JP2613106B2 - リンパ球活性調節用抗体ヘテロコンジュゲート - Google Patents

リンパ球活性調節用抗体ヘテロコンジュゲート

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Description

【発明の詳細な説明】 ＜発明の技術分野＞ 本発明は新規の抗体ヘテロコンジユゲートおよびＴ細
胞とＢ細胞の様なリンパ球の活性調節におけるそれらの
利用に関する。特に本発明は各抗体がちがつたリンパ球
表面抗原と反応性である互いに結合した少なくとも２抗
体より成るヘテロコンジユゲートに関する。
これらのヘテロコンジユゲートはリンパ球に結合しそ
れらが反応しているそれぞれの細胞表面抗原を互いに物
理的に接近させる作用をしてリンパ球の物質導入及び増
殖の向上又は減少シグナルを生ずると思われる。本発明
の好ましい実施態様によればＴ細胞レセプターと反応性
ある抗体又はその会合したCD3複合体はＴ細胞の活性化
と機能促進のためCD2、CD4、CD6又はCD8の様な第２のＴ
細胞表面抗原と反応性をもつ抗体に交差結合する。他の
好ましい実施態様によればCD5T細胞表面抗原と反応性を
もつ抗体はリンパ球活性化と機能促進のためCD4、CD6又
はCD8の様な第2T表面抗原と反応性をもつ抗体に交差結
合する。更に他の実施態様において、CD45系統抗原と反
応性をもつ抗体はリンパ球活性化と機能を抑制するCD
2、CD3、CD5又はCD28の様な第２・Ｔ細胞表面抗原と反
応性をもつ抗体に交差結合する。また更に他の実施態様
におけるCD4抗原と反応性をもつ抗体はリンパ球活性化
と機能を促進するためCD45抗原と反応性をもつ抗体と交
差結合する。本発明の抗体ヘテロコンジユゲート、方
法、および組成物は伝染病、癌、エイズおよび自己免疫
症の様な病気治療においてリンパ球を調節して細胞免疫
反応を改良するに有効である。
＜従来の技術及び発明が解決すべき課題＞ この技術分野においてＴ細胞ともいうＴリンパ球は少
なくとも２の明瞭方法で免疫反応を伝達すると知られて
いる。細胞毒性Ｔ細胞は特異的標的細胞の溶解に関与す
るがヘルパーＴ細胞はＢ細胞の増殖と分化を助けて抗原
に特異的な抗体が生成される。〔例えばマツクミラン出
版社のJ.W.キムボール著Introduction To Immunology,
２版11−13章参照〕いづれの型のＴ細胞も活性化されて
Ｔ細胞セレプター（Ti）又はＴ細胞表面上のその会合CD
3複合体（CD3/Tiレセフター複合体ともいう）と抗原存
在細胞上の抗原との相互作用によつてその作用をする。
〔例えばE.LラインヘルツらのImmunol.Rev.,81,95−129
（1984）に記載の“人のＴリンパ球上のクロノテイピツ
クな表面構造：抗原レセプタ複合体の官能的および生化
学的分析”参照〕 しかし抗原が抗原存在細胞上の特定なMHC（主組織適
合性複合体）をエンコードした抗原と会合したときにの
みＴ細胞は抗原に応答することが発見されている。した
がつて抗原のＴ細胞認識は抗原と会合したMHCをエンコ
ードした生成物グラスによつて制限されるといわれてい
る。このMCH制限の結果、細胞毒性Ｔ細胞はクラスI MHC
抗原と会合した抗原により活性化されたヘルパーＴ細胞
はクラスII MHC抗原と会合した抗原により活性化され
る。〔例えばJ.W.キムボール著上記Introduction To Im
munology,286−89ページ、348−58ページ参照〕 更にCD3/Tiレセプター複合体の他にクラスII MHCで制
限されたＴ細胞はCD4とよばれる細胞表面抗原を発現
し、一方クラスI MHCで制限されたＴ細胞はCD8細胞表面
抗原を発現する。MHC制限とCD抗原発現との間のこの関
連はＴ細胞活性化において制限されたMHC抗原はCD抗原
の自然リガンドである、即ちペルパーＴ細胞上のCD4抗
原は抗原存在細胞（例えば大食細胞）上のクラスII MHC
分子と相互作用しまた細胞毒性Ｔ細胞上のCD8抗原は特
異的標的細胞（例えばビールス感染細胞）上のクラスI
MHC分子と相互作用するとの仮説に導かれている。〔例
えばF.エムリツヒらのEur.J.Immunol.,17,529−34（198
7）記載の報文“Ｔ細胞レセプター複合物とサブセツト
に特異的な分化抗原との交差結合は人のCD4とCD8T細胞
中インターロイキン２レセプター発現を刺戟する”参
照〕またＴ細胞による抗原認識は第４級複合体によつて
もできると提案されている、この場合Ｔ細胞表面上のCD
3/Tiレセプター複合体はCD4又はCD8の様なCD抗原と共同
して適当なMHCとした抗原と共同している抗原を“見
る”。〔例えばP.アンダーソンらのJ.Immunol.,139（N
o.3）:678−82（1987）記載報文“T3（CD3）とT4（CD
4）の交差結合による停止Ｔリンパ球増殖促進”参照〕 本出願に使用のCD抗原はこれら抗原の単一化命名法を
制定する国際機関により定められたとおり細胞表面上の
モノクロナール抗体（mAbs）の反応性によつてきめられ
る天然にある細胞表面の分化抗原である。〔例えばA.J.
マツクミカエル著Leukocyte TypingIII、（英国オツク
スフオードのオツクスフオード大学版、1987）を参照〕
多数のCD抗原は分子的にクローン化されておりしたかつ
て十分特徴づけられている。〔Id〕、よく知られたCD抗
原にはパン−Ｔ抗原、CD3、CD2、CD5、CD6およびCD7、
ヘルパーＴ細胞サブ集団に特異的なCD抗原、CD4および
サツプレツサーＴ細胞サブ集団に特異的なCD抗原、CD8
がある。〔例えばJ.A.レツドベツターらのPerspectves
in Immunogenetics And Histocompatibility,6巻および
E.ヘイズ著リンパ球表面抗原325−40（1984）（米国組
織適合性と免疫遺伝学学会、ニユーヨーク、1984）参
照〕CD28は大半のＴ細胞上にある抗原である。〔ヤマダ
らのEur.J.Immunol，15,1164−1169（1985）〕これらの
分化抗原は上記のとおりレゼプターとし働らきまたＴ細
胞のシグナルな形質導入に結び付いていると思われる
が、これらのＴ細胞活性化の実際の機能は知られていな
いので、研究の大目標である。
例えばＴ細胞活性化におけるCD抗原の役割決定研究が
分子レベルで行なわれている。CD3/Tiレセプター複合体
とmAb又は抗原いづれかとの反応がＴ細胞内のトランス
メンブレイン“シグナル”を発生すると知られている。
このシグナルはしばしばイノシトールホスフエート
〔１、２および３〕生成と細胞質的遊離カルシウム
（〔Ca2+〕ｉ）濃度増加を特徴とする。〔例えばJ.B.イ
ムボーデンらのJ.Exp.Med., 161,44,−56（1985）および
J.B.イムボーデンらのJ.Immunol.，138（No.5）、1322
−24（1987）中の“人のＴ細胞クローンによる抗原認識
がイノシトールトリホスフエートの増加となる“参照〕 このシグナル発生はしかしＴ細胞を刺戟し増殖させる
には十分でないだろう。〔Id.873において〕実験条件の
もとでＴ細胞表面上のCD3抗原が例えば細胞を附属細胞
の存在で（例えば単球FCセプターとCD3に対する抗体のF
C部分との相互反応によつて）又は固体支持体上の抗体
固定化によるいづれかによつて交差結合した抗体と反応
させて交差結合させたときＴ細胞は増殖する。
故に固体支持体に結合しているCD3/Tiレセプター複合
体に対するmAbsはＴ細胞を刺戟し１部はCD3抗原の交差
結合によりまた１部はCD3/Tiレセプター複合体のインタ
ーナリゼーシヨンがＴ細胞活性化を阻止し易いそのイン
ターナリゼーシヨン防止により〔例えばJ.A.レドベツタ
ーらのJ.Immunol.,136,3945−52（1986）中の報文“CD3
結合原子価およびCD3細胞表面複合体のインターナリゼ
ーシヨンがＴ細胞の第２シグナルへの反応を調節する”
参照〕増殖させる。〔例えばP.アンダーソンらの上記報
文およびC.ウオーカーらのEur.J.Immunol., 17:873−80
（1987）中の報文“抗−CD3抗体と第２抗−Ｔ細胞抗体
の交差結合によるＴ細胞の活性化：機構およびサブセツ
ト特異的な活性化”参照〕しかし治療用途のＴ細胞のイ
ンビボ活性化には固体支持体上に固定化された抗CD3使
用は実質的に困難である。この使用には固体支持体、普
通小球の患者への注射があるが、これは動脈閉止又は閉
塞の様な患者健康上である危険を伴う。
更に生理学的条件のもとで、このCD3抗原の交差結合
によるCD3/Ti刺戟でさえもCD3/Tiと他CD抗原間のＴ細胞
表面上の相互作用による増進が必要な最小シグナルだけ
を働かせることが提案されている。〔P.アンダーソンら
の上記文献678ページ参照〕。
更にＴ細胞活性化におけるCD抗原相互作用の実際効果
については不明確である。例えば自然のCD4損失変異体
の分析〔P.マラツクらのJ.Exp.Med., 158,1077−91（198
3）中の報文“Ｔ細胞上の大部分の組織適合性複合体に
拘束された抗原レセプタII.L3T4生成物の役割”参照〕
並びに遺伝子移動実験〔例えばD.ゲイらのNature,328:6
26−29（1987）中の文献“人のＴ−細胞蛋白質CD4およ
び主組織適合性複合体HLA−DR抗原間の官能的相互作用
“参照〕はCD4の発現は特定抗原に対するＴ細胞反応を
増進することを示唆しまた抗原濃度が適当以下のときは
又は抗原/MHC−エンコード抗原に対するＴ細胞の結合性
が低いときはCD4は特に重要な役を演ずることを示唆し
ている。〔A.レグニーヤービグローらのEur.J.Immuno
l.，16:1385−90（1986）中の報文“附属分子およびＴ
細胞活性化Ｉ、抗原セレプター結合性がLEA−１およびL
3T4に対するモノクロナール抗体による抑制に対するＴ
細胞感度に差別的影響する、”またS.シヤウらのJ.Immu
nol.,134（No.5）:3019−26（1985）中の報文“細胞毒
性Ｔリンパ球（CTL）クローンの抗−T3および抗−T4
（しかし抗−LFA−１ではない）モノクロナール抗体に
よる抑制に対する感受性はCTL−標的相互作用の“結合
性”によつて変る”参照〕更にCD3およびCD4と反応性で
あるmAbsが同じ固体支持体上に固定されたときは固定化
された抗体にさらされたＴ細胞増殖は促進された。同様
にCD3およびCD4に対するmAbsが固体支持体に結合したと
きＴ細胞の増殖はCD3単独に対する抗体への暴露で認め
られたよりも促進された。〔P.アンダーソンらの上記報
文参照〕 しかし可溶性CD4モノクロナール抗体についての研究
は可溶性抗体がＴ細胞反応を阻むことを示しCD4がＴ細
胞活性化を阻む負シグナルを送ることを示唆している。
〔例えばJ.P.バンクらのJ.Exp.Med．163:1294（1985）;
J.P.タイトらのJ.Cell,Mol.Immunol.，２:179−90（198
6）中の“Ｔ細胞活性化におけるL3L4の役割:L3T4はIa−
結合性蛋白質および負シグナルをトランスジユースする
レセプタの両方であつてもよい";およびP.M.ロソフらの
Cell, 49,845−53（1987）中“マイトジエンと抗原で活
性化されたシグナル形質導入におけるL3T4の役割”参
照〕 Ｂ細胞としても知られているＢリンパ球は抗原生成性
（形質）細胞の前駆体である。Ｂ細胞が抗原によつて刺
戟されるとヘルパーＴ細胞と大食細胞の協同作業を要し
Ｂ細胞は増殖し形質細胞とメモリー（記憶）Ｂ細胞に分
化する。Ｂ細胞上に確認されているCD抗原にはCD19、CD
20、CDw40、CD45、CD45RおよびBgp95（未だCD命名をう
けていない）がある。〔マツクミカエル、Leukocyte Ty
ping III、上記〕 興味のある他のCD抗原はCD45白血球共通抗原（Ｌ−1C
A、T200又はLy−５としても知られている）である。C45
は造血直系の細胞に限られる分子量範囲（Mr）180乃至2
20KDaの主糖蛋白質料を含有する。〔トロウブリツジら
のProc.Nat′l.Acad.USA 72:157−161（1975）；コム
ロらのImmunogenties1:452−456（1975）；シールドら
のImmunogenties；９;423−433（1979）；ダルチヨーら
のEur.J.Immuno．10:737−744（1980）；およびオメア
リーらのJ.Exp.Med．152:842−852（1980）参照〕CD45
の明白なイソ型蛋白質（isoforms）は別のmRNAスプライ
シングから生ずる。このイソ型蛋白質はＴとＢリンパ球
のサブ集団上に区別して発現される。人CD抗原に対する
いくかのモノクロナール抗体（mAbs）は全CD45イソ型蛋
白質によつて分子量220、205、190および180KDaに分け
られたエピトープを認識する。〔コボルドらのLeukocyt
e Typing III上記、15章788−803ページ〕。しかし他の
mAdsはＢリンパ球およびＴ細胞のサブ集団上に選択的に
発現されているCD45Rと命名された220KDa CD45のイソ型
蛋白質のみを認識する。〔上記コボルド文献；ダルチヨ
ーらのJ.Exp.Med.,153:753−765（1981）；モリモトら
のJ.Immunol.134:1508−1515（1985）；およびレドベツ
ターらのJ.Immunol. 134:1819−1825（1985）〕他のmAd
s、UCHL−１は外皮胸腺細胞および活性化又はメモリー
Ｔ細胞部分集合に制限される180KDa種に選択的に結合す
る。
最近ねずみ〔トマスらのCell,41:83−93（1985）およ
びバークレーらのEMBO J.6:1259−1264（1987）〕、マ
ウス〔サガらのProc.Nat′l.Acad.Sci.USA 83:6940−69
44（1986）;W.C.ラシユケのProc.Nat′l,Acad.Sci.USA8
4:161−165（1987）；トマスらのProc.Nat′l,Acad.Sc
i.USA84:5360−5363（1987）およびサガらのProc.Nat′
l,Acad.Sci.USA84:5364−5368（1987）〕および人〔ラ
ルフらのEMBO J.6:1251−1257（1987）およびストロイ
リらのJ.Exp.Med.166:1548−1566（1987）〕CD45（Ｌ−
CA）の一次構造はcDNAヌークレオチド配列から推論され
ている。CD45は大705−707アミノ酸原形質セグメント、
22アミノ酸トランスメンブレインセグメントおよび400
乃至550アミノ酸範囲の細胞外領域と１体となつたメン
ブレイン蛋白質である。単一遺伝子の一次複写（トラン
スクリプト）のスプライシングで生じた別のmRNAによつ
て生成されているCD45の種々のイソ型蛋白質はちがつた
細胞外領域をもつが、同じトランスメンブレインが原形
質セグメントをもつ。〔上記バークレーおよびラルフお
よびスロイリ文献〕原形質セグメントは約300の残基を
もつ相同の強く保護された２領域をもつ。
CD45の機能を解明しようとする研究は矛盾する結果を
生じている。〔上記コボルド文献〕人又はマウス抗原に
対するmAdsはＴとＢ細胞増殖、〔ハーブらのJ.Immunol.
