MXPA04009771A

MXPA04009771A - Moleculas de anticuerpo contra cea antiidiotipicas y su uso como vacuna contra el cancer.

Info

Publication number: MXPA04009771A
Application number: MXPA04009771A
Authority: MX
Inventors: J Carr Francis
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2002-04-09
Filing date: 2003-04-07
Publication date: 2004-12-13
Also published as: AU2003229614A1; PL371202A1; WO2003084996A2; RU2004133040A; US20050222392A1; BR0309134A; JP2005535571A; KR20040101428A; WO2003084996A3; CN1646567A; EP1492819A2; CA2481829A1; ZA200409034B

Abstract

La presente invencion proporciona moleculas, preferiblemente inmunoglobulinas disenadas, adecuadas para uso como una vacuna antiidiotipica para tumores positivos a CEA. Las moleculas inducen una respuesta inmunologica mediada tanto por CMH clase I como por CMH clase II para celulas tumorales que presentan CEA para una respuesta antitumoral eficiente y sostenida en el hospedador. La presente invencion proporciona versiones modificadas de anticuerpos contra CEA antiidiotipicos, preferiblemente el anticuerpo de raton 708, con propiedades de vacunacion mejoradas. Las modificaciones se relacionan con la introduccion de segmentos de secuencias que se derivan, por ejemplo, de epitopos de CEA, antigeno CD55 y epitopo de CMH especificos para cancer CEA dentro de las regiones variables de las moleculas de anticuerpo.

Description

MOLECULAS DE ANTICUERPO CONTRA CEA ANTIIDIOTIPICAS Y SU USO COMO VACUNA CONTRA EL CANCER CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona moléculas, denominadas preferiblemente inmunoglobulinas , adecuadas para uso como una vacuna antiidiotipica contra tumores positivos de CEA (antigeno carcinoembriónico) . Las moléculas inducen una respuesta inmunológica mediada tanto por CMH clase I como por CMH clase II para las células tumorales que presentan CEA para una respuesta antitumoral eficiente y sostenida por parte del hospedador. La presente invención proporciona versiones modificadas de anticuerpos contra CEA antiidiotípicos', preferiblemente el anticuerpo de ratón 708, con propiedades de vacunación mejoradas. Las modificaciones se relacionan con la introducción de segmentos de secuencia derivados, por ejemplo de CEA, antigeno CD55 y epítopos de CMH' específicos para CEA de cáncer dentro de las regiones variables de las moléculas de anticuerpo. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Durante mucho tiempo ha existido . el deseo de proporcionar composiciones capaces de estimular o amplificar la interacción del sistema inmunológico humano con células cancerosas con el propósito de eliminar las células cancerosas del cuerpo. En contraste con la vacunación para EF: 158134 proporcionar inmunidad contra agentes infecciosos, el dotar de protección al sistema inmunológico para la eliminación de células cancerosas es un objetivo técnico más demandante, no menor a que el sistema inmunológico se requiera que se dirija a células para las cuales existe una tolerancia inmunológica establecida o en algunos casos, las células cancerosas mismas pueden haber adquirido propiedades que las vuelven susceptibles de evadir la detección o eliminación inmunológicas normales . La presente invención se relaciona con la inducción de una respuesta inmunológica dependiente de linfocitos T contra células cancerosas. La mayor parte de las investigaciones anteriores se han enfocado en antígenos limitados a linfocitos T CD8 positivos y CMH clase I, no obstante, la presente invención reconoce la importancia de las respuestas de CMH clase II limitadas a linfocitos T CD4 positivos y en las modalidades preferidas proporciona una vacuna capaz de suministrar epítopos para antígenos de cáncer limitados a clase I y clase II. El antígeno canceroso el cual es el objetivo de las moléculas de la presente invención es el antígeno carcinoembriónico (CEA, por sus siglas en inglés) . CEA es una proteína de la superficie celular que se expresa en demasía, en una amplia gama de cánceres sólidos y se ha enfocado como el objetivo para el desarrollo de vacunas por muchos grupos de investigadores diferentes en todo el mundo, la molécula es un aglucoproteína de 180 kDa anclada a gpi que se expresa en 90% de los cánceres de colorrectales , 70% de cánceres gástricos, pancreáticos y cánceres pulmonares de células no pequeñas, y en 50% de cánceres de mama. La proteína muestra homología considerable con antígeno de reacción cruzada no específico (NCP, por sus siglas en inglés) y la glucoproteína biliar (BFP, por sus siglas en inglés) que se encuentra en granulocitos normales. Se puede detectar CEA en la circulación de la mayor parte de pacientes con tumores CEA positivos y también se ha encontrado en el tracto digestivo normal del feto humano. La proteína parece funcionar como una molécula de adhesión y existe cierta esperanza de que los tratamientos dirigidos a CEA puedan ser benéficos en evitar la metástasis tumoral . CEA es un objetivo atractivo para las inmunotera ia contra el cáncer, que incluyen esquemas de vacunación, pues en donde se encuentra típicamente está presente con altas concentraciones en la superficie de los tumores . Muchos estudios anteriores han aprovechado las secuencias proteínicas derivadas de CEA en una solución de vacunación para terapia. Los estudios en ratones han demostrado la superioridad de CEA expresada en vaccinia (rV-CEA) sobre CEA recombinante como una vacuna, y se ha demostrado inducción de respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL, por sus siglas en inglés) que resulta en regresión de los tumores establecidos [Kantor, J. et al (1992), J. Nati. Cáncer Inst.. 84: 1084-1091]. Cuando se aplica a un estudio clínico en fase I en pacientes con carcinoma metastásico, rV-CEA es capaz de inducir una respuesta de CTL para CEA que destruye células tumorales [Tsang, K. Y. et al (1995) J, natl . Cáncer. Inst. 87 : 982-990]- No obstante, también se induce una respuesta inmunológica significativa hacia la vaccinia lo cual limita los prospectos para inmunizaciones subsecuentes en estos sujetos para obtener un resultado clínico útil. Otros estudios clínicos involucran una dosis de cebado con rV-CEA y después reforzar con CEA codificado dentro del vector avipox lo cual ha generado respuestas promisorias en pacientes que también reciben GM-CSF e IL-2 a dosis bajas [Marshall, J. L. et al (2000) J. Clin. Oncology. 18 . ( : 3964-3973] . Se requieren estudios clínicos adicionales antes de que se pueda demostrar la utilidad de tal régimen de vacunación complejo. Una solución alternativa utilizada para dirigir CEA es la inmunización . contra idiotipos. Los anticuerpos antiidiotípicos que reconocen el sitio de unión de anticuerpos antitumorales puede actuar como imitador funcional del antígeno. Por lo tanto, se pueden utilizar para estimular las respuestas tanto humorales como celulares. Se ha llevado a cabo un ensayo clínico fase I del 3H1 antiidiotípico murino el cual imita CEA en pacientes con cáncer colorrectal avanzado. El anticuerpo 3H1 se ha descrito extensamente en la patente de E.U.A. 5,977,315 y se ha demostrado que el anticuerpo induce respuestas de anticuerpo contra CEA en pacientes con muchos quienes muestran respuestas proliferativas a CEA [Foon, K. A. et al (1995) J. Clin. Invest. 96_: 334-342] . Otros estudios tratan a pacientes con enfermedad residual mínima, y han demostrado que pacientes con respuestas de linfocitos T tanto a anticuerpos antiidiotípicos como a CEA. No obstante, en este estudio el antiidiotipo no induce respuestas CTL [Foon, K. A. , et al (1999) J. Clin. Oncology. 17: 2889-2895] . Los anticuerpos antiidiotípicos que imitan a antígenos tumorales distintos al CEA han sido investigados clínicamente por su utilidad como vacunas terapéuticas. Los ejemplos incluyen el antígeno GD2 y el anticuerpo antiidiotípico 1A7 [documento de E.U.A. 6,509,016], también anticuerpos antiidiotípicos para el antígeno GD3 [documento de E.U.A. 5,529,922; EP0473721] y el antígeno p97 asociado a melanoma [documento de E.U.A. 4,918,164] por numerar sólo algunos. Los métodos inmunoterapéuticos adaptables más complejos aprovechan los anticuerpos antiidiotípicos también se han hecho avanzar, por ejemplo como, se describe en el documento de E.U.A. 5,766,588. Un ejemplo particular de un esquema de vacunación que utiliza un anticuerpo antiidiotípico se proporciona por estudios del anticuerpo monoclonal humano 107AD5. Se ha encontrado que este anticuerpo proporciona una imitación molecular de la proteína CD55 conocida también como antígeno asociado a tumor 791T/gp72 encontrado en células de cáncer colorrectal . La proteína CD55 funciona para proteger a las células del ataque mediado por complemento y en células cancerosos esta proteína se encuentra habitualmente en concentraciones elevadas [Li , L., et al (2001) Br. J. Cáncer _8_4: 80-86] . Se ha demostrado que el anticuerpo 107AD5 ha sido promisorio en muchos ensayos químicos y respuestas inmunológicas antitumorales que incluyen inducción de IL-2 lo cual se puede medir en muchos pacientes [Robins, R.A et al (1991) Cáncer Res. 51: 5425-5429; Dentón, G.W.L., et al (1994) Int. J. Cáncer 57: 10-14; & O90/04415] . No obstante, los ensayos más recientes han indicado que el anticuerpo solo no es probable que sea eficaz en pacientes con una carga tumoral grande y que la estrategia de vacunación con este anticuerpo puede ser más benéfica en pacientes que presentan una enfermedad residual mínima [Maxwel1 -Armstrong, C.A. et al (2001) Bri. J. Cáncer 84: 1443-1446]. Pese al progreso evidente, permanece una necesidad continua por moléculas mejoradas capaces . de inducir una respuesta inmunológica contra las células cancerosas humanas en general y en particular contra células cancerosos positivas a CEA o cánceres positivos para sobreexpresión de CD55. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona polipéptidos adecuados para uso como una vacuna antiidiotípica contra tumores positivos a CEA. Los inventores han reconocido la importancia de la necesidad de inducir una respuesta inmunológica mediada tanto por CMH clase I como por CMH clase II a células tumorales que presentan CEA para una respuesta antitumoral eficiente y sostenida del hospedador . Las composiciones polipeptídicas en la presente son capaces de proporcionar epítopos de CEA limitados tanto a CMH clase I como por CMH clase II. La invención proporciona polipéptidos modificados en donde las secuencias polipeptídicas están derivadas en gran parte del anticuerpo murino antiidiotípico 708. Cuando las secuencias polipeptídicas comparten segmentos de secuencia comunes con las regiones V del anticuerpo 708 se proporcionan muchas de las modalidades en las cuales los segmentos de secuencia ya sea de CEA o del antígeno CD55 se proporcionan de manera adicional. En una modalidad adicional se proporcionan secuencias polipeptídicas en las cuales se han llevado a cabo sustituciones de aminoácidos que resultan en la separación de los epítopos de linfocitos T no deseados. En tales composiciones el intento es enfocar la respuesta inmunológica inducida a CEA o al componente de epítopo CD55 y eliminar epítopos peptídicos competentes que no contribuyen a la respuesta anticancerígena deseada. El anticuerpo 708 original se produce utilizando anticuerpo contra CEA NCR23 como antígeno. El anticuerpo monoclonal NCR23 en sí mismo se une a un epítopo específico de CEA y muestra una reactividad cruzada mínima con tejidos normales [Price, M. R. et al (1987) , Cáncer, Im unology and Immunotherapy. 25: 10-15] . El anticuerpo antiidiotípico 708 reconoce especialmente NCR23 y puede inducir anticuerpos Ab3 en ratones y ratas los cuales reconocen CEA. Son de importancia particular los casos en donde el anticuerpo antiidiotípico 708 también puede cebar linfocitos T humanos a partir de pacientes con cáncer para reconocer ya sea CEA o células tumorales que expresan CEA [Durrant, L. G. et al (1992) , Int. J". Cáncer. 50: 811-816] . Las secuencias de región variable del anticuerpo 708 se han obtenido y analizado para determinar la presencia de elementos de secuencia homólogos a regiones de la proteína CEA. La primera y segunda regiones determinadores de complementariedad de la cadena H (CDRH2 y CDRH3) muestran homología con CEA pero no con las moléculas relacionadas estrechamente NCA o BGP. La región variable 708 y las regiones determinadoras de complementariedad (CDR) de la cadena H en particular representan un imitador molecular de elementos particulares de la molécula CEA y es probable que proporcionen la base para la naturaleza iditoípica del anticuerpo 708 para CEA. La presente invención comprende versiones derivadas modificadas del anticuerpo 708 original. En todas las modalidades preferidas, las moléculas 708 modificadas incluyen un dominio de región C humano en lugar de las regiones C murina originales. Se llevan a cabo otras modificaciones en los dominios de la región V de la molécula. Tales modificaciones se pueden resumir que comprenden uno o más cambios dirigidos hacia los siguientes objetivos, en donde necesita estar involucrado por lo menos un cambio dirigido a una secuencia CEA: • I . Conversión de regiones de homología CEA existente en regiones con identidad de secuencia CEA. II. Sustitución de los segmentos de secuencia cortos existentes con segmentos de secuencia derivada de CEA. III. Sustitución de los segmentos de secuencia corta existentes' con segmentos de secuencia derivada del anticuerpo 107AD5 IV. Sustitución de los segmentos de secuencia corta existentes con segmentos de secuencia derivada de CD55. V. Eliminación de epítopos de linfocitos T no deseados por sustitución de residuos aminoácidos específicos con residuos aminoácidos alternativos.

