ES2226823T3 - Isoforma c de la tenascina como marcador de neoplasias. - Google Patents

Isoforma c de la tenascina como marcador de neoplasias.

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ES2226823T3 ES00925224T ES00925224T ES2226823T3 ES 2226823 T3 ES2226823 T3 ES 2226823T3 ES 00925224 T ES00925224 T ES 00925224T ES 00925224 T ES00925224 T ES 00925224T ES 2226823 T3 ES2226823 T3 ES 2226823T3
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Abstract

Anticuerpo aislado o un fragmento de éste capaz de identificar una isoforma de tenascina-C humana que contieneel dominio C. Se ha descubierto que las isoformas humanas de TN-C que contienen el dominio C (de ahora en adelante denominado como cTN-C) se expresan fuertemente en estructuras vasculares y en la proximidad de células proliferativas de astrocitoma de alto grado (grado III) y glioblastoma. Las isoformas en cuestión se expresan también ampliamente en estructuras vasculares de neoplasmas humanos de pulmón, aunque no son detectables en ningún tejido adulto humano normal. Por tanto, la presente invención hace referencia a un método para la identificación de tejidos neoplásicos in vivo e in vitro, basado en la determinación de la presencia de las isoformas cTN-C de TN-C. La invención también hace referencia a ligandos capaces de reconocer cTN-C y sus conjugados El término ¿ligandos¿ se usa aquí para referirse a anticuerpos o sus fragmentos o a cualquier otra molécula capaz de reconocer yunirse a cTN-C. En particular, según la presente invención, los ¿ligandos¿ son fragmentos de anticuerpos humanos recombinantes y más particularmente fragmentos scFv. De hecho, comparados con las inmunoglobulinas convencionales, los fragmentos pequeños de anticuerpos humanos, como son los fragmentos scFv, no se acumulan en el hígado, no son inmunogénicos y muestran una mejor penetración en los tejidos. Según la invención, se pueden obtener conjugados útiles mediante técnicas conocidas de conjugación bioquímica o genética del ligando de cTN-C con las moléculas idóneas para el diagnóstico utilizando un soporte fijo y/o para un propósito terapéutico. Las moléculas adecuadas para la conjugación con el ligando pueden ser, p.ej., radioisótopos, substancias fluorescentes, citocinas, toxinas, fotosensisibilizadores, agentes trombogénicos, etc. Para construir los conjugados de acuerdo con la invención es posible utilizar, p.ej., el ligando descrito arriba así como péptidos u otras moléculas no proteicas.

Description

Isoforma C de la Tenascina como marcador de neoplasias.
Campo de la invención
La presente invención hace referencia a un procedimiento de diagnóstico que permite identificar de forma altamente específica neoplasias humanas mediante fragmentos de un anticuerpo humano recombinante y a los mencionados fragmentos y sus conjugados. La invención también se refiere al uso de fragmentos y sus conjugados en la preparación de formulaciones con utilidad terapéutica.
Antecedentes
Durante el crecimiento neoplásico, la matriz extracelular (de ahora en adelante referida como ME) de los tejidos normales, donde se localiza el crecimiento tumoral, se remodela a través de procesos de degradación proteolítica y síntesis de nuevos componentes
Los componentes de la ME de los tumores difieren de los de los tejidos normales, en términos de cantidad y calidad, y contribuyen a la creación de unas condiciones que favorecen el crecimiento tumoral y su desarrollo, incluyéndose entre ellos la angiogénesis que juega un papel fundamental en el desarrollo neoplásico.
La Tenascina-C (de ahora en adelante referida como TN-C) es una glicoproteína consistente en seis subunidades similares unidas por enlaces disulfuro. Está codificada por un único gen y su expresión está regulada por un solo promotor.
A través de un mecanismo conocido como ayuste alternativo, 9 dominios proteicos, homólogos a los "dominios tipo III de la fibronectina" (de ahora en adelante nombrados como FNIII) pueden ser incluidos u omitidos del mRNA de la TN-C humana dando lugar a varias isoformas proteicas.