133:10−15（1984）；バーナボイらのEur.J.Immunol.1
7:1461−1466（1987）およびミツトラーらのJ.Immunol.
138:3159−3166（1987）〕、抗体生成性細胞生成、〔ヤ
クラのJ.Exp.Med.157:1077−1088（1983）〕およびナチ
ユラルキラー（NK）細胞および細胞毒性Ｔ細胞活性〔シ
ーマンらのJ.Immunol.127:982−986（1981）;W.ニユー
マンのProc.Nat′l.Acad.Sci.USA 79:3858−3862（198
2）：ナカヤマらのProc.Nat′l.Acad.Sci.USA 76:1977
−1981（1979）およびレフランコイスらのNature（Lond
on）314:449−452（1985）〕を抑制すると報告されてい
る。しかしある条件ともとで抗−CD45mAdsもＴ細胞増殖
を促進すると報告されている。〔上記コボルト文献：上
記レドベツター文献およびマートレルらのEur.J.Immuno
l.17:1447−1451（1987）〕上記のトマスは80KDaの分子
の原形質部分はその保護された２相同領域と共にCD45の
機能に重要な役割を演ずると示唆している。最近この領
域は人の胎盤の可溶性および粒状部分両方から分離され
た主低分子量蛋白質チロシンホスフアターゼに相同であ
ると発見された。〔トンクスらのJ.Biol.Chem.,263:672
2−6730（1988）：およびチヤーボヌーらのProc.Nat′
l,Acad.Sci.USA85:7182−7186（1988）〕これはCD45が
他の膜と結合した分子との相互作用によつて働らく膜で
囲まれた蛋白質チロシンホスフアターゼであることを示
唆している。
＜課題を解決するための手段＞ 本発明はリンパ球上の抗原に係合しうる少なくとも２
個の抗体分子より成り、これらの分子は単体物質の介在
なしにそれ自体が交差結合剤によって互いに直接に交差
結合しており、各分子が個々のリンパ球表面にある異な
る抗原と反応性をもつリンパ球の調節に有効なヘテロコ
ンジュゲート、その製法及びそれを含むリンパ球機能調
節用医薬組成物を提供するものである。これらのヘテロ
コンジユゲートのあるものはＴ細胞の活性化においてＴ
細胞中のその（〔Ca2+〕ｉ）増加能力がCD3抗原単独に
対する抗体において見られるよりも約２桁低い蛋白質濃
度において測定されたとおりシグナル形質導入を促進す
る。
また本発明のヘテロコンジユゲートはリンパ球の活性
化と働らきを抑制しうるものを包含する。
本発明の好ましい実施態様によればCD2/Tiレセプター
複合物又はその成分部分と反応するモノクロナール抗体
はCD2、CD4、CD6又はCD8抗原の様なＴ細胞表面上の第２
抗原と反応するモノクロナール抗体と交差結合してＴ細
胞の活性化におけるシグナル形質導入を促進するヘテロ
コンジユゲートを生成する。他の好ましい実施態様によ
ればCD5T細胞表面抗原と反応性をもつモノクロナール抗
体はCD4、CD6又はCD8の抗原の様なＴ細胞表面上の第２
抗原と反応するモノクロナール抗体に交差結合する。特
に好ましい実施態様はCD4に対する抗体に交差結合したC
D3に対する抗体より成るヘテロコンジユゲートに関す
る。
更に他の好ましい実施態様にすればCD45T細胞表面抗
原と反応するモノクロナール抗体はCD2、CD3、CD5又はC
D28の様なＴ細胞表面上の第２抗原と反応するモノクロ
ナール抗体に交差結合してリンパ球の活性化と増殖を抑
制するヘテロコンジユゲートを生成する。特に好ましい
実施態様はCD45抗原又はCD45のイソ型蛋白質と反応する
抗体に交差結合している抗体CD3より成るヘテロコンジ
ユゲートに関する。
本発明はまた細胞免疫応答生成におけるリンパ球活性
化の促進又は抑制のため本発明のヘテロコンジユゲート
によるリンパ球処理方法を包含する。したがつて本発明
のヘテロコンジユゲートはその少なくも１種の製薬有効
量と製薬上使用できるキヤリヤーより成る医薬組成物に
使用できる。故に本発明のヘテロコンジユゲート、方法
および組成物は例えば伝染病、癌、エイズおよび自己免
疫症の治療に免疫応答を増進又は調節する免疫療法に使
用できる。
ここに記載の本発明の十分な理解をえるために次の明
細を記述する。
本発明は新規の抗体ヘテロコンジユゲートおよびリン
パ球活性化および機能の促進と抑制におけるその用途に
関する。特に本発明は互いに交差結合しておりまた各抗
体は異なるリンパ球細胞表面抗原と反応性がある少なく
も２抗体より成るヘテロコンジユゲートに関する。活性
向上のためコンジユゲートの１抗体はＴ細胞レセプター
（Ti）又はそれと会合したCD3抗原複合対と反応性であ
りまた他の抗体はCD抗原（例えばCD2、CD4、CD6又はCD
8）の様な第2T細胞表面抗原と反応性である。またコン
ジユゲートの１抗体はCD5抗原と反応性でありまた他の
抗体がCD4、CD6又はCD8の様な第2T細胞表面抗原と反応
性である。ヘテロコンジユゲートCD4/CD45もＴ細胞活性
促進に至る。抑制にはヘテロコンジユゲートの１抗体が
抗原のCD45族（イソ型蛋白質）と反応性であると好まし
く、また他の抗体はCD2、CD3、CD5又はCD28の様なＴ細
胞表面抗原と反応性である。
論理に拘束されることなく本発明のヘテロコンジユゲ
ートはリンパ球と反応したとき細胞表面上のそれぞれの
抗原に結合しこれらの抗原を互いに接近させることによ
りＴ細胞活性化中にヘルパーＴ細胞と抗原のある細胞の
接触の際Ｔ細胞レセプターとCD4間におこる集団形成に
そつくりなステツプを演ずると信じられる。〔例えばA.
クツパーら合Proc.Nat′l Acad.Sei.USA.84:5888−5892
（1987）中の“CD4（L3T4）分子とＴ細胞レセプターの
集団形成はヘルパーＴ細胞と抗原のある細胞の特異的直
接相互作用によつておこる”参照〕細胞表面上のＴ細胞
抗原間の相互作用はCD3/Tiで仲介されたトランスメンブ
レインシグナル発生を促進し、したがつてＴ細胞活性化
を促進すると思われる。
CD45抗原のリンパ球に対する影響の機構解明されてい
ないが、本発明のCD45ヘテロコンジユゲートは他のリン
パ球レセプターと物理的に会合させたときそれらを官能
的に修飾する様働らき例えばCD3抗原の様なあるCDレセ
プターの凝集後に制御する。CD45の原形質領域と人の胎
盤の主蛋白質チロシンホスフアターゼ間の最近記載され
た相同性は前者が実際に他の膜と会合している分子上、
例えばCD3のゼタ鎖上のキーチロシル残基を脱りん酸化
して白血球のシグナル（形質）導入を変更する様働らく
膜に囲まれた蛋白質チロシンホスフアターゼであると示
唆する〔クラウスナーらのJ.Biol.Chem.262:12654−126
59（198）〕CD45はまた通常抗原によるシグナル（形
質）導入を調節する様働らくCD4と会合した蛋白質チロ
シンキナーゼを活性を修飾するだろう。〔ラツドからの
Proc.Nat′l Acad.Sei.USA.85:5190−5194（1988）〕ま
たCD4と会合したチロシンキナーゼはそのチロシル残基
上のCD45抗原を酸化しその活性を変える。これは下記実
施例に示すとおりCD4CD5レセプターの交差結合の結果と
してえられた独特な向上活性を説明できるだろう。この
モデルは重要なチロシル残基のりん酸化反応が先におこ
りまたそがカルシウムの動員に必要であること予言する
であろう。他の膜と結合している蛋白質と接近してのみ
働らく完全膜状酵素は特異的細胞表面分子に対する蛋白
質チロシンキナーゼ／ホスフアターゼ調節局限化に役立
つ。故に本発明ヘテロコンジユゲートはリンパ球の活性
化と機能と促進又は抑制に働きうると信じられる。
本発明によるＴ細胞調節、即ち抑制はパン−Ｔ細胞調
節又はＴ細胞の特殊サブセツト又はクローンの調節でも
よいのである。パン−Ｔ細胞調節はＴ細胞とＴ細胞の全
プール又は集合を調節するヘテロコンジユゲートとの接
触から生じる。このヘテロコンジユゲートは全Ｔリンパ
球上に発見されるＴ細胞抗原と反応する抗体より成る。
この様な１ヘテロコンジユゲートは本発明のCD3/CD2ヘ
テロコンジユゲートであり、CD3とCD2はパン−Ｔ細胞抗
原である。〔例えばJ.A.レドベツターらの上記Perspect
ives Immunogenetics And Hitocompatibility中の表１
参照〕 しかし適当なヘテロコンジユゲート使用によつてより
特異的な調節ができる。例えばヘルパー又はサプレツサ
ーサブセットの様なＴ細胞の特殊サブ集団のみを活性化
したい場合にはこれは１抗体がその特殊Ｔ細胞サブ集団
と反応体である、即ち１抗体はそのサブ集団に特異性の
抗原と反応する必要のある、ヘテロコンジユゲートを構
成することによつてできる。コンジユゲートの他の抗体
はパン−Ｔ細胞抗原に特定であると好ましい。この実施
態様によれば本発明のCD3/CD4又ぱCD5/CD4ヘテロコンジ
ユゲートは明確にいえばヘルパーＴ細胞活性化を促進す
る（CD4はヘルパーＴ細胞サブセツトに特異的である）
が、CD3/CD8又はCD5/CD8ヘテロコンジユゲートは詳述す
ればサプレツサーＴ細胞サブ集団の活性化を促進する。
（C8はサプレツサーＴ細胞サブセツトに特異的である） また本発明のCD3/CD45ヘテロコンジユゲートは明確に
いえばCD45抗原をもつＴ細胞活性化を抑制する。CD45レ
セプターのイソ型蛋白質Ｔ細胞の部分集合上あらわされ
るので、CD15イソ型蛋白質と反応する抗体をもつ本発明
のヘテロコンジユゲートもこれらのＴ細胞部分集合調節
用に使用できる。
結局クロノチピツク（clonotiypic）な調節を即ち特
定のＴ細胞クローンの調節を望む場合、本発明のヘテロ
コンジユゲートは抗クロノチピツク（Ti）抗体をその１
成分としてもつ、即ち調節を求められたクローンのＴ細
胞レセプターの種々の領域と反応する抗体をもつ。故に
クロノチピツクなＴ細胞が特定の抗原、例えば腫瘍又は
ウイルス性抗原をうまく見えない又はそれに反応できな
い場合又はその応答に抑圧されている場合このＴ細胞に
特異性の抗−クロノチピツク抗体（Ti/CD4、Ti/CD8、Ti
/CD6、Ti/CD2）より成る本発明のヘテロコンジユゲート
はこれらのＴ細胞クローン調節に使用できる。またＴ細
胞の特定クローン抑制のためTi/CD45（又はTi/CD45イソ
型蛋白質）より成るヘテロコンジユゲートが使用でき
る。本実施態様によりヘテロコンゲユゲートのTi成分は
特定のＴ細胞の抗体本質的に抗原の代りをすると見るこ
とができる。ヘテロンシュゲートの他の抗体はパン−Ｔ
細胞に特異性な又はサブセツトに特異性な抗体又はCD45
又はCD45イソ型蛋白質と反応する抗体でもよい。
この様に本発明のヘテロコンジユゲートを成す抗体は
リンパ球表面抗原と反応するどんな抗体も包含する。好
ましい実施態様によればコンジユゲートの１抗体はTi又
はCD3T細胞抗原と反応性である。更に他の実施態様によ
ればCD3T細胞表面抗原と反応する抗体はＴ細胞表面上の
CD4抗原と反応性の抗体に交差結合する。
本発明のヘテロコンジユゲートを成す他の抗体には他
のCD抗原、例えばリンパ球上のCD2、CD5、CD6、CD7、CD
8、CD28と反応性の抗体があるが、これらに限定するも
のではない。〔例えばA.バーナードら著Leukocyte Typi
ng（ハイデルベルグ，スプリンゲルフエヤラーグ,198
4）；およびJ.A.レドベツターらの上記、Perspectives
In Immunogenetics And Histocompatibility．参照〕故
に他の好ましい実施態様によればCD5T細胞表面抗原と反
応する抗体はCD4、C6又はCD8抗原と反応性の抗体と交差
結合して本発明のヘテロコンジユゲートを生成する。更
に他の好ましい実施態様はリンパ球細胞表面上のCD45抗
原又はCD45イソ型蛋白質と反応する抗体に交差結合して
いるCD3T細胞表面抗原と反応性の抗体である。
本発明のヘテロコンジユゲートを成す抗体はポリクロ
ナール性又は好ましくはモノクロール性であり、抗体の
活性結合領域をもつ完全な抗体分子又はフラグメント、
例えばFab又はＦ（ab′）２であり、かつこの分野にお
いて確立された技術によつて製造できる。〔例えば下記
実施例１−３にあげられた抗CD3、抗CD4、抗CD5および
抗CD2モノクロナール抗体製造文献参照〕更にCD2、CD
3、CD4およびCD5抗原の様なCD抗原の多くに対するモノ
クロナール抗体は市販されている、（カリフオルニア州
マウンテンビウ，ベクトンデイツキンソン）又は国際白
血球型検査所から入手できる。モノクロナール抗体を使
うならば抗体ははつかねずみ又は人のもの又はキメラの
抗体でもよい。〔例えばV.T.オイのBiotechniques.４
（No.3）:214−221（1986）中の“キメラ抗体”参照〕
更に本発明はまだバイスペシフイツク（bispecific）又
は組換えモノクロナール抗体をも包含し、その抗体の第
１の特異性は第1T細胞抗原と反応性でありまた第２の特
異性は第２のＴ細胞抗原に向けられる。このバイスペシ
フイツク抗体は米国特許第4,474,893号に記載のとおり
カドロマ（quadroma）又はトリオマ（trioma）細胞から
製造でき又は化学的に製造できる。〔ブレンナンらのSc
ience:229:81−83（1985）〕 本発明のヘテロコンジユゲートを成す抗体はヘテロバ
イフアンクシヨナル交差結合剤、GMBS（マレイミドブチ
ルオキシサクシニド）又はSPDP（Ｎ−サクシニミジル３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）使用の様な
この分野で知られた方法によつて互いに共有結合的に結
合できる。〔例えば共有原子価抗体カツプリング法論の
ためのD.M.ウエイヤら著Handbook of Experimental Imm
unology.第４版（1986年）巻1,免疫化学中pp.31.4−31.
