ES2939298T3 - Combinación de marcadores para el diagnóstico del cáncer - Google Patents

Abstract

Se describe un método para diagnosticar un cáncer o una lesión premaligna. El método que comprende determinar un nivel de expresión de CD24 en leucocitos comprendidos en una muestra biológica de un sujeto, en el que un nivel de CD24 en leucocitos pequeños y no en leucocitos grandes por encima de un umbral predeterminado es indicativo de cáncer o lesión premaligna. También se describen un método para controlar la eficacia de la terapia contra el cáncer y un kit para diagnosticar un cáncer o una lesión premaligna. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Combinación de marcadores para el diagnóstico del cáncer

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a métodos para diagnosticar el cáncer o predisposición al mismo mediante la determinación del nivel de expresión de CD24+CD11b- en una muestra que comprende leucocitos.

CD24, una molécula de superficie celular similar a la mucina, tiene un nivel alto de expresión en una gran variedad de tumores sólidos, así como en malignidades hematológicas, ya de manera temprana en el proceso de múltiples etapas de la carcinogénesis, y se encontró que se correlacionaba con un mal pronóstico y un curso más agresivo de la enfermedad. Se mostró previamente que la conjugación de anticuerpos monoclonales (mAb) anti-CD24 (SWA11) con un derivado truncado de exotoxina de Pseudomonas (PE38) mataba selectivamente las células cancerosas humanas en ratones e inducía la apoptosis sin toxicidad para los tejidos normales [Shapira et al., Gastroenterology (2011) 140: 935-946]. En el ICPC (Centro Integrado de Prevención del Cáncer) se desarrollaron nuevos anticuerpos monoclonales humanizados dirigidos frente a CD24 y se descubrió que eran específicos para las células cancerosas que expresaban CD24.

El cáncer colorrectal (CRC) es un problema de salud importante en todo el mundo (1,2 millones de casos nuevos por año y aproximadamente medio millón de muertes en todo el mundo). La carcinogénesis del CRC es un proceso de múltiples etapas que abarca más de 10-20 años, lo que proporciona una ventana de oportunidad para una intervención y prevención efectivas. La extirpación de la lesión premaligna, el adenoma, puede prevenir el CRC. La detección temprana, p. ej., cuando el paciente está asintomático, es la terapia individual más importante. La detección temprana puede mejorar significativamente la morbilidad y la mortalidad. Sin embargo, aunque estas estrategias se consideran práctica clínica estándar, su impacto es limitado debido a la invasividad, la baja adherencia o el alto costo. El número de muertes por CRC sigue siendo alarmantemente alto y hace que la prevención del CRC sea primordial.

El cáncer pancreático (PC) es la cuarta causa de muerte por cáncer, siendo responsable del 7 % de todas las muertes relacionadas con el cáncer tanto en hombres como en mujeres. No existe una herramienta de diagnóstico estándar para PC. Cuando se diagnostica temprano, la resección quirúrgica ofrece la mejor oportunidad de supervivencia a largo plazo para este cáncer devastador, que actualmente tiene menos del 5 % de supervivencia a cinco años y una esperanza de vida media de 3-6 meses.

Los linfomas y las leucemias son enfermedades muy heterogéneas, que varían tanto por el tipo de célula maligna como por la localización del tumor. Actualmente, no existe un análisis de sangre u otra herramienta de cribado para la detección y el diagnóstico tempranos.

Se ha mostrado que el diagnóstico temprano mejora significativamente el pronóstico y disminuye significativamente la morbilidad y la mortalidad de varios tipos de cáncer. La herramienta de cribado debe ser lo suficientemente no invasiva, económica y debe permitir una amplia aplicabilidad para que las poblaciones sanas estén dispuestas a realizarla periódicamente. Así, por ejemplo, un simple análisis de sangre aumenta el cumplimiento del cribado, promoviendo la detección temprana y mejores resultados para los pacientes. Un ejemplo de ello es el ensayo de ADN metilado de Septina 9 (SEPT9) en sangre, que detecta específicamente los CRC con una sensibilidad general del 90 % [Kristiansen G et al., J M olH istol(2004) 35:255-62; Warren JD et al., BMC Med (2011) vol. 9: artículo 133]. Sin embargo, el ensayo de Septin 9 en plasma detectó solo el 12 % de los adenomas con una tasa de falsos positivos del 3 % y más tarde se mostró que el ensayo en heces es más preciso [Tóth K et al., PLoS One (2012) vol. 7(9): ID de artículo e46000].

Algunos inventores de la presente invención han desarrollado previamente una tecnología para la detección y diagnóstico de diversas malignidades humanas. Por ejemplo, se mostró previamente que el nivel de expresión de CD24 en leucocitos de sangre periférica puede usarse para la detección temprana de adenomas colorrectales y CRC [Kraus et al., Dis Markers (2009) doi: 10.1155/2015/916098. Epub 2015 11 de mayo].

El arte anterior adicional incluye:

La Aplicación de Patente de EE. UU. no.20040005596 de Li J. et al. divulga métodos para diagnosticar el cáncer mediante la determinación del nivel de CD24 in situ en muestras de tejido sospechosas de ser precancerosas o cancerosas.

La Publicación PCT No. WO 2007/088537 de Arber N. divulga métodos para diagnosticar el cáncer mediante la determinación del nivel de CD24 no anclado circulante en una muestra biológica de un sujeto (p. ej., en una muestra de heces, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de orina o una muestra de saliva).

La Publicación PCT No. WO 2009/074988 de Arber N. divulga un método para diagnosticar el cáncer o una lesión premaligna. El método comprende determinar un nivel de CD24 expresado en las células sanguíneas periféricas de un sujeto que lo necesita, en donde el nivel de CD24 por encima de un umbral predeterminado es indicativo del cáncer o de la lesión premaligna.

Resumen de la invención

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para diagnosticar un cáncer o una lesión premaligna, comprendiendo el método determinar un nivel de expresión de CD24 en leucocitos comprendidos en una muestra biológica del sujeto, en donde un nivel de CD24 en leucocitos pequeños y no en leucocitos grandes por encima de un umbral predeterminado es indicativo del cáncer o de la lesión premaligna, en donde dichos leucocitos pequeños tienen una firma CD24+CD11b- y dichos leucocitos grandes tienen una firma CD24+CD11 b+.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para monitorizar la eficacia de la terapia del cáncer, comprendiendo el método determinar un nivel de expresión de CD24 en leucocitos comprendidos en una muestra biológica del sujeto que ha sido tratado con una terapia del cáncer, en donde una disminución del nivel de CD24 en leucocitos pequeños y no en leucocitos grandes desde un umbral predeterminado después de la terapia del cáncer es indicativo de la reducción del cáncer, monitorizando, de esta manera, la eficacia de la terapia del cáncer, en donde dichos leucocitos pequeños tienen una firma CD24+CD11b- y dichos leucocitos grandes tienen una firma CD24+CD11b+.

Según algunas realizaciones de la invención, los leucocitos pequeños se seleccionan del grupo que consiste en linfocitos T, linfocitos B y monocitos.

Según algunas realizaciones de la invención, los leucocitos grandes se seleccionan del grupo que consiste en neutrófilos, células dendríticas, granulocitos, macrófagos y células NK.

El método puede comprender además corroborar el diagnóstico usando un ensayo de diagnóstico seleccionado de una biopsia, una histología, un escaneo CT (Tomografía Computerizada) y una MRI (Imagenología por Resonancia Magnética).

Según algunas realizaciones de la invención, la muestra se selecciona del grupo que consiste en una muestra de sangre, una muestra de suero, una muestra de heces, una muestra de orina y una muestra de saliva.

Según algunas realizaciones de la invención, la determinación se efectúa ex vivo.

Según algunas realizaciones de la invención, la determinación se efectúa a nivel de proteína.

Según algunas realizaciones de la invención, la determinación se efectúa mediante citometría de flujo.

Según algunas realizaciones de la invención, la determinación se efectúa a nivel de

polinucleótido. El método puede comprender además administrar al sujeto un agente terapéutico para el tratamiento del cáncer o de la lesión premaligna.

El agente terapéutico puede seleccionarse del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, una inmunoterapia con anticuerpos, una terapia con radiación, una vacuna contra el cáncer, un agente antiinflamatorio y un suplemento dietético.

El al menos un agente puede comprender un agente polipeptídico.

El agente polipeptídico puede comprender un anticuerpo.

El anticuerpo puede unirse a un resto detectable.

El al menos un agente puede comprender un agente oligonucleotídico.

Según algunas realizaciones

invención, la lesión premaligna es un adenoma.

Según algunas realizaciones

invención, la lesión premaligna está asociada a un tumor sólido.

Según algunas realizaciones

invención, el cáncer es un tumor sólido.

Según algunas realizaciones

invención, el tumor sólido es un cáncer del tracto gastrointestinal. Según algunas realizaciones de la invención, el tumor sólido se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vías biliares, cáncer de esófago, cáncer de cavidad oral, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer del tracto urinario, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de las trompas de Falopio, sarcoma, melanoma, carcinoma de células escamosas, cáncer de cerebro y glioma.