La presente invención de esta manera proporciona secuencias polipeptídicas nuevas, cada una diseñada de acuerdo con uno o más de los objetivos anteriores y cada una presentando elementos de secuencias con identidad u homología cercana con las regiones V de 708 nativo, la molécula de CEA humana o la molécula CD55 humana o un idiotipo para la molécula CD55 en forma de anticuerpo de ratón 107AD5. La invención incorpora muchas secuencias polipeptídicas las cuales juntas abarcan la totalidad de los "elementos de diseño" que se incluyen en una lista anterior. Cada polipéptido descrito en la presente es una modalidad de acuerdo con la invención. En resumen, la invención se relaciona con los siguientes temas: · Una molécula de inmunoglobulina o un fragmento de la misma derivada de un anticuerpo contra CEA antiidiotípico original y que comprende regiones constantes de origen humano y regiones variables diseñadas sintéticamente que comprenden uno o más segmentos de secuencia de más de 4 aminoácidos, de manera preferible de 5 a 20 residuos aminoácidos consecutivos derivados de CEA antigénico de tumor humano (antígeno carcinoembriónico) . Las más preferidas son los segmentos de secuencias que tienen exactamente la longitud (número de residuos de aminoácidos) de un CDR de una cadena ligera o pesada del anticuerpo antiidiotípico correspondiente (por ejemplo 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 17, 18). • Una molécula de inmunoglobulina correspondiente, en donde por lo menos uno de los segmentos de secuencia es un componente de una región determinadora de complementariedad (CDR) de la cadena pesada o ligera de la inmunoglobulina o que se superpone con residuos adyacentes de una región de infraestructura adyacente al CDR. • Una molécula de inmunoglobulina correspondiente, en donde el componente forma 30 a 100%, de manera preferible 80 a 100% de los residuos aminoácidos del CDR. • Una molécula de inmunoglobulina correspondiente, en donde el anticuerpo antiidiotípico original es el anticuerpo de ratón 708. No obstante, también son adecuados de acuerdo con la invención otros anticuerpos contra CEA antiidiotípicos . • Una molécula de inmunoglobulina correspondiente, que comprende dentro de las regiones variables de manera adicional segmentos de secuencia de 5 a 25, de manera preferible 10 a 20 residuos aminoácidos consecutivos que se derivan del antígeno CD55 humano o las regiones intervariables de un anticuerpo contra CD55 antiidiotípico, en donde se prefiere el anticuerpo 105AD7. • Una molécula de inmunoglobulina correspondiente, en donde, dentro de las regiones variables adicionalmente de epítopos de CMH clase II potenciales, los cuales no contribuyen a una respuesta inmunológica contra las células cancerosas humanas CEA positivas, han sido removidos por sustituciones de aminoácidos. • Una molécula de inmunoglobulina correspondiente que comprende dentro de las regiones variables de manera adicional segmentos de secuencia derivados de CEA los cuales son epítopos de CMH clase I que responden a células cancerosas humanas CEA positivas, preferiblemente TLLSVTRNDV y YLSGA LNL, en donde, en una modalidad preferida de la invención, las secuencias son parte o constituye por completo uno o más de los CDR de la cadena ligera de la inmunoglobulina . • Una molécula de inmunoglobulina correspondiente, que comprende dentro de las regiones variables de manera adicional segmentos de secuencia derivados de CEA los cuales son epítopos de CMH clase II los cuales contribuyen a una respuesta inmunológica contra células cancerosas humanas CEA positivas. • Una molécula de inmunoglobulina correspondiente que comprende una cadena pesada variable que se selecciona de cualquiera de las secuencias como se muestran en las figuras 4 a 7, o una cadena ligera variable que se selecciona de cualquiera de las secuencias como se muestran en las figuras 8 y 9. · Una molécula de inmunoglobulina correspondiente, en donde la cadena variable pesada o ligera comprende uno o más segmentos de secuencia en identidad con los segmentos de secuencia seleccionados del grupo: (i) 345-354 de CEA humana: (ii) 387-396 de CEA humana: (iii) 571-579 de CEA humana: (iv) 629-645 de CEA humana: (v) 148-167 de CD55 humana: • Una composición farmacéutica que comprende una molécula de inmunoglobulina como se describe en lo anterior en una cantidad biológicamente eficaz, un adyuvante y opcionalmente un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. • El uso de una molécula de inmunoglobulina o una composición farmacéutica de cualquiera de las , reivindicaciones especificadas en lo anterior para la elaboración de un medicamento para vacunación de un individuo humano que padece de un tumor sólido CEA positivo o un tumor que genera metástasis, en donde de manera preferible, la vacunación provoca una estimulación mejorada de linfocito T CD8 y CD4 positivos en el individuo. • Un método para la producción de una molécula de vacuna en base en una molécula de inmunoglobulina diseñada sintéticamente adecuada para el tratamiento de un individuo humano que padece de un tumor sólido positivo a CEA (antígeno carcinoembriónico) o un tumor que produce metástasis, el método comprende las siguientes etapas: (i) seleccionar un anticuerpo contra CEA antiidiotípico no humano, preferiblemente el anticuerpo 708 de ratón, (ü) sustituir las regiones constantes no humanas por regiones constantes humanas, (iii) sustituir parcial o completamente una o más de las regiones hipervariables (CDR) con segmentos de secuencia derivados de CEA, por lo que los residuos de infraestructura adyacentes a los CDR se pueden incluir, y opcionalment e que comprenden una o más etapas que se seleccionan del grupo: (iv) sustituir segmentos de secuencia dentro de las regiones variables con segmentos derivados del antígeno CD55 ¦ o los CDR de un anticuerpo contra CD55 antiidiotípico, (v) sustituir los segmentos de secuencia dentro de las regiones variables con segmentos los cuales son epítopos de CMH clase I o CMH clase II que contribuyen a una respuesta inmunológica dirigida a células cancerosas humanas CEA positivas, (vi) eliminar dentro de las regiones variables los epítopos potenciales CMH clase II, los cuales no contribuyen a una respuesta inmunológica para células cancerosas humanas CEA positivas. Una primera modalidad de la invención es el suministro de una molécula de anticuerpo que comprende el anticuerpo 708 con regiones constantes humanas. Una segunda modalidad es el suministro del anticuerpo 708 con regiones constantes humanas y que presenta una modificación de los dominios de la región V. Las modificaciones preferidas se llevan a cabo dentro de una o más de las regiones CDR de la molécula y resultan en la presencia de segmentos de secuencia con identidad para CEA humano. Tales elementos de secuencia de CEA se consideran como epítopos "deseados". En modalidades adicionales, el número de epítopos de CEA deseados se incrementa adicionalmente por introducción de otros elementos de secuencia derivados de CEA. En modalidades adicionales, los epítopos deseados alternativos se incluyen adicionalmente dentro de la secuencia por sustitución de residuos aminoácidos. Los epítopos alternativos deseados particularmente son elementos de secuencia a partir del antígeno CD55 humano del anticuerpo de ratón denominado 105AD7 el cual en sí mismo es un anticuerpo monoclonal antiidiotípico que en sí mismo proporciona un imitador molecular de la proteína CD55 [Maxwell-Armstróng, C.A. , et al (2001) Bri. J. Cáncer 84: 1433-1436]. Tales epítopos adicionales deseados se insertan dentro de la región V de anticuerpo en posiciones las cuales pueden incluir a los CDR o dominios de infraestructura adyacentes . En una modalidad adicional de la invención, se proporcionan secuencias de anticuerpo que comprenden una o más secuencias de epítopo deseadas dentro de un dominio de región V suprimido de secuencias de epítopo no deseadas. Tales secuencias, en este caso, son epítopos dirigidos de CMH clase II y se eliminan por sustituciones razonadas de aminoácidos dentro del péptido que constituye un ligando para por lo menos un halotipo de CMH clase II existente en la población humana. Bajo el esquema actual, se proporcionan 4 secuencias de región V de cadena H diferentes y 2 secuencias de región V de cadena L diferentes. La presente descripción no proporciona límites a las posibles combinaciones de cadena H y cadena L que se puede proporcionar para constituir una molécula de anticuerpo completa. La constitución de la molécula de anticuerpo completa se puede obtener mediante técnicas de ADN recombinante y los métodos para purificar y manipular moléculas de anticuerpo bien conocidos en la técnica. Las moléculas polinucleotídicas (por ejemplo ADN) que codifican para secuencias polipeptídicas descritas en la presente se consideran por igual bajo el alcance de la presente y son modalidades preferidas. Las moléculas de anticuerpo de la presente invención están diseñadas para uso intactas, pero esto no significa que sea una limitación y también se pueden considerar para uso fragmentos inmunogénicos de los anticuerpos. Por lo tanto se pueden preparar Fv, Fab o F(ab')2 u otros derivados utilizando técnicas recombinantes o fragmentos preparados utilizando técnicas convencionales de separación proteolítica y purificación de anticuerpos. Un objetivo de la invención es que los anticuerpos descritos en la presente encuentren utilidad en composiciones que contienen una cantidad inmunogénica, y de manera más preferible una cantidad terapéutica de por lo menos una de las moléculas de anticuerpo modificadas de la invención. La cantidad inmunogénica o terapéutica es una cantidad de la composición de anticuerpo capaz de estimular una respuesta inmunológica en un paciente que recibe el tratamiento y en quién la respuesta inmunológica de manera más preferible es una respuesta tanto humoral como celular. Se desea además proporcionar una composición en la cual la cantidad terapéutica resulte en que el sistema inmunológico de los pacientes muestre actividad aumentada contra células tumorales que expresan CEA. Las composiciones tendrán un efecto terapéutico al eliminar las células tumorales o al suprimir el crecimiento de tumor. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 proporciona una comparación de secuencia de las regiones CDR del anticuerpo antiidiotípico 708 y CEA. Los aminoácidos marcados con negrillas son aquellos que muestran identidad y los que están subrayados son aquellos de identidad o similitud con el siguiente aminoácido. La figura 2 proporciona ejemplos de un análisis de motivo de unión de CMH de las regiones variables CDR2 y CDR3 de la cadena pesada del antiidiotipo 708. Los aminoácidos con negrillas son aquellos los cuales muestran identidad y los subrayados son aquellos de identidad o similitud en el siguiente aminoácido. Las figuras 3A y 3B muestran la secuencia proteínica (código de una sola letra) de las regiones variables del anticuerpo 708. Figura 3A = cadena pesada; Figura 3B = cadena ligera. Las secuencias subrayadas son los CDR. FR = secuencia de infraestructura. Se utilizan las designaciones de CDR de acuerdo con el esquema de Kabat [Martin, A.C.R. (1996), PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25_ 130-133] pero la numeración de residuos se ha modificado individualmente, de acuerdo con esta invención. La figura 4 muestra la secuencia proteínica (código de una sola letra) de 708BH1. Esta secuencia comprende a 708VH, con los epítopos no deseados eliminados. Las secuencias subrayadas son los CDR. La figura 5 muestra la secuencia proteínica (código de una sola letra) de 708VH2. Esta secuencia comprende 708VH con los epítopos no deseados eliminados e incorpora secuencias relacionadas con CEA adicionales. Las secuencias subrayadas son los CDR.

