JPH01126558A - 抗体依存性細胞性細胞毒性の測定方法 - Google Patents

抗体依存性細胞性細胞毒性の測定方法

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JPH01126558A
JPH01126558A JP19073188A JP19073188A JPH01126558A JP H01126558 A JPH01126558 A JP H01126558A JP 19073188 A JP19073188 A JP 19073188A JP 19073188 A JP19073188 A JP 19073188A JP H01126558 A JPH01126558 A JP H01126558A
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activator
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JP19073188A
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Alton C Morgan Jr
アルトン　シー．モーガモ，ジュニア
Scott S Graves
スコット　エス．グレイブス
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Poniard Pharmaceuticals Inc
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は一般的に、腫瘍を有する患者を処置するための
方法、及び特に抗体依存性細胞性細胞毒性（ａｎｔｉｂ
ｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅ’ｎｔ　ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉｕ
ｔｅｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　；　ＡＤＣＣ）の生
体内増強（ｉ′ｎｖｉｖ。
ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の測定方法に関する。本発
明はまた、細胞毒性応答を最１にするためにリンホカイ
ンと共に多形核白血球（ＰＭＮ）エフェクター細胞をプ
レインキユヘートすることを含む、ＰＭＮ及びモノクロ
ーナル抗体により介在されるＡＤＣＣを増強するための
方法も開示する。
〔従来の技術〕
癌治療への免疫学的アプローチは、最近目立って進歩し
て来た。たとえば、モノクローナル抗体の開発は、腫瘍
細胞への薬物又は毒素の特異的集中のための１手段を提
供する。最近認識されている他の治療上の免疫学的アプ
ローチは、癌又は腫瘍細胞に対する宿主の免疫応答の増
強又は強化を含む。種々の宿主細胞及び因子が肺癌細胞
に対する宿主の免疫応答に関与し、そしてこれらの種々
の成分の間の相互作用が、抗−腫瘍免疫性に根本的な役
割をもたらすと思われる。
宿主の免疫系の１つの要因は、リンパ球である。
現在、いくつかの異なったタイプのリンパ球が同定され
、それに特徴づけられている。“Ｂ　１．ｌｉｌ胞”と
して命名されたこれらのものは、特定の抗原に結合する
抗体分子の産生に関与される。さらにもう１つのタイプ
のリンパ球は、一定の抗原に対して特異的でもあり得る
Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、さらに細胞毒性（ｃｙｔｏｔ
ｏｘｉｃ）　Ｔ細胞（一定の標的細胞に結合し、そして
それを殺すことが知られている）量サプレッサーＴ細胞
（免疫刺激の後、ある時点で宿主の免疫応答を阻害する
ために作用することが知られている）；及びヘルパーＴ
ｌ１ｌ胞（Ｂ細胞の分化及び細胞溶解性Ｔ細胞応答のた
めに必要であることが知られている）に機能的に細分類
されている。
“ＮＫ”又は“ナチュラルキラー”細胞と命名されてい
るもう１種のリンパ球の亜集団は、種々の腫瘍細胞に対
して自発的な細胞毒性反応性を示すことが知られている
。ＮＫ細胞は、末梢血液の単核細胞の約５％を示す、“
大顆粒状リンパ球”（ＬＧＬ）と呼ばれる形態的に同定
できる細胞並集団を意味する（Ｔ、Ｔｉｍｏｎｅｎなど
２、ムハム傾虹」邸：５６９ページ、１９８１）。ＮＫ
細胞は免疫監視を通して腫瘍細胞に対する宿主の自然の
耐性を担当することができ、そしてそれは異常又は悪性
細胞のための宿主の初期検出系である（Ｇ、Ｔｒｉｎｃ
ｈｉｅｒｉａｎｄ　Ｂ、Ｐｅｒｕｓｓｉａ、　Ｌａｂ、
Ｉｎｖｅｓｔ、　５０：４８９ページ、１９８４）。腫
瘍細胞に対するＮＫ細胞の反応性は、種々のインターフ
ェロンへの３露により生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）又は
生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で増強され得る（Ｊ、Ｒ，Ｏ
？ｔａｌｄｏなど２、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ１、　１３８
　：３５６６゜１９８７）。
癌治療は最近、宿主自体の免疫応答の増強に焦点が当て
らされて来た。初期の方法においては、異種ワクチンが
、患者の免疫系を刺激するために、癌患者に投与された
（Ｒ，Ｐ、ＭｃＣａｂｅなど、＋Ｊ、Ｎａｔｌ−Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｔｎｓｔ、　　６０ニア７３ページ、１９７８
）　、しかしながら、実際、ワクチン増強は効果がない
こが示された。ワクチン増強の研究に関する１つの問題
は、それらが重度の腫瘍患者に対して行なわれたことで
ある。多数の動物モデル研究は、宿主の内因性免疫応答
の増強が重度の腫瘍を減じるためには不適切であること
を示している。従って、企画されたようなワクチン増強
研究は、好結果をもたらす身体自体の防御系の増強の可
能性をほとんど有さなかった。
“アトブチイブ（ａｄｏｐｔｉｖｅ）免疫療法”と呼ば
れているより有望な治療アプローチはまた、腫瘍細胞に
対する個々の患者の免疫応答の増強の特徴も示す。その
原型方法は、Ｓ、＾、ＲｏｓｅｎｂｅｒｇａｎｄＷ、Ｄ
、Ｔｅｒｒｙ、Ａｄｖ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　２５
：３２３ページ、１９７７により記載され、そして再注
入する前、生体外での患者の抗−腫瘍リンパ球の拡張を
利用した。しかしながら、この免疫療法アプローチの可
能性に対する初期の障害は、生体外で多量の患者の免疫
細胞を産生できないことであった。Ｔ細胞増殖因子（イ
ンターロイキン２　；　ＩＬ−２）の発見及び製造は、
患者自身のリンパ球の生体外拡張を可能にした。
数年後、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇはリンホカイン活性化キラ
（ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｋｉｌ
ｌｅｒ；　Ｌ　Ａ　Ｋ　）細胞現象を記載しくＳ、Ａ、
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｊ、Ｎａｔ１、Ｃａｎｃ、Ｉｎ
５ｔ。
互：５９５ページ、１９８５）　、　　そしてこれは、
患者自身の細胞から細胞毒性抗腫瘍リンパ球を誘発する
ことにおいて、ＩＬ−２の増殖促進のみならず、またそ
の分化特性をも利用した。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇの方法に
よれば、多量の患者の末梢血液リンパ球が単離され、そ
して大規模なＭｉ織培養容器中でＩＬ〜２と共に培養さ
れる。ＩＬ−２は、これらのリンパ球の増殖及び活性化
を促進し、生体外細胞毒性測定により測定されるように
腫瘍細胞を殺すそれらの能力を高める。ヒト患者におけ
るＬＡＫ療法のＲｏｓｅｎｂｅｒｇの方法は、ＬＡＫ細
胞及びＩＬ−２の両者が患者に同時に注入された場合、
腫瘍の退化が最適に誘導されたことを示した。
つい最近、アトブチイブ免疫療法の新しい変法力く記載
されている（Ｓ、八、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｓなど、　、
　５ｃｉｅｎｃｅＪ刹：　１３１８ページ、１９８６）
。ＬＡＫ細胞よりも５０〜１００倍効果的であるリンパ
球集団が腫瘍を存する患者から得られた。この集団は、
腫瘍浸潤性リンパ球（ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔ
ｉｎｇ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　；　Ｔ　Ｉ　Ｌ　）か
ら成り、そしてＬＡＫ免疫療法に関しては、そのＴｒＬ
細胞がＩＬ−２への暴露に基づいて生体外で拡張された
。最適なＴＩＬ療法は、注入の時点での宿主の免疫抑制
に依存する。
ＬＡＫ又はＴＩＬ細胞のいずれかを使用するアトブチイ
ブ免疫療法は、いくつかの欠点を有する。
第一の欠点は、効果的な腫瘍処置が頻繁且つ重度の副作
用又は毒性を一般的に伴うことである。毒性が正常な組
織をある非特異的に標的にする活性化されたリンパ球の
注入、又はＩＬ−２（、活性化された状態で注入された
リンパ球を維持するために使用される）の同時投与のい
ずれのせいであるかは明確でない。いくつかの報告は、
ＬＡＫ細胞が非培養性正常細胞でなく新しい腫瘍標的の
みを溶解するであろうというＲｏｓｅｎｂｅｒｇの初め
の報告（Ｍ、Ｔ、Ｌｏｔｚｅなど２、Ｃａｎｃ、Ｒｅｓ
、４１：４４２０，１９８１；Ｅ、Ａ。
Ｇｒｉｍｍなど２、ムシ１４吋、　１５５　：１８３３
，１９８２）とは対象的に、ＬＡＫ細胞が正常な細胞を
認識し、そして殺す（Ｐ、Ｍ、５ｏｎｄｅｌなど２、　
Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ１、　１３７　：５０２＋　１９８６
；Ｂ、Ｌｏｖｅｌａｎｄなど２、　Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．
５９：１５９゜１９８６）ことを示唆した。Ｒｏｓｅｎ
ｂｅｒｇのＬＡＫ法の追加の欠点は、それぞれの患者の
リンパ球の生体外拡張及び活性化のばく大な費用である
。再注入の前、４〜６日間患者のリンパ球を培養するた
めの計算された費用は、１つのコース当り約ｔｏ、ｏｏ
。
ドルである（Ｓ、Ａ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｔｅｃｈｎ
ｏ１、Ｐｅｒｓ四蛙戊虹Ｔｈｅ　Ｗｉｌｋｅｒｓｏｎ　
ＧｒｏｕｈＩｎｃ、　１　：１，１９８６　）　ａさら
にもう１つの欠点は、ヒＩ−ＡＢ血清補充物の存在下で
患者のリンパ球を培養することの必要性に由来する。ヒ
ト血液生成物の使用は、ウィルス感染、たとえば肝炎及
びＡＩＤＳの危険を実質的に高める。
患者のリンパ球が内因的に活性化され得る理論に基づく
試みが、患者に直接的にＩＬ−２を注入することによっ
て行なわれた。この技法は、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇの方法
により必要とされるような、患者の細胞の大規模な生体
外培養に関連する費用及び危険を回避することができる
であろう。しかしながら、いくつかの要因は、リンパ球
の内因的活性化のためのＩＬ−２の注入が治療的に不可
能であることを示唆する。
ＩＬ−２による最適な内的活性化を制限する第１の因子
が、Ａ、Ｂ、Ｒｅ５ｋｅ−Ｋｕｎｚなど２、５ｃａｎｄ
、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ１、１！％ｊ　：　６９３．１９８
６による研究によって例示されている。
この研究は、リンパ球上に発現されるＩＬ−２受容体と
ＩＬ−２との相互作用を試験し、そして最適なエフェク
ター細胞の細胞溶解性が、短い血清の半減期及びＩＬ−
２の投与量−制限性毒性のために生体内で達成され得な
い条件である高いＩＬ−２受容体占有を必要とすること
を見出した。推定的な研究は、活性化された細胞上にＩ
Ｌ−２に対する高い親和性の受容体及び低い親和性の受
容体の存在を示し、そしてその高い親和性を有する受容
体は、ＩＬ−２に帰する生物学的活性のほとんどを介在
する（Ｒ，Ｊ、Ｒｏｂｂ　ａｎｄ　Ｃ，Ｍ、Ｒｕ５ｋ、
ムＩｌ１ｍｕｎｏ１．１３７　：１４２，１９８６：　
Ｍ、　Ｆｕｊｉｉ　など６．ムＩｍｍｕｎｏ１．１３７
　：１５５２，１９８６）　、さらに、ｒＬ−２の前活
性化は、高い投与量のＩＬ−２への続く暴露に対してＴ
リンパ球の感度を減じることが示された（Ｊ、Ｄ、Ａｓ
ｈｗｅｌｌなど２、Ｊ、Ｉ＋＋＋ｍｕｎｏ１．１３７　
：２５７２゜１９８６）。高められた量のＩＬ−２に対
する感受性の欠如は、一定の生物学的応答を達成するた
めに高い親和性のＩＬ−２受容体の多数が占をされなけ
ればならないためであると思われた。
活性化されたリンパ球のほとんどの細胞溶解活性はたぶ
