JPH01304356A - リンパ球活性調節用抗体ヘテロコンジュゲート - Google Patents

リンパ球活性調節用抗体ヘテロコンジュゲート

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JPH01304356A
JPH01304356A JP1084148A JP8414889A JPH01304356A JP H01304356 A JPH01304356 A JP H01304356A JP 1084148 A JP1084148 A JP 1084148A JP 8414889 A JP8414889 A JP 8414889A JP H01304356 A JPH01304356 A JP H01304356A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈発明の技術分野〉 本発明は新規の抗体へテロコンジュゲー）ＦよびＴａ胞
とＢ細胞の様なリンパ球の活性調節におけるそれらの利
用に関する。特に本発明は各抗体がちがったリンパ球表
面抗原と反応性である互いに結合した少な（も２抗体よ
り成るヘテロコンジュゲートに関する。
これらのヘテロコンジユゲートはリンパ球に結合しそれ
らが反応しているそれぞれの細胞表面抗原を互いに物理
的に接近させる作用をしてリンパ球の形質導入及び増殖
の向上又は減少シグナルを生ずると思われる。本発明の
好ましい実施態様によればＴ細胞レセプターと反応性あ
る抗体又はその会合したＣＤ３複合体はＴ細胞の活性化
と機能促進のためＣ’　Ｄ　２、ＣＤ４、ＣＤ６又はＣ
Ｄ１３の様な第２のＴ細胞表面抗原と反応性をもつ抗体
に交差結合する。他の好ましい実施態様によればＣ’　
Ｉ）５　Ｔ細胞表面抗原と反応性をもつ抗体はリンパ球
活性化と機能促進のためＣＤ４、ＣＤ６又はＣＤ８の様
な第２１表面抗原と反応性をもつ抗体に交差結合する。
更に他の実施態様において、ＣＤ４５系統抗原と反応性
をもつ抗体はリンパ球活性化と機能を抑制するＣＤ２、
ＣＤ３、ＣｊＪ５又はＣＤ２Ｂの様な第２・Ｔ細胞表面
抗原と反応性をもつ抗体に交差結合する。また更に他の
実施態様に２けるＣＤ４抗原と反応性をもつ抗体はリン
パ球活性化と機能を促進するためＣＤ４５抗原と反応性
をもつ抗体と交差結合する。本発明の抗体ヘテロコンジ
ユゲート、方法、および組成物は伝染病、癌、エイズ８
よび自己免疫症の様な病気治療においてリンパ球を調節
して細胞免疫反応を改良するに有効である。
〈従来の技術及び発明が解決すべき課題〉この技術分野
に２いてＴ細胞ともいうＴ＋）ンバ球は少なくとも２の
明瞭方法で免疫反応を伝達すると知られている。
細胞毒性ＴＩＩＩＩｌ胞は特異的標的細胞の溶解に関与
するが、ヘルパーＴ細胞はＢ細胞の増殖と分化を助けて
抗原に特異的な抗体が生成される。〔例えはマツクミラ
ン出版社のへＷ、キムポール著　１ｎｔτｏｄ１Ｌｃｔ
ｉｏｎ　Ｔｏ　Ｊｔｎｍｕｎｏｌｏｇｙ。
２版１１−１３章参照］いづれの型のｒ１１１Ｂ胞も活
性化されてＴ細胞レセプター（ｒｊ）又はＴ細胞表面上
のその会合ＣＤ３複合体（ＣＤ３／ＩＥレセプタ一複合
体ともいう）と抗原存在細胞上の抗原との相互作用によ
ってその作用をする。〔例えばＥ、Ｌ、ラインヘルツら
のｌｍｍ５ｓｏ　ｌ　、Ｒｅ　ｖ　、。
８１．９５−１２９（１９８４）に記載の７人のＴリン
ノで上止のクロノティビックな表面構造：抗原レセプタ
複合体の官能的Ｂよび生化学的分析”参照〕 しかし抗原が抗原存在細胞上の特定なＮＥＣ（主組織適
合性複合体）をエンコードした抗原と会合したとぎにの
みＴ細胞は抗原に応答することが発見されている。した
かって抗原のＴ細胞認識は抗原と会合したＭＢＣをエン
コードした生成物クラスによって制限されるといわれて
いる。このＭＩｉＣ制限の結果、細胞毒性Ｔ細胞はクラ
ス（ＭＢＣ抗原と会合した抗原により活性化されまたヘ
ルパーＴ細胞はクラス■ＭＨＣ抗原と会合した抗原によ
り活性化される。
〔例えばＪ、Ｗ、キムボール著上記Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔ
ｉｏｎ　Ｔ。
１ｍｍ５％ｏｌｏ（Ｈ，２８６８９ページ、　３４８−
５８ページ参照〕 更にＣＤ　３　／　Ｔ　ｔレセプター複合体の他にクラ
ス■ＭＨＣで制限されたＴ細胞はＣＤ４とよばれる細胞
表面抗原を発現し、一方クラスｌ　ＭＢＣで制限された
Ｔ細胞はＣＤ８細胞表面抗原を発現する。ＭＢＣ制限と
ＣＤ抗原発現との間のこの関連はＴ細胞活性化において
制限されたＭＢＣ抗原はＣ”Ｄ抗原の自然リガンドであ
る、即ちヘルパーＴ細胞上のＣＤ４抗原は抗原存在細胞
（例えば大食細胞）上のクラス■ＭＨＣ分子と相互作用
しまた細胞毒性Ｔ細胞上のＣＤ８抗原は特異的標的細胞
（例えばビールス感染細胞）上のクラス）　ＭＢＣ分子
と相互作用するとの仮説に導かれてい＝１３− る。〔例えばＦ、エムリツヒらのＥｕｒＪ、Ｉｍｍｘｎ
ｏｌ、、（７゜５２９−３４（１９８７）記載の報文″
Ｔ細胞しセプター複合物とサブセットに特異的な分化抗
原との交差結合は人のＣ’　ＩＪ　４とＣ’　Ｄ　８　
Ｔ細胞中インターロイキン２レセプター発現を刺戟する
”参照〕またＴ細胞による抗原認識は第４級複合体によ
ってもできると提案されている、この場合Ｔ細胞表面上
のＣＤ３／Ｔｉレセプタ一複合体はＣＤ４又はＣＤ８の
様なＣＤ抗原と共同して適当なＭＢＣとした抗原と共同
している抗原を“見る”。〔例えばＰ、アンダーソンら
のハＩｍｍｗｓｏ１．．１３９（／Ｉ６３　）　：　６
７８−８２（１９８７）記載軸支″”Ｔ３（ＣＤ３）と
Ｔ４（ｃ’１）４）の交差結合による停止１１７７２球
増殖促進”参照３本出願に使用のＣＤ抗原はこれら抗原
の単一化命名法を制定する国際機関により定められたと
おり細胞表面上のモノクロナール抗体（ｔｎＡｂ　ａ　
）の反応性によってきめられる天然にある細胞表面の分
化抗原である。〔例えばＡ、Ｊ、マツクミカｊＪｌｚ著
Ｌｇ１４ｋｏｃｙｔｇ　Ｔｙｐｉｎｇ　Ｉｌｌ、（英国
オックスフォードのオックスフォード大学版、１９８７
）を参照〕多数のＣＤ抗原は分子的にクローン化されて
おりしたがって十分％徴づけられる。〔ｌｄ〕、よ（知
られたＣＤ抗原にはパンーＴ抗原、ＣＤ３、ＣＤ２、Ｃ
Ｄ５、ＣＤｆ３ｆ６よびＣＤ７、ヘルパーＴ細胞サブ集
団に特異的なＣＤ抗原、ｃ’　ｌ）４３よびサツブレツ
サーＴ細胞サブ集団に特異的なＣＩＪ）抗原、ＣＤ８が
ある。〔例えばＪ、Ａ　　レッドベラター球表面抗原３
２５−４０（１９８４）（米国組織適合性と免疫遺伝学
学会、ニューヨーク、１９８４）参照”ＪＣＢ２８は大
半のＴ細胞上にある抗原である。〔ヤマダらのＥ１！ｒ
、Ｊ、Ｉｍｔｎｓｎｏｌ、１５　、１１６４　１１６９
　（１９８５））これらの分化抗原は上記のとおりレセ
プターとして働らぎまたＴ細胞のシグナルな形質導入に
結び付いていると思われるが、これらのＴ細胞活性化の
実際の機能は知られていないので研究の大目標である。
例えばＴ細胞活性化におけるＣＤ抗原の役割決定研究が
分子レベルで行なわれている。ＣＤ３／Ｔｉレセプタ一
複合体とｔｎＡｂ又は抗原いづれかとの反応がＴ細胞内
のトランスメンプレイン“シグナル”を発生すると知ら
れている。
このシグナルはしばしばイノシトールホスフェート〔１
，２および３〕生成と細胞質的遊離カルシウム（〔Ｃα
”１（）濃度増加を特徴とする。〔例えばＪ、Ｂ、イム
ボーデンら１３２２−２４（１９８７）中の１人のＴ細
胞クローンによる抗原認識がイノシトールトリホスフェ
ートの増加となる”参照〕 このシグナル発生はしかしＴ細胞を刺戟し増殖させるに
は十分でないだろう。〔ｂ←　８７３において〕実験条
件のもとでＴ細胞表面上のＣＤ３抗原が例えば細胞を附
属細胞の存在で（例えば単球ＦＣレセプターとＣＤ３に
対する抗体のＦＣ部分との相互反応によって）又は固体
支持体上の抗体固定化によるいづれかによって交差結合
した抗体と反応させて交差結合させたとぎＴ細胞は増殖
する。
故に固体支持体に結合しているＣ　Ｄ　３　／　Ｔ　ｉ
レセプター複合体に対するｍＡｂａはＴ細胞を刺戟し１
部はＣＤ３抗原の又差結合によりまた１部はＣ’　Ｄ　
３　／　Ｔ　（レセプター複合体のインターナリゼーシ
ョンがＴ１１１Ｂ胞活性化を阻止し易いそのインターナ
リゼーション防止により〔例えばＪ、Ａ。
レドベツターらのＪ、Ｉｍｍｒｂｓｏｌ、、１３６．３
９４５　５２（１９８６）中の軸支″’ＣＤ３結合原子
価８よびＣＤ３細胞表面複合体のインターナリゼーショ
ンがＴ細胞の第２シグナルへの反応を調節する”参照〕
増殖さぜる。〔例えばＰ、アンダーメンらの上記軸支７
およびＣ，ウォーカーらのＥｓｒｊ、ｌｍｍ５ｎｏ１．
、１７　：　８７３−８０　（１９８７）中の雑文１抗
−ＣＤ３抗体と第２抗−Ｔ細胞抗体の交差結合によるＴ
細胞の活性化：機構およびサブセットに特異的な活性化
”参照〕しかし治療用途のＴ細胞の±乙ごず活性化には
固体支持体上に固定化された抗ＣＤ３使用は実質的に困
難である。この使用には固体支持体、普通小琢の患者へ
の注射があるが、これは動脈閉止又は閉塞の様な患者健
康上ある危険を伴なう。
更に生理学的条件のもとで、このＣＤ３抗原の交差結合
によるＣ　Ｄ　３　／　Ｔ　ｉ刺戟でさえもＣＤ　３　
／　Ｔ　ｉと他ｃｎ抗原間のＴ細胞表面上の相互作用に
よる増進が必要な最小シグナルだけを働かせることが提
案されている。〔Ｐ、アンダ−メンらの上記文献６７８
ページ参照〕。
史にＴ細胞活性化に２けるＣＤ仇原相互作用の実際効果
については不明確である。例えば自然のＣ’　Ｄ　４損
失変異体の分析Ｃ，／’、？ラックらのＪ、Ｅｚｐ、Ｍ
ａｄ、、　１５８　、１０７７−９１（１９８３）中の
雑文”Ｔ細胞上の大部分の組織適合性複合体に拘束され
た抗原レセプタ■、Ｌ３Ｔ４生成物の役割”参照〕並び
に遺伝子移動実験〔例えばり、ゲイらの７Ｖａｔｓｒｇ
、３２８：６２６−２９（１９８７）中の文献”人のＴ
−細胞蛋白質ＣＤ４ｊ６よび主組織適合性複合体ＨＬＡ
−ＤＲ抗原間の官抗原用互作用”参照〕はＣＤ４の発現
は％定抗原に対するＴ細胞反応を増進することを示唆し
また抗原濃度か適当以Ｆのとぎは又は抗原７ＭＥＣ−エ
ンコード抗原に対するＴ細胞の結合性が低いとぎはＣＤ
４は特にＸ要な役を演することを示唆している。ＣＡ、
レグニーヤービグローらのＥｓｒ、Ｊ、１ｍｍ５ｎｏ１
．．１６　：　１３８５−９０（１９８６）中の雑文“
附属分子８よびＴ細胞活性化Ｉ、抗原レセプター結合性
がＬＥＡ−１５６よびＬ３Ｔ４に対するモノクロナール
抗体による抑制に対するＴ細胞感度に差別的影響する、
”またＳ、シャクらのＪ、　Ｉ　ｍｍｓ％ｏｌ　、。
１３４（４５）：　３０１９−２６（１９８５）中の雑
文”細胞壽性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）クローンの抗−Ｔ３
および抗−１４（しかし抗−ＬＦＡ−１ではない）モノ
クロナール抗体による抑制に対する感受性はＣＴＬ−標
的相互作用の゛結合性”によって変る”参照〕更にＣＤ
３ｊ３よびＣ’　Ｉ）　４と反応性であるｍＡｂｓ　が
同じ固体支持体上に固定されたとぎは固定化された抗体
にさらされたＴ細胞増殖は促進された。同様にＣＤ３ｇ
よびこｌ）４に対するｍＡｂｓが固体支持体に結合した
ときｒＨＢ胞の増殖はＣＤ３単独に対する抗体への暴露
で認められたよジも促進された。［Ｐ。
アンタ゛−ソンらの上記雑文参照］ しかし可溶性ＣＤ４モノクロナ一ル抗体についての研究
は可溶性抗体がＴ細胞反応を阻むことを示しｃ、’　ｎ
　４がＴ細胞活性化を阻む負シグナルを送ることを示唆
している。
〔例えばＪ、Ｐ、バンクらのＪ、Ｅｚｐ、Ｍａｄ−リ５
３：１２９４（１９８５）；／Ｊ’、タイトら（ｒ）Ｈ
Ｊ、Ｃａ１ｌ、Ｍｏ１．Ｉｍｍｗｎｏｔ、。
２：１７９−９０（１９８６）中の０Ｔ細胞活性化にお
ける／、　３　Ｔ　４の役割：Ｌ３Ｔ４はＩａ−結合性
蛋白質および負シグナルをトランスジュースするレセプ
タの両方であってもよい”；およびＦＡ、ロンフらのシ
ジ（，４９，８４５−５３（１９８７）中の０マイトジ
エンと抗原で活性化されたシグナル形質導入に８けるＬ
３Ｔ４分子の役割”参照〕Ｂ細胞としても知られている
Ｂ＋）ンパ球は抗原生成性（形質）細胞の前駆体である
。Ｂ細胞が抗原によって刺戟されるとヘルパーＴ細胞と
大食細胞の協同作業を要しＢ細胞は増殖し形質細胞とメ
モリー（記憶）ＢｌｆｌｉＪ胞に分化する。
Ｂ細胞上に確認されているＣＤ抗原にはＣＤ１９、ＣＤ
２０、ＣＤｗ　４０、ＣＤ４５、（”１）４５Ｒおよび
ＢＱｐ９５（未だＣＤ命名をうけていない）がある。〔
マツクミカエ興味ある他のＣＤ抗原はＣｊＪ４５白血球
共通抗原（Ｌ−ＣＡ、Ｔ２Ｏ０又はＬｙ−５としても知
られている）である。
Ｃ“４５は造血直系の細胞に限られる分子量範囲（Ｍｒ
　）１８０乃至２２０Ｋｎαの主糖蛋白質料を包含する
。〔ドロウプリｇａｕｎｔイ６１１；　９　’　４２３
　４３３　（１９７９Ｌ　　ダルテヨ８５２（１９８０
）参照〕ＣＤ４５の明白なイソ型蛋白質（ｉｓｏｆｏｒ
ｍｓ　　）は別のｍ　ＲＡ’　Ａスプライシングから生
ずる。このイソ型蛋白質はＴと８１７７３球のサブ集団
上に区別して発現される。人ＣＤ４５抗原に対するいく
つかのモノクロナール抗体（ｒｒＩＡｂｓ　　）は全Ｃ
／）４５イソ型蛋白質によって分子量２２０．２０５．
１９０８よび１８０ＫＩＪαに分けられたエピトープを
認識する。〔コボルドらのページ〕。しかし他のｎ＞Ａ
ｈａはＢリンパ球８よびＴ細胞のザブ集団上に選択的に
発現されているＣＤ４５Ｒと命名された２　２０　ＫＤ
ａ　ＣＤ　４５のイソ型蛋白質のみを認識する。
〔上記コボルド文献；ダルチョーらのＪ、Ｅｚｐ、Ｍａ
ｄ、。
１５３ニア５３−７６５（１９８１）；モリモトらのＪ
。
ｌｍｍ５ｓｏ１．１３４：１５０８　１５１５（１９８
５）；およびレドベツターらのＪ、Ｉｍｒｎｕｎｏｌ　
、、１３５　：　１８１９−１．８２５（１９８５）］
他のｍＡｂｇ、ＵＣＨＬ−１は外皮胸腺細胞および活性
化又はメモリーＴ細胞部分集合に制限される１　８０　
Ｋｌ）　ａ棟に選択的に結合する。
最近ねずみ〔トマスらのＣ’ａ１１．４１　：　８３−
９３（１９８５）８よびバークレーらのＥＭＢＯＪ、６
：１２５９−１２６４（１９８７）］、マウス〔サガら
のＰｒｏｃ、ＩＶａｔ′１．Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　８３：６９４０−６９４４（１９８
６）；ＩＣ，ラシュケのＰｒｏｅ、Ｎａｔ’ｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８４：１６１−１６５（１９８７）