Según algunas realizaciones de la invención, el cáncer es una malignidad hematopoyética.

La malignidad hematopoyética puede seleccionarse del grupo que consiste en un linfoma, una leucemia y un mieloma múltiple.

A no ser que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y/o científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de realizaciones de la invención, a continuación, se describen métodos y/o materiales ejemplares. En caso de conflicto, prevalecerá la especificación de la patente, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser necesariamente limitantes.

Breve descripción de las varias vistas del o de los dibujos

Algunas realizaciones de la invención se describen en la presente memoria, solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se destaca que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con fines de discusión ilustrativa de las realizaciones de la invención. A este respecto, la descripción tomada con los dibujos hace evidente a los expertos en la técnica cómo se pueden poner en práctica las realizaciones de la invención.

En los dibujos:

Las FIG. 1A-E son gráficos que ilustran la distribución de pacientes con cáncer colorrectal (CRC, Figuras 1A-1B), cáncer pancreático (PC, Figuras 1C-1D) y mieloma múltiple (MM, Figura 1E) en comparación con sujetos normales (sanos). Los diagramas de caja representan el porcentaje de células que expresan CD24 y negativas para CD11b (es decir, células CD24+CD11b-) como se determina por citometría de flujo. Los dos paneles para cada tipo de cáncer, es decir, para CRC y PC, representan dos concentraciones de anticuerpo de CD24 que se han usado. Las líneas negras a lo largo de cada gráfico representan valores medianos.

La FIG. 1F es una tabla que resume el valor P, la sensibilidad, la especificidad, el valor predictivo positivo y el valor predictivo negativo de los sujetos analizados en las Figuras 1A-1D anteriores.

Las Fig. 2A-D son gráficos que ilustran las curvas ROC empíricas. La Figura 2A muestra Normal frente a CRC (0,025 pg de Ab); la Figura 2B muestra Normal frente a CRC (0,05 pg de Ab); la Figura 2C muestra Normal frente a PC (0,025 pg de Ab); y la Figura 2D muestra Normal frente a PC (0,05 pg de Ab).

Las Fig. 3A-B son gráficos que ilustran la distribución de un estudio adicional que incluye pacientes con cáncer pancreático en comparación con sujetos normales (sanos). Se usaron dos concentraciones del mAb anti-CD24. Los diagramas de caja representan el porcentaje de células que expresan CD24 y negativas para CD11b (es decir, células CD24+CD11 b-) como se determina por citometría de flujo.

Descripción de realizaciones específicas de la invención

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a métodos para diagnosticar cáncer o predisposición al mismo mediante la determinación del nivel de expresión de CD24+CD11b- en una muestra que comprende leucocitos.

Los principios y la operación de la presente invención pueden comprenderse mejor con referencia a los dibujos y las descripciones adjuntas.

Antes de explicar con detalle al menos una realización de la invención, debe entenderse que la invención no está necesariamente limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados por los Ejemplos. La invención es susceptible de otras realizaciones o de ser puesta en práctica o llevada a cabo de varias maneras. Además, debe entenderse que la fraseología y la terminología empleadas en la presente memoria tienen fines descriptivos y no deben considerarse como limitantes.

CD24 tiene un alto nivel de expresión en numerosos tejidos malignos, entre ellos linfomas de células B, gliomas, carcinomas de próstata, gástrico, pancreático y de pulmón de células no pequeñas. La expresión incrementada de CD24 suele estar ligada con un curso más agresivo de la enfermedad.

Se ha mostrado que el diagnóstico temprano mejora significativamente el pronóstico y disminuye significativamente la morbilidad y la mortalidad de varios tipos de cáncer. El trabajo anterior divulgó métodos para diagnosticar el cáncer mediante la determinación del nivel de CD24 circulante no anclado en una muestra biológica de un sujeto (p. ej., en una muestra de heces, una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de orina o una muestra de saliva) o métodos para diagnosticar el cáncer o una lesión premaligna mediante la determinación de un nivel de CD24 expresado en células de sangre periférica de un sujeto.

Mientras se lleva la presente invención a la práctica, los presentes inventores han descubierto un ensayo de cribado simple y mejorado para el diagnóstico del cáncer mediante la detección de la expresión de CD24 en leucocitos pequeños. Así, según las presentes enseñanzas, los niveles elevados de leucocitos CD24+CD11b- se asocian con cáncer, lesión premaligna o predisposición a la misma.

Para caracterizar el perfil de expresión de CD24 y CD11b, los leucocitos de sangre periférica (PBL) de pacientes con cáncer e individuos sanos con edad y sexo concordantes se separaron de la sangre recién extraída y se analizó la expresión dual de CD24 y CD11b usando citometría de flujo. Los presentes inventores generaron además un archivo de molde para el análisis de las muestras usando puertas dentro del software para crear un árbol de población jerárquico al comienzo del cribado. Este archivo de molde se usa para analizar las muestras después de completar la adquisición de datos. El archivo de molde incluye un ajuste de compensación, que se aplica uniformemente a todos los datos recogidos con el fin de minimizar la superposición de fluorescencia entre los canales de detección.

Usando este archivo de molde, los resultados confirmaron que los sujetos con cáncer tenían niveles elevados de leucocitos CD24+CD11b- en comparación con sujetos sanos (es decir, normales). Se verificó además que los sujetos sanos gozaban de buena salud usando un examen minucioso y extenso en el Centro Integrado de Prevención del Cáncer en el Centro Médico de Tel Aviv (como se discutió anteriormente en Sella T. et al., Eur J Intern Med (2013) 24(3): 245-9). El cáncer fue verificado por histología en todos los pacientes.

Tomado en conjunto, este este ensayo simple y no invasivo se puede usar para identificar de manera confiable a individuos con varios precánceres y cánceres (tales como adenomas colorrectales, carcinoma temprano, tumores pancreáticos y otros tumores sólidos y hematológicos) o predisposición a los mismos.

Por tanto, según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para diagnosticar un cáncer o una lesión premaligna, comprendiendo el método determinar un nivel de expresión de CD24 en leucocitos comprendidos en una muestra biológica de un sujeto, en donde un nivel de CD24 en leucocitos pequeños y no en leucocitos grandes por encima de un umbral predeterminado es indicativo del cáncer o de la lesión premaligna.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "diagnosticar" se refiere a clasificar una patología (p. ej., un cáncer o una lesión premaligna asociada con CD24) o un síntoma, determinar la gravedad de la patología, monitorizar la progresión de la patología, pronosticar el resultado de una patología y/o perspectivas de recuperación.

Tal y como se usa en la presente memoria, la frase "lesión premaligna" se refiere a una masa de células y/o tejido que tiene una probabilidad incrementada de transformarse en un tumor maligno.

En la lesión premaligna de la presente invención, CD24 se sobreexpresa en leucocitos pequeños en comparación con un tejido o célula no maligno. Los ejemplos de lesiones premalignas asociadas con CD24 incluyen, pero no se limitan a, pólipos adenomatosos, esófago de Barrett, IPMN (Neoplasia Mucinosa Papilar Intraductal), DCIS (Carcinoma Ductal in Situ) en la mama, leucoplasia y eritroplasia.

Según una realización específica, la lesión premaligna es un adenoma.

Según una realización específica, la lesión premaligna está asociada a un tumor sólido.

Según una realización específica, la lesión premaligna está asociada a un tumor no sólido.

Por tanto, la lesión premaligna que se diagnostica según el método de este aspecto de la presente invención puede transformarse en un cáncer (o tumor) maligno sólido o no sólido (p. ej., malignidades hematológicas). Según una realización específica, la lesión premaligna que se diagnostica mediante el método de este aspecto de la presente invención es un pólipo adenomatoso del colon, un pólipo adenomatoso del recto, un pólipo adenomatoso del intestino delgado y esófago de Barrett.