ん、顆粒に存在する細胞溶解性タンパク質により介在さ
れている。これらの顆粒は、ＬＡＫ殺細胞を中介してい
るように思われる（Ｐ、Ａ。
１１ｅｎｋａｒｔなど２、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ１、　１
３７　：２６１１，１９８６）。
最適の顆粒形成はしばしば、生体外でのＩＬ−２への長
時間の暴露を必要とする。従って、顆粒の生体外形成は
、たぶん−船釣に達成され得ないＩＬ−２のレベルを必
要とするであろう。
すべてのこれらのデータは、ＩＬ−２によるＬＡＫ細胞
前駆体の刺激の後、最適に活性化されたＬＡＫ細胞への
前駆体の分化をさらに生体外又は生体内で高めるために
増加する投与量のＩＬ−２が必要とされるであろうこと
を示唆する。生体内でＬＡＫ集団を誘発し又は維持する
ためにＩＬ−２の投与量を多くする必要性は、高い受容
体占有率を達成するために、十分なｒＬ−２を生体内投
与することにおける薬理動態的な障害により妨げられる
であろう。これらの障害は、生体内投与に基づ＜ＩＬ−
２の短い半減期（Ｊ、Ｈ，Ｄｏｎｏｈｕｅ　ａｎｄＳ、
Ａ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ１、　１
３０　：２２０３．１９８３）　。
及び生体内でのＩＬ−２の生来の毒性を包含する。
従って、最適の腫瘍殺細胞を達成するために生体内で患
者のリンパ球を刺激することは、薬理学的に不可能であ
る。
癌治療のために示唆することができるもう１つの免疫学
的機構は、抗体依存性細胞性細胞毒性（八〇ＣＣ）であ
る。ＡＤＣＣは、白血球の補体−又はＦｃ受容体−介在
結合を通して宿主のエフェクター機構を指令するために
、腫瘍標的に結合されるモノクローナル抗体を使用する
であろう。
最近の研究は、ヒト免゛疫成分と一緒にＡＤＣＣを現わ
すマウスモノクローナル抗体の能力に集中して来た。１
つの研究においては、抗−黒色種母モノクローナル抗体
９．２．２７．５４　（ＩｇＧ２ａ）が、ヒト大顆粒状
リンパ球（ｌａｒｇｅ　ｇｒａｎｕｌａｒ　Ｉｙｍｐｈ
ｏｃｙｔｅ；　Ｌ　ＧＬ）及びヒト黒色腫標的細胞系の
存在下で測定される場合、最少のＡＤＣＣを示した（Ｒ
，Ｂ、ｔｌｅｒｂｅｒｍａｎなど２、Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　
Ｔｈｅｒａ　　。
Ｒ，Ａ、Ｒｅ１ｓｆｅｌｄ　ａｎｄ　Ｓ、５ｅｌ１、編
集者、　１９８５．Ａｌａｎ　Ｒ。
Ｌｉ５ｓ；Ｉｎｃ２、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ、　１９
３〜２０３ページ；及びＪ、Ｒ，０ｒｔａｌｄｏなど２
、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ１、　１３８　：３５６６．１９
８７）。
ＡＤＣＣ活性は、第２モノクローナル抗体Ｍ　８３．６
（１ｇＧ３）を用いることによって改良された。両ＭＡ
ｂ（モノクローナル抗体）の生体外ＡＤＣＣは、リンホ
カイン、たとえばインターフェロン−α又ＬＪ：　Ｉ　
Ｌ　−２によりＬＧＬを前処理することにより増強され
得る。
高められた腫瘍細胞性細胞毒性は、ＩｇＧ３モノクロー
ナル抗体（ＭＡｂ）の存在下で観察されるけれども、Ｍ
ＡｂによるＡＤＣＣ増強の機構は不明であった。２種の
案が提案された：ＭＢ３．６により認識されるＣＤ−３
糖脂質抗原がＡＤＣＣのために特に適切な標的構造を有
するが、又はＩ　ｇＧ３のサブクラスはＩｇＧ２ａサブ
クラスよりも一層効果的であるかのいづれかであった。
前案の支持においては、患者に投与される場合にいくら
がの臨床効能を示す、同じＣＤ　−３ｔＪ！脂質に向け
られた第２ＭＡｂ、すなわちＲ２４、がＴ細胞の亜集団
上に存在する交差反応性抗原に結合することが示された
。腫瘍細胞とＴ細胞とのパイ・−アーム（ｂｉ−ａｒｍ
）結合がＡＤＣＣを誘発することができ；又はＴ細胞増
殖の増強により、腫瘍中のＴ細胞浸潤物が拡張され得、
そしてそれらの効能が高められ得た（Ｉ’　、　ｌ１ｅ
ｒｓｅｙなど、。
Ｃａｎｃ、Ｒｅｓ、　　４６：６０８３，１９８６）　
。
何人かの研究者は、マウスモデルを用いて、エフェクタ
ー細胞の生体内増強を試験し始めている。
１つの研究においては、マウスがＩＬ−２を注射され、
その後、ＡＤＣＣ及びエフェクター細胞：’ＩＸ　Ｉｓ
　１胞性が試験された（Ｓ、ｌｌｉｎｕｍａなど２、　
Ｔｍｍｕｎｏ１、　５９：２５１．１９８６）。エフェ
クター細胞殺細胞性及びＡＤＣＣに対するＩＬ−２の効
果が同じ細胞標的に対して測定されず、そしてＡＤＣＣ
はＩｇＧ２ａのＭＡｂを用いて評価された重大な欠点が
存在する。増強のレベルは、ひじょうに低くかった。な
ぜならば、Ｉｌｉｎｕｍａなどは、ＡＤＣＣ−効果性Ｍ
Ａｂのサブクラスを使用しなかったからであった。第２
の研究は、マウス中でエフエフクー細胞応答を生体内維
持するためにＬＡＫ細胞の再注入と共にＩＬ−２の投与
を行なった（Ｍ、Ｚ、Ｐａｐａなど、　、　Ｃａｎｃ、
　Ｒｅｓ　、並：４９７３．１９８６）。
エフェクター機能、たとえばＡＤＣＣのわずかな増強が
観察されたに過ぎなかった。さらにもう１つの出版物は
、次のことを示唆したニジクロホスファミドによる前処
理、並びにＩＬ−２−活性化エフェクター細胞及びＩ　
Ｌ−２投与が転移の最適な処理のために必要とされた（
Ｓ、Ａ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇなど、。
５ｃｉｅｎｃｅ　　２３３　：１３１８，１９８６）　
、後者の２つの研究は、リンホカイン及びネズミエフエ
クター細胞介在性殺細胞に関する生体外及び生体内実験
における有意な欠点、すなわち生体外及び生体内応答の
相互関係の欠乏を指摘する。この欠点は、ＩＬ−２−刺
激性Ｔ細胞は、標的の卵巣癌細胞系に対して有意な生体
外細胞毒性を持たないが、しかし生体内注射に基づいて
、抗−腫瘍効果が示されたことを示すデータによってさ
らに示される（Ｊ、Ｒ。
０ｒｔａｌｄｏなど２、Ｃａｎｃ、ｌ？ｅｓ、　４６：
４４１４，１９８６）　、　Ｐａｐａなどの出版物は、
生体外でのＬＡＫ細胞による標的細胞の細胞溶解性が生
体内での同じ標的細胞に対する治療効果を予測し得ない
ことをさらに示した。
細胞毒性に対する活性化されたエフェクター細胞及びＡ
ＤＣＣの関係は不明瞭である。生体外実験により、腫瘍
殺細胞におけるＡＤＣＣの役割を調べたが、ＡＤＣＣが
患者において一般的に達しうるＩＬ−２のレベルにより
生体内で刺激され得るかどうかは現在のところ知られて
いない。短い血清半減期及びＩＬ−２の毒性は、得られ
るＩＬ−２の最大の生体内レベルを制限する。ＬＡＫ細
胞生成のために最適な条件がＡＤＣＣのためにも最適で
あるかどうかはやはり不明である。さらに、最適なタイ
プのＭＡｂがＡＤＣＣを増強するか否かもまた不明であ
る。
本発明は、宿主の抗−腫瘍応答の＾ＯＣＣ増強を有意に
改良し、そしてさらに他の関連する利点をも提供する。
〔発明開示〕
本発明は、腫瘍を有する患者における抗体依存性細胞性
細胞毒性（ＡＤＣＣ）応答の最適な生体内増強の時間を
決定するための測定方法を提供する。
この新規の方法は、次の段階を含んで成る：患者のＡＤ
ＣＣの基礎レベル及びＮＫ又はＬＡＫ細胞活性を決定す
るために患者から基礎エフェクター細胞サンプルを取り
出す段階；１回又は数回の投与により患者にリンホカイ
ンを投与する段階；リンホカインの投与の後、所定の間
隔で患者からエフェクター細胞を取り出す段階、　ＡＤ
ＣＣの試験レベルを確立し、そして基礎レベル以上のＡ
ＤＣＣの増加を決定するためにエフェクター細胞の第一
のアリコートを各間隔で測定する段階；前記基礎レベル
以上のＮＫ又はＬＡＫ細胞活性の増加を決定するために
エフェクター細胞の第二の７リコートを各間隔で測定し
、抗体（Ａｂ）によりａ了された殺細胞性とＡｂに１丞
されない殺細胞性の差を確立し、そしてそれによってＡ
ＤＣＣ応答のためのエフェクター細胞の最適な生体内活
性化の時間を決定することにより抗体注入のための最適
期間を決定する段階。
前記方法の基礎エフェクター細胞サンプルは、ある期間
にわたって取り出された複数のサンプルを含んで成る。
ＡＤＣＣの基礎レベルを決定する段階は、基礎エフェク
ター細胞サンプル、抗体及び標的細胞を一緒にし、そし
て標的細胞の溶解により細胞毒性を検出する段階を含ん
で成る。好ましくは、抗体は、ネズミＩｇＧ３、ラット
ＩｇＧｚｂ　、キメラ（マウス／ヒト）　ＩｇＧ１１キ
メラＴｇＧ２、キメラＩｇＧ２、キメラＩｇＧ、及びバ
イ−アーム結合をすることができるヘテロハイブリドモ
ノクローナル抗体から成る群から選択されたモノクロー
ナル抗体である。
さらに、溶解アッセイは、”ｃｒ放出Ｌｓ”’Ｉｎ放出
及びトリパンブルー排除から成る群から選択される。標
的細胞は、患者からの腫瘍細胞に抗原活性的に類似する
培養された腫瘍細胞である。リンホカイン又はリンホカ
インの組合せは、インターロイキン−２、インターロイ
キン−４°、インターロイキン−６、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ
−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ及びインターロイキン−３から成
る群から選択される。
最適の活性化の時間を決定する段階は、同じ試験レベル
の間の差異を決定するために、外来リンホカインを伴う
又は伴わないＡＤＣＣの試験レベル及びＬＡＫ又はＮＫ
活性の試験レベルを各時間間隔で比較し、そして外来リ
ンホカイン又はリンホカインの組合せの添加によってＡ
ＤＣＣのさらなる増強が生じない時間を決定する段階を
含んで成る。好ましくは、前もって選択された差は、溶
解単位を用いて計算される。その方法は、リンホカイン
投与の前又は間、患者にサイトキサンを投与する段階を
さらに含んで成ることができる。その方法はまた、エフ
ェクター細胞の最適な生体内活性化の時間を決定する段
階の後、患者のｌ１ｆｆｉ瘍に対して向けられたＡＤＣ
Ｃ−効果性抗体の治療的に有効な量を患者に投与する段
階をさらに含んで成る。これらの抗体は、好ましくは、
ネズミＩｇＧ３、ラットＩｇＧｚｂ　％キメラ　（マウ
ス／ヒト）　ＩｇＧいキメラＩｇＧ２、キメラｒｇｃ２
、キメラＩｇＧ４及びバイ−アーム結合することができ
るヘテロハイブリドモノクローナル抗体から成る抗体の
群から選択される。
その方法はまた、ＡＤＣＣ応答についてのエフェクター
細胞の最適生体内活性化の時間を決定する段階の後、所
定の時間にわたりエフェクター細胞の最適生体内活性化
を維持するのに適切な量でリンホカインが注入される追
加の段階も含んで成る。
もう１つの好ましい態様においては、本発明は、患者に
１又は複数のリンホカインを１回又は複数回投与し；　
ＡＤＣＣのためのエフェクター細胞の最適生体内活性化
の時間を決定し；そして腫瘍を局在化せしめ、そして抗
−腫瘍応答を開始するために適当な量で有効なＡＤＣＣ
抗体を注入する段階を含んで成る、腫瘍を有する患者の
生体内処置のための方法を含む。この処置方法の最適生
体内活性化を決定する段階は、上記に開示された方法を
含む。
さらにもう１つの観点において、本発明は、腫瘍を有す
る患者から白血球含有サンプルを取り出し；その白血球
含有サンプルからＰＭＮ画分を分離し；該ＰＭＮ画分と
ＡＤＣＣ刺激量の活性化物質とをインキュベートし、そ
れにより活性化されたＰＭＮエフェクター細胞を生産し
；腫瘍を有する患者にＡＤＣＣ有効性モノクローナル抗
体の治療量を投与し、それにより腫瘍部にモノクローナ
ル抗体を局在化せしめ；そして腫瘍を有する患者にその
活性化されたＰＭＮエフェクター細胞を注入し、それに
より活性化されたＰＭＮエフェクター細胞及びモノクロ
ーナル抗体が抗−腫瘍応答を開始する段階を含んで成る
、多形核白血球（Ｐ　Ｍ　Ｎ　）及びモノクローナル抗
体により介在されるＡＤＣＣを増強するための方法を開
示する。
〔発明の特定の記載〕
ＮＫ−（ＬＧＬ−）介在（７）ＡＤＣＣニ関する方法を
示す前、この後使用される用語の定義を示すことが本発
明の理解の助けとなるであろう。
丈之±左工ｌ：特定の受容体への結合を通して免疫学的
応答を調節することができる蛋白質又は有機化合物（た
とえば、ＩＬ−２、ＩＬ−３。
ＩＬ−４，ＴＬ−６，Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ。
ＧＭ−ＣＳＦ）。−リンホカイン”は、生来のリンホカ
インペプチド及び生来のリンホカインの性質に類似する
機能的性質を有する薬物分子を含む。
工互フ〕２と夕、」町竪：標的細胞の溶解を介在するこ
とができる顆粒球、卓球又はリンパ系のリンパ細胞。
Ｍ、Ｍｌｊ−皿：典型的には、エフェクター細胞のみに
よって又は結合された抗体及びエフェクター細胞の組合
せによって溶解され得る、培養された又は新鮮なヒト腫
瘍細胞。
ＮＫ凪旧：大顆粒状リンパ球（Ｌ　Ｇ　Ｌ）の表現型を
有し、そして細胞表面マーカー１．　ｅ　ｕ　−Ｍ　１
及びＯＫＭ−１により定義された高密度（Ｐｅｒｃｏｌ
ｌ）のリンパ球細胞。ＮＫ１１１胞は、一定の標的細胞
、たとえばに５６２の？８解を中介することができる。