；ト？スらのＰｒｏｃ。
ＵＳＡ　　８４：５３６４−５３６８（１９８７））お
よび人〔ラルフらのＥＭＢＯＪ、５：　　１２５１−１
２５７（１９８７）ＦＪよびストロイリらのＪ、Ｅｚｐ
　Ｊｆｇｄ　、　１６６　：１５４８−１５６６（１９
８７）　〕ＣＤ４５（Ｌ−ＣＡ）の−次構造はｃＤ　Ｎ
Ａヌークレオナド配列から推論されている。ＣＤ４５は
太７０５−７０７アミノ酸原形質セグメント、２２アミ
ノ酸トランスメンズレインセグメント７および４００乃
至５５０アミノ酸範囲の細胞外領域と１体となったメン
プレイン蛋白質である。単一遺伝子の一次複写（トラン
スクリプト）のスプライシングで生じた別の１ｒＬＲＡ
’　Ａによって生成されているＣ’ＪＪ４５の種々のイ
ソ型蛋白質はちがった細胞外領域をもつが、同じトラン
スメンプレインが原形質セグメントをもつ。〔上記バー
クレーおよびラルフぢよびストロイリ文献〕原形質セグ
メントは約３００の残基をもつ相同の強く保護された２
領域をもつ。
ＣＤ４５の機能を解明しようとする研究は矛盾する結果
を生じている。〔上記コボルド文献〕人又はマウス抗原
に対するｍＡｂｓ　はＴとＢ細胞増殖、〔ハーブらのＪ
Ｉｍｔｎｗｎｏｔ、１３３：１０　１５（１９８４）；
バーナボイらのＥｕｒ、Ｊ、Ｉｍｔｎｓｎｏｌ、１７　
：　　１４６１　１４６６（１９８７）ｇよびミツトラ
−らのＪ、ｌｍｍ５ｎｏ　ｌ　、　１３８　：３１５９
−３１６６（１９８７）］、抗体生成性細胞生成、〔ヤ
クラのＪ、Ｅｚｐ、ｈｂｄＡ５７：１０７７　１０８８
（１９８３））８よびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞お
よび細胞毒性Ｔ細胞活性〔ジーマンらのＪ、ｌｍｍ５ｎ
ｏｌ　、１２７　：　９８２　９８６（１９８１）；Ｅ
ニューマンのＰ　ｒｏ　ｅ　、７ｖａ　ｔ’　ｌ　、Ａ
ｃａｄ　。
Ｓａｔ、ＵＳＡ　７９：３８５８−３８６２（１９８２
）　：ナカヤマらのＰｒｏｃ、Ｎａ白、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｔ、ＵＳＡ　　７６：１９７７−１９８１（１９７９）
およびレフランコイスらのＮａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏ
ｎ　）　３１４　：　４４９−４５２（１９８５））を
抑制すると報告されている。しかしある条件のもとで抗
−Ｃ７７４５ｒｎＡｂ　ｓもＴ細胞増殖を促進すると報
告されている。〔上記コポルド文献二上記しドベツター
文献忘よびマートレルらのＥｓｒＪ、ｌｍｍ５ｎｏＬ、
１７　：］］４４７−１４５１１９８７））上記リドマ
スは８０に１）αの分子の原形質部分はその保護された
２相同領域と共にＣＬ）４５０機能に重要な役割を演す
ると示唆している。最近この領域は人の胎盤の可溶性君
よび粒状部分両方から分離された主像分子量蛋白質チロ
シンホスファターゼに相同であると発見された。〔トン
クスらのＪ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｇｍ、、２６３　：　６
７２２−６７３０（１９８８）：Ｅよびテヤーボヌーら
のＰｒｏｃ。
（１９８８）］これはＣＤ４５か他の膜と結合した分子
との相互作用によって働らく脱で囲まれた蛋白質チロシ
ンホスファターゼであることを示唆している。
く課題を解決するための手段〉 本発明は上に議論された不明確な点を明らかにしＴ細胞
の様なリンパ球上に発現されたちがった表面抗原と反応
性をもつ互いに交差結合している少な（も２の抗体より
成る抗体ヘテロコンジユゲートを提供するものである。
これらのヘテロコンジュゲートのあるものはＴ細胞の活
性化に２いてＴ細胞中の七の（［’ｃＬ２＋〕、）増加
能力がＣＤ３抗原を 単独に対する抗体に２いて見られるよりも約２桁低い蛋
白質＃度において測定されたとおシグナル形質導入を促
進する。
寸だ本発明のヘテロコンジユゲートはリンパ球の活性化
と働らきを抑制しうるものを包含する。
本発明の好ましい実施態様によればＣＤ　３　／　Ｔ　
ｔレセプター複合物又はその成分部分と反応するモノク
ロナール抗体はｃ　ｎ　２、ＣＤ４、ＣＤ６又はＣＤ８
抗原の様なＴ細胞表面上の第２抗原と反応するモノクロ
ナール抗体と交差結合してＴ細胞の活性化に２けるシグ
ナル形質導入を促進するヘテロコンジュゲートを主成す
る。他の好ましい実施態様によればＣ’１）５Ｔ細胞表
面抗原と反応性をもつモノクロナール抗体はＣＤ４、Ｃ
’　Ｄ　６又はＣＤ８抗原の様なＴ細胞表面上の第２抗
原と反応するモノクロナール抗体に交差結合する。特に
好ましい実施態様はＣＤ４に対する抗体に交差結合した
ＣＤ３に対する抗体より成るヘテロコンジュゲートに関
する。
更に他の好ましい実施態様によればＣＤ４５Ｔ細胞表面
抗原と反応するモノクロナール抗体はＣＤ２、ＣＤ３、
ＣＤ５又はＣＤ２８の様なＴ細胞表面上の第２抗原と反
応するモノクロナール抗体に交差結合してリンパ球の活
性化と増殖を抑制するヘテロコンジュゲートを主成する
。特に好ましい実施態様はＣＤ４５抗原又はＣ’１）４
５のイソ型蛋白質と反応する抗体に交差結合している抗
体ＣＤ３より成ルヘテロコンジュゲートに関する。
本発明はまた細胞免疫応答生成におけるリンパ球活性化
の促進又は抑制のため本発明のヘテロコンジユゲートニ
よるリンパ球処理方法を包含する。したがって本発明の
ヘテロコンジュゲートはその少なくも１ｍの製薬有効量
と製薬上使用できるキャリヤーより成る医薬組成物に使
用できる。
故に本発明のヘテロコンジユゲート、方法忘よび組成物
は例えば伝染病、癌、エイズおよび自己免疫症の治療に
免疫応答を増進又は調節する免疫療法に使用できる。
ここに記載の本発明の十分な理解をえるため次の明細を
記述する。
本発明は新規の抗体ヘテロコンジユゲートおよびリンパ
球活性化および機能の促進と抑制に８けるその用途に関
する。特に本発明は互いに交差結合して２ｖまた各抗体
は異なるリンパ球細胞表面抗原と反応性がある少な（も
２抗体より成るヘテロコンジュゲートに関する。活性向
上のためコンジュゲートの１抗体はＴ細胞レセプター（
ＴＯ又はそれと会合したＣＤ３抗原抗原体と反応性であ
ジまた他の抗体はＣＤ抗原（例えばＣＤ２、ＣＤ４、Ｃ
Ｄ６又はＣＤ８）の様な第２１細胞表面抗原と反応性で
ある。またコンジュゲートの１抗体はＣＤ５抗原と反応
性でありまた他の抗体がＣ“Ｄ４、ＣＤ６又はＣＤ８の
様な第２１細胞表面抗原と反応性である。ヘテロコノシ
ュゲートＣＤ４／ＣＤ４５もＴ胴細活性促進に至る。抑
制にはヘテロコンジユゲートの１抗体が抗原のＣＤ４５
族（イソ型蛋白質）と反応性であ　　、ると好ましく、
また他の抗体はＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５又はＣＤ２８の
様なＴ細胞表面抗原と反応性である。
理論に拘束されることなく本発明のヘテロコンジユゲー
トはリンパ球と反応したとぎ細胞表面上のそれぞれの抗
原に結合しこれらの抗原を互いに接近させることにより
Ｔ細胞活性化中にヘルパーＴａ胞と抗原のある細胞の接
触の際Ｔ細胞レセプターとＣＤ　４間に２こる集団形成
に七つ（ジなステップを演すると信じられる。〔例えば
Ａ、タッパ−らのＰｒｏｃ、Ｎａｔ’Ｌ　Ａｃａｄ、Ｓ
ｅｔ、　ＵＳＡ　、　８４　：　５８８８−５８９２（
１９８７）中の”ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）分子とＴ細胞レセ
プターの集団形成はヘルパーＴ細胞と抗原のある細胞の
特異的直接相互作用によっておこる”参照〕細胞表面上
のＴ細胞抗原間の相互作用はＣＤ　３　／　Ｔ　ｉで仲
介されたトランスメンプレインシグナル発生を促進し、
したがってＴ細胞活性化を促進すると思われる。
ＣＤ４５抗原のリンパ球に対する影響の機構解明されて
いないが、本発明のＣＤ４５ヘテロコンジユゲートは他
のリンパ球レセプターと物理的に会合させたときそれら
を官能的に修飾する様働らき例えばＣＤ　３抗原の様な
あるＣＤレセプターの凝集後に抑制する。ＣＤ４５の原
形質領域と人の胎盤の主蛋白質チロシンホスファターゼ
間の最近記載された相同性は前者が実際に他の膜と会合
している分子上、例えばＣ’　Ｉ）　３のゼタ鎖上のキ
ーチロシル残基を脱りん酸化して白血球のシグナル（形
質）導入を変更する様働ろく膜に囲ゴれた蛋白質チロシ
ンホスファターゼであると示唆する。〔クラウスナーら
のＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈａｍ、２６２：１２６５４−１２
６５９（１９８７））ＣＤ４５はまた通常抗原によるシ
グナル（形質）導入を調節する様働らくＣＤ４と会合し
た蛋白質チロシンキナーゼ活性を修飾するだろう。〔ラ
ンドらのＰｒｏｃ、Ｎａｔ′１．Ａｃａｄ、ＳＣ４，Ｕ
ＳＡ　　　８５：５１９０−５１９４（１９８８））ま
たＣＤ４と会合したチロシンキナーゼはそのチロシル残
基上のＣＤ４５抗原をりん酸化しその活性を変える。こ
れは下記実施例に示すと−Ｂｔ）ＣＤ４とＣＤ４５レセ
プターの交差結合の結果としてえられた独特な向上活性
を説明できるだろ５゜このモデルは重要なチロシル残基
のジん酸化反応が先におこりまたそれがカルシウムの動
員に必要であることを予言するであろう。他の膜と結合
し℃いる蛋白質と接近してのみ働ら（完全膜状酵素は特
異的細胞表面分子に対する蛋白質チロシンキナーゼ／ホ
スファターゼ調節局限化に役立つ。故に本発明ヘテロコ
ンジユゲートはリンパ球の活性化と機能の促進又は抑制
に働ぎうると信じられる。
本発明によるＴ細胞調節、即ち抑制はパンーＴ細胞調節
又はＴ細胞の特殊サブセット又はクローンの調節でもよ
いのである。パンーＴ細胞調節はＴ細胞とＴ細胞の全プ
ール又は集合を調節するヘテロコンジュゲートとの接触
から生じる。このヘテロコンジュゲートは全Ｔリンパ上
止に発見されるＴ細胞抗原と反応する抗体より成る。こ
の様な１ヘテロコンシユケートは本発明のＣＤ３／ＣＤ
２ヘテロコンジユゲートであり、ＣＤ３とＣＤ２はパン
−Ｔｌ１９胞抗原である。〔例えばＪ、Ａ　　レドベツ
ターらの上記ＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓＩｔｎｔｎ％Ｌ
ｔＬｏ（Ｈｎｇｔｉｃａ　Ａｎｔｉ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍ
ｐαｔｉｂｔＨ１ｙ中の表１参照〕 しかし適当なヘテロコンジュゲート使用によってよジ特
異的な調節ができる。例えばヘルパー又はサブレツザー
サブセットの様なＴ細胞の特殊サブ集団のみを活性化し
たい場合にはこれは１抗体がその特殊Ｔ細胞サブ集団と
反応体である、即ち１抗体はそのサブ集団に特異性の抗
原と反応する必要のある、ヘテロコンジュゲートを構成
することによってできる。コンジュゲートの他の抗体は
パンーＴ細胞抗原に特定であると好ましい。この実施態
様によれば本発明のＣＤ３／ＣＤ４又はＣＤ３７ＣＤ４
ヘテロコンジユゲートは明確にいえばヘルパーＴ細胞活
性化を促進する（ＣＤ４はヘルパーＴａ胞ザブセットに
特異的である）が、ＣＤ３７ＣＤ８又はＣＤ５／Ｃ′Ｉ
）８ヘテロコンジユゲートは詳述すればサプレッサーす
Ｍ胞サブ集団の活性化を促進する。
（ＣＤ　８はサブレツザ〜Ｔ細胞ザブセットに特異的で
ある）また本発明のＣＤ３７ＣＤ４５ヘテロコンジユゲ
ートハ明確にいえばＣＤ４５抗原をもつＴ細胞活性化を
抑制する。
ＣＤ４５レセプターのイン型蛋白質Ｔ細胞の部分集合上
あられされるので、ＣＤ４５イソ型蛋白質と反応する抗
体をもつ本発明のヘテロコンジユゲートもこれらのＴ細
胞部分集合調節用に使用できる。
結局クロッチピック（ＣＯＯ％ｏｔｉｙｐｉｃ　）な調
節を即ち特定のＴ細胞クローンの調節を望む場合、本発
明のヘテロコンジユゲートは抗クロッチビック（Ｔ（）
抗体をその１成分としてもつ、即ち調節を求められたク
ローンのＴＨＥ胞レセプターの種々の領域と反応する抗
体をもつ。故にクロッチビックなＴ＃ｌ胞が特定の抗原
、例えばｍ瘍又はウィルス性抗原をうまく見えない又は
それに反応できない場合又はその応答に抑圧される場合
このＴ細胞に特異性の抗−クロノテビック抗体（Ｔ　ｉ
　／ＣＤ　４、Ｔ　ｉ　／ＣＪ）　８、Ｔイ／ＣＤ　６
、Ｔ　ｉ　／ＣＤ　２　）より成る本発明のヘテロコン
ジユゲートはこれらのＴ細胞クローン調節に使用できる
。またＴ細胞の特定クローン抑制のためＴｉ／ＣＤ４５
（又はＴｔ　／ＣＤ　４５イソ型蛋白質）より成るヘテ
ロコンジュゲートが使用できる。
本実施態様によりヘテロコンジュゲートのＴ（成分は特
定のＴ細胞の調節に本質的に抗原の代りをすると見るこ
とができる。ヘテロコンジュゲートの他の抗体はパン〜
Ｔ細胞に特異性な又はサブセットに特異性な抗体又はＣ
Ｄ４５又はＣＤ４５イソ型蛋白質と反応する抗体でもよ
い。
この様に本発明のヘテロコンジユゲートを成す抗体はリ
ンパ球表面抗原と反応するどんな抗体も包含する。好ま
しい実施態様によればコンジュゲートの１抗体はＴ（又
はＣＤ３Ｔ細胞抗原と反応性である。更に他の実施態様
によればＣＤ３Ｔａ胞表面抗原と反応する抗体はＴ細胞
表面上のｃｎ４抗原と反応性の抗体に交差結合する。
本発明のヘテロコンジユゲートを成す他の抗体には他の
ＣＤ抗原、例えばリンパ球上のＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ６
、Ｃ’　Ｄ　７、ＣＤ８、ＣＤ２Ｂと反応性の抗体があ
るが、これらに限定するものではない。〔例えばＡ、パ
ーナートら著フエヤラーグ、１９８４）；ｇよびＪ、Ａ
、レドベツターらい実施態様によればＣＤ５．Ｔ細胞表
面抗原と反応する抗体はＣＤ４、ＣＤ５又はＣＤ８抗原
と反応性の抗体と交差結合して本発明のヘテロコンジユ
ゲートを生成する。更に他の好ましい実施態様はリンパ
球細胞表面上のＣＤ４５抗原又はＣＤ４５イン型蛋白質
と反応する抗体に交差結合しているＣＤ３　Ｔ細胞表面
抗原と反応性の抗体である。
本発明のヘテロコンジユゲートを成す抗体はポリクロナ
ール性又は好ましくはモノクロナール性であり、抗体の
活性結合領域をもつ完全な抗体分子又はフラグメント、
例えばＦａｂ又はＦ（ａｈ’）２　　であり、かつこの
分野において確立された技術によって製造できる。〔例
えば下記実施例１−３にあげられた抗ＣＤ３、抗Ｃ’　
Ｄ　４、抗ＣＤ５および抗ＣＤ２モノクロナール抗体製