Los ejemplos no limitantes de cánceres que pueden diagnosticarse mediante el método de este aspecto de la presente invención (es decir, mediante el análisis de la sobreexpresión de CD24 en leucocitos pequeños) incluyen tumores del tracto gastrointestinal (cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de región anal, cáncer colorrectal, cáncer de intestino delgado y/o grueso, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer gástrico, cáncer de intestino delgado, adenocarcinoma que surge en el intestino delgado, tumores carcinoides que surgen en el intestino delgado, linfoma que surge en el intestino delgado, tumores mesenquimatosos que surgen en el intestino delgado, tumores del estroma gastrointestinal), carcinoma de vesícula biliar, tumores del tracto biliar, cáncer de próstata, cáncer de riñón (renal) (p. ej., tumor de Wilms), cáncer de hígado (p. ej., hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular), cáncer hepatobiliar, cáncer del árbol biliar, tumores de la vesícula biliar, cáncer de vejiga, rabdomiosarcoma embrionario, tumor de células germinales, tumor trofoblástico, tumor de células germinales testiculares, teratoma inmaduro de ovario, uterino, cáncer epitelial de ovario, tumor sacrococcígeo, coriocarcinoma, tumor trofoblástico del sitio placentario, tumor epitelial del adulto, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, cáncer de pulmón (p. ej., carcinoma de pulmón de células pequeñas y células no pequeñas), nasofaríngeo, cáncer de mama, carcinoma de células escamosas (p. ej., en cabeza y cuello), cáncer de cavidad oral, tumor neurogénico, astrocitoma, ganglioblastoma, neuroblastoma, linfomas (p. ej., enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células B, Burkitt, de células T cutáneas, histiocítico, linfoblástico, de células T, tímico, linfoma cutáneo de células T, linfoma primario del sistema nervioso central), gliomas, carcinoma medular de tiroides, cáncer testicular, cáncer de cerebro y de cabeza/cuello, cáncer ginecológico, cáncer de endometrio, tumores de células germinales, tumores mesenquimales, tumores neurogénicos, cáncer de vejiga, cáncer de uréter, cáncer de pelvis renal, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de testículo, cánceres del cuerpo uterino, carcinoma endometrial, sarcoma uterino, carcinoma peritoneal y carcinoma de las trompas de Falopio, tumores de células germinales del ovario, tumores del estroma de los cordones sexuales, cáncer del sistema endocrino, tumores de tiroides, carcinoma medular de tiroides, linfoma de tiroides, tumores de paratiroides, tumores suprarrenales, tumores endocrinos pancreáticos, sarcomas de tejido blando y hueso, mesotelioma benigno y maligno, mesotelioma peritoneal maligno, mesotelioma maligno de la túnica vaginal del testículo, mesotelioma maligno del pericardio, cáncer de piel, melanoma cutáneo, melanoma intraocular, neoplasias del sistema nervioso central, meduloblastomas, meningiomas, tumores de nervios periféricos, tumores de la región pineal, adenomas hipofisarios, craneofaringiomas, neuromas acústicos, tumores del glomus yugular, cordomas y condrosarcomas, hemangioblastomas, papilomas y carcinomas del plexo coroideo, tumores del eje espinal, leucemia, leucemia aguda, leucemia crónica y un mieloma múltiple.

Según algunas realizaciones de la invención, el cáncer es un tumor sólido.

Según algunas realizaciones de la invención, el tumor sólido es un cáncer del tracto gastrointestinal.

Según algunas realizaciones de la invención, el tumor sólido se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, cáncer de vías biliares, cáncer de esófago, cáncer de cavidad oral, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de pulmón (p. ej., carcinoma de pulmón de células no pequeñas), cáncer de mama, cáncer del tracto urinario, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de las trompas de Falopio, sarcoma, melanoma, carcinoma de células escamosas, cáncer cerebral y glioma.

Según algunas realizaciones de la invención, el cáncer es un tumor no sólido (p. ej., malignidad hematopoyética).

Según algunas realizaciones de la invención, la malignidad hematopoyética es un linfoma, leucemia o mieloma múltiple.

Según una realización específica, la malignidad hematopoyética es un linfoma de Hodgkin, un linfoma no Hodgkin, una leucemia crónica (p. ej., leucemia linfocítica crónica (CLL)), una leucemia aguda (p. ej., leucemia linfocítica aguda (ALL)), una leucemia de células B, un linfoma de células B, una leucemia de Burkitt, un linfoma cutáneo de células T (CTCL), histiocítico, linfoblástico, de células T, tímico, etc.).

Tal y como se usa en la presente memoria, la frase "sujeto que lo necesita" o "sujeto" se refiere a un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano, de cualquier edad o género que corre el riesgo de tener cáncer [p. ej., un sujeto genéticamente predispuesto, un sujeto con antecedentes médicos y/o familiares de cáncer, un sujeto que ha estado expuesto a carcinógenos, riesgos laborales, riesgos ambientales] y/o un sujeto que muestra signos clínicos sospechosos de cáncer [p. ej., sangre en las heces o melena, dolor inexplicable, sudoración, fiebre inexplicable, pérdida de peso inexplicable hasta anorexia, cambios en los hábitos intestinales (estreñimiento y/o diarrea), tenesmo (sensación de defecación incompleta, específicamente para el cáncer de recto), anemia y/o debilidad general]. Adicionalmente o alternativamente, el sujeto puede ser un sujeto humano sano que se somete a un chequeo rutinario de bienestar.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "CD24" se refiere a la secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia de aminoácidos de al menos una porción funcional de la proteína de superficie celular similar a mucina anclada a fosfatidilinositol. Se proporciona una proteína CD24 ejemplar en el No. de Acceso de GenBank NP_037362.1. Se proporciona un transcrito de CD24 ejemplar en el No. de Acceso de GenBank NM_013230.2.

Tal y como se usa en la presente memoria, la frase "nivel de expresión de CD24" se refiere al grado de expresión génica y/o actividad del producto génico de CD24 en la muestra biológica. Por consiguiente, el nivel de CD24 se puede determinar a nivel de aminoácidos usando métodos de detección de proteínas o a nivel de ácidos nucleicos usando métodos de detección de ARN (como se discute con mayor detalle más adelante en la presente memoria).

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "CD11b" se refiere a la secuencia de ácido nucleico y/o la secuencia de aminoácidos de al menos una parte funcional de la proteína de superficie celular Integrina alfa M (ITGAM). Se proporcionan proteínas CD11b ejemplares en los No. de Acceso de GenBank NP_000623.2 y NP_001139280.1. Se proporcionan transcritos de CD11b ejemplares en los No. de Acceso de GenBank NM_000632 y NM_001145808.

Tal y como se usa en la presente memoria, la frase "nivel de expresión de CD11b" se refiere al grado de expresión génica y/o actividad del producto génico de CD11b en la muestra biológica. Por consiguiente, el nivel de CD11b se puede determinar a nivel de aminoácidos usando métodos de detección de proteínas o a nivel de ácidos nucleicos usando métodos de detección de ARN (como se discute con mayor detalle más adelante en la presente memoria).

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "leucocitos" se refiere a glóbulos blancos. Los leucocitos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, linfocitos T (también conocidos como células T), linfocitos B (también conocidos como células B), monocitos, macrófagos, granulocitos, neutrófilos, células dendríticas y células NK.

El término "leucocitos pequeños" se refiere a linfocitos que varían en tamaño entre 6 y 9 gm de diámetro. Estos típicamente incluyen linfocitos T (también conocidos como células T), linfocitos B (también conocidos como células B) y monocitos. Según la invención, los leucocitos pequeños comprenden una firma CD24+CD11 b'.

Según una realización, los leucocitos pequeños pueden expresar los siguientes marcadores: CD24, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD14, CD16 y/o CD33.

Según la invención, los leucocitos pequeños carecen de expresión de CD11 b, es decir, son CD11 b'.

Según una realización específica, los leucocitos pequeños expresan una firma CD24+CD3+CD4+ (p. ej., células T). Según una realización específica, los leucocitos pequeños expresan una firma CD24+CD3+CD8+ (p. ej., células T). Por consiguiente, según una realización, las células T se identifican usando un anticuerpo que se une específicamente a CD24, CD3, CD4 y/o CD8.

Según una realización específica, los leucocitos pequeños expresan una firma CD24+CD19+ (p. ej., células B). Según una realización específica, los leucocitos pequeños expresan una firma CD24+CD20+ (p. ej., células B). Por consiguiente, según una realización, las células B se identifican usando un anticuerpo que se une específicamente a CD24, CD19 y/o CD20.

Según una realización específica, los leucocitos pequeños expresan una firma CD24+CD14+ (p. ej., monocitos). Según una realización específica, los leucocitos pequeños expresan una firma CD24+CD16+ (p. ej., monocitos). Según una realización específica, los leucocitos pequeños expresan una firma CD24+CD33+ (p. ej., monocitos). Por consiguiente, según una realización, los monocitos se identifican usando un anticuerpo que se une específicamente a CD24, CD14, CD16 y/o CD33.

Según una realización, los leucocitos pequeños comprenden una población heterogénea de células, es decir, que comprenden más de un tipo celular, p. ej., células T, células B y/o monocitos, tales como p. ej., células T CD24+CD3+CD4+/CD8+, células B CD24+CD19+/CD20+ y/o monocitos CD24+CD14+/CD16+/CD33+).

El término "leucocitos grandes" se refiere a linfocitos que varían en tamaño por encima de 9 pm de diámetro y que contienen más citoplasma y gránulos dispersos (en comparación con los leucocitos pequeños). Estos típicamente incluyen granulocitos (p. ej., neutrófilos y eosinófilos), células dendríticas, macrófagos y células NK. Según la invención, los leucocitos grandes comprenden una firma CD24+CD11 b+.

Según una realización, los leucocitos grandes pueden expresar los siguientes marcadores: CD11b, CD66b, CD11c, CD123, CD56 y/o CD68.

Según una realización específica, los leucocitos grandes expresan un marcador CD66b (p. ej., granulocitos). Por consiguiente, según una realización, los granulocitos se identifican usando un anticuerpo que se une específicamente a CD66b.