活ｆ　　れたＬＫＪＩＩＩ　：短期間（１〜３時間）低
投与量（１〜５０　Ｕ／ｍＩ）のリンホカインに暴露さ
れた大顆粒状リンパ球群。活性化されたＮＫ細胞は、Ｎ
Ｋ−感受性及びＮＫ−耐性標的細胞の両者の増強された
細胞溶解を中介することができる。
Ｊ引取：いづれかの抗原刺激の存在下で、長期間（２〜
６日）高い投与量（５０〜１００ＯＵ／ｍｌ）のリンホ
カインへの暴露により誘発されるリンホカイン−活性化
キラー細胞。ＬＡＫ細胞はＮＫ−感受性及びＮＫ−耐性
腫瘍標的細胞の両者に対して細胞毒性である。
昶μト抗体依存性細胞性細胞毒性。ＡＤＣＣは、抗体分
子により作られる架橋を通しての標的細胞へのエフェク
ター細胞の結合を特徴とする。その抗体は、標的細胞の
表面上に発現される抗原及びエフェクター細胞上のＦｃ
又は補体受容体に結合することができる。他方、その同
じ抗体は、バイ−アーム結合を通して標的及びエフェク
ター細胞の両者を結合することができる。標的細胞にひ
じょうに近い付近へのエフェクター細胞からの細胞毒性
分子の放出は、標的細胞の細胞溶解をもたらすことがで
きる。
Ｍ匹二澁来立坑鉢：これらの抗体は、ネズミＩｇＧ２、
ネズミＩｇＧｚａ　、ラットＩｇＧｚｂ　、キメラ（マ
ウス／ヒト）　ＩｇＧいキメラＩｇＧｚ、キメラＩｇＧ
２、キメラＩｇＧ、及びそれらのヘテロバイブリドから
成る群に属する。
ＮＫ−介在ＡＤＣＣの増強 上記のように、癌の処置のための免疫療法は最近ひじょ
うに注目されて来た。アトブチイブ免疫療法は臨床試験
の段階に進歩して来たが、しかしその方法は、上記に論
じられたようにいくつかの欠点を含む。本発明は、現在
使用されている方法の危険性及び出費を回避する、癌治
療への免疫療法アプローチを提供する。
本発明の１つの利点は、それが宿主のＡＤＣＣ応答の増
強を用い、そして抗−腫瘍活性のために宿主のＬＡＫ／
エフェクター細胞集団の最適刺激に依存しないことであ
る。生体外実験は、宿主のＡＤＣＣ応答、特にＬＧＬ又
は他のＦｃ受容体担持細胞を通して介在される応答がＬ
ＡＫ細胞の活性化のために必要とされる量よりも低い量
のＩＬ−２により増強されることを示した。もう１つの
利点は、生体内でのＡＤＣＣ増強のために必要とされる
ＩＬ−２の量が薬理学的に許容され、そしてリンホカイ
ンの生体内投与に基づいてＡＤＣＣの最適刺激性を提供
することである。腫瘍細胞の抗体−介在性殺細胞の改良
された特異性及び有効性が本発明によりさらに提供され
る。
本発明は、腫瘍を有する患者における抗体依存性細胞性
細胞毒性（ＡＤＣＣ）応答の生体内増強のための方法を
記載し、そして該方法とは、患者から基礎エフェクター
キ■胞サンプルを取り出し；該サンプルを用いて、ＡＤ
ＣＣの基礎レベル及びＮＫｍ胞活性を決定し；愚者にリ
ンホカインを１回又は複数回投与し；リンホカインの投
与の後、所定の間隔で患者からエフェクター細胞を取り
出し；ΔＤＣＣの増強のレベルを確立するためにエフェ
クター細胞のアリコートを各間隔で測定し；基礎レベル
以上のＮＫ／ＬＡＫ細胞活性の増強を決定するためにエ
フェクター細胞の第二のアリコートを各間隔で測定し；
　ＡＤＣＣ応答についてのエフェクター細胞の最適生体
内活性化の時間、たとえばリンホカイン注入後の、ＡＤ
ＣＣ及びＮＫ／ＬＡＫエフェクター細胞対標的細胞の力
価曲線の差異が最大に異なる点を決定し；そして所定の
期間ＡＤＣＣのためのエフェクター細胞の最適生体内活
性化を維持するために適当な投与量でリンホカインを注
入することを含んで成る。
さらに、本発明は、投与当り１０〜５００　ｗの範囲の
星のＡ　ＤＣＣ−効果的ＭＡｂの１回又は複数回での注
入を提供する。最適ＡＤＣＣ増強の時間での抗体処置は
、投与される抗体に対して宿主の抗グロブリン応答を高
めるためのリンホカインの能力により、１０〜１２日間
に制限される。これに関しては、抗体処置の間のリンホ
カイン投与の停止又はマウス／ヒトキメラの使用は、抗
グロブリン応答の発生率及び強さを低めることを助ける
ことができる。
本発明によれば、１又は複数の基礎エフェクター細胞サ
ンプルが、リンホカインの投与前、患者から取り出され
る。好ましい態様においては、それらの基礎サンプルは
液体窒素中で凍結され、そしてリンホカイン投与の間取
り出されるサンプルと同じ測定で試験される。この様に
して、ＡＤＣＣの基礎レベルは、最も確かな方法での増
強されたレベルに比較することができる。好ましい態様
は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅにより単離された単
核細胞、抗体（好ましくはネズミＩｇＧ、サブクラス）
及び低レベルのＮＫ細胞殺細胞活性のために選択された
標的細胞を一緒にし、そして標的細胞溶解アッセイによ
り細胞毒性を検出することによって、患者サンプルのＡ
ＤＣＣを測定することを含んで成る。好ましい標的細胞
溶解アッセイは、５１Ｃｒ放出、１１Ｉｎ放出及びトリ
パンブルー排除を含む。
投与されたリンホカインは好ましくは、血清の半減期を
最大にするためにゆっくりとした静脈内注入により患者
に与えられる。これに関する特に好ましいリンホカイン
はインターロイキン−２（ＩＬ−２）である。増強され
るＡＤＣＣのために細胞集団を活性化するためには、他
のリンホカインも本発明で適切であることは、当業者に
とって明らかであろう。そのようなリンホカインは、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ
−４及びＩＬ−６を含むことができ、そしてそれらは単
独で又は１又は複数のこれらのリンホカインの組合せで
使用され得る。特に好ましい組合せは、ＩＬ−２とＩＬ
−６（Ｂ細胞−刺激因子２、インターフェロンＢ２）と
の組合せ（Ｔ細胞増殖のための相乗的な組合せであるこ
とが示されている）、及びＩＬ−２とＩＬ−４との組合
せである（Ｌｉｃｈｔｍａｎなど２、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
１、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８４：８２４．１９８’
７；５ｅｖｅｒｉｎｓｏｎなど２、Ｈｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ。
１７：６７、１９８７）。さらに好ましい態様において
は、１５０〜４００ｍｇ／ｋｇの範囲でのサイキサンが
、Ｔサプレンサー細胞の免疫抑制効果を選択的に停止す
るために、リンホカイン投与の２４時間前、選択された
間隔で患者に前投与される。
ＡＤＣＣ応答のためにエフェクター細胞の最適生体内活
性化の時間を決定する段階は、リンホカイン投与に伴う
増強のレベルを決定するために、正常な提供者のリンパ
球又は患者自身の基礎サンプルとの比較により患者のＡ
ＤＣＣ活性の試験レベル及びＮＫ及びＬＡＫ細胞活性の
試験レベルを各時間間隔で比較する段階を含んで成る。
生体外添加される外来ＩＬ−２を有する生体内刺激され
たサンプルに比較して、刺激されていない及び生体内刺
激されたサンプルを試験することによって（例６を参照
のこと）　、ＡＤＣＣが最適に刺激されているか、及び
抗体注入が開始され得るかどうかを決定することができ
る。
ＰＭＮ−介在されるＡＤＣＣの増強 多形核白血球（ＰＭＮ）の第一の機能は、病原体による
浸入に対しての宿主の保護である。この保護方法は、反
応性酸素代謝物（たとえば過酸化水素及びスーパーオキ
シド）、細胞毒性酵素（たとえばミエロペルオキシダー
ゼ）又はハロゲン化物の放出により仲介される。
ＰＭＮのもう１つの機能は、抗体依存性細胞性細胞毒性
ＣＡＤＣＣ）の機構を通しての有核細胞の細胞溶解の中
介である。ＡＤＣＣは、標準の生体外測定、たとえば標
的細胞からの”Ｃｒ放出により定義され又は測定され得
る。このＡＤＣＣの生体外測定は、標的組織での生体内
炎症応答を誘発するための抗体の能力と相互関係を示す
。
ＡＤＣＣの有核細胞標的は、腫瘍起源のものである。
ＡＤＣＣの殺細胞機能は、種々のタイプのエフェクター
細胞、たとえば大顆粒状リンパ球（ＬＧＬ）及び単球／
マクロファージ並びにＰＭＮにより仲介され得る。さら
に、補体は、抗−標的細胞抗体の存在下で標的細胞に対
して直接的な細胞溶解効果を存し、又は標的細胞の間接
的な細胞溶解を誘発するためにエフェクター細胞上の受
容体を通して作用することができる。特定の標的細胞に
対して細胞毒性活性を最適にするために、種々のエフェ
クター細胞のＡＤＣＣ能力を刺激し又は増強することが
所望される。
ＡＤＣＣ法は３種の成分、すなわちエフェクター細胞、
抗体及び標的細胞を含む。有核の腫瘍性標的細胞のＰＭ
Ｎ−介在性ＡＤＣＣは、ＰＭＮエフェクター細胞への抗
−腫瘍抗体のＦｃ受容体結合を必要とする。抗−腫瘍抗
体の抗原結合領域は、標的細胞の腫瘍抗原に結合し、従
ってエフェクター細胞と標的細胞との間に“橋”を形成
する。次に、標的細胞のＰＭＮ−介在性細胞毒性は、２
種の明確な機構：（１）酸素反応性種の好中球産生又は
（２）細胞溶解素様分子の顆粒エキソサイト−シスのい
づれかによりもたらされ得る。
腫瘍性標的細胞のＰＭＮ−介在性ＡＤＣＣは、ポリクロ
ーナル抗−腫瘍抗体を用いてあらかじめ試験された。理
論的には、ネズミモノクローナル抗体が、ＡＤＣＣの可
能性ある介在体として見込みがある。
たとえば、モノクローナル抗体は、ひじょうに特異的な
抗−腫瘍物質の限りない一定した供給を提供する。治療
物質として有用であるためには、これらのモノクローナ
ル抗体は、ヒト腫瘍標的細胞を細胞溶解するために、ヒ
トエフェクター細胞（ＰＭＮ）と相互作用する必要があ
る。
本発明は、モノクローナル抗体が、ヒトエフェクター細
胞及び標的細胞による標準ＡＤＣＣアッセイにおいて試
験される場合、単独でＰ　Ｍ　Ｎ　−ＡＤＣＣのひじょ
うに弱い介在体であることを開示する。本発明は、この
欠点を克服し、そしてモノクローナル抗体を用いての腫
瘍標的細胞のＰＭＮ−介在、ＡＤＣＣを増強するための
方法を提供する。この増強は、モノクローナル抗体及び
標的細胞とＰ　Ｍ　Ｎとを生体内で一緒にする前、リン
ホカインと共にＰＭＮエフェクター細胞とを生体外でブ
レインキュベートすることにより達成される。他方、リ
ンホカインは、抗−腫瘍モノクローナル抗体の注入の前
、ＡＤＣＣ増強のために有効な量で腫瘍を有する患者に
投与され得る。
本発明の１つの態様は、腫瘍を有する患者の生体内処置
のための方法を開示し、そして該方法は、腫瘍を有する
患者から白血球含有サンプルを取り出し； 該白血球含有サンプルから多形核白血球（ＰＭＮ）画分
を分離し； 該ＰＭＮ画分を、ＡＤＣＣ刺激量の活性化物質と共にイ
ンキュベートし、これにより活性化されたＰＭＮエフェ
クター細胞を産生し； 腫瘍を有する患者にＡＤＣＣ−効果性モノクローナル抗
体の治療量を投与し、これにより腫瘍部にモノクローナ
ル抗体を局在化せしめ；そして腫瘍を有する患者に前記
活性化されたエフェクター細胞を注入し、それにより該
活性化されたＰＭＮエフェクター細胞及びモノクローナ
ル抗体が抗−腫瘍応答を開始する段階を含んで成る。
血液及び骨髄は、本発明の白血球含有サンプルの例であ
る。白血球含有サンプルからＰＭＮを分離するための良
く知られた標準方法のいずれかが、本発明のの方法に使
用され得る。
モノクローナル抗体−介在のＰ　Ｍ　Ｎ　−ＡＤＣＣ応
答の有意な増強は、ＰＭＮエフェクター細胞がリンホカ
イン又はＰＭＮ活性化物質と共にブレインキュベートさ
れる場合に観察される。本発明において、用語“活性化
物質”とは、リンホカイン活性化物質及びＰＭＮ活性化
物質の両者を含むであろう。好ましい活性化物質は、顆
粒球−単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）　、顆粒
球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ｒ−インターフェ
ロン（ガン？−ＩＦＮ）　、ｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ
ペプチド（ｆＭＬＩ’）　、及びホルボールミリステー
トアセテート（ＰＭＡ）を含み、そしてそして特にＧＭ
−ＣＳＦが好ましいリンホカインである。
さらに、蛋白質キナーゼ活性化物質も、本発明の方法に
使用され得る。さらに、カルシウムイオノフォーレ＾２
３１８７は、ＰＭＮ活性化のためにＰＭＡと共に相乗的
に使用され得る。
活性化物質の組合せもまた、本発明に都合良く使用され
得る。たとえば、ＧＭ−Ｃ５Ｆ又は蛋白質キナーゼ活性
化物質以外のリンホカインが、増強されたＡＤＣＣ活性
を長時間維持する活性化されたＰＭＮを誘発するために
ＧＭ−ＣＳＦとの組合せで使用され得る。リンホカイン
の組合せとＰＭＮエフェクター細胞とのインキュベーシ
ョンは５次々と又は同時にリンホカインを添加すること
を含む。
Ｐ　Ｍ　Ｎと共に生体外インキュベーションされる活性
化物質の好ましい濃度は、約０．ＩＵ／−〜約１０００
Ｕ／ｍ１の範囲であり、そして特に約１０ｔｊ／−〜約
５００　Ｕ　／　ｍｔの濃度が好ましい。明らかに、使
用されるリンホカインの量は、標的細胞のＡＤＣＣ殺細
胞のために使用されるリンホカイン及び：Ｉ−フェクタ
ー細胞：抗体：標的細胞の特定の組合せに依存する。