造文献参照〕更にＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ５
抗原の様なＣＤ抗原の多（に対するモノクロナール抗体
は市販されている、（カリフォルニヤ州マウンテンビウ
、ベクトンデイツキンソン）又は国際白血球型検査所か
ら入手できる。モノクロナール抗体を使うならば抗体は
はつかねずみ又は人のもの又はキメラの抗体でもよい。
〔例えばｐ’、Ｔ、オイのＢｉｏｔａｃｈｎｔ♂ｔｇｓ
。
４（、％３）：２１４−２２１（１９８６）中の１キメ
ラ抗体”参照〕更に本発明はまたパイスペシフィック（
ｂｉａｐａｃｉ−ｆｔｃ）又は組換えモノクロナール抗
体をも包含し、その抗体の第」の特異性は第１Ｔ細胞抗
原と反応性でありまた第２の特異性は第２のＴ細胞抗原
に向けられる。このパイスペシフィック抗体は米国特許
第４，４７４．８９３号に記載のとＪ５カドロマ（ｑｘ
ａｄｒｏｍａ　）又はトリオ−ｑ（ｔｒｉｏｒｎａ）細
胞から製造でき又は化学的に製造できる。〔プレンナン
らの５ｃｉｅｎｃｅ：２２９：８１８３（１９８５））
本発明のヘテロコンジユゲートを成す抗体はへテロパイ
ファンクショナル交差結合剤、ＧＭＢＳ（マレイミドブ
チルオキシザクシュミド）又は５ＰＤＰ（Ｎ−サクシニ
ミジル　３〜（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）
使用の様なこの分野で知られた方法に町って互いに共有
結合的に結合できる。〔例えば共有原子価抗体カップリ
ング法論のだｐｐ、３１．４−３１．１２０Ｒ，Ｒ，ハ
ープイーの“流動血球計算法に使用のための螢光性蛋白
質の精製とカップリング参照〕 したがって本発明は同一リンパ球上の異なるリンパ球抗
原と反応する少なくも２分子より成るどんなヘテロコン
ジユゲートも包含し、そのヘテロコンジュゲートはリン
パ球の活性化と機能の促進と抑制に働ら（のである。本
発明はＴ細胞並びにＢ細胞上の抗原とも反応性をもつヘ
テロコンジュゲートを対象としている。
抗体の他に本発明のヘテロコンジユゲートはリンパ球レ
セプターに結合しつるリガンドをもっていてもよい。例
えばＣＩＪ）４レセプターはリガンドｇｐ１２０（人の
免疫不全ウィルス又は”ＨＩＶ”の糖蛋白質レセプター
）と反応性があると示されている。〔リンスレーらのＪ
７ｉｒｏｌｏｇＷ６２：３６９５−３７０２（１９８８
）］故にリガンドｇｐ１２０に交差結合した抗Ｃｌ）　
３抗体より成るヘテロコンジュゲートはＣＤ３＠３よび
ＣＤ４レセプターとの交差結合によってＴ細胞活性向上
に使われるだろう。ちがったＴ−Ａ］− 細胞レセプターと反応するリガンドに交差結合している
Ｔ細胞レセプターと反応性のあるリガンドより成る他の
りガントコンジュゲートも考えられる。
本発明のヘテロコンジユゲートおよびこれらのＴ細胞活
性化における使用法はＴ細胞表面上のＣＤ３抗原と反応
する抗体がＣＤ４抗原と反応する抗体と会合して本発明
の新規ＣＩＪ）３／ＣＤ４ヘテロコンジユゲートを生成
する好ましい実施態様によって例証される。このヘテロ
フンシュゲートによるＣＤ４　　Ｔ細胞処理はＣＤ３の
みに対する抗体による細胞処理と比較して細胞間〔Ｃα
２町動員の著しい増加とイノシトールホスフェート１．
２、および３生成の実質的増加で示されるとおりＴ細胞
のヘルパーサブセット、にぢけるシグナル形質導入の増
加となった。ＣＤ３７ＣＤ４ヘテロコンジユゲートのこ
のシグナル増加性活性はｃ′Ｄ３／ＣＤ３−１６よびＣ
Ｄ４／ＣＤ４ホモコンジユゲート又はそれらの混合物が
この増加した活性を示さないので単にオリゴマー化によ
るものではなかった。また抗ＣＤ３と抗ＣＤ４抗体混合
物がこの活性を増すよりもむしろ減少することはこの技
術分野で従来かられかっている。〔例えば上記Ｐ、Ｍ、
ロゾフらの文献〕更にヘテロコンジュゲートによって示
された増加した活性はＣＤ４に対する可溶性モノクロナ
ール抗体によるＴ細胞子処理によって抑制された。
またＣＤ３／ＣＤ４ヘテロコンジユゲートはＴ細胞活性
化に新規の官能的活性をあられした。即ちヘテロコンジ
ュゲートはＣＤ２Ｂと反応性のあるモノクロナール抗体
存在のもとで（、’Ｄ４＋Ｔ＃ｌ胞の増殖をおこしまた
］、０Ｏｓｙ／ｍの様な低濃度でさえＣＤ２８刺戟によ
って十分共マイトジェン的（ｏｏｍｉｔｏｇｇｎｉｃ　
　）であった。この様な共マイトジェン性はＣＤ３に対
する抗体単独又はＣＤ３／ＣＤ３又はＣＬ）　４　／　
Ｃ’　Ｉ）　４ホモコンジユゲートを使用して発見され
なかった。更に本発明のＣＤ３／ＣＤ４ヘテロコンシユ
／７’−トはＣＤ２８モノクロナ一ル抗体との組合せで
Ｔ細胞を細胞サイクルをとおし著しくドライブでき、刺
戟の初め３日以内に細胞の大部分を第２サイクルに入れ
ることが発見された。
反対にＣＤ３に対する抗体単独又はＣＤ３７ＣＤ３又は
ＣＤ４／ＣＤ４ホモコンジュゲートは著しい細胞サイク
ル変換をおこさなかった。
更にＣＤ３／ＣＤ４ヘテロコンジユゲートはＴ細胞表面
上ＣＤ３とＣＤ４両抗原のモジュレーションを２こしＣ
Ｄ４の表面発現の減少となることが発見された。この結
果はＣＤ３に対する固定化抗体を用いた場合であると従
来示されたと２クヘテロコンジユゲートがＴ細胞レセプ
ターをＴ細胞表面に簡単に固定しないことを示している
。〔例えばＪ、Ａ、　　レドベツターらのＪ、Ｉｍｍ％
ｎｏｌ−＋上記参照〕ＣＤ３／ＣＤ、ヘテロコンジユゲ
ートによって見られた結果はＴ細胞表面上のＣＤ４抗原
がＣ’　Ｄ　３　／　Ｔｔ　　レセプタ十 一複合物とＣＤ４抗原間の物理的相互作用によ、！１ｌ
ｌＣＤ４　　ヘルパーＴ細胞のＴ細胞活性化中シグナル
形質導入に活動的ポシチブな役割を演することを示して
いる。
シングル形質導入を増すＣＤ３／ＣＤ４ヘテロコンジユ
ゲートの能力の基礎をなす分子機構はよ（諒解されてい
ない。
ＣＤ４のＣＤ　３　／　Ｔｔ　　との相互作用の少なく
も１効果はイノシトールホスフェート生成促進にあると
思われＣＤ４が膜ホスフオイノシチドのＣＤ３／Ｔｉ　
によっておこる加水分解を促進しイノシトールトリホス
フェート生成となることを示唆している。これは出願人
らの実験結果によるものであって、イノシトールホスフ
ェートにより生ずるＣＩＪ）３／ＣＤ４ヘテロコンジユ
ゲートの活性は細胞と可溶性ＣＤ４モノクロナール抗原
との反応によって抑制されることを示している。この抑
制はＣＤ　３　／　Ｔ　ｉのみが効力の小さいシグナル
トランスジューサー（ｔｒα％ｚｄｓｃａｒ）であるな
らば、ＣＤ４とＣＤ　３　／　１’　ｉの抗体により生
じた解離の結果であろう。またＣＤ４とその抗体の独立
した相互作用はイノシトールホスフェート生成を抑制す
るマイナス信号を伝達する。
イノシトールトリホスフェート（ｌａｄ’、）の生成が
Ｔ細胞中の原形質カルシウムの動員を仲介すると信じら
れるので、ＣＤ４とＣＤ　３　／　Ｔ　ｔの相互作用も
細胞間蓄積からのカルシウム放出を促進すると思われる
。〔Ｃα２＋〕動員におけるＣＤ３／ＣＤ４ヘテロコン
ジユゲート対ＣＤ３に対する抗体の薬量一応答曲線比較
はＣＤ４とＣ’　Ｄ　３　／　Ｔｔ　が接近して、即ち
ＣＤ３／ＣＤ４ヘテロコンジユゲート使用によって刺戟
されたとき、ＣＤ３／Ｔｉが単独で刺戟されたとぎ（図
３参照）よりも検出できる（Ｃ，２−１−１、応答はＴ
細胞上のずっと少ないレセプターの相互作用からえられ
るこ４６一 とを示している。故に本発明のＣＤ３／ＣＤ４ヘテロコ
ンジユゲートの１性質はレセプター低占有度に２けるそ
のＴ細胞活性化能力である。
イノシトールホスフェート生成とカルシウム動員はＴ細
胞活性化に伴なう信号でありＴ細胞増殖に導くから本明
細書に示した結果は作用機構に関係なく本発明のＣＤ３
／ＣＤ４ヘテロコンジユゲートがＴ細胞活性化と増殖促
進に有効であることを明確に示している。
本発明はまたＣＤ３／ＣＤ４ヘテロコンジユゲート同４
１Ｔ細胞活性化におけるよい信号発生能力をあられす他
のヘテロコンジユゲートも包含する。例えば本発明のＣ
Ｄ３７ＣＤ２ヘテロコンジユゲート、ＣＤ３／ＣＤ６ヘ
テロコンジユゲート、ＣＤ３／ＣＤ７ヘテロコンジユゲ
ート７およびＣＤ３／ＣＤ８ヘテロコンジユゲートもカ
ルシウム動員に強い活性をあられす。更に本発明により
多数の抗ＣＤ５をもつヘテロコンシュ’７’−）Ｃ例ｔ
ばＣＤ５／ＣＤ４ヘテロコンジユゲート、Ｃ，Ｄ５／Ｃ
Ｄ６５／ＣＤ６ヘテロコンジユゲート５／ＣＤ８ヘテロ
コンジユゲート）も構成されまたＴ細胞中の〔Ｃａ２＋
〕動員に強い活性をあられした。
ＣＤ４５抗原又はそのイソ型蛋白質と反応する抗体をも
っておＪ　リンパ球球性性化機能の抑制又はＴ細胞活性
化と機能の促進に有用である本発明のヘテロコンジユゲ
ートはＣＤ３抗原と反応性のある抗体がｃｎ４５抗原と
反応性ある抗体と会合して本発明の新規ヘテロコンジユ
ゲートを生成する好ましい実施態様によって例示される
。このヘテロコンジュゲートによるＴ細胞処理は細胞内
カルシウム動員の著しい減少によって示されるとお９Ｔ
細胞のＣＤ３で仲介された活性化中止（トランスメンプ
レイン信号）となった。
１ｆ、ニーＣＤ３、ＣＤ２、ＣＤ５又はＣＤ２８の様な
Ｔａ胞の表面上の種々のＣＤレセプターとＣＤ４５レセ
プタ一間の相互作用誘導はモノクロナール抗体を使って
なされリンパ球上のｃｎ４５レセプターを同一リンパ球
上の他のＣＤレセプターと交差結合させた。この交差結
合は細胞表面上の共通レセプターの交差結合により生じ
たＴ細胞抗原のホモ凝集体生成からおこる原形質遊離カ
ルシウム濃度（［’ａ”］、）増加をな（した。固定化
された抗ＣＤ３モノクロナール抗体刺戟によりはじまっ
たＴ細胞増殖は同一表面上で固定化されたとき抗ＣＤ４
５抗体又は抗ＣＤ４５Ｒ抗体によって抑制されたが溶液
中ではそうでなかった。
同様にＣＤ２とＣＤ２Ｂレセプターのそれぞれ抗−ＣＤ
２と抗ＣＤ２Ｂ抗体による刺戟後のＴ細胞の増殖はＣＤ
４５抗体が抗ＣＤ２抗体又は抗ＣＤ２８抗体のいづれか
に交差結合したとき抑制されたが、抗ＣＤ４５抗体が別
個に細胞表面に結合したときには抑制されなかった。こ
れらの結果＝４９− はＴ細胞上のＣＤ４５又はＣＤ４５Ｒの様なＣＤ４５イ
ソ型蛋白質と反応性のある抗体忘よびＣＤ抗原と反応す
る抗体よル成るヘテロコンジュゲートが細胞調節に有効
であることを示唆している。
反対にＴ細胞上のＣＤ４レセプターのホモ凝集体形成に
より生じた（　ＣｆＬｚ＋　）、増加はモノクロナール
抗体を使っ＄ てＣＤ４レセプターがＣＤ４５レセプターに交差結合し
たとき強（促進された。故にＴ細胞上のＣＤ４に対する
抗体およびＣＤ４５又はＣＤ４５Ｒイソ型蛋白質と反応
性のある抗体より成るヘテロコンジュゲートもＣＤ４に
ボジチブな全細胞又はｃｎ４５イン型蛋白質の発現であ
られされるＣＤ４細胞のサブセットのＴ細胞機能促進に
使用できる。
本発明のヘテロコンジユゲートはリンパ球調節に有効で
あり、したがって伝染病、癌、エイズおよび自己免疫症
の様な病状の細胞免疫反応の調節に使用できる。これら
のヘテロコンジユゲートは特にＴ細胞の欠失又は不調の
様な病状に′ｊ６ける細胞免疫反応調節に便利である。
例えばＣＤ４５イソ型蛋白質はある自免疫症に異常にあ
られれることが示されている。〔ローズらのＰｒｏａ、
ＮαｔｌＡｅａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）８２ニア３８９
　７３９３（１９８５）］したがってＣＤ４５レセプタ
ー又はＣＤ４５イソ型蛋白質と反応する少なくも１分子
をもつ本発明のヘテロコンジユゲートは自免疫症におけ
るリンパ球機能調節に有効であろう。
筐た本発明のヘテロコンジユゲートは後天的免疫不全症
候群（エイズ）による患者の免疫感応向上に有効である
。
Ｃ’　ｌ）４抗原はエイズに応答できる人の免疫不全ウ
ィルス（ＩＩＩＶ）のレセプターの役をすると知られて
いる。ＣＤ４はＴ細胞のウィルス感染中ＨＩＶのＱｐ　
１２０外皮糖蛋白質が結合するレセプターであると信じ
られている。〔例えばり、Ａ、ラスキーらのＣａ１ｌ、
５０：９７５（１９８７）とＭ、コワルスキーらの５Ｃ
ｔｅ％Ｃｍ、２３７：１３５１（１９８７）参照〕ＢＩ
Ｖ感染後ＣＤ　４の細胞表面発現が下方調整されまたＣ
Ｄ４　ｍＲＮＪ濃度が減少する。〔Ｊ、Ａ。
ホクシーらのＳｃｔｇｎｏｇ２３４：　　１１２３−１
１２７（１９８６）中“Ｔ４　（ＣＤ４　）蛋白質中の
変質とＩＩＩＶで感染した細胞中のｎｒ、　ＲＮ　Ａ合
成”参照〕エイズ患者が可溶性抗原に対する免疫感応減
少を示すこともよく確立されている。〔例えばＨ、Ｃ、
ＶインラノＮｅｗ、Ｅｓｇ　、Ｊ、ｂｂｄ　、　。
３１３（／１６２）ニア９−８４（１９８５）中の６後
天性免疫不全症候群をもつ患者の免疫機能の定量分析”
参照〕炙ンビトロ研究によって精製ＨＩＶ　　ｇｐ１２
０はクローン形成性刺戟に対するＴ細胞応答を抑制でき
ることがわかった。
この結果は出願人らがＣＤ　４　［対する可溶性モノク
ロナール抗体を用いて見た影響と同じである。〔Ｄ、Ｌ
、マンらのＪ、ｌｍｍ１ｂｎｏＬ、、１３８：２６４０
　２６４４（１９８７）中の”ＥＴＬＶ−ｆｆｌ大外皮
蛋白質（ｇｐ１２０）はＰＥＡによって生じたリンパ球
胚子発生を抑制する”参照〕故にエイズ患者に見られる
免疫抑圧はＣＤ４抗原表情に２けるＨＩＶ感染の効果に
関係すると提案できる、即ちＨＩＶ感染後おこるＴ細胞
上のｃ’　ｎ　４の下方調整は細胞の信号能力を減少す
ることによって免疫感応に影響し、抗原に答えてＴ細胞
活性化減少となる。このモデルを支持して出願人らはｃ
ｐｓに刺戟された遊離カルシウム濃度増加はＨＩＶに感
染した細胞において損なわれることを発見している。〔
Ｇ、Ｐ。
リネットらの５ｃｉｅ％ｃｇ、　　２４１　　：　５７
３−５７６（１９８８）（１）−ＨＩ’ＶＣ感染したＴ
１ｍ胞はＣＤ３／抗Ｗｖセプタ一通路をとおして選択的
トランスメンプレイン信号欠失をあられす”参照〕この
観察は本発明のヘテロコンジユゲート、特にＣＤ３７Ｃ
Ｄ４ヘテロコンジユゲートがＨＩＶ感染から生じている
Ｔ細胞機能障害の研究又は治療に有効である。
本発明はまた病状における細胞免疫反応調節のため本発
明のヘテロコンジユゲート使用によるインビトロ又はイ
ンビボのいづれかにおけるリンパ球処理方法も包含する
。
本発明の１実施態様によればヘテロコンジュゲートはＴ
細胞のインビトロ活性化に利用できる。この活性化は患
者から採取した７　リンパ球を本発明のヘテロコンジユ
ゲートの少な（も１とインビトロ接触させＴ細胞を活性
化した後元の供与体に再注入することによジ行なわれる
。〔例えばＳ、Ａ、ａ−ゼンベルグらの人ＢｔｏＬ、Ｒ
ａａｐ、Ｍｏｄｉｆ、３：５５０１−５５１１’（１９