La figura 6 muestra la secuencia proteínica (código de una letra) de 708VH3. Esta secuencia comprende a 708VH, con los epítopos no deseados eliminados e incorpora secuencias adicionales derivadas de CEA y CD55. Las secuencias subrayadas son CDR. La figura 7 muestra la secuencia proteínica (código de una sola letra) de 708VH4. Esta secuencia comprende a 708VH, con los epítopos no deseados eliminados y que incorpora las secuencias derivadas de CEA y 105AD7 adicionales. Las secuencias subrayadas son los CDR. La figura 8 muestra la secuencia proteínica (código de una sola letra) de 708VL1. Esta secuencia comprende a 708VL, con los epítopos . no deseados eliminados. Las secuencias subrayadas son los CDR. La figura 9 muestra la secuencia proteínica (código de una sola letra) de 708VL2. Esta secuencia comprende a 708VL, con los epítopos no deseados eliminados e ¦ incorpora secuencias relacionadas con CEA adicionales. Las secuencias subrayadas son los CDR. La figura 10 muestra la secuencia proteínica (código de una sola letra) de CEA. La figura 11 muestra la secuencia proteínica (código de una sola letra) del antígeno CD55. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las moléculas de la presente invención son moléculas de anticuerpo modificadas con utilidad como los componentes activos de una vacuna contra el cáncer. Por lo tanto, la invención se relaciona con el tratamiento terapéutico de enfermedades humanas . Las moléculas se originan como un anticuerpo antiidiotípico denominado 708. El anticuerpo monoclonal 708 se genera contra el anticuerpo monoclonal contra CEA, NCRC23. El anticuerpo 708 nativo es capaz de bloquear la interacción de NCRC23 con su antígeno y puede inducir respuestas tanto de anticuerpo como de linfocito T que reconocen de manera específica a este antígeno, no obstante, el anticuerpo 708 nativo de ratón no puede estimular linfocitos de donadores normales [Durrant, L. G. et al (1992), ibid] . Se han realizado muchas modificaciones al anticuerpo 708 nativo con el fin de mejorar su capacidad para que funcione como una vacuna anticancerígena. Las modificaciones han resultado en las composiciones descritas en la presente y son modalidades de la presente invención. Todas las modificaciones del anticuerpo 708 de ratón nativo (original) se pueden llevar a cabo utilizando medios de ingeniería genética ampliamente conocidos en el arte. La primera de tales modificaciones es común a cada una de las moléculas 708 variantes. Esta modificación es la ingeniería de los dominios de región constante de manera tal que estas son secuencias de proteína de región constante humana. Es común en el campo denominar a tal anticuerpo sometido a ingeniería como "anticuerpo quimérico" . Dentro del contexto de la presente invención, la conversión del anticuerpo 708 murino a un anticuerpo quimérico tiene una consecuencia muy importante con respecto a la capacidad de la molécula 708 modificada para actuar como una vacuna contra el cáncer. Los inventores han reconocido que la estimulación de las respuestas de linfocitos T que previamente no se han expuesto requiere un buen direccionamiento de las células presentadoras de antígeno tales como las células dendríticas. El dominio de la región constante humana de cada una de las moléculas 708 modificadas de la presente invención permite la captación de las moléculas vía los receptores Fe (CD64) sobre células dendríticas y otras células. Se ha demostrado que la captación promedio de esta ruta resulta en el cebado de las respuestas de los linfocitos T tanto auxiliares (helper) como citotóxicos [Durrant, L. G. , et al (2001), Znt. J. Cáncer. 92 : 414-420] . En el presente caso, un isotipo de IgGl humana se ha sometido a ingeniería para las regiones V derivadas de 708, aunque en principio se entiende que se puede incorporar bajo el esquema de la presente invención cualquier isotipo capaz de ser reconocido por el sistema receptor Fe. La primera modificación del anticuerpo 708 es la conversión a un anticuerpo quimérico y por lo tanto involucra la ingeniería de la región constante, las modificaciones subsecuentes y por lo tanto las modalidades de la invención se relacionan con las alteraciones de las regiones V del anticuerpo 708 original. Las secuencias de la región V de 708 se han descrito previamente [W098/52976] y las secuencias proteínicas nuevamente se han proporcionado en la presente como figura 3. Las secuencias de la región determinante de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) han sido analizadas para regiones de homología con CEA y las secuencias relacionadas tales como NCA. El CDRH2 muestra homología con tres regiones específicas de CEA y dos de estas también comparten homología con NCA. Una tercera región está en un área específica para CEA. Como el Abl original NCRC23, unido a una región específica de CEA no es inesperado que se encuentre que el antiidiotipo 708 puede contener una secuencia homologa a CEA. Además de la región encontrada en CDRH2 , CDRH3 muestra homología con tres regiones de CEA, y estas también comparten homología con NCA. El análisis comparativo de las secuencias polipeptídicas y polinucleotídicas es bien conocido en la técnica y existen muchas herramientas de elementos de programación (software) que habilitan estos procedimientos. Uno de dichos programas, como se utiliza para la comparación de las secuencias del anticuerpo 708 y CEA como se describe en lo anterior es "DNAstar" (DNASTAR Inc. Madison, WI , Estados Unidos de América) , el cual tiene las implementaciones de varios algoritmos de alineación que incluyen al de Lipman y Pearson [Lipman & Pearson (1985) , Science 227 : 1435-1441] el cual es particularmente útil para similitudes de secuencia de proteína . También se ha realizado el análisis para regiones del anticuerpo 708 de las cadenas pesada y ligera y el CEA humano que se adapta a los motivos de epítopo de linfocitos T reconocidos. Cada análisis se puede llevar a cabo utilizando métodos conocidos en el arte, por ejemplo, como se describe en W098/52976, o con referencia a bases de datos tales como SYFPEITHI [Rammensee, H. G. et al (1999) Im unogenetics 50: 213-219] . Un análisis muestra que la región CDRH2 contiene los motivos de unión HLA-A3 , All, Aw68, B35, B53, DR1 , DR3 , DR7 y DR8. El análisis de la secuencia de CEA en paralelo confirma que los motivos HLA-A3 , DR1 y DR7 también están presentes en el área específica de CEA con homología para CDRH2. La región CDRH3 contiene los motivos de unión HLA-A2 , A3, All, A24, B27, DQ7 , pan DR y DR 1. El motivo HLA-A3 también se encuentra en la región homologa de CEA. Aunque esta región de CEA también muestra homología con NCA, existe una diferencia de aminoácidos en NCA, de leucina a una arginina. Dado que la leucina es un residuo de receptáculo clave para la unión de A3 , es poco probable que las células que expresan NCA presentarán este epítopo en el contexto de HLA-A3. Estos resultados sugieren que pacientes con fenotipos HLA-DR1 o 7, y HLA-A3 puedan mostrar las respuestas de linfocitos T tanto auxiliares como citotóxicos para 708 nativo y es más probable que respondan a sus tumores CEA positivos . Tomados juntos, estos resultados y observaciones han llevado a una compresión de que las secuencias de la región V de 708 nativo proporcionan un imitador molecular de la molécula de CEA. Además, la condición imitadora parece estar dirigida a varias posiciones diferentes en la secuencia de CEA y a su vez estas secuencias se adaptan para muchos motivos del tipo de linfocitos T auxiliares y citotóxicos. Los inventores han buscado incrementar el perfil inmunogénico similar a CEA inherente de la secuencia 708 nativa al realizar modificaciones en la secuencia de manera que se incrementa el grado de secuencia similar a CEA dentro de la molécula. La estrategia se ha extendido para incluir la siembra de elementos de secuencia derivados de CEA adicionales dentro de la región V 708 original en posiciones en donde no está presente homología preexistente con la secuencia derivada de CEA que entra. Esto se ha vuelto posible por la flexibilidad inherente de la región V de inmunoglobulina y que es capaz de aceptar hipervariabilidad de secuencia en zonas particulares (los COR) y aún así retener la integridad estructural completa y la capacidad de que se exprese y procese como cualquier otra molécula de inmunoglobulina. Este proceso se auxilia adicionalmente por la carencia de cualquier requerimiento para el anticuerpo sometido a ingeniería para retener cualquier forma de actividad de unión a antígeno, en realidad, se prefiere de manera adicional que no existe interacción con antígeno alguno, especialmente un antígeno unido a una célula, lo cual es posible por las preparaciones de esta invención. Las moléculas polipeptídicas de la presente invención están diseñadas con el propósito de suministrar epítopos inmunogénicos al sistema inmunologico del paciente sujeto, de manera que el sistema inmunologico de los pacientes cambie de dirección para eliminar células que expresen CEA. Por lo tanto, es importante inducir brazos humoral y celular del sistema inmunologico y esto se proporciona al suministrar epítopos auxiliares de linfocitos T potentes y epítopos limitados a CMH clase I. Se han identificado previamente muchos de los epítopos limitados CMH clase I dentro de la secuencia de CEA, y en algunos casos han sido el sujeto de ensayos clínicos [Kwong, Y, et al (1995) ¿TNCI 87: 982-990] . En la presente invención, los segmentos de secuencia derivados de CEA TLLSVTRNDV (residuos 345-353) y YLSGANLNL (residuos 571-579) los cuales se conocen como epítopo de CMH clase I se ha sometido a ingeniería dentro de los CDR de la cadena ligera. Además del uso de los segmentos de secuencia derivados de CEA, una característica importante adicional de la presente invención es la incorporación de secuencias CD55 y una versión mimética de parte de CD55 en forma de segmentos de secuencia del anticuerpo 105AD7. La molécula CD55 se expresa ampliamente en tejido humano normal en donde sirve para proteger a las células de la crisis mediada por complemento y por linfocitos citolíticos naturales (natural killer (NK) ) . La validez de CD55 como un objetivo para la inmunoterapia se basa en observación de la expresión aumentada de CD55 en tipos de tumores múltiples y en estudios que utilizan anticuerpo 105AD7. Este anticuerpo imita a un epítopo en CD55 y los ensayos clínicos han demostrado estimulación de las respuestas de los linfocitos T en pacientes tratados con la totalidad del anticuerpo 105 AD7 en una estrategia de vacunación [WO97/32021 y todas las referencias en dicho documento] . La presente invención proporciona por primera vez composiciones que presentan combinaciones de epítopos inmunogénicos derivados de CEA, CD55 o 105AD7. Además, cada uno de los epítopos con potencia biológica demostrada con respecto a la' estimulación de las respuestas inmunológicas humanas se proporcionan como parte de una molécula de inmunoglobulina para conferir ventajas técnicas y biológicas significativas sobre esquemas, por ejemplo, en donde se proporcionan epítopos equivalentes individualmente, como péptidos sintéticos. Como entidades moleculares, los polipéptidos de la presente invención se pueden describir como "anticuerpos antigenizados " . En la literatura se han reportado anticuerpos antigenizados que incluyen anticuerpos que presentan combinaciones de los epítopos de tipo de CMH clase I y CMH clase II [Zaghouani, H. et al (1993) Eur. J. Immunol. 23: 2746-2750; Xiong, S. et al (1997) Nature Biotech. 15_: 882-886 y referencias en la presente] . Es una consideración de los inventores que ninguna de estas soluciones se ha dirigido a antígenos propios, aprovechando los determinantes idiotípicos ni se han tomado las etapas para suprimir la secuencia no sometida a ingeniería de los epítopos inmunogénicos no deseados, de acuerdo con el esquema de esta invención. Igualmente, ninguno de estos estudios anteriores ha proporcionado composiciones dirigidas para inmunoterapia contra el cáncer. En consecuencia, la invención proporciona secuencias de región V modificadas que contienen segmentos o de secuencia, los cuales comparten identidad con regiones de la molécula de CEA. La invención también describe secuencias de la región V que comparten identidad con los segmentos de secuencia presentes en la molécula CD55. En una modalidad adicional, se describe una secuencia de región V modificada para contener un segmento de secuencia a partir del anticuerpo 107AD5. Específicamente, se proporcionan residuos que contienen secuencias de la región V en identidad con los residuos 345-354, 386-397, 571-579 y 629-645 a partir de la secuencia de CEA; y secuencias con identidad con los residuos 148-167 de la molécula CD55. Una secuencia que corresponde con la mayor parte de la infraestructura 1 de la cadena VH de anticuerpo 107AD5 se incorpora dentro de una variante descrita de la presente invención. Específicamente, una composición de acuerdo con la secuencia de la figura 7 se prefiere y contiene elementos de secuencia de la región de infraestructura 1 de VH107AD5 en sustitución de la región correspondiente dentro de la secuencia 708VH3 descrita en la presente. Se apreciará que. para los elementos de secuencia de CEA insertados dentro de las cadenas VH de la molécula 708 modificada, las inserciones han sido en regiones en donde existe homología significativa de la secuencia de CEA en la molécula original. Por lo tanto, una composición de VH preferida como se muestra en la figura 5 comprende los residuos 629-645 de CEA insertados dentro de la cadena VH en una zona que abarca la región CDRH2 que también incluye los residuos 386-397 de CEA insertados dentro de la cadena VH en una zona que abarca la región CDRH3. Una composición de cadena VL preferida proporciona los elementos de secuencia de CEA 345-354 y 571-579 insertados dentro de la cadena VL en las regiones que abarcan las zonas CDRL1 y CDRL3, respectivamente (figura 9) . Una composición preferida que contiene los elementos de secuencia CD55 tal como la región 148-167 contiene la secuencia CD55 insertada dentro de una cadena VH dentro de una zona que comprende la parte distal de la infraestructura 1 y la totalidad de CDRH1 (figura 6) . Se entiende que en la presente, el término " inmunogenicidad" incluye la capacidad para provocar, inducir o facilitar de alguna otra manera una respuesta mediada por humoral o por linfocitos T en un animal hospedador, y en particular cuando el "animal hospedador" es un humano. El término "anticuerpo" o " inmunoglobulina" se utiliza en la presente en su sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecífieos) formados de por lo menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos en la medida en que muestren la actividad biológica deseada. El término de manera general incluye heteroanticuerpos los cuales están constituidos de dos o más anticuerpos o fragmentos de los mismos de especificidad de unión diferente, los cuales están unidos. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de sus regiones constantes, los anticuerpos intactos se les pueden asignar a diferentes "clases de anticuerpo (inmunoglobulina) " . Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de estas pueden dividirse adicionalmente en "subclases" (isotipos) , por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se les denominan , d, e,. ?, y µ, respectivamente. La clase principal preferida para anticuerpos de acuerdo con la invención es IgG y con mayor detalle Igl e IgG2. Los anticuerpos habitualmente son glucoproteínas que tienen un peso molecular de aproximadamente 150,000, constituidos de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se une a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que ' el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada cadena pesada y ligera también está separada regularmente con puentes disulfuro dentro de la cadena. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH, por sus siglas en inglés) seguido por cierta cantidad de dominios constantes . Las regiones variables comprenden regiones hipervariables o regiones "CDR" que contienen el sitio de unión a antígeno y que son las responsables de la especificidad del anticuerpo, y las regiones "FR" las cuales son importantes con respecto a la afinidad/avidez por el anticuerpo. La región hipervariable generalmente comprende residuos aminoácidos de una "región determinadora de complementariedad" o "CDR" (por sus siglas en inglés) (por ejemplo residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera, y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; o aquellos residuos de un "bucle hipervariable " (por ejemplo los residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3 ) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)) . Los residuos "FR" (región de infraestructura) son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de la región hipervariable como se definen en la presente. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Los residuos aminoácidos particulares se considera que forman interconexión entre los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, . denominados kappa ( ) , lambda (?) en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. El término "región determinadora de complementariedad" (CDR, por sus siglas en inglés) se refiere a los segmentos de la secuencia dentro de las regiones UV de anticuerpo las cuales son hipervariables en secuencia, en relación con el resto del dominio de la región V. Las CDR de los anticuerpos que unen antígeno son críticas para determinar la interacción entre el anticuerpo y el antígeno. Cada región V contiene tres CDR, por convención, las CDR de VH se denominan CDRH1, CDRH2 y CDRH3. De manera similar, las CDR de la cadena ligera se denominan CDRL1, CDRL2 y CDRL3. Las CDR están interpuestas por regiones de una secuencia relativamente invariable denominados segmentos o dominios de "infraestructura" (FR, por sus siglas en inglés) . En la presente invención se han realizado modificaciones tanto en los CDR como en las regiones de infraestructura de ambas cadenas, VH y VL. Algunas de las modificaciones son sustituciones de un solo aminoácido dispersadas y en otros casos se han insertado segmentos de una secuencia nueva dentro de la secuencia de la región V original . Como se utiliza en la presente, el término VH significa un polipéptido que tiene una longitud de aproximadamente 110 a 125 residuos aminoácidos, cuya secuencia corresponde a cualquiera de las cadenas VH especificadas en la presente la cual, en combinación con una VL son capaces de constituir una molécula de inmunoglobulina . De manera similar, VL significa un polipéptido que tiene una longitud de aproximadamente 95-130 residuos aminoácidos, cuya secuencia corresponde a cualquiera de las cadenas VL especificadas en la presente las cuales, en combinación con una VH son capaces de asociación y constitución conjuntas del tetrámero de inmunoglobulina completo. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina de longitud completa son de aproximadamente un peso molecular de 50 kDa y están codificadas por un gen para VH en la parte N terminal y uno de los genes de la región constante (por ejemplo ?) en la parte C terminal. Similármente, las cadenas ligeras de longitud completa tienen un peso molecular de aproximadamente 25 kDa y están codificadas por un gen para la región V en la parte N terminal y un gen para la región constante ? o ? en la parte C terminal . En la técnica, el término "anticuerpo" se acepta que indica una molécula que es capaz de combinarse, interactuar o asociarse de alguna otra manera con un antígeno, y el término "antígeno" se utiliza para referirse a una sustancia que es capaz de interactuar con el anticuerpo. Se reconocerá fácilmente que dentro del contexto de la presente invención, las secuencias de inmunoglobulina modificadas, como se definen en lo anterior y en lo que sigue están construidas para servir como vehículos para el suministro de secuencias peptídicas inmunogénicas específicas y no existe esperanza o deseo de que una inmunoglobulina surja de la combinación de cualquiera de las secuencias polipeptídicas descritas en la presente pueda funcionar como una entidad de unión para un antígeno. En todos los respectos además de la unión de antígeno, las moléculas que se describen en la presente retienen la misma estructura de dominio y secuencias de región constante como anticuerpos y por lo tanto continúan considerándose como anticuerpos. El término "anticuerpo monoclonal", como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que constituyen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se presenten de manera natural que puedan estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, están dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpo policlonal las cuales incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes (epítopos) diferentes, cada anticuerpo, monoclonal está dirigido contra un determinante único en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en la medida en que se pueden sintetizar no contaminados por otros anticuerpos. Los métodos para elaborar anticuerpos monoclonales incluyen el método de hibridoma descrito por Kohler y Milstein (1975, Nature 256, 495) y en "Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas" (1985, Burdon et al., Eds, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volumen 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam) , o se pueden elaborar por métodos bien conocidos de ADN recombinantes (véase, por ejemplo, el documento de E.U.A. 4,816,567) . Los anticuerpos monoclonales también se pueden aislar a partir de bibliotecas de anticuerpos de fagos utilizando las técnicas descritas en Clackson et al. Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J". Mol. Biol, 222:58, 1-597 (1991) , por ejemplo. El término "anticuerpo quimérico" significa anticuerpos en los cuales una porción de la cadena pesada o ligera es idéntica u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de una o varias de las cadenas son idénticas u homologas a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos en la medida en que muestren la actividad biológica deseada (por ejemplo: documento de E.U.A. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci . E.U.A., 81:6851-6855 (1984)). También se conocerá en la técnica métodos para elaborar anticuerpos quiméricos y humanizados.