12のR.R.ハーデイーの“流動血球計算法に使用のための
蛍光性蛋白質の精製とカツプリング”参照〕 したがつて本発明は同一リンパ球上の異なるリンパ球
抗原と反応する少なくとも２分子より成るどんなヘテロ
コンジユゲートも包含し、そのヘテロコンジユゲートは
リンパ球の活性化と機能の促進と抑制に働らくのであ
る。本発明はＴ細胞並びにＢ細胞上の抗原とも反応性を
もつヘテロコンジユゲートを対象としている。
抗体の他に本発明のヘテロコンジユゲートはリンパ球
レセプターに結合しうるリガンドをもつていてもよい。
例えばCD4レセプターはリガンドgp120（人の免疫不全ウ
イルス又は“HIV“の糖蛋白質レセプター）と反応性が
あると示されている。〔リンスレーらのJ.Virology62:3
695−3702（1988）〕故にリガンドgp120に交差結合した
抗CD3抗体より成るヘテロコンジユゲートはCD3およびCD
4レセプターとの交差結合によつてＴ細胞活性向上に使
われるだろう。ちがつたＴ細胞レセプターと反応するリ
ガンドに交差結合しているＴ細胞レセプターと反応性の
あるリガンドより成る他のリガンドコンジユゲートも考
えられる。
本発明のヘテロコンジユゲートおよびこれらのＴ細胞
活性化における使用法はＴ細胞表面上のCD3抗原と反応
する抗体がCD4抗原と反応する抗体と会合して本発明の
新規CD3/CD4ヘテロコンジユゲートを生成する好ましい
実施態様によつて例証される。このヘテロコンジユゲー
トによるCD4+T細胞処理はCD3のみに対する抗体による細
胞処理と比較して細胞間〔Caa+〕動員の著しい増加とイ
ノシトールホスフエート１、２、および３生成の実質的
増加で示されるとおりＴ細胞のヘルパーサブセツト、に
おけるシグナル形質導入の増加となつた。CD3/CD4ヘテ
ロコンジユゲートのこのシグナル増加性活性はCD3/CD3
およびCD4/CD4ホモコンジユゲート又はそれらの混合物
がこの増加した活性を示さないので単にオリゴマー化に
よるものではなかつた。また抗CD3と抗CD4抗体混合物が
この活性を増すよりもむしろ減少することはこの技術分
野で従来からわかつている。〔例えば上記P.M.ロゾフら
の文献〕更にヘテロコンジユゲートによつて示された増
加した活性はCD4にする可溶性モノクロナール抗体によ
るＴ細胞予処理によつて抑制された。
またCD3/CD4ヘテロコンジユゲートはＴ細胞活性化に
新規の官能的活性をあらわした。即ちヘテロコンジユゲ
ートはCD28と反応性のあるモノクロナール抗体存在のも
とでCD4+T細胞の増殖をおこしまた100ng/mlの様な低濃
度でさえCD28刺戟につて十分共マイトジエン的（comito
genic）であつた。この様な共マイトジエン性はCD3に対
する抗体単独又はCD3/CD3又はCD4/CD4ホモコンジユゲー
トを使用して発見されなかつた。更に本発明のCD3/CD4
ヘテロコンジユゲートはCD28モノクロナール抗体との組
合せでＴ細胞を細胞サイクルをとおし著しくドライブで
き、刺戟の初め３日以内に細胞の大部分を第２サイクル
に入れることが発見された。反対にCD3に対する抗体単
独又はCD3/CD3又はCD4/CD4ホモコンジユゲートは著しい
細胞サイクル変換をおこさなかつた。
更にCD3/CD4ヘテロコンジユゲートはＴ細胞表面上CD3
とCD4両抗原のモジユレーシヨンをおこしCD4の表面発現
の減少となることが発見された。この結果はCD3に対す
る固定化抗体を用いた場合であると従来示されたとおり
ヘテロコンジユゲートがＴ細胞レセプターをＴ細胞表面
に簡単に固定しないことを示している。〔例えばJ.A.レ
ドベツターらのJ.Immunol.,上記参照〕 CD3/CD4ヘテロコンジユゲートによつてえられた結果
はＴ細胞表面上のCD4高原がCD3/Tiレセプター複合物とC
D4抗原間の物理的相互作用によりCD4+ヘルパーＴ細胞の
Ｔ細胞活性化中シグナル形質導入に活動的ポシチブな役
割を演ずることを示している。
シングル形質導入を増すCD3/CD4ヘテロコンジユゲー
トの能力の基礎をなす分子機構はよく諒解されていな
い。CD4のCD3/Tiとの相互作用の少なくとも１効果はイ
ノシトールホスフエート生成促進にあると思われCD4が
膜ホスフオイノシチドのCD3/Tiによつておこる加水分解
を促進しイノシトールトリホスフエート生成となること
を示唆している。これは出願人らの実験結果によるもの
であつて、イノシトールフスフエートにより生ずるCD3/
CD4ヘテロコンジユゲートの活性は細胞と可溶性CD4モノ
クロナール抗原との反応によつて抑制されることを示し
ている。この抑制はCD3/Tiのみが効力の小さいシグナル
トランスジユーサー（transducer）であるならば、CD4
とCD3/Tiの抗体により生じた解離の結果であろう。また
CD4とその抗体の独立した相互作用はイノシトールホス
フエート生成を抑制するマイナス信号を伝達する。
イノシトールトリホスフエート（InsP3）の生成がＴ
細胞中の原形質カルシウムの動員を仲介すると信じられ
るので、CD4とCD3/Tiの相互作用も細胞間蓄積からのカ
ルシウム放出を促進すると思われる。〔Ca2+〕動員にお
けるCD3/CD4ヘテロコンジユゲート対CD3に対する抗体の
薬量−応答曲線比較はCD4とCD3/Tiが接近して、即ちCD3
/CD4ヘテロコンジユゲート使用によつて刺戟されたと
き、CD3/Tiが単独で刺戟されたとき（図３参照）よりも
検出できる〔Ca2+〕：応答はＴ細胞上のずつと少ないレ
セプターの相互作用からえられることを示している。故
に本発明のCD3/CD4ヘテロコンジユゲートの１性質はレ
セプター低占有度におけるそのＴ細胞活性化能力であ
る。
イノシトールホスフエート生成とカルシウム動員はＴ
細胞活性化に伴なう信号でありＴ細胞増殖に導くから本
明細書に示した結果は作用機構に関係なく本発明のCD3/
CD4ヘテロコンジユゲートがＴ細胞活性化と増殖促進に
有効であることを明確に示している。
本発明はまたCD3/CD4ヘテロコンジユゲート同様Ｔ細
胞活性化におけるよい信号発生能力をあらわす他のヘテ
ロコンジユゲートも包含する。例えば本発明のCD3/CD2
ヘテロコンジユゲート、CD3/CD6ヘテロコンジユゲー
ト、CD3/CD7ヘテロコンジユゲートおよびCD3/CD8ヘテロ
コンジユゲートもカルシウム動員に強い活性をあらわ
す。更に本発明により多数の抗CD5をもつヘテロコンジ
ユゲート（例えばCD5/CD4ヘテロコンジユゲート、CD5/C
D6ヘテロコンジユゲートおよびCD5/CD8ヘテロコンジユ
ゲート）も構成されまたＴ細胞中の〔Ca2+〕に強い活性
をあらわした。
CD45抗原又はそのイソ型蛋白質と反応する抗体をもつ
ておりリンパ球活性化と機能の抑制又はＴ細胞活性化と
機能の促進に有用である本発明のヘテロコンジユゲート
はCD3抗原と反応性のある抗体がCD45抗原と反応性ある
抗体と会合して本発明の新規ヘテロコンジユゲートを生
成する好ましい実施態様によつて例示される。このヘテ
ロコンジユゲートによるＴ細胞処理は細胞内カルシウム
動員の著しい減少によつて示されるとおりＴ細胞のCD3
で仲介された活性化中止（トランスメンブレイン信号）
となつた。
またCD3、CD2、CD5又はCD28の様なＴ細胞の表面上の
種々のCDレセプターとCD45レセプター間の相互作用誘導
はモノクロナール抗体を使つてなされリンパ球上のCD45
レセプターを同一リンパ球上の他のCDレセプターと交差
結合させた。この交差結合は細胞表面上の共通レセプタ
ーの交差結合により生じたＴ細胞抗原のホモ凝集体生成
からおこる原形質遊離カルシウム濃度（〔Ca2+〕ｉ）増
加をなくした。固定化された抗CD3モノクロナール抗体
刺戟によりはじまつたＴ細胞増殖は同一表面上で固定化
されたとき抗CD45抗体又は抗CD45R抗体によつて抑制さ
れた溶液中ではそうではなかつた。同様にCD2とCD28レ
セプターのそれぞれ抗−CD2と抗28抗体による刺戟後の
Ｔ細胞の増殖はCD45抗体が抗CD2抗体又は抗CD28抗体の
いづれかに交差結合したとき抑制されたが、抗CD45抗体
が別個に細胞表面に結合したときには抑制されなかつ
た。これらの結果はＴ細胞上のCD45又はCD45Rの様なCD4
5イソ型蛋白質と反応性のある抗体およびCD抗原と反応
する抗体より成るヘテロコンジユゲートが細胞調節に有
効であることを示唆している。
反対にＴ細胞上のCD4レセプターのホモ凝集体形成に
より生じた〔Ca2+〕ｉ増加はモノクロナール抗体を使つ
てCD4レセプターがCD45レセプターに交差結合したとき
強く促進された。故にＴ細胞上のCD4に対する抗体およ
びCD45又はCD45Rイソ型蛋白質と反応性のある抗体より
成るヘテロコンジユゲートもCD4にポジチブな全細胞又
はCD45イソ型蛋白質の発現であらわされるCD4細胞のサ
ブセツトのＴ細胞機能促進に使用できる。
本発明のヘテロコンジユゲートはリンパ球調節に有効
であり、したがつて伝染病、癌、エイズおよび自己免疫
症の様な病状の細胞免疫反応の調節に使用できる。これ
らのヘテロコンジユゲートは特にＴ細胞の欠失又は不調
の間な病状における細胞免疫反応調節に便利である。
例えばCD45イソ型蛋白質はある自免疫状に異常にあら
われることが示されている。〔ローズらのProc.Nat′l
Acad.Sci（USA）82:7389−7393（1985）〕したがつてCD
45レセプター又はCD45イソ型蛋白質と反応する少なくと
も１分子をもつ本発明のヘテロコンジユゲートは自免疫
症におけるリンパ球機能調節に有効であろう。
また本発明のヘテロコンジユゲートは後天的免疫不全
症候群（エイズ）による患者の免疫感応向上に有効であ
る。CD4抗原はエイズに応答できる人の免疫不全ウイル
ス（HIV）のレセプターの役をすると知られている。CD4
はＴ細胞のウイルス感染中HIVのgp120外皮糖蛋白質が結
合するレセプターであると信じられている。〔例えばL.
A.ラスキーらのCell,50:975（1987）とM.カワルスキー
らのScience,237:1351（1987）参照〕HII感染後CD4の細
胞表面発現が下方調整されまたCD4mRNA濃度が減少す
る。〔J.A.ホクシーらのScience234:1123−1127（198
6）中“４（CD4）蛋白質中の変質とHIVで感染した細胞
中のmRNA"参照［エイズ可溶性抗原に対する免疫感応減
少を示すこともよく確立されている。〔例えばH.C.レイ
ンらのNew.Eng.J.Medh,313（No.2）:79−84（1985）中
の“後天性免疫不全症候群をもつ患者の免疫機能の定量
分析”参照〕インビトロ研究によつて精製HIVgp120はク
ローン形成性刺戟に対するＴ細胞応答を抑制できること
がわかつた。この結果は出願人らがCD4に対する可溶性
モノクロナール抗体を用いて見た影響と同じである。
〔D.L.マンらのJ.Immunol.,138:2640−2644（1987）中
の“HTLV−III大外皮蛋白質（gp120）はPHAによつて生
じたリンパ球胚子発生を抑制する“参照〕故にエイズ患
者に見られる免疫抑圧はCD4抗原表情におけるHIV感染の
効果に関係すると提案できる、即ちHIV感染御おこるＴ
細胞上のCD4の下方調整は細胞の信号能力を減少するこ
とによつて免疫感応に影響し、抗原に答えてＴ細胞活性
化減少となる。このモデルを支持して出願人らはCD3に
刺戟された遊離カルシウム濃度増加はHIVに感染した細
胞において損なわれることを発見している。〔G.P.リネ
ツトらのScience,241:573−576（1988）の“HIVに感染
したＴ細胞はCD3/抗原レセプター通路をとおして選択的
トランスメンブレイン信号欠失をあらわず”参照〕この
観察は本発明のヘテロコンジユゲート、特にCD3/CD4ヘ
テロコンジユゲートがHIV感染から生じているＴ細胞機
能障害の研究又は治療に有効である。
本発明はまた病状における細胞免疫反応調節のため本
発明のヘテロコンジユゲート使用によるイン ビトロ又
はインビボのいづれかにおけるリンパ球処理方法を包含
する。
本発明の１実施態様によればヘテロコンジユゲートは
Ｔ細胞のイン ビトロ活性化に利用できる。この活性化
は患者から採取したＴリンパ球を本発明のヘテロコンジ
ユゲートの少なくとも１とイン ビトロ接触させＴ細胞
を活性化した後元の供与体に再注入することにより行な
われる。〔例えばS.A.ローゼンベルグらのJ.Biol.Resp.