８４）中の１リンパ様細胞とインターリューキン２の全
身投与による癌の免疫治療法”参照〕この治療法にはＴ
細胞と他の免疫変調剤とのイン　ビトロ共培養又は予備
培養がある。
別の実施態様によればヘテロコンジュゲートは田来れば
インターリューキン−２（ＩＬ−２）、発育素又はＣＤ
５の様な効果をねらう抗体〔例えばＥ、Ａ、クラークら
の”効果をねらう抗体による免疫反応の増進”参照〕お
よびＣＤ２８Ｃ下記実施例１参照）の様な他の薬剤と共
に患者にヘテロコンジュゲートを注射してＴ細胞のイン
　ビボ活性化に使用できる。処理方法に関係な（ＦｅＬ
ｂ又はＦ（ａｈ’）２の様な抗体フラグメント、キメラ
抗体又はパイスペシフィックな抗体より成るヘテロコン
ジュゲート使用に有効である。
本発明ノヘテロコンジユゲートはまた静脈内、経口、皮
下、腹腔内又はリンパ管内の様な普通の投与法を用い’
Ｃ（ン　ビボ投与できるが、上記投与法に限定するもの
ではない。静脈内投与法が好ましい。
ヘテロコンジュゲートを含む本発明の製薬組成物は固体
、準固体および液体服用形態、例えば錠剤、ビル、粉末
、溶液又は懸濁液、生薬、重合体ミクロカプセル又はミ
クロヴエシクル、リボゾーム７および注射用溶液など種
々の服用形態にできるが、上記に限定するものではない
。好ましい形態し工投与方法と治療用途によるのである
。
ヘテロコンジュゲート組成物は人の血清アルブミンの様
な血清蛋白質、ホスフェートの様な緩衝物質、水又は塩
類又は電解液などこの分野で知られた普通の調剤用キャ
リヤーを含んでもよい。
本発明のヘテロコンジユゲートの最有効投与法と用法は
病気の軽重と経過、患者の健康と治療に対する応答およ
び医師の判断による。したがってヘテロコンジュゲート
用量は個々の患者に対し規定する必要がある。とにか（
本発明のヘテロコンジユゲートの有効薬量は約１乃至約
１００■／　ｆｌＬ”である。Ｔ細胞のイン　ビトロ治
療のためには１０９細胞当シヘテロコンジユゲート薬量
約２００　Ｐｆｆ乃至約２■が使われる。
本発明のヘテロコンジユゲートはまたＴ細胞の欠失又は
不調などの病気をもつ患者に与えられたＴ細胞表面抗原
、例えばＣＤ抗原のレセプター機能測定のため診断に使
用できる。シグナル形質導入（実施例１参照）と適当対
照物測定用上記カルシウム試験を用いて平常人と罹病者
からのＴ細胞の本発明特定ヘテロコンジユゲートによる
活性化を比較してＣＤ機能の欠失を測定できる。例えば
本発明のＣＤ３７ＣＤ４ヘテロコンジユゲートは可溶性
抗−ＣＤ３単独十 でみもれる濃度より低い蛋白質濃度において（Ｃａ’〕
動員を促進する。故にこの低薬量において実際にＣＤ’
４レセプター機能が測定されている。これはこの薬量に
おける（、’Ｄ３／ＣＤ、ヘテロコンジユゲート活性を
阻止する可溶性抗−ＣＤ４能力によって反映される。同
様にＣＤ３／ＣＤ８ヘテロコンジユゲートの低薬量によ
ってＣＤ８レセプターの機能測定ができる。この薬量に
おいてヘテロコンジユゲートは癌および自己免疫症の様
な種々の病状にｉ６ける特殊ＣＤレセプター機能欠失の
検出に使用できる。またカルシウム試験は適当な単一抗
体対照物が行なわれる限り本発明のどんなヘテロコンジ
ユゲートのどんな薬量においても試験できる、即ちヘテ
ロコンジュゲートの活性はその成分をなしている非結合
抗体の活性と比較する必要がある。
〔例えば１９８７年３月１３日公告Ｅ、Ｌ、ラインヘル
ツらのヨーロッパ特許用Ｍ２２　］、、７６８号参照〕
〈実施例〉 本発明が更に十分に諒解される様下記実施例を記載する
。
実施例は単に例証するためのものであって、これによっ
て本発明の範囲を限定すると解釈すべきではないのであ
る。
＝５８− 実施例１゜ 次の実施例は本発明の新規のヘテロコンジユゲートの製
造法と特性を記述するものである。この実施態様によっ
てＣ’　Ｊ）３と反応する抗体はＣＤ４と反応する抗体
に交差結合してヘテロコンジュゲートによ多処理された
ＣＤ４　　　（即ちヘルパー）Ｔ細胞活性化に強いトラ
ンスメンプレイン信号を出す様な新規ＣＤ３／ＣＤ４ヘ
テロコンジユゲートを生成した。
本発明のＣ’ｌ）３／ＣＤ４ヘテロコンジユゲート製造
本実施態様のヘテロコンジユゲート製造に使われるＣＤ
３とＣＤ４抗体はそれぞれＧｌ　９−４　（Ｂａｔｈ／
ｃ、ＩｇＧ、）と０１７−２　（Ｂａｔｈ／ｃ−１１Ｇ
、）であった。これらの抗体はＪ、Ａ、　　レドペッタ
ーとＥ、クラークのＨ％ｍａｎ　ｌｍｍ５ｎｏ−１工ゎ
１５　：　３Ｏ−４３（１９８６）中の”扁桃経中心と
外套域Ｂ細胞サブセットの表面表現型と機能オよびノコ
。
レドベツターらのＭｏｌｇｃｓｌｃｙ　Ｉｍｌｍｍ５ｎ
ｏｌｏ　２４　（４１２）：１２５５−１２６１（１９
８７）＆）″ＣＤ４抗体特異性をもつ免疫グロブリンラ
イトチェーンダイマー”に記載のとおり製造した。また
本実施態様のヘテロコンジユゲート構成に使用できる他
の抗Ｃ″Ｄ３および抗ＣＤ４モノクロナール抗体は市販
品を入手できる。（例えばそれぞれＦＬ、クールター社
のＴ３およびＣＡ、ベクトンデイツキンソンのＬａｗ−
３）Ｇ１９　４と０１７−２抗体は腹水液から塩沈澱と
ＩＪＥＡＥクロマトグラフにより精製した後使用前に透
析と０．４５μフイルターをとおし涙過して製造した。
２モノクロナ一ル抗体を上記／＜　、　Ｒ、ノ・−デイ
−のフイコエリトリンカップリングについて記載のとＰ
３クヘテロバイファンクショナル（異ａ２官能性）交差
結合剤、ＧＭＢＳ（ＣＡ、ラジョラのＣ’ａｌｂｉｃｈ
ｇｒｎ、　）および５−イミノチオレインＨＣｌ（ＩＬ
、ロックフォードのピャスケミカル社）と１：１モル比
に８いて結合させた。えたヘテロコンシュケートはシュ
ーパーローズ６（スエーデン、ウプザラのファーマシア
）ＦＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーにより遊離抗
体から分離し、ヘテロコンジュゲートのフルオレセイン
に直接結合した抗ＣＤ３と抗ＣＤ４モノクロナール抗体
の結合阻止能力検査によυ両ＣＤ　３とＣ’　Ｄ　４と
の反応性を試験した。このＣＤ３／ＣＤ４ヘテロコンシ
ユケートをＧｌ　９−４／Ｇｌ　７−２と命名した。
次にＧｌ　９−４７Ｇｌ　７−２ヘテロコンジユゲート
の細胞中の原形質カルシウム動員促進能力を０１９−４
（抗ＣＤ３）単独の活性と比較試験した。使用細胞はフ
ィコルーハイバク上遠心分離した後プラスチックに耐着
させ大部分の単琢を除去して末梢血液から精製した人の
末梢血液リンパ球であった。
細胞内の〔ＣｃＬ〕、増加をｐ、ｓ、ラピノヴイチらの
Ｊ、Ｉ常惜５ｓｏ１，１３７（４３）：９５２　９６１
（１９８６）中のＰＥＡ又は抗ＣＤ３によるマイトゲン
刺戟後の細胞内遊離カルシウム反応におけるＴ細胞間の
異質性、インド−Ｉの刺戟的使用と流動細胞計算による
免疫螢光”に記載のとおりのインド−１（ＯＲ，ユーゲ
ンのモレキュラープローブス）および５０ＨＨ／２１５
０型流動細胞計算器（ＭＡ、ウェストウッドのオルトジ
アゴノスナックシステム社）を用い測定した。単に細胞
（５Ｘ１０’／Ｆｄ）は細胞膜をとおし浸透し原形室中
加水分解されて不透過物トラップ型となるアセトキシ−
メチルエステル（ＯＲ，ジャンクションシティのモレキ
ュラーブローブス）と培養することによりインド−１（
１ｎｄｏ−１）で負荷した。培養は示されたインド−１
濃度をもつ媒質中３７℃で４５分間行なつた。次いで細
胞を洗い新培地中に２．５　Ｘ　１０’／ｍｌに再懸濁
させ分析まで暗室渦中で蓄えた。各試験にインド−１負
荷した細胞を培地でｌ　ｘ　ｌ　Ｑ”／ｍｌに稀め３７
℃で平衡させた。
分光螢光計と上記ラビノヴイツテにより記載された流動
細胞計算法を用いて測定を行なった。時間に対する平均
インド−１紫／青螢光比を計算したプログラムによって
ヒストグラムを分析した。また時間対細胞応答パーセン
トを対照細胞の比について２標準偏差であるインド−１
比の値を先づ測定したプログラムによって分析した後時
間に対するこの出発値以上の細胞パーセントをプロット
した。全流動細胞計算値についてＸ（時間）軸上１００
点があった。
図１に示すとおりＣａ　濃度（ＣＣａ、”〕、　）増加
に要し２＋ たＧｌ　９−４７Ｇ１７−２濃度はＧ１９−４単独使用
で要した濃度よりも１．５−２桁低かった。更に免疫螢
光による＋ ＣＤ４　　細胞増加は［Ｃ’α２＋〕、活性と応答細胞
バーセン＄ トの対応増加を生じたのでＧ　１９−４／Ｇ　１７−２
へｆｒｙコンジュゲート活性はＣＤ４　　Ｔ細胞に制限
された。故に図２に示すとおシ末梢血液リンパ球がＧ１
９−４／Ｇ１７−２ヘテロコンジユゲートによって刺戟
されたとき細胞の平均最大［（？、２　　）、応答は約
１３００　ｎｕであって約６０チの細胞が反応した。し
かし細胞のＣＤ４＋サブセットを分析シタトキ、平均Ｊ
ｕｃ　ＣＣａ’　”　］　６応答＆’り　１０．０００
ｎＭであり〉９５％の細胞が応答した。更にＣＪＪ）４
＋細胞上のヘテロコンジユゲート活性は細胞を５μｒ／
Ｎに１７−２（抗ＣＤ４）ｔ”５分間前処理し、次に０
．４　／ＩＦ／ｒｎｌ　ノヘテロコンジユゲート処理に
よって殆んど完全に抑制された。
図２に示すと８すＣＤＢネガテブ、こ゛Ｄ１１ネガテブ
、ＣＤ１６ネガテプおよびＣＤ２０ネガテプ細胞上のゲ
ーティング（ｇａｔｉｎσ１通門）によってＣ“Ｄ４＋
細胞を分析した。ｃｎ４　　Ｍ胞についてのこのネガチ
ブ選択は末梢血液リンパ球をフイフエリトリン（ＰＥ）
と会合した２Ｈ７、ＣＤ２０と反応性をもつモノクロナ
ール抗体〔例えばＥ。
Ａ、クラークらのＰｒｏｅ、Ｎａｔ’１．Ａｃａｔｉ、
Ｓｃｉ、ＵＳＡ。
８２：１７６６−１７７０（１９８５）中の５人のＢ細
胞活性化における１３ｐ３５細胞表面ポリペプチドの役
割６参照〕、ＦＣ−２、ＣＤ１６に対するモノクロナー
ル抗体、〔例えばＣ，アナセラティらのＪ、Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ　、、１３９　（Ａ６）：１７７２−１７７９（１
９８７）中の”羊赤血球結合蛋白質ＣＣＤ２）とＦＣ−
レセプター（ＣＤ１６）の交差結合による天然キラー細
胞中のカルシウムフラックス誘発と細胞崩壊活性促進”
参照〕、Ｇ１．０−１、ＣＤ８に対するモノクロナール
抗体、〔例えばＪ、Ａ、レドベッターらのＪ、ｌｍｍ５
ｎｏＬ、、　１３４　：　４２５０−４２５４　（１９
８５）中の”人のチムスーロイケミア様抗原とＣＤ１３
分子間共有結合”参照〕および６０．１、ＣＤ工１と反
応するモノクロナール抗体、〔例えばＪ、Ｐ、バンヨン
らの１４ｕｋｏａｙｔｇＴｙｔｐｉ％ｔｔ　ＩＩｌ、　
　８４４−４７ページ中の１モノクロナ一ル抗体研究会
で説明された中性好生白血球凝集体中のＬＦＡファミリ
ーのアルファとベータ鏡上のエピトープ差別関係”参照
〕を着色し〉９５％ＣＤ４ポジテプである非着色細胞上
のゲーティングして行なった。ヘテロコンジュゲートに
より影響されたものが原形質源からのカルシウム動員で
あったかどうか見るため、キレートシシたがって細胞外
カルシ’７　ムを除去するＳｍＭ　ＥＧＴＡＣエチレン
クリコール−ビス（β−アミノエテルエーテル）−Ｎ、
Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラ酢酸〕の存在においてＧ１９−
４対Ｇ　１９−４／Ｇ１７−２ヘテロコンジユゲートの
比較滴定を行なった。図３はＥＧＴＡ存在下に２げるＧ
１９−４／Ｇ１７−２ヘテロコンジユゲートによるカル
シウム動員能力のほぼ２２−１ｏ増加があったことを示
している。細胞外カルシウムの存在における終点までの
滴定は活性のほぼ２−　ｌｏｇ増加を示した。（データ
は示していない）。
ＣＤ３又はＣＤ４抗原に結合している原子価が〔Ｃａ２
＋〕ｎへのＣＤ　３／ＣＤ　４ヘテロコンジユゲートの
影響の原因となることを排除するため出願人らはＣＤ３
／ＣＤ４ヘテロコンジユゲートと比較するためＣ））３
／ＣＤ３およびＣＤ４／ＣＤ４ホモコンジユゲートを構
成した。ホモコンジュゲートはＣＤ３７ＣＤ４ヘテロコ
ンジユゲートに対し上記のとおり構成され、それぞれＧ
ｌ　９−４／Ｇ１９−４およびＧｌ　７−２／Ｇ１７−
２とそれぞれ命名されている。下記式１に示すとＢジ、
ＣＤ３／ＣＤ３ホモコンジュゲートもＣＤ３／ＣＤ３と
ＣＤ４／ＣＤ４ホモコンジユゲ一ト混合物も〔Ｃａ２＋
〕ｎのＣＤ３／ＣＤ４ヘテロコンジユゲートの促進効果
と同じではなかった。この結果はＣＤ３／ＣＤ４ヘテロ
コンシユ’７’−）のｆｆｉ性向上カヘテロコンジユゲ
ートの原子価機能ではなくしたがって多分これらの抗原
とヘテロコンジユゲートの相互作用から２こるＣＤ３と
ＣＤ４分子の物理的接近から生ずることを示唆している
。更にヘテロコンシュゲートとホモコンジュゲートは間
接着色と流動細胞計算を用いる結合試験において遊離抗
体よりも相性性が小さかった。（データは示していない
〕故にＣＤ３／（、’　Ｄ　４ヘテロコンジユゲートの
独特な活性はヘテロコンジユゲートの第２％異性に原因
するＣＤ３結合親和力への影響に関係ありそうもない。
表　　　１ ＣＤ３／ＣＤ４ヘテｏ　　　　１０　　１５，６００　
１２０フンシユゲート　　　　　２　　１０，９００　
　８３０．４　　４，１４０　　３２ ０．０８　　８１０　　　６．２ Ｃ’ｌ）３／ＣＤ３ホモコ５０　　　２，３６０　　１
８ンジユゲー）　　　　　　　１０　　　　５５９　　
　４．３２　　　　３０１　　　２．３ ＣＤ４／ＣＤ４＊モコ　　　１００　　　　１３０　　
　１．０ンジユゲート５０　　　　１３０　　　１．０
ＣＤ３／ＣＤ４とＣＤ４／ＣＤ４２５＋２５　　　５９
０　　　４．５ホモコンジユゲ一ト混合Ｔｈ　　　　　
Ｓ＋５　　　　２７２　　　２．１１＋１　　　　２５
１　　　　１．９３ 〔（、’ａ”）ｉ応答試験はインド−１をもち上記のと
おりＰＥと精舎した仇−ＣＤ２０、抗（、’　ｌ）　８
　ｇよび抗（、’　Ｉ）　１６で着色された末梢血液リ
ンパ球を使用した。非着色細胞は〉９５％　ＣＤ４＋細
胞をなすと分析された。ピーク平均応答は刺戟後初めの
５分以内に２こった。
Ｔ細胞に８ける原形質カルシウム動員がイノシトールト
リホスフェート（１％８Ｐ３）の生成によって仲介され
ると思われるので、出願人らは精ｐｃＤ４　　Ｔ細胞を
（、’Ｄ３のみに対するモノクロナール抗体によるか又
は（、’　Ｄ　３　／　Ｃ’　Ｄ４ヘテロコンジユゲー
トによるかいづれかで刺戟後イノシトールホスフェート
の増加を枳１］定した。
ＣＤ４十Ｔ細胞なＣ，Ｈ，ジューンらのＭｏＬ、ＣａＮ
。
Ｂｊｏｊ、、７（４１２）：４４７２−４４８１（１９
８７）中の°′こ゛Ｄ２Ｂ経路を含んでいるＴ細胞増殖
はシクロスポリン−抵抗体インターロイキン２遺伝子発