Kusagawa y col. (British Journal of Cancer,77(1) 98-102 1998) descubrieron que los tejidos cancerosos de pulmón humano contenían niveles elevados de proteína tenascina-C. El estudio observó que en tejidos cancerosos de pulmón al contrario que en pulmón normal se expresaba una isoforma de mRNA de tenascina-C más larga, y que la proteína tenascina-C se degradaba en muchos casos de cáncer de pulmón. Los autores sugirieron el uso de la degradación de la tenascina-C como un marcador del potencial metastático.
En la patente internacional WO 92/04464 se describen los anticuerpos monoclonales que se unen a epítopos de la tenascina humana y un procedimiento para determinar el potencial metastásico de los melanomas mediante el uso de anticuerpos para detectar tenascina en fluidos corporales de un paciente, basado en el descubrimiento de que los melanomas metastásicos secretan tenascina.
En la patente internacional WO 96/08513 se identifican las regiones de las proteínas de tenascina responsables de la promoción y la inhibición de la adhesión, la propagación y el crecimiento de las neuritas.
Vollmer y col. (Biochem. Cell Biol.75(6) 759-769 1997) proporcionan evidencias de que la tenascina-C es producida tanto por las células humanas de adenocarcinoma de endometrio como por las células del estroma. El estudio encuentra un elevado número de variantes por ayuste.
Mighell y col. (Int. J. Cancer.72(2) 236-240 1997) describieron el uso de la transcripción inversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa para la identificación de variantes por ayuste de tenascina-C en tejidos normales como patológicos de mucosa oral, y describieron un nuevo dominio de la tenascina C implicado en el ayuste alternativo.
Talts y col. (Int. J. Dev. Biol.41(1) 39-48 1997) estudiaron la expresión de tenascina-C en riñón de embrión de ratón durante el desarrollo y desarrollaron anticuerpos monoclonales contra la tenascina-C de ratón.
Por tanto, está claro que el desarrollo de un procedimiento y de los reactivos que permitan la identificación de las isoformas presentes sólo en tejidos neoplásicos sería de gran importancia. Esto, de hecho, permitiría un diagnóstico altamente preciso y específico, y posibilitaría que un fármaco u otro efector actúe únicamente sobre el tumor con propósitos terapéuticos.
Descripción de las figuras
Figura 1A: Modelo estructural (en dominios) de una subunidad de TN-C humana. Los símbolos ovales y cuadrados representan las repeticiones de tipo EGF y FN, respectivamente. Se muestran también los extremos amino terminal y el COOH terminal tipo fibrinógeno: de A1 a D se muestran las repeticiones de tipo FN en sombreado, cuya expresión se regula por ayuste alternativo del pre-mRNA. La parte superior de la figura muestra también las proteínas de fusión TNC-\beta-galactosidasa o las proteínas recombinantes utilizadas. Las flechas indican la posición de los epítopos de cada recombinante o anticuerpo monoclonal. A indica continuidad.
Figura 1B: Electroforesis en Dodecil sulfato sódico (SDS PAGE al 4-18%) de la proteína recombinante TN-C "larga" (que contiene los dominios A1 a D) y de la TN-C "corta" (que no contiene los dominios A1 a D. Los geles se tiñeron con azul de Comassie y las inmuno-transferencias se hibridaron con scFv TN11 y TN12.
Figura 1C: Inmuno-transferencias de varias proteínas de fusión y recombinantes (A), teñidas con scFv TN11 y TN12. Los valores mostrados a la izquierda indican la masa molecular (en Kilodaltons) de los estándares.
Figura 2: Transferencias de Northern de RNA enriquecido en poli A procedente de tejidos humanos de (1) corazón, (2) cerebro, (3) placenta, (4) pulmón, (5) hígado, (6) músculo esquelético, (7) riñón, y (8) páncreas, y a partir de tejidos fetales humanos de (1) cerebro, (2) pulmón, (3) hígado y (4) riñón, realizadas usando la sonda de cDNA descrita en el texto, la cual es específica para la isoforma cTN-C, la sonda HT11 que reconoce todas las isoformas TN-C, y el cDNA de la G3PDH humana para la normalización de las membranas. Los números de la izquierda representan las medidas de los estáandares (en kb).
Figura 3: Análisis inmunohistoquímico de secciones de glioblastoma con scFv TN11 (A y B) y con doble tinción obtenida con scFv TN11 (rojo) y mAb K167 (marrón) (C, E, F y G); secciones de metástasis cerebral de un carcinoma pulmonar teñidas con scFv TN11 (D). Barra = 10 \mum.