Por ejemplo, los métodos para elaborar anticuerpos quiméricos incluyen los descritos en las patentes de Boss (Celltech) y por Cabilly (Genentech) (documento de E.U.A. 4,816,397; y 4 , 816, 567) . Las inmunoglobulinas de la presente invención pueden ser anticuerpos completos o fragmentos de las mismas. Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que preferiblemente comprende la región que une antígeno, o región variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv y Fe, diacuerpos (diabodies) , anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena única; y anticuerpos multiespecífieos conformados a partir de uno o varios fragmentos anticuerpo. Un anticuerpo "intacto" es aquel el cual comprende una región variable que se une a antígeno así como un dominio constante de cadena ligera (CL) y dominios constantes de cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o funciones efectoras. La digestión de los anticuerpos con papaína produce dos fragmentos idénticos que se unen a antígeno, denominados fragmentos "Fab", cada uno comprende un sitio de unión a antígeno único y una región CL y CH1 , y un fragmento "Fe" residual cuyo nombre refleja su- capacidad para cristalizar fácilmente. La región "Fe" de los anticuerpos comprenden, como una regla, una región CH2 , CH3 y la región de bisagra de una clase principal de anticuerpo IgGl o IgG2. La región de bisagra es un grupo de aproximadamente 15 residuos aminoácidos los cuales combinan la región CH1 con la región CH2-CH3. El tratamiento con pepsina proporciona un 5 fragmento "F(ab')2" que tiene dos sitios de unión a antígeno y que aún es capaz de unión cruzada de antígeno. "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo el cual contiene un sitio completo de reconocimiento de antígeno y de unión a antígeno. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de l.G cadena pesada y uno de cadena ligera en una asociación estrecha y no covalente . En esta configuración en donde las tres regiones hipervariables (CDR) de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren al anticuerpo especificidad para unirse al antígeno. No obstante, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprende solo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tienen la capacidad de reconocer y unir antígeno, aunque con una afinidad menor en comparación con el sitio de unión completo. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos "Fab1" difieren de los' fragmentos Fab por la adición de algunos' residuos en la parte 5 carboxi terminal del dominio CH1 de cadena pesada que incluyen una o más cisteínas -de la región de bisagra del anticuerpo. Los fragmentos del anticuerpo F(ab')2 originalmente se producen como pares de fragmentos de Fab' los cuales tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo (véase, por ejemplo Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996; documento de E.U.A. 4,342,566). Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena única" o "scFv" (por sus siglas en inglés) comprenden los dominios V y V de anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica única. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende además un polipéptido enlazante entre los dominios VH y VL el cual permite que scFv forme la estructura deseada para unión de antígeno. Se conocen anticuerpos Fv de cadena sencilla, por ejemplo, de Plückthun (The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol . 113, Rosenburg y Moore eds . , Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994), W093/16185; documentos de E.U.A. 5,571,894; 5,587,458; Huston et al. (1988, Proc . Nati. Acad. Sci . 85, 5879) o Skerra y Plueckthun (1988, Science 240, 1038). Las inmunoglobulinas de la invención también pueden ser anticuerpos biespecíficos . Los "anticuerpos biespecífieos " son anticuerpos divalentes únicos (o fragmentos inmunoterapéuticamente eficaces de los mismos) los cuales tienen dos sitios de unión de antígeno específicos diferentes. Por ejemplo, el primer sitio de unión de antígeno se dirige a un receptor de angiogénesis (por ejemplo receptor de integrina o VEGF) , mientras que el segundo sitio de unión de antígeno se dirige a un receptor ErbB (por ejemplo EGFR o Her 2) . Se pueden producir anticuerpos biespecífieos por técnicas químicas (véase, por ejemplo, Kranz et al. (1981) Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. 78, 5807), por técnicas de "polidoma" (Véase documento de E.U.A. 4,474,893) o por técnicas de ADN recombinante , la totalidad de las cuales son conocidas por sí mismas. Se describen métodos adicionales en los documentos O 91/00360, O 92/05793 y WO 96/04305. Los anticuerpos biespecífieos también se pueden preparar a partir de anticuerpos de cadena sencilla (véase, por ejemplo, Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85, 5879; Skerra y Plueckthun (1988) Science 240, 1038). Las inmunoglobulinas de la invención también pueden ser inmunoco jugados . El término " inmunoconjugado" se refiere a un anticuerpo o inmunoglobulina, respectivamente o a un fragmento inmunológicamente eficaz del mismo, el cual se fusiona por unión covalente a una molécula no inmunológicamente eficaz. Preferiblemente, este asociado de fusión es un péptido o una proteína la cual puede estar glucosilada. Tal molécula que no es un anticuerpo se puede unir a la parte C terminal de las cadenas pesadas constantes del anticuerpo o a las partes N terminales de las cadenas variables ligera o pesada. Los asociados de fusión se pueden unir vía una molécula enlazadora la cual es, como una regla, un péptido que contiene 3 a 15 residuos aminoácidos . Los inmunoconjugados de acuerdo con la invención consisten de una inmunoglobulina o un fragmento inmunoterapéuticamente eficaz de la misma dirigida a un receptor tirosina cinasa, preferiblemente un receptor ErbB (ErbBl/ErbB2 ) y un péptido antagonista de integrina o un receptor angiogénico, preferiblementé una integrina o un receptor de VEGF y TNFa o una proteína de fusión que consiste esencialmente de TNFa e IFNy u otra citocina adecuada, la cual está unida con su parte N terminal a la parte C terminal de la inmunoglobulina, preferiblemente la porción Fe de la misma. El término incluye también constructos (combinaciones) de fusión correspondientes que comprenden inmunoglobulinas (anticuerpos) biespecíficos o multiespecíficos , o fragmentos de los mismos. Las moléculas de anticuerpo de la presente invención se conciben para que funcionen como el componente activo (es decir, inmunogénico) de una preparación de vacuna, en donde el término o"vacuna" describe una preparación para administración a un sujeto con el propósito de inducir una respuesta inmunológica . En el presente contexto, la reacción inmune es con intenciones terapéuticas, aunque las vacunas se pueden utilizar como un tratamiento auxiliar para la extirpación quirúrgica de un tumor o para profilaxis de la enfermedad o para la eliminación de la enfermedad. El término "epítopo de linfocitos T" significa, de acuerdo con lo que se describe en esta invención, una secuencia de aminoácidos la cual es capaz de unir CMH clase I o clase II, capaz de estimular linfocitos T o que también se une (sin que necesariamente active de manera mensurable) linfocitos T en un complejo con CMH clase I o clase II. El término "péptido", como se utiliza en la presente y en las reivindicaciones anexas, es un compuesto que incluye dos o más aminoácidos. Los aminoácidos se unen juntos por una unión peptídica (que se define en este documento posteriormente) . Existen 20 aminoácidos diferentes que se presentan de manera natural involucrados en la producción biológica de péptidos, y cualquier cantidad de ellos se puede unir en cualquier orden para constituir una cadena o anillo peptídico. Los aminoácidos que se presentan de manera natural utilizados en la producción biológica de péptidos tienen, todos, configuración L. Se pueden preparar péptidos sintéticos utilizando métodos de síntesis convencionales, utilizando L-aminoácidos, D-aminoácidos o diversas combinaciones de aminoácidos de las dos configuraciones diferentes. Algunos péptidos contienen únicamente algunas unidades de aminoácidos. Los péptidos cortos, por ejemplo que tienen menos de 10 unidades de aminoácidos algunas veces se les denomina como "oligopéptidos " . Otros péptidos contienen una gran cantidad de residuos aminoácidos, por ejemplo hasta 100 o más y se les denomina como "polipéptidos" . Por convención, un "polipéptido" se puede considerar a cualquier cadena peptídica que contenga tres o más aminoácidos, mientras que un "oligopéptido" habitualmente se considera como un tipo particular de polipéptido "corto" . De esta manera, como se utiliza en la presente, se entiende que cualquier referencia a un "polipéptido" también incluye un oligopéptido". Además, cualquier referencia a un "péptido" incluye polipéptidos, oligopéptidos y proteínas. Cada distribución diferente de aminoácidos forma polipéptidos o proteínas diferentes. El número de polipéptidos (y por lo tanto el número de proteínas diferentes que se pueden formar) prácticamente es ilimitado. La presente invención proporciona una serie de secuencias VH modificadas y VL modificadas. Como se ha indicado previamente, una molécula de anticuerpo del tipo IgG comprende dos cadenas H y dos cadenas L asociadas por un enlace disulfuro. Se apreciará que en principio se puede realizar cualquier combinación de cadena H y cadena L y una ruta puede ser la expresión conjunta de los genes para anticuerpo relevantes desde dentro de la misma célula. Para las diversas secuencias de cadena H y cadena L descritas en la presente invención no se pretende que sea un límite respecto a la combinación de cualquier cadena H particular con cualquier cadena L particular, aunque un grupo de combinaciones preferido particularmente sería aquel en donde se presenta cadena H 1 con cadena L 1; cadena H 2 con cadena L 2 , cadena H 3 con cadena L 2 y cadena H 4 con cadena L 2. Otras combinaciones se pueden contemplar y pueden incluir, por ejemplo, combinaciones que presentan regiones V 708 originales de la figura 3. Para el suministro específico de antígenos derivados de proteína a moléculas de CMH clase I o clase II, la proteína debe ser procesada correctamente dentro de un compartimiento apropiado para liberación subsecuente y presentación de los péptidos en las moléculas de CMH clase I y clase II. La presencia de dominios de región constante humanos y particularmente el denominado isotipo IgGl de las moléculas de la presente invención maximiza la oportunidad de que la proteína entre a la célula presentadora de antígeno (APC, por sus siglas en inglés)' en donde será captada vía el receptor de superficie Fe (CD65) . En general, la presentación de péptidos de CMH clase I se facilita si la proteína es procesada en el sitio plasma mientras que la presentación de CMH clase II se facilita si la proteína es procesada en los compartimientos endosómicos. Los antígenos proteínicos exógenos con frecuencia generan buenas respuestas mediadas por CMH clase II (especialmente expansión de linfocitos T auxiliares) pero respuestas pobres mediadas por CMH clase I. La captación vía el receptor Fe (CD65) representa un caso especial y resulta en presentación óptima de epítopos tanto clase I como clase II [Durrant, L.G. (2001), ibid] . Una característica común de péptidos específicos de tejido limitados a CMH clase I y CMH clase II tal y como surgen de la proteína CEA y pueden ser reconocidos por los linfocitos T, es su baja afinidad por el surco de unión peptídico de CMH [Pardoll, D. (1988) Nat. Medicine 4 525-531] . Tales epítopos por lo tanto, en. términos relativos, se presentan con baja eficiencia a la superficie del APC y su población de linfocitos T asociados los cuales pueden no haberse vuelto tolerantes a los péptidos propios del antígeno del cáncer. Por lo tanto, se desea en gran medida proporcionar una preparación de vacuna capaz de proporcionar el antígeno del cáncer en un vehículo el cual sea capaz de maximizar la probabilidad de presentación del antígeno de cáncer deseado y en el cual se minimice el número de posibles péptidos competitivos para presentación. A este respecto, las moléculas de la presente invención se han analizado para determinar la presencia de péptidos susceptibles de unirse a moléculas de CMH clase II y, en una modalidad de la invención, tales secuencias de péptidos no deseados con la capacidad de unirse a CMH clase II se han alterado de manera que no se produzca más la interacción de unión.