現と関連している”文献記載のと２り精製した。簡単に
いえば、末梢血液リンパ球は実験員の白血球泳動後フィ
コール／ノ・イパーク密度勾配遠心分離法によって見ら
れた。Ｔ細胞のｃｎ４＋すブセットはＣＤ８　、ＣＤ１
１　、ＣＤ１６＋、ＣＤ１４＋およびＣＤ２０＋細胞を
飽和量の適切なモノクロナール抗体で先づ被覆した後磁
性粒免疫吸収によるネガテブ選択によって分離できる。
（抗ＣＤ１４モノクナール抗体、２０，３以外の先に言
及した抗体の大部分はに、カマランらのＣ１１ｎ、Ｉｔ
ｎｔｎｓｎｏｌｔｒｇｙ　ａｎｄ　ｌｍｍ５ｎｅｐａｔ
ルｏｌｏｇｙ、２９：１８１−１９５（１９８３）中の
１モノクロナ一ル抗体によって確認された人の単球−組
織法分別抗原”記載のとおり製造した。）この方策は止
まっている末梢血液１９７１球の上にＣＤ４とＣＤ８表
面抗原の相互の重複しない分布を利用した。細胞を３回
洗浄して非結合抗体を除去した後山羊の抗−マウスイム
ノグロブリンで被覆された磁性粒子（ＭＡ、ケンブリッ
ジのアドヴアンスドマグネテックインステイテユート）
と共に培養し、また小粒被覆細胞を磁性分離によって除
去した。一般に流動細胞計算により算定したときＣＤ４
　か９８％以上でありまた非特異性エステラーゼの染色
により測足したとき単球０１％以下を含む約５００　Ｘ
　１０６　ＣＤ４＋　Ｔ細胞が回収された。
精製したＣＤ４＋Ｔ細胞を４１１９７ｍ１　ＰＨＡと４
０ｐＣ４７ｇ　ｍｙ　ｏ　−２Ｃ３Ｈ］−イノシトール
（３７ＭＢｇ　／ｍＡ　；　ＩＬ。
アーリントンハイツのアマージャム社）を追加された１
０チ加熱失活された牛胎児血清を追加したＲＰＭＪ　１
６４０（“培地″）中に２−４Ｘ１０’細胞／Ｎ濃度で
再懸濁し空気中Ｃ０２５％の雰囲気で３７℃で培養した
。７２時間後細胞を３回洗い１０　ｍＡｉ　ＬｉＣ１１
を追加した°゛培地中に細胞５Ｘ１０’／ｄ濃度に再懸
濁した。２０分暗培養後１・９−４又はＧｌ　９−４／
Ｇｌ　７−２ヘテロコンジユゲートは＝０において加え
最終濃度はμ？／就とした。次いで種々の時点で５　Ｘ
　１０’細胞試料をとシ出しエツペンドルフ５４】４遠
心分離機で１０秒間沈降させた。培地吸引径細胞ペレッ
トに水冷１０％ＴＣ”Ａ（ｗ／ｖ）１ｍ７を加えた。
９００Ｘｙ遠心分離によって５分間不純物除去後、上澄
液を６容量のジエチルエーテルで抽出した後中和した。
フォーメート形ダウエックス１　ｘ８（１００−２００
メツシユ）（Ｃ“、ｌ、ＩＪツテモンドの１３ｉｏ−Ｒ
αｄ）を用い、陰イオン交換クロマトグラフィーによっ
て〔３Ｈ〕−イノシトールホスフェートを分離しＢｉｂ
−５ａｆｅ　　２　（Ｉ　Ｌ　、マウントプロスペクト
、リザーテブロダクツ社）中で液体シンチレーション分
光検査法により定量した。３Ｈ化されたイノシトールホ
スフェ−）　ＩＩＩ定用のこの方法はへＢ、イムボーデ
ンらの上＝７３− 記、″″Ｔ細胞抗原レセプターによるトランスメンプレ
イン信号′７およびＪ、Ｂ、イムボーデンらの上記、”
人のＴ細胞クローンによる抗原認定はイノシトールトリ
ホスフェートの増加となる”に記載されている。
図４が示すとおり１μｍ／ＷＬｌにおいてヘテロコンジ
ユゲート刺戟はイノシトールホスフェート１．２、およ
び３の生成を実質的に増加したが、Ｇ１９−４のみでは
イノシ）−ルホスフエート１の僅かな増加となった。非
刺戟細胞の３Ｈ化されたイノシトールホスフェートの実
験開始（ｔ−０）と終点（ｔ−１０分）に′ｊ６ｉ−ｊ
る濃度も示されている。
図５に示された追加実験に８いて、ＣＤ４に対する遊離
モノクロナール抗体、Ｇ１７−２はへテロコンシュ’７
’−）によりおこったイノシトールホスフェート応答を
阻止することが認められた。Ｇ１７−２は遊離抗ＣＤ３
モノクロナ一ルｉ体、Ｇ１９−２に対するイノシトール
ホスフェート−７４＝ 応答を阻止しなかった。これらの実験によればＣＤ４＋
　Ｔ細胞は〔３ｕ〕−イノシトール（４０μＣ４／ａｔ
　）　−、およびＰＩＩＡ（４μｆ／ｍｌ）を含む培地
中７２時間培養され、十分洗われた後１０　ｍＭ　Ｌｉ
Ｃ１１を含む培地に再懸濁され３７℃で２０分培養され
た。Ｇ１７−２〔Ｊ、Ｆ、ボッディングのＡｆｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ　Ａｔｓｔｔｂｏｄｔｇｓ　Ｐｒ１ｎＣｉｐ
ｌｅｓ　ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ、２３０ページ（１９
８３年アカデミツクプレス）に記載のとおりビオチン結
合した〕を次に選択試料に加えた。５分波Ｇ１９−４、
Ｇ１７−２、Ｇ１９−４７ＧＪ７−２ヘテロコンジユゲ
ートおよびアヴイジンを示したとおり加え更に１０分間
培養をつづけた。１０％ＴＣＡ中で細胞試料（１０７細
胞／試料）の分解後〔３Ｈ〕−イノシトールホスフェー
トを抽出し陰イオン交換クロマトグラフィーで分離し上
記のとおり定量した。別個の２実験を図５に示している
。３倍の細胞試料の平均＋／　−ｓ　ａｍ（標準誤差）
を示しまたモノクロナール抗体の最終濃度（μｆｆ／ｍ
ｌ　）を図示している。
故に実験データは本発明のヘテロコンジユゲートのイノ
シトールホスフェート生成における促進効果のみでなく
ＣＤ４に対する可溶性抗体がこのＴ細胞応答を阻止する
ことも示している。したがってデータはＴ細胞応答刺戟
におけるＣＤ４抗原のはだす重要な役目を示唆している
。
ＣＩＪ）３／ＣＤ３とＣＤ４／ＣＤ４ホモコンジユゲー
トを対照物として用いた増殖試験において示したと−Ｅ
ｌ）本発明の（、’ｌ）３／ＣＬ）４ヘテロコンジユゲ
ートがＴ細胞活性化において新規機能をもつことが発見
されている。この試験のＣＤ４＋Ｔ細胞は５％加熱失活
した牛胎児血清（ＵＴ、ローガン、ハイコン）を含むＲ
ＰＭＴ１６４０培地中ウェル当り５　Ｘ　１０’細胞で
平底９６ウエルミクロタイター板の試料中に４重に培養
した。ＣＩＪ）４　　細胞を０１９−４（抗ＣＪＪ３）
、Ｇｌ　９−４／Ｇｌ　９−４　（ＣＤ３／ＣＤ３ホモ
コンジユゲート）、Ｇ１９−４／Ｇｌ　７−２　（ＣＤ
３７ＣＤ　４ヘテロコンジユゲート）又はＧ１７−２／
Ｇｌ　７−２（ＣＤ４７ＣＤ４ホモコンジユゲート）の
いづれかと共に、ＰＭＡ（ホルボール　ミリステート　
アセテート）（１μｒ／ｍＪ）又はモノクロナール抗体
、９３、Ｔ細胞表面上ＣＤ２８刺戟と反応性をもつ抗体
Ｃ，ＣＢａ１ｂ／ｅ　　ｘＣ５７ＥＬ／６　）　Ｆｌ、
　ＩｇＧ、ｏＬ〕と共に又はそれらなしで３日間培養し
た。〔例えばＪ、Ａ、−・ンセンらのＪ請騒％ｏ　−ｇ
ｍｎａｔｉｃｓ、１０：２４７−５２（１９８０）中の
１人間リンパ球の新規Ｔ細胞抗原およびＩｃＬ抗原を同
定するモノクロナール抗体″′参照〕抗体とコンジュゲ
ートはすべて１μｆ／ｍｌで使用した。チミジン取込み
（平均ｃｐｖｎ士ｓａｗ）は３日培養の最後の８時間細
胞を３Ｈ−チミジン（ＭＡ　、ボストンのニュー　イン
グランド　ニューフレア社）の１μＣ（／ウェルでパル
スした後液体しンナレーション計数器で３日月に測定し
た。
図６に示したとおり精製ＣＤ＋　Ｔ細胞を抗ＣＤ３試薬
単独又はＰＭＡ単独のいづれかと共に培養したが増殖は
認められなかった。ＰＭＡがあった場合ＣＤ３に対する
モノクロナール抗体を含む抗体調合物はすべて相当量の
Ｃ３Ｈ〕−チミジン取込みをぢこしたが、ＣＤ４ホモコ
ンジユゲートはマイトジェン性ではなかった。種々の試
薬とＣＤ２Ｂに対するモノクロナール抗体。９３との相
乗作用を試験したが、実質的差異があった。ＣＤ３／Ｃ
Ｄ４ヘテロコンジユゲートのみがＣＤ２Ｂ抗体に対し感
応をおこした。従来の研究はＣＤ２８刺戟が精製Ｔ細胞
に対しマイトジェン性でないが、ＣＤ２８に対するモノ
クロナール抗体はＰＭＡが−’７８− あると細胞サイクルをとおしＴａ胞の９５％以上が進行
すると示している。〔例えば上記Ｃ，Ｈ，ジューンらの
Ｍａｒ。
ＣｅＬｌ、Ｂｔｏｌ、、参照〕精製Ｔ細胞のＣＤ２８刺
戟が液相ＣＤ抗体とマイトジェン性でないという発見は
従来の研究を確認している。〔例えばＡ、ワイスらのＪ
、Ｉｎｍｕ、？Ｌｏ　ｌ　、。
１７３（Ａ３）：８１９−８２５（１９８６）中の１人
のＴ細胞活性化におけるＴ３／抗原レセプター複合物と
Ｔ。
４４の相乗作用”参照〕 ＣＤ３／ＣＤ４ヘテロコンジユゲートとＣＤ３／ＣＤ３
ホモコンジユゲートの間のＣＤ　２８刺戟に対する差異
が定性的か定量的か決定のためＣ“Ｄ４＋Ｔ細胞をＧ１
９−４、Ｇ　］、　９−４／Ｇ　１７−２ヘテロコンジ
ユゲート又はＧ１９−４７Ｇ　１９−４ホモコンジユゲ
ートの種々の濃度と、ｐＭＡ（１ｐＹ／ｍｌ）又は抗（
、’Ｄ２Ｂモノクロナール抗体、９．３（１μ？／ｒｒ
Ｌｌ　）のいづれかと共に培養した。図７に示すとおり
Ｇ１９−４７Ｇｌ　７−２ヘテロコンジユゲートは１０
０　ｎｌＦ／／ｎＩＶの様な低濃度においてさえＣＤ２
Ｂ刺戟で十分マイトジェン性であるが、ＣＤ３７ＣＤ３
ホモコンジユゲートは１０μｆＡＩＬｌにおいてそうで
なかった。反対にＰＭＡとＣＤ３刺戟に対する細胞のマ
イトジェン性反応は試験したすべての濃度においてＣＤ
３抗体コンジュゲートについて同じであった。更に運動
性実験はＣＤ３７ＣＤ３ホモコンジユゲートとＣＤ３／
ＣＤ４ヘテロコンシユケートのＣＤ２８刺戟に対する差
異は増殖の時間経過の移動によらないことを示した。（
データは示していない）故に増殖にぢいてＣＤ３と反応
する可溶性抗体に応答しないＣＤ４　　Ｔ細胞はＣＤ２
９に対する抗体存在下の増殖によって本発明のＣＤ３７
ＣＤ４ヘテロコンジユゲートに応答することがわかる。
更にＴａ胞増殖における（、’Ｄ３／ＣＤ、ヘテロコン
ジユゲートの効果を検べるため、刺戟後の３連続細胞サ
イクルの各相に３いて細胞判別法によって細胞サイクル
運動性を検べた。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＰＥと結合したＣＤ
８、ＣＤ６君よびＣＤ２０抗体（前記）で染色後サイト
フルオログラフ５ＱＨＨ細胞分数器（ＭＡ、ウェストウ
ッドのオルソジアゴノスチック　システム社）で流動細
胞計算法にまり＋ ＣＤ４　　Ｔ細胞を分類した。ネガテブな細胞を分類し
、分類集団の再分析によってＣＤ４ボジテブなもの９７
％であった。免疫螢光パラメーターのほかに前方スキャ
ターと有角スキャターを測定し、リンパ球集団を制限し
単球、汚物Ｂよび死細胞を除外するに用いた。細胞は２
０Ｃにふいて２０００細胞／秒速度で分類された。
分類した細胞は丸底９６ウエルミクロタイター板（デン
マーク、カンブストリップ、Ｎ５ｔＬｃ）中５Ｘ１０’
細胞／ウェルにおいて４重に培養した。培養物に５μｍ
／縦の０１９一４／Ｇ１７−２ヘテロコンジユゲート又
はＣＤ３又はＣＤ４ホモコンジユゲートを加え又はＰＥ
Ａは０　ｐＹ／Ｉｌｌで加えた。細胞を０，６μｍ廁抗
ＣＤ２８モノクロナール抗体、９．３．１．５　Ｘ　１
０−’Ｍ　　ＢｒｄＵ、　１００　Ｕ　７ｇペニシリン
および１００μｆ／ｒｎｌストレプトマイシンの存在下
における１０ＦＢＳおよび５Ｘ１０−５Ｍ２−メルカプ
トエタノールを追加したＲＰＭＩ　１６４０中で成長さ
せた。３７℃（５％　Ｃ０２）で３日間培養後培地をし
づかにウェルから吸出し、０．１＆）リス、ＰＨ７，４
，０，９％Ａ’ａ　Ｃ１，１ｗＡｆＣａＣ１！、、１．
　ＯｍＭＭｇＣ／Ｊｚ、０．２％　　ＢＳＡ、０．１％
　ＮＰ４０および１重ｇＰ／ＷＬｔヘキスト３３２５８
（シグマ）７および５μＹ／ｒｕｂ　エチジウムブロマ
イド、ＥＢ（カルビオケム）を含む染色溶液０．２１で
置換した。細胞を４℃で３０分培養後再懸濁させ、ｐ、
ｓ、ラビノヴインテリＰｒｏｏ、Ｎａ白。
Ａｅａｄ、Ｓｅｔ、ＵＳＡ、８０　：２９５６−６０（
１９８３）中の”牛の内皮細胞によって生成された平常
安定繊維素溶解防止剤検出”に記載のとおりＰＤＰｌ　
１１０３コンピユータ（ＭＡ、メイナードのデイジタル
エキツプメント）にインターフェイスしたＩＣＰ−２２
（オルソ　ジアゴノスナック　システム社）上で流動細
胞ｉｉｔ算を行なった。紫外線励起（ＵＧ１フィルター
）を使用しまたへキス）３３２５８放射線を４２５乃至
５００％ｍで検出しまた螢光を６００％ｍ以上で検出し
た。約３−４Ｘ１０”細胞の螢光を分析しヘキスト対Ｅ
Ｂ螢光の２変量ヒストグラムとして記録した。個々の細
胞サイクルコンパートメント太ぎさ測定は分析とｐ、ｓ
、ラビノヴイツテによって報告されたと２り曲線フィッ
ティングによった。
第１、第２又は第３細胞サイクルを経た細胞パーセント
は図８に示している。図に示すとｉ３シＣＤ３７ＣＤ４
ヘテロコンジユゲートによって３日刺戟後細胞の４５％
がＳ相又はそれ以上に入り細胞の３９％が増殖の第２サ
イクルに入ったのでＣＤ３７ＣＤ４ヘテロコンジユゲー
トのみが細胞を細胞サイクルに目立って送ることができ
た。故にＣＤ３／ＣＤ４ヘテロコンジユゲートプラス抗
ＣＤ２Ｂ刺戟に応じて精製ＣＤ４＋細胞による３Ｈ−チ
ミジン取込みは第２および第３世代につづく実質的増殖
反応をあられす。反対に他の抗体調合物はいづれも目立
った細胞遷移がおこらなかった。（図８参照）図８はま
た分類された細胞の７０％が３日培養後Ｓ相に入ったＰ
ＨＡプラス抗ＣＤ２８対照と比較してＣＤ３７ＣＤ４ヘ
テロコンジユゲートによって刺戟された細胞の４５％が
応答したこともあられしている。
これはＣＤ３／ＣＤ４ヘテロコンジユゲートで刺戟後相
当数のＣＤ４＋細胞が細胞サイクル進行をもつたことを
示している。
細胞抗原を共変調する ＣＤ４　　Ｔｉ１ｊＪＪ胞表面上の抗原又は抗体結合物
は０μｍ／Ｎ抗体濃度にＢいて３７℃、１８時間培養後
その密度を抗−マウスＩ、第２段階による免疫螢光を用
いて測定しＦＡＣ５■流動細胞計算法で測定することに
よｐＴ細胞表面上のＣＤ３およびｃｎ４抗原のｃｌ）３
７ＣＤ４ヘテロコンジユゲート、ＣＤ３又はＣＤ４ホモ
コンシユケート又はＣＤ４又はＣＤ３単独に対する抗体
による変調を測定した。
結果を下記衣■に示している。その密度は直線スケール
上測定したバックグラウンド以上の平均螢光強度単位と
してあられしている。
表　　　■ Ｃ“Ｉ）４　　　　　　　　　　　　１５０　　　４８
　　　　　　６８ＣＤ４／こ“ｌ）４　　　　　　　　
　　　　２２６　　　　　　７５　　　　　　　　　　
６７ホモコンジユゲート ＣＤ３　　　　　　　　　　　１７７　　　　９．０　
　　　９５ＣＤ３／ＣＤ３　　　　　　３４０　　　１
０　　　　　９９ホモコンジユゲート ＣＤ３／ＣＤ４　　　　　　　３６９　　　１９　　　
　　９５ヘテロコンジユゲート 表に示すと旧りＣＤ３に対する抗体又は（、”Ｄ３／Ｃ
Ｄ３ホモコンジュゲートによる１夜培養は表面ＣＤ３を