Figura 4: Análisis inmunohistoquímico de secciones seriadas de carcinoma de mama ductal invasivo usando scFv TN12 (A y C) y scFv TN11 (B y D) y secciones seriadas de meningioma teñidas con scFv TN12 (E) y scFv TN11 (F). Barra = 10 \mum.
Figura 5: Demostración por transferencia de Southern de la especificidad de la sonda de cRNA usada en los experimentos de hibridación in situ. Abajo: tinción de un gel de agarosa con bromuro de etidio. 1: TNFNALL (que comprende el dominio 2, tipo III al dominio 7, tipo III incluyendo los dominios sujetos a ayuste del DNA de la TN-C humana); 2: TNFN1-8 (lo mismo que la secuencia TNFNALL, pero sin los dominios sujetos a ayuste); 3: todos los dominios tipo TNEGF; 4: dominio D, tipo III; 5: dominio C, tipo III; 6: dominio 1, tipo III; 7: dominios tipo TNEGF del 8 al 10; 8: estándar. Arriba: Transferencia de Southern de los mismos fragmentos descritos arriba, hibridados con la sonda marcada con digoxigenina (DIG). Los números de la derecha corresponden a kb.
Figura 6: Dos ampliaciones de experimentos de hibridación in situ sobre secciones de criostato de glioblastoma humano, usando la sonda de cRNA del dominio C marcada con DIG. La señal positiva es visible únicamente en algunas células tumorales que presentan núcleos grandes.
Descripción detallada de la invención
Se ha descubierto que las isoformas humanas de TN-C que contienen el dominio C (de ahora en adelante denominado como cTN-C) se expresan fuertemente en estructuras vasculares y en la proximidad de células proliferativas de astrocitoma de alto grado (grado III) y glioblastoma. Las isoformas en cuestión se expresan también ampliamente en estructuras vasculares de neoplasmas humanos de pulmón, aunque no son detectables en ningún tejido adulto humano normal.
Por tanto, la presente invención hace referencia a un método para la identificación de tejidos neoplásicos in vivo e in vitro, basado en la determinación de la presencia de las isoformas cTN-C de TN-C.
La invención también hace referencia a ligandos capaces de reconocer cTN-C y sus conjugados
El término "ligandos" se usa aquí para referirse a anticuerpos o sus fragmentos o a cualquier otra molécula capaz de reconocer y unirse a cTN-C.
En particular, según la presente invención, los "ligandos" son fragmentos de anticuerpos humanos recombinantes y más particularmente fragmentos scFv. De hecho, comparados con las inmunoglobulinas convencionales, los fragmentos pequeños de anticuerpos humanos, como son los fragmentos scFv, no se acumulan en el hígado, no son inmunogénicos y muestran una mejor penetración en los tejidos.
Según la invención, se pueden obtener conjugados útiles mediante técnicas conocidas de conjugación bioquímica o genética del ligando de cTN-C con las moléculas idóneas para el diagnóstico utilizando un soporte fijo y/o para un propósito terapéutico. Las moléculas adecuadas para la conjugación con el ligando pueden ser, p.ej., radioisótopos, substancias fluorescentes, citocinas, toxinas, fotosensisibilizadores, agentes trombogénicos, etc.
Para construir los conjugados de acuerdo con la invención es posible utilizar, p.ej., el ligando descrito arriba así como péptidos u otras moléculas no proteicas.
Según la invención, es particularmente interesante el ligando representado por el anticuerpo recombinante humano scFv, cuya secuencia se indica en la Tabla 1 (SEQ ID NO.1) nombrado de ahora en adelante como TN11.
1
2
Parte experimental Aislamiento de los fragmentos de anticuerpo contra la isoforma TN-C "larga"
Se seleccionó una librería de expresión en fagos de scFv humano usando, como un antígeno, la variante TN-C "larga" incluyendo todos los dominios FNIII sujetos a ayuste alternativo. El medio de cultivo de las colonias bacterianas obtenido de dicha selección se analizó mediante la técnica de ELISA usando, como antígenos, variantes de TN-C con todos los dominios FNIII ("larga") o sin dominio FNIII ("corta") sujetas a ayuste alternativo.
