DE68925593T2 - Antikörper-Heterokonjugate zur Regulation der Lymphozytenaktivität - Google Patents
Antikörper-Heterokonjugate zur Regulation der LymphozytenaktivitätInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft neue Antikörper- Heterokonjugate und deren Verwendung bei der Regulierung der Aktivität von Lymphocyten, beispielsweise T-Zellen und B-Zellen. Die Erfindung betrifft insbesondere Heterokonjugate, welche mindestens zwei miteinander gekoppelte Antikörper aufweisen, wobei jeder Antikörper mit einem anderen Lymphocyten- Oberflächenantigen reagieren kann. Diese Heterokonjugate scheinen dadurch zu wirken, daß sie an Lymphocyten binden und die entsprechenden Zelloberflächenantigene, mit denen sie reagieren, räumlich aneinanderbringen. Dies führt zu einer verstärkten oder reduzierten Signaltransduktion und Proliferation der Lymphocyten. Bei einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform wird ein Antikörper, der mit dem T-Zellenrezeptor oder dessen assoziierten CD3-Komplex reagieren kann, mit einem Antikörper vernetzt, der mit einem zweiten T-Zellenoberflächenantigen reagieren kann, beispielsweise CD2, CD4, CD6 oder CD8, um die Aktivierung und Funktion der T-Zellen zu verstärken. Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Antikörper, der mit dem CD5-T-Zellenoberflächenantigen reagieren kann, mit einem Antikörper vernetzt, der mit einem zweiten T-Zellenoberflächenantigen reagieren kann, beispielsweise CD4, CD6 oder CD8, um die Lymphocytenaktivierung und -funktion zu verstärken. Bei einer Weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Antikörper, der mit der CD45-Antigenfamilie reagieren kann, mit einem Antikörper vernetzt, der mit einem zweiten T-Zellenoberflächenantigen, beispielsweise CD2, CD3, CD5 oder CD28, reagieren kann, um Lymphocytenaktivierung und -funktion zu inhibieren. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Antikörper, der mit dem CD4-Antigen reagieren kann, mit einem Antikörper vernetzt, der mit dem CD45-Antigen reagieren kann, um Lymphocytenaktivierung und -funktion zu steigern. Die erfindungsgemäß bereitgestellten Antikörper-Heterokonjugate, Verfahren und Zusammensetzungen können bei der Regulierung von Lymphocyten Anwendung finden. Dies bewirkt eine verbesserte zelluläre Immunantwort bei der Behandlung von Erkrankungen, beispielsweise infektiösen Erkrankungen, Krebs, AIDS und Autoimmunerkrankungen.
- Bekanntlich können T-Lymphocyten, die in der Fachwelt auch als T-Zellen bezeichnet werden, eine Immunantwort auf mindestens zwei verschiedenen Wegen herbeiführen. Cytotoxische T-Zellen sind bei der Lysis bestimmter Zielzellen (target cells) beteiligt, während Helfer-T-Zellen die Proliferation und Differenzierung von B-Zellen unterstützen. Dies führt zur Produktion von Antigen-spezifischen Antikörpern (vergleiche z.B. J.W. Kimball, (Hrsg.), Introduction To Immunology, 2. Ausgabe, Kapt. 11-13, Macmillan Publishing Co. (1986)). Jeder T-Zellen-Typ wird zur Ausübung seiner Funktion dadurch aktiviert, daß eine Interaktion des T-Zellenrezeptors (Ti) oder seines assoziierten CD3-Komplexes (auch als CD3/Ti-Rezeptorkomplex bezeichnet) an der T-Zellenoberfläche mit einem Antigen auf einer antigenpräsentierenden Zelle stattfindet (man vergleiche z.B. E.L. Reinherz et al., "Clonotypic Surface Structure On Human T Lymphocytes: Functional And Biochemical Analysis of The Antigen Receptor Complex" Immunol., Rev. 81:95-129 (1984)).
- Es hat sich jedoch herausgestellt, daß T-Zellen auf ein Antigen nur dann ansprechen, wenn dieses Antigen mit einem bestimmten MHC (major histocompatibility complex)-kodierten Antigen auf der antigenpräsentierenden Zelle assoziiert ist. Es wird daher davon gesprochen, daß die Erkennung eines Antigens durch T-Zellen auf die Klasse des MHC- kodierten Produkts beschrankt ist, das mit dem Antigen assoziiert ist. Das Ergebnis dieser MHC-Restriktion ist, daß cytotoxische T-Zellen aktiviert werden durch Antigene in Assoziation mit MHC-Antigenen der Klasse 1 und daß Helfer-T-Zellen durch Antigene aktiviert werden, die mit MHC-Antigenen der Klasse II assoziiert sind (man vergleiche z.B. J.W. Kimball (Hrsg.), Introduction To Immunology, siehe oben, S. 286-89 und S. 348-58).
- Außerdem wurde erkannt, daß T-Zellen, welche für MHC der Klasse II spezifisch sind, zusätzlich zum CD3/Ti-Rezeptorkomplex ein als CD4&spplus;bezeichnetes Zelloberflächenantigen exprimieren, während die auf MHC der Klasse 1 beschränkten T-Zellen ein CD8-Zelloberflächenantigen exprimieren. Diese Assoziation zwischen MHC-Restriktion und CD-Antigenexpression führte zu der Hypothese, daß bei der T-Zellenaktivierung die entsprechenden MHC-Antigene die natürlichen Liganden für die CD-Antigene darstellen, d.h. das CD4-Antigen auf Helfer-T-Zellen interagiert mit den Klasse II MHC-Molekülen auf den antigenpräsentierenden Zellen (z.B. Makrophagen) und das CD8-Antigen auf cytotoxischen T-Zellen interagiert mit den Klasse 1 MHC-Molekülen auf bestimmten Zielzellen (z.B. virusinfizierten Zellen) (man vergleiche z.B. F.M. Emmrich et al., "Cross-Linking of the T-Cell Receptor Complex With The Subset- Specific Differentiation Antigen Stimulates Interleukin 2 Receptor Expression In Human CD4&spplus;and CD8-T-Cells", Eur. J. Immunol., 17:529-34 (1987)). Außerdem ist vorgeschlagen worden, daß die Erkennung des Antigens durch T-Zellen mittels eines quaternären Komplexes stattfinden könnte, indem der CD3/Ti-Rezeptorkomplex auf der T-Zellenoberfläche in Assoziation mit einem CD-Antigen, wie CD4&spplus;oder CD8, das Antigen in Assoziation mit dem geeigneten MHC-kodierten Antigen "sieht" (man vergleiche z.B. P. Anderson et al., "Cross-Linking of T3 (CD3) with T4 (CD4) Enhances The Proliferation of Resting T Lymphocytes", J. Immunol. 139 (NO. 3):678-82 (1987)).
- Im Rahmen der vorliegenden Unterlagen werden unter CD- Antigenen natürlich vorkommende Zelloberflächendifferenzierungsantigene verstanden, die durch die Reaktivität von monoklonalen Antikörpern (mAbs) auf der Oberfläche von Zellen definiert sind, dies entspricht der von einem internationalen Arbeitskreis vorgeschlagenen Bezeichnung, dessen Aufgabe es ist, eine einheitliche Nomenklatur für diese Antigene vorzuschlagen (man vergleiche z.B. A.J. Mcmichael (Hrsg.), Leukocyte Typing III, Oxford University Press (Oxford, U.K. 1987)). Eine große Zahl von CD-Antigenen ist molekular kloniert worden und ist daher vollständig charakterisiert (Id.). Zu gut bekannten CD- Antigenen gehören die pan-T-Antigene, CD3, CD2, CD5, CD6 und CD7, ein für die Helfer-T-Zellen-Untergruppe spezifisches CD-Antigen, CD4, und ein für die Suppressor-T-Zellen-Untergruppe spezifisches CD-Antigen, CD8 (man vergleiche z.B. J.A. Ledbetter et al, in Perspectives in Immunogenetics And Histocompatibility, Bd. 6, E. Heise (Hrsg.), Lymphocyte Surface Antigens 1984, 5. 325-40, American Society For Histocompatibility And Immunogenetics (New York 1984)). CD28 ist ein Antigen, das auf einer Vielzahl von T-Zellen vorhanden ist (Yamada et al., Eur. J. Immunol. 15:1164-1169 (1985)). Obwohl von diesen Differenzierungsantigenen angenommen wird, daß sie als Rezeptoren der oben beschriebenen Art fungieren und obwohl sie mit der Signaltransduktion in T-Zellen in Verbindung gebracht worden sind, ist ihre genaue Funktion bei der T-Zellenaktivierung nicht bekannt und Gegenstand intensiver Forschung.
- So sind beispielsweise Untersuchungen durchgeführt worden, um die Rolle der CD-Antigene bei der T-Zellenaktivierung im molekularen Bereich herauszufinden. Es ist bekannt, daß die Reaktion des CD3/Ti-Rezeptorkomplexes mit entweder mAb oder einem Antigen zur Generation eines Transmembran-"Signales" innerhalb der T-Zelle führt. Dieses Signal wird oft durch die Produktion von Inositphosphaten(1, 2 und 3) und eine Zunahme der Konzentration von cytoplastischem, freiem Calcium ((Ca ²&spplus;)i) charakterisiert (man vergleiche z.B. J.B. Imboden et al., "Transmembrane Signalling By The T Cell Antigen Receptor", J. Exp. Med. 161:446-56 (1985) and J.B. Imboden et al., "Antigen Recognition By A Human T Cell done Leads To Increases In Inositol Trisphosphate", J. Immunol., 138 (No. 5): 1322-24 (1987)).
- Die Generation dieses Signals kann jedoch zur Stimulierung der T-Zellen-Proliferation nicht ausreichen. (Id. bei 873). Unter experimentellen Bedingungen konnte festgestellt werden, daß, wenn das CD3-Antigen auf der T-Zellenoberfläche vernetzt ist, z.B. durch Umsetzen dieser Zelle mit einem vernetzten Antikörper, wobei der Antikörper entweder in Anwesenheit von zusätzlichen Zellen (z.B. durch die Interaktion des Monocyten-Fc-Rezeptors mit dem Fc-Teil eines Antikörpers für CD3) oder durch Immobilisieren des Antikörpers an einem festen Träger vernetzt wurde, eine T-Zellenproliferation resultiert.