殆んど検出できなかったが、ＣＤ４に対する抗体又はＣ
Ｄ４／ＣＤ４ホモコンジユゲートで同様培養後もなお相
当量の表面ＣＤ４が残っていた。しかしＣＤ３７ＣＤ４
ヘテロコンジユゲートはＣＤ３とＣＤ４両方のモジュレ
ーションをな８６一 し表面Ｃ／）４の減少を示した。この試験に用いた抗体
とコンジュゲートはモジュレーション接抗ＣＤ３又は抗
ＣＤ　４モノクロナ一ル抗体の直接螢光コンジュゲート
を用いて試験したとぎ細胞表面の遊離ＣＤ３又はＣＤ４
抗原（即ち抗体に結合していない）が検出されなかった
からすべて過剰であった。（データは示していない）故
に本発明のＣＤ３／　ＣＪＪ　４ヘテロコンジユゲート
はＴｆｆ＠胞表面上表面上３とｃｎ４抗ＴｊＸを同時モ
ジュレーションし、ヘテロコンジュゲートがＣＤ３に対
し固定化された抗体の場合提案されていたと５Ｓｔ）細
胞表面にＴ細胞レセプターを単に固定していないことを
示している。〔例えばレドベツターらのツユＩ　ｍｆｎ
％％ｏ１．上記参照〕更に可溶性抗ＣＤ３による研究は
ＣＤ３が細胞表面からモジュレートされたとぎＣＤ３／
Ｔｉレセプターはインターナライズされ〔例えば（，１
，Ｆ、プレスらのＣｇＬｌｓｂｌａｒ　　ｌｍｍ５ｔＬ
ｏＬ、、１０２　：　１０　２０（１９８６）中の“人
のＴ＃Ｉ胞に向けられたりシンＡ鎖免疫毒評価″および
（ｊ、Ｆ、プレスらのＣａ％ｃａｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
、４８　：　２２４９−２２５７（１９８８）中の１正
常および悪性１９７３球によるねずみ抗−人ＣＤ３モノ
クロナール抗体のエンドサイトシスおよび分解″′参照
〕Ｔ細胞活性化を抑制した。本発明のヘテロコンジユゲ
ートはまたレセプターのインターナリゼーションに導（
が、なおＴ＃Ｉ胞活性化を促進する。
本実施例の示すとＢ力木発明のＣＤ３／ＣＤ４ヘテロコ
ンジユゲートはＣＤ４＋Ｔ細胞活性化においてＣａ２＋
動員とイノシトールホスフェート生成の両方を促進する
。更にこのヘテロコンジュゲートは初めの３日間内の刺
戟で細胞の相当部分を第２細胞サイクルに駆る様なＣＤ
２Ｂに対する抗生 体の存在下でＣＤ４　　Ｔ細胞増殖に新規の官能性活性
をもつ。更に本ヘテロコンジユゲートはそれと反応性の
ある抗原を共モジュレートし、それがＴＩＶ＋１１１胞
の活性化においてこれら抗原を近隣にひきよせる様働ら
（どの仮説を支持すると思われる。
下記実施例はＣＤ　Ｔ細胞抗原と反応する他の多数抗体
のいづれかと交差結合しているＣＤ３抗原と反応性のあ
る抗体より成る本発明の他のヘテロコンジユゲートの構
造と特性を記載するものである。
前記実施例１に記載のとおり構成された抗体ヘテロコン
ジユゲートは１ｃＬ＋　　モノクロナール抗体Ｇ１９−
４（抗ＣＤ３）（前記した）および９，６（抗ＣＤ２）
〔例えばＰ、Ｊ。
マーチンものＪ、ｌｍｍ５ｎｏＬ、、１３１　：　１８
０（１９８３）中の１人のＩ゛細胞表面蛋白質Ｔｐ５０
上の明らかな２エピトープの同定と官能特性”参照〕、
（ｂ）　　モノクロナール抗体Ｇ１９−４および１０．
２（抗−ＣＩＪ）５）より成るＣＤ３／ＣＤ５ヘテロコ
ンジユゲート、　Ｃ例ｊ’Ｊｆ、Ｐ、Ｊ、マーテンらの
Ｉｍｍｓｎｏｇｇｌｍｍ５ｎｏ、　　１１　：　４２９
　（１９８０）中の１新しい人のＴ細胞分化抗原：慢性
リンパ球白血病細胞上の意外な発現″およびＰ、Ｊ、マ
ーチンらのＪ、ｌｍｍ５ｃｎｏｌ　、。
１２：１９２０（１９８１）中の゛平常人の１９７３球
を認めるモノクロナール抗体および悪性Ｂリンパ球Ａ比
較研究”参照〕、（ｃ）モノクロナール抗体Ｇ１９−４
ｇよびＧ３−６（抗ＣＤ６）より成る（、’　Ｄ　３　
／　ＣＤ　６ヘテロコンジユゲート（Ｇ３−６はＴ白血
病細胞系、Ｉｆ　１３　Ｓ　２によってＢａ　ｌ　ｂ　
／　ｃマウスの免疫法によって形成されたＩＱＧ、イソ
タイプの抗ＣＤ６モノクロナール抗体である。ハイプツ
リドマ（ｈｙ　ｂｒｉｄｏｍａａ　）はマウスからＮＳ
Ｉ骨ずイ腫系による牌臓細胞の融合によって生成され通
常のＴ細胞への結合とＣＤ６関係抗体、１２．１との交
互ブロッキングにより診査された。〔例えばＰ、Ｊ、　
　マーテンらのＪ、Ｉｍｔｐｃｕｎｏ　ｌ　、。
１２７、上記参照）　）　；　（ｄＪ　　モノクロナー
ル抗体Ｇ１９−４７およびＧ３−７（抗ＣＤ７）より成
るＣＤ３７ＣＤ７ヘテロコンジユゲート。Ｇ３−７はＢ
ａｒｂ／ｃマウスのＴ白血病細胞系、Ｈ５Ｂ２による■
免疫法により生成したＩ、Ｇ。
インタイブの抗−ＣＤ７モノクロナ一ル抗体である。ハ
イブリドマはＮ’ＳＩ骨ずい種糸をもつマウスからえた
＃臓細胞の溶融によって生成し平常Ｔ細胞への結合と米
国型培養体コレクションからえられるＣＤ７関連抗体、
３，４１とクロスブロッキングによって診査した。また
抗ＣＤ７％ノクロナール抗体は市販入手できる。（ＣＡ
、マウンテインビューのベクトンデイッキ／メン））〔
例えばＥ、Ｌ、ライフヘルツら著Ｌａ５ｋｏｅｙｔａ　
　Ｔｙｐｉｎｇ　ＩＩ、１巻　３−３０（１９８６）参
照）；ｆ＃）　　モノクロナール抗原Ｇ１９−４ぢよび
ＧＩＯ−ＩＣ抗ＣＤ８）より成るＣＤ３／ＣＤ８ヘテロ
コンジユゲート（文献前出）′Ｊ３よび（／Ｊ　　モノ
クロナール抗体Ｇ１９−４′ｊ６よび９．３より成るＣ
Ｄ３／ＣＤ２８ヘテロコンジユゲート（文献前出）であ
った。
これらのヘテロコンジユゲートは実施例１に記載のとお
りそのＴ細胞に２ける原形質Ｃａ２＋動員促進能力につ
いて試験された。名ヘテロコンジユゲートはＣＤ３単独
に対する抗体活性が最適以下でありかつコンジュゲート
の向上活性が検出される濃度１μｍ／ゴで試験した。細
胞をヘテロコンジュゲートで刺戟仮初めの５分以内にイ
ンド−１負荷末梢血液リンパ球の［Ｃａ２　］、反応ピ
ークがおこった。非刺戟細胞は（Ｃａ”　　］４　１３
０５Ｍを示した。ＣＤ３／ＣＤ４とＣＤ３／ＣＤ８ヘテ
ロコンジユゲート使用実験に？いてコンジュゲ−トの活
性をそれぞれＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞サブセツトにつ
いて測定した。これらのヘテロコンジユゲートのカルシ
ウム動員活性は下表■に示されている。
表　　　■ ＣＤ３／ＣＤ３（（８９−４７Ｇ１９−４）　　　　１
８に゛ｌ）３／ＣＤ２　　（＆１　９−４／９．６　　
）　　　　　　　　　　　　　２７２２ＣＤ３／ＣＤ４
（Ｇ１９−４７Ｇ１７−２）　　　３３４９ＣＤ３／Ｃ
Ｄ５　（Ｇ１９−４／１０．２　）　　　　　　　１５
５ＣＤ３／ＣＤ６（０１９−４／Ｇ３−６）　　　　　
８３６Ｃ″Ｄ３／ＣＤ７（Ｇ１９−４／Ｇ３−７）　　
　　　２７６ＣＤ３／ＣＤ８　（Ｇｌ　９−４／Ｇｌ　
Ｏ−１）　　　２６９０ＣＤ３／ＣＤ２８　（Ｇ１９−
４／９．３　）　　　　　　　２０４表■が示すとぶり
ＣＤ３／ＣＤ２、ＣＤ３／ＣＤ６、 ＣＤ３／ＣＤ７７およびＣＤ３／ＣＤ８ヘテロコンジユ
ゲート（ＣＤ３／ＣＤ３ヘテロコンジュゲートも同様）
によつて処理されたＴ細胞内において刺戟されない又は
ＣＤ３／ＣＤ３で刺戟された細胞の活性に比べて上記ヘ
テロコンジユゲートはカルシウム動員の著しい増加をお
こした。これらのヘテロコンジユゲートは実施例１に記
載のＣＤ３／ＣＤ４ヘテロコンジユゲートの様にそれら
が反応しているそれぞれの抗原を接近させる様働きトラ
ンスメンプレイン信号君よびＴ上紙活性化を促進すると
信じられる。
実施例３゜ 本実施例は更に多数の他のＣＤ　Ｔ細胞抗原のいづれか
に交差結合しているＣＤ５　Ｔ細胞表面抗原と反応性あ
る抗体よｐ成る本発明の他のヘテロコンジユゲートの構
成と特性を記載するものである。
上記実施例１に記載のとおり構成されたこれら抗体ヘテ
ロコンジユゲートは次のものであった：（α）モノクロ
ナール抗体１０，２と９．６より成るＣＤ５／ＣＤ２ヘ
テロコンジユゲート；（ｂ）モノクロナール抗体１０．
２と９．３より成るＣＤ５７ＣＤ８ヘテロコンジユゲー
ト；（ａｔ　　モノクロナール抗体１０．２と０１７−
２より成るＣＤ５／ＣＤ４ヘテロコンジユゲー）＋（Ｊ
　　モノクロナール抗体１０．２とＧ３−６、Ｊ、！ｌ
成るＣＤ５／ＣＤ６ヘテロコンジユゲート；（ａ）　　
モノクロナール抗体１０２とＧ３−７より成るＣＤ５／
ＣＤ７ヘテロコンジユゲート；および（／ｌ　　モノク
ロナール抗体１０．２とＧＩＯ−１より成るＣＤ５／Ｃ
Ｄ８ヘテロコンジユゲート。本実施態様のヘテロコンジ
ユゲートを構成するに使われたモノクロナール抗体はす
べて前に記載したものである。
これらのヘテロコンジユゲートはまた実施例１に記載し
たとおりＴ細胞中の原形質Ｃａ”＋の動員促進能力も試
験された。この実験結果は表■に示されている。本実験
に使った各ヘテロコンジュゲートの濃度は表に示してい
る。インド−１をもった末梢血液リンパ球のピークＣＣ
ａ”〕ｉ　　反応は刺戟仮初めの１０分以内におこった
。刺戟されない細胞は１３０　ｎＭのＣｃａ”　］　ｉ
を示した。表が示すとおりＣＤ５／ＣＤ５ヘテロコンジ
ユゲートは１８０％Ｍの［Ｃｚ”）ｔを示した。ＣＤ５
／ＣＤ４とＣＤ５／（、’Ｊ）８ヘテロコンジユゲート
のそれぞれＣＤ４　　とＣＤ８　Ｔ細胞サブセットにつ
いて試験した。
表　　　■ μｍ／酎） ＣＤ５７ＣＤ２　（１０，２／９．６．２０　　　　　
　２０４μｉ／猷） ＣＤ／ＣＤ２８　（１０，２／９．３．１０　　　　　
　１９６μｙ　７ｍｇ　） （、’Ｄ５／ＣＤ４　（１０，２／Ｇｌ　７−２、　　
　　６４０２μｍ／酎） ＣＤ５／ＣＤ６　（１０，２／Ｇ３−６．２　　　４２
１μｙ　７ｍｇ　） ＣＤ５／ＣＤ７　（１０，２／Ｇ３−７．１５　　　　
１７８μｉ／猷） μｆ／紅） 表■が示すとＢす、ＣＤ５／ＣＤ４、ｃｌ）ｓ／ＣＤ６
′ｊ！３よびＣＤ５７ＣＤ８ヘテロコンジユゲートは刺
戟されない又はＣＤ５／ＣＤ５で刺戟された細胞と比較
してカルシウム動員の著しい増加を示している。これら
のヘテロコンジユゲートも他の前記ヘテロコンジユゲー
トと同様にＴ細胞活性化促進に有効であると信じられる
。
実施例４゜ 本実施例においてはＴ細胞表面上のＣＤ３とＣＤ４５抗
原７およびＣＤ３とＣＤ４５抗原と反応性をもつ抗体の
ヘテロコンジユゲートの間のｍＡｂでおきた相互作用を
用いてＴ細胞活性化におけるこれらの方法の効果を検べ
た。
細胞調製 末梢血液単球細胞および末梢血液からのナイロン羊毛に
非付着性リンパ球を前記のと２ジ製造した。〔クラーク
ら−９８＝ １００−１１３（１９８６）、両者を参考として本明細
書に加えてオ＜〕ナイロン羊毛非付着性リンパ球は次の
とおりのナイロン羊毛分離法によってえた：ナイロン管
（ＩＶＡ。
シアトルのオンコゲン製）に牛胎児血清５％を含むＲＰ
ＭＩ培地を負荷し３７℃で４５分間予備培養後使用した
。細胞を管に流し込んだ後３７℃で４５分間培養した。
温培地を用い６虹を管からとり１２００ｒｐｍで８分間
回転２回させた後増殖緩衝液（１５％人のＡＢ血清、約
１．５ｍＡ）に再懸濁させた。非付着性細胞を計算し容
量を試験での用途にしたがって調整した。
人の白血球マーカーに次のＢａＬｂ／ｃマウスｍＡｂｓ
を使用した：　９．４　（ＩｙＧｔｃＬ）、抗ＣＤ４５
Ｃ上記コボルト〕；Ｇ　１−１５　（ＩｇＧ、）Ｈよび
３　Ａ　Ｃ５（ＩｆＧｔａ）、抗ＣＤ４５Ｒ〔レドベツ
ツター上記およびレドペツターらのＩ。
１１ｒｓｐａＣｔｉｖｇｓ　　ｉ％Ｉｍｔｎｓｘｏｇｍ
ｎｇｔｔｃｓ　　ａｎｄ１１ｔｓｔｏｃｏｍｐａｔｔｂ
イ１ｉｔｙ、ヘイス、Ｅ著、（ＡＳ〃ｉ　。
ニューヨーク）３２５−３４０ページ］；９６．５［ブ
ラウンらのＪ、Ｉ雪職％ｏ１．１２７（２）に６３９−
５４６　（１９８１）］、Ｐ、ビヴアリー博士によって
ｓくられたＵＣＨＬ−１（ＩｇＧ１）抗ＣＤ４５（１８
０フオーム）〔上記スミス〕；Ｇ　１９　４　（ｂｌＧ
＋）、抗Ｃ’　Ｉ）　３　［上記レドペッター〕；９．
６、抗ｃｎ２、（前記）；および９３、抗ＣＤ２Ｂ（前
記）。ねずみ抗−マウスカッパー特異性ｍＡｂ、　１８
７．１〔ウエヤらのＪ、ｌｍｍ１Ｌ％ｏｌ　、Ｍｇｔｈ
、　７４　：　９３　１０４（１９８４））はマウスｔ
ｎＡｂを交差結合のため使用した。
モノクロナール抗体ヘテロコンジユゲートはへテロ２官
能性交差結合剤ＧＭＢＳ（ＣＡ、ラジョラのカルビオヶ
ム）と５−イミノチオランＨＣ１（ＩＬ、　　ロックフ
ォードのピャス　ケミカル社）は＝１モル比で実施例１
に記載のとおり製造した。特に抗体（Ｉｍｐ／Ｎ）はカ
ップリング緩衝液（０，１Ｍ　Ｎ、ＨＰＯ，−２塩基性
７水化物、Ｑ、　ｌ　Ｍ　ＮａＣ１１、ｐＨ７，５）に
対し１夜透析した。コンジュゲートの第１抗体はイミノ
チオラン塩酸塩（ピャス　ケミカル社の２−ＪＴ）溶液
（カップリング緩衝液中１０ｍ９／ｍｌ　）　５０　ｐ
ｉ（０，５■）を撹拌しながら加えてチオール化した。
コンジュゲートの第２抗体をＧＭＢＳ溶液（ジメナルホ
ルムアミド、（ＤＭＦ）３６０μｌ中にＩＩＲ９）　５
μノ　（１４μｍ）と処理した。溶液を室温で１時間培
養した。抗体を別のＦＤ−１０管（スエーデン、ウプサ
ラのファーマシア）に流しカップリング緩衝液中予備平
衡させた。合計２．６罰の空隙容量後抗体を元の容量の
２倍採取した。抗体を混合し室温で５時間培養し、反応
混合物に２５ｍＭ　Ｂ−メルカプトエタノール（１μｌ
：５６０μｌカツプリング緩衝液）１μｌを加えて室温
で１５分培養した。これに１１μｌ　（１１７ｊＦ）の
Ｎ−エチルマレイミド（ＭＯ，セントルイスのシグマケ
ミカル社）を加えて反応を停止しＤＭＦ中１■／１とし
た。
コンジュゲートをホスフェート緩衝塩溶液（ＰＥＳ）に
対し１夜透析した。えたＣＤ３７ＣＤ４５ヘテロコンジ
ユゲートを実施例１に記載のとおりシュ−パーローズ６
ＦＰＬＣ上遊離抗体から分離しＧ１９−４／９．４と命
名した。
Ｔｎ、、４　ｂ　ｓ　　とビオテンの結合物は前記した
とおりビオチンーサクシニミド（ＭＯ，セントルイスの
シグマ　ケミカル社）を使用した。〔ハルデイ−、Ｒ，
Ｒ，（１９８６）’艷Ｅａｎｄｂａｏｋ　ｏｆ　Ｅｚｐ
ａｒｉｍｅ％ｔａｇ　Ｉｍｌｍｍ５ｎｏｌｏ。
（ウィルら著）（バックウェル、オフスフオード）３１
．１−３１．２ページ（１９８６）］］ホルボールー１
２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）とアビジ
ンはＭＯ。
セントルイスのシグマ　ケミカル社よりえた。組かえイ
ンターロイキン２　（ｒｌＬ２）はＨＡ、ボストンのジ
エンツイームから購入しいくつかの試験に増殖促進に使
用した。
血液Ｔ細胞の増殖は２００μｌミクロタイターウエル中
１０６細胞／酎を用い実施例１に記載のとおり〔３Ｂ〕
チミジンにューイングランドニュークレア；特殊活性２