本発明に使用される適切なモノクローナル抗体は、ネズ
ミモノクローナル抗体ＩｇＧ、　；キメラモノクローナ
ル抗体（たとえばマウス／ヒトキメラ）、たとえばキメ
ラＩｇＧ、及びキメラＩｇＧ３；及びヒトＩｇＧ、及び
ｒｇｃ、モノクローナル抗体を含む。Ｆａｂ又は抗原結
合領域を通して標的及びエフェクター細胞の両者を結合
することができるヘテロバイブリド又は二価抗体もまた
本発明に有用である。これに関しての好ましいモノクロ
ーナル抗体は、癌腫細胞に対して向けられたネズミＩｇ
Ｇ、モノクローナル抗体であり、そして特にモノクロー
ナル抗体ＮＲ−Ｃｏ−０４が好ましい。明らかに、他の
腫瘍標的細胞特異性を有するモノクローナル抗体（ネズ
ミ又はキメラ）もまた、本発明に使用するために適切で
ある。たとえば、Ｐ　Ｍ　Ｎ　−ＡＤＣＣを刺激するた
めに、標的腫瘍細胞上で適切な抗原と反応し、そしてそ
のＦＣドメインを通して結合する全癌腫モノクローナル
抗体が本発明に使用され得る。
本発明は標準のＡＤＣＣ測定を使用する。たとえば、Ａ
ＤＣＣ応答を測定するために使用される標的細胞溶解測
定は、Ｓ　ＣＣｒ放出、ＩＩＩ　Ｉｎ放出及び１〜リパ
ンブルー排除を含むことができる。
本発明の第一の態様は、リンホカインと共にＰＭＮをイ
ンキュベーションする段階の後、ＰＭＮからリンホカイ
ンを除く追加の段階をさらに含むことができる。
患者に投与されるＡＤＣＣ−効果的モノクローナル抗体
の量は、好ましくは標的組織又は器官内で局在し、そし
て抗原陽性細胞に結合するために十分である。モノクロ
ーナル抗体は、１回で、複数回で又は連続的に注入され
得る。
本発明の第二の態様は、腫瘍を有する患者の生体内処理
のための方法であり、該方法は、腫瘍を有する患者から
白血球含有サンプルを取り出し； 該白血球含有サンプルから多形核リンパ球（ＰＭＮ）画
分を分離し： 該ＰＭＮ画分をＡＤＣＣ刺激■刺激性化物質と共にイン
キュベートし、それにより活性化されたＰＭＮエフェク
ター細胞を生産し； ＡＤＣＣ効果量のモノクローナル抗体（患者の腫瘍に対
して向けられる）により前記活性化されたＰＭＮエフェ
クター細胞を感作し、それにより活性化されたＰＭＮ−
モノクローナル抗体複合体を形成し；そして腫瘍を有す
る患者に前記活性化されたＰＭＮ−モノクローナル抗体
複合体を注入し、それにより抗−腫瘍応答を開始する段
階を含んで成る。
本発明の第三の態様は、腫瘍を有する患者の生体内処理
のための方法を含む、該方法は、活性化物質を、ＰＭＮ
エフェクター細胞の生体内活性化のために十分な量でＭ
１瘍を有する患者に注入し；そして 前記腫瘍を有する患者に、ＡＤＣＣ効果量のモノクロー
ナル抗体を投与し、それにより腫瘍部にモノクローナル
抗体を局在化せしめ、そして抗−腫瘍応答を開始する段
階を含んで成る。
本発明の第四の態様は、腫瘍を有する患者の生体内処理
のための方法を開示し、該方法は、第１活性化物質を、
ＰＭＮエフェクター細胞の生体内増殖のために十分な量
で腫瘍を有する患者に注入し、それにより患者中に白血
球増加を誘発し； 第２活性化物質を、ＰＭＮエフェクター細胞の生体内活
性化のために十分な量で、白血球増加に続いて、腫瘍を
有する患者に注入し；そしてＡＤＣＣ効果量のモノクロ
ーナル抗体を、ｌｌｆｆ１ｍを有する患者に投与し、そ
れにより腫瘍部でモノクローナル抗体を局在化せしめ、
そして抗−腫瘍応答を開始せしめる段階を含んで成る。
本発明の第五の態様は、腫瘍を有する患者の生体内処理
のための方法を記載し、該方法は、第１活性化物質を、
ＰＭＮエフェクター細胞の生体内増殖のために十分な量
で腫瘍を有する患者に注入し、それにより患者中に白血
球増加を誘発し； 前記腫瘍を有する患者から白血球含有サンプルを取り出
し； 前記白血球含有サンプルから多形核白血球（ＰＭＮ）画
分を分離し； 該ＰＭＮ画分を、ＡＤＣＣ刺激量の第２活性化物質と共
にインキュベートし、それにより活性化されたＰＭＮエ
フェクター細胞を産生し； 該活性化されたＰＭＮエフェクター細胞を前記腫瘍を有
する患者に注入し；そして 該腫瘍を有する患者にＡＤＣＣ効果量のモノクローナル
抗体を投与し、それにより腫瘍部でモノクローナル抗体
を局在化せしめ、そして抗−腫瘍応答を開始せしめる段
階を含んで成る。
本発明の第六の態様は、モノクローナル抗体により介在
される抗体依存性細胞性細胞毒性（八〇ＣＣ）療法にお
ける使用のための多形核白血球（ＰＭＮ）の生体外活性
化方法を記載し、該方法は、適切な提供者から白血球含
有サンプルを取り出し； 該白血球含有サンプルから多形核白血球（ＰＭＮ）を分
離し；そして 該ＰＭＮ画分をＡＤＣＣ刺激量の活性化物質と共にイン
キュベートし、これによりモノクローナル抗体により介
在されるへ〇〇〇療法において使用するための活性化さ
れたＰＭＮを産生ずる段階を含んで成る。
次の例を要約すれば、■土は、ＮＫ−介在及びＰＭＮ−
介在されたＡＤＣＣのリンホカイン増強を決定すること
に使用される細胞系、試薬及びアッセイを記載する。Ｎ
Ｋ−介在されたＡＤＣＣのリンホカイン増強の可能性を
支持する生体外データが■１に示される。患者中へのリ
ンホカインの生体内注入及び続＜ＮＫ−介在されたＡＤ
ＣＣ増強の生体外評価に由来する結果がｌ−に示される
。
■土は、Ｐ　Ｍ　Ｎ　−ＡＤＣＣに対するＣＡＭ−ＣＳ
Ｆの効果を示し、そしてｌはＧＭ−ＣＳＦにより増強さ
れたＰＭＮ−ＡＤＣＣの抗原特異性を特徴づける。
ＰＭＮ−ＡＤＣＣのために必要とされるＣＭ−ＣＳＦの
量の力価測定はｌに示され；Ｃ；Ｍ−ＣＳＦ増強の動力
学は■ユに記載される。エフェクター細胞のＧＭ−ＣＳ
Ｆ活性化及びタンパク質キナーゼＣ活性化がｌに比較さ
れる。サルへのＧＭ−ＣＳＦの生体内投与の後、白血球
増加の誘発がＡ工に例示される。汎上皇は、腫瘍を有す
る患者にＡＤＣＣを増強するためにＧＭ−ＣＳＦにより
ＰＭＮの生体外活性化を記載する。
次の例は例示的であって、制限するものではない。
まず、低量のＩＬ−２によるＡＤＣＣの増強を生体外に
おいて、エフェクター細胞として正常提供者のリンパ球
を用いて試験した。エフェクター細胞を調製するため、
末梢血細胞を１５−のヘパリン処理した試験管、（Ｃｕ
ｒｔｉｎ　Ｍａｔｈｅｓｏｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。
Ｉｎｃ２、Ｔｕｋｗｉｌａ、ＷＡ）に集めた。同容量の
３％デキストランを血液と混合し、そしてこの混合物を
室温にて３０分間インキュベートした。次に、白血球に
富む血漿層を除去した。５０−のコニカルチューブに１
２．５−の１１ｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１１１９（Ｓｉｇ
ｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ２、セントルイス、ＭＯ）
を加え、１２．５ｎ＋７のリンパ球分離媒体（ＬＳＭＨ
Ｏｒｇａｎｏ　Ｔｅｋｎｉｋａ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）
を上に重層し、そして２５−の白血球に富む血づえを上
に重層した。単核白血球のｇＩＩ製のため、末梢血をリ
ン酸緩衝化塩溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中に１：２で稀釈し、
そして２５−の稀釈した血液を１５−のＬＳＭの上に重
層した。コニカルチューブを６５０にｇにて２０分間室
温で遠心した。単核層を取り出し、そして他の５０−チ
ューブに入れ、各多形核白血球層も他の５０ｍ１チユー
ブに取り出した。取り出した細胞層のそれぞれをＰＢＳ
により５０−に稀釈し、そして細胞を遠心分離した（単
核球−６５０Ｘ９．１０分間、室温；　ＰＭＮ　−２５
０！ｇ、５分間、室温）。ＰＭＮ層が有意な可視的な赤
血球細胞の汚染を示した場合、ＰＭＮを５−の脱イオン
水中に１５〜３０秒間再懸濁し、ＰＢＳにより迅速に５
０−に稀釈し、そして２５０！ｇにて５分間、室温で遠
心分離した。同じ細胞タイプのすべてのペレットを一緒
にし、調製物をＰＢＳにより５〇−に稀釈し、そして上
記のように細胞タイプに従って遠心分離した。細胞ペレ
ットを測定媒体（１０％の熱不活性化したウシ胎児血清
（Ｆ　ＣＳ）を含有するし一グルタミンを伴うＲＰＭＩ
　　１６４０（ＷｈｉｔｔａｋｅｒＭＡ　Ｂｉｏｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＯ）に懸濁
し、計数し、そして適当な濃度に稀釈した。細胞調製物
はまた、０．４％トリパンブルーの排除により生存につ
いて評価した。
Ｂ、　ＰＭＮ−ＡＤＣＣのためのエフェクター　己未梢
血の多形核白血球（ＰＭＮ）を健康な正常ヒト提供者か
ら得た。血液（１５０ｃｃ）を静脈穿刺によりヘパリン
処理されたチューブに吸い出し、そして等容量のリン酸
緩衝化塩溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中３％デキストランと混合
した。ＩＸｇにて１０分間の室温での沈降の後、白血球
に富む血漿をリンパ球分離媒体（ＬＳＭ、Ｏｒｇａｎｏ
ｎ　Ｔｅｃｈｎｉｃａ＋Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）の上に重
層した。ＰＭＮ及び赤血球（ＲＢ　Ｃ）ペレットをＲＢ
Ｃ溶解溶液（１００ａｆ（７）水中０．８００％−／Ｖ
ＮＨ４（Ｊ！　、　　０．１％Ｗ／Ｖ　ＫＨＣＯ３，３
７，０ｇｗ　ＥＤＴＡ四ナトリウム、ｐＨ７，３）によ
り処理してＰＭＮを精製した。室温にて約５分間インキ
ュベートした後、ＰＢＳにより容量を３倍に増加し、そ
して細胞を遠心分離により２回洗浄した。細胞をＲＰＭ
Ｉ−５％ＦＣ３に再懸濁した後、ＰＭＮを細胞毒性測定
において使用し、又は応答変性剤（ｒｅｓｐｏｎｓｅ　
ｍｏｄｉｆｉｅｒ）と共にインキュベートした。顕微鏡
による観察を伴う細胞化学的染色は、ＰＭＮが２０％以
上精製されたことを示した。さらに、この積法はＰＭＮ
の活性化をもたらさない。
モンキーでの研究のため、カニクイザル（Ｍ。
ファシクラリス（Ｍ、　　［ａ（ｉｃｕｌａｒｉｓ）　
　からの末梢血をＰＢＳにより１：４に稀釈し、そして
９５％ＬＳＭの上に重層した。次に、この調製物を１１
００Ｘにて２０分間室温にて遠心した。モンキーのＰＭ
ＮをヒトＰＭＮについて調載した方法に従って精製し、
そして細胞化学的染色及び顕微鏡による計数により決定
した場合８０％より高い均一性を有するＰＭＮを得た。
Ｃ０盗煎亘皿 この発明において使用される主標的細胞はＬＳ−１８０
！Ｉｔ胞であり、これは結腸の腺癌を有する患者に由来
する。やはり結腸腺癌由来のＬＳ−１７４、ＬｏＶｏ及
び５ＷＩ−２２２、並びに乳腺癌セルラインであるＭＤ
Ａ−ＭＢ−４８４もＰＭＮ−介社細胞毒性を評価するた
めに使用した。
標的細胞を付着培養物として、１０％血清（８％Ｓｅｒ
ｕｍ　Ｐｌｕｓ、Ｈａｚｅｌｔｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ。
及び２％新生牛血清、Ｍ、Ａ、Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ
。
Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、２ｍＭＬ−グルタ
ミン及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｍ、＾、Ｂｉｏ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ）が補充されたＩ？ＰＭ１１６４０培
地中に維持した。培養物は３７℃にて５％ＣＯ□を含む
空気の湿潤雰囲気中で増殖せしめた。
標的細胞培養物がコンフルエンシーに達した時、培地及
び浮遊細胞をデカントし、そして付着した細胞を１９ｍ
７のＰＢＳにより洗浄した。標的細胞をεＤＴ＾−機械
的力又はトリプシン処理のいずれかにより遊離せしめた
後、２５０！ｇにて５分間又は１５０！ｇにて１０分間
遠心分離した。細胞ペレットを取り出し、そしてＦｅ２
を含有しない測定媒体ｌ　ｒｒｌ中に稀釈し、そして細
胞を計数した。
Ｌ　Ｓ−１８０（Ｔ）はヌードマウス中で継代されたｔ
、５−１８０！［１胞である。Ｌ　Ｓ−１８０（Ｔ）を
得るため、Ｎ　ｕ　／　Ｎ　ｕマウスに、２００Ｉｊ１
のＲＰＭ１１６４０中トリプシンで中隔リプシンＳ−１
８０細胞２Ｘ１０ｈを皮下注射した。腫瘍が触知可能な
大きさに増殖した後（約７日）、これらを外科的に取り
出し、ステンレス線の篩を通して分離し、そして１５０
！ｇにて１０分間遠心した。次に細胞ペレ７）を洗浄し
、そして５％のＦｅ２を含有するＲＰＭＩ中に再懸濁し
、そしてレベル法に先立ってトリパンブルー排除細胞を
決定した。
Ｄ、跋東 抗−腺癌モノクローナル抗体ＮＲ−Ｃｏ−０４（Ｉｇｈ
：結腸癌の腫瘍関連グリコリピドに対して向けられたも
の）及びＮＲＣｏ　　０２　（ＩｇＧ＋：癌胎児性抗原
に対して向けられたもの）をこの発明における標準試薬
として使用した。ＮＲ−ＬＵｌ　０　（ＩｇＧｚｂ）は
総癌（ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ）モノクローナル抗体