Según una realización específica, los leucocitos grandes expresan un marcador CD11c y/o CD123 (p. ej., células dendríticas). Por consiguiente, según una realización, las células dendríticas se identifican usando un anticuerpo que se une específicamente a CD11c y/o CD123.

Según una realización específica, los leucocitos grandes expresan un marcador CD56 (p. ej., células NK). Por consiguiente, según una realización, las células NK se identifican usando un anticuerpo que se une específicamente a CD56.

Según una realización específica, los leucocitos grandes expresan un marcador CD68 (p. ej., macrófagos). Por consiguiente, según una realización, las células NK se identifican usando un anticuerpo que se une específicamente a CD68.

Según una realización, los leucocitos grandes comprenden una población heterogénea de células, es decir, que comprenden más de un tipo celular, p. ej., macrófagos, células NK, células dendríticas y granulocitos.

Según una realización, el CD24 está anclado a los leucocitos (es decir, no se refiere al CD24 libre, no anclado). Según una realización, el CD11 b está anclado a los leucocitos (es decir, no se refiere a CD11 b libre, no anclado). La frase "muestra biológica", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier muestra que comprenda leucocitos. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, una muestra de sangre (p. ej., suero), una muestra de saliva, una muestra de heces, una muestra de orina, un frotis de pap, una muestra de cuello uterino, una muestra de médula ósea, un líquido linfático, un líquido de ascites, una muestra de piel, varias secreciones externas de las vías respiratorias, intestinales y genitourinarias, lágrimas, leche, una muestra de biopsia de tejido, una muestra de líquido cefalorraquídeo (CSF), una muestra de fluido espermático, una muestra de fluido amniótico y una muestra de vellosidades coriónicas (CVS), y también muestras de constituyentes de cultivos celulares in vivo. Cabe señalar que una "muestra biológica de un sujeto" también puede comprender opcionalmente una muestra que no se haya extraído físicamente del sujeto.

Según una realización, la muestra biológica contiene leucocitos pequeños.

Según una realización, la muestra biológica contiene leucocitos grandes.

Según una realización, la muestra biológica no contiene leucocitos grandes.

Según una realización, la muestra biológica que contiene leucocitos es una muestra de sangre (p. ej., una muestra de sangre periférica).

Según una realización, la muestra biológica que contiene leucocitos es una muestra de linfocitos de sangre periférica (PBL).

Según una realización, la muestra biológica que contiene leucocitos es una muestra de biopsia (p. ej., una muestra de biopsia de cáncer o premalignidad).

Se pueden utilizar numerosos métodos de recogida de tejidos o fluidos bien conocidos para recoger la muestra biológica o las células (p. ej., leucocitos) del sujeto con el fin de determinar el nivel de expresión de CD24 y CD11 b (o cualquiera de los otros marcadores celulares descritos anteriormente). Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, jeringa con aguja, biopsia con aguja fina, biopsia con aguja, biopsia con aguja gruesa y biopsia quirúrgica, frotis bucal y lavado. Independientemente del procedimiento empleado, una vez obtenida una muestra biológica se puede determinar el nivel de la variante y así realizar un diagnóstico.

Los métodos de procesamiento de muestras biológicas para obtener leucocitos a partir de las mismas son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, lisis de eritrocitos, aislamiento de células mononucleares mediante separación por gradiente de densidad y diversos métodos de clasificación sin flujo, tales como separaciones con perlas magnéticas (para el enriquecimiento de poblaciones celulares específicas, p. ej., monocitos, linfocitos T, linfocitos B). La muestra biológica también puede procesarse para obtener leucocitos pequeños o grandes en función del tamaño usando cualquier método conocido en la técnica, tal como por filtración.

Se apreciará que la determinación del nivel de CD24 y/o CD11b en los leucocitos se puede efectuar ex vivo (sobre una muestra derivada del sujeto), así como in vivo (dentro del sujeto). Asimismo, puede verse realizarse el nivel de expresión de uno cualquiera de CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD14, CD16 y/o CD33 en leucocitos pequeños o CD66b, CD11c, CD123, CD56 y/o CD68 en leucocitos grandes ex vivo o in vivo.

Según una realización, el nivel de la secuencia de aminoácidos de CD24 y/o CD11b (proteína CD24 y/o CD11b) se determina usando un anticuerpo específico de CD24 y/o CD11b, respectivamente, mediante la formación de un inmunocomplejo [es decir, un complejo formado entre el antígeno CD24 y/o CD11b (una secuencia de aminoácidos de CD24 y/o CD11b) presente en la muestra biológica y el anticuerpo específico de CD24 y/o CD11b, respectivamente].

Según una realización, el nivel de la secuencia de aminoácidos de CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD14, CD16, CD33, CD66b, CD11c, CD123, CD56 y/o CD68 (proteínas CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD14, CD16, CD33, CD66b, CD11c, CD123, CD56 y/o CD68, respectivamente) se determina usando anticuerpos específicos mediante la formación de un inmunocomplejo [es decir, un complejo formado entre el antígeno presente en la muestra biológica y el anticuerpo específico].

El inmunocomplejo de la presente invención se puede formar a una variedad de temperaturas, concentración de sal y valores de pH que pueden variar dependiendo del método y la muestra biológica usada y los expertos en la técnica son capaces de ajustar las condiciones adecuadas para la formación de cada inmunocomplejo.

El término "anticuerpo", tal y como se usa en esta invención, incluye moléculas intactas, así como fragmentos funcionales de las mismas, tales como Fab, F(ab')2, Fv o moléculas de dominio único tales como VH y VL para un epítopo de un antígeno. Estos fragmentos de anticuerpos funcionales se definen como sigue: (1) Fab, el fragmento que contiene un fragmento de unión a antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo, se puede producir mediante la digestión del anticuerpo completo con la enzima papaína para producir una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada; (2) Fab', el fragmento de una molécula de anticuerpo que se puede obtener tratando el anticuerpo completo con pepsina, seguido de reducción, para producir una cadena ligera intacta y una parte de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anticuerpo; (3) (Fab')2, el fragmento del anticuerpo que se puede obtener tratando el anticuerpo completo con la enzima pepsina sin reducción posterior; F(ab')2 es un dímero de dos fragmentos Fab' unidos entre sí por dos enlaces disulfuro; (4) Fv, definido como un fragmento diseñado genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresadas como dos cadenas; (5) anticuerpo de cadena única ("SCA"), una molécula diseñada genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada, unidas por un conector polipeptídico adecuado como una molécula de cadena única fusionada genéticamente; y (6) Los anticuerpos de dominio único están compuestos por un único dominio VH o VL que exhibe suficiente afinidad por el antígeno.

Los métodos para producir anticuerpos policlonales y monoclonales, así como fragmentos de los mismos, son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1988).

Los fragmentos de anticuerpos según la presente invención se pueden preparar mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo o mediante la expresión en E. coli o células de mamíferos (p. ej., cultivo de células de ovario de hámster chino u otros sistemas de expresión de proteínas) del ADN que codifica el fragmento. Los fragmentos de anticuerpos se pueden obtener por digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos por métodos convencionales. Por ejemplo, se pueden producir fragmentos de anticuerpos mediante escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab')2. Este fragmento se puede escindir aún más usando un agente reductor de tiol y, opcionalmente, un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo resultantes de la escisión de los enlaces disulfuro, para producir fragmentos monovalentes 3,5S Fab'. Alternativamente, una escisión enzimática usando pepsina produce dos fragmentos Fab' monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, por Goldenberg, Pat. de EE. UU. No. 4.036.945 y 4.331.647, y referencias contenidas en las mismas.

Véase también Porter, R. R. [Biochem. J. 73: 119-126 (1959)]. También se pueden usar otros métodos de escisión de anticuerpos, tales como la separación de cadenas pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadena ligerapesada, escisión adicional de fragmentos u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, siempre que los fragmentos se unan al antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.

Los fragmentos Fv comprenden una asociación de cadenas VH y VL. Esta asociación puede ser no covalente, como se describe en Inbar et al. [Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 69:2659-62 (19720]. Alternativamente, las cadenas variables pueden unirse mediante un enlace disulfuro intermolecular o entrecruzarse mediante productos químicos tal como el glutaraldehído. Preferiblemente, los fragmentos Fv comprenden cadenas VH y VL conectadas por un conector peptídico. Estas proteínas de unión a antígeno de cadena única (scFv) se preparan mediante la construcción de un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican los dominios VH y VL conectados por un oligonucleótido. El gen estructural se inserta en un vector de expresión, que posteriormente se introduce en una célula huésped tal como E. coli. Las células huésped recombinantes sintetizan una única cadena polipeptídica con un péptido conector que une los dos dominios V. Los métodos para producir scFv se describen, por ejemplo, por Whitlow y Filpula, Methods 2: 97-105 (1991); Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Pack et al., Bio/Technology 11:1271-77 (1993); y la Pat. de EE. UU. No. 4.946.778.

Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica una única región determinante de la complementariedad (CDR). Los péptidos CDR ("unidades mínimas de reconocimiento") pueden obtenerse mediante la construcción de genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Dichos genes se preparan, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable a partir del ARN de las células productoras de anticuerpos. Véase, por ejemplo, Larrick y Fry [Methods, 2: 106-10 (1991)].

Los anticuerpos también se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluidas las bibliotecas de presentación de fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Las técnicas de Cole et al. y Boerner et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985)) y Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. De manera similar, los anticuerpos humanos se pueden producir mediante la introducción de loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, p. ej., ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógena se han inactivado parcial o completamente. Después del pulso, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se asemeja mucho a la observada en los seres humanos en todos los aspectos, incluidos el reordenamiento de genes, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las Pat. de EE. UU. No.5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995).

Según el método de este aspecto de la presente invención, una cantidad de formación de inmunocomplejos es indicativa de un diagnóstico del cáncer o la lesión premaligna. Se pueden usar varios métodos para detectar la formación del inmunocomplejo de la presente invención (p. ej., inmunocomplejo de CD24 y/o CD11b) de la presente invención y los expertos en la técnica son capaces de determinar qué método es adecuado para cada inmunocomplejo.

El anticuerpo (p. ej., anticuerpo de CD24 y/o CD11b) usado en el inmunocomplejo de la presente invención se puede marcar usando métodos conocidos en la técnica. Se apreciará que los anticuerpos marcados pueden ser anticuerpos primarios (es decir, que se unen al antígeno específico, p. ej., un antígeno CD24 y/o un antígeno CD11 b) o anticuerpos secundarios (p. ej., anticuerpos anticonejo de cabra marcados, anticuerpos antihumanos de ratón marcados) que se unen a los anticuerpos primarios. El anticuerpo se puede conjugar directamente con un marcaje o se puede conjugar con una enzima.

Los anticuerpos de la presente invención pueden marcarse con fluorescencia (usando un tinte fluorescente conjugado con un anticuerpo), radiomarcarse (usando anticuerpos radiomarcados, p. ej., con 125I), o conjugados con una enzima (p. ej., peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) y usados junto con un sustrato cromogénico para producir una reacción colorimétrica. Los sustratos cromogénicos utilizados por los anticuerpos conjugados con enzimas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, AEC, rojo rápido, sustrato ELF-97 [2-(5'-cloro-2-fosforiloxifenil)-6cloro-4(3H)-quinazolinona], fosfato de p-nitrofenilo (PNPP), difosfato de fenolftaleína y ELF 39-fosfato, BCIP/INT, Vector Red (VR), salmón y fosfato de magenta (Avivi C., et al., 1994, J Histochem. Cytochem. 1994; 42: 551-4) para la enzima fosfatasa alcalina y Nova Red, diaminobencidina (DAB), sustrato Vector(R) Sg , sustrato quimioluminiscente basado en luminol para la enzima peroxidasa. Estos sustratos enzimáticos están disponibles comercialmente en Sigma (St Louis, MO, EE. UU.), Molecular Probes Inc. (Eugene, OR, EE. UU.), Vector Laboratories Inc. (Burlingame, CA, EE. UU.), Zymed Laboratories Inc. (San Francisco, CA, EE. UU.), Dako Cytomation (Dinamarca).

La detección del inmunocomplejo (p. ej., inmunocomplejo de CD24 y/o CD11b) en los leucocitos se puede realizar usando la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS), el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), p. ej., el ensayo ELISA tipo sándwich, la transferencia Western y los análisis de radioinmunoensayo (RIA), inmunoprecipitación (IP) o mediante un enfoque basado en el peso molecular.

El análisis por FACS permite la detección de antígenos presentes en las membranas celulares tales como CD24 y/o CD11b. Brevemente, los anticuerpos específicos (p. ej., anticuerpos específicos de CD24 y/o CD11b) se unen a fluoróforos y la detección se realiza por medio de una máquina clasificadora de células que lee la longitud de onda de la luz emitida por cada célula a medida que pasa a través de un haz de luz. Este método puede emplear dos o más anticuerpos simultáneamente.

El nivel de CD24 y/o CD11b (o cualquiera de los otros marcadores celulares descritos anteriormente) también se puede determinar mediante ELISA. Brevemente, una muestra que contiene, p. ej., el antígeno CD24 y/o CD11 b se fija a una superficie tal como un pocillo de una placa de microtitulación. Se aplica un anticuerpo específico de antígeno (p. ej., un anticuerpo de CD24 y/o CD11 b) acoplado a una enzima y se permite que se una al antígeno. A continuación, se detecta y cuantifica la presencia del anticuerpo mediante una reacción colorimétrica que emplea la enzima acoplada al anticuerpo. Las enzimas comúnmente empleadas en este método incluyen la peroxidasa de rábano picante y la fosfatasa alcalina. Si está bien calibrado y dentro del rango lineal de respuesta, la cantidad de sustrato presente en la muestra es proporcional a la cantidad de color producido. Generalmente, se emplea un estándar de sustrato para mejorar la precisión cuantitativa.

Para la transferencia Western, las proteínas se extraen de una muestra celular y se someten a electroforesis (p. ej., SDS-PAGE) y se transfieren a una membrana (p. ej., de nitrocelulosa o PVDF). A continuación, la membrana interactúa con un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo de CD24 y/o CD11b) que puede marcarse directamente o someterse a un anticuerpo secundario marcado. La detección puede ser por autorradiografía, reacción colorimétrica o quimioluminiscencia. Este método permite tanto la cuantificación de una cantidad de sustrato como la determinación de su identidad por una posición relativa en la membrana que es indicativa de una distancia de migración en el gel de acrilamida durante la electroforesis.

En el caso en el que la concentración del antígeno en la muestra biológica sea baja, la detección del antígeno (p. ej., secuencia de aminoácidos de CD24 y/o CD11b) puede realizarse mediante inmunoprecipitación (IP). Para el análisis de inmunoprecipitación, el anticuerpo (p. ej., anticuerpo de CD24 y/o CD11b) puede interactuar directamente con una muestra (p. ej., lisado celular) que incluye, p. ej., CD24 y/o CD11b y el complejo formado puede detectarse adicionalmente usando un anticuerpo secundario conjugado con perlas (p. ej., si el anticuerpo de CD24 y/o CD11b es un anticuerpo monoclonal de ratón, el anticuerpo secundario puede ser un anticuerpo antiratón conjugado con, p. ej., perlas de Sefarosa). Luego, las perlas se pueden precipitar mediante centrifugación, después de lo cual las proteínas precipitadas (p. ej., CD24 y/o CD11 b y anticuerpos anti-CD24 y/o anti-CD11 b) se pueden separar de las perlas (p. ej., usando desnaturalización a 95 °C) y luego someterse a análisis de transferencia Western usando los anticuerpos específicos (p. ej., anticuerpos específicos de CD24 y/o CD11b). Alternativamente, el anticuerpo, p. ej., el anticuerpo anti-CD24 y/o anti-CD11b, y el anticuerpo secundario conjugado con perlas se pueden añadir a la muestra biológica que contiene el antígeno (p. ej., CD24 y/o CD11 b) para formar así un inmunocomplejo. Alternativamente, por ejemplo, dado que CD24 y/o CD11b es una proteína altamente glicosilada, también se puede precipitar usando un sustrato capaz de unirse a polipéptidos glicosilados tal como Concavalina A (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Suecia) que también se puede conjugar a perlas, seguido de análisis de transferencia Western con, p. ej., anticuerpos anti-CD24 y/o anti-CD11b.

El nivel de CD24 y/o CD11b (o cualquiera de los otros marcadores celulares descritos anteriormente) también se puede determinar mediante radioinmunoensayo (RIA). En una versión, este método implica la precipitación del antígeno deseado (p. ej., CD24 y/o CD11b) con un anticuerpo específico y una proteína de unión al anticuerpo radiomarcada (p. ej., proteína A marcada con I125) inmovilizada en un vehículo precipitable tal como perlas de agarosa. El número de cuentas en el sedimento precipitado es proporcional a la cantidad de antígeno.

En una versión alternativa del RIA, se emplean un antígeno marcado y una proteína de unión al anticuerpo sin marcar. Se añade una muestra que contiene una cantidad desconocida de antígeno en cantidades variables. La disminución de las cuentas precipitadas del antígeno marcado es proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra añadida.

El nivel de CD24 y/o CD11b (o cualquiera de los otros marcadores celulares descritos anteriormente) también se puede determinar usando un enfoque basado en el peso molecular. Dado que el inmunocomplejo exhibe un peso molecular más alto que sus componentes, también se pueden emplear métodos capaces de detectar dicho cambio en el peso molecular. Por ejemplo, el inmunocomplejo puede detectarse mediante un ensayo de retardo en gel.

Brevemente, se carga con muestras un gel de acrilamida no desnaturalizante. Un cambio en el tamaño (peso molecular) del producto proteico en comparación con sus componentes es indicativo de la presencia de un inmunocomplejo. Dicho cambio a un peso molecular más alto se puede ver usando una tinción de proteína no específica tal como la tinción con plata o la tinción con azul de Commassie.