７Ｃゼ／ミリモル；　Ｉ　Ｃｊ−３７ＧＢｑ　）取込み
により測定した。
特に増殖試験については単核細胞をレドベツターらの７
゜ｌｍｍ５ｘｏ１．１３５：１８１９−１８２５（１９
８５）に記載のとＢり培養した。簡単に単核細胞は末梢
血液からフィコール−ハイパツク上密度遠心分離によっ
て分離した後プラスチックに付着させて単球の大部分を
除去した。細胞を９６−ウェルミクロタイター板（ＣＡ
、オクスナードのベクトンデイツキンソンのフアシヨン
）でペニシリン、ストレプトマイシンおよび１５％人Ａ
Ｂ血清を含むＲＰＭＩ培地（Ｆｌ、　　ブラウン　デイ
ヤのベル　フリーズ）中４倍試料中２゜５　Ｘ　１０’
／ｍ４！度で培養した。Ｔ細胞刺戟のためマイトゲンフ
ィトへマグルチニン（ＰＨＡ；ＮＣ，グリーンビルのウ
エルカムダイアノスナックス）又はセファローズにカッ
プルした抗ＣＤ３　ｍＡｂ　（Ｇ　１９−４　）のいづ
れかを使用した。培養３又は４日後、ウェル当り０．５
、Ｕこ“イ〔３Ｈ〕チミジン（ＭＡ４．ボストンのニュ
ーイングランドニューフレア；６．７Ｃ４／ミリモル特
殊活性）で６時間ウェルをパルスした。細胞収穫器を用
いてガラス繊維フィルター上に細胞を集め液体シンチレ
ーション計測器で放射能を測定した。ある実験で組かえ
剤ＩＬ　２　（ｒｌＬ−２：ＭＡ、ボストンのジエンツ
イーム）を２５Ｕ／ｙｕｌにおいて用いた。
試験前にミクロタイター板のウェルに予備被覆されたー
ｂＧ１９−４　１０μｆ／ｍｌを使って３日実験の最終
６時間の間に〔３Ｈ〕チミジン吸収量測定を行なった。
抗ＣＤ４５ｍＡｂ　９．４の溶液中濃度は１μｍ〜であ
って、１０■／ａの量でミクロタイター板上に固定され
た。細胞は４重に培養され平均が示された。標準誤差１
１％以下であった。
表■に結果をまとめて示している。
表　　　■ 培地　　　　　　　　　　　　０．３　　０．４　０．
３＋　　０．５０．５０．４ 抗ＣＤ３　　　　　　−　　１３７．９　１４３．５　
３２．３表Ｖは抗Ｃ’　Ｄ　３と共に固定化された抗Ｃ
Ｄ４５はＴ＃ｌ胞を７５チ以上も抑制したが溶液中の抗
（、’Ｄ４５は抑制しな一コｎへ− いことを示している。固定されたＣＤ４５の抑制効果は
ＰＭＡ又は外生ｒｌＬ２の最適以下の濃度であってさえ
明瞭であった。
抗ＣＤ３　　ｍＡｂ　（Ｇ　１９−４　）で刺戟後のＴ
細胞の増殖はまた固定化された抗ＣＤ３　　ｍＡｂ　　
および固定化された又は溶液中のＣＤ４５ＲｍＡｂ（Ｇ
１１５および３ＡＣ５）によっても測定された。増殖は
抗ＣＤ４５について上記のとおり測定された。抗ＣＤ４
５Ｒ愼ＡｂＧＩ−１５と３ＡＣ５は溶液中１ｐｆｆｌｒ
ｒｔｌ量で使すし１０　／’　ｆ／ｍｌ　ＫＭ　イて固
定された。黒色腫抗原ｐ９７に対する対照１ｇＧ、　ａ
ｍＡｂ　９６．５は溶液中１μｍ／縦量で非反応性対照
として使われ１０μ？／ｍｌで固定化された。衣■はこ
の実験結果を示している。
−１○６一 表　　　■ ｒＩＬ−２ 培地　　　　　　　　　　　　０．１　　０．５　　　
０．４抗ＣＤ３固定化十培地　　　　１４３．６　２８
１．５　　２９１．８＋　０＝１５抗ＣＤ４ＳＲ（液）
　　１３７．５　２６１．５　　３０９．４−３ＡＣ５
抗ＣＤ４５Ｒ（液）　　１７７．８　２６６．２　　２
９４．６＋９６．５　（液）　　１４７．９２６２．１
３１２．４（固定化）　　　　　　　　１０，１　　６
８．２　　　９５．５＋８６．５（固定化）　　　　　
１５４．４　２４７．１　　２８０．４ＣＤ４５Ｒ（３
ＡＣ５）又はＣＤ４５Ｒ（Ｇ１−１５）Ｂ　Ａ　ｂ　１
＋のいづれかが抗ＣＤ３と共に固定され、しかしＣＤ４
５ＲｍＡｂａが溶液中にない時には抑制は明白であった
。再びＰＭＡ又はｒＩＬ２のいづれもこの抑制にはかつ
ことができなかった。黒色腫抗原ｐ９７に対する対照ｍ
Ａｂ、９６．５は溶液中に存在するか又は抗ＣＤ３と共
に固定されたかいづれかのとき固定されたＣＤ３に応じ
て増殖を抑制しなかった。
固定されたＣＤ４５　　ｍＡｂ（９，４）によってみら
れる抑制が単にプラスチック表面からのＣＤ３　惧Ａｂ
（Ｇ１９−４）の夢動によるものでないことの確認のた
めミクロタイターウェルを抗ＣＤ３単独、抗ＣＤ３プラ
ス抗ＣＤ４５又は抗Ｃ“Ｄ３プラス対照ｍＡｂ、　９６
．５で被覆した。末梢血液単核細胞を４．８．１６ｊｄ
よび３２μＹ／ｗｉ１３＠度で単独又は抗ＣＤ４５　　
ｍＡｈ　９．４又は抗ＣＤＢ　ｔｎＡｈと同じ濃度の対
照ｍＡｂ　９６．５と共にホスフェート緩衝塩溶液中室
温で２時間培養してミクロタイター板壁に固定した抗Ｃ
Ｄ３ｍＡｂ　　Ｇ１９　４で刺戟した。牛血清アルブミ
ンを加えて更に蛋白質を附加させた。溶液中のＣ“Ｄ４
５　ｍ、Ａｂ　９．４による増殖を比較のため使用した
。ＩｎＷ／ｎｌ（ＱＰＭＡの存在有無で増殖を測定した
。細胞を３日間４重に培養し最終６時間の間〔３Ｈ〕チ
ミジンでパルスした。図９はこれらの実験結果を示して
いる。（平均値を示した、標準誤差は各点に２いて平均
値の１５係以下であった。）図９は（αン　ウェル被覆
のためより多い抗ＣＤ３が使われたからより多い増殖が
あった。従来報告（ゲラバートらのＪ、Ｉｍｍｘｎｏｌ
、１３８　：１６６０−１６６６（１９８７））と一致
；（リ　ＣＤ４５　　惧Ａｈ　９．４はすべての濃度に
おいて実質的に抑制をおこした。但し固定化された時の
みである；ぢよび（ｃ）同形対照９６．５　ｍＡ　ｂで
同時被覆することによって本質的に抑制はおこらなかっ
た、抗ＣＤ４５による抑制は抗ＣＤ　３の移動を生じな
かったことを示している；以上のことを示している。培
養物に１％ｆ　／ｙｎｌ　　Ｐ　Ｍ　Ａを添加するとｍ
Ａｂを４μｆ／　ｍｌ又はそれ以下で被覆した時のみ固
定抗ＣＤ４５による抑制を逆にするが、高濃度ではそう
ならない。（図９Ｂ）これは抗ＣＤ４５の臨界濃度がＰ
ＭＡの存在において抑制保持のためプラスチック表面上
杭ＣＤ３に接近している必要があることを示唆している
。
増殖をもたらすＴ細胞活性化は溶液中ｍＡｂ　９．３と
９６を用いてそれぞれＣＤ２ＢとＣ”　Ｄ　２を刺戟し
次いで第２工程で抗−ｋ　　ｍＡｂ　　１８７．１を用
い交差結合させて進行させつる。〔ヴアンリールらのＥ
ｕｒ、Ｊ、Ｉｍｔｎｗ？ＬｏＬ、　　１８　：１６７−
１７５（１９８８）′Ｂよびレドベツターらの１３８８
（１９８７）］この系に８けるＣＤ４５結紮効果を検べ
るため交差結合しているｍＡｂ　　１８７．１を含む又
は含まぬ溶液中で抗ＣＤ４５を抗ＣＤ２８に又は抗Ｃ’
ｌ）２にＩＩＯＴ− 加えた。〔上記ウエヤら、〕増殖を上記のとおシ〔ｓＨ
〕チミジン取込みによって測定した。抗ＣＤ２８　　ｍ
Ａｈ　９．３と抗ＣＤ２　ｍＡｋ　９．６を各１μり／
１濃度で活性化のため使用した。抗ＣＤ４５　ｍＡｂ　
９．４はμｍ／ｒｒＬｌで用（・また抗−ｋ　　ｍＡｂ
　　１８７．１対マウスｍＡｂの最終比４：１にする様
ｍＡｂ　１　Ｂ　７．１を抗体交差結合に使った。増殖
をτＩＬ２の存在（１００単位／ｍ〕）と非存在にお（
・て測定した。
表■は結果を示している。標準誤差は各点に２１．・て
平均値の１２％以下であった。
表　　　■ 培地　　　　−０，２０，３１，６０，４＋　　　６．
８　　４．２　　３７．６　　　２．５抗ＣＤ２Ｂ　　
　−０，２４，３４７，４０，４＋　　　１２．６　　
３６．１　　７２．５　　　９．６抗−ＣＤ２　−　０
．５　０．２　１２．７　　０．２＋　　　４．４　　
　７．０　　３７．３　　　４．０抗ＣＤ４５のみの添
加が外生デＩＬ２を要することな（ＣＤ２又はＣＤ２８
　　ｍＡｂｓのいづれかによって生じた細胞増殖又は増
加を促進できることは明らかである。（表■）すべての
場合他の刺戟剤なしでさえｒｌＬ２添加は更に細胞増殖
を増大した。これらの現象はＩＬ２の高親和性レセプタ
ー発現に対するＣＤ４５連結効果によるであろう。
（上記レドベツター） 反対に１８７．１抗−ｋ　惧Ａ６添加によってＣ”Ｄ２
又はＣＤ２Ｂに対する交差結合性ＣＤ４５はｃｎ４５単
独の刺戟効果を逆にしｒｌＬ２があってもなくともＣＤ
２又ＣＤ２８による刺戟を減少した。（表■）、これは
１８７゜１の非特異性抑制活性によるものではない、Ｃ
Ｄ４５　　ｍＡｂ９．４が含まれない場合ＣＤ２８又は
ＣＤ２刺戟は共に１８７．１によって促進されるからで
ある。
ＣＤ３、ＣＤ２およびＣＤ２８は、これらのレセプター
が細胞表面上に連結された場合（Ｃａ２＋）、の増加と
なる＄ シグナル形質導入路にカップルさせられる。〔レドベツ
ターらのＰｒｏｃ、ＩＶａｔ’１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　
、ＵＳＡ　　８４：１３８４１３８８（１９８７））［
Ｃａ”］、　　はＣＤ３、ＣＤ２＄ 一１１’３− 又はＣＤ２８レセプターを交差結合後ＣＤ４５　　犠Ａ
ｈ　９．４の存在下に２いて又はなしで測定された。（
図１０）この実鋏に２いてビオチン結合ｍＡｂを末梢血
液Ｔ細胞に結合させた後アグイジン添加によって細胞表
面に交差結合させた。インド−１をもった末梢血液単核
Ｔ細胞（ＯＲ，ジャンクションシティのモレキュラープ
ローブス）中ノ〔ＣｃＬ２＋〕　　増加は単独で又は抗
ＣＤ４５　ｍＡｂ　９．４又は抗ＣＤ４５ＲｆｌＬＡｂ
　３ＡＣ５と共にＴ細胞上のレセプターを交差結合後天
のと２り測定した；（条件は図１０に示している。） １、ＣＤ３レセプターをビオチン結合抗ＣＤ３　ｔｍＡ
ｂ　　Ｇ１９−４（２μｖ／１）とｔ−１，５分に２い
て交差結合きぜだ後アヴイジン（８ρ／虹）をｔ−５，
５分に加えた。（−）これを抗−ＣＤ４５　　窺Ａｈ　
　９．４（１０μｍ／祷）の存在におけるＣＤ３レセプ
ターの同じ交差結合（−−−−）と又はビオチン結合抗
（’、’Ｄ４５　　ｒｌＬＡｈ　９．４　（１０μ？／
酎）後アビジン添加（４８μ？）（・・・・・）と比較
した。ビオチン結合抗ＣＤ４５　　慨Ａｈ　９．４．　
（１０μ７／が）後アヴイジン（４０μｒ／ｍｌ）添加
の追加対照も使用した。（−−−−）（図１ＯＡ）； ２　抗ＣＤ３　　ｍＡｈ　　Ｇ１９−４（）２５μｒ／
ＩＩＬ＃）効果を抗ＣＤ３　　ｍＡｂ　　Ｇ１９　４と
抗ＣＤ　４５　　ｍＡｈ　　９．４のＣＤ３７Ｃ”Ｄ４
５ヘテロコンジュゲート（−・・・−）と比較した。（
図１０Ｂ）； ３、ＣＤ２レセプターをビオチン結合抗ＣＤ　２　　ｍ
Ａ　ｈ９．６　１０μｆ／ｒｒｔｌを時間３分迄加えて
交差結合させた後４０μｆ／ｍｌのアビジンは．５分で
添加した。（−）（図１０６）； ４、ＣＤ２Ｂレセプターを３分間に加えた１０μ？／ｍ
ｌのビオチン結合抗ＣＤ　２８　ｍＡｂ　９．３と交差
結合させた後１＝−３分においてアビジン４０　ｐ’ｊ
／ｍ、ｌ添加（−）の場合を、抗（、’１Ｊ）２８　ｍ
Ａｂ　９．３　１０／ｎ／ｍ１３と抗Ｃ’　Ｉ）　４５
　ｍＡ　ｂ９．４　１０μｍ／１を用いｔ−−３分にお
いてＣＤ２ＢとＣＤ４５を同時交差結合させた後アビジ
ンを８０μ？／酎をｔ−１，５分において添加（・・・
・・）した場合と比較した。
（図１０Ｄ）；および ５、ＣＤ４レセプターをｔ−−３分でビオチン結合抗Ｃ
ＤＡ　ｍＡｂ　Ｇ１７−２　１０μ？／酎の添加により
交差結合させた後ｔ−１５分で４０μｙ／ｍｌのアビジ
ンを添加した。
（−）これは０μ９／ｄのビオチン結合抗−ＣＤ４恒Ａ
ｈＧ１７−２および１０　ｐｔ　／ｒｕｇのビオチン結
合抗こＤ４、ｇＡｂ　９．４をｔ−−３分に添加してＣ
’　Ｄ　４とＣＤ４５を同時交差結合させた後のｔ−１
５分におけるアビジン８０μ？／−添加（・・・・）と
比較した。ビオチン結合抗Ｃ’　Ｉ）　４ｍＡｂ　Ｇ　
１７　２　（１０μｒ／ｒＩＬｌ）プラス抗ＣＤ４５ｔ
ｎＡｂ９．４（１０μり／彪）（結合していない）の後
ｔ−１，５分において４０μｙ／ａｔのアビジン添加の
比較も示されている。
（−・−）（図１１）。
図１ＯＡ−Ｅはこれらの実験結果を示している。
ＣＩＪ）３、ＣＤ２およびＣＤ　２’　８交差結合後に
みられる〔コ゛α２＋〕ｉの増加はビオチンの会合した
９、４の存在によって抑制されたことが明らかであった
。９．４がビオチン化されずビオチンにより交差結合し
ないときは抗ＣＤ３でおこったカルシウム動員量の僅か
な減少がなお認められた。
（図１０，４）Ｌかし完全な阻止はＣＤ４５とＣＤ３が
接近させられることが必要と思われた。更に抗−マウス
イムノグロブリン使用免疫螢光試験がヘテロコンジユゲ
ートが細胞表面上の両レセプターに結合しくデータは示
していない）また抗ＣＤ３０２５μｉが強いカルシウム
応答を引出しえることを示してさえも抗ＣＤ４５と抗Ｃ
Ｄ３のへテロコンジユゲートは直接には〔こ“α２＋〕
、を増加できなかった。
（図１０Ｂ）３ＡＣ５の様なＣＪ）　４５　ＲｍＡｂは
（、’　Ｊ）　２について示した様に、細胞レセプター
と反応性あるｍＡｂｓに連結した場合〔こ′ｃＬ２＋〕
ｉ応答を部分的に抑制できた。
（図１０６） ＣＤ　４５　ＲｍＡ　ｂによってできた部分抑制は一部
であるが全部でないＩ°細胞上のＣＤ４５Ｒイソ型蛋白
質の発現を反映している。（上記、レドベツター）。Ｃ
″Ｄ３、ＣＤ２およびＣ″Ｄ２Ｂ上の抑制効果と反対に
ＣＤ４へのＣＤ４５の連結は０“Ｄ４がそれ自体に交差
結合したとぎに比べて強い再現性の信号増大を与えた。
（図１０Ｅ）これは応答細胞数の増加なしに８こり、同
じＣ／Ｊ　４ボジテブ細胞がＣＤ４５とＣ’　Ｄ　４の
連結後、より感応性であったことを示している。故にＣ
Ｄ４５はそれと相互作用しているレセプターによってト
ランスメンプレイン信号を増減いづれにも調節−１１，
８− すると思われる。
こ“Ｄ４５の従来研究はそれがリンパ球活性を増減いづ
れにも調節作用すると示唆した。（上記レドベツター；
）・−プ；およびマートレル）、ＣＤ４５およびＣＤ４
５Ｈに対する可溶性ｍＡｂは小球に付着したＰＩｉＡ又
は抗ＣＤ３と共にＩＬ−２生成、ＩＬ−２レセプタ一発
現およびＴ細胞増殖の増加に共−刺戟性である。可溶性
抗ＣＤ４５はＣＤ２又はＣＤ２８　　ｍＡｂ　　と協同
作用する。（表Ｖ］）、これらの共同刺戟効果はＣＤ４
＋細胞に制限され、ＣＤ４を発現しないＣＤＦ３＋細胞
には見られない。これはＣＤ４５がＣＩＪ）３又はＣ“
Ｄ２の様な他の細胞表面抗原に対するその作用から明ら
かにＣＤ４に特徴的効果をもつという事実に一部よるも
のであろう。Ｃ”Ｄ４５がＣＤ４と緊密関係となったと
ぎそれはＣＤ４により伝達されたカルシウム信号を加速
又は増加するが、Ｃ“Ｄ３およびＣＤ２にカップルした
とぎはシグナル形質導入を阻止する。
上記実施例（４）は本発明のＣＤ４７ＣＤ４５ヘテロコ
ンジユゲート使用によって示されたとおｔ）ＣＤ４５を
Ｔ細胞レセプター〇Ｄ２、ＣＤ３、ＣＤ５又はＣＤ２８