である。
組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦはＣＯ８細胞トランスフェク
タント（Ｄ、Ｍｅｔｃａｌｆ等、Ｂｌｏｏｄ　　６７：
３７−４５．１９８６）から得られた。レチナル（Ｒｅ
ｔｉｎａｌ）、ホルボールミリステートアセテート（Ｐ
ＭＡ）及びＡ！３１８７はＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｃｏ、＋　セントルイス、ＭＯから得た。
Ｅ、ＮＫ　　−八ＤＣＣの　西　・　　　　　″　″パ
ＮＫ−ＡＤＣＣ細胞毒性測定のため、適当な数のＬ　Ｓ
　−１８０標的細胞を４００〜５００　ｐｌナトリウム
”　Ｃｒ（１ｍＣｉ／　ｍｌ　；　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ
ｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ＋ボストン、ＭＡ）により３７℃
にて２時間にわたり、１５〜３０分間ごとに穏やかに混
合しながらラベルした。ラベルされた細胞を１５−の測
定媒体で２回洗浄し、次に２５０Ｘｇにて５分間、室温
で洗浄した。最終ベレットを１０％のＦｅ２を含有する
測定媒体中に再懸濁し、計数し、そして２Ｘ１０’生存
細胞／−に稀釈した。
Ｎ　Ｋ−ＡＤＣＣのＩＬ−２増強の典型的な測定におい
て、５０ｍの適切な濃度のＩＬ−２をマイクロタイクー
プレートのウィルに添加した。但し、標的細胞からの５
ＩＣｒの全体の及び自然的放出の決定のために使用され
るべきウェルには添加しなかった。ＩＬ−２は典型的に
は１００ｖン′−又は１０　Ｕ／ｍｌの最終濃度で加え
た。ＩＬ−２を含有するウェルにはまた１００μｌの適
切な濃度のエフェクター細胞を加え、そしてプレートを
３７℃にて３時間インキュベートした。
自然的Ｓ　Ｉ　Ｃｒ放出の決定のために使用されるべき
ウェルには２００ハの測定媒体を加え、全５ＩＣｒ放出
の決定のために使用されるべきウェルには２００μ！の
２％ＮＰ−４０を加えた。ナチュラルキラー細胞対照ウ
ェルは、３つの異るエフェクター：標的（Ｅ　：　Ｔ）
比率（１００：　１．５０：　１．２５：　１）から成
り、これらを５０　ｐｉの測定媒体と共にインキュベー
トした。１００：１．５０：１及び２５：１のＥ：Ｔ比
率から成るＮＫ−ＡＤＣＣ−試験ウェルを、種々の濃度
に稀釈された抗体５０１１１と共にインキュベートした
。例えば、ＬＳ　１８０標的細胞のため、ネズミ　Ｉｇ
Ｇ、門Ａｂ　Ｎｉ２−ＧＯ−０４を５！！ｇ／ウェル又
はｌｎ／ウェルで加え、そして陽性対照とし、陰性対照
は５■／ウエル又は１μｇ／ウェルで添加されるＩｇＧ
＋　ＭＡｂ　ＮＲＣ０−０２であった。次に、すべての
ウェルに５０１１１の適切な濃度の５１Ｃｒ−ラベル化
標的細胞を加えた。このマイクロタイタープレートを６
０％ｇにて２時間、室温で遠心分離し、そしてプレート
を３７℃にて４時間インキュベートした。
４時間のインキュベーションの後、マイクロタイタープ
レートを２５０Ｘｇにて５分間、室温で遠心し、そして
１００Ｉの上清を各ウェルから別の１２×７５１１ガラ
ス管に移した。次に各チューブをＴ−カウンターを用い
て′″’Ｃｒの放出にアッセイした。
一般にすべての変数は三回又は四回試験した。
複数のチューブの平均を計算し、そしてＮＫ−ＡＤＣＣ
の量を次の式に従って決定した。
“最終溶解（％）”はナチュラルキサ−細胞（ＮＫ）対
照ウェルの溶解（％）値をＮ　Ｋ　−ＡＤＣＣ−試験ウ
ェルの溶解（％）値から減することにより算出した。標
的細胞の溶解の所定の％を得るために必要なエフェクタ
ー細胞の数を“溶解ユニット”と称した。この例におい
ては、溶解ユニットの計算のために標的細胞の１０％の
溶解が選択された。３つの異るＥＡＴ比を用いて溶解ユ
ニットを計算するため、３つの異るＥＡＴ比において対
応する溶解％値について半対数直線回帰を用いる。
直線回帰分析から得られる１０％溶解についての既知の
値から、溶解単位（１０％の溶解を得るのに必要なエフ
ェクター細胞の数）が計算される。
次に１０　Ｘ　１０６個のエフェクター細胞当りの溶解
ユニット数が示される。
Ｆ、ＰＭＮ−Ａ吐息ｑ踪１■側肚熔１１組む適切な数の
標的細胞を２００μＣｉ”Ｃｒ（５ＬＣｒ　−ＮａｚＣ
ｒＯｚ；　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｅｓ
ボストン、ＭＡ）により３７°Ｃにて２時間、１５〜３
０分間ごとに穏やかに混合しながらラベルした。ラベル
された細胞を１５ｉｔｆのＲＰＭＩにより３回洗浄し、
そして次に２５０Ｘｇにて５分間、室温で遠心分離した
。最終ベレットを５％ＳＣＳ含有ＲＰＭＩ中に再懸濁し
、計数し、そして適当な濃度に稀釈した。
典型的な測定において、エフェクターＰＭＮを異るエフ
ェクター二標的比で、マイクロタイタープレート（Ｆａ
ｔ：ｃｏｎ　Ｐｌａｃｔｉｃｓ、０ｘｎａｒｄ、ＣＡ）
のウェルに加えた。但し、標的細胞からの”Ｃｒの全放
出及び自然放出の決定のために使用されるべきウェルに
は加えなかった。ＧＭ−ＣＳＦ増強のため、ＰＭＮは一
般にマイクロタイタープレート内でリンホカインの添加
により処理された。エフェクター細胞は抗体及び標的細
胞の添加の前に洗浄するか、又はＡＤＣＣアッセイの間
リンホカインの応答にゆだねた。
ＮＲ−Ｃｏ−’０４抗体を１鱈／ウエル（４硝／＋ｕｆ
）の濃度で適切なウェルに添加し、そして次にマイクロ
タイタープレートを３７℃にて３時間インキュベートし
た。標的細胞（５０ｐｊのＲＰＭＩ−５％ＦＣ３中Ｉ　
Ｘ　１０’細胞）を適切なウェルに加え、そしてマイク
ロタイタープレートを６０Ｘｇにて２分間湿度で遠心し
、そして３７℃にて４時間インキュベートした。
自然Ｓ　Ｉ　Ｃｒ放出の決定のために使用されるウェル
に２００μ！のＲＰＭＩ−５％ＦＣ３中ラベルされた標
的細胞のみを加え、全”Ｃｒ放゛出の決定のために使用
されるウェルにラベルされた標的細胞及び２００μｌの
１．０％ＮＰ−４（）を加えた。
４時間のインキュベーションの後、マイクロタイタープ
レートを２５０Ｘｇにて５分間室温で遠心し、そして１
２５Ｊ１１の上清を各ウェルから別の１２Ｘ７５ｍｍガ
ラス管に移した。次に、各チューブをベックマン５００
０γカウンターを用いて５１Ｃｒ放出についてアッセイ
した。
Ｐ　Ｍ　Ｎ　−ＡＤＣＣ測定は例１．Ｅ、において前記
した方法に従って３回行った。溶解％（又は比放出％）
は標的細胞のＡＤＣＣのレベルを示すものである。試験
放出とはエフェクター細胞及び標的細胞を含むウェル中
の放出量を意味する。
適切なエフェクター細胞集団の生体内及び生体外活性化
のレベルを、２色フルオレッセンスサイトメトリーを用
いて決定することができる。エフェクター細胞表面上及
びエフェクター細胞内の分子は、エフェクター細胞を活
性化物質に暴露した後のＡＤＣＣ活性の増強のために重
要である。機能的に増強され得る抗原には、種々の細胞
タイプに対する細胞溶解過程及び付着過程に関与するＬ
ＦＡ（リンパ球機能関連抗原）、並びにＬＧＬ　、ＰＭ
Ｎ及び活性化されたＴ細胞の顆粒中に存在する蛋白質が
含まれる。後者のタイプの蛋白質の例にはサイトリシン
、パーフォリン並びに種々のプロテアーゼ及びエステラ
ーゼが含まれる。さらに、補体断片に結合する細胞表面
蛋白質は活性化物質への暴露の後に機能的に増強され得
る。活性化物質への生体内暴露に続くこれらの抗原の増
加した又は減少した細胞表面又は細胞内発現は、最適医
療効果を達成するためのＡＤＣＣ−有効抗体の注入のた
めの適切な時間を示すものである。活性化物質による処
置の前及び後での患者のエフェクター細胞上のこれらの
抗原の発現を比較して、ＡＤＣＣの有効性のための患者
のエフェクター細胞の活性化状態を決定することができ
る。
例えば、ＮＫ　（ＬＧＬ）エフェクター細胞のＩＬ−２
により誘導された活性化は、ＮＨ細胞上に存在する細胞
表面抗原に対するＴＩＴＣ−又はフォコエリスリンーラ
ベル化モノクローナル抗体を用いてモニターされる。要
約すれば、プラスチ、クー非付着単核細胞を、！Ｌ−２
療法の前及び後の腫瘍担持患者から得られた末梢血から
分離する。
非付着細胞を遠心分離により洗浄し、そしてｊｌ　４ｉ
ｊ液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋１％ヒトＩｇＧ）中に再懸
濁する。細胞を洗浄し、そしてＮＫ　（ＬＧＬ）に対し
て特異的な抗体、例えばＮＫＨ−１を加える。
４℃にて４５分間混合物をインキュベートした後、細胞
を遠心分離により洗浄し、そしてＦＩＴＣでラベルされ
たヤギ抗−マウスＦ（ａｂ’）ｚじ（１，ＡＭ”と命名
する）を加える。４℃にて３０分間インキュベートした
後、細胞を洗浄しそして正常マウスＩｇを添加してすべ
ての未結合ＦＩＴＣ−ＧＡＭをブロックする。次に、第
二のマーカー抗体であるフィコエリスリン−ラベル化Ｏ
Ｋ　Ｍ　−１（Ｃ：＋ｂリセプターに対して向けられた
モノクローナル抗体）を加え、そして４℃にて３０分間
インキュベートする。あるいは、フィコエリスリン−ラ
ベル化抗−’ｃｏ”　、抗−ＬＦＡ−１又は抗−ＬＦＡ
−３モノクロ一ナル抗体を用いてＮＫ細胞の活性化を評
価することができる。
単核細胞集団に向けられた前方及び９０°光散乱窓を有
するＥｐｉｃｓ　Ｃサイトメーター上でフローサイトメ
トリー分析を行う。赤−緑オーバーランプの補償が染色
されたサンプルを用いて達成される。バックグラウンド
フルオレッセンス強度のレベルを決定するために負対照
サンプルが分析される。ｊｉｌ−のフィコエリスリン−
ラベル化ＯＫＭ−１染色サンプルを移行せしめて赤蛍光
ゲートを陽性に染色された細胞上にセットする。次に、
ＯＫＭ−１フエコエリスリン陽性細胞上に向けられた緑
蛍光を集めて試験サンプルを分析する。細胞内マーカー
抗原の評価のため、細胞をリソレシチンで透過性にした
後抗体により染色する。
ＰＭＮエフェクター細胞のＧＭ−ＣＳＦ−により誘導さ
れた活性化は、ＰＭＮｌ［１胞上に存在する細胞表面抗
原に対して向けられたＦＩＴＣ−及びフィコエリスリン
−ラベル化モノクローナル抗体を用いて類似の方法によ
りモニターすることができる。
活性化されたＰＭＮを検出するための適切なモノクロー
ナル抗体は、顆粒球及び単球に関連する抗原を認識する
１、ｅｕ−Ｍｌである。
！１．サイトフルオロメトリー八Ｆ ＮＲ−Ｃｏ−０４及びＮＲ−Ｃｏ−０２モノクロ一ナル
抗体により認識される標的セルライン（ＬＳ　　１８０
　、ＬＳ　−１７４、ＬｏＶｏ、　ＳＷＩ　　２２２、
Ｍ　Ｄ　Ａ−４８４）上の抗原の密度を決定するために
サイトフルオロメトリー分析を用いた。標的細胞を４℃
にて４５分間、１．０％のＢＳＡ及び０．１％のＣｏｈ
ｎ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｕヒト免疫グロブリンを含有す
るＰＢＳ中に稀釈されたネズミモノクローナル抗体（ｌ
ＪＩｇ／＋ａＺ）の存在下でインキュベートした。遠心
分離による２回の洗浄の後、細胞をＦＩＴＣ−ラベル化
Ｆ（ａｂ’）ｚヤギ°抗−マウス抗体により４℃にて３
０分間ラベルした。細胞を洗浄し、そして未処理標的細
胞のフルオレッセン同等物（Ｐ、！、比）　、　ＦＩＴ
Ｃヤギ抗体＋標的細胞；及びネズミモノクローナル抗体
＋ＦＩＴＣヤギ抗体＋標的細胞を、Ｅｐｉｃｓ　Ｃサイ
トメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｒｐ、）上で、ラベ
ルされた細胞をフルオレッセインーラベル化ビープ（Ｃ
ｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｒｐ、）の標準調製物と比較するこ
とにより決定した。試験サンプルの蛍光強度を対照の蛍
光強度で除すことにより正味Ｆ、Ｅを決定した。
ＧＭ−Ｃ５Ｆを年令及び体重を一致させたＭ。
ファシクラリスモンキーに、５０ｎ／ｋｇの静脈内ポル
ス（ｂｏｌｕｓ）として１〜２分間にわたって投与し、
次に５０１１ｇ／ｋｇ／日の連続静脈内点滴注入を１０
日間行った。注射は内在カテーテルを通して拘束した動
物に投与した。細胞の計数（血液斑点及び染色）並びに
＾ＯＣＣ測定を、２０日間にわたる選択された日に採取
された１０ｍ１のヘパリン処理血液のサンプルに対して
行った。
Ｊ！Ｌ２ＬＮ　Ｋ　−ＡＤＣＣ’、の　　　７　　びＬ
ｈ襞 正常提供者のリンパ球を５０Ｕ／−のＩ　Ｌ　−２゜の
存在下又は非存在下で３時間インキュベートし、そして
次に５ＩＣｒ−ラベル化標的細胞に対する細胞毒性につ
いて試験した。第１図は、Ｉ’Ｌ−２の非存在下におい
てエフェクター細胞＋ネズミｊｇＧｚａＭＡｂ（非−Ａ
ＤＣＣ）が標的細胞を溶解しなかったことを示している
。殺細胞のレベルはエフェクター細胞のみによる殺細胞
と同じであった。ＩＬ−２の非存在下で、エフェクター
細胞＋ＩｇＧ：＋　ＭＡｂ（ＡＤＣＣ）は幾らかの膜種
的細胞を、特に高いＥＣＴ比において生じさせた。正常
提供者のリンパ球がＩＬ−２の存在下で活性化された時
、エフェクター細胞のみによる殺細胞及びＡＤＣＣ細胞
溶解（ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ）の両方が増強された。非−