- Somit stimulieren mAbs für den CD3/Ti-Rezeptorkgmplex,die an einen festen Träger gekoppelt worden sind, T-Zellen dazu, zu proliferieren (man vergleiche z.B. P. Anderson et al., siehe oben und C. Walker et al., "Activation of T Cells By Cross-Linking An Anti-CD3 Antibody With A Second Anti-TCell Antibody:Mechanism And Subset-Specific Activation", Eur. J. Immunol., 17:873-80 (1987)). Dies beruht teilweise auf der Quervernetzung des CD3-Antigens und teilweise auf der Verhinderung der Internalisation des CD3/Ti-Rezeptorkomplexes, wobei diese Internalisation dazu neigt, die Zellenaktivierung zu inhibieren (man vergleiche z.B. J.A. Ledbetter et al., "Valency Of CD3 Binding And Internalization Of The CD3 Cell-Surface Complex Control T Cell Responses To Second Signals", J. Immunol., 136: 3945-52 (1986)). Es bestehen jedoch beträchtliche Schwierigkeiten hinsichtlich der Verwendung von Anti- CD3, der an einem festen Träger immobilisiert ist, zur Unterstützung der T-Zellenaktivierung in vivo für therapeutische Anwendungen. Eine derartige Verwendung würde die Injektion des festen Trägers, gewöhnlich kleine Kügelchen, in einen Patienten bedingen. Dies wiederum könnte ein gewisses Gefahrenmoment für die Gesundheit des Patienten darstellen und beispielsweise zu blockierten oder verklebten Arterien führen.
- Es ist weiterhin vorgeschlagen worden, daß unter physiologischen Bedingungen sogar diese CD3/Ti-Stimulierung durch Quervernetzung des CD3-Antigens nur ein minimales Signal hervorruft, das durch Interaktionen auf der T-Zellenoberfläche zwischen CD3/Ti und anderen CDAntigenen verstärkt werden müßte (man vergleiche P. Anderson et al., siehe oben bei 5. 678).
- Es besteht außerdem eine Unsicherheit hinsichtlich der exakten Auswirkung der CD-Antigeninteraktionen bei der T-Zellenaktivierung. So deuten beispielsweise die Analyse von Varianten mit spontanem CD4-Verlust (man vergleiche P. Marrack et al., "The Major Histocompatiblity Complex Restricted Antigen Receptor On T Cells II, Role.Of The L3T4 Product", J. Exp. Med. 158:1077-91 (1983)) und ferner Gentransferexperimente (man vergleiche z.B. D. Gay et al., "Functional Interaction Between Human T-Cell Protein CD4&spplus;And The Major Histocompatibility Complex HLA-DR Antigen", Nature, 328:626-29 (1987) daraufhin, daß die Expression von CD4&spplus;die T-Zellenantwort auf ein spezifisches Antigen erhöht und daß CD4&spplus;eine besonders wichtige Rolle spielt, wenn die Konzentrationen der Antigene suboptimal sind oder wenn die Avidität der T-Zelle auf Antigen/ MHC-kodiertes Antigen niedrig ist (man vergleiche A. Regnier- Bigouroux et al., "Accessory Molecules And T Cell Activation I. Antigen Receptor Avidity Differentially Influences T Cell Sensitivity To Inhibition By Monoclonal Antibodies To LFA-1 And L3T4", Eur.J. Immunol., 16:1385-90 (1986) und S. Shaw et al., "Susceptibility Of Cytotoxic T Lymphocyte (CTL) Clones To Inhibition By Anti-T3 and Anti-T4 (but not Anti-LFA-1) Monodonal Antibodies Varies With The "Avidity" Of CTL-Target Interaction", J. Immunol., 134 (No. 5): 3019-26 (1985)). Falls mAbs, die mit CD3 und CD4&spplus;reagieren können, auf demselben festen Träger immobilisiert werden, wurde außerdem die Proliferation der T-Zellen, die den immobilisierten Antikörpern ausgesetzt waren, verstärkt. Zudem tritt, wenn mAbs für CD3 und CD8 an einen festen Träger gekoppelt werden, eine Proliferation der T-Zellen ein, die stärker ist als diejenige, die dann beobachtet wird, wenn man nur mit einem Antikörper für CD3 alleine behandelt (man vergleiche P. Anderson et al., siehe oben).
- Jedoch deuten Untersuchungen mit löslichem CD4&spplus;monoklonalem Antikörper darauf hin, daß derlösliche Antikörper die T- Zellenantwort inhibiert. Dies deutet darauf hin, daß CD4 ein negatives Signal übermitteln kann, das die T-Zellenaktivierung inhibiert (man vergleiche z.B. J.P. Bank et al., J. Exp. Med. 163:1294 (1985); J.P. Tite et al., "The Role Of L3T4 In T Cell Activation: L3T4 May Be Both An Ia-Binding Protein And A Receptor That Transduces A Negative Signal", J. Cell. Mol. Immunol., 2:179-90 (1986); und P.M. Rosoff et al., "The Role Of The L3T4 Molecule In Mitogen And Antigen- Activated Signal Transduction", Cell, 49:845-53 (1987)).
- B-Lymphocyten, die auch als B-Zellen bezeichnet werden, sind die Prekursoren der antikörper-produzierenden (Plasma) Zellen. Sobald B-Zellen durch ein Antigen stimuliert werden (dies erfordert die Kooperation von Helfer-T-Zellen und Makrophagen) proliferieren die B-Zellen und differenzieren zu Plasmazellen und Gedächtnis-B-Zellen. CD-Antigene, die auf B-Zellen identifiziert worden sind, sind beispielsweise CD19, CD20, CDw4O, CD45, CD45R und Bgp95 (ein Antigen, das bis jetzt noch keine CD-Bezeichnung erhalten hat) (McMichael, Leukocyte Typing III, siehe oben).
- Ein weiteres interessantes CD-Antigen ist das CD45 leukocyte common antigen (L-CA, auch als T200 oder Ly-5 bekannt). CD45 umfaßt eine Familie von Haupt-Glykoproteinen, die von einem Molekulargewicht (Mw) von 180 bis 220 kDA reichen, welches auf hämopoetische Zellen beschränkt ist (Trowbridge et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:157- 161 (1975); Komuro et al., Immunogenetics 1:452-456 (1975); Schied et al., Immunogenetics 9:423-433 (1979); Dalchau et al., Eur. J. Immunol. 10:737-744 (1980) und Omary et al., J. Exp. Med. 152:842-852 (1980)). Bestimmte Isoformen von CD45 entstehen beim alternativen mRNA-Spleißen. Diese Isoformen werden differenziell auf Subpopulationen von T- und B-Lymphocyten exprimiert. Einige monoklonale Antikörper (mAbs) für das Human-CD45- Antigen erkennen Epitope, welche allen CD45-Isoformen mit Mw220, 205, 190 und 180 kDa gemeinsam sind (Cobold et al., Leukocyte Typing III, siehe oben, Kapt. 15, 5. 788-803). Andere mAbs erkennen jedoch nur die 220 kDa-Isoform von CD45 (als CD45R bezeichnet), die selektiv auf B-Lymphocyten und einer Subpopulation von T-Zellen exprimiert wird (Cobold,siehe oben; Dalchau et al., 3. Exp. Med. 153: 753-765 (1981); Morimoto et al., J. Immunol. 134:1508-1515 (1985); und Ledbetter et al., J. Immunol. 135:1819-1825 (1985)). Ein weiterer monoklonaler Antikörper, UCHL-1, bindet selektiv an die 180 kDa-Spezies, die auf kortikale Thymocyten und eine Untergruppe von aktivierten oder Gedächtnis- T-Zellen beschränkt ist (Smith et al., Immunology, 58:63-70 (1986)).
- Kürzlich sind die Primärstrukturen von Ratten-(Thomas et al., Cell, 41:83-93 (1985) und Barclay, et al., EMBO J. 6:1259-1264 (1987)), Mäuse-(Sage et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 83:6940-6944 (1986); w.C. Raschke, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 84:161-165 (1987); Thomas et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci USA 84:5360-5363 (1987) und Saga et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 84:5364-5368 (1987)) und Human-(Ralph et al., EMBO J. 6:1251-1257 (1987) und Streuli et al., J. Exp. Med. 166:1548-1566 (1987)) CD45-(L-CA) aus cDNA-Nukleotidsequenzen abgeleitet worden. CD45 ist ein integrales Membranprotein mit einem großen cytoplasmischen 705-707-Aminosäuresegment, einem 22-Aminosäuretransmembransegment und einer extracellulären Domäne, die von 400 bis 550 Aminosäuren reicht. Die verschiedenen Isoformen von CD45, die beim alternativen mRNA-Spleißen primärer Transkripte eines einzelnen Gens generiert werden, haben unterschiedliche extrazelluläre Domänen, besitzen jedoch dieselben Transmembran und cytoplasmischen Segmente (Barclay, siehe oben; Ralph, siehe oben und Streuli, siehe oben). Das cytoplasmische Segment hat zwei homologe, hochkonservierte Domänen von etwa 300 Resten.