Modif.,3:5501−5511（1984）中の“リンパ様細胞とイ
ンターリユーキン２の全身投与による癌の免疫治療法”
参照〕この治療法にはＴ細胞と他の免疫変調剤とのイン
ビトロ共培養又は予備培養がある。
別の実施態様によればヘテロコンジユゲートは出来れ
ばインターリユーキン−２（IL−２）、発育素又はCD5
の様な効果をねらう抗体〔例えばE.A.クラークらのImmu
nol.Today,7:267−270（1986）中“効果をねらう抗体に
よる免疫反応増進”参照〕およびCD28（下記実施例１参
照）の様な他の薬剤と共に患者にヘテロコンジユゲート
を注射しぃてＴ細胞のイン ビボ活性化に使用できる。
処理方法に関係なくFab又はＦ（ab′）２の様な抗体フ
ラグメント、キメラ抗体又はバイスペシフイツクな抗体
より成るヘテロコンジユゲート使用に有効である。
本発明のヘテロコンジユゲートはまた静脈内、経口、
皮下、腹腔内又はリンパ管内の様な普通の投与法を用い
てイン ビボ投与できるが、上記投与法に限定するもの
ではない。静脈内投与法が好ましい。
ヘテロコンジユゲートを含む本発明の製薬組成物は固
体、準固体および液体服用形態、例えば錠剤、ピル、粉
末、溶液又は懸濁液、坐薬、重合体ミクロカプセル又は
ミクロヴエシクル、リポゾームおよび注射用溶液など種
々の服用形態にできるが、上記に限定するものではな
い。好ましい形態は投与方法と治療用途によるものであ
る。
ヘテロコンジユゲート組成物は人の血清アルブミンの
様な血清蛋白質、ホスフエートの様な緩衝物質、水又は
塩類又は電解液などの分野で知られた普通の調剤用キヤ
リヤーを含んでもよい。
本発明のヘテロコンジユゲートの最有効投与法と用法
は病気の軽重と経過、患者の健康と治療に対する応答お
よび医師の判断による。したがつてヘテロコンジユゲー
ト用量は個々の患者に対し規定する必要がある。とにか
く本発明のヘテロコンジユゲートの有効薬量は約１乃至
約100mg/m2である。Ｔ細胞のイン ビトロ治療のために
は109細胞当りヘテロコンジユゲート薬量約200μｇ乃至
約2mgが使われる。
本発明のヘテロコンジユゲートはまたＴ細胞の欠失又
は不調などの病気をもつ患者に与えられたＴ細胞表面抗
原、例えばCD抗原のレセプター機能測定のため診断に使
用できる。シグナル形質導入（実施例１参照）と適当対
照物測定用上記カルシウム試験を用いて平常人と罹病者
からのＴ細胞の本発明特定ヘテロコンジユゲートによる
活性化を比較してCD機能の欠失を測定できる。例えば本
発明のCD3/CD4ヘテロコンジユゲートは可溶性抗−CD3単
独でみられる濃度より低い蛋白質濃度において〔Ca2+〕
動員を促進する。故にこの低薬量において実際にCD4レ
セプター機能が測定されている。これはこの薬量におけ
るCD3/CD4ヘテロコンジユゲート活性を阻止する可溶性
抗−CD4能力によつて反映される。同様にCD3/CD8ヘテロ
コンジユゲートの低薬量によつてCD8レセプターの機能
測定ができる。この薬量においてヘテロコンジユゲート
は癌および自己免疫症の様な種々の病状における特殊CD
レセプター機能欠失の検出に使用できる。またカルシウ
ム試験は適当な単一抗体対照物が行なわれる限り本発明
のどんなヘテロコンジユゲートのどんな薬量においても
試験できる、即ちヘテロコンジユゲートの活性はその成
分をなしている非結合抗体の活性と比較する必要があ
る。〔例えば1987年３月13日公告E.L.ラインヘルツらの
ヨーロッパ特許出願221,768号参照〕 ＜実施例＞ 本発明が更に十分に諒解される様下記実施例を記載す
る。実施例は単に例証するためのもであつて、これによ
つて本発明の範囲を限定すると解釈すべきではないので
ある。
実施例 1. 次の実施例は本発明の新規のヘテロコンジユゲートの
製造法と特性を記述するものである。この実施態様によ
つてCD3と反応する抗体はCD4と反応する抗体に考査結合
してエヘロコンジユゲートにより処理されたCD4+（即ち
ヘルパー）Ｔ細胞活性化に強いトランスメンブレイン信
号を出す様な新規CD3/CD4ヘテロコンジユゲートを生成
した。
本発明のCD3/CD4ヘテロコンジユゲート製造 本実施態様のヘテロコンジユゲート製造に使われるCD
3とCD4抗体はそれぞれG19−４（Balb/c.IgG1）とG17−
２（Balb/c.IgG1）であつた。これらの抗体はJ.A.レド
ベツターとE.クラークのHuman Immunolgy,15:30−43（1
986）中の“扁桃胚中心と外套域Ｂ細胞サブセツトの表
面表現型と機能”およびJ.A.レドベツターらのMolecula
r Immunology24（No.12）:1255−1261（1987）の“CD4
抗体特異性をもつ免疫グロブリンライトチエーンダイマ
ー”に記載のとおり製造した。また本実施態様のヘテロ
コンジユゲート構成に使用できる他の抗CD3および抗CD4
モノクロナール抗体は市販品を入手できる。（例えばそ
れぞれFL.クールター社のT3およびCA.ベクトンデイツキ
ンソンのLeu−３）G19−４とG17−２抗体は腹水液から
塩沈澱とDEAEクロマトグラフにより生成した後使用前に
透析と0.45μフイルターをとおし過して製造した。
２モノクロナール抗体を上記R.R.ハーデイーのフイコ
エリトリンカツプリングについて記載のとおりヘテロバ
イフアンクシヨナル（異種２官能性）交差結合剤、GMBS
（CA.ラジヨラのCalbichem.）および５−イミノチオレ
インHCl（IL.ロツクフオードのピヤスケミカル社）と1:
1モル比において結合させた。えたヘテロコンジユゲー
トはシユーパーローズ６（スエーデン、ウプサラのフア
ーマシア）FPLCサイズ排除クロマトグラフイーにより遊
離抗体から分離し、ヘテロコンジユゲートのフルオレセ
インに直接結合した抗CD3と抗CD4モノクロナール抗体の
結合阻止能力検査により両CD3とCD4との反応性を試験し
た。このCD3/CD4ヘテロコンジユゲートをG19−4/G17−
２と命名した。
本発明のCD3/CD4ヘテロコンジユゲートによるカルシウ
ム動員促進 次にG19−4/G17−２ヘテロコンジユゲートの細胞中の
原形質カルシウム動員促進能力をG19−４（抗CD3）単独
の活性と比較試験した。使用細胞はフイコル−パイパク
上遠心分離した後プラスチツクに附着させ大部分の単球
を除去して末梢血液から精製した人の末梢血液リンパ球
であつた。
細胞内の〔Ca2+〕ｉ増加をP.S.ラピノプイチらのJ.Im
munol.,137（No.3）:952−961（1986）中の“PHA又は抗
CD3によるマイトゲン刺戟後の細胞内遊離カルシウム反
応におけるＴ細胞間の異質性、インド−Ｉの刺戟的使用
と流動細胞計算による免疫蛍光”に記載のとおりのイン
ド−１（OR.ユーゲンのモレキユラープローブス）およ
び50HH/2150型流動細胞計算器（MA.ウエストウツドのオ
ルトジアゴノスチツクシステム社）を用い測定した。単
に細胞（５×107/ml）は細胞膜をとおし浸透し原形質中
加水分解されて不透過物トラツプ型となるアセトキシ−
メチルエステル（OR.ジヤンクシヨンシテイのモレキユ
ラープロブース）と培養することによりインド−１（in
do−１）で負荷した。培養は示されたインド−１濃度を
持つ媒質中37℃で45分間行なつた。次いで細胞を洗い新
培地中に2.5×106/mlに再懸濁させ分析まで暗室温中で
蓄えた。各試験にインド−１負荷した細胞を培地で１×
106/mlに稀め37℃で平衡させた分光蛍光計と上記ラビノ
ヴイツチにより記載された流動細胞計算法を用いて測定
を行なつた。時間に対する平均インド−１紫／青蛍光比
を計算したプログラムによつてヒストグラムを分析し
た。また時間対細胞応答パーセントを対照細胞の比につ
いて２標準偏差であるインド−１比の値を先づ測定した
プログラムによつて分析したプログラムによつて分析し
た後時間に対するこの出発値以上の細胞パーセントをプ
ロツトした。全流動細胞計算値についてＸ（時間）軸上
100点があつた。
図１に示すとおりCaa+濃度（〔Ca2+〕ｉ）増加に要し
たG19−4/G17−２濃度はG19−４単独使用で要した濃度
よりも1.5−２桁低かつた。更に免疫蛍光によるCD4+細
胞増加は〔Ca2+〕ｉ活性と応答細胞パーセントの対応増
加を生じたのでG19−4/G17−２ヘテロコンジユゲート活
性はCD4+T細胞に制限された。故に図２に示すとおり末
梢血液リンパ球がG19−4/G17−２ヘテロコンジユゲート
によつて刺戟されたとき細胞の平均最大〔Ca2+〕ｉ応答
は約1300nMであつて約60％の細胞が反応した。しかし細
胞のCD4+サブセツトを分析したとき、平均最大〔Ca2+〕
ｉ応答は＞10,000nMであり＞95％の細胞が応答した。更
にCD4+細胞上のヘテロコンジユゲート活性は細胞を５μ
g/ml G17−２（抗CD4）で５分間前処理し、次に0.4μg/
mlのヘテロコンジユゲート処理によつて殆んど完全に抑
制された。
図２に示すとおりCD8ネガチプ、CD11ネガチプ、CD16
ネガチプおよびCD20ネガチプ細胞上のゲーテイイング
（gating,通門）によつてCD4+細βを分析した。CD4+細
胞についてこのネガチプ選択は末梢血液リンパ球をフイ
コエリトリン（PE）と会合した2H7、CD20と反応性をも
つモノクロナール抗体〔例えばE.A.クラークらのProcb.
Nat′l.Acad.USA,82:1766−1770（1984）中の“人のＢ
細胞活性化におけるBp35細胞病面ポリペルトドの役割
“参照〕、FC−２、CD16に対するモノクロナール抗体、
〔例えばC.アナセツテイらのJ.Immunol.,139（No.6｝:1
772−1779（1987）中の“羊赤血球結合蛋白質（CD2）と
FC−レセプター（CD16）の交差結合による天然キラ一細
胞中のカルシウムフラツクス誘発細と細胞崩壊活性促
進”参照〕、G10−１、CD8に対するモノクロナール抗
体、〔例えばJ.A.レドベツターらのJ.Immunol.,134:425
0−4254（1985）中の“人のチムス−ロイケミア様抗原
とCD8分子間共有結合”参照〕および60.1、CD11と反応
するモノクロナール抗体、〔例えばJ.P.バンヨンらのLe
ukocyte Typing III.884−47ページ中の“モノクロナ
ール抗体研究会で説明された中性好生白血球凝集体中の
LFAフアミリーのアルフアトとベータ鎖上のエピトープ
差別関係”参照〕を着色し＞95％CD4ポジチブである非
着色細胞上のゲーテイングして行なつた。ヘテロコンジ
ユゲートにより影響されたものが原形質源からのカルシ
ウム動員であつたかどうか見るため、キレートしたがつ
て細胞外カルシウムを除去する5mM EGTA〔エチレンギコ
ール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−N,N,N′,
N′−テロラ酢酸〕の損再の存在においてG19−4/G17−
２ヘテロコンジユの比較滴定を行なつ打た。図３はEGTA
存在下におけるG19−4/G17−２ヘテロコンジユゲートに
よるカルシウム動員能力のほぼ２−log増加があつたこ
とを示している。細胞外カルシウムの存在におけら終点
までの滴定は活性のほぼ２−log増加を示した。（デー
タは示していない）。
CD3又はCD4抗原に結合している原子価が〔Ca2+〕ｉへ
のCD3/CD4ヘテロコンジユゲートの影響を原因となるこ
とを排除するため出願人らはCD3/C4ヘテロコンジユゲー
トと比較するためCD3/CD3およびCD4/CD4ホモコジユゲー
トを構成した。ホモコンジユゲートはCD3/CD4ヘテロコ
ンジユゲートに対し上記のとおり構成され、それぞれG1
9−4/G19−４およびG17−2/G17−２とそれぞれ命名され
ている。下記表１に示すとおり、CD3/CD3モオコンジユ
ゲートモCD3/CD3とCD4/CD4ホモコンジユゲート混合物も
〔Caa+〕ｉへのCD3/CD4ヘテロコンジユゲートの促進効
果と同じではなかつたこの結果はCD3/CD4ヘテロンジユ
ゲートの活性向上がヘテロコンジユゲートの原子価機能
ではなくしたがつて多分これらの抗原とヘテロコンジユ
ゲートの相互作用からおこるCD3とCD4分子の物理的接近
から生ずることを示唆している。更にヘテロコンジユゲ
ートとホモコンジユゲートは間接着色流動細胞計算を用
いる結合試験において遊離抗体よりも稍活性が小さかつ
た。（データは示していない）故にCD3/CD4ヘテロコン
ジユゲートの独特な活性はヘテロコンジユゲートの第２
特異性に原因するCD3結合親和力への影響に関係ありそ
うもない。
〔Ca2+〕ｉ応答試験はインド−１をもち上記のとおり
PEと結合した抗−CD20、抗CD8および抗CD16で着色した
末梢血液リンパ球を使用した。非着色細胞は＞95％CD4+
細胞をなすと分析された。ピーク平均応答は刺戟後初め
の５分以内におこつた。
本発明CD3/CD4ヘテロコンジユゲートにるイノシトール
ホスフエート合成への効果 Ｔ細胞における原形質カルシウム動員がイノシトール
トリホスフエート（InsP3）の生成によつて仲介される
と思われるので、出願人らは生成CD4+T細胞をCDのみに
対するモノクロナール抗体によるか又はCD3/CD4ヘテロ
コンジユゲートによるかづれかで刺戟後イノシトールホ
ースフエートの増加を測定した。
CD4+T細胞をC.H.ジユーンらのMol.Cell.BIOL.,7（No.