La capacidad de un péptido para unir una molécula dada de CMH clase II para presentación en la superficie de un APC depende de muchos factores y de manera más notable su secuencia primaria. Esto influirá tanto en su susceptibilidad a separación proteolítica y también su afinidad para unión dentro del surco de unión peptídico de la molécula de CMH clase II. El complejo peptídico de CMH clase II sobre la superficie APC presenta una cara de unión a un receptor de linfocito T (TCR, por sus siglas en inglés) particular capaz de reconocer determinantes proporcionados tanto por residuos expuestos del péptido como la molécula de CMH clase II. En la técnica existen procedimientos para identificar péptidos sintéticos capaces de unirse a moléculas de CMH clase II, que incluyen, por ejemplo, métodos para unir epítopos restringidos DR reactivos ampliamente [W099/61916] , no obstante, tales péptidos pueden no funcionar como epítopos de linfocitos T en todas las situaciones, particularmente in vivo debido a las vías de procesamiento u otros fenómenos. También se han proporcionado métodos para habilitar la detección de epítopos de linfocitos T por exploración por medio de computadora para motivos de secuencia reconocidos en epítopos de linfocitos T determinados experimentalmente o bien, de manera alternativa, utilizando técnicas de computadora para predecir péptidos que se unan a CMH clase II. Se proporciona un ejemplo en WO02/069232 que describe un enfoque de enebrado computacional para identificar secuencias polipeptídicas con el potencial para unirse a un subconjunto de alotipos de DR de CMH clase II humana. Un objetivo particular de la presente invención es proporcionar moléculas de vacuna polipeptídicas en las cuales la respuesta inmunológica de la vacuna se enfoque de manera principal en un grupo deseado de epítopos de linfocitos T y se reduzca el número de epítopos de linfocitos T potenciales no deseados. Es posible aplicar cualquiera de los métodos descritos previamente [W098/59244 ; W098/52976; WO00/34317, WO02/069232] para identificar la susceptibilidad de unión de los péptidos derivados de 708 a una molécula de CMH clase II. En la práctica, las composiciones constituidas por la presente invención se han derivado posterior al análisis llevado a cabo utilizando herramientas de elementos de programación (software) que aprovechan el esquema que se indica en WO02/069232. Brevemente, los elementos de programación (software) simulan el proceso biológico de presentación de antígeno a nivel de la interacción de unión del péptido CMH clase II para proporcionar una calificación de unión para una secuencia peptídica dada. Tal calificación se determina para muchos alotipos predominantes de CMH clase II existentes en la población humana. Dado que este esquema es capaz de probar cualquier secuencia proteínica, se pueden predecir las consecuencias de sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos con respecto a la capacidad de un péptido para interactuar con un surco de unión de CMH clase II. En consecuencia, se pueden diseñar composiciones de secuencia nuevas las cuales contengan un número reducido de péptidos capaces de interactuar con CMH clase II y de esta manera para que funcionen como epítopos de linfocitos T inmunogénicos . El procedimiento para llegar a las composiciones que se describen en la presente por lo tanto involucra identificar primero la presencia de péptidos de unión de CMH clase II no deseados, en segundo lugar, la eliminación de la secuencia de unión de CMH clase II no deseada por sustitución de aminoácidos para hacer que la secuencia ya no sea capaz de unirse con el sistema de CMH clase II y en tercer lugar volver a analizar la secuencia modificada para determinar cualquier capacidad remanente para unirse a moléculas de CMH clase II o para determinar la presencia de algún otro ligando adicional para CMH clase II que pueda haber sido introducido durante la modificación. La eliminación de los epítopos para CMH clase II en consecuencia involucra la sustitución de aminoácidos para generar variantes modificadas en las que se ha suprimido o eliminado los epítopos de linfocito T no deseados. Las sustituciones de aminoácidos se han realizado en puntos apropiados dentro de la secuencia peptídica que se predice para obtener una reducción sustancial o eliminación de la actividad del epítopo de linfocito T no deseado. Un "punto apropiado" es lo mismo que un residuo aminoácido que se une dentro de uno de los receptáculos de unión que se proporcionan dentro del surco de unión de C H clase II. Se prefiere de manera adicional alterar la unión dentro del primer receptáculo del surco en lo que se denomina Pl o posición de ancla Pl del péptido. La calidad de interacción de unión entre el residuo de ancla Pl del péptido y el primer receptáculo del surco de unión de CMH clase II se reconoce como un constitutivo del determinante principal de afinidad de unión total del péptido completo. Una sustitución apropiada en esta posición del péptido será por un residuo que se acomode de manera menos adecuada dentro del receptáculo, por ejemplo, la sustitución por un residuo más hidrofílico. Los residuos aminoácidos en el péptido en las posiciones que igualan o que se unen dentro de otra de las regiones de receptáculo dentro del surco de unión de CMH también se considera que se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Como será evidente para una persona experta en la técnica, se pueden llegar a grupos alternativos múltiples de sustituciones en las cuales se cumple el objetivo de eliminar epítopos no deseados. No obstante, las secuencias resultantes deberán permanecer ampliamente homologas con las composiciones específicas descritas en la presente y por lo tanto se encuentran bajo el alcance de la presente invención. Sería típico llegar a secuencias que son aproximadamente 70% o más homologas con las secuencias especificadas actuales con respecto a su última región homologa y aún así permanecer operacionalmente equivalentes. Tales secuencias igualmente se encuentran bajo el alcance de la presente invención. La presente invención describe secuencias de la región V modificadas que contienen segmentos de secuencia que comparten homología con regiones de la molécula de CEA. Cuando existen tales homologías, estas son características intrínsecas a la secuencia de anticuerpo 708 original. La invención proporciona formas modificadas de la secuencia original 708 y a este respecto proporciona secuencias en las cuales las regiones de los dominios de infraestructura del anticuerpo contienen sustituciones de residuos con el propósito de eliminar o reducir actividad inmunogénica no deseada para la molécula cuando se administra al sujeto humano. La actividad inmunogénica no deseada se relaciona con elementos de secuencia que se originan desde la región V murina original y que no incluyen elementos de secuencia con homología por CEA humana, CD55 humana o elementos del anticuerpo 105AD7 sometidos a ingeniería deliberadamente en la secuencia. Los epítopos no deseados o que no se quieren, como se definen en la presente, se pueden medir por su capacidad del elemento de secuencia no deseado para unirse a una molécula de CMH clase II para estimular a los linfocitos T vía presentación dentro de una molécula CMH clase II o para unirse a un complejo soluble CMH clase II el cual se puede unir a linfocitos T humanos o un complejo receptor de linfocitos T. Bajo el esquema de la presente invención, se proporcionan 4 secuencias de región V de cadena H diferentes y 2 secuencias de la región V de la cadena L diferentes. La presente descripción no proporciona límites respecto a las ¦ posibles combinaciones de cadena H y cadena L que se pueden proporcionar para constituir una molécula de anticuerpo completa. La constitución de la molécula de anticuerpo completa se puede obtener por técnicas de ADN recombinante y métodos para purificar y manipular moléculas de anticuerpo bien conocidas en la técnica. Las técnicas necesarias se explican completamente en la literatura, tal como en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal. Cell Culture" (R. I. Freshney, ed. , 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds . ) ; "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller & . P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction" , (Mullís et al., eds . , 1994) ; "Current Protocols in Immunology11 (J. E. Coligan et al . , eds . , 1991) . Las moléculas preferidas de esta invención se pueden preparar por cualquiera de varias maneras pero de manera más preferible se lleva a cabo aprovechando los métodos ¦ recombinantes sistemáticos. Es un procedimiento relativamente sencillo utilizar las secuencias de proteína y la información proporcionada en la presente para deducir un polinucleótido (ADN) que codifica para cualquiera de las regiones V de anticuerpo preferidas. Esto se puede obtener, por ejemplo, utilizando herramientas de elementos de programación (software) de computadora tal como el conjunto de programas (software suite) [DNAstar Inc, Madison, WI , USA] o similar. Cualquiera de tales secuencias de ADN con la capacidad de codificar para los polipéptidos preferidos de la presente invención o para homólogos significativos de losx mismos se considerarán como modalidades de esta invención. Como un esquema general, cualquiera de los genes para las cadenas VH o VL se puede elaborar utilizando síntesis de genes y se puede clonar en un vector de expresión adecuado. A su vez, el vector de expresión se introduce dentro de una célula hospedadora y las células se seleccionan y cultivan. Las moléculas de anticuerpo se purifican fácilmente a partir del medio de cultivo y se formulan en una preparación de vacuna para administración terapéutica. A modo de ejemplo no limitante, uno de tales esquemas involucran un procedimiento de síntesis de genes utilizando paneles de oligonucleótidos sintéticos. Los genes se ensamblan utilizando reacción en cadena de ligasa (LCR, por sus siglas en inglés) en donde los oligonucleótidos que presentan extremos complementarios se permite que se reasocien, seguido por amplificación y rellenado utilizando reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) . El PCR es impulsado por adición de una concentración aumentada de los oligonucleótidos flanqueantes para que actúen como cebadores. Los productos de PCR se ensamblan en genes de anticuerpo de longitud completa mediante PCR adicional a partir de vectores que contienen regiones flanqueantes del gen para inmunoglobulina 5' y 3' y subclonación en vectores de expresión para expresión del anticuerpo completo. Los genes para VH y VL ensamblados pueden servir como plantillas para mutagénesis y construcción de secuencias de anticuerpo variantes múltiples tales como cualquiera de las descritas en la presente. Es particularmente conveniente utilizar la estrategia de "PCR de extensión y superposición" como se describe por Higuchi et al [Higuchi et al (1988) Nucleic Acids Res. 16: 7351] aunque también se pueden aplicar con facilidad otras metodologías y sistemas.