Se apreciará que el análisis de una cantidad de CD24 y/o CD11b (o cualquiera de los otros marcadores celulares descritos anteriormente) en los leucocitos también puede efectuarse a nivel de polinucleótido. Los métodos de detección de ARN se pueden realizar usando un polinucleótido aislado (p. ej., una sonda de polinucleótido, una sonda/cebador de oligonucleótido) capaz de hibridar con una secuencia de ácido nucleico, p. ej., una secuencia de ácido nucleico de CD24 y/o CD11b tal como el transcrito de CD24 y/o CD11b o una porción del mismo, respectivamente. Dicho polinucleótido puede tener cualquier tamaño, tal como un polinucleótido corto (p. ej., de 15­ 200 bases), un polinucleótido intermedio de 100-2.000 bases y un polinucleótido largo de más de 2.000 bases.

La sonda polinucleotídica aislada usada por la presente invención puede ser cualquier molécula de ARN marcada directa o indirectamente [p. ej., oligonucleótido de ARN (p. ej., de 17-50 bases), una molécula de ARN transcrita in vitro], molécula de ADN (p. ej., oligonucleótido, p. ej., 15-50 bases, molécula de ADNc, molécula genómica) y/o un análogo de la misma [p. ej., ácido nucleico peptídico (PNA)] que es específico para el transcrito de ARN, p. ej., transcrito de ARN de CD24 y/o CD11b de la presente invención.

Los oligonucleótidos diseñados según las enseñanzas de la presente invención se pueden generar según cualquier método de síntesis de oligonucleótidos conocido en la técnica, tal como la síntesis enzimática o la síntesis en fase sólida. El equipo y los reactivos para ejecutar la síntesis en fase sólida están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Applied Biosystems. También se puede emplear cualquier otro medio para dicha síntesis; la síntesis real de los oligonucleótidos está dentro de las capacidades de un experto en la técnica y se puede lograr a través de metodologías establecidas como se detalla, por ejemplo, en "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988)) y "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984) utilizando química de fase sólida, p. ej., fosforamidita de cianoetilo seguida de desprotección, desalinización y purificación, por ejemplo, mediante un método automatizado en tritilo o HPLC.

El polinucleótido aislado usado por la presente invención se puede marcar directa o indirectamente usando una etiqueta o molécula marcadora. Dichos marcadores pueden ser, por ejemplo, moléculas fluorescentes (p. ej., fluoresceína o Rojo Texas), moléculas radiactivas (p. ej., 32P-^y -ATP o 32P-a-ATP) y sustratos cromogénicos [p. ej., Rojo Fast, BCIP/INT, disponible en (ABCAM, Cambridge, m A)]. El marcaje directo se puede lograr mediante la conjugación covalente de una molécula marcadora con el polinucleótido (p. ej., usando síntesis en fase sólida) o mediante la incorporación mediante polimerización (p. ej., usando una reacción de transcripción in vitro o marcaje cebado al azar). El marcaje indirecto se puede lograr mediante la conjugación covalente o la incorporación al polinucleótido de una molécula de etiqueta no marcada (p. ej., digoxigenina o biotina) y, posteriormente, sometiendo el polinucleótido a una molécula marcada (p. ej., anticuerpo anti-digoxigenina o estreptavidina) capaz de reconocer específicamente la etiqueta no marcada.

Los polinucleótidos descritos anteriormente pueden emplearse en una variedad de métodos de detección de ARN tales como análisis de transferencia Northern, PCR con transcripción inversa (RT-PCR) [p. ej., una RT-PCR semicuantitativa, una RT-PCR cuantitativa usando, p. ej., el Light Cycler™ (Roche)], hibridación de ARN in situ (ARN-ISH), tinción de RT-PCR in situ [p. ej., como se describe en Nuovo G^j , et al. 1993, Intracellular localization of polymerase chain reaction (PCR)-amplified hepatitis C cDNA. Am J Surg Pathol. 17: 683-90, y Komminoth P, et al. 1994, Evaluation of methods for hepatitis C virus detection in archival liver biopsies. Comparison of histology, immunohistochemistry, in situ hybridization, reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and in situ RT-PCR. Pathol Res Pract., 190: 1017-25] y análisis de micromatrices de oligonucleótidos [p. ej., usando la micromatriz Affymetrix (Affymetrix®, Santa Clara, CA)].

Como se mencionó, un nivel de CD24 en los leucocitos pequeños y no en los leucocitos grandes por encima de un umbral predeterminado es indicativo del cáncer o de la lesión premaligna.

El "umbral predeterminado" puede determinarse experimentalmente comparando muestras de leucocitos normales (p. ej., muestras obtenidas de sujetos sanos) con muestras de leucocitos derivadas de sujetos que se sabe que tienen cáncer o una lesión premaligna (p. ej., cáncer colorrectal, cáncer pancreático, carcinoma temprano, sarcoma, mieloma múltiple, etc.). Preferiblemente, se analiza un número estadísticamente significativo de muestras.

Según una realización, el análisis del nivel de CD24 en leucocitos pequeños y no en leucocitos grandes puede llevarse a cabo calculando la expresión total de leucocitos CD24+ en una muestra (es decir, en todos los leucocitos pequeños y grandes), calculando la expresión dual de leucocitos CD24+ y CD11b+ en una muestra (es decir, demostrando leucocitos grandes), y restando el número de leucocitos CD24+ CD11b+ del número total de leucocitos CD24+.

Según una realización, el análisis del nivel de CD24 en leucocitos pequeños y no en leucocitos grandes puede llevarse a cabo calculando el número de células que expresan CD24 y no expresan CD11 b.

Según una realización, el análisis del nivel de CD24 en leucocitos pequeños y no en leucocitos grandes puede llevarse a cabo calculando el número de células T, p. ej., células que expresan CD24, CD3, CD4 y/o CD8.

Según una realización, el análisis del nivel de CD24 en leucocitos pequeños y no en leucocitos grandes puede llevarse a cabo calculando el número de células B, p. ej., células que expresan CD24, CD19 y/o CD20.

Según una realización, el análisis del nivel de CD24 en leucocitos pequeños y no en leucocitos grandes puede llevarse a cabo calculando el número de monocitos, p. ej., células que expresan CD24, CD33, CD14 y/o CD16.

Según una realización, el análisis del nivel de CD24 en leucocitos pequeños y no en leucocitos grandes puede llevarse a cabo calculando el número de células T, p. ej., células que expresan CD24, CD3, CD4 y/o CD8, y células B, p. ej., células que expresan CD24, CD19 y/o CD20.

Según una realización, el análisis del nivel de CD24 en leucocitos pequeños y no en leucocitos grandes puede llevarse a cabo calculando el número de células T, p. ej., células que expresan CD24, CD3, CD4 y/o CD8, y monocitos, p. ej., células que expresan CD24, CD33, CD14 y/o CD16.

Según una realización, el análisis del nivel de CD24 en leucocitos pequeños y no en leucocitos grandes puede llevarse a cabo calculando el número de células B, p. ej., células que expresan CD24, CD19 y/o CD20, y monocitos, p. ej., células que expresan CD24, CD33, CD14 y/o c D16.

Según una realización, el análisis del nivel de CD24 en leucocitos pequeños y no en leucocitos grandes puede llevarse a cabo calculando el número de células T, p. ej., células que expresan CD24, CD3, CD4 y/o CD8, células B, p. ej., células que expresan CD24, CD19 y/o CD20, y monocitos, p. ej., células que expresan CD24, CD33, CD14 y/o CD16.

Según una realización, se analiza un número limitado de marcadores celulares, p. ej., 2-10, 2-9, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 2­ 4 o 2-3 marcadores celulares.

Según una realización específica, solo se analizan 2 marcadores celulares (p. ej., CD24 y CD11b).

Se pueden analizar tres marcadores celulares (p. ej., CD24, CD3 y CD11b; CD24, CD4 y CD11b; CD24, CD8 y CD11b; CD24, CD3 y CD4; CD24, CD3 y CD8; CD24, CD19 y/o CD11 b; CD24, CD20 y/o CD11b; CD24, CD14 y/o CD11 b; CD24, CD16 y/o CD11b; CD24, CD33 y/o CD11b; CD24, CD14 y/o CD16; CD24, CD14 y/o CD33; CD24, CD16 y/o CD33).

Se pueden analizar cuatro marcadores celulares (p. ej., CD24, CD3, CD4 y CD11b; CD24, CD3, CD8 y CD11b; CD24, CD19, CD20 y CD11b; CD24, CD33, CD14 y CD11b; CD24, CD33, CD16 y CD11b; CD24, CD14, CD16 y CD11b).

Se apreciará que la presencia del cáncer o de la lesión premaligna puede validarse adicionalmente usando ensayos adicionales. Por ejemplo, en el caso en el que el nivel de CD24 detectado en los leucocitos pequeños de un sujeto esté por encima de un umbral predeterminado, se pueden realizar análisis adicionales tales como biopsia de tejido, histología, escaneo CT (Tomografía Computerizada), MRI (Imagenología por Resonancia Magnética), rayos X, ultrasonido, mamografía, endoscopia y/o colonoscopia.