- Untersuchungen, die durchgeführt werden, um die Funktion von CD45 zu bestimmen, haben zu einander widersprechenden Ergebnissen geführt (Cobald, siehe oben). Es wurde berichtet, daß mAbs gegen Human- oder Mäuse-Antigen die T und B-Zellproliferation (Harp et al., J. Immunol. 133:10-15 (1984),
- Bernabeu et al., Eur. J. Immunol. 17:1461-1466 (1987) und Mittler et al., J. Immunol. 138:3159-3166 (1987)), die Produktion Antikörper-bildender Zellen (Yakura, J. Exp. Med. 157:1077-1088 (1983)) und die Aktivität natürlicher Killerzellen (Natural killer cell; NK) und cytotoxischer T-Zellen (Seaman et al., J. Immunol. 127:982-986 (1981); W. Newman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 79:3858-3862 (1982); Nakayama et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 76:1977-1981 (1979) und Lefrancois et al., Nature (London) 314:449-452 (1985)) inhibieren. Es wurde jedoch auch berichtet, daß Anti-CD45-mAbs unter gewissen Bedingungen die T-Zellproliferation erhöhen (Cobold, siehe oben, Ledbetter, siehe oben und Martorell et al., Eur. J. Immunol. 17:1447-1451 (1987)). Thomas, siehe oben, hat vorgeschlagen, daß der cytoplasmische 80 kDa-Teil des Moleküls mit seinen beiden konservierten homologen Domänen eine kritische Rolle bei der CD45-Funktion spielen könnte. Kürzlich wurde festgestellt, daß diese Domänen homolog sind mit einer Haupt-Proteintyrosinphosphatase mit niedrigem Molekulargewicht, die sowohl aus der löslichen als auch aus der festen Fraktion von Humanplacenta isoliert wurde (Tonks et al., J. Biol. Chem., 263:6722-6730 (1988); und Charbonneau et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:7182-7186 (1988)). Dies deutet darauf hin, daß CD45 eine membrangebundene Proteintyrosinphosphatase ist, die durch Wechselwirkung mit anderen Membranassoziierten Molekülen ihre Funktion erfüllt.
- In Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985), 82 (24) 8648-52 offenbaren M.A. Lin et al. Heteroantikörper-Duplexe, die durch kovalente Bindung eines Antikörpers gegen den T3-Komplex, der mit den α,β-Rezeptoren menschlicher, reifer T-Zellen assoziiert ist, und eines zweiten Antikörpers, der spezifisch für das Oberflächenantigen auf einem Human-B-Lymphom ist, gebildet werden. Das Heterokonjugat induziert die Lysis von B- Lymphomz ellen durch Human-T8 +-CTLs.
- Die EP-A-0 235 805 offenbart ein Gemisch von monoklonalen Anti- T-Zellen-Antikörpern mit unterschiedlicher Spezifität, wobei wenigstens einer davon zur Klasse IgG und wenigstens ein weiterer zur Klasse IgM gehört. Während die Antikörper vom IgG- Typ verwendet werden, um lymphoides und transplantiertes Gewebe effektiv zu erreichen, werden die Antikörper vom IgM-Typ zur Inaktivierung zirkulierender T-Zellen im wirtssäugetier verwendet.
- Die vorliegende Erfindung klärt einige der oben erwähnten Unsicherheiten und stellt Antikörper-Heterokonjugate bereit, welche mindestens zwei Antikörper aufweisen, die mit unterschiedlichen Oberflächenantigenen reagieren können, welche auf Lymphocyten, beispielsweise T-Zellen, exprimiert werden, wobei die Antikörper miteinander vernetzt sind. Bestimmte dieser Heterokonjugate verstärken die Signaltransduktion bei der Aktivierung von T-Zellen, bestimmt durch deren Fähigkeit zur Steigerung von ((Ca²&spplus;)i) in T-Zellen bei Proteinkonzentrationen, die in etwa um zwei Größenordnungen niedriger sind als die für den Antikörper gegen das CD3-Antigen alleine.
- Eine erste erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft ein zur Regulierung von Lymphocyten verwendbares Heterokonjugat, umfassend wenigstens zwei Moleküle, die ausgewählt sind unter Antikörpern und Ligandenproteinen, die in der Lage sind, an Antigene auf Lymphocyten zu binden, wobei die Moleküle miteinander vernetzt sind und jedes Molekül jeweils mit einem anderen Antigen, das sich auf der Oberfläche bestimmter Lymphocyten befindet, reagieren kann; vorzugsweise handelt es sich bei dem Heterokonjugat um ein Antikörperheterokonjugat, das zur Aktivierung von T-Lymphocyten brauchbar ist und wenigstens zwei miteinander vernetzte Antikörpermoleküle umfaßt, wobei jeder Antikörper jeweils mit einem anderen Antigen, das sich auf der Oberfläche bestimmter Lymphocyten befindet, reagieren kann.
- Zu den erfindungsgemäß erhältlichen Heterokonjugaten gehören auch solche, welche die Aktivierung und Funktion von Lymphocyten inhibieren können.
- Nach einer bevorzugten erfindungsgemäflen Ausführungsform wird ein monoklonaler Antikörper, der mit dem CD3/Ti- Rezeptorkomplex oder dessen Komponenten reagieren kann, mit einem monoklonalen Antikörper vernetzt, welcher mit einem zweiten Antigen auf der T-Zelloberfläche, beispielsweise das CD2, CD4, CD6 oder CD8-Antigen, reagieren kann, um Heterokonjugate zu bilden, welche die Signaltransduktion bei der Aktivierung von T-Zellen verstärken. Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein monoklonaler Antikörper, der mit dem CD5-T-Zellenoberflächenantigen reagieren kann, mit einem monoklonalen Antikörper vernetzt, der mit einem zweiten Antigen auf der T-Zelloberfläche, beispielsweise der CD4, CD6 oder CD8-Antigen, reagieren kann. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Heterokonjugat, das aus einem Antikörper für CD3, der mit einem Antikörper für CD4&spplus;vernetzt ist, aufgebaut ist.
- Nach einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform wird ein monoklonaler Antikörper, der mit dem CD45-T-Zellenoberflächenantigen reagieren kann, mit einem monoklonalen Antikörper vernetzt, der mit einem zweiten Antigen auf den T-Zellenoberflächen, beispielsweise dem CD2, CD3, CD5 oder CD28-Antigen, reagieren kann, um Heterokonjugate zu bilden, welche die Aktivierung und Proliferation von Lymphocyten inhibieren. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft Heterokonjugate, die aus einem Antikörper für CD3, der mit einem Antikörper vernetzt ist, welcher mit dem CD45-Antigen oder den Isoformen von CD45 reagieren kann, aufgebaut ist.
- Erfindungsgemäß werden auch in vitro- Verfahren zur Behandlung von Lymphocyten mit den erfindungsgemäß erhältlichen Heterokonjugaten bereitgestellt, um die Aktivierung von Lymphocyten bei der Produktion von zellulären Immunantworten zu verstärken oder zu inhibieren. Die erfindungsgemäß bereitgestellten Heterokonjugate können daher in pharmazeutischen Mitteln eingesetzt werden, beispielsweise in solchen, die eine pharmazeutisch wirksame Menge mindestens eines erfindungsgemäß bereitgestellten Heterokonjugats und einen pharmazeutisch verträglichen Träger aufweist. Somit können die erfindungsgemäß bereitgestellten Heterokonjugate, Verfahren und Mittel bei der Immuntherapie zum Verstärken oder Regulieren von Immunantworten Anwendung finden, beispielsweise bei der Behandlung von infektiösen Erkrankungen, Krebs, AIDS und Autoimmunerkränkungen.
- Figur 1 zeigt eine vergleichende graphische Darstellung des Ansteigens der Konzentration von cytoplasmischem freiem Calcium ((Ca²&spplus;)i) gegen die Zeit nach Stimulierung der Peripherblutlymphocyten mit unterschiedlichen Konzentrationen von entweder (A) einem CD3/CD4-Heterokonjugat einer erfindungsgemäßen Ausführungsform, G19-4/G17-2 oder (B) einem anti-CD3-monoklonalen Antikörper, G19-4.
- Figur 2 zeigt vergleichende graphische Darstellungen des ((Ca²&spplus;)i)- signals und den Prozentsatz der ansprechenden Zellen gegen die Zeit nach Stimulierung von entweder Peripherblutlymphocyten (PBL) oder von CD4&spplus;-T-Zellen mit einem erfindung sgemäßen CD3/CD4-Heterokonjugat, G19-4/G17-2. Der inhibierende Effekt der Vorbehandlung der Zellen mit dem anti-CD4-monoklonalen Antikörper, G17-2, auf die eine Stimulierung mit dem Heterokonjugat folgt, ist ebenfalls dargestellt.
- Figur 3 zeigt vergleichende Titrationen der (Ca²&spplus;)i-Aktivität des erfindungsgemäßen G19-4/G17-2-Heterokonjugats ( ) oder des anti-CD3-monoklonalen Antikörpers, G19-4 ( ), auf CD4&spplus;-T-Zellen in Anwesenheit von 5 mM EGTA.
- Figur 4 zeigt vergleichende graphische Darstellungen der Zunahme an Inositphosphaten gegen die Zeit nach Stimulierung von CD4&spplus;-T-Zellen mit anti-CD3, G19-4 ( ) oder mit einem erfindungsgemäßen CD3/CD4-Heterokonjugati G19-4/G17-2 (Δ) bei 1 µg/ml. Der Inositphosphatlevel bei nicht-stimulierten Kontrollen (0) bei t = 0 und t = 10 Min. sind ebenfalls dargestellt. Das Diagramm A zeigt die Zunahme an Inositphosphat 1 (InsP&sub1;); das Diagramm B zeigt die Zunahme an Inositphosphat 2 (InsP) und das Diagramm C zeigt die Zunahme and Inositphosphat 3 (InsP&sub3;).
- Figur 5 zeigt zwei unabhängige Experimente, in denen die Zunahme an Insp, nach der Stimulierung der CD4&spplus;-T-Zellen und nach Vorbehandlung mit Biotin-konjugiertem Anti-CD4&spplus;(G17-2), mit entweder Anti-CD3 (G19-4), G17-2, einem CD3/CD4-Heterokonjugat (G-19-4/G17-2) oder Avidin und Kombinationen davon, wie dies in der Zeichnung dargestellt ist, gemessen wurde.
- Figur 6 zeigt die Wirkungen eines anti-CD3-monoklonalen Antikörpers (CD3 Mono), eines CD3/CD3-Homokonjugates (CD3 Homo), eines CD4/CD4-Homokonjugates (CD4&spplus;Homo) und eines CD3/CD4-Heterokonjugates gemäß der vorliegenden Erfindung (CD3 + 4 Hetero) auf die T-Zellenproliferation, angezeigt durch (³H)-Thymidin-Inkorporation von CD4&spplus;-T-Zellen, mit oder ohne PMA oder Antikörper gegen CD28.
