルオレセインイソチオシアネート、及び４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールであることを特徴とする、請求項８記載の方法。 17．パネルが、MC5-レッド色素１、サイトケラチン−エネルギー共役色素、増殖細胞核抗原−シアニン５、チューブリン−SAM −フルオレセインイソチオシアネート、及び４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールであることを特徴とする、請求項８記載の方法。 18．蛍光測定機器がフローサイトメーターであることを特徴とする、請求項１記載の方法。 19．連続したゲートでの制御を、標的細胞の所望のパラメータの分析ができるように、ゲートで連続して適用することを特徴とする、請求項１記載の方法。 20．標的細胞が新生物細胞であることを特徴とする、請求項１９記載の方法。 21．標的細胞が充実性腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１９記載の方法。 22．標的細胞が非付着腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１９記載の方法。 23．標的細胞が胸部腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１９記載の方法。 24．ガン治療における薬物療法を監視するにあたり、蛍光測定機器により、適切な疾病関連マーカー及び DNA含量を測定することを特徴とする、ガン治療における薬物療法の監視方法。 25．不均一試料の細胞中の DNA含量及び増殖を測定することを特徴とする、請求項１記載の方法。 26．蛍光測定装置がフローサイトメーターであることを特徴とする、請求項１、２４及び２５のいずれか一項記載の方法。 27．透過／固定剤がリゾルシチン／パラホルムアルデヒドであることを特徴とする、請求項２又は３記載の方法。 28．脱水剤がメタノールであることを特徴とする、請求項２又は３記載の方法。 29．洗浄剤がNP40であることを特徴とする、請求項２又は３記載の方法。 30．複雑な生物学的組織を分析するために、マーカーのパネルから成り、各マーカーの容器を含む、細胞を単離するか又は濃縮するキットであって、前記パネルが： (a)生存マーカー； (b)腫瘍関連抗原； (c)組織特異抗原； (d)増殖関連抗原；及び (e)DNA 含量色素であることを特徴とする、複雑な生物学的組織の分析用の細胞の単離又は濃縮キット。 31．パネルが、MC5-レッド色素１、サイトケラチン−エネルギー共役色素、増殖細胞核抗原−アロフィコシアニン、エチジウムモノアジド、及び４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールであることを特徴とする、請求項３０記載のキット。 32．パネルが、MC5-レッド色素１、サイトケラチン−エネルギー共役色素、増殖細胞核抗原−フルオレセインイソチオシアネート、７−アミノアクチノマイシンＤ、及び４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールであることを特徴とする、請求項３０記載のキット。 33．パネルが、MC5-アロフィコシアニン、サイトケラチン−レッド色素１、増殖細胞核抗原−シアニン５、チューブリン−SAM −フルオレセインイソチオシアネート、及び４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールであることを特徴とする、請求項３０記載のキット。 34．パネルが、MC5-レッド色素１、サイトケラチン−エネルギー共役色素、増殖細胞核抗原−シアニン５、チューブリン−SAM −フルオレセインイソチオシアネート、及び４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールであることを特徴とする、請求項３０記載のキット。 35．生存マーカーが、核酸特異色素であることを特徴とする、請求項３０記載のキット。 36．生存マーカーが細胞内抗原であることを特徴とする、請求項３０記載のキット。 37．細胞内抗原がチューブリンであることを特徴とする、請求項３６記載のキット。 38．生存マーカーが細胞骨格抗原であることを特徴とする、請求項３０記載のキット。 39．細胞骨格抗原がサイトケラチンであることを特徴とする、請求項３８記載のキット。