抗体介在殺細胞の上昇したレベルを“活性化されたＮＫ
殺細胞”と称する。“ＮＫ”という表示は、最適な活性
化を達成するために“ＬＡＫ殺細胞”がＴＬ−２の一層
多い量へのエフェクター細胞の一層長時間の暴露を必要
とするという事実を反映している。ＩＬ−２へのエフェ
クター細胞の短時間の暴露がＮＫ−ＡＤＣＣ反応及び活
性化されたＮＫ細胞毒性反応の両者を増強するが、これ
らの実験条件下でのＡＤＣＣ毒性は標的細胞の活性化さ
れたＮＫ殺細胞より有意に大である。
ＮＫ−八〇ＣＣはまた、ＬＡＫ細胞の発生について典型
的な条件により誘導されたエフェクター細胞により処理
した（第２図）。正常提供者のリンパ球を１００　Ｕ　
／　ｍ７のＩＬ−２の存在下又は非存在下で６日間イン
キュベートした後に細胞毒性活性の測定を行った。ＩＬ
−２の非存在下で無視できるＮ　Ｋ　−ＡＤＣＣ及びＬ
ＡＫ殺細胞が観察された。ＴＬ−２の存在下で、ＡＤＣ
Ｃ−介在ＭＡｂの存在下又は非存在下でのエフェクター
細胞についての細胞毒性プロフィールは本質的に同じで
あった。これらのデーターは、細胞毒性測定へのＭＡｂ
の添加が追加の殺細胞効果をもたらさないことを示して
いる。すなわち、使用される条件がＬＡＬＩＩＩ胞の生
成のために最適であれば増強されたＮＫ−ＡＤＣＣ応答
は起こらない。従って、ＬＡＫ細胞療法を最適化するた
めに計画された現在のｂ−法的方法は最適なＮＫ−ＡＤ
ＣＣ応答のために患者のエフェクター細胞を増強するた
めに最適ではないであろう。
ＩＬ−２の力価測定が示すところによれば、Ｎ　Ｋ−Ａ
ＤＣＣの増強のために要求されるＩＬ−２の？店度はＮ
Ｋ殺細胞を活性化するため（第３図）、又はそれについ
ては、ＬＡＫ殺細胞を活性化するため（第２図）に要求
されるＩＬ−２の濃度よりも低い。０．１〜１．ＯＵ／
−の濃度のＩＬ−２へのエフェクター細胞の短時間（３
時間）の暴露が、ＮＫ殺細胞のかなりの補助を伴わない
でＡＤＣＣの有意な増強をもたらした。ＮＫ殺細胞の補
助のためにはより高濃度のＩ　Ｌ　−２（１０−５０Ｕ
／ｍｌ）が必要であった。これに対して、親細胞を１０
０〜１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２に３〜６日間暴露する
ことにより生体内でＬＡＫ細胞は最適に生ずる（Ｊ、Ｈ
，Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ及びＬル几ａｎｉａｒ、　２しエム
シル世−１６虹：８１４．１９８６）。
これらのデータが示すところによれば、ＮＫ−ＡＤＣＣ
生体内増強は、ＮＨの活性化又はＬＡＫ殺細胞の発生の
ために必要とされるのよりも低い投与量のＩＬ−２の投
与により達成され得る。
、±４１〜２□　　ＮＫ　　−ＡＤＣＣ，ｔ　　Ｆ電’
（７）　　−゛　　　！’）−ｉ、ｆｉ　　、９ｉ襞 サイトキサンにより］゛サプレッサー細胞の免疫抑制活
性を廃棄することによる、ＩＬ−２を用いる抗−腫瘍活
性を達成するために有用な臨床的方法を第４図に示す。
サイトキサン前処理がＬＡＫ細胞集団の一層の拡大を可
能にする。これらの増殖及び活性化はおそらくサプレッ
サー細胞により下方制御されないためである。”ＯＦＦ
”はＩＬ−２が投与されなかったことを示す。ＴＬ−２
療法に先立ち、患者のリンパ球は、ＩＬ−２により刺激
されていない正常提供者のリンパ球に比べて、１８Ｇ、
による同程度の又は低いＡ［ｌＣＣ殺細胞を示した。
第５図はＩＬ−２の注入後に観察された１人の患者のＮ
　Ｋ　−ＡＤＣＣの生体内増強を示す。第４図の方法に
従ってΦ者にＩＬ−２を与えた。リンパ球を患者から５
３日目、７８日目及び１４４４４日目り出し、そして単
独で又はＩｇＧ２ａ　ＭＡｂ（非−ＡＤＣＣ）もしくは
ＩｇＧ３ＭＡｂ（八〇ＣＣ）の存在下でＮ　Ｋ　−ＡＤ
ＣＣ活性を測定した。患者のリンパ球はＮＫ−ＡＤＣＣ
の顕著な増強を示し、ＩＬ−２投与の後の段階の間に最
大の増強を示した。しかしながら、１４４日までにＬＡ
Ｋ殺細胞のレベルの上昇が現われ、そして例２において
報告されるデーターのように、これらの生体内生成ＬＡ
Ｋ細胞は標的細胞のＮ　Ｋ　−ＡＤＣＣ殺細胞を中介し
なかった。このモニター結果に基けば、患者はＩＬ−２
注入の７８日目に近い期間において抗体投与から最も利
点を得た。１４４日までのＮ　Ｋ−ＡＤＣＣ増強の喪失
を回避するため、患者は低下したＩＬ−２のレベル又は
処置のための短縮された日数を得た。ＩＬ−２の連続注
入を受けた５人の追加の患者をＮＫ−ＡＤＣＣ活性につ
いてモニターした。すべてが患者自身の刺激されていな
いリンパ球又は正常提供者のリンパ球により達成される
ＮＫ−ＡＤＣＣのレベルより実質的に高いＮＫ−ＡＤＣ
Ｃの増強を示した。
例えば、達成され得る最大Ｎ　Ｋ　−ＡＤＣＣ応答は、
Ｉ　Ｌ−２療法を受けた患者からの８日目のサンプルに
ついて行われたのと同様にして決定することができる（
第６図）。この予測は、患者のすでに刺激されたリンパ
球の部分に外来ＩＬ−２を生体外で加え、そして添加さ
れたＩＬ−２の存在下又は非存在下でＮ　Ｋ　−ＡＤｃ
ｃ活性を比較することにより行われた。外来ＩＬ−２の
添加はＮ　Ｋ　−ＡＤＣＣ及び活性化されたＮＫ殺細胞
の両者を増加せしめ、８日間の処置過程にわたるＩＬ−
２の生体内注入が最大Ｎ　Ｋ　−／ＩＤｃｃ活性化をも
たらさなかったことが示された。このタイプのデーター
は、リンホカインの使用量を増加するか又は処置日数を
増加することによって患者のさらなる処置を調整して、
抗体の投与に先立ってＮ　Ｋ　−ＡＤＣＣ活性を一層増
強するために使用される。
これらの許容されるレベルの注入から得られるデーター
は、リンホカインの連続注入により最大Ｎ　Ｋ−ＡＩ）
ＣＣ応答が生体内で達成され得ることを示唆する。しか
しながら、生体内でのＮ　Ｋ　−ＡＤＣＣ応答の増強の
ために必要とされる循環ＩＬ−２のレベルは腫瘍標的細
胞の活性化されたＮＫ又はＬＡＫによる殺細胞のために
最適であるとは限らない。
事実、抗体に指令されない殺細胞の最適化のために要求
されるＩＬ−２の一層高い投与量は、前の処置において
達成されたＮ　Ｋ　−ＡＤＣＣ増強を廃棄するようであ
る。
開本　ＧＭ−ＣＳＦの　土　　は　　　　でのＰＭＮ−
ＡＤＣＣ 大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）によるＡＤＣＣの介在のため
のネズミＩｇＧ、モノクローナル抗体の卓越性が＾、Ｃ
，Ｍｏｒｇａｎ、−Ｊｒにより出願された係属中の米国
特許出１’９ＪＩＮａ０８０．３１９に開示されている
。この研究はネズミＩｇＧｚモノクローナル抗体がＰＭ
ＮによるＡＤＣＣの効果的な介在因子であるか否かを決
定するために行われた。
モノクローナル抗体ＮＲＣｏ　　０４　（ＩｇＧ：＋）
を標準的３時間５１Ｃｒ放出測定においてヒト末梢ＰＭ
Ｎ及びＬｓ−ｉａｏａ的細胞に加えた。第１図は、１０
０：１というエフェクタ一対標的の高い比率において、
ＮＲ−Ｃｏ−０４抗体のみはＰＭＮによるＡＤＣＣの貧
弱な介在因子であったことを示している。
第７図は、ＮＲ−Ｃｏ−０４抗体及びＬＳ−１８０標的
細胞の添加前１時間にわたるＰＭＮとＧＭ−ＣＳ　Ｆ　
（５００Ｕ　／ａｆ）との前インキュベーションがＰ　
Ｍ　Ｎ　　ＩｇＧ１　ＡＤＣＣの有意な増強をもたらし
たことをさらに示している。
ＩｇＧｘモノクローナル抗体により介在されるＰＭＮ−
ＡＤＣＣのＧＭ−Ｃ５Ｆ増強を第１表に量的に示す。
】」≦曳 ＧＭ−ＣＳＦによるＰＭＮ介在ＩｇＧ３−ＡＤＣＣの増
強細胞毒性 ＮＳＣ”　　　ＡＤＣＣＧＭ−Ｃ５Ｆ−ＡＤＣＣ”Ｎ＝
１５人の提供者 （１）抗体の非存在下でＰＭＮにより介在される非特異
的細胞性細胞毒性（ＮＳＣ） （２）ＮＲ−Ｃｏ−０４抗体及び５ＩＣｒ−ラベル化Ｌ
Ｓ−１８０標的細胞の添加の前に１００　Ｕ　／　ｍｔ
のＣ，Ｍ−ＣＳＦの存在下で１時間エフェクター細胞を
インキュベートした。
１５人の正常提供者から得られたＰＭＮを用い　−るＰ
ＭＮ介在１ｇｈ　ＡＤＣＣの分析が示すところによれば
、未刺激ＰＭＮによる平均ＡＤＣＣ値は５０：１のエフ
ェクター：標的比率において８．０％の比Ｍ出であった
。ＰＭＮを１００ｖ／ｍｌにおいてＧＭ−ＣＳＦと共に
１時間にわたり前インキュベートした場合、Ｐ　Ｍ　Ｎ
　　ｔｇｃ３ＡＤＣＣ活性は２６．９％の比放出の平均
値に上昇した。
ＰＭＮの他の可能性ある活性化物質を、ＩｇＧ、モノク
ローナル抗体と共にＰ　Ｍ　Ｎ−ＡＤＣＣを増強するそ
れらの能力について試験した。
玉叢表 ＰＭＮ介在ＡＤＣＣに対する種々の活性化物質の効果芽
じＬ表（続き） ＰＭＡ、　　３０分間　　　ＮＲ−ＣＯ−０４１８，８
±０．６（１）３時間ＡＤＣＣ測定のためにエフェクタ
ー細胞：標的細胞比は１００：１であった。
（２）　　ＬＳ−１８０標的細胞、及びＮＲ−ＣＯ−０
４、ＮＲ−Ｃｏ−０２又はＮＲ−ＬＵ−１８抗体のいず
れかを添加する前３０分間又は１８時間のいずれかにわ
たり種々の活性化物質によりＰＭＮを前処理した。
第２表が示すところによれば、可能性ある活性□化物質
、例えばγ−Ｉ　ＦＮ　、　ｆＭＬＰ、　ＰＭＡ又は　
゛ＰＭＡ十カルシウムイオノホーレ（ｃａｌｃｉｕｍｉ
ｏｎｏｐｈｅｒｅ）　Ａ２３１８７は、ＰＭＮ介在１ｇ
Ｇ、　Ａ［ｌＣＣの増強について、ＧＭ−ＣＳＦより効
果的でなかった。
予想されるように、単球コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ
）はＮＲ−ＣＯ−０４によるＰ　Ｍ　Ｎ　−ＡＤＣＣの
増強のために完全に無効であった。ＩｇＧ＋モノクロー
ナル抗体（ＮＲ−Ｃｏ−０２）及びＩｇＧｚｂモノクロ
ーナル抗体（ＮＲ−ＬＵ−１０５ＬＧＬ−ＡＤＣＣの増
強のために有効である）をＧＭ−ＣＳＦ−活性化Ｐ　Ｍ
　Ｎと共に試験した場合、ＰＭＮ−ＡＤＣＣの増強は見
られなかった。
ＧＭ−ＣＳＦ及びｒ−ＩＦＮとの３０分間の前インキュ
ベーションに加えて、ＰＭＮをさらにＧＭ−ＣＳＦ及び
Ｔ−ＩＦＮにより１８時間前処理した。増強されたＡＤ
ＣＣはγ−ＩＦＮ前インキュベーションを用いる場合に
比べてｃＭ−ｃｓＦ前インキュベーションを用いる場合
に高かった。しかしながら、１８時間の前インキュベー
ションの後のＰＭＮ活性化の喪失はγ−ＩＦＮ処理ＰＭ
Ｎの場合よりＧＭ−ＣＳＦ処理細胞の場合に大であり、
ｒ−ＩＦＮの保護効果が示唆された。
炭５．　　ＣＭ−ＣＳＦでｊげ１されたＰＭＮ−ＴＧ！
ＧＭ−ＣＳＦで増強されるＰＭＮ　　ＩｇＧ３＾ＤＣＣ
の抗原特異性を特徴付けるため、ＮＲ−ＣＯ−０４及び
ＮＲ−ＣＯ−０２抗体を、結腸由来及び乳房由来の両者
の癌セルラインの標的化について（ＧＭ−ＣＳＦ前イン
キユベーシヨンを伴って、又は伴わないで）試験した。
−Ｎ、Ｄ、　　１．３±０．７ ゴ冒り表（続き） （１）種々の５１Ｃ「−ラベル化標的細胞及びＩｇＧ、
又はＩｇＧ、抗体のいずれかの添加の前に３０分間ＰＭ
Ｎ−ｔ−ＧＭ−ＣＳＦと共に前インキュベートした。
（２）３時間ＡＤＣＣ測定のためにエフェクター細胞：
標的細胞比はｔｏｏ：ｔであった。
第３表は、ＧＭ−ＣＳＦ（７）みの存在下、１００　：
１のエフェクタ一対標的比において、ＮＲ−Ｃ０−０４
モノクロ一ナル抗体が実質的なＰＭＮ−ＡＤＣＣを介在
するが、ＮＲ−ＣＯ−０２はそうでないことを示す。増
強されたＰ　Ｍ　Ｎ　　ＩｇＧ＋　ＡＤＣＣが結腸由来
又は乳房由来のセルラインを用いて観察された。第３表
はさらに、Ｐ　Ｍ　Ｎ　　ｒｇｃ、　ＡＤＣＣが多くの
抗原陽性標的細胞に対して有効であることを示した。デ
ータはまた、抗体ラベル化の強度（Ｆ、Ｅ比）及び細胞
毒性％によって明らかにされるように、標的細胞上の抗
原と細胞毒性との間の良好な関連性を示唆する。
ヌードマウスＣＬ　Ｓ　−１８０（Ｔ）　）中に移植さ
れた抗原陽性細胞は生体外培養された同じ細胞（ＬＳ−
１８０）よりも低い抗原密度を示したが、Ｌ　Ｓ−１８
０（Ｔ）標的細胞は有意なレベルのＰＭＮ−八〇ＣＣに
対して感受性であった。しかしながら、低いがしかし有
意なレベルのＮＲＣｏ　　０４結合を有する１つのセル
ライン（ＬｏＶｏ）　ハＰ　Ｍ　Ｎ　−ＡＤＣＣに対し
て感受性でなかった。
」ン惧ＬＪミュ　ＰＭＮ−ＩＣｆｆ八ＯＣへに文・する
ＧＭ　　ＣＳＦＰＭＮ介在ＡＤＣＣの最適増強のために
必要なＧＭ−Ｃ５Ｆの濃度を決定するため、ＰＭＮをＧ
Ｍ−ＣＳＦの稀釈物（１００ＯＵ／−から始まる）と共
に１時間前インキュベートした。第８図はＮＲ−ＣＯ−
０４抗体によるＰ　Ｍ　Ｎ　−ＡＤＣＣの量依存性の増
強を示す。ＰＭＮ−ＡＤＣＣの有意な増強が０．０１０
７ｍ７という低いＧ　Ｍ　　ＣＳ　Ｆ　ｇｆ度において
観察され、そしてＩＯＵ／ｍ１より高いＧ　Ｍ　　ＣＳ
　Ｆ　ｔＨ度において最大５ＩＣｒ放出が得られた。い
ずれかの濃度でＧＭ−ＣＳＦと共に前インキュベートさ
れたＰＭＮがＮＲＣｏ　　０２　（ＩｇＧ＋）の存在下
又は抗体の非存在下のいずれかでｒｓ−１８０標的細胞
のＡＤＣＣを介在することに失敗した場合、増強はＩｇ
Ｇ＋　ＮＲＣｏ　　０４抗体の存在に厳密に依存した。
セ１１ユ　ＰＭＮ　　上ＡＤＣＣのＧＭ−ＣＳＦ　　＝
’、の仇皿ＡＤＣＣのためのＰＭＮのＣＭ−ＣＳＦ活性
化の動態を、５分間未満〜２時間にわたるリンホカイン
へのＰ　Ｍ　Ｎの暴露により試験した。第９図は、Ｐ　
Ｍ　Ｎ　　１ｇＧ３　ＡＤＣＣのＧＭ−ＣＳＦ増強が非