- Figur 7 zeigt eine vergleichende graphische Darstellung des proliferativen Ansprechens der CD4&spplus;-T-Zellen, ausgedrückt durch ³H-Thymidin-Inkorporation gegen die Konzentration von entweder G19-4 (CD3 Mono) + PMA ( - ), G19-4 + Anti-CD28 (α-CD28) ( - ), einem CD3/CD4-Heterokonjugat (CD3 + 4 Hetero) PMA ( ... ), einem CD3/CD4-Heterokonjugat + α-CD28 ( - ), einem CD3/CD3-Homokonjugat (CD3 Homo) + PMA ( - ) oder einem CD3/CD3-Homokonjugat + α-CD28 ( - ).
- Figur 8 zeigt den Prozentsatz an CD4&spplus;-T-Zellen nach dem ersten, zweiten oder dritten Zellzyklus nach Stimulierung der T-Zellen während eines Zeitraums von 3 Tagen mit entweder PHA (Phytohemagglutinin), einem erfindungsgemäßen CD3/CD4-Heterokonjugat, G19-4/G17-2, einem CD3/CD3-Homokonjugat, G19-4/G19-4, einem zur Kontrolle eingesetzten CD3/CD8-Heterokonjugat, G19-4/G10-1, und einem CD4/CD4- Homokonjugat, G17-2/G17-2.
- Figur 9 zeigt eine vergleichende graphische Darstellung der Inhibierung der proliferativen Antwort der T-Zellen, induziert durch immobilisierten Anti-CD3 mab G19-4, angezeigt durch (³H)-Thymidin-Inkorporation entweder alleine ( ) oder gegen die Konzentration von entweder Anti-CD45- mab 9.4 ( ) oder Anti-p97 mAb 96.5 ( ), ohne(A) oder mit (B) PMA, (Proliferation mit Anti-CD45 mab 9.4 in Lösung ( ) ist für Vergleichszwecke ebenfalls dargestellt, Mittelwerte sind ebenfalls angegeben: die Standardabweichungen betrugen < 15 %).
- Figur 10 zeigt Graphiken, welche die Regulierung der Signaltransduktion in T-Zellen durch den CD45-Rezeptor wiedergeben, bestimmt durch die Zunahmen an (Ca²&spplus;)i gegen die Zeit nach Vernetzen der Rezeptoren an T-Zellen entweder alleine oder zusammen mit Anti-CD45 mab 9.4 oder Anti-CD45R mAb 3 AC5, wie dies im Beispiel 4 beschrieben ist (siehe unten). Der Mittelwert (Ca²&spplus;)i ist auf der linken Seite gezeigt: der Prozentsatz an ansprechenden Zellen ist auf der rechten Seite für jedes Experiment dargestellt: die Pfeile zeigen an, wann mAbs oder Avidin zugegeben wurden.
- Zum besseren Verständnis der Erfindung wird die nachfolgende detaillierte Beschreibung gegeben.
- Die vorliegende Erfindung betrifft neue Antikörper- Heterokonjugate und deren Verwendung bei der Verstärkung oder Inhibierung der Lymphocyten-Aktivierung und-Funktion. Die Erfindung betrifft insbesondere Heterokonjugate, die aus mindestens zwei Antikörpern aufgebaut sind, welche miteinander vernetzt sind, wobei jeder Antikörper mit einem anderen Lymphocyten-Zelloberflächenantigen reagieren kann. Es ist für die Verstärkung der Aktivität bevorzugt, daß einer der Antikörper des Konjugats mit dem T-Zellenrezeptor (Ti) oder dessen assoziierten CD3-Antigenkomplex reagieren kann, während der andere Antikörper mit einem zweiten T-Zellenoberflächenantigen reagieren kann, wozu beispielsweise die CD-Antigene zählen (z.B. CD2, CD4, CD6 oder CD8). In alternativer Weise kann einer der Antikörper des Konjugats mit dem CD5-Antigen reagieren, während der andere Antikörper mit einem zweiten T-Zellenoberflächenantigen reagieren kann, wie CD4, CD8 oder CD8. Das Heterokonjugat CD4/CD45 führt ebenfälis zu verstärkter T-Zellenaktivität.
- Zum Zwecke der Inhibierung ist einer der Antikörper der Heterkonjugate vorzugsweise derart, daß er mit der CD45-Familie von Antigenen (Isoformen) reagieren kann, während der andere Antikörper mit einem T-Zellenoberflächenantigen, wie CD2, CD3, CD5 oder CD28, reagieren kann. Es wird daher angenommen (wobei dies keinen verbindlichen Charakter hat), daß die hier beschriebenen Heterokonjugate, wenn sie mit Lymphocyten reagieren, dadurch wirken, daß sie an die entsprechenden Antigene auf der Oberfläche der Zelle binden, wodurch sie diese Antigene in eine enge räumliche Nachbarschaft miteinander bringen. Dies stellt einen Schritt dar, welcher die zwischen dem T-Zellenrezeptor und CD4&spplus;nach Kontakt der Helfer-T-Zellen mit Antigen-präsentierenden Zellen während der T-Zellenaktivierung stattfindende Cluster-Bildung nachahmen könnte (man vergleiche z.B. A. Kupfer et al., "Coclustering Of CD4&spplus;(L3T4) Molecule With The T-Cell Receptor Is Induced By Specific Direct Interaction Of Helper Interaction of Helper T Cells And Antigen-Presenting Cells", Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 84:5888-5892 (1987)). Diese Interaktion zwischen T-Zellenantigenen auf der Zelloberfläche scheint die CD3/Ti-vermittelte Transmembransignalisierung und somit die T-Zellenaktivierung zu verstärken.
- Obwohl der Mechanismus der Wirkung des CD45-Antigens auf Lymphocyten noch nicht verstanden wird, könnte es ein, daß die hier beschriebenen CD45-Heterokonjugate dadurch ihre Wirkung entfalten, daß sie andere Lymphocytenrezeptoren funktional modifizieren, wenn sie mit diesen in eine enge physikalische Assoziation gebracht werden, wobei dies beispielsweise zu einer Inhibierung nach der Aggregation bestimmter CD-Rezeptoren,.beispielsweise dem CD3-Antigen, führt.
- Die kürzlich beschriebene Homologie zwischen den cytoplasmischen Domänen von CD45 und der Haupt-Proteintyrosinphosphatase aus Humanplazenta legt nahe, daß erstere in der Tat eine membrangebundene Proteintyrosinphosphatase ist, welche die Signaltransduktion in Leukocyten durch Dephosphorylierung von Schlüsseltyrosylresten an anderen membran-assoziierten Molekülen, wie beispielsweise an der Zetakette von CD3, modifiziert. (Klausner et al., J. Biol. Chem., 262:12654-12659 (1987)}. CD45 könnte auch die mit CD4&spplus;assozuerte Proteintyrosinkinaseaktivität modifizieren, wobei dessen Funktion normalerweise wäre, die Antigen-verursachte Signaltransduktion zu regulieren (Rudd et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci, USA 85:5190-5194 (1988)). Weiterhin könnte die CD4-assoziierte Tyrosinkinase das CD45-Antigen an seinen Tyrosylresten phosphorylieren und dessen Aktivität verändern. Dies könnte für die einzigartige verstärkende Aktivität verantwortlich sein, welche als Ergebnis der Vernetzung der CD4&spplus;und CD45-Rezeptoren erhalten wird, wie dies in den nachstehenden Beispielen näher erläutert ist. Nach diesem Modell ließe sich vorhersagen, daß die Phosphorylierung der Schlüsseltyrosylreste zuvor stattfindet und für die Mobilisierung von Calcium notwendig ist. Eine integrale Membranform des Enzyms, welche nur in enger Nachbarschaft mit anderen Membran-assoziierten Proteinen funktioniert, könnte dazu dienen, eine Proteintyrosinkinase/Phosphataseregulierung an bestimmten Zelloberflächenmolekülen zu lokalisieren. Es wird daher angenommen, daß die erfindungsgemäß bereitgestellten Heterokonjugate die Lymphocytenaktivierung und -funktion verstärken oder inhibieren können.
- Es sollte festgehalten werden, daß die T-Zellenregulierung, d.h. Inhibierung, gemäß der vorliegenden Erfindung eine pan-T-Zellenregulierung oder die Regulierung einer bestimmten Untergruppe oder Klons der T-Zellen sein kann. Die pan-T- Zellen- regulierung resultiert aus dem Kontakt der T-Zellen mit Heterokonjugaten,welche die Gesamtheit oder Population der T-Zellen regulieren. Diese Heterokonjugate sind aus Antikörpern aufgebaut, welche mit T-Zellenantigenen reagieren können, die auf allen T-Lymphocyten gefunden werden. Ein solches Heterokonjugat ist das erfindungsgemäße CD3/CD2-Heterokonjugat, wobei CD3 und CD2 pan-T-Zellenantigene sind (man vergleiche z.B. J.A. Ledbetter et al., in Perspectives in Immunogenetics And Histocompatibility, siehe oben, Tabelle 1).
- Durch Einsatz einesgeeigneten Heterokonjugats kann jedoch eine spezifischere Regulierung erzielt werden. Dies gilt beispielsweise für Fälle, in denen es gewünscht ist, nur eine spezifische Subpopulation der T-Zellen, beispielsweise den Helfer- oder Suppressor-Subset, zu aktivieren. Dies kann man beispielsweise dadurch erreichen, daß man ein Heterokonjugat konstruiert, in dem einer der Antikörper mit der bestimmten T-Zellensubpopulation reagieren kann, d.h. einer der Antikörper muß mit einem Antigen reagieren können, das für diese Subpopulation spezifisch ist. Der andere Antikörper des Konjugats ist vorzugsweise spezifisch für ein pan-T-Zellenantigen. Liegt eine solche Ausführungsform vor, dann verstärken erfindungsgemäße CD3/CD4&spplus;oder CD5/CD4-Heterokonjugate die Aktivierung der Helfer-T-Zellen in spezifischer Weise (CD4&spplus;ist spezifisch für den Helfer- T-Zellensubset), während CD3/CD8 oder CD5/CD8-Heterokonjugate die Aktivierung der Suppressor-T-Zellensubpopulation spezifisch verstärken (CD8 ist spezifisch für den Suppressor T-Zellensubset).