Los genes para inmunoglobulina de longitud completa que contienen los casetes de región variable se ensamblan utilizando PCR de superposición. Brevemente, se utiliza el ADN de los vectores M13-VHPCR1 y MI3 -VKPCR1 [Orlandi et al (1989), PNAS, 89_: 3833-7] como plantillas para producir dos fragmentos de PCR superpuestos adicionales para cada una de las cadenas deseadas VH y VL, incluyendo la secuencia flanqueante 5' con el promotor de inmunoglobulina de la cadena pesada murina y que codifica para el péptido señal líder y la secuencia flanqueante 3' que incluye el sitio de empalme y las secuencias de intrón. Los fragmentos de ADN producidos de esta manera para cada VH y VL se combinan en un PCR utilizando cebadores flanqueantes necesarios para obtener secuencias de ADN de longitud completa. El gen completo para la cadena pesada con las secuencias flanqueantes 5 ' y 31 se clona en el vector de expresión pSVgpt [Reichmann et al (1988) Nature, 332:323] el cual incluye el dominio de región constante IgGl humano [Takahashi et al (1982) Cell , 2_9:671] y el gen gpt para selección en células de mamífero. El gen completo para la cadena ligera con las secuencias flanqueantes 5 ' y 3 ' se clona en el vector de expresión pSVHyg [Reichmann et al ibid] en el cual el gen gpt se sustituye por el gen para resistencia a higromicina (hyg) e incluye un dominio de la región constante ? humana [Heiter et al (1980) Cell, 22:197].