Se apreciará que las presentes enseñanzas también pueden usarse para determinar la eficacia del tratamiento. Por tanto, la determinación de la expresión de CD24 en leucocitos pequeños puede efectuarse después y opcionalmente antes de la terapia anticancerosa, por lo que una reducción de la expresión de CD24 en leucocitos pequeños y no en leucocitos grandes es indicativa de la eficacia del tratamiento.

También se describe un método para tratar un cáncer o una lesión premaligna en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar un agente terapéutico para el tratamiento del cáncer o la lesión premaligna al sujeto diagnosticado.

También se describe un agente terapéutico para su uso en el tratamiento del cáncer o una lesión premaligna en un sujeto que lo necesita, en donde el sujeto ha sido diagnosticado con un cáncer o una lesión premaligna.

Los agentes terapéuticos ejemplares para el tratamiento del cáncer incluyen, pero no se limitan a, quimioterapia, radioterapia, fototerapia y terapia fotodinámica, cirugía, terapia nutricional (p. ej., suplemento dietético), terapia ablativa, radioterapia y quimioterapia combinadas, braquioterapia, terapia con haz de protones, inmunoterapia (p. ej., vacuna contra el cáncer o inmunoterapia con anticuerpos), terapia celular, terapia radioquirúrgica con haz de fotones.

Los ejemplos no limitantes de agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, fármacos basados en platino (p. ej., oxaliplatino, cisplatino, carboplatino, espiroplatino, iproplatino, satraplatino, etc.), agentes alquilantes (p. ej., ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucilo, busulfán, melfalán, mecloretamina, uramustina, tiotepa, nitrosoureas, etc.), antimetabolitos (p. ej., 5-fluorouracilo, azatioprina, 6-mercaptopurina, metotrexato, leucovorina, capecitabina, citarabina, floxuridina, fludarabina, gemcitabina (Gemzar.RTM.), pemetrexed (ALIMTA.RTM.), raltitrexed, etc.), alcaloides vegetales (p. ej., vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina, podofilotoxina, paclitaxel (Taxol.RTM.), docetaxel (Taxotere.RTM.), etc.), inhibidores de la topoisomerasa (p. ej., irinotecán, topotecán, amsacrina, etopósido (VP16), fosfato de etopósido, tenipósido, etc.), antibióticos antitumorales (p. ej., doxorrubicina, adriamicina, daunorrubicina, epirrubicina, actinomicina, bleomicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, etc. ), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, estereoisómeros de los mismos, derivados de los mismos, análogos de los mismos y combinaciones de los mismos.

Un agente para determinar un nivel de expresión de CD24 y el agente para determinar un nivel de expresión de CD11 b pueden envasarse en un kit y etiquetarse para su uso en el diagnóstico de un cáncer o una lesión premaligna.

Cuando el agente es un agente polipeptídico (p. ej., anticuerpo anti-CD24 y/o anti-CD11 b), el kit puede incluir además reactivos para análisis por FACS. Adicionalmente o alternativamente, el kit puede comprender reactivos para análisis por Transferencia Western y al menos un gel prefabricado para realizar la Transferencia Western.

Cuando el agente es un agente oligonucleotídico (p. ej., una sonda polinucleotídica), el kit puede incluir además una enzima ADN polimerasa, tal como una ADN polimerasa termoestable, una enzima transcriptasa inversa, una mezcla de dNTP, un tampón de reacción en cadena de polimerasa concentrado y un tampón de enzima de transcriptasa inversa concentrado. Los agentes de detección pueden incluir análogos de nucleótidos y/o un resto marcador, p. ej., un resto directamente detectable tal como un fluoróforo (fluorocromo) o un isótopo radiactivo, o un resto indirectamente detectable, tal como un miembro de un par de unión, tal como la biotina, o una enzima capaz de catalizar una reacción colorimétrica o luminométrica no soluble. El kit también puede comprender al menos un gel prefabricado para realizar RT-PCR. Además, el kit puede incluir además al menos un contenedor que contiene reactivos para la detección de ácidos nucleicos sometidos a electroforesis. Dichos reactivos incluyen aquellos que detectan directamente los ácidos nucleicos, tales como el agente intercalante fluorescente o los reactivos de tinción con plata, o los reactivos dirigidos a detectar ácidos nucleicos marcados, tales como, pero no limitados a, los reactivos ECL.

El kit de la invención preferiblemente incluye un aviso asociado con el mismo en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de kits de diagnóstico. Con el kit también se pueden proporcionar instrucciones detalladas para el uso, el almacenamiento y la resolución de problemas.

También se describe una composición que comprende al menos aproximadamente un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más de leucocitos pequeños y un anticuerpo dirigido a CD24.

También se describe una composición que comprende al menos un 70 % de leucocitos pequeños y un anticuerpo dirigido a CD24.

También se describe una composición que comprende al menos un 80 % de leucocitos pequeños y un anticuerpo dirigido a CD24.

También se describe una composición que comprende al menos un 90 % de leucocitos pequeños y un anticuerpo dirigido a CD24.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "aproximadamente" se refiere a ± 10 %.

Los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "incluyendo", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluye, pero no se limita a".

El término "que consiste en" significa "que incluye y se limita a".

El término "que consiste esencialmente en" significa que la composición, el método o la estructura pueden incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solo si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, método o estructura reivindicada.

Tal y como se usa en la presente memoria, la forma singular "un", "una" y "el" incluyen referencias plurales a no ser que el contexto dicte claramente otra cosa. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluidas las mezclas de los mismos.

A lo largo de esta solicitud, se pueden presentar varias realizaciones de esta invención en un formato de rango. Debe entenderse que la descripción en formato de rango es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un rango ha divulgado específicamente todos los subrangos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese rango. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un rango tal como de 1 a 6 ha divulgado específicamente subrangos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese rango, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del rango.

Siempre que se indique un rango numérico en la presente memoria, se pretende que incluya cualquier número citado (fraccional o integral) dentro del rango indicado. Las frases "que varía/varía entre" un primer número indicado y un segundo número indicado y "que varía/varía desde" un primer número indicado "hasta" un segundo número indicado se usan indistintamente en la presente memoria y pretenden incluir el primer y el segundo número indicado y todos los números fraccionarios y enteros entre ellos.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "método" se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos conseguir una tarea determinada, incluyendo, pero no limitado a, aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos para, o desarrollados fácilmente a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos por profesionales de las artes químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas y médicas.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "tratar" incluye suprimir, inhibir sustancialmente, ralentizar o revertir la progresión de una afección, mejorar sustancialmente los síntomas clínicos o estéticos de una afección o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una afección.

Se aprecia que ciertas características de la invención, que se describen, para mayor claridad, en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una sola realización. A la inversa, diversas características de la invención, que se describen, por brevedad, en el contexto de una sola realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada o como adecuada en cualquier otra realización descrita de la invención. Ciertas características descritas en el contexto de varias realizaciones no deben considerarse características esenciales de esas realizaciones, a no ser que la realización no sea operativa sin esos elementos.

Diversas realizaciones y aspectos de la presente invención, tal como se delinearon anteriormente en la presente memoria y como se reivindican en la sección de reivindicaciones a continuación, encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que, junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención de manera no limitante.

Generalmente, la nomenclatura usada en la presente memoria y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías como se muestra en las Pat. de EE. UU. No.

4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a Edición), Appleton y Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen extensamente en la bibliografía de patentes y científica, véanse, por ejemplo, las Pat. de EE. UU. No.

3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., y Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996);

A lo largo de este documento se proporcionan otras referencias generales. Se cree que los procedimientos allí descritos son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para conveniencia del lector.

MATERIALES GENERALES Y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

Aislamiento de leucocitos de sangre periférica

La sangre se recogió en tubos de recogida de 9 ml (Vacuette®, Greiner bio-one). Todas las muestras se recogieron y procesaron de manera idéntica. Los leucocitos de sangre periférica (PBL) se aislaron de muestras de sangre recogiendo capas leucocitarias obtenidas después de centrifugar durante 3 minutos a 3.000 rpm y descartando el sobrenadante de plasma. Los eritrocitos residuales se lisaron mediante una incubación breve en tampón de lisis de eritrocitos (ELB) que contenía NH4Cl 155 mM, EDTA 0,1 mM y KHCO³ 10 mM. El sedimento resultante se lavó en PBS y las células se fijaron con formaldehído al 2 %. A continuación, se contaron las células y se sometieron a un ensayo de citometría de flujo.

Sujetos

Los PBL de pacientes e individuos sanos con edad y sexo concordante se separaron de la sangre recién extraída. Todas las muestras se recogieron y procesaron de manera idéntica. Las muestras se obtuvieron de voluntarios en el Centro Médico Sourasky de Tel Aviv y el Centro Médico Rabin. Los sujetos elegibles completaron un cuestionario médico detallado que incluía diagnósticos de cáncer, datos demográficos y otra información epidemiológica.