12）:4472−4481（1987）中の“CD28経路を含んでいる
Ｔ細胞増殖はシクロスポリン−抵抗体インターロイキン
２遺伝子発現と関連している”文献記載のとおり精製し
た。簡単にいえば、末梢血液リンパ球は実験員の白血球
泳動後フイコール／ハイパーク密度勾配遠心分離法によ
つてえられた。Ｔ細胞のCD4+サブセツトはCD8+、CD1
1+、CD16+、CD14+およびCD20+細胞を飽和量の適切なモ
ノクロナール抗体で先づ被覆した後磁性免疫吸収による
ネガチブ選択によつて分離できる。（抗CD14モノクナー
ル抗体、20.3以外の先に言及し抗体の大部分はK.カマウ
ンらのClin.Immunolegy and Immunopathology,29:181−
195（1983）中の“モノクロナール抗体によつて確認さ
れた人の単球一組織球分別抗原”記載のとおり製造し
た。）この方策は止まつている末梢血液Ｔリンパ球の上
にCD4とCD8表面抗原の相互の重複しない分布を利用し
た。細胞を３回洗浄して非結合抗体を除去した後山羊の
抗−マウスイムノグロビリンで被覆された磁性粒子（M
A.ケンブリツジのアドヴアンスドマグネチツクインステ
イチユート）と共に培養し、また小粒被覆細胞を磁性分
離によつて除去した。一般に流動細胞計算により算定し
たときCD4+が98％以上でありまた非特異性エステラーゼ
の染色により限定したとき単球0.1％以下を含む約500×
106CD4+T細胞が回収された。
精製したCD4+T細胞を４μg/ml PHAと40μCi/ml myo−
２〔3H〕−イノシトール（37MBg/ml;IL.アーリントンハ
イツのアマーシヤム社）を追加された10％加熱失活され
た牛胎児血清を追加したPRMJ1640（“培値”）中に２−
４×106細胞〜ml濃度で再懸濁し空気中CO25％の雰囲気
で37℃で培養した。72時間後細胞を３回洗い10mM LiCl
を追加した“培値”中に細胞５×106/ml濃度に再懸濁し
た。20分培養後G19−４又はG19−4/G17−２ヘテロコン
ジユゲートをｔ＝０において加え最終濃度を１μg/mlと
した。次いで種々の時点で５×106細胞試料をとり出し
エツペンドルフ5414遠心分離機で10秒間沈降させた。培
地吸引後細胞ペレツトに氷冷10％TCA（w/v）1mlを加え
た。900×ｇ遠心分離によつて５分間不純物除去後、上
澄液を６容量のジエチルエーテルで抽出した後中和し
た。フオーメート形ダウエツクス１×８（100−200メツ
シユ）（CA.リツチモンドのBio−Rad）を用い、陰イオ
ン交換クロマトグラフイーによつて〔3H〕−イノシトー
ルホスフエートを分離しBiO−Safe2（IL.マウントプロ
スペクト、リサーチプロダクツ社）中で液体シンチレー
シヨン光分検査法により定量した。3H化されたイノシト
ールホスフエート測定用のこの方法はJ.B.イムボーデン
らの上記、“Ｔ細胞抗原レセプターによるトランスメン
ブレイン信号”およびJ.B.イムボーデンらの上記、“人
のＴ細胞クローンによる抗原認定はイノシトールトリフ
スフエートの増加となる”に記憶されている。
図４が示すとおり１μg/mlにおいてヘテロコンジユゲ
ート刺戟はイノシトールホスフエート１、２、および３
生成を実質的に増加したが、G19−４のみではイノシト
ールホスフエート１の僅かな増加となつた。非刺戟細胞
の3H化されたイノシトールノスフエートの実験回路（ｔ
＝０）と終点（（ｔ＝10分）における濃度を示さおれて
いる。
図５に示された追加実験において、CD4に対する遊離
モノクロナール抗体、G17−２はヘテロコンジユゲート
によりおこつたイノシトールホスフエート応答を阻止す
るとが認められた。G17−２は遊離抗CD3モノロナール抗
体、G19−２に対するイノシトールホスフエート応答を
阻止しなかつた。これらの実験によればCD4+T細胞は〔3
H〕−イノシトール（40μCi/ml）−およびPHA（４μg/
l）を含む培地中72時間培養され、十分洗われた後10mM
LiClを含む培地に再懸濁され37℃で20分培養された。Z1
7−２〔J.W.コツデイングのMonoclonal Anticodies Pri
nciples and Practice,230ページ（1983年アカデミツク
プレス）記載のとおりにビオチン結合した〕を次に選択
試料に加えた。５分後G19−４、G17−２、G19−4/G17−
２ヘテロコンジユゲートおよびアヴイジンを示したとお
り加え更に１分間培養をつづけた。10％TCA中で細胞試
料（107細胞／試料）分解後〔3H〕−イノシトールホス
フエートを抽出し陰イオン光かクロマトグラフイーで分
離し上記のとおり定量した。別個の２実験を図５に示し
ている。３倍の細胞試料の平均＋／−sem（標準誤差）
を示しまたモノクロナールの抗体の最終濃度（μg/ml）
を図示している。
故に実験データは本発明のヘテロコンジユゲートのイ
ノシトールホスフエート生成における促進効果のみでな
くCD4に対する可溶性抗体がこのＴ細胞応答を阻止する
ことも示している。したがつてデータはＴ細胞応答刺戟
におけるCD4抗原のなたす重要な役目を示唆している。
CD3/CD4ヘテロコンジユゲートはＴ細胞活性化において
新規の活性をもつ CD3/CD3とCD4/CD4ホモコンジユゲートを対照物として
用いた増殖試験において示したとおり本発明のCD3/CD4
ヘテロコンジユゲートがT4細胞活性化においても新規機
能をもつこを発見されている。この試験のCD4+Tは細胞
は５％加熱失活した牛胎児血清（UT.ローガン、ハイコ
ン）の含むRPMT1640培地中ウエル当り５×104細胞で平
底96ウエルミクロタイター板の試料中に４重量に培養し
た。CD4+細胞をG19−４（抗CD3）、G19−/G19−４（CD3
/ホモコンジユゲート）、G19−4/G17−２（CD3/CD4ヘテ
ロコンジユゲート）又はG17−2/G17−２（CD4/CD4モホ
コンシジユゲート）のいずれかと共に、PMA（ホルボー
ル ミリステート アセテート）（１μg/ml）又はモノ
クロナール抗体、9.3、Ｔ細胞表面上CD28抗原と反応性
をもつ抗体〔（Balb/c×C57BL/6）FI、IgG2a〕と共に又
はそれらなしで３日間培養した。〔例えばJ.A.ハンセン
らのImmunogenetics,10:247−52（1980）中の“人間リ
ンパ球の新規Ｔ細胞抗原およびIa抗原を動道程するもの
クラノール対等”参照〕抗体とコンジユゲートはすでて
１μg/mlで使用した。チミジン取込み（平均cpm±sem）
は３日培養の最後の８時間細胞を3H−チミジン（MA.ポ
ストニユー イングランド ニユークレア社）の１μCi
/ウエルでパルスした後液体レンチレーシヨン計数機で
３日目に測定した。
図６に示したとおり精製CD+T細胞を抗CD3試薬単独又
はPMA単独のいづれかと共に培養したが増殖は認められ
なかつた。PMAがあつた場合CD3に対するモノクロナール
抗体を包む抗体調合物はすべて相当量の〔3H〕−チミジ
ン取込みをおこしたが、CD4ホモコンジユゲートはマイ
トジエン性ではなかつた。種々の試薬とCD28に対するモ
ノクロナール抗体。9.3との相乗作用を試験したが、実
質的差異があつた。CD3/CD4へテロコンジユゲートのみ
がCD28抗体に対し感応をおこした。従来の研究はCD28刺
戟が精製Ｔ細胞に対してマイトジエン性でないがCD28に
対するモノクロナール抗体はPMAがあると細胞サイクル
をとおしＴ細胞の95％以上が進行すると示している。
〔例えば上記C.M.ジユーンらのMol.Cell.Biol.,参照〕
精製Ｔ細胞のCD28刺戟が液相CD抗体とマイトジエン性で
ないという発見は従来の研究を確認している。〔例えば
A.ワイスらのJ.Immunol.,173（No.3）:819−825（198
6）中の“人のＴ細胞活性化におけるT3/抗原レセプター
複合物とTp44の相乗作用”参照〕 CD3/CD4ヘテロコンジユゲートとCD3/CD3ホモコンジユ
ゲートの間のCD28刺戟に対する差異が定性的が定量的が
決定のためCD4+T細胞をG19−４、G19−4/G17−２ヘテロ
コンジユゲート又はG19−4/G19−４ホモコンジユゲート
の種々の濃度と、PMA（１μg/ml）又は抗CD28モノクロ
ナール抗体、9.3（１μg/ml）のいづれかと共に培養し
た。第７図に示すとおりG19−4/G17−２ヘテロコンジユ
ゲートは100ng/mlの様な低濃度においてさえCD28刺戟で
十分マイトジエン性であるが、CD3/CD3ホモコンジユゲ
ートは10μg/mlにおいてそうでなかつた。反対にPMAとC
D3刺戟に対する細胞のマイドジエン性反応に試験したす
べての濃度においてCD3抗体コンジユゲートについて同
じであつた。更に運動性実験はCD3/CD3ノモコンジユゲ
ートとCD3/CD4ヘテロコンジユゲートのCD28刺戟に対す
る差異は増殖の時間経過の移動によらないことを示し
た。（データは示してない） 故に増殖においてCD5と反応する可溶性抗体に応答し
ないCD4+T細胞はCD29に対する抗体存在下の増殖によつ
て本発明のCD3/CD4ヘテロコンジユゲートに応答するこ
とがわかる。
更にＴ細胞増殖におけるCD3/CD4ヘテロコンジユゲー
トの効果を検べるため、刺戟後の３連続細胞サイクルの
各相において細胞判別法によつて細胞サイクル運動性を
検べた。CD4+T細胞をPEと結合したCD8、CD6およびCD20
抗体（前記）で染色後サイトフルオログラフ50HH細胞分
数器（MA.ウエストウツドのオウソジアゴノチツク シ
ステム社）で流動細胞計算法によりCD4+T細胞を分類し
た。ネガチブな細胞を分類し、分類集団の再分析によつ
てCD4ポジチブなもの97％であつた。免疫蛍光パラメー
ターのほかに前方スキヤターと右角スキヤターを測定
し、リンパ球集団を性し単球、汚物および死細胞を除外
するに用いた。細胞は20Cにおいて2000細胞／秒速度で
分類された。
分類した細胞は丸底96ウエルミクロタイター板（デン
マーク、カンプストリツプ、Nunc）中５×104細胞／ウ
エルにおいて４重培養した。培養物に５μg/mlのG19−4
/G17−２ヘテロコンジユゲート又はCD3又はCD4がホモコ
ンジユゲートを加えて又はPHAを10μg/mlで加えた。細
胞を0.6μg/ml抗CD28モノクロナール抗体、9.3、1.5×1
0-4M BrdU、100U、100U/mlペニシリンおよび100μg/ml
ストレプトマイシンの存在下における10FBSおよび５×1
0-5M2−メルカプトエタノールを追加しRPMI164中で成長
させた。37℃（５％ CO2）で３日間培養後培地をしづ
かにウエルから吸出し、0.1Mトリス、pH7.4、0.9％NaC
l、1mMCaCl2、1.0mM MgCl2、0.2％BSA、0.1％NP40およ
び１μg/m1秒ヘキスト33258（シグマ）および５μg/ml
エチジウムブロマイド、EB（カビオケム）を含む染色溶
液0.2mlで置換した。細胞を４℃で30分培養後再懸濁さ
せ、P.S.ラビノヴイツチのProc.Nat′l.Acad.Sei.USA,8
0:2956−60（1983）中の“牛の内皮細胞によつて生成さ
れた平常安定繊維素溶解防止剤検出”に記載のとおりPD
P11/03コンピユータ（MA.メイナードのデイジタルエキ
ツプメント）にインターフエイスしたICP−22（オルソ
ジアゴノスチツク システム社）上で流動細胞計算を
行なつた。紫外線励起（UG1フイルター）を使用しまた
ヘキスト33258放射線を425乃至500nmで検出しまた螢光
を600nm以上で検出した。約３−４×103細胞の螢光を分
析しヘキスト対EB螢光の２変量ヒストグラムとして記録
した。個々の細胞サイクルコンパートメント大きさ測定
は分析とP.S.ラビノヴイツチによつて報告されたとおり
曲線フイツテイングによつた。
第１、第２又は第３細胞サイクルを経た細胞パーセン
トは図８に示している。図に示すとおりCD3/CD4ヘテロ
コンジユゲートによつて３日刺戟後細胞の45％がＳ相又
はそれ以上に入り細胞の39％が増殖の第２サイクルに入
つたのでCD3/CD4ヘテロコンジユゲートのみが細胞を細
胞サイクルに目立つて送ることができた。故にCD3/CD4
ヘテロコンジユゲートプラス抗CD28刺戟に応じて精製CD
4 +細胞による3H−チミジン取込みは第２および第３世代
につづく実質的増殖反応をあらわす。反対に他の抗体調
合物はいづれも目立つた細胞遷移がおこらなかつた。
（図８参照）図８はまた分類された細胞の70％が３日培
養後Ｓ相に入つたPHAプラス抗CD28対照と比較してCD3/C
D4ヘテロコンジユゲートによつて刺戟された細胞の45％
が応答したこともあらわしている。これはCD3/CD4ヘテ
ロコンジユゲートで刺戟後相当数のCD4 +細胞が細胞サイ
クル進行をもつたことを示している。
CD3/CD4ヘテロコンジユゲートはCD3とCD4T細胞抗原を共
変調する CD4+T細胞表面上の抗原又は抗体結合物を10μg/ml抗
体濃度において37℃、18時間培養後その密度を抗−マウ
スIg第２段階による免疫螢光を用いて測定しFACS IV流
動細胞計算放で測定することによりＴ細胞表面上のCD3
およびCD4抗原のCD3/CD4ヘテロコンジユゲート、CD3又
はCD4ホモコンジユゲート又はCD4又はCD3単独に対する
抗体による変調を測定した。結果を下記表IIに示してい
る。その密度は直線スケール上測定したバツクグラウン
ド以上の平均螢光強度単位としてあらわしている。
表に示すとおりCD3に対する抗体又はCD3/CD3ホモコン
ジユゲートによる１夜培養は表面CD3を殆んど検出でき
なかつたが、CD4に対する抗体又はCD4/CD4ホモコンジユ
ゲートで同様培養後もなお相当量の表面CD4が残つてい
た。しかしCD3/CD4ヘテロコンジユゲートはCD3とCD4両
方のモジユレーシヨンをなし表面CD4の減少を示した。
この試験に用いた抗体とコンジユゲートはモジユレーシ
ヨン後抗CD3又は抗CD4モノクロナール抗体の直接螢光コ
ンジユゲートを用いて試験したとき細胞表面の遊離CD3
又はCD4高原（即ち抗体に結合していない）が検出され
なかつたからすべて過剰であつた。（データは示してい
ない）故に本発明のCD3/CD4ヘテロコンジユゲートはＴ
細胞表面上のCD3とCD4抗原を同時モジユレーシヨンし、
ヘテロコンジユゲートがCD3に対し固定化された抗体の
場合提案されていたとおり細胞表面にＴ細胞レセプター
を単に固定していないことを示している。〔例えばレド
ベツターらのJ.Immunol.上記参照〕更に可溶性抗CD3に
よる研究はCD3が細胞表面からモジユレートされたときC
D3/Tiレセプターはインターナライズされ〔例えばO.W.