- In alternativer Weise inhibieren erfindungsgemäße CD3/CD45- Heterokonjugate spezifisch die Aktivierung von T-Zellen, welche CD45-Antigene tragen. Da Isoformen des CD45-Rezeptors ebenso auf Subsets von T-Zellen exprimiert werden, können erfindungsgemäße Heterokonjugate, welche einen mit CD45- Isoformen reaktiven Antikörper enthalten, ebenfalls für die Regulierung dieser Untergruppen von T-Zellen eingesetzt werden.
- Ist eine klonotypische Regulierung erwünscht (i.e.: Regulierung von spezifischen T-Zellklonen), dann enthält das erfindungsgemäße Heterokonjugat einen antiklonotypischen (Ti)-Antikörper als einen seiner Bestandteile, i.e. einen Antikörper, der mit der variablen Region des T-Zellenrezeptors desjenigen Klons reagiert, der reguliert werden soll. Ist somit eine klonotypische T-Zelle nicht in der Lage, ein bestimmtes Antigen, z.B. ein Tumor- oder virales Antigen, in adaequater Weise zu erkennen oder darauf anzusprechen oder ist sein Ansprechen unterdrückt, dann kann ein erfindungsgemäßes Heterokonjugat, das einen für diese T-Zelle (Ti/CD4, Ti/CD8, Ti/CD6, Ti/CD2) spezifischen anti-klonotypischen Antikörper enthält eingesetzt werden, um diese T-Zellklone zu regulieren. In alternativer Weise ist es möglichi für die Inhibierung eines bestimmten Klons von T-Zellen ein Heterokonjugat einzusetzen, das aus Ti/CD45 (oder Ti/CD45-Isoform) aufgebaut ist. Bei dieser Ausführungsform kann die Ti-Komponente des Heterokonjugats derart angesehen werden, als ob sie im wesentlichen den Platz des Antigens bei der Regulierung der spezifischen T-Zelle einnimmt. Der andere Antikörper des Heterokonjugats kann ein pan-T-zellenspezifischer oder Untergruppen-spezifischer Antikörper oder ein Antikörper sein, der mit CD45 oder der CD45-Isoform reagieren kann.
- Somit enthalten die Antikörper, welche die erfindungsgemäßen Heterokonjugate aufweisen, jeden Antikörper, der mit einem Lymphocytenoberflächenantigen reagieren kann. Nach einer bevorzugten Ausführungsform kann einer der Antikörper des Konjugats mit dem Ti oder CD3- Zellantigen reagieren. Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Antikörper, der mit dem CD3-T-Zellenoberflächenantigen reagieren kann, mit einem Antikörper vernetzt, der mit dem CD4-Antigen auf der T-Zellenoberfläche reagieren kann.
- Zu weiteren Antikörpern, welche die erfindungsgemäßen Heterokonjugate umfassen können, zählen Antikörper, welche mit anderen CD-Antigenen reagieren können, z.B. CD2, CD5, CD6, CD7, CD8, CD28 und CD28 auf Lymphocyten (man vergleiche zB. A. Bernard et al., (Hrsg.), Leukocyte Typing, Springer Verlag (Heidelberg 1984); und J.A. Ledbetter et al. in Perspectives In Immunogenetics And Histocompatibility, siehe oben). Diese Aufzählung ist jedoch nicht vollständig. Nach einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform wird daher ein Antikörper, der mit dem CD5-T-Zellenoberflächenantigen reagieren kann, mit einem Antikörper vernetzt, der mit dem CD4, CD6 oder CD8-Antigen reagieren kann, um ein erfindungsgemäßes Heterokonjugat zu bilden. Eine weiterhin bevorzugte Ausführungsform ist ein Antikörper, der mit dem CD3-T-Zellenoberflächenantigen reagieren kann und der mit einem Antikörper vernetzt ist, welcher mit dem CD45-Antigen oder der Isoform von CD45 auf der Lymphocytenzelloberfläche reagieren kann.
- Die Antikörper, welche die erfindungsgemäflen Heterokonjugate umfassen, können polyklonal oder vorzugsweise monoklonal sein, können intakte Antikörpermoleküle oder Fragmente sein, welche die aktive Bindungsregion des Antikörpers aufweisen, z.B. Fab oder F(ab')2,und können durch im Stande der Technik gut bekannte Verfahren hergestellt werden (man vergleiche z.B. diejenigen Veröffentlichungen, welche die Herstellung von Anti-CD3, Anti-CD4, Anti-CD5 und Anti-CD2-monoklonalen Antikörpern beschreiben und auf die in den nachstehenden Beispielen 1 bis 3 Bezug genommen wird). Außerdem sind monoklonale Antikörper für viele der CD-Antigene, wie den CD2, CD3, CD4&spplus;und CD5-Antigenen, im Handel erhältlich (Becton Dickinson, Mountainview, CA) oder können von International Leukocyte Typing Workshops bezogen werden. Falls monoklonale Antikörper zur Anwendung kommen, dann können diese Antikörper von Mäusen oder Menschen stammen oder chimäre Antikörper sein (man vergleiche z.B. V.T. Oi, "Chimeric Antibodies", Biotechniques, 4 (Nr. 3):214-221 (1986)). Zudem sind erfindungsgemäß auch bispezifische oder rekombinante monoklonale Antikörper umfaßt, wobei eine Spezifizität des Antikörpers diejenige ist, daß er mit einem T-Zellenantigen reagieren kann, wobei die andere Spezifizität auf ein zweites T-Zellenantigen gerichtet ist. Derartige bispezifische Antikörper kann man aus Quadroma oder Trioma-Zellen herstellen, wie dies in dem US-Patent 4 474 893 beschrieben ist, oder können auch chemisch hergestellt werden (Brennan et al., Sci. :229:81-83 (1985)).
- Die Antikörper, welche die erfindungsgemäflen Heterokonjugate aufweisen, können kovalent aneinander gebunden werden mittels bekannter Techniken, beispielsweise durch die Verwendung von hetero-bifunktionalen Vernetzungs-Reagenzien, GMBS (Maleimidobutryloxysuccinimid) oder SPDP (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat) (man vergleiche z.B. R.R. Hardy, "Purification and Coupling of Fluorescent Proteins For Use in Flow Cytometry", Handbook Of Experimental Immunology, Bd. 1, Immunochemistry, D.M. Weir et al, (Hrsg.), S. 31.4-31.12 4. Ausgabe, (1986) für eine Diskussion üblicher Antikörperkoppelungstechniken).
- Zur vorliegenden Erfindung gehören daher selbstverständlich auch Heterokonjugate, welche mindestens zwei Moleküle aufweisen, die mit unterschiedlichen Lymphocytenantigenen auf demselben Lymphocyt reagieren können, wobei das Heterokonjugat in der Lage ist, die Aktivierung und Funktion des Lymphocyten zu verstärken oder zu inhibieren. Erfindungsgemäß werden auch Heterokonjugate bereitgestellt, die mit Antigenen auf B-Zellen sowie auf T-Zellen reagieren können.
- Es ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäß bereitgestellten Heterokonjugate neben den Antikörpern auch Liganden enthalten können, die sich an Lymphocytenrezeptoren anlagern können. So hat sich beispielsweise herausgestellt, daß der CD4-Rezeptor mit dem Liganden gp120 (einem Glykoproteinrezeptor des Human Immunodeficiency Virus oder "HIV") (Linsley et al., J. Virology 62:3695-3702 (1988)) reagieren kann. Somit könnte ein Heterokonjugat, das aus einem Anti-CD3-Antikörper besteht, der mit dem Liganden gpl20 vernetzt ist, zur Verstärkung der T-Zellenaktivität durch Vernetzen der CD3- und CD4-Rezeptoren eingesetzt werden. Andere Ligandenkonjugate, die aus einem Liganden bestehen, der mit einem T-Zellenrezeptor reagieren kann, welcher mit einem Liganden vernetzt ist, der mit einem unterschiedlichen T-Zellenrezeptor reagieren kann, sind ebenfalls erfindungsgemäß umfaßt.
- Die erfindungsgemäß erhältlichen Heterokonjugate und deren Verwendung zur T-Zellenaktivierung werden an einer bevorzugten Ausführungsform beispielhaft dargestellt, in welcher ein Antikörper, der mit dem CD3-Antigen auf der Oberfläche von T-Zellen reagieren kann, mit einem Antikörper konjugiert wurde,der mit dem CD4-Antigen reagieren kann, um ein neues erfindungsgemäßes CD3/CD4-Heterokonjugat zu bilden. Die Behandlung von CD4&spplus;-T-Zellen mit diesem Heterokonjugat führte zu einer verstärkten Signaltransduktion in der Untergruppe von Helfer-T-Zellen angezeigt durch eine signifikante Zunahme hinsichtlich der intracellulären (Ca²+)i-Mobilisierung und einer wesentliehen Zunahme der Bildung von Inositphosphat 1, 2, und 3, verglichen mit der Behandlung der Zellen mit dem Antikörper für CD3 alleine. Diese signalverstärkende Aktivität des CD3/CD4-Heterokonjugats beruhte nicht auf einer Oligomerisation, da CD3/CD3 und CD4/CD4-Homokonjugate oder Mischungen davon diese erhöhte Aktivität nicht zeigten.
- Zudem ist zuvor im Stande der Technik gezeigt worden, daß Mischungen von Anti-CD3- und Anti-CD4-Antikörpern diese Aktivität eher herabsetzen können als verstärken (man vergleiche z.B. P.M. Rosoff et al., siehe oben). Zudem wurde die durch das Heterokonjugat hervorgerufene verstärkte Aktivität durch Vorbehandlung der T-Zellen mit dem löslichen monoklonalen Antikörper für CD4&spplus;inhibiert.