Esta investigación permitió la identificación de un clon que produce anticuerpos específicos para la forma "larga" de TN-C. A partir del sobrenadante del cultivo bacteriano de dicho clon, denominado TN11, se purificó el scFv mediante inmuno-cromatografía en columna de Sepharose conjugada con el fragmento recombinante A-D (que contiene todos los dominios FNIII sujetos a ayuste alternativo).
TN11 fue caracterizado mediante la técnica de inmunotransferencia, la cual permite la evaluación de la reacción específica con la TN-C "larga" y "corta" y con varias proteínas de fusión recombinantes (TN A-D, TN B-D, TN C, TN B, \lambdaTN27 y \lambdaTNBC) que contienen varios dominios de la TN-C humana (Figura 1 A). Dicha técnica proporcionó evidencias de que el TN11 no sólo reconocía la forma "larga" de TN-C (como ya se demostró por el ELISA durante las fases de selección), sino que también reaccionaba específicamente con todos los fragmentos que contenían el dominio C (Figura 1B, C). Ello fue una prueba de que el epítopo reconocido por TN11 está localizado en el dominio C de la TN-C. Investigaciones similares demostraron que TN11 no reacciona con la TN-C purificada a partir del medio de cultivo de fibroblastos humanos normales, porque la TN-C producida por dichas células no contiene el dominio C.
Se realizaron experimentos de RT-PCR a partir de RNA total extraído de cultivos de fibroblastos humanos normales (GM-6114, ATCC, Rockville, MD, USA), de células derivadas a partir de melanoma humano (SKMEL-28, ATCC, Rockville, MD, USA) y a partir de muestras de tejido de glioblastoma y meningioma humano, usando los siguientes cebadores:
5'GCTACCCCCTAGTACTGATTTTATTGTCTA (de la base 4542 a la 4571 correspondientes a la secuencia TN-C humana) (SEC ID Nº. 3),
5'TTTCCAGTGGCTCAGACTGC (secuencia complementaria, de la base 5028 a la base 5047) (SEC ID Nº.4),
5'CTGGTCTGAGTCTTGGTTCCGTCC (secuencia complementaria, de la base 5322 a la base 5345) (SEC ID Nº 5).
Los experimentos de RT-PCR evidenciaron que el dominio C de la TN-C, ausente en células GM-6114 y SKMEL-28 al igual que en meningiomas, está presente en el mRNA de la TN-C purificada a partir de fragmentos de glioblastoma humano.
Los experimentos de transferencia de Northern realizados usando mRNA de tejidos humanos normales, adultos y embrionarios, respectivamente, y una sonda de cDNA que contiene 270 bases (de la 4630 a la 4899) de la secuencia TN-C humana, demostraron que el mRNA de este dominio se expresa únicamente en tejidos fetales (cerebro, hígado y riñón) y está ausente en el mRNA de tejidos adultos (Figura 2).
La afinidad de unión del anticuerpo purificado TN11 a la TN "larga" se determinó mediante análisis de interacción usando BIAcore. La constante de disociación fue de 1,3x10^{-10}.
Los análisis inmunohistoquímicos realizados usando TN11, que es específico para el dominio C de la TN-C, confirmaron que el dominio C no se detecta en tejidos normales adultos. En cambio, hay una gran presencia de TN-C total (puesta en evidencia a través de la reacción con el anticuerpo monoclonal BC-4, específico para todas las isoformas de TN-C humanas, ya que reconoce un epítopo de la molécula de la TN-C humana correspondiente a una zona constante).
También se observó que prácticamente todos los glioblastomas investigados expresan niveles muy elevados del dominio C, 14 de los 15 casos de tumores fuertemente positivos (Tabla 2 y Figura 3). En particular, la presencia de esta isoforma de TN-C se identificó principalmente en zonas próximas a estructuras vasculares, en áreas con una actividad de proliferación celular elevada, en el estroma de los focos de células tumorales (Figuras 3 A, B, C, E y G), y en células proliferativas (Figura 3 F). En cambio, no se obtuvo reacción positiva en otros tumores cerebrales, exceptuando 2 meningiomas de los 23 que fueron débilmente positivas en las zonas próximas a estructuras vasculares (Tabla 2 y Figura 4).