プレスらのCellular Immunol.,102:10−20（1986）中の
“人のＴ細胞に向けられたリシンＡ鎖免疫毒評価“およ
びO.W.プレスらのCancer Research,48:2249−2257（198
8）中の“性状および悪性Ｔリンパ球によるねずみ抗−
人CD3モノクロナール抗体のエンドサイトシスおよび分
解”参照〕Ｔ細胞活性化を抑制した。本発明のヘテロコ
ンジユゲートはまたレセプターのインターナリゼーシヨ
ンに導くが、なおＴ細胞活性化を促進する。
本実施例の示すとおり本発明のCD3/CD4ヘテロコンジ
ユゲートはCD4+T細胞活性化においてCa2+動員とイノシ
トールホスフエート生成の両方を促進する。更にこのヘ
テロコンジユゲートは初めの３日間内の刺戟で細胞の相
当部分を第２細胞サイクルに駆る様なCD28に対する抗体
の存在下でCD4 +T細胞増殖の官能性活性をもつ。更にヘ
テロコンジユゲートはそれと反応性のある抗原を共モジ
ユレートし、それがＴ細胞の活性化においてこれら抗原
を近隣にひきよせる様働らくとの仮説を支持すると思わ
れる。
実施例 2. 下記実施例はCDT細胞抗原と反応する他の多数抗体の
いづれかと交差結合しているCD3抗原と反応性のある抗
体より成る本発明の化のヘテロコンジユゲートの構造と
特性を記載するものである。
前記実施例１に記載のとおり構成された抗体ヘテロコ
ンジユゲートは（ａ）モノクロナール抗体G19−４（抗
体CD3）（前記した）および9.6（抗CD2）〔例えばP.J.
マーチンらのJ.Immunol.,131:180（1983）中の“人のＴ
細胞表面蛋白質Tp50上の明らかな２エピトープの同定と
官能特性”参照〕、（ｂ）モノクロナール抗体G19−４
および10.2（抗−CD5）より成るCD3/CD5ヘテロコンジユ
ゲート、〔例えばP.J.マーチンらのImmunogenetics.11:
429（1980）中の“新しい人のＴ細胞分化抗原：慢性リ
ンパ球白血病細胞上の意外な発現”およびP.J.マーチン
らのJ.Immunol.,12:1920（1981）中の“平常人のＴリン
パ球を認めるモノクロナール抗体および悪性Ｂリンパ球
Ａ比較研究”参照〕、（ｃ）モノクロナール抗体G19−
４およびG3−６（抗CD6）より成るCD3/CD6ヘテロコンジ
ユゲート（G3−６はＴ白血病細胞計、HBS2によつてBalb
/cマウスの免疫法によつて形成されたIgG1イソタイプの
抗CD6モノクロナール抗体である。ハイブツリドマ（hyb
ridomas）はマウスからNSI骨ずい腫系による脾臓細胞の
融合によつて生成され通常のＴ細胞への結合とCD6関係
抗体、12.1との交互ブロツキングにより診査された。
〔例えばP.J.マーチンらのJ.Immunol.,127、上記参
照〕）；（ｄ）モノクロナール抗体G19−４およびG3−
７（抗CD7）より成るCD3/CD7ヘテロコンジユゲート。G3
−７はBalb/cマウスのＴ白血病細胞系、HSB2によるＩ免
疫法により生成したIgG1イソタイプの抗−CD7モノクロ
ナール抗体である。ハイブリドマはNSI骨ずい腫系をも
つマウスからえた脾臓細胞の溶融によつて生成し平常Ｔ
細胞への結合と米国型培養体コレクシヨンからえられる
CD7関連抗体、3A1とクロスブロツキングによつて診査し
た。また抗CD7モノクロナール抗体は市販入手できる。
（CA.マウンテインビユーのベクトンデイツキンソ
ン））〔例えばE.L.ラインヘルツら著Leukocyte Typing
II,1巻 ３−30（1986）参照〕；（ｅ）モノクローナ
ル抗原G19−４およびGIO−１（抗CD8）より成るCD3/CD8
ヘテロコンジユゲート（文献前出）および（ｆ）モノク
ロナール抗体G19−４および9.3より成るCD3/CD28ヘテロ
コンジユゲート（文献前出）であつた。
これらのヘテロコンジユゲートは実施例１に記載のと
おりそのＴ細胞における原形質Ca2+動員促進能力につい
て試験された。各ヘテロコンジユゲートはCD3単独に対
する抗体活性が最適以下でありかつコンジユゲートの向
上活性が検出される濃度１μg/mlで試験した。細胞をヘ
テロコンジユゲートで刺戟後初めの５分以内にインド−
１負荷末梢血液リンパ球の〔Ca2+〕ｉ反応ピークがおこ
つた。非刺戟細胞は〔Ca2+〕i130nMを示した。CD3/CD4
とCD3/CD8ヘテロコンジユゲート使用実験においてコン
ジユゲート使用実験においてコンジユゲートの活性をそ
れぞれCD4+とCD8+T細胞サブセツトについて測定した。
これらのヘテロコンジユゲートのカルシウム動員活性は
下表IIIに示されている。
表IIIが示すとおりCD3/CD2、CD3/CD6、CD3/CD7および
C3/CD8ヘテロコンジユゲート（CD3/CD3ヘテロコンジユ
ゲートも同様）によつて処理されたＴ細胞内において刺
戟されない又はCD3/CD3で刺戟された細胞の活性に比べ
て上記ヘテロコンジユゲートはカルシウム動員の著しい
増加をおこした。これらのヘテロコンジユゲートは実施
例１に記載のCD3/CD4ヘテロコンジユゲートの様にそれ
らが反応しているそれぞれの抗原を近接させる様働きト
ランスメンブレイン信号およびＴ細胞活性化を促進する
と信じられる。
実施例 3. 本実施例は更に多数の他のCD T細胞抗原のいづれかに
交差結合しているCD5 T細胞表面抗原と反応性ある抗体
より成る本発明の他のヘテロコンジユゲートの構成と特
性を記載するものである。
上記実施例１に記載のとおり構成されたこれら抗体ヘ
テロコンジユゲートは次のものであつた：（ａ）モノク
ロナール抗体10.2と9.6より成るCD5/CD2ヘテロコンジユ
ゲート；（ｂ）モノクロナール抗体10.2と9.3より成るC
D5/CD8ヘテロコンジユゲート；（ｃ）モノクロナール抗
体10.2とG17−２より成るCD5/CD4ヘテロコンジユゲー
ト；（ｄ）モノクロナール抗体10.2とG3−６より成るCD
5/CD6ヘテロコンジユゲート；（ｅ）モノクロナール抗
体10.2とG3−７より成るCD5/CD7ヘテロコンジユゲー
ト；および（ｆ）モノクロナール抗体10.2とG10−１よ
り成るCD5/CD8ヘテロコンジユゲート。本実施態様のヘ
テロコンジユゲートを構成するに使われたモノクロナー
ル抗体はすべて前に記載したものである。
これらのヘテロコンジユゲートはまた実施例１に記載
したとおりＴ細胞中の原形質Ca2+の動員促進能力も試験
された。この実験結果は表IVに示されている。本実験に
使つた各ヘテロコンジユゲートの濃度は表に示してい
る。インド−１をもつた末梢血液リンパ球のピーク〔Ca
2+〕ｉ反応は刺戟後初めの10分以内におこつた。刺戟さ
れない細胞は130nMの〔Ca2+〕ｉを示した。表が示すと
おりCD5/CD5ヘテロコンジユゲートは180nMの〔Ca2+〕ｉ
を示した、CD5/CD4とCD5/CD8ヘテロコンジユゲートのそ
れぞれのCD4+とCD8+T細胞サブツトについて試験した。
表IVが示すとおり、CD5/CD4、CD5/CD6およびCD5/CD8
ヘテロコンジユゲートは刺戟されない又はCD5/CD5で刺
戟された細胞と比較してカルシウム動員の著しい増加を
示している。これらのヘテロコンジユゲートも他の前記
ヘテロコンジユゲートと同様にＴ細胞活性化促進に有効
であると信じられる。
実施例 4. 本実施例においてはＴ細胞表面上のCD3とCD45抗原お
よびCD3とCD45抗原と反応性をもつ抗体のヘテロコンジ
ユゲートの間のmAbでおきた相互作用を用いてＴ細胞活
性化におけるこれらの方法の効果を検べた。
細胞調製 末梢血液単球細胞および末梢血液からのナイロン羊毛
に非付着性リンパ球を前記のとおり製造した。〔クラー
クらのProc.Nat'l.Acad.USA 82:1766−1770（1985）お
よびクラークらのHum.Immunol.,16:100−113（1986）、
両者を参考として本明細書に加えておく〕ナイロン羊毛
非付着性リンパ球は次のとおりのナイロン羊毛分離法に
よつてえた：ナイロン管（WA.シアトルのオンコゲン
製）に牛胎児血清５％を含むRPMI培地を負荷し37℃で45
分間予備培養後使用した。細胞を管に流し込んだ後37℃
で45分間培養した。温培地を用い6mlを管からとり1200r
pmで８分間回転２回させた後増殖緩衝液（15％人のAB血
清、約1.5ml）に再懸濁させた。非付着性細胞を計算し
容量を試験での用途にしたがつて調整した。
人の白血球マーカーに次のBalb/cマウスmAbsを使用し
た:9.4（IgG2a）、抗CD45〔上記コボルド〕;G1−15（Ig
G1）および3AC5（IgG2a）、抗CD45R〔レドベツツター上
記およびレドベツターらのIn Perspectives in Immunog
enetics and Histocompatibility,ヘイス,E著，（ASH1,
ニユーヨーク）325−340ページ〕;96.5〔ブラウンらの
J.Immunol.127（２）に639−546（1981）〕、P.ビヴア
リー博士によつておくられたUCHL−１（IgG1）抗CD45
（180フオーム）〔上記スミス〕;G19−４（IgG1）、抗C
D3〔上記レドベツター〕;9.6、抗CD2、（前記）；およ
び9.3、抗CD28（前記）。ねずみ抗−マウスカツパー特
異性mAb、187.1〔ウエヤらのJ.Immunol.Meth.74:93−10
4（1984）〕マウスmAbを交差結合のため使用した。
mAbヘテロコンジユゲートの製造 モノクロナール抗体ヘテロコンジユゲートはヘテロ２
官能性効果結合剤GMBS（CA.ラジヨラのカルビオケム）
と５−イミノチオランHCl（IL.ロツクフオードのピヤス
ケミカル社）を1:1モル比で実施例１に記載のとおり
製造した。特に抗体（1mg/ml）はカツプリング緩衝液
（0.1M Na2HPO4−２塩基性７水化物、0.1M NaCl、pH7.