- Das CD3/CD4-Heterokonjugat zeigte außerdem eine neue funktionale Aktivität bei der T-Zellenaktivierung, d.h. das Heterokonjugat induzierte die Proliferation von CD4&spplus;-T- Zellen in Anwesenheit eines monoklonalen Antikörpers, der mit CD28 reagieren kann, und war zudem vollständig comitogen mit der CD28-Stimulierung, sogar bei so niedrigen Konzentrationen wie 100 ng/ml. Eine derartige Comitogenität wurde bei Verwendung des Antikörpers für CD3 alleine oder von CD3/CD3 oder CD4/CD4-Homokonjugat nicht festgestellt. Zudem wurde gefunden, daß das erfindungsgemäße CD3/CD4-Heterokonjugat in Kombination mit dem CD28-monoklonalen Antikörper in der Lage war, die T-Zellen in signifikanter Weise durch den Zellzyklus zu steuern, wobei eine signifikanter Anteil der Zellen innerhalb der ersten drei Tage der Stimulierung in einen zweiten Zyklus eintraten. Im Gegensatz dazu induzierten der Antikörper für CD3 alleine oder die CD3/CD3 oder CD4/CD4- Homokonjugate keinen signifikanten Zellzyklusübergang.
- Außerdem wurde gefunden, daß das CD3/CD4-Heterokonjugat die Modulation sowohl des CD3 als auch des CD4-Antigens auf der T-Zellenoberfläche verursachte. Dies führte zu einer Abnahme hinsichtlich der Oberflächenexpression von CD4. Dieses Ergebnis deutet daraufhin, daß das Heterokonjugat den T- Zellenrezeptor nicht auf einfache Weise an die T-Zellenoberfläche bindet, bzw. dort verankert, wie dies zuvor bei der Verwendung eines immobilisierten Antikörpers für CD3 der Fall war (man vergleiche z.B. J.A. Ledbetter et al., J. Immunol., siehe oben).
- Die mit dem CD3/CD4-Heterokonjugat erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß das CD4-Antigen auf der T-Zellenoberfläche eine aktive positive Rolle bei der Signaltransduktion während der T-Zellenaktivierung der CD4&spplus;-Helfer-T-Zellen mittels einer physikalischen Interaktion zwischen dem CD3/Ti-Rezeptorkomplex und dem CD4-Antigen spielt.
- Die molekularen Mechanismen, die der Fähigkeit des CD3/CD4- Heterokonjugats zur Erhöhung der Signaltransduktion zugrundeliegen, sind nicht aufgeklärt. Zumindest ein Effekt der CD4-Interaktion mit CD3/Ti scheint die Verstärkung der Inositphosphatproduktion zu sein. Dies legt nahe, daß CD4 die CD3/Ti-induzierte Hydrolyse von Membranphosphoinositiden fördern könnte, was wiederum zur Produktion von Inosittriphosphat führt. Dies wird durch die erhaltenen experimentellen Daten gestützt, welche darauf hindeuten, daß die Inositphosphat-erzeugende Aktivität des CD3/CD4- Heterokonjugats durch Reaktion der Zellen mit löslichem CD4&spplus;monoklonalem Antikörper inhibiert wird. Diese Inhibierung kann eine Folge einer Antikörper-induzierten Dissoziation von CD4&spplus;und CD3/Ti sein, falls CD3/Ti allein ein weniger wirksamer Signalvermittler ist. In alternativer Weise kann die unabhängige Interaktion von CD4&spplus;mit seinem Antikörper ein negatives Signal transmittieren, welches die Erzeugung von Inositphosphaten inhibiert.
- Da angenommen wird, daß die Erzeugung von Inosittriphosphat (InsP&sub3;) die Mobilisierung von cytoplasmischem Calcium in T-Zellen vermittelt, scheint die Interaktion von CD4&spplus;mit CD3/Ti auch die Freisetzung von Calcium aus intracellulären Speichern zu fördern.Ein Vergleich der Dosis-Ansprechkurven des CD3/CD4-Heterokonjugats gegen den Antikörper für CD3 hinsichtlich (Ca²&spplus;)-Mobilisierung zeigt, daß ein detektierbares (Ca²&spplus;)-Signal erreicht wird durch die Interaktion von wesentlich weniger Rezeptoren auf der T-Zelle, falls CD4&spplus;und CD3/Ti nebeneinander stimuliert werden, d.h. durch Verwendung des CD3/CD4-Heterokonjugats, verglichen mit dem Fall, daß CD3/Ti alleine stimuliert wird (man vergleiche Fig. 3). Eine Eigenschaft des erfindungsgemäßen CD3/CD4-Heterokonjugats ist somit seine Fähigkeit, T-Zellen bei einer niedrigen Rezeptorbeladung zu aktivieren.
- Da bekannt ist, daß die Inositphosphaterzeugung und die calciummobilisierung Signale darstellen, die mit der Aktivierung von T-Zellen assoziiert sind, wodurch eine T-Zellenproliferation herbeigeführt wird, zeigen die hier erläuterten und bereitgestellten Daten in eindeutiger Weise, daß das erfindungsgemäß bereitgestellte CD3/CD4-Heterokonjugat unabhängig vom Wirkungsmechanismus bei der Verstärkung der T-Zellenaktivierung und Proliferation nützlich ist.
- Erfindungsgemäß werden auch weitere Heterokonjugate bereitgestellt, die, wie das CD3/CD4-Heterokonjugat,verstärkte signalisierende Fähigkeiten bezüglich der T-Zellenaktivierung besitzen. So zeigten beispielsweise ein CD3/CD2-Heterokonjugat, ein CD3/CD6-Heterokonjugat, ein CD3/CD7-Heterokonjugat und ein CD3/CD8-Heterokonjugat der vorliegenden Erfindung ebenfalls eine verstärkte Aktivität bei der Mobilisierung von Calcium. Zudem wurden verschiedene Anti- CD5- haltige Heterokonjugate erfindungsgemäß konstruiert (z.B. ein CD5/CD4-Heterokonjugat, ein CD5/CD6-Heterokonjugat und ein CD5/CD8-Heterokonjugat). Diese zeigten eine verstärkte Aktivität hinsichtlich der Mobilisierung von (Ca²&spplus;) in T-Zellen.
- Die erfindungsgemäß bereitgestellten Heterokonjugate, die einen Antikörper enthalten, der mit dem CD45-Antigen oder dessen Isoformen reagieren kann, und die für die Inhibierung der Lymphocytenaktivierung und -funktion oder die Verstärkung der T-Zellenaktivierung und -funktion nützlich sind, werden an einer bevorzugten Ausführungsform exemplifiziert, in der ein Antikörper, der mit dem CD3-Antigen reagieren kann, mit einem Antikörper konjugiert wurde, der mit dem CD45- Antigen reagieren kann, um ein neues erfindungsgemäßes CD3/ CD45-Heterokonjugat bereitzustellen. Die Behandlung von T-Zellen mit diesem Heterokonjugat führte zur Aufhebung der CD3-vermittelten Aktivierung (Transmembransignal) der T-Zellen, angezeigt durch eine signifikante Abnahme hinsichtlich der intracellulären Calciummobilisation.
- Außerdem wurde die Induktion der Interaktion zwischen verschiedenen CD-Rezeptoren auf der Oberfläche von T-Zellen, wie CD3, CD2, CD5 oder CD28, und dem CD45-Rezeptor durch Verwendung monoklonaler Antikörper erreicht, um den CD45- Rezeptor auf dem Lymphocyten mit einem weiteren CD-Rezeptor auf demselben Lypmphocyten zuvernetzen. Diese Vernetzung führte zur Aufhebung der Znahme hinsichtlich der cytoplasmischen freien Calciumkonzentration ((Ca²&spplus;)i), die bei der Bildung von Homoaggregaten der T-Zellenantigene stattfand, die durch Vernetzen gemeinsamer Rezeptoren auf der Zellenoberfläche induziert wurde. Die T-Zellenproliferation, die durch eine Stimulierung mit immobilisiertem Anti-CD3-monoklonalen Antikörpern angeregt wurde, wurde durch Anti-CD45-Antikörper oder Anti-CD45R-Antikörper inhibiert, wenn sie auf derselben Oberfläche immobilisiert waren. Dies fand in Lösung nicht statt. Eine ähnliche Proliferation der T-Zelle nach Stimulierung der CD2 und CD28-Rezeptoren durch Anti-CD2- bzw. Anti-CD28-Antikörper wurde inhibiert, wenn ein CD45-Antikörper entweder mit einem Anti-CD2-Antikörper oder einem Anti-CD28-Antikörper vernetzt war. Dies fand jedoch nicht statt, wenn ein Anti-CD45-Antikörper auf getrennte Weise mit der Zellenoberfläche verbunden war. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die Heterokonjugate, die aus Antikörpern, welche mit CD45 oder Isoformen von CD45, beispielsweise OCD45R reagieren können und Antikörpern, welche mit CD-Antigenen auf T-Zellen reagieren können, bestehen, zur Regulierung der Zellen Anwendung finden können.
- Im Gegensatz dazu wurde die Zunahme an (Ca²&spplus;)i, die durch Bildung von Homoaggregaten von CD4-Rezeptoren auf T-Zellen induziert wurde, dann sehr verstärkt, wenn der CD4- Rezeptor mit dem CD45-Rezeptor unter Verwendung monoklonaler Antikörper vernetzt war. Somit kann ein neues Heterokonjugat, das aus einem Antikörper gegen CD4 und einem Antikörper, der mit CD45 oder Isoformen von CD45R auf T-Zellen reagieren kann, dazu eingesetzt werden, die T-Zellenfunktion von allen CD4-positiven Zellen oder Subpopulationen von CD4-Zellen, die durch Expression von CD45- Isoformen definiert sind, verstärken.
- Die erfindungsgemäß erhältlichen Heterokonjugate sind nützlich bei der Regulierung von Lymphocyten und können daher zur Regulierung der zellulären Immunantwort bei Erkrankungen, beispielsweise bei infektiösen Erkrankungen, Krebs, Aids und Autoimmunreaktionen eingesetzt werden. Diese Heterokonjugate sind insbesondere für die Regulierung der zellulären Immunantwort bei Krankheitszuständen nützlich, bei denen ein Defekt oder eine Fehiregulation der T-Zellen gegeben ist.