の様なシグナル形質導入エレメントと接触させる条件の
もとで抗Ｃ″Ｄ４５の抑制効果が最も明らかにわかるこ
とを示している。
抗ＣＤ４５抗原は非常に速（リンパ球活性化に働らき、
通常３０乃至６０秒以内に検知できる細胞内遊離カルシ
ウム動員を阻止する。抗ＣＤ４５の促進効果はまたＣＤ
４５レセプターをＣＤ４レセプターの近（におくことに
よって示される。これらの結果はリンパ球上のレセプタ
ーと反応性のある分子を含むヘテロコンジュゲートがＴ
ＭＵ胞とＢ細胞を包含するリンパ球の活性と作用を促進
又は抑制するレセプターｍ」の相互作用をおこす別方法
を提供できることを示唆している。
本発明の多数の実施態様について記述したが本発明の基
本的構成はリンパ球、例えは他のリンパ球抗原ヘテロコ
ンジユゲート混合物の活性促進又はリンパ球作用の抑制
に導く更に他の実施態様となる様変更もできるのである
。したがって本発明の範囲は実施例によって明細書に記
述した特定実施態様によるよりもむしろ本発明の特許請
求の範囲によって定義されていることが認められるであ
ろう。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明の１実施態様の（Ａ）　　ＣＤ　３　／　
ＣＤ　４ヘテロコンジユゲート、Ｇ１９−４／Ｇｌ　７
−２又は（Ｂ）抗−ＣＤ　３モノクロナ一ル抗体、Ｇ１
９−４のいづれかの濃度変更による末梢血液リンパ球刺
戟における時間対原形質遊離カルシウム（〔Ｃα２＋）
、）濃度増加の比較曲線図である。 図２は本発明のＣＤ３７Ｃ’ｌ）４ヘテロコンシユケー
ト、Ｇ１９−４／Ｇｌ　７−２による末梢血液リンパ球
（ＰＢＬ）又はＣ″Ｄ４　　Ｔ細胞のいづれるの刺戟に
おける時間対〔ＣｃＬ２＋〕ｉ応答と応答する細胞パー
セントの比較曲線図である。抗−ＣＤ４モノクロナ一ル
抗体、（ＩＩ；１７−２による細胞前処理後のヘテロコ
ンジユゲートによる刺戟の抑制効果も示されている。 図３はＣＤ４　　Ｔ細胞上の本発明のＧｌ　９−４／Ｇ
ｌ　７−２へテロコンジュゲー）（ＩＩＩ）又は抗−Ｃ
Ｄ３モノクロナ一ル抗体、Ｇ１９−４（ロ）の５常Ｍ　
ＥＧＴＡ存在下における〔Ｃα２　〕、活性の比較滴定
曲線を示している。 図４は抗−ＣＤ３、Ｇ１９−４（・）又は本発明のＣＤ
３／ＣＤ４ヘテロコンジユゲート、Ｇｌ　９−４７Ｇ１
７−２（△）の１μｂ勺てよるＣＤ４　　Ｔ細胞刺戟に
おける時間対イノシトールホスフェート増加の比較図を
示している。 １−０とｔ−１０分における非刺戟対照、（Ｏ）のイノ
シト−ルホスフエート濃度が示されている。図Ａはイノ
シトールホスフェート１　（Ｉｎ５ｅｔ　）増加を示し
、図３はイノシトールホスフェ−）　２　（ＩｆＬｓｅ
ｔ）の増加を示し図Ｃはイノシトールホスフェート３（
ＩｆＬｓＰ３）の増加を示している。 図５はビオチン接合した抗ＣＤ４（Ｇ１７−２）により
、抗−ＣＤ３　（Ｇｌ　９−４　）、Ｇ１７−２、（、
’Ｄ３／ＣＤ４ヘテロコンジュゲー）　（Ｇｌ　９−４
／Ｇｌ　７−２　）又はアビジン７およびそれもの混合
物（図示）のいづれかにより前処理されたＣＤ４十Ｔ細
胞刺戟後Ｉｎｓ、、　　の増加を測定した別個の２実験
を示している。 図６はＰＭＡ（フォルボールミリステートアセテート）
又はＣＤ２Ｂに対する抗体と共に又はそれなしでＣＤ４
＋Ｔ細胞による〔３Ｈ〕−チミジン取込みによって示さ
れた様なＴ細胞増殖における抗ＣＤ３モノクロナール抗
体（ＣＤ３モノ）、ＣＤ３／ＣＤ３ホモコンジユゲート
（ＣＤ３ホモ）、ＣＤ４／ＣＤ４ホモコンジユゲート（
ＣＤ４ホモ）、７および本発明のＣＤ　３７　ＣＤ　４
ヘテロコンジユゲート（ＣＤ３＋４へテロ）の影響を示
している。 図７は３〃−チミジン取込み対Ｇ１９−４（ＣＤ３モノ
）＋ＰＭＡ（マーマ）、Ｇ１９−４＋抗ＣＤ２８（α−
ＣＤ２８）（一）、ＣＤ３／ＣＤ４ヘテロコンジユゲー
ト（Ｃ／１３＋４へテロ）＋ＰＭＡ（マ・・・・マ）、
ＣＤ３／ＣＤ４ヘテロコンジユゲート＋α−ＣＤ２８Ｃ
−）、ＣＤ３７ＣＤ３ホモコンジユゲート（ＣＤ　３ホ
モ）　＋ＰＭＡ（マー・−マ）又はＣＤ３／ＣＤ３ホモ
コンジユゲート＋α−ＣＤ２８（−ψ−）のいづれかの
濃度によって示される様なＣＤ４＋Ｔａ胞の増殖応答の
比較曲線図である。 図８はＰＨＡ（フィトへマグルテニン〕、本発明のＣＤ
３／ＣＤ、ヘテロコンジユゲート、Ｇ１９−４／Ｇ１７
−２、ＣＤ３７ＣＤ３ホモコンジユゲート、Ｇ１９−４
／Ｇ１９−４、対照としてＣＤ３／ＣＤ８ヘテロコンジ
ユゲート、（ン１９−４／Ｇ１０−１ｇよびＣＪ）　４
　／　ＣＤ　４ホモコンジユゲート、Ｇｌ　？−２／Ｇ
ｌ　７−２のいづれかによる３日間のＴ細胞刺戟後の第
１、第２又は第３細胞ザイクル通過ＣＤ４　　Ｔ細胞パ
ーセントを示している。 図９は〔３〃〕−チミジン取込み、単独（○）又はそれ
対抗Ｃ’ｌ）４５　　ｍＡｂ　　９．４　（ロ）又は抗
−ｐ９７　　ｍＡｂ９６．５（ロ）いづれかの濃度によ
って（Ａ）　　ＰＭＡなしで又は（Ｂ）　　ＰＭＡと共
に示される様な固定化抗ＣＤ３　ｍＡｂＧ１９−４によ
り生じたＴ細胞増殖反応抑制の比較図である。（溶液中
杭ＣＤ４５　ｍＡｂ　９．４による増殖（△）も比較の
ため示されている；平均値を示している；標準誤差〈１
５％である。） 図１０はＴ細胞単独上又は下記実施例４に記載のと８り
抗−Ｃ’　Ｉ）　４５　　ｍＡｂ　９．４又は抗ＣＤ４
５ＲｍＡｂ　　３ＡＣ５−１９へ− と共にレセプターと交差結合後の時間に対する〔ＣｔＬ
２＋〕増加によって測定されたとおりＴ細胞におけるシ
グナル形質導入のＣＤ４５レセプターによる調節曲線図
を示している。（各実験の〔Ｃα２＋〕ｉ平均値は左に
また応答細胞パーセントは右に示している。矢印はｍＡ
ｂ又はアビジン添加時間を示している。） 出　　願　　人　　オンコシエン 代　理　人　弁理士　　斉　藤　武　彦代　理　人　弁
理士　　川　瀬　良　治叶の（ｍｉｎ）　　　　　　　
　　　　岨１ｒｉｉ＋を而ｎ）ｖＦ面（ｍｉｎ３ ＦＩＧ、４ 手続補正書 平成１年６月５日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １事件の表示 平成１年特許願第８４１．４８号 ２発明の名称 リンパ球活性調節用抗体ヘテロコンジユゲート３補正を
する者 事件との関係　　　特許出願人 名称　オンコシエン ４代理人 願書に添付の手書き明細書及び図面の浄書６補正の内容

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、リンパ球上の抗原に結合しうる少なくとも２分子よ
    り成り、該分子は互いに交差結合しており、各分子は個
    々のリンパ球表面上にある異なる抗原と反応性をもつこ
    とを特徴とするリンパ球調節に有効なヘテロコンジユゲ
    ート。 ２、互いに交差結合している少なくとも２個の抗体分子
    より成り、各抗体がＴリンパ球表面上にある異なる抗原
    と反応性をもつことを特徴とするＴリンパ球活性化に有
    効な抗体ヘテロコンジユゲート。 ３、抗原がＴリンパ球表面上のＣＤ抗原である請求項１
    又は２に記載のヘテロコンジユゲート。 ４、抗原がＢリンパ球表面上のＣＤ抗原である請求項１
    又は２に記載のヘテロコンジユゲート。 ５、ヘテロコンジユゲートの１分子がＴ細胞レセプター
    又はその会合ＣＤ３抗原と反応性をもつ請求項１又は２
    に記載のヘテロコンジユゲート。 ６、ヘテロコンジユゲートの１分子がＣＤ５Ｔ細胞表面
    抗原と反応性をもつ請求項１又は２に記載のヘテロコン
    ジユゲート。 ７、上記分子が抗体である請求項１に記載のヘテロコン
    ジユゲート。 ８、ＣＤ３／ＣＤ４抗体ヘテロコンジユゲート。 ９、抗体ヘテロコンジユゲート、Ｇ１９−４／Ｇ１７−
    ２。 １０、ＣＤ３／ＣＤ２、ＣＤ３／ＣＤ６、ＣＤ３／ＣＤ
    ７およびＣＤ３／ＣＤ８より成る群からえらばれたこと
    を特徴とする抗体ヘテロコンジユゲート。 １１、ＣＤ５／ＣＤ４、ＣＤ５／ＣＤ６およびＣＤ５／
    ＣＤ８より成る群からえらばれたことを特徴とする抗体
    ヘテロコンジユゲート。 １２、ヘテロコンジユゲートの１分子がＣＤ４５抗原又
    はＣＤ４５抗原のイソ型蛋白質と反応性をもつ請求項１
    又は２に記載のヘテロコンジユゲート。 １３、抗体ヘテロコンジユゲートＣＤ３／ＣＤ４５。 １４、抗体ヘテロコンジユゲートＧ１９−４／９．４。 １５、ＣＤ２／ＣＤ４５、ＣＤ３／ＣＤ４５、ＣＤ４／
    ＣＤ４５、およびＣＤ２８／ＣＤ４５より成る群からえ
    らばれたものであることを特徴とする抗体ヘテロコンジ
    ユゲート。 １６、ＣＤ２／ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ３／ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ
    ４／ＣＶ４５Ｒ、およびＣＤ２８／ＣＤ４５Ｒより成る
    群からえらばれたものであることを特徴とする抗体ヘテ
    ロコンジユゲート。 １７、抗体がＦａｂおよびＦ（ａｂ′）＿２フラグメン
    トより成る群からえらばれた抗体フラグメントより成る
    請求項２又は７に記載のヘテロコンジユゲート。 １８、抗体がモノクロナール性である請求項２又は７に
    記載の抗体ヘテロコンジユゲート。 １９、抗体がキメラなものである請求項２又は７に記載
    のヘテロコンジユゲート。 ２０、Ｔリンパ球表面上の異なる２抗原に結合する親和
    力をもつことを特徴とするバイスペシフイツク抗体。 ２１、上記分子がリンパ球表面抗原と反応性をもつリガ
    ンドペプチドである請求項１に記載のヘテロコンジユゲ
    ート。 ２２、リンパ球を請求項２に記載の少なくも１のヘテロ
    コンジユゲートと接触させることより成るＴリンパ球活
    性化法。 ２３、リンパ球を請求項１又は２に記載のヘテロコンジ
    ユゲートと接触させることより成るＴリンパ球および／
    又はＢリンパ球の機能調節方法。 ２４、リンパ球を少なくとも１個の抗体をもつヘテロコ
    ンジユゲートと接触させることより成りかつ上記ヘテロ
    コンジユゲートの少なくとも１個の抗体がＣＤ４５細胞
    表面抗原又はＣＤ４５抗原のイソ型タンパク質と反応性
    をもつ請求項２３に記載のＴリンパ球および／又はＢリ
    ンパ球の機能調節方法。 ２５（ａ）Ｔリンパ球を請求項１に記載の少なくとも１
    個のヘテロコンジユゲートと接触させてリン球をインビ
    トロ活性化しかつ（ｂ）活性化したリンパ球を元の供与
    体に再注入する工程より成ることを特徴とするリンパ球
    の機能調節方法。 ２６、それぞれの分子が個々のリンパ球表面上の異なる
    抗原と反応性である、リンパ球上の抗原に結合しうる少
    なくとも２個の分子を交差結合させることを特徴とする
    リンパ球調節に有効なヘテロコンジユゲートの製造方法
    。 ２７、該分子が反応性である該リンパ球がＴリンパ球で
    ある請求項２６に記載の方法。 ２８、抗原がＴリンパ球表面上のＣＤ抗原である請求項
    ２６に記載の方法。 ２９、抗原がＢリンパ球表面上のＣＤ抗原である請求項
    ２６に記載の方法。 ３０、ヘテロコンジユゲートの１分子がＴ細胞レセプタ
    ー又はその会合ＣＤ３抗原と反応性をもつ請求項２６に
    記載の方法。 ３１、ヘテロコンジユゲートの１分子がＣＤ５Ｔ細胞表
    面抗原と反応性をもつ請求項２６に記載の方法。 ３２、上記分子が抗体である請求項２に記載の方法。 ３３、該分子がＣＤ３抗原と反応性の抗体及びＣＤ４抗
    原と反応性の抗体である請求項２６又は２７に記載の方
    法。 ３４、該抗体が抗体Ｇ１７−２に交叉結合した抗体であ
    る請求項３３に記載の方法。 ３５、該分子がＣＤ３抗原に反応性の抗体であり、かつ
    抗体がＣＤ６、ＣＤ７及びＣＤ８抗原に反応性の抗体よ
    り成る群から選ばれたものである請求項２６に記載の方
    法。 ３６、該分子がＣＤ５抗原と反応性の抗体であり、かつ
    抗体がＣＤ４、ＣＤ６及びＣＤ８抗原と反応性の抗体よ
    り成る群から選ばれたものである請求項２６に記載の方
    法。 ３７、分子の１がＣＤ４５抗原又はＣＤ４５抗原のイソ
    型蛋白質と反応性である請求項２６に記載の方法。 ３８、分子の１がＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ２８
    抗原に反応性の抗体より成る群から選ばれた抗体であり
    、かつ他の分子がＣＤ４５抗原と反応性の抗体である請
    求項２６に記載の方法。 ３９、分子の１がＣＤ２、ＣＤ４及びＣＤ２８抗原と反
    応性の抗体より成る群から選ばれた抗体であり、かつ他
    の分子がＣＤ４５Ｒ抗原と反応性の抗体である請求項２
    ６に記載の方法。 ４０、該分子がモノクロナール抗体である請求項２６乃
    至３９のいずれか１に記載の方法。 ４１、分子がＦａｂ及びＦ（ａｂ′）＿２フラグメント
    より成る群から選ばれた抗体フラグメントより成る請求
    項２６に記載の方法。 ４２、分子がキメラ抗体である請求項２６に記載の方法
    。 ４３、分子がリンパ球表面抗原と反応性のリガンドペプ
    チドである請求項２６に記載の方法。 ４４、該交差結合が化学的交差結合である請求項２６に
    記載の方法。 ４５、マレイミドブチリルオキシスクシンイミド及びＮ
    −スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
    オネートより成る群から選はれた試薬を用いて該化学的
    交差結合を行なう請求項４４に記載の方法。 ４６、請求項１又は２に記載の少なくとも１のヘテロコ
    ンジユゲートを有効成分とする伝染性疾病、癌、エイズ
    及び自己免疫性の治療剤。 ４７、Ｔ細胞不調又は機能障害を含む病気にかかつてい
    る患者のＴリンパ球上の請求項１又は２に記載のヘテロ
    コンジユゲートのカルシウム起動化活性をヘテロコンジ
    ユゲートの成分を構成する非コンジユゲート抗体の活性
    と比較測定して上記患者のＣＤレセプター機能不全を診
    断するための診断薬。 ４８、請求項８又は１２に記載のヘテロコンジユゲート
    を有効成分とする自己免疫症治療剤。
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