5）に対し１夜透析した。コンジユゲートの第１抗体は
イミノチオラン塩酸塩（ピヤス ケミカル社の２−IT）
溶液（カツプリング緩衝液中10mg/ml）50μ（0.5mg）
を攪拌しながら加えてチオール化した。コンジユゲート
の第２抗体をGMBS溶液（ジメチルホルムアミド、（DM
F）360μ中に1mg）５μ（14μｇ）と処理した。溶
液を室温で１時間培養した。抗体を別のPD−10管（スエ
ーデン、ウブサラのフアーマシア）に流しカツプリング
緩衝液中予備平衡させた。合計2.6mlの空隙容量後抗体
を元の容量の２培採取した。抗体を混合し室温で５時間
培養し、反応混合物に25mM B−メルカプトエタノール
（１μ:560μカツプリング緩衝液）１μを加えて
室温で15分培養した。これに11μ（11μｇ）のＮ−エ
チルマレイミド（MO.セントルイスのシグマケミカル
社）を加えて反応を停止したDMF中1mg/mlとした。
コンジユゲートをホスフエート緩衝塩溶液（PBS）に
対し１夜透析した。えたCD3/CD45ヘテロコンジユゲート
を実施例１に記載のとおりシユーパローズ6FPLC上遊離
抗体から分離しG19−4/9.4と命名した。
mAbsとビチオンの結合物は前記したとおりビチオン−
サクシニミド（MO.セントルイスのシグマ ケミカル
社）を使用した。〔ハーデイー,R.P.（1986）In Handbo
ok of Experimental Immunology.（ウイルら著）（バツ
クウエル，オクスフオード）31.1−31.2ページ（198
6）〕ホルボール−12−ミリステート−13−アセテート
（PMA）とアビジンはMO.セントルイスのシグマ ケミカ
ル社よりえた。組かえインターロイキン２（rIL2）はM
A.ボストンのジエンツイームから購入していくつかの試
験に増殖促進に使用した。
血液Ｔ細胞の増殖は200μミクロタイマーウエル中1
06細胞/mlを用いた実施例１に記載のとおり〔3H〕チミ
ジン（ニユーイングランドニユークレア；特殊活性27Ci
/ミリモル;1Ci＝37GBq）取込みにより測定した。特に増
殖試験については単核細胞をレドベツターらのJ.Immuno
l.135:1819−1825（1985）に記載のとおり培養した。簡
単に単核細胞は末梢血液からフイコール−ハイパツク上
密度遠心分離によつて分離した後プラスチツクに付着さ
せて単球の大部分を除去した。細胞を96−ウエルミクロ
タイター板（CA.オクスナードのベクトンデイツキンソ
ンのフアルコン）でペニシリン、ストレプトマイシンお
よび15％人AB血清を含むRPMI培地（WI.ブラウン デイ
ヤのペル フリーズ）中４倍試料中2.5×105/ml濃度で
培養した。Ｔ細胞刺戟のためマイトゲンフイトヘマグル
チニン（PHA;NC.グリーンビルのウエルカムダイアノス
チツクス）又はセフアローズにカツプルした抗CD3 mAb
（G19−４）のいづれかを使用した。培養３又は４日
後、ウエル当り0.5、uCi〔3H〕チミジン（MA.ボストン
のニユーイングランドニユークレア;6.7Ci/ミリモル特
殊活性）で６時間ウエルをパルスした。細胞収穫器を用
いてガラス繊維フイルター上に細胞を集め液体シンチレ
ーシヨン計測器で放射能を測定した。ある実験で組かえ
剤IL2（rIL−2;MA.ボストンのジエンツイーム）を25U/m
lにおいて用いた。試験前にミクロタイター板のウエル
に予備被覆されたmAbG19−４ 10μg/mlを使つて３日実
験の最終６時間の間に〔3H〕チミジン吸収量測定を行な
つた。抗CD45 mAb 9.4の溶液中濃度は１μg/mlであつ
て、10mg/mlの量でミクロタイター板上に固定された。
細胞は４重に培養され平均が示された。標準誤差11％以
下であつた。
表Ｖに結果をまとめて示している。
表Ｖは抗CD3と共に固定化された抗CD45はＴ細胞を75
％以上も抑制したが溶液中の抗CD45は抑制しないことを
示している。固定されたCD45の抑制効果はPMA又は外生r
IL2の最適以下の濃度であつてさえ明瞭であつた。
抗CD3 mAb（G19−４）で刺戟後のＴ細胞の増殖はまた
固定化された抗CD3 mAbおよび固定化された又は溶液中
のCD45R mAb（G1−15および3AC5）によつても測定され
た。増殖は抗CD45について上記のとおり測定された。抗
CD45R mAb G1−15と3AC5は溶液中１μg/ml量で使われ10
μg/mlにおいて固定された。黒色腫抗原p97に対する対
照IgG2a mAb 96.5は溶液中１μg/ml量で非反応性対照と
して使われ10μg/mlで固定化された。表VIはこの実験結
果を示している。
CD45R（3AC5）又はCD45R（G1−15）mAbsのいづれかが
抗CD3と共に固定され、しかしCD45R mAbsが溶液中にな
い時には抑制は明白であつた。再びPMA又はrIL2のいづ
れもこの抑制にはかつことができなかつた。黒色腫抗原
p97に対する対照mAb、96.5は溶液中に存在するか又は抗
CD3と共に固定されたかいづれかのとき固定されたCD3に
応じて増殖を抑制しなかつた。
固定されたCD45 mAb（9.4）によつてみられる抑制が
単にプラスチツク表面からのCD3 mAb（G19−４）の移動
によるものでないことの確認のためミクロタイターウエ
ルを抗CD3単独、抗CD3プラス抗CD45又は抗CDプラス対照
mAb、96.5で被覆した。末梢血液単核細胞を４、８、16
および32μg/ml濃度で単独又は抗CD45 mAb 9.4又は抗CD
3 mAbと同じ濃度の対照mAb 96.5と共にホスフエート緩
衝塩溶液中室温で２時間培養してミクロタイター板壁に
固定した抗CD3 mAb G19−４で刺戟した。牛血清アルブ
ミンを加えて更に蛋白質を附加させた。溶液中のCD45 m
Ab 9.4による増殖を比較のため使用した。1ng/mlのPMA
の存在有無で増殖を測定した。細胞を３日間４重に培養
し最終６時間の間〔3H〕チミジでパルスした。第９図は
これらの実験結果を示している。（平均値を示した、標
準誤差は各点において平均値の15％以下であつた。） 図９は（ａ）ウエル被覆のためより多い抗CD3が使わ
れたからより多い増殖があつた。従来報告（ゲツバート
らのJ.Immunol.138:1660−1666（1987））と一致；
（ｂ）CD45 mAb 9.4はすべての濃度において実質的に抑
制をおこした。但し固定化された時のみである；および
（ｃ）同形対照96.5 mAbで同時に被覆することによつて
本質的に抑制はおこらなかつた、抗CD45による抑制は抗
CD3の移動を生じなかつたことを示している；以上のこ
とを示している。培養物に1ng/ml PMAを添加するとmAb
を４μg/ml又はそれ以下で被覆した時のみ固定抗CD45に
よる抑制を逆にするが、高濃度ではそうならない。（図
9B）これは抗CD45の臨界濃度がPMAの存在において抑制
保持のためプラスチツク表面上抗CD3に接近している必
要があることを示唆している。
増殖をもたらすＴ細胞活性化は溶液中mAb 9.3と9.6を
用いてそれぞれCD28とCD2を刺戟し次いで第２工程で抗
−k mAb 187.1を用い交差結合させて進行させうる。
〔ヴアンリールらのEur.J.Immunol.18:167−175（198
8）およびレドベツターらのProc.Na'l.Acad.Sci,USA84:
1384−1388（1987）〕この系におけるCD45結紮効果を検
べるため交差結合しているmAb 187.1を含む又は含まぬ
溶液中で抗CD45を抗CD28に又は抗CD2に加えた。〔上記
ウエヤら．〕増殖を上記のとおり〔3H〕チミジン取込み
によつて測定した。抗CD28 mAb 9.3と抗CD2 mAb 9.6を
各１μg/ml濃度で活性化のため使用した。抗CD45 mAb
9.4を１μg/mlで用いまた抗−k mAb 187.1対マウスmAb
の最終比4:1にする様mAb 187.1を抗体交差結合に使つ
た。増殖をrIL2の存在（100単位/ml）と非存在において
測定した。表VIIは結果を示している。標準誤差は各点
において平均値の12％以下であつた。
抗CD45のみの添加が外生rIL2を要することなくCD2又
はCD28 mAbsのいづれかによつて生じた細胞増殖又は増
加を促進できることは明らかである。（表VII）すべて
の場合他の刺戟剤なしでさえrIL2添加は更に細胞増殖を
増大した。これらの現象はIL2の高親和性レセプター発
現に対するCD45連結効果によるであろう。
（上記レドベツター） 反応に187.1抗−k mAb添加によつてCD2又はCD28に対
する交差結合性CD45はCD45単独の刺戟効果を逆にしrIL2
があつてもなくともCD2又CD28による刺戟を減少した。
（表VII）．これは187.1の非特異性抑制活性によるもの
ではない、CD45 mAb 9.4が含まれない場合CD28又はCD2
刺戟は共に187.1によつて促進されるからである。
CD3、CD2およびCD28は、これらのレセプターが細胞表
面上に連結された場合〔Ca2+〕ｉの増加となるシグナル
形成導入路にカツプルさせられる。〔レドベツターらの
Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA84:1384−1388（1987）〕〔C
a2+〕ｉはCD3、CD2又はCD28レセプターを交差結合後CD4
5 mAb 9.4の存在下において又はなしで測定された。
（図10）この実験においてビオチン結合mAbの末梢血液
Ｔ細胞に結合させた後アヴイジン添加によつて細胞表面
に交差結合させた。インド−１をもつた末梢血液単核Ｔ
細胞（OR.ジヤンクシヨンシテイのモレキユラープロー
ブス）中の〔Ca2+〕増加は単独で又は抗CD45 mAb 9.4又
は抗CD45R mAb 3AC5と共にＴ細胞上のレセプターを交差
結合後次のとおり測定した：（条件は図10に示してい
る。） 1.CD3レセプターをビチオン結合抗CD3 mAb G19−４（２
μg/ml）とｔ＝1.5分において交差結合させた後アヴイ
ジン（８μg/ml）を＝5.5分に加えた。（−）これを抗
−CD45 mAb 9.4（10μg/ml）の存在におけるCD3レセプ
ターの同じ交差結合（−−）と又はビチオン結合抗CD45
mAb 9.4（10μg/ml）後アヴイジン添加（48μｇ）（…
…）と比較した。ビチオン結合抗CD45 mAb 9.4（10μg/
ml）後アヴイジン（40μg/ml）添加の追加対照も使用し
た。（……）（図10A）； 2.抗CD3 mAb G19−４（−）25μg/mlの効果を抗CD3 mAb
G−19と抗CD45 mAb 9.4のCD3/CD45ヘテロコンジユゲー
ト（……）と比較した。（図10B）； 3.CD2レセプターをビチオン結合抗CD2 mAb 9.6 10μg/
mlを時間３分迄加えて交差結合させた後40μg/mlのアビ
ジンを1.5分で添加した。（−）（図10C）； 4.CD28レセプターを３分間に加えた10μg/mlのビチオン
結合抗CD28 mAb 9.3と交差結合させた後ｔ＝−３分にお
いてアビジン40μg/ml添加（−）の場合を、抗CD28 mAb
9.3 10μg/mlと抗CD45 mAb 9.4 10μg/mlを用いｔ＝
−３分においてCD28とCD45を同時交差結合させた後アビ
ジンを80μg/mlをｔ＝1.5分において添加（……）した
場合と比較した。（図10D）；および 5.CD4レセプターをｔ＝−３分でビチオン結合抗CD4 mAb
G17−２ 10μg/mlの添加により交差結合させた後ｔ＝
1.5分で40μg/mlのアビジンを添加した。（−）これを1
0μg/mlのビチオン結合抗−CD4 mAb G17−２および10μ
g/mlのビチオン結合抗CD4 mAb 9.4をｔ＝−３分に添加
してCD4とCD4を同時交差結合させた後のｔ＝1.5分にお
けるアビジン80μg/ml添加（……）と比較した。ビチオ
ン結合抗CD4 mAb G17−２（10μg/ml）プラス抗CD45 mA
b 9.4（10μg/ml）（結合していない）の後ｔ＝1.5分に
おいて40μg/mlのアジビン添加の比較も示されている。
（−・−）（図10E）． 図10A−Ｅはこれらの実験結果を示している。
CD3、CD2およびCD28交差結合後にみられる〔Ca2+〕ｉ
の添加はビチオンの会合した9.4の存在によつて抑制さ
れたことが明らかであつた。9.4がビチオン化されずビ
チオンにより交差結合しないときは抗CD3でおこつたカ
ルシウム動員量の僅かな減少がなお認められた。（図10
A）しかし完全な阻止はCD45とCD3が接近させられること
が必要と思われた。更に抗−マウスイムノグロブリン使
用免疫螢光試験がヘテロコンジユゲートが細胞表面上の
両レセプターに結合し（データは示していない）また抗
CD3の25μｇが強いカルシウム応答を引き出しえること
を示してさえも抗CD45と抗CD3のヘテロコンジユゲート
は直接には〔Ca2+〕ｉは増加できなかつた。（図10B）3
AC5の様なCD45R mAbはCD2について示した様に、細胞レ
セプターと反応性あるmAbsに連結した場合〔Ca2+〕ｉ応
答を部分的に抑制できた。（図10C） CD45R mAbによつてできた部分抑制は一部であるが全
部でないＴ細胞上のCD45Rイソ型蛋白質の発現を反映し
ている。（上記、レドベツター）。CD3、CD2およびCD28
上の抑制効果と反応にCD4へのCD45の連結はCD4がそれ自
体に交差結合したときに比べて強い再現性の信号増大を
与えた。（図10E）にこれは応答細胞数の増加なしにお
こり、同じCD4ポジチブ細胞がCD45とCD4の連結後、より
感応性であつたことを示している。故にCD45はそれと相
互作用しているレセプターによつてトランスメンブレイ
ン信号を増減にづれにも調節すると思われる。
CD45の従来研究はそれがリンパ球活性を増減いづれに
も調節作用すると示唆した。（上記レドベツター；ハー
プ；およびマートレル）.CD45およびCD45Rに対する可溶
性mAbは小球に付着したPHA又は抗CD3と共にIL−２生
成、IL−２レセプター発現およびＴ細胞増殖の増加に共
−刺戟性である。可溶性抗CD45はCD2又はCD28 mAbと協
同作用する。（表VI）．これらの共同刺戟効果はCD4＋
細胞に制限され、CD4を発現しないCD8＋細胞には見られ
ない。これはCD45がCD3又はCD2の様な他の細胞表面抗原
に対するその作用から明らかにCD4に特徴的効果をもつ
という事実に一部よるものであろう。CD45がCD4と緊密
関係となつたときそれはCD4により伝達されたカルシウ
ム信号を加速又は増加するが、CD3およびCD2にカツプル
したときはシグナル形質導入を阻止する。
上記実施例（４）は本発明のCD4/CD45ヘテロコンジユ
ゲート使用によつて示されたとおりCD45をＴ細胞レセプ
ターCD2、CD3、CD5又はCD28の様なシグナル形質導入エ
レメントを接触させる条件のもとで抗CD45の抑制効果が
最も明らかにわかることを示している。抗CD45抗原は非
常に速くリンパ球活性化に働らき、通常30乃至60秒以内
に検知できる細胞内遊離カルシウム動員を阻止する。抗