Se observó también una gran presencia de cTN-C en secciones de neoplasmas pulmonares, especialmente en la proximidad con estructuras vasculares.
Se realizaron estudios de hibridación in situ (Figuras 6A y B) utilizando sondas de cRNA específicas para cTN-C y marcadas con DIG en secciones de glioblastoma obtenidas mediante criostato (Figura 5). Los resultados obtenidos prueban que la isoforma cTN-C es producida por las células tumorales, pero no por todas las células tumorales.
Se demostró también la expresión de cTN-C en estructuras vasculares en un modelo de melanoma humano, en ratones atímicos desnudos (usando células SK-MEL-28). Los ratones atímicos desnudos portadores de melanoma humano se inyectaron con scFv TN11 marcado radioactivamente, lo que demostró la acumulación específica del anticuerpo únicamente en las estructuras vasculares del tumor.
Para concluir, la determinación de la presencia de la isoforma cTN-C de TN-C es un método válido para el diagnóstico de diversos tipos de tumores. Además, la presencia de dicha isoforma en tejidos neoplásicos puede ser útil también con propósitos terapéuticos.
3
Todos los tumores fueron fuertemente positivos con el scFv TN12, que identifica todas las isoformas. El scFv TN11 identifica la isoforma TN-C que únicamente contiene el dominio C.
(1)
El caso positivo lo fue tan sólo en algunas estructuras vasculares
(2)
El caso positivo fue un meningioma de transición y mostró positividad sólo en algunas estructuras vasculares
(3)
De los 7 casos positivos, 3 lo fueron en tejido conectivo y algunas estructuras vasculares y 3 sólo en algunas estructuras vasculares.
(4)
En los 3 casos positivos, la tinción pudo observarse ligeramente.
<110> Philogen s.r.l.
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<120> Procedimiento diagnóstico para la identificación de neoplasias humanas basado en la determinación de la isoforma cTN-C de TN-C, fragmentos de anticuerpos y sus conjugados usados en dicho procedimiento y su terapia
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<130> rec hAb anti-c-TNC
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<140>
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<141>
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> FI99A000094
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<151> 1999-04-20
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<160> 5
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<170> Patentln Ver. 2.1.
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<210> 1
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<211> 747
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(747)
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<400> 1
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4
5 
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<210> 2
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<211> 249
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
6 
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<210> 3
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<211> 30
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador para 35 PCR.
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<400> 3
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gctaccccct agtactgatt ttattgtcta 
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador para PCR.
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tttccagtgg ctcagactgc 
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<210> 5
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador para PCR.
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ctggtctgag tcttggttcc gtcc 
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Claims (11)

1. Anticuerpo aislado o un fragmento de éste capaz de identificar una isoforma de tenascina-C humana que contiene el dominio C.
2. Anticuerpo o un fragmento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un fragmento de un anticuerpo recombinante humano.
3. Anticuerpo o un fragmento de éste de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un scFv o un fragmento de éste.
4. Anticuerpo o un fragmento de éste de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el fragmento es un scFv de un anticuerpo recombinante humano que tiene la secuencia de SEC ID Nº 1.
5. Conjugado que comprende un anticuerpo o un fragmento de éste de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 y una molécula adecuada para uso diagnóstico.
6. Conjugado de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la molécula es un radioisótopo, una substancia fluorescente, una citocina, una toxina un fotosensibilizador o un agente trombogénico.
7. Utilización de un anticuerpo o un fragmento de éste de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la preparación de un reactivo diagnóstico para determinar la isoforma de tenascina C que contiene el dominio C en tejidos y/o fluidos biológicos.
8. Utilización de un conjugado de acuerdo con la reivindicación 5 o reivindicación 6 en la preparación de un reactivo de diagnóstico para determinar la isoforma de tenascina C que contiene el dominio C en tejidos y/o fluidos biológicos.
9. Procedimiento in vitro para identificar tejidos neoplásicos, que comprende determinar la presencia de la isoforma de tenascina C que contiene el dominio C en un tejido o fluido biológico.
10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la presencia de la isoforma de tenascina C se determina por un anticuerpo o un fragmento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la presencia de la isoforma de tenascina C se determina por un anticuerpo o un fragmento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6.
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