常に急速な現象であることを示す。暴露されたＰＭＮの
即座の洗浄及びこれに続く遠心分離がＡＤＣＣの最適に
近いレベルをもたらす。ＧＭ−ＣＳＦへのより長時間の
暴露（２時間）はＰＭＮ−ＡＤＣＣの増強の非−刺激レ
ベルに迫る低下をもたらした。
Ｋ５６２標的細胞に対する好中天然細胞毒性のプロティ
ンキナーゼＣ介在はＲ，Ｇａｖｉｏｌｉ等、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ。
１１ｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　１４８　：１
２９０−９４．１９８７により報告されている。ＰＭＮ
のＧＭ−ＣＳＦ活性化が同様の態様で機能するか否かを
決定するため、プロティンキナーゼＣ阻害物質及び活性
化物質の効果を試験した。第４表に示すように、プロテ
ィンＣ阻害剤であるレチナル（Ｒｅｔｉｎａｌ）がＰ　
Ｍ　Ｎ　−ＡＤＣＣのＧＭ−ＣＳＦ増強を量依存型で廃
棄した。
部Ｕし表 （１）ＰＭＮをレチナルの非存在下又は１〜１００　ｍ
のレチナルの存在下で３０分間インキュベートし、次に
ＧＭ−ＣＳＦを添加して又は添加しないで１５分間イン
キュベートした。次に、３時間ＡＤＣＣ測定のためにＮ
Ｒ−ＣＯ−０４抗体及びＬＳ−１８０標的細胞を添加し
た。
（２）ＰＭＮを上記の様に処理した。但し、ＰＭＡ及び
Ａ２３１８７をＮＲ−Ｇｏ−０４抗体及びＬＳ−１８０
標的細胞の直前に加えた。
ＧＭ−ＣＳＦによるＰＭＮの処理はレチナルによる阻害
を逆転することに失敗した。しかしながら、レチナルの
添加に先立つＰＭＡ、プロティンキナーゼＣ活性化物質
及びカルシウムイオノホーレＡ２３１８７の添加は増強
されたレベルにＰＭＮ−＾ＯＣＣを回復せしめた。ＧＭ
−ＣＳＦ刺激の非存在下で観察される低レベルのＰ　Ｍ
　Ｎ−ＡＤＣＣはレチナルにより量依存的にさらに抑制
された。
ＧＭ−ＣＳＦへのＰＭＮの生体内暴露はモンキーのＰＭ
Ｎ及び好酸球のロイコサイトシスを誘導する（Ｐ、Ｍａ
ｙｅｒ等、Ｂｌｏｏｄ　　７０：２０６−１３．１９８
７）。
先行する例はＰＭＮ−八〇ＣＣに対するＧＭ−Ｃ５Ｆの
強力な生体外効果を記載している。従って、モンキーに
ＧＭ−ＣＳＦを注入し、そしてＰＭＮ−ＡＤＣＣの生体
内増強について試験した。
Ｍ、ファシクラリス（Ｍ、ｆａｓｉｃｕｌａｒｉｓ）モ
ンキーにＧＭ−ＣＳＦを２週間にわたり注入した。種々
の時点で血液サンプルを採取し、リンパ球を計数し、そ
してＡＤＣＣ活性を測定した。第１０図は、注入の８日
後にＧＭ−Ｃ５Ｆが循環する全白血球（その多くが好中
球である）を有意に増加せしめたことを示している。Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ注入の８日後における成熟ＰＭＮのエフェク
ター機能の生体外分析が示すところによれば、Ｌ　Ｓ　
−１８０標的細胞に対するＮＲ−Ｃｏ−０４介在ＡＤＣ
Ｃ活性は、未処理の対照と比較した場合、ＧＭ−ＣＳＦ
で処理されたモンキーにおいて有意に増強されなかった
。
より長時間にわたるＧＭ−ＣＳＦの注入は循環する細胞
の数もＰＭＮ−ＡＤＣＣ活性も増加せしめなかった（デ
ーターは示されていない）。ＧＭ−ＣＳＦへのモンキー
ＰＭＮの短時間（１時間）の暴露が、ＬＳ−１８０標的
細胞に対するＡＤＣＣの存意なレベルをもたらす（デー
ターは示してない）ことを他の研究が示している。これ
らのデーターは、ＧＭ−ＣＳＦは有効な生体内コロニー
刺激因子として働くが、ＧＭ−ＣＳＦ単独は、試験条件
下では、ＡＤＣＣ生体内活性の貧弱な誘導物質である。
株化 末梢血から成熟ＰＭＮ冨化画分を得るために腫瘍担持、
患者に対してサイトホーレシス（Ｃｙ　ｔｏｐｈｏｒｅ
ｓ　ｉ　ｓ）を行う。要約すれば、ＰＭＮ冨化法は、沈
降剤であるとドロキシエチル澱粉との組み合わせにおい
て行われる標準的血液ホーレシス（ｐｈｏｒｅｓ　ｉｓ
）を含む。ホーレシス過程の直前１２〜１８時間にわた
り患者をプレドニソン（ｐｒｏｄｎｉｓｏｎｅ）により
前処理することができる。プレドニソンは骨髄から末梢
血への成ｙ！好中球の放出を誘導するステロイドである
。ＰＭＮは無菌条件下で、約３０Ｘ１０９細胞／サイト
ホーレシスの典型的な細胞回収量をもって集められる。
“活性化されたＰＭＮ”を生じさせるため、ＰＭＮを１
００Ｕ／ｍＺ（７）ＧＭ−ＣＳ　Ｆと共ニ１５〜３０分
間インキュベートする。あるいは、ＧＭ−ＣＳＦ及びｒ
−ＩＦＮの組み合わせを用いて患者のＰＭＮを一夜活性
化することができる。例えば、リンホカインの組み合わ
せを用いる場合、ＰＭＮを１００　Ｕ　／　ｎｄのＣＭ
−ＣＳＦ及び同時ニＡｏｃｃＴｌ１重量のＴ−ＩＦＮと
共にインキュベートし、又はＡＤＣＣ刺激量のγ−ＩＦ
Ｎと共にインキュベートしそして次に１００　Ｕ　／　
＋ｎｌのＧＭ−ＣＳＦと共に１５分間インキュベートす
ることができる。
０者のサイトホーレシスが完了した直後に、そして活性
化されたＰＭＮの再注入の前に、ネズミＩｇＧ３モノク
ローナル抗体ＮＲ−Ｃｏ−０４を患者に投与する。注入
されるＡＤＣＣ−有効モノクローナル抗体の崖は約１０
ｍｇ／７０ｋｇ〜約５００　ｍｇ　／　７０　ｋｇであ
る。理想的には、モノクローナル抗体の投与は活性化さ
れたＰＭＮの再注入の前２４〜７２時間に完了する。こ
の時点で、抗体の血清レベルが低下し、そして抗体の最
適レベルが腫瘍細胞に結合するであろう。次に、活性化
されたＰＭＮを、追加量のＧＭ−’ＣＳＦと共に１ｌｆ
ｆｌ瘍担持患者に再注入する。
以上、特定の具体例について記載したが本発明の範囲内
において種々の変更を行うことができょう。
【図面の簡単な説明】
第１図は、低投与１（７）ＩＬ−２（１〜ＩＯＵ／ｎｕ
）への正常な提供者のリンパ球の３時間にわたる暴露に
基づ＜　、ＡＤＣＣ及びＮＫ細胞溶解の生体外増強を示
す。標的細胞に対する種々のエフェクター細胞の割合で
のＣｒ−５１放出が示される。ネズミＩｇｃ、　ＭＡｂ
十エフェクターによる殺細胞のレベルハ、エフェクター
細胞のみによる殺細胞レベルと同じである。八ＤＣＣＭ
八すはネズミＩｇＧｉ（ＮＲ−Ｃｏ−０４）であり、そ
して標的細胞系は結腸癌ＬＳ−１８０である。 第２図は、抗体介在−又は非抗体介在殺細胞の試験の前
、正常なリンパ球が６日間の前暴露のために高い投与１
（１００〜１００（ＩＵ／ｍＺ）のＩ　Ｌ−２中にイン
キュベートされる場合（典型的にはＬＡＫ細胞方法）の
ＡＤＣＣ及びＬＡＫ殺細胞性を比較する。 第３図は、３時間の前暴露に伴う、ＡＤＣＣの増強及び
ＮＫ殺細胞の活性化のＩＬ−２投与量依存性を示す。試
験は、エフェクター二標的細胞が５０：１の比で行なわ
れた。 第４図は、ＩＬ−２及びサイトキサン（２００■／ｋｇ
）により患者を処置するための臨床方法を示す。 第５図は、生体外試験により示されるように、第４図の
方法に従って、ｒＬ−２の注入に基づいての１人の患者
のＡＤＣＣ応答の生体内増強を示す。 第６図は、ＩＬ−２療法の間、取り出される患者のリン
パ球に外来Ｉ　Ｌ−２を添加することによって得られる
最大のＡＤＣＣ応答を評価する。曲線の差は、ＡＤＣＣ
増強のレベルが追加のＩＬ−２投与により達成され得る
ことを示す。 第７図は、ｒｇｃ、　（◇−◇）　　；　ＧＭ−ＣＳ　
Ｆ（５００Ｕ／ｍｌ）と共にＰ　Ｍ　Ｈの１時間のブレ
インキュベーションに続＜ＩｇＧ、（■−ＩＩ）により
；■ｇ島（×−×）；又はＧＭ−ＣＳＦと共にＰＭＮの
１時間のブレインキュベーションにＹ、７　＜　ＩｇＧ
：＋　（ローロ）により介在されたＬＳ−１８０標的細
胞のＰＭＮ−八ＯＣＣを示す。 第８図は、Ｐ　Ｍ　Ｎ　−ＡＤＣＣ及び非特異的細胞毒
性に対するＧＭ−ＣＳＦの力価測定を示す。ＰＭＮは、
ＬＳ−１８０標的細胞に対する細胞毒性活性を測定する
前、種々の濃度のＣＭ−ＣＳＦにより１時間処理され（
点の棒）、ＡＤＣＣ活性を有するＮＲ−Ｃｏ−０２モノ
クロ一ナル抗体及びＰＭＮは、ＧＭ−ＣＳＦにより処理
され（密な斜線の棒）；又はＡＤＣＣ活性を有するＮＲ
−Ｃｏ−０４モノクロ一ナル抗体及びＰＭＮは、ＧＭ−
ＣＳＦにより処理された（目のあらい斜線の棒）。 第９図は、ＰＭＮのＧＭ−ＣＳＦ活性化の動態を示す。 対照のＰＭＮは、抗体及び標的細胞の添加の前、洗浄さ
れるか（濃い斜線の棒）又は洗浄されなかった（薄い斜
線の棒）。他方、ＰＭＮは、１００　Ｕ　／　＋ｎｌの
ＧＭ−ＣＳＦにより種々の時間処理され、そして抗体及
び標的細胞の添加の前、洗浄されるか（黒くぬりつぶさ
れた棒）又は洗浄されなかった（点の捧）。 第１０ａ図及び第１０ｂ図は、Ｍ、ファシキユラリＸ　
（Ｍ、ｆａｓｉｃｕｌａｒｉｓ）に対するＧＭ−ＣＳＦ
の生体内投与の効果を示す。サルを、ＧＭ−ＣＳＦの連
続した注入の後、１〜８日目に、血液細胞のプロフィー
ルについて評価した。（第１０ａ図）。Ｆｉｃｏｌｌに
より分離されたＰＭＮを、１及び８日目にＮＲ−Ｃｏ−
０４抗体及びＬ　Ｓ　−１８０標的細胞によりＡＤＣＣ
を仲介するための能力について評価した（第１０ｂ図）
。 図面の浄δ（内容（！：変更なし） ＩＬ−２力価　３時間インキュ　Ｅ：Ｔ：５０：１ペー
シヨン 線１の多項回帰　　　　　　　　ＦＩＧ、３（１，万丑
（Ｉｆ　ｌ　＋　（５，４１４Ｅ４０［１）　ｓＸ変動
−２，２［１２Ｅ−１（１０ 几−２スケジユール 〃＝週末 ＦＩＧ、７ １２：ｌ　　　Ｚｉ：ｌ　　　団：Ｉ　　　Ｉ［Ｘｌ：
１エフェクター：標的細胞比 ＧＭＣ５Ｆ　（ユニット／ｍＬ） インキュベーション時間（分） ＦＩＧ、１０Ａ ＦＩＧ、１０Ｂ モンキー 手続補正書く方式） 昭和６３年１１月ざ日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 昭和６３年特許願第１９０７３１号 ２、発明の名称 抗体依存性細胞性細胞毒性の測定方法 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　ネオルックス　コーボレイション４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号６、
補正の対象 （１）願書の「出願人の代表者」の欄 （２）委任状 （３）明細書 （４）図面 ７、補正の内容 （１）　（２）　　別紙の通り （３）明細書の浄書（内容に変更なし）（４）　　図面
の浄書（内容に変更なし）８、添附書類の目録 （１）訂正願書　　　　　１通 （２）　　委任状及び訳文　　　　　　　　　各１通（
３）浄書明細書　　　　　　　１通 （４）浄書図面　　　　　１通

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、腫瘍を有する患者における抗体依存性細胞性細胞毒
    性（ＡＤＣＣ）応答の最適生体内増強の時間を決定する
    ための生体外測定法であって、 患者からの基礎エフェクター細胞サンプルを用いてＡＤ
    ＣＣの基礎レベル及びＮＫ又はＬＡＫ細胞活性を決定し
    ； 前記基礎レベルを超えるＡＤＣＣの試験レベルを確立す
    るため前記患者に１又は複数のリンホカインを１回又は
    複数回投与したした後に所定の間隔において該患者から
    取り出されたエフェクター細胞の第一のアリコートを各
    間隔において測定し：前記基礎レベルより高いＮＫ細胞
    活性の変化を決定するためにエフェクター細胞の第二の
    アリコートを各間隔において測定し、これによって活性
    化されたＮＫ活性のレベルを確立し；そして、ＡＤＣＣ
    応答についてのエフェクター細胞の最適生体内増強の時
    間を決定する； 段階を含んで成る方法。 ２、前記基礎エフェクター細胞サンプルが一定の時間に
    わたって取り出された複数のサンプルを含んで成る、請
    求項１に記載の方法。 ３、ΛＤＣＣの基礎レベルを決定する前記段階が、基礎
    エフェクター細胞サンプル、抗体及び標的細胞を一緒に
    し；そして 標的細胞溶解測定によって細胞毒性を検出する；段階を
    含んで成る、請求項１又は２に記載の方法。 ４、エフェクター細胞の第一のアリコート及びそれに続
    くアリコートを測定するための段階が、エフェクター細
    胞のアリコートを抗体及び標的細胞と一緒にし；そして 標的細胞溶解測定により細胞毒性を検出する；段階を含
    んで成る、請求項１又は２に記載の方法。 ５、前記抗体がモノクローナル抗体である請求項３又は
    ４に記載の方法。 ６、前記抗体がネズミＩｇＧ＿３、ラットＩｇＧ＿２＿
    ｂ、キメラ（マウス／ヒト）ＩｇＧ＿１、キメラＩｇＧ
    ＿２、キメラＩｇＧ＿３、キメラＩｇＧ＿４、及びバイ
    −アーム結合をすることができるヘテロハイブリドモノ
    クローナル抗体から選択される、請求項３、４又は５に
    記載の方法。 ７、前記標的細胞溶解測定が＾５＾１クロム放出、＾１
    ＾１＾１インジューム放出、及びトリパンブルー排除か
    ら選択される、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方
    法。 ８、前記標的細胞が患者からの腫瘍細胞である、請求項
    ３又は４に記載の方法。 ９、前記標的細胞が、患者からの腫瘍細胞に抗原的に類
    似する培養された腫瘍細胞である、請求項３又は４に記