CD45の促進効果はまたCD45レセプターをCD4レセプター
の近くにおくことによつて示される。これらの効果はリ
ンパ球上のレセプターの反応性のある分子を含むヘテロ
コンジユゲートがＴ細胞とＢ細胞を包含するリンパ球の
活性と作用を促進又は抑制するレセプター間の相互作用
をおこす別方法を提供できることを示唆している。
本発明の多数の実施態様について記述したが本発明の
基本的構成はリンパ球、例えば他のリンパ球抗原ヘテロ
コンジユゲート混合物の活性促進又はリンパ球作用の抑
制に導く更に他の実施態様となる様変更もできるのであ
る。したがつて本発明の範囲は実施例によつて明細書に
記述した特定実施態様によるよりもむしろ本発明の特許
請求の範囲によつて定義されていることが認められるで
あろう。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明の１実施態様の（Ａ）CD3/CD4ヘテロコン
ジユゲート、G19−4/G17−２又は（Ｂ）抗−CD3モノク
ロナール抗体、G19−４のいづれかの濃度変更による末
梢血液リンパ球刺戟における時間対原形質遊離カルシウ
ム（〔Ca2+〕ｉ）濃度増加の比較曲線図である。 図２は本発明のCD3/CD4ヘテロコンジユゲート、G19−4/
G17−２による末梢血液リンパ球（PBL）又はCD4+T細胞
のいづれるの刺戟における時間対〔Ca2+〕ｉ応答と応答
する細胞パーセントの比較曲線図である。抗−CD4モノ
クロナール抗体、G17−２による細胞前処理後のヘテロ
コンジユゲートによる刺戟の抑制効果も示されている。 図３はCD4+T細胞上の本発明のG19−4/G17−２ヘテロコ
ンジユゲート（■）又は抗−CD3モノクロナール抗体、G
19−４（□）の5mM EGTA存在下における〔Ca2+〕ｉ活
性の比較滴定曲線を示している。 図４は抗−CD3、G19−４（●）又は本発明のCD3/CD4ヘ
テロコンジユゲート、G19−4/G17−２（△）の１μg/ml
によるCD4+T細胞刺戟における時間対イノシトールホス
フエート増加の比較図を示している。ｔ＝０とｔ＝10分
における非刺戟対照（０）のイノシトールホスフエート
濃度が示されている。図Ａはイノシトールホスフエート
１（InsP1）増加を示し、図３はイノシトールホスフエ
ート２（InsP2）の増加を示し図Ｃはイノシトールホス
フエート３（InsP3）の増加を示している。 図５はピチオン接合した抗CD4（G17−２）により、抗−
CD3（G19−４）、G17−２、CD3/CD4ヘテロコンジユゲー
ト（G19−4/G17−２）又はアビジンおよびそれらの混合
物（図示）のいづれかにより前処理されたCD4+T細胞刺
戟後InsP1の増加を測定した別個の２実験を示してい
る。 図６はPMA（フオルボールミリステートアセテート）又
はCD28に対する抗体と共に又はそれなしでCD4+T細胞に
よる〔3H〕−チミジン取込みによつて示された様なＴ細
胞増殖における抗CD3モノクロナール抗体（CD3モノ）、
CD3/CD3ホモコンジユゲート（CD3ホモ）、CD4/CD4ホモ
コンジユゲート（CD4ホモ）、および本発明のCD3/CD4ヘ
テロコンジユゲート（CD3＋４ヘテロ）の影響を示して
いる。 図７は3H−チミジン取込み対G19−４（CD3モノ）＋PMA
（▼−▼）、G19−４＋抗CD28（α−CD28）（▽−
▽）、CD3/CD4ヘテロコンジユゲート（CD3＋４ヘテロ）
＋PMA（▼……▼）、CD3/CD4ヘテロコンジユゲート＋α
−CD28（▽−▽）、CD3/CD3ホモコンジユゲート（CD3ホ
モ）＋PMA（▼−・−▼）又はCD3/CD3ホモコンジユゲー
ト＋α−CD28（▽−・−▽）のいづれかの濃度によつて
示される様なCD4+T細胞の増殖応答の比較曲線図であ
る。 図８はPHA（フイトヘマグルチニン）、本発明のCD3/CD4
ヘテロコンジユゲート、G19−4/G17−２、CD3/CD3ホモ
コンジユゲート、G19−4/G19−４、対照としてCD3/CD8
ヘテロコンジユゲート、G19−4/G10−１およびCD4/CD4
ホモコンジユゲート、G17−2/G17−２のいづれかによる
３日間のＴ細胞刺戟後の第１、第２又は第３細胞サイク
ル通貨CD4+T細胞パーセントを示している。 図９は〔3H〕−チミジン取込み、単独（○）又はそれ対
抗CD45 mAb 9.4（□）又は抗−p97 mAb 96.5（□）いづ
れかの濃度によつて（Ａ）PMAなしで又は（Ｂ）PMAと共
に示される様な固定化抗CD3 mAb G19−４により生じた
Ｔ細胞増殖反応抑制の比較図である。（溶液中抗CD45 m
Ab 9.4による増殖（△）も比較のため示されている；平
均値を示している；標準誤差＜15％である。） 図10はＴ細胞単独上又は下記実施例４に記載のとおり抗
−CD45 mAb 9.4又は抗CD45R mAb 3AC5と共にレセプター
と交差結合後の時間に対する〔Ca2+〕増加によつて測定
されたとおりＴ細胞におけるシグナル形質導入のCD45レ
セプターによる調節曲線図を示している。（各実験の
〔Ca2+〕ｉ平均値は左にまた応答細胞パーセントは右に
示している。矢印はmAb又はアジピン添加時間を示して
いる。）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｋ (56)参考文献 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍ ｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．139，Ｎｏ. ３（1987），ＰＰ．678−682 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ，Ｖｏｌ．24，Ｎｏ．12 （1987），ＰＰ．1255−1261 Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ, Ｖｏｌ．15（1986）ＰＰ．30−43

Claims (43)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】リンパ球上の抗原に結合しうる少なくとも
    ２個の抗体分子より成り、これらの分子は担体物質の介
    在なしにそれ自体が交差結合剤によって互いに直接に交
    差結合しており、各分子が個々のリンパ球表面にある異
    なる抗原と反応性をもつことを特徴とするリンパ球の調
    節に有効なヘテロコンジュゲート。
  2. 【請求項２】互いに交差結合している少なくとも２個の
    抗体分子より成り、これらの分子は担体物質の介在なし
    にそれ自体が交差結合剤によって互いに直接に交差結合
    しており、各分子がＴリンパ球表面にある異なる抗原と
    反応性をもつことを特徴とするＴリンパ球の活性化に有
    効なヘテロコンジュゲート。
  3. 【請求項３】抵原がＴリンパ球表面のCD抗原である請求
    項１又は２記載のヘテロコンジュゲート。
  4. 【請求項４】抗原がＢリンパ球表面のCD抗原である請求
    項１又は２記載のヘテロコンジュゲート。
  5. 【請求項５】ヘテロコンジュゲートの分子の一つがＴ細
    胞レセプター又はその会合CD3抗原と反応性をもつ請求
    項１又は２記載のヘテロコンジュゲート。
  6. 【請求項６】ヘテロコンジュゲートの分子の一つがCD5T
    細胞表面抗原と反応性をもつ請求項１又は２記載のヘテ
    ロコンジュゲート。
  7. 【請求項７】分子が抗体である請求項１記載のヘテロコ
    ンジュゲート。
  8. 【請求項８】CD3/CD4抗体ヘテロコンジュゲートである
    請求項２記載のヘテロコンジュゲート。
  9. 【請求項９】抗体ヘテロコンジュゲートG19−4/G17−２
    である請求項２記載のヘテロコンジュゲート。
  10. 【請求項１０】CD3/CD2、CD3/CD6、CD3/CD7およびCD3/C
    8より成る群から選ばれる請求項２記載のヘテロコンジ
    ュゲート。
  11. 【請求項１１】CD5/CD4、CD5/CD6、およびCD5/CD8より
    成る群から選ばれる請求項２記載のヘテロコンジュゲー
    ト。
  12. 【請求項１２】ヘテロコンジュゲートの分子の一つがCD
    45抗原又はCD45抗原のイソ型と反応性をもつ請求項１又
    は２記載のヘテロコンジュゲート。
  13. 【請求項１３】抗体ヘテロコンジュゲートCD3/CD45であ
    る請求項２記載のヘテロコンジュゲート。
  14. 【請求項１４】抗体ヘテロコンジュゲートG19/4/9.4で
    ある請求項２記載のヘテロコンジュゲート。
  15. 【請求項１５】CD2/CD45、CD3/CD45R、CD4/CD45、およ
    びCD28/CD45より成る群から選ばれる請求項２記載のヘ
    テロコンジュゲート。
  16. 【請求項１６】CD2/CD45R、CD3/CD45R、CD4/CD45R、お
    よびCD2 8/CD45Rより成る群から選ばれる請求項２記載
    のヘテロコンジュゲート。
  17. 【請求項１７】抗体がFabおよびＦ（ab′）２フラグメ
    ントより成る群から選ばれる抗体フラグメントより成る
    請求項２又は７記載のヘテロコンジュゲート。
  18. 【請求項１８】抗体がモノクローナルである請求項２又
    は７記載のヘテロコンジュゲート。
  19. 【請求項１９】抗体がキラメ型である請求項２又は７記
    載のヘテロコンジュゲート。
  20. 【請求項２０】該分子がリンパ球表面抗原と反応性をも
    つリガンドペプチドである請求項１記載のヘテロコンジ
    ュゲート。
  21. 【請求項２１】リンパ球上の抗原に結合しうる少なくと
    も２個の抗体分子より成り、これらの分子は担体物質の
    介在なしにそれ自体が交差結合剤によって互いに直接に
    交差結合しており、各分子が個々のリンパ球表面にある
    異なる抗原と反応性をもつヘテロコンジュゲートを有効
    成分とするリンパ球機能調節用医薬組成物。
  22. 【請求項２２】互いに交差結合している少なくとも２個
    の抗体分子より成り、これらの分子は担体物質の介在な
    しにそれ自体が交差結合剤によって互いに直接に交差結
    合しており、各分子がＴリンパ球表面にある異なる抗原
    と反応性をもつヘテロコンジュゲートを有効成分とする
    Ｔリンパ球活性用医薬組成物。
  23. 【請求項２３】リンパ球上の抗原に結合しうる少なくと
    も２個の抗体分子より成り、これらの分子は担体物質の
    介在なしにそれ自体が交差結合剤によって互いに直接に
    交差結合しており、各分子が個々のリンパ球表面にある
    異なる抗原と反応性をもつヘテロコンジュゲートを有効
    成分とするＴリンパ球および／又はＢリンパ球の機能調
    節用医薬組成物。
  24. 【請求項２４】互いに交差結合している少なくとも２個
    の抗体分子より成り、これらの分子は担体物質の介在な
    しにそれ自体が交差結合剤によって互いに直接に交差結
    合しており、各分子がＴリンパ球表面にある異なる抗原
    と反応性をもつヘテロコンジュゲートを有効成分とする
    Ｔリンパ球および／又はＢリンパ球の活性化用医薬組成
    物。
  25. 【請求項２５】それぞれの抗体分子が個々のリンパ球表
    面の異なる抗原と反応性である、リンパ球上の抗原に結
    合しうる少なくとも二つの分子を交差結合剤によって互
    いに直接に交差結合させることを特徴とするリンパ球上
    の抗原に結合しうる少なくとも２個の抗体分子より成
    り、これらの分子は担体物質の介在なしにそれ自体が交
    差結合剤によって直接に交差結合しており、各分子が個
    々のリンパ球表面にある異なる抗原と反応性をもつリン
    パ球の調節に有効なヘテロコンジュゲートを製造ずる方
    法。
  26. 【請求項２６】分子が反応性である該リンパ球はＴリン
    パ球である請求項25記載の方法。
  27. 【請求項２７】抗原がＴリンパ球表面のCD抗原である請
    求項25記載の方法。
  28. 【請求項２８】抗原がＢリンパ球表面のCD抗原である請
    求項25記載の方法。
  29. 【請求項２９】ヘテロコンジューゲートの分子の一つが
    Ｔ細胞レセプター又はその会合CD3抗原と反応性をもつ
    請求項25記載の方法。
  30. 【請求項３０】ヘテロコンジュゲートの分子の一つがCD
    5T細胞表面抗原と反応性をもつ請求項25記載の方法。
  31. 【請求項３１】分子がCD3の抗原と反応性の抗体及びCD4
    抗原と反応性の抗体である請求項25記載の方法。
  32. 【請求項３２】抗体が抗体G17−２に交差結合する抗体G
    17−４である請求項31記載の方法。
  33. 【請求項３３】分子がCD3抗原に反応性の抗体及びCD6、
    CD7及びCD8抗原に反応性の抗体より成る群から選ばれる
    抗体である請求項25記載の方法。
  34. 【請求項３４】分子がCD5抗原に反応性の抗体及びCD4、
    CD6及びCD8抗原と反応性の抗体より成る群から選ばれる
    抗体である請求項25記載の方法。
  35. 【請求項３５】分子の一つがCD45抗原又はCD45抗原のイ
    ソ型と反応性である請求項25記載の方法。
  36. 【請求項３６】分子の一つがCD2、CD3、CD4及びCD28抗
    原に反応性の抗体より成る群から選ばれる抗体であり、
    かつ他の分子がCD45抗原と反応性の抗体である請求項25
    記載の方法。
  37. 【請求項３７】分子の一つがCD2、CD3、CD4及びCD28抗
    原と反応性の抗体より成る群から選ばれる抗体であり、
    かつ他の分子がCD45R抗原と反応性の抗体である請求項2
    5記載の方法。
  38. 【請求項３８】分子がモノクローナル抗体である請求項
    25〜37のいずれか一つの項に記載の方法。
  39. 【請求項３９】分子がFabおよびＦ（ab′）２フラグメ
    ントより成る群から選ばれる抗体フラグメントより成る
    請求項25記載のヘテロコンジュゲート。
  40. 【請求項４０】分子がキラメ抗体である請求項25記載の
    方法。
  41. 【請求項４１】分子がリンパ球表面抗原と反応性のリガ
    ンドペプチドである請求項25記載の方法。
  42. 【請求項４２】交差結合が化学的交差結合である請求項
    25記載の方法。
  43. 【請求項４３】化学的交差結合がマレイミドブトリルオ
    キシスクシンイミド及びＮ−スクシンイ ミジル３−
    （２−ピリジルジチオ）プロピオネートより成る群から
    選ばれる試薬を用いて実施される請求項42記載の方法。
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