Ensayo de citometría de flujo

Para cada muestra, se analizaron 20.000 leucocitos. Se tiñeron suspensiones de células individuales de leucocitos humanos usando los siguientes anticuerpos: anti-CD11b-PerCp-Cy5.5 (M1/70) (Tombo Bioscience) y anti-CD24-FITC humanizado (producido por los presentes inventores). El porcentaje de células CD24+CD11b- se determinó restando el porcentaje de células positivas para CD24 y CD11 b (tinción doble) de las células positivas para CD24 (tinción única).

La sangre se recogió en tubos de recogida de 9 ml (Vacuette®, Greiner bio-one). Todas las muestras se recogieron y procesaron de manera idéntica. Los PBL se aislaron de muestras de sangre recogiendo capas leucocitarias obtenidas después de centrifugar durante 3 minutos a 3.000 rpm y descartando el sobrenadante de plasma. Los eritrocitos residuales se lisaron mediante una breve incubación en tampón de lisis de eritrocitos. El sedimento resultante se lavó en PBS y se fijó con formaldehído al 2 %. Las células se contaron y se sometieron a un ensayo de citometría de flujo.

El CD24 y el CD11 b celulares se evaluaron mediante citometría de flujo. Se usaron aproximadamente 1 x 106 células en cada experimento. Después de la tripsinización, las células se lavaron en tampón de clasificación celular activado por fluorescencia y se fijaron con formaldehído al 2 % durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT). Después de lavar con tampón FACS, se añadieron 100 pl de los diferentes anticuerpos marcados durante 30 minutos a RT. Después de lavar X3 con tampón FACS, la detección de anticuerpos unidos se realizó en un CyFlow® Cube 6 (Sysmex Europe GmbH) y los resultados se analizaron con el programa FCS express.

Ejemplo 1

Diagnóstico de cáncer usando expresión dual de CD24 y CD11b en leucocitos

Usando una matriz de expresión génica, algunos inventores de la presente invención han mostrado previamente que CD24 se expresa de manera diferencial en enterocitos normales y transformados, volviendo a los niveles normales después de una exposición corta y prolongada a la inhibición de COX-2 [Sagiv, E. et al., Gastroenterology (2006) 31 (2):630-9; Sagiv, E. et al., Digestión (2011) 84(3): 169-84; Sagiv, E. et al., Clin Cáncer Res (2007) 3 (22 Pt 1): 6807­ 15]. La expresión de CD24 se detectó en el 90,7 % de los adenomas colorrectales y en el 86,3 % de los CRC en comparación con la expresión débil en el 16 % del epitelio normal adyacente. Se obtuvieron resultados similares para otros cánceres GI [Sagiv, E. et al., Gastroenterology (2006), supra].

Los leucocitos de sangre periférica (PBL) son los sensores del cuerpo. Viajan por todo el cuerpo, entrando y saliendo de los tejidos con inflamación y neoplasia. Por lo tanto, pueden servir como mensajeros. Algunos inventores de la presente invención han mostrado previamente que el nivel de expresión de CD24 en los PBL puede usarse para la detección temprana de adenomas colorrectales y CRC [Kraus et al., Dis Markers (2009), supra]. Según Kraus et al., el análisis por transferencia western (WB) para el nivel de CD24 en los lisados de PBL tuvo una buena sensibilidad y especificidad para detectar adenomas colorrectales en comparación con sujetos sanos con colonoscopia normal. Por lo tanto, se concluyó de Kraus et al. que CD24 solo puede ser una herramienta clínica útil para el cribado de cáncer colorrectal en individuos asintomáticos. Aunque la transferencia western es un procedimiento común para los laboratorios de diagnóstico, tiene varias desventajas: es una herramienta cualitativa, requiere mucho trabajo y es costosa. Por consiguiente, el presente trabajo se concentró en desarrollar un mejor ensayo de cribado para cánceres y precánceres usando la expresión del marcador CD24 y utilizando citometría de flujo.

Para el análisis por citometría de flujo, los PBL de pacientes e individuos sanos se separaron de la sangre recién extraída. Las suspensiones de células individuales se tiñeron usando: anti-CD11b-PerCp-Cy5.5 y anti-CD24-FITC. Los presentes inventores descubrieron que en sujetos sanos CD24 se expresa en tipos de células grandes (tales como neutrófilos, granulocitos). Dado que CD11 b se expresa en la superficie de estas células grandes, la tinción de los PBL purificados con marcadores CD24 y CD11b (tinción simple y doble) permitió distinguir entre diferentes poblaciones celulares, p. ej., entre células de pacientes normales y con cáncer (p. ej., CRC, PC y MM). El porcentaje de células CD24+CD11b- se determinó restando el porcentaje de células positivas para CD24 y CD11b (tinción doble) de las células positivas para CD24 (tinción simple).

Los datos se analizaron después de la creación de un árbol de población jerárquico en el software al comienzo del cribado. Este molde se usó en todos los análisis posteriores. El archivo de molde incluía el ajuste de compensación, que se aplicó uniformemente a todos los datos recogidos con el fin de minimizar la superposición de fluorescencia entre los canales de detección. La población de control normal incluía individuos sanos que se sometieron a un examen completo y extenso en el Centro Integrado de Prevención del Cáncer en el Centro Médico de Tel-Aviv, como se discutió anteriormente [Sella T. et al., Eur J Intern Med (2013) 24(3): 245-9]. El cáncer fue verificado por histología en todos los pacientes.

Los resultados de CD24 se dicotomizaron en función de si estaban por encima o por debajo del nivel de punto de corte (26-30 % de expresión de CD24). También se determinaron la sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos positivos y negativos. La discriminación del ensayo de CD24 entre pacientes con niveles por encima y por debajo del umbral se cuantificó mediante el área bajo la curva ROC (AUC) y se informó con intervalos de confianza (iC) del 95 %. Los resultados indicaron la capacidad de detectar el cáncer y de distinguir a los individuos sanos del cáncer colorrectal (CRC) (P < 0,013, véanse las Figuras 1A-B), cáncer pancreático (PC) (P < 0,018, véanse las Figuras 1C-D y las Figuras 3A-B), vías biliares (P < 6,45E-12, datos no mostrados), sarcoma (P < 0,036, datos no mostrados) y mieloma múltiple (P < 0,4E-08, véase la Figura 1E). La sensibilidad y la especificidad de CD24 para distinguir el CRC de sujetos normales fue del 79,2 % y el 74,7 %, respectivamente, con una AUC de 0,786 (véanse las Figuras 2A-B) y para detectar PC fue del 75,0 % y el 85 %, respectivamente, con una AUC de 0,791 (véanse las Figuras 2C-D). En la medida en que se usen títulos de sección, no deben interpretarse como necesariamente limitantes.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un método para diagnosticar un cáncer o una lesión premaligna, comprendiendo el método determinar un nivel de expresión de CD24 en leucocitos comprendidos en una muestra biológica de un sujeto, en donde un nivel de CD24 en leucocitos pequeños y no en leucocitos grandes por encima de un umbral predeterminado es indicativo de dicho cáncer o dicha lesión premaligna, y en donde dichos pequeños leucocitos tienen una firma CD24+CD11b- y dichos leucocitos grandes tienen una firma CD24+CD11 b+.

2. Un método para monitorizar la eficacia de la terapia contra el cáncer, comprendiendo el método determinar un nivel de expresión de CD24 en leucocitos comprendidos en una muestra biológica de un sujeto que ha sido tratado con una terapia contra el cáncer, en donde una disminución en el nivel de CD24 en leucocitos pequeños y no en leucocitos grandes desde un umbral predeterminado después de la terapia contra el cáncer es indicativa de reducción de dicho cáncer, y en donde dichos leucocitos pequeños tienen una firma CD24+CD11b- y dichos leucocitos grandes tienen una firma CD24+CD11 b+, monitorizando de esta manera la eficacia de la terapia contra el cáncer.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dichos leucocitos pequeños se seleccionan del grupo que consiste en linfocitos T, linfocitos B y monocitos.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dichos leucocitos grandes se seleccionan del grupo que consiste en neutrófilos, células dendríticas, granulocitos, macrófagos y células NK.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde dicha muestra se selecciona del grupo que consiste en una muestra de sangre, una muestra de suero, una muestra de heces, una muestra de orina y una muestra de saliva.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en donde dicha lesión premaligna es un adenoma.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicha lesión premaligna está asociada con un tumor sólido.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en donde dicho cáncer es un tumor sólido.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en donde dicho tumor sólido es un cáncer del tracto gastrointestinal.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde dicho tumor sólido se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer del intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, cáncer del tracto biliar, cáncer de esófago, cáncer de cavidad oral, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer del tracto urinario, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer uterino, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de las trompas de Falopio, sarcoma, melanoma, carcinoma de células escamosas, cáncer de cerebro y glioma.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho cáncer es una malignidad hematopoyética.