- So konnte beispielsweise gezeigt werden,daß CD45-Isoformen bei bestimmten Autoimmunerkrankungen abnormal exprimiert werden (Rose et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 82: 7389-7393 (1985)). Daher können erfindungsgemäß erhältliche Heterokonjugate, die mindestens ein Molekül enthalten, das mit dem CD45-Rezeptor oder CD45-Isoformen reagieren kann, bei der Regulierung der Lymphocytenfunktion bei Autoimmunerkrankungen nützlich sein.
- Außerdem können die erfindungsgemäß erhältlichen Heterokonjugate bei der Verstärkung der Immunantwort von Patienten nützlich sein, welche das Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) besitzen. Es ist bekannt, daß das CD4-Antigen als Rezeptor für den Human Immunodeficiency Virus (HIV) dient, das für AIDS verantwortlich ist. Es wird angenommen, daß CD4&spplus;der Rezeptor ist, an den sich das gpl20 Hüllglykoprotein von HIV bei der Infektion der T-Zellen mit dem Virus bindet (man vergleiche z.B. L.A. Lasky et al., Cell, 50:975 (1987) und M. Kowalski et al., Science, 237:1351 (1987)). Nach der HIV-Infektion wird die Zelloberflächenexpression von CD4&spplus;herunterreguliert und der Gehalt an CD4&spplus;mRNA nimmt ab (man vergleiche 3.A. Hoxie et al., "Alterations in T4 (CD4) Protein And mRNA Synthesis In Cells Infected With HIV", Science, 234:1123-1127 (1986)). Es besteht auch eine gesicherte Kenntnis darüber, daß Aids-Patienten eine reduzierte Immunantwort auflösliche Antigene zeigen (man vergleiche z.B. H.C. Lane et al., "Qualitative Analysis of Immuno Function In Patients With The Acquired Immunodeficiency Syndrome", New Eng. J. Med., 313 (Nr. 2), 79-84 (1985)). In vitro Untersuchungen haben gezeigt, daß gereinigtes HIV gpl20 die T-Zellenantwort auf mitogene Stimulierung inhibieren kann; dies stellt ein Ergebnis dar, das ähnlich zu derjenigen Wirkung ist, die bei der Verwendung eines löslichen monoklonalen Antikörpers für CD4&spplus;beobachtet wurde (man vergleiche D.L. Mann et al., J. Immunol. "HTLV-III Large Envelope Protein (gpl20) Suppresses PHA-Induced Lymphocyte Blastogensis", 138:2640-2644 (1987)).
- Man könnte somit davon ausgehen, daß die bei Aids- Patienten beobachtete Immunsuppression mit dem Effekt der HIV-Infektion bei der CD4-Antigenexpression eine Rolle spielt, d.h. die Herabregulierung von CD4&spplus;auf der T-Zelle, die nach der HIV-Infektion stattfindet, kann die Immunantwort beeinflussen, indem die Fähigkeit der Zelle zur Signalgebung verringert wird. Dies führt zu einer herabgesetzten T-Zellenaktivierung beim Ansprechen auf das Antigen. Für dieses Modell spricht, daß gefunden wurde, daß die CD3-stimulierten Steigerungen hinsichtlich der freien Calciumkonzentration in HIV- infizierten Zellen geschwächt wird (G.P. Linette et al., HIV-1 Infected T Cells Exhibit A Selective Transmembrane Signalling Defect Through The CD3/Antigen Receptor Pathway", Science, 241:573-576 (1988)). Diese Beobachtungen deuten daraufhin, daß die erfindungsgemäßen Heterokonjugate, insbesondere ein CD3/CD4-Heterokonjugat zur Untersuchung oder Behandlung von T-Zellenfehlfunktionen Anwendung finden können, welche aus einer HIV-Infektion resultieren.
- Erfindungsgemäß werden auch Verfahren zur Behandlung von Lymphocyten, entweder in vitro oder in vivo, mit den hier offenbarten Heterokonjugaten zur Regulierung der zellulären Immunantwort bei Erkrankungen bereitgestellt.
- Nach einer erfindungsgemäßen Ausführungsform können die Heterokonjugate bei der in vitro Aktivierung von T-Zellen eingesetzt werden. Diese Aktivierung kann dadurch durchgeführt werden, daß von einem Patienten entnommene T- Lymphocyten mit mindestens einem der erfindungsgemäß erhältlichen Heterokonjugate in vitro in Kontakt gebracht werden, wobei die T-Zellen aktiviert werden. Danach kann dann eine Reinfusion in den autologen Donor erfolgen (man vergleiche z.B. S.A. Rosenberg et al., "Immunotheraphy Of Cancer By Systemic Administration of Lymphoid Cells Plus Interleukin 2", J. Biol. Resp. Modif., 3:5501-5511 (1984)). Diese Behandlungsmethode kann auch die in vitro Koinkubation oder Preinkubation von T-Zellen mit anderen Immunomodulatoren beinhalten.
- Nach einer alternativen Ausführungsform können die Heterokonjugate dazu eingesetzt werden, T-Zellen in vivo durch Injektion der Heterokonjugate in einen Patienten aktiviert werden, möglicherweise zusammen mit anderen Agentien, beispielsweise Interleukin-2 (IL-2), Wachstumsfaktoren oder agonistischen Antikörpern, wie CD5 (man vergleiche z.B. E.A. Clark et al., "Amplification Of The Immune Response By Agonistic Antibodies", Immunology Today, 7:267-270 (1986) und CD 28 (man vergleiche das nachstehend beschriebene Beispiel 1). Unabhängig von der Behandlungsmethode kann es angebracht sein, Heterokonjugate zum Einsatz zu bringen, welche Antikörperfragmente, wie Fab oder F(ab')2, chimäre Antikörper oder bispezifische Antikörper aufweisen.
- Die erfindungsgemäßen Heterokonjugate können auch in vivo gemäß üblichen Verabreichungsmethoden verabreicht werden, wozu beispielsweise eine intravenöse, orale, subkutane, intrapen toneale oder intralymphatische Verabreichung zählen. Vorzugsweise wird intravenös verabreicht.
- Die erfindungsgemäß bereitgestellten pharmazeutischen Mittel, welche diese Heterokonjugate aufweisen, können vielfältige Dosierungsformen besitzen. Dazu zählen beispielsweise feste, haibfeste und flüssige Dosierungsformen, wie Tabletten, Pillen, Pulver, flüssige Lösungen oder Suspensionen, Suppositorien, polymeren Mikrokapseln oder Mikrobläschen, Liposome und injizierbare oder per Fusion verabreichbare Lösungen. Die bevorzugte Form hängt von der Verabreichungsart und der therapeutischen Anwendung ab.
- Die Heterokonjugatmittel können übliche pharmazeutisch verträgliche Träger enthalten, welche im Stand der Technik bekannt sind, wozu z.B. Serumproteine, wie Humanserum albumin, Puffersubstanzen, wie Phosphate, Wasser oder Salze oder Elektrolyten zählen.
- Die wirksamste Verabreichungsart und der wirksamste Dosierungsplan für die erfindungsgemäßen Heterokonjugatmittel hängt von der Schwere und dem Verlauf der Krankheit, dem Gesundheitszustand des Patienten und dem Ansprechen auf die Behandlung und der Beurteilung des behandelnden Arztes ab. Demzufolge sollte die Dosierungen der Heterokonjugate auf den einzelnen Patienten abgestellt werden. Nicht destoweniger kann eine wirksame Dosis des erfindungsgemäßen Heterokonjugats im Bereich von etwa 1 bis etwa 100 mg/m² liegen. Für eine in vitro Behandlung der T-Zellen kann eine Dosis von etwa 200 µg bis 2 mg an Heterokonjugat/10&sup9;-Zellen zur Anwendung gebracht werden.
- Die erfindungsgemäßen Heterokonjugate können außerdem für diagnostische Zwecke eingesetzt werden, um die Rezeptorfunktion eines gegebenen T-Zellenoberflächenantigens, z.B. CD-Antigen, bei Patienten zu bestimmen, welche unter Erkrankungen leiden, bei denen ein Defekt oder ein Disregulation der T-Zellen beteiligt ist. Unter Einsatz eines wie hier be schriebenen Calciumassays für die Bestimmung der Signaltransduktion (man vergleiche Beispiel 1) und geeigneter Kontrollen kann man einen Defekt in der CD-Funktion bestimmen, indem man die Aktivierung mittels eines spezifischen erfindungsgemäßen Heterokonjugats der T-Zellen von einem normalen Donor gegenüber einem erkrankten Donor bestimmt. So steigert beispielsweise das erfindungsgemäße CD3/CD4-Heterokonjugat die (Ca²&spplus;); Mobilisierung bei Proteinkonzentrationen, die niedriger sind, als diejenigen, die mit löslichem Anti-CD3 alleine beobachtet werden. Man mißt somit bei diesen niedrigen Dosen die Funktion des CD4-Rezeptors. Dies zeigt sich in der Fähigkeit des löslichen Anti-CD4, die Aktivität des CD3/CD4-Heterokonjugats bei diesen Dosen zu blockieren (man vergleiche Fig. 2). In ähnlicher Weise kann man mit dem CD3/CD8-Heterokonjugat die Funktion des CD8- Rezeptors bei niedrigen Dosen messen. Man kann das Heterokonjugat dann bei diesen Dosen dazu einsetzen, Defekte in einer bestimmten CD-Rezeptorfunktion bei verschiedenen Krankheitszuständen, beispielsweise Krebs und Autoimmunerkrankungen,zu detektieren. Man kann auch die Calciumassays bei jeder Dosis mit jedem erfindungsgemäß erhältlichen Heterokonjugat durchführen, solange die geeigneten einzelnen Antikörperkontrollen durchgeführt werden, d.h. die Aktivität des Heterokonjugats muß mit der Aktivität der unkonjugierten Antikörper verglichen werden, welche die Komponenten des Heterokonjugats ausmachen (man vergleiche z.B. die europäische Patentanmeldung 221 768 von E.L. Reinherz et al., veröffentlicht am 13.05.1987).
- Die folgenden Beispiele werden zum besseren Verständis der Erfindung gegeben. Es versteht sich, daß die Beispiele nur zur Veranschaulichung dienen und die Erfindung in keiner Weise einschränken sollen.