    載の方法。 １０、ＡＤＣＣの基礎レベルを決定する段階が、活性化
    されたエフェクター細胞と関連する細胞表面又は細胞内
    マーカーに対して特異性を有する第一又は第二のラベル
    された抗体と共に前記基礎エフェクター細胞サンプルを
    インキュベートし；そして２色蛍光サイトメトリーを用
    いてエフェクター細胞の活性化のレベルを測定する； ことを含んで成る、請求項１又は２に記載の方法。 １１、エフェクター細胞の第一のアリコート及びそれに
    続くアリコートを測定する段階が、 活性化されたエフェクター細胞と関連する細胞表面又は
    細胞内マーカーに対して特異性を有する第一の及び第二
    のラベルされた抗体と共にエフェクター細胞のアリコー
    トをインキュベートし；そして ２色蛍光サイトメトリーを用いてエフェクター細胞の活
    性化のレベルを測定する； 段階を含んで成る、請求項１又は２に記載の方法。 １２、前記抗体がＮＫＨ−１、ＯＫＭ−１、抗−ＬＦＡ
    −１、抗−ＣＤ−２、又は抗−ＬＦＡ−３である、請求
    項１０又は１１に記載の方法。 １３、前記リンホカイン又はリンホカインの組み合わせ
    がインターロイキン−２、インターロイキン−４、イン
    ターロイキン−６、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−Ｃ
    ＳＦ、及びインターロイキン−３から選択される、請求
    項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。 １４、前記リンホカインの組み合わせがインターロイキ
    ン−２及びインターロイキン−４である、請求項１３に
    記載の方法。 １５、前記リンホカインの組み合わせがインターロイキ
    ン−２及びインターロイキン−６である、請求項１３に
    記載の方法。 １６、前記エフェクター細胞がＬｅｕ−Ｍ＿１もしくは
    ＯＫＭ−１細胞表面マーカー又はＬＧＬフェノタイプに
    より特徴付けられる、請求項１〜１２のいずれか１項に
    記載の方法。 １７、最適活性化の時間を決定する段階が、外来リンホ
    カインを伴う又は伴わないＡＤＣＣの試験レベル及びＬ
    ＡＬ又はＮＫ活性の試験レベルを各時間間隔において比
    較することにより該試験レベル間の差異を決定し；そし
    て 外来リンホカイン又はリンホカインの組み合わせの添加
    によってＡＤＣＣのさらなる増強が生じない時間を決定
    する； 段階を含んで成る、請求項１に記載の方法。 １８、あらかじめ選択された差異が細胞溶解ユニットに
    より計算される、請求項１７に記載の方法。 １９、リンホカインの投与の前又はその間にサイトキサ
    ンが患者に投与されている、請求項１〜１８のいずれか
    １項に記載の方法。 ２０、前記サイトキサンがＩＬ−２投与の少なくとも２
    ４時間前に静脈内投与されている、請求項１９に記載の
    方法。 ２１、ＡＤＣＣ応答についてのエフェクター細胞の最適
    生体内活性化の時間を決定する段階の後所定の時間にわ
    たりエフェクター細胞の最適生体内活性化を維持するの
    に適当な量でリンホカインが注入されている、請求項１
    〜２０のいずれか１項に記載の方法。 ２２、モノクローナル抗体により介在される抗体依存性
    細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）療法における使用のための
    多形核白血球（ＰＭＮ）の生体外活性化方法であって、 適切な提供者から取り出された白血球含有サンプルから
    多形核白血球（ＰＭＮ）画分を分離し；そして 該ＰＭＮ画分をＡＤＣＣ刺激量の活性化物質と共にイン
    キュベートし、これによってモノクローナル抗体により
    介在されるＡＤＣＣ療法において使用するための活性化
    されたＰＭＮを生産する； 段階を含んで成る方法。 ２３、前記白血球含有サンプルが血液である、請求項２
    ２に記載の方法。 ２４、前記白血球含有サンプルが骨髄である、請求項２
    ２に記載の方法。 ２５、前記活性化物質がリンホカインである、請求項２
    ２、２３又は２４項に記載の方法。 ２６、前記活性化物質がプロテインキナーゼアクチベー
    ターである、請求項２２、２３又は２４項に記載の方法
    。 ２７、前記活性化物質がＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、γ
    −ＩＦＮ、ｆＭＬＰ及びＰＭＡから選択される、請求項
    ２２、２３又は２４項に記載の方法。 ２８、前記活性化物質が複数のリンホカインの組み合わ
    せ、複数のプロテインキナーゼアクチベーターの組み合
    わせ、又はリンホカイン類とプロテインキナーゼアクチ
    ベーター類との組み合わせである、請求項２２、２３又
    は２４項に記載の方法。 ２９、リンホカインの組み合わせがＧＭ−ＣＳＦ及びγ
    −ＩＦＮである、請求項２８に記載の方法。 ３０、活性化物質のＡＤＣＣ刺激量が約５０Ｕ／ｍｌ〜
    約１０００Ｕ／ｍｌである、請求項２２に記載の方法。 ３１、活性化物質のＡＤＣＣ刺激量が約１００Ｕ／ｍｌ
    〜約５００Ｕ／ｍｌである、請求項３０に記載の方法。 ３２、前記ＡＤＣＣ応答が、＾５＾１クロム放出、＾１
    ＾１＾１インジウム放出及びトリパンブルー排除から選
    択された標的細胞溶解測定を用いて測定される、請求項
    ２２〜３１のいずれか１項に記載の方法。 ３３、前記ＡＤＣＣ応答が、活性化されたエフェクター
    細胞と関連する細胞表面又は細胞内マーカーに対して特
    異性を有する第一の及び第二のラベルされた抗体との組
    み合わせにおいて２色蛍光サイトメトリーを用いて測定
    される、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の方法
    。 ３４、前記抗体がＬｅｕ−Ｍ１、ＯＫＭ−１、抗−ＬＦ
    Ａ−１、抗−ＣＤ−２又は抗−ＬＦＡ−３である、請求
    項３３に記載の方法。 ３５、インキュベーションの段階の後、活性化されたＰ
    ＭＮを患者の腫瘍に対して向けられたモノクローナル抗
    体のＡＤＣＣ有効量により感作し、これによって活性化
    されたＰＭＮ−モノクローナル抗体複合体を形成する段
    階をさらに含んで成る、請求項２２に記載の方法。 ３６、前記モノクローナル抗体がネズミＩｇＧ＿３、ラ
    ットＩｇＧ＿２＿ｂ、キメラ（マウス／ヒト）ＩｇＧ＿
    １、キメラＩｇＧ＿３、並びに標的細胞及び活性化され
    たＰＭＮエフェクター細胞の両者にバイ−アーム結合す
    ることができるヘテロハイブリドモノクローナル抗体か
    ら選択される、請求項３５に記載の方法。 ３７、前記モノクローナル抗体が抗−癌モノクローナル
    抗体である、請求項３５に記載の方法。 ３８、前記抗−癌モノクローナル抗体がＮＲ−ＣＯ−０
    ４である、請求項３７に記載の方法。 ３９、前記モノクローナル抗体が走化性物質と連結され
    ている、請求項３５に記載の方法。 ４０、前記走化性物質がｆＭＬＰである請求項３９に記
    載の方法。 ４１、モノクローナル抗体により介在される抗体依存性
    細胞毒性（ＡＤＣＣ）療法において使用するための多形
    核白血球（ＰＭＮ）の生体外活性化を増強する方法であ
    って、 患者におけるロイコサイトーシスを誘導するために、Ｐ
    ＭＮエフェクタ−細胞の生体内増殖のために十分な量で
    第一の活性化物質が注入された腫癌担持患者から取り出
    された白血球含有サンプルから、多形核白血球（ＰＭＰ
    ）画分を分離し；そして 該ＰＭＮ画分をＡＤＣＣ刺激量の第二の活性化物質と共
    にインキュベートし、こうしてモノクローナル抗体によ
    り介在されるＡＤＣＣ療法における使用のための活性化
    されたＰＭＮを生産する； 段階を含んで成る方法。 ４２、前記白血球含有サンプルが血液である、請求項４
    １に記載の方法。 ４３、前記白血球含有サンプルが骨髄である、請求項４
    １に記載の方法。 ４４、前記第一の又は第二の活性化物質がリンホカイン
    である、請求項４１、４２又は４３に記載の方法。 ４５、前記第一の又は第二の活性化物質がプロテインキ
    ナーゼアクチベーターである請求項４１、４２又は４３
    に記載の方法。 ４６、前記第一の又は第二の活性化物質がＧＭ−ＣＳＦ
    、Ｇ−ＣＳＦ、γ−ＩＦＮ、ｆＭＬＰ及びＰＭＡから選
    択される請求項４１、４２又は４３に記載の方法。 ４７、前記第一の又は第二の活性化因子が複数のリンホ
    カインの組み合わせ、複数のプロテインキナーゼアクチ
    ベーターの組み合わせ、又はリンホカイン類とプロテイ
    ンキナーゼアクチベーター類との組み合わせである、請
    求の範囲第４１項、第４２項又は第４３項に記載の方法
    。 ４８、リンホカインの組み合わせがＧＭ−ＣＳＦ及びγ
    −ＩＦＮである、請求項４７に記載の方法。 ４９、前記第二の活性化物質のＡＤＣＣ刺激量が約５０
    Ｕ／ｍｌ〜約１０００Ｕ／ｍｌである、請求項４１に記
    載の方法。 ５０、前記第二の活性化物質のＡＤＣＣ刺激量が約１０
    ０Ｕ／ｍｌ〜約５００Ｕ／ｍｌである、請求項４９に記
    載の方法。 ５１、前記ＡＤＣＣ応答が＾５＾１クロム放出＾１＾１
    ＾１インジウム放出及びトリパンブルー排除から選択さ
    れた標的細胞溶解測定を用いて測定される、請求項４１
    〜５０のいずれか１項に記載の方法。 ５２、前記ＡＤＣＣ応答が、活性化されたエフェクター
    細胞と関連する細胞表面又は細胞内マーカーに対して特
    異性を有する第一の及び第二のラベルされた抗体との組
    み合わせにおいて２色蛍光サイトメトリーを用いて測定
    される、請求項４１〜５０のいずれか１項に記載の方法
    。 ５３、前記抗体がＬｅｕ−Ｍ１、ＯＫＭ−１、抗−ＬＦ
    Ａ−１、抗−ＣＤ−２又は抗−ＬＦＡ−３である、請求
    項５２に記載の方法。 ５４、インキュベーション段階の後に、活性化されたＰ
    ＭＮエフェクター細胞から第二の活性化物質を除去する
    ことをさらに含んで成る、請求項４１に記載の方法。 ５５、インキュベーション段階の後に、患者の腫瘍に対
    して向けられたモノクローナル抗体のＡＤＣＣ有効量に
    より、活性化されたＰＭＮを感作することをさらに含ん
    で成る、請求項４１に記載の方法。 ５６、前記モノクローナル抗体がネズミＩｇＧ＿３、テ
    ットＩｇＧ＿２＿ｂ、キメラ（マウス／ヒト）ＩｇＧ＿
    １、キメラマウスＩｇＧ＿３、並びに標的細胞及び活性
    化されたＰＭＮエフェクター細胞の両者にバイ−アーム
    結合することができるヘテロハイブリドモノクローナル
    抗体から選択される、請求項５５に記載の方法。 ５７、前記モノクローナル抗体が抗−癌モノクローナル
    抗体である、請求項５５に記載の方法。 ５８、前記抗−癌モノクローナル抗体がＮＲ−ＣＯ−０
    ４である、請求項５７に記載の方法。 ５９、前記モノクローナル抗体が走化性物質に連結され
    ている、請求項５５に記載の方法。 ６０、前記走化性物質がｆＭＬＰである、請求項５９に
    記載の方法。 ６１、腫瘍を有する患者における生体内ＡＤＣＣ応答を
    増強するための、ＡＤＣＣのためのエフェクター細胞を
    刺激することができる１又は複数の活性化物質の有効量
    を含んで成る医薬。 ６２、前記活性化因子がリンホカインである、請求項６
    １に記載の医薬。 ６３、前記活性化物質がプロテインキナーゼアクチベー
    ターである、請求項６１に記載の医薬。 ６４、前記活性化物質がインターロイキン−２、インタ
    ーロイキン−４、インターロイキン６、ＧＭ−ＣＳＦ、
    Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、インターロイキン−３、γ−
    ＩＦＮ、ｆＭＬＰ及びＰＭＡから選択されたものである
    、請求項６１に記載の医薬。 ６５、前記活性化物質が複数のリンホカインの組み合わ
    せ、複数のプロテインキナーゼアクチベーターの組み合
    わせ、又はリンホカイン類とプロテインキナーゼアクチ
    ベーター類との組み合わせである、請求項６１に記載の
    医薬。 ６６、前記リンホカインの組み合わせがインターロイキ
    ン−２及びインターロイキン−４である、請求項６５に
    記載の医薬。 ６７、前記リンホカインの組み合わせがインターロイキ
    ン−２及びインターロイキン−６である、請求項第６５
    に記載の医薬。 ６８、前記リンホカインの組み合わせがＧＭ−ＣＳＦ及
    びγ−ＩＦＮである、請求項６５に記載の医薬。
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