Para ambos vectores, los genes para VH o VL ensamblados por completo se subclonan como fragmentos HindIIl/BamHI purificados por electroforesis en gel y se manejan utilizando procedimientos y sistemas reactivos bien conocidos. Los vectores de expresión de cadena pesada y ligera se cotransfectan utilizando electroporación en NSO, un mieloma de ratón que no produce inmunoglobulina que se obtiene de European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) . Las colonias que expresan el gen gpt se seleccionan en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DME ) suplementado con suero bovino fetal 10% (v/v) y antibióticos (por ejemplo de Gibco, Paisley, Reino Unido) y con 0.8 µg/ml de ácido micofenólico y 250 pg/ml de xantina (Sigma, Poole, Reino Unido) . La producción de anticuerpo humano por clones de células transíectadas se miden fácilmente mediante la prueba de ELISA para IgG humana [Tempest et al (1991) BioTechnology 9: 266]. Las líneas de células secretoras de anticuerpo se expanden y el anticuerpo se purifica por cromatografía de afinidad con proteína A [Harlow E.& Lañe D.; ijbid] . La concentración del anticuerpo purificado se determina utilizando una prueba de ELISA que detecta la región constante ? humana de los anticuerpos de interés. Las moléculas de acuerdo con la invención se pueden administrar solas en un tratamiento con un solo medicamento, o bien en combinación con otros medicamentos farmacéuticamente eficaces. Tales medicamentos pueden incluir agentes inmunoterapéuticos o agentes quimioterapéuticos los cuales contienen isótopos radiomarcados citotóxicos eficaces, u otros agentes citotóxicos, tales como péptidos citotóxicos (por ejemplo citocinas) o medicamentos citotóxicos y similares. El término "agente citotóxico", como se. utiliza en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de las células o que provoca destrucción de las células. Se pretende que el término incluya isótopos radioactivos, agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, micótico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas. El término también puede incluir miembros de la familia de citocina, preferiblemente IFNy, así como agentes antineoplásicos que tengan también actividad citotóxica. El término "agente quimioterapéutico" o "agente antineoplásico" se considera de acuerdo con las enseñanzas de esta invención, como un miembro de la clase de los "agentes citotóxicos", como se especifica en lo anterior e incluye agentes químicos que ejercen efectos antineoplásicos, es decir, que impiden el desarrollo, maduración o dispersión de células neoplásicas, directamente en la célula tumoral, por ejemplo mediante efectos citostáticos o citotóxicos o bien indirectamente a través de mecanismos tales como modificación de la respuesta biológica. Los agentes quimioterapéuticos adecuados de acuerdo con la invención preferiblemente son compuestos químicos naturales o sintéticos, pero no se excluyen de manera expresa moléculas biológicas tales como proteínas, polipéptidos, etc. Existe una gran cantidad de agentes antineoplásicos disponibles en uso comercial, en evaluación clínica y en desarrollo preclínico, las cuales se pueden incluir en la presente invención para tratamiento de tumores/neoplasias por politerapia (tratamiento combinado) con TNFa y los agentes antiangiogénicos como se menciona en lo anterior, opcionalmente con otros agentes tales como antagonistas del receptor de EGF. Debe resaltarse que los agentes quimioterapéuticos se pueden administrar opcionalmente junto con la combinación de medicamentos mencionada antes. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes, por ejemplo mostazas nitrogenadas, compuestos de etilenimina, sulfonatos de alquilo u otros compuestos con una acción alquilante tales como nitrosoureas , cisplatino y dacarbazina; antimetabolitos , por ejemplo, ácido fólico, purina o antagonistas de pirimidina; inhibidores mitóticos, por ejemplo alcaloides vinca y. derivados de podofilotoxina; antibióticos citotóxicos y derivados de camptotecina . Los agentes quimioterapéuticos preferidos o la quimioterapia incluyen amifostina (etiol) , cisplatino, dacarbazina (DTIC) , dactinomicina, mecloretamina (mostaza nitrogenada) , estreptozocina, ciclofosfamida, carnustina (BCNU) , lomustina (CCNU) , doxorrubicina (adriamicina) , doxorrubicina lipo (doxil) , gemcitabina (gemzar) , daunorrubicina, daunorrubicina lipo (daunoxome) , procarbazina, mitomicina, citarabina, etopósido, metotrexato, 5-fluorouracilo (5-FU) , vinblastina, vincristina, bleomicina, paclitaxel (taxol) , docetaxel (taxotere) , aldesleucina, asparaginasa, busulfano, carboplatino, cladribine, camptotecina, CPT-11, 10-hidroxi-7-etilcamptotecina (SN38) , dacarbazina, floxuridina, fludarabina, hidroxiurea, ifosfamida, idarrubicina, mesna, idarrubicina , mesna, interferón a, interferón ß, irinotecano, mitoxantrona, topotecano, leuprolide, megestrol, melfalano, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargase , pentostatina, pipobromano, · plicamicina, estreptozocina, tamoxifeno, tenipósido, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostaza de uracilo, vinorrelbina, clorambucilo y combinaciones de los mismos. Los agentes quimioterapéuticos más preferidos de acuerdo con la invención son cisplatino, gemcitabina, doxorrubicina, paclitaxel (taxol) y bleomicina. Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con métodos para el tratamiento terapéutico de humanos utilizando las composiciones de anticuerpo modificados. Para administración a un individuo, cualquiera de las composiciones de anticuerpos modificados se puede producir para que de manera preferible sea por lo menos 80% pura y libre de pirógenos y otros contaminantes. Se entiende además que las composiciones terapéuticas de las proteínas de anticuerpo modificadas se pueden utilizar junto con adyuvantes y sustancias portadoras conocidas comúnmente en la técnica. Tales sustancias en sí mismas no proporcionan epítopos inmunogénicos . Un adyuvante bien conocido comprende una emulsión de aceite mineral y se le denomina adyuvante de Freund, pero se puede considerar por igual otra preparación, por ejemplo, las descritas en los documentos EP-A-0745388 , EP-A-0781559, documentos de E.U.A. 5,057,540; 5,407,684; 5,077,284; 4,436,728; 5,171,568; y 4,726,947 o similares. La preparación de vacuna preferiblemente se administrará con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales excipientes pueden actuar como un diluyente, pero pueden incluir agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsificantes , sales, agentes encapsulantes , amortiguadores y mej oradores de penetración por la piel. Los ejemplos se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (Alfonso R. Gennaro, ed. , 18 ava. edición, 1990). También se puede considerar la encapsulación en liposomas como un medio para formular las proteínas para uso terapéutico y tal uso también puede incluir esquemas terapéuticos que involucran modificadores de respuesta biológica tales como GM-CSF o IL-2 u otras proteínas . Se reconoce que para inducir una respuesta inmunológica o para tratar a un individuo que presenta un tumor asociado a CEA, la preparación de vacuna se administra a un individuo parenteralmente, y puede incluir la administración intracutánea, intramuscular o intradérmica . Los términos "cáncer" y "tumor" se refieren o describen la condición fisiológica en mamíferos que típicamente está caracterizada por crecimiento celular no regulado. Por medio de las moléculas y las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención los tumores, preferiblemente tumores asociados a CEA pueden ser tratados, tales como los tumores de mama, corazón, pulmón, intestino delgado, colon, bazo, riñon, vejiga, cabeza y cuello, ovario, próstata, cerebro, páncreas, piel, hueso, médula ósea, sangre, timo, útero, testículos, cuello uterino e hígado. Los cánceres preferidos de acuerdo con la invención son los cánceres colorectal, gástrico, pancreático, pulmonar de células no pequeñas y de mama . Las moléculas de acuerdo con la invención se administran a un individuo por medio de una composición f rmacéutica. Las "composiciones farmacéuticas" de la invención pueden comprender agentes que reducen o evitan efectos secundarios asociados con la politerapia (tratamiento combinado) de la presente invención ("tratamiento adyuvante") que incluye pero que no se limita a aquellos agentes que reducen, por ejemplo, el efecto tóxico de los medicamentos contra el cáncer, por ejemplo inhibidores de resorción ósea, y agentes cardioprotectores . Tales agentes de adyuvantes impiden o reducen la incidencia de náusea y vómito asociada con la quimioterapia, radioterapia o con las cirugías, o reducen la incidencia de infección asociada con la administración de medicamentos anticancerígenos mielosupresores . Los agentes adyuvantes son bien conocidos en la técnica. Los agentes de inmunoglobulina de acuerdo con la invención preferiblemente se administran en combinación con adyuvantes como BCG y estimuladores del sistema inmunológico.

La cantidad de preparación de vacuna que se va a administrar depende de varios factores, por ejemplo la condición del paciente y la vía de administración. Un régimen -.de dosificación que constituye un ejemplo no limitante varía de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 20 mg, y el régimen de dosificación puede ser quincenal para cuatro inyecciones, seguido por inyecciones mensuales, según se requiera. Las dosis de mantenimiento dependerán de la condición y respuesta del individuo que es tratado. Las preparaciones de vacuna de la invención se consideran particularmente útiles como un adyuvante terapéutico para la intervención quirúrgica convencional para cáncer y por lo tanto servirán para reducir la probabilidad de recurrencia de tumores y relapso clínico.

La eficacia de la administración de vacuna puede incluir pruebas clínicas para determinar el avance del cáncer, por ejemplo detección de indicadores inflamatorios, mamografías, determinación cintigráfica radioactiva (radioscintigrafía) y cualquiera de las otras investigaciones clínicas bien conocidas en la técnica. Se prefiere particularmente determinar la respuesta inmunológica celular en un paciente que recibe las vacunas de la presente invención. Los ensayos preferidos especialmente se enfocan en la actividad específica de linfocitos T y pueden incluir, por ejemplo, la medición de proliferación de linfocitos T. En este ensayo se „ obtienen células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) a partir de una muestra de sangre completa. Las células se cultivan en presencia de péptidos sintéticos tales como los derivados de CEA humana o CD55 humana o alternativamente expuestos a proteína CEA completa o CEA irradiada que expresan células a diversas concentraciones. Preferiblemente, las células estimuladoras son autólogas con las células sensibles (que responden) . Se determina un índice de estimulación (SI, por sus siglas en inglés), típicamente utilizando incorporación de timidina tritiada como marcador de proliferación celular. En tal ensayo, la proliferación positiva inducida por CEA o CD55 se considerará concluyente si el SI medido tiene un valor de por lo menos 2.0, preferiblemente de 2.5 o mayor. Para este ensayo, SI = CPM del cultivo de prueba/CPM del cultivo control no tratado. La estimulación de los linfocitos T Thl, los cuales proporcionan "ayuda" para la formación de los linfocitos T citotóxicos se puede medir por ensayo de la producción de interferón ? en el sobrenadante de cultivo en el día 8-10. La producción de interferón ? se mide fácilmente utilizando sistemas basados en ELISA disponibles comercialmente. La actividad de los linfocitos T citotóxicos específico para CEA o CD55 también puede ser informativa de manera particular. De manera particular, los ensayos adecuados para este tipo se describen por Kantor et al [Kantor, J. et al (1992) Cáncer Res. 5_2: 6917-6925 & JNCI (1992) 84:1084-1091] y Kwong et al [Kwong, Y. et al (1995) JNCI 87:982-990]. El ensayo involucra la medición de liberación de 51Cr al medio, a partir de células objetivo que expresan CEA, marcadas, y el por ciento específico de liberación de 51Cr al medio se mide en comparación con los objetivos etiquetados cultivados solos (control negativo) y objetivos lisados con un detergente (control positivo) . A manera de un ejemplo no limitante adicional, el método para la derivación de las secuencias de proteína preferidas de la invención se describe a continuación: La producción de 708 quimérica se ha descrito previamente (Durrant, L. G., et al (2001) Int. J. Cáncer. 92^:414-420) . Las secuencias de la proteína de región variable se examinan para determinar la presencia de epítopos de linfocitos T no deseados utilizando los métodos descritos en el documento WO 98/52976 y las variantes de secuencia designadas. El análisis adicional se lleva a cabo en la secuencia de proteína CEA humana [Schre e, H. et al (1990), Mol. Cell. Biol. 10:2738-2748], la secuencia de proteína CD55 humana [Caras, I. W. et al (1987) Nature 325:545-549] y las secuencias de la región variable del anticuerpo 107AD5 [WO97/32021] . El análisis comprende alineaciones por homología utilizando conjunto de programas (software suites) disponibles comercialmente (por ejemplo "DNAstar", DNASTAR Inc, adison, WI . EUA) y análisis de epítopos, como se describe en otra parte [W098/59244 ; W098/52976; WO00/34317; Rammensee, H. G. et al (1999) ibid] . El esquema para el análisis de las secuencias peptídicas con potencial para actuar como ligandos de unión de CMH clase II se ha descrito con detalle previamente [WO 02/069232] . Utilizando este procedimiento, los ligandos múltiples para CMH clase II para uno o más alotipos se han identificado en los dominios de la región V del anticuerpo 708. Las secuencias variantes se compilan en las cuales se han suprimido los ligandos de CMH. clase II. Esto se obtiene por ciclos repetitivos de sustitución de aminoácidos y reanálisis para confirmar la eliminación de los epítopos. Las secuencias proteínicas de las composiciones deseadas se muestran en las figuras 4 a 9. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una molécula de inmunoglobulina o un fragmento de la misma, caracterizada porque se deriva de un anticuerpo contra CEA antiidiotípico original y que comprende regiones constantes de origen humano y regiones variables diseñadas sintéticamente, que comprenden uno o más segmentos de secuencia de más de 4 residuos aminoácidos consecutivos que se derivan de CEA (antígeno carcinoembrionico) de antígeno tumoral humano . 2. La molécula de inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque uno de los segmentos de secuencia comprende 5 a 20 residuos aminoácidos consecutivos .
3. La molécula de inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque por lo menos uno de los segmentos de secuencia es un componente de una región determinante de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de la cadena pesada o ligera de la inmunoglobulina o se superpone con residuos adyacentes de una región de infraestructura adyacente al CDR.
4. La molécula de inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el componente constituye 30 a 100% de los residuos aminoácidos de la CDR.
5. La molécula de inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación 3 ó 4, caracterizada porque la CDR es una CDR de la cadena pesada de la inmunoglobulina.
6. La molécula de inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque por lo menos dos CDR de cada cadena pesada o cadena ligera consisten completamente de segmentos de secuencia derivados de CEA.
7. La molécula de inmunoglobulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el anticuerpo antiidiotípico original es el anticuerpo de ratón 708.
8. La molécula de inmunoglobulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque comprende dentro de las regiones variables adicionalmente segmentos de secuencia de 5 a 25 residuos aminoácidos consecutivos que se derivan del antígeno CD55 humano o las regiones hipervariables de un anticuerpo contra CD55 antiidiotípico.
9. La molécula de inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el anticuerpo contra CD55 antiidiotípico es el anticuerpo de ratón 105AD7.
10. La molécula de inmunoglobulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque dentro de las regiones variables se han eliminado por sustituciones de aminoácidos adicionalmente epítopos potenciales de CMH Clase II, los cuales no contribuyen a una respuesta inmune para células de cáncer humanas CEA positivas.
11. La molécula de inmunoglobulina de conformidad 'con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque comprende dentro de las regiones variables adicionalmente segmentos de secuencia derivados de CEA los cuales son epítopos de CMH clase I.
12. La molécula de inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque los segmentos de secuencia derivados de CEA son TLLSVTRNDV y YLSGANLNL .
13. La molécula de inmunoglobulina de conformidad con la reivindicación 11 ó 12, caracterizada porque los segmentos de secuencia derivados de CEA son parte o forman por completo uno o más de las CDR de la cadena ligera de la inmunoglobulina .
14. La molécula de inmunoglobulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque comprende dentro de las regiones variables de manera adicional segmentos de secuencia derivados de CEA los cuales son epítopos de CMH clase II que contribuyen a una respuesta inmunológica dirigida a células de cáncer humanas CEA positivas.
15. La molécula de inmunoglobulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque comprende una cadena pesada variable que se selecciona de cualquiera de las secuencias como se muestran en las figuras 4 a 7.
16. La molécula de inmunoglobulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque comprende una cadena ligera variable que se selecciona de cualquiera de las secuencias que se muestran en las figuras 8 y 9.
17. La molécula de inmunoglobulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque comprende una cadena pesada que se selecciona de cualquiera de las secuencias como se muestran en las figuras 4 a 7 y una cadena ligera que se selecciona de cualquiera de las secuencias como se muestran en las figuras 8 y 9,
18. La molécula de inmunoglobulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque la cadena pesada o ligera variable comprende uno o más segmentos de secuencia en identidad con los segmentos de secuencia que se seleccionan del grupo: (i) 345-354 de CEA humana (ii) 387-396 de CEA humana (iii) 571-579 de CEA humana (iv) 629-645 de CEA humana (v) 148-167 de CD55 humana.
19. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una molécula de inmunoglobulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 en una cantidad biológicamente eficaz, un adyuvante y opcionalmente un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
20. El uso de una molécula de inmunoglobulina o una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones especificadas en lo anterior, para la elaboración de un medicamento para vacunación de un individuo humano que padece de un tumor sólido positivo a CEA o un tumor que produce metástasis.
21. El uso de conformidad con la reivindicación 20, en donde la vacunación provoca estimulación mejorada de linfocitos T CD8 o CD4 positivos en el individuo.
22. Un método para la producción de una molécula de vacuna en base en una molécula de inmunoglobulina diseñada sinté icamente adecuada para el tratamiento de un individuo humano que padece de un tumor sólido positivo a CEA (antígeno carcinoembriónico) o un tumor que produce metástasis, el método está caracterizado porque comprende las siguientes etapas : (i) seleccionar un anticuerpo contra CEA antiidiotípico no humano, (ii) sustituir las regiones constantes no humanas por regiones constantes humanas, y (iii) sustituir parcial o completamente una o más de las regiones hipervariables (CDR, por sus siglas en inglés) con segmentos de secuencia derivados de CEA, por lo que se pueden incluir residuos de infraestructura adyacentes a las CDR.
23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque comprende de manera adicional una o más de las etapas que se seleccionan del grupo de: (iv) sustituir segmentos de secuencia dentro de las regiones variables con segmentos derivados del antígeno CD55 o las regiones hipervariables de anticuerpo contra CD55 antiidiotí ico , (v) sustituir segmentos de secuencia dentro de las regiones variables con segmentos los cuales son epítopos para CMH clase I o CMH clase II que responden a células de cáncer humano CEA positivas, (vi) retirar dentro de las regiones variables los epítopos potenciales de CMH clase II, los cuales no contribuyen a una respuesta inmunológica para células de cáncer humano CEA positivas.
24. El método de conformidad con la reivindicación 22 ó 23, caracterizado porque el anticuerpo contra CEA antiidiotípico no humano es el anticuerpo de ratón 708.