- Im folgenden Beispiel ist die Herstellung und Charakterisierung eines neuen erfindungsgemäß erhältlichen Heterokonjugats näher erläutert. Bei dieser Ausführungsform wurde ein Antikörper, der mit CD3 reagieren kann, mit einem Antikörper vernetzt, der mit CD4&spplus;reagieren kann, um ein neues CD3/CD4-Heterokonjugat zu bilden, das ein verstärktes Transmembran-Signal bei der Aktivierung von CD4&spplus; (d.h. Helfer)-T-Zellen bewirkt, welche mit dem Heterokonjugat behandelt wurden.
- Bei den CD3-und CD4-Antikörpern, die zur Herstellung des Heterokonjugats dieser Ausführungsform eingesetzt wurden, handelt es sich um G19-4 (Balb/c, IgG&sub1;) bzw.G17-2 (Balb/c, IgG&sub1;). Diese Antikörper wurden hergestellt, wie dies von J.A. Ledbetter und E. Clark, "Surface Phenotype And Funktion of Tonsillar Germinal Center And Mantle Zone B Cell Subsets", Human Immunologyi 15:30-43 (1986) und J.A. Ledbetter et al., "An Immunoglobulin Light Chain Dimer With CD4&spplus;Antigen Specificity, Molecular Immunology, 24 (Nr. 12):1255-1261 (1987) beschrieben wurde. Weitere monoklonale Anti-CD3- und Anti-CD4-Antikörper, die zur Konstruktion dieses Heterokonjugats eingesetzt werden können, sind im Handel erhältlich (Z.B. T3, Coulter Co., FL bzw. Leu-3, Becton Dickinson, CA). Die G19-4 und G17-2 Antikörper wurden durch Salzpräzipitation und DEAE- Chromatographie sowie durch anschließende Dialyse und Filtration durch 0,45 µ Filter vor der Verwendung von der Ascitesflüssigkeit abgetrennt.
- Die beiden monoklonalen Antikörper wurden in einem molaren 1:1-Verhältnis mit dem heterobifunktionalen Vernetzungs-Reagens, GMBS Calbiochem, La Jolla, CA) und 5-Iminothiolan HC1 (Pierce Chemical Co., Rockford IL) konjugiert, wie dies für die Phykoerythrinkopplung von R.R. Hardy, siehe oben, beschrieben ist. Das resultierende Heterokonjugat wurde von freiem Antikörper mittels Superose 6 (Pharmacia, Uppsala,Schweden) FPLC-Größenausschlußchromatographie abgetrennt und sowohl mit CD3 als auch CD4&spplus;auf die Reaktivität getestet, indem die Fähigkeit des Heterokonjugats untersucht wurde, die Bindung von monoklonalen Anti-CD3 und Anti-CD4-Antikörpern zu blockieren, welche direkt mit Fluoreszein konjugiert wurden. Dieses CD3/CD4-Heterokonjugat wurde als G19-4/G17-2 bezeichnet.
- Das G19-4/G17-2-Heterokonjugat wurde dann auf seine Fähigkeit getestet, die Mobilisierung von cytoplasmischem Calcium in Zellen zu verstärken, verglichen mit der Aktivität von G19-4 (Anti-CD3) alleine. Bei den eingesetzten Zellen handelt es sich um menschliche Peripherblutlymphocyten, die vom Peripher blut durch Zentrifugieren auf Ficoll-Hypaque und durch anschließendes Aufbringen auf Kunststoff zur Entfernung der Hauptmenge der Monocyten gereinigt.
- Zunahmen an (Ca²&spplus;)i innerhalb der Zellen wurden unter Verwendung von Indo-1 (Molecular Probes, Eugene, OR) und eines Model 50 HH/2150-Flußcytometers (Ortho Diagnostic Systems, Inc., Westwood, MA) bestimmt, wie dies zuvor von P.S. Rabinovitch et al., "Heterogeneity Among T Cells In Intracellular Free Calcim Responses After Mitogen Stimulation With PHA or Anti-CD3. Simultaneous Use Of Indo-1 And Immunofluorescence With Flow Cytometry", J. Immunol., 137 (Nr. 3): 952-961 (1986), beschrieben wurde, worauf ausdrücklich Bezug genommen wird. Dazu wurden Zellen (5 x 10&sup7;/ml) mit Indo-1 mittels Inkubation mit dessen Acetoxymethylesters (Molecular Probes, Junction City, OR) beladen, der durch die Zellmembran permeieren kann und im Cytoplasma zur impermeablen Form hydrolysiert wird. Die Inkubation wurde während eines Zeitraums von 45 Min. bei 37ºC in einem Medium durchgeführt, das die angegebene Indo-1-Konzentration enthielt. Die Zellen wurden dann gewaschen und in frischem Medium bei 2,5 x 10&sup6;/ml resuspendiert und im Dunklen bei Raumtemperatur bis zur Analyse aufbewahrt. Für jeden Assay wurden Indo-1-beladene Zellen bis zu 1 x 10&sup6; ml mit Medium verdünnt und bei 37ºC äquilibriert. Die Messungen wurden unter Einsatz der Spektrofluorimetrie und der Flußcytometrie durchgeführt, wie dies von Rabinovitch, siehe oben, beschrieben wurde. Die Histogramme wurden mit Programmen analysiert, welche das mittlere Indo-1 violett/blau Fluoreszenzverhältnis je Zeiteinheit bestimmen. Außerdem wurde der Prozentsatz an ansprechenden Zellen gegen die Zeit mit Hilfe von Programmen analysiert, die zuerst den Wert des Indo-1-Verhältnisses bestimmten, das um zwei Standardabweichungen oberhalb des Verhältnisses für die Kontrollzellen lag. Dann wurde der Prozentsatz an Zellen oberhalb dieses dreifachen Wertes gegen die Zeit geplottet. Es wurden 100 Datenpunkte auf der X (Zeit)-Achse bei allen flußcytometrischen Messungen aufgetragen.
- Wie aus der Fig. 1 ersichtlich ist, ist die Konzentration an G19-4/G17-2, die zur Steigerung der Konzentration von Ca²&spplus;[(Ca)i] erforderlich ist, um 1,5 bis 2 Größenordnungen niedriger als diejenige Konzentration, die bei Verwendung von G19-4 alleine erforderlich ist. Zudem wurde die Aktivität des G19-4/G17-2-Heterokonjugats auf CD4&spplus;-Zellen beschränkt, da die Anreicherung für CD4&spplus;-Zellen bei der Immunofluoreszenz zu einer entsprechenden Zunahme hinsichtlich der [Ca²&spplus;] i-Aktivität und des Prozentsatzes der ansprechenden Zellen führte. Fig. 2 zeigt somit, daß, falls Peripherblutzellen mit dem G19-4/G17-2-Heterokonjugat stimuliert wurden, die mittlere maximale [CA²&spplus;]i-Antwort für diese Zellen etwa 1300 nM betrug, während in etwa 60 % der Zellen ansprachen. Wurde jedoch nur die CD4&spplus;- Untergruppe von Zelle analysiert, dann war die maximale [Ca²&spplus;]i- Antwort größer 10 000 nM und mehr als 95 % der Zellen sprachen an. Zudem wurde die Aktivität des Heterokonjugats auf CD4&spplus; -Zellen durch die Vorbehandlung der Zellen bei -5 Min. mit 5 µg/ml G17-2 (Anti-CD4) und anschließend mit 0,4 µg/ml des Heterokonjugats fast vollständig inhibiert.
- Die CD4&spplus;-Zellen wurden durch Einengen (gating) auf CD8negative, CD11-negative, CD16-negative und CD20-negative Zellen analysiert, wie dies in dem Diagrammeinschub der Fig. 2 gezeigt ist. Diese Negativ-selektion auf CD4&spplus;-Zellen wurde durchgeführt durch Anfärben der Peripherblutlymphocyten mit Phycoerythrin (PE)-konjugiertem 2H7, einem monoklonalen Antikörper, der mit CD20 reagieren kann (man vergleiche z.B. E.A. Clark et al., "Role Of The Bp35 Cell Surface Polypeptide In Human B-Cell Activation", Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 82:1766-1770 (1985)),FC-2, einem monoklonalen Antikörper für CD16 (man vergleiche z.B. C. Anasetti et al., "Induction of Calcium Flux And Enhancement Of Cytolytic Activity In Natural Killer Cells By Cross-Linking of The Sheep Erythrocyte Binding Protein (CD2) And The Fc-Receptor (CD16)", J. Immunol., 139 (Nr. 6):1772-1779, (1987)), G10-1, einem monoklonalen Antikörper für CD8 (man vergleiche z.B. J.A. Ledbetter et al., "Covalent Association Between Human Thymus Leukemia-Like Antigens, And CD8 Molecules", J. Immunol., 134:4250-4254 (1985)) und 60.1, einem monoklonalen Antikörper, der mit Cd11 reagieren kann (man vergleiche z.B. J.P. Bunyon et al., "Differential Participation of Epitopes On Alpha And Beta Chains Of the LFA Family In Neutrophil Aggregation As Defined By Workshop Monodonal Antibodies", in Leukocyte Typing III, wie oben, S. 844-47) und durch Gating auf den nicht-angefärbten Zellen, die zu mehr als 95 % CD4-positiv waren.
- Vergleichende Titrationen von G19-4 gegen das G19-4/G17-2- Heterokonjugat wurden gleichfalls in Anwesenheit von 5 mM EGTA (Ethylenglykol-bis (β-aminoethylether)-N,N,N',N'- tetraessigsäure) durchgeführt, welche extra-zelluläres Calcium komplexiert und somit entfernt, um zu prüfen, ob es sich um eine Calciummobilisierung aus cytoplasmischen Quellen handelt, die durch das Heterokonjugat beeinflußt worden war. Fig. 3 zeigt, daß in etwa eine Zunahme um zwei Zehnerpotenzen hinsichtlich der Fähigkeit, Calcium mit dem G19-4/G17-2-Heterokonjugat in Anwesenheit von EGTA zu mobilisieren, stattgefunden hat. In Anwesenheit von extrazellulärem Calcium deuteten Titrationen bis zum Endpunkt an, daß eine Zunahme um zwei Zehnerpoten zen hinsichtlich der Aktivität ebenfalls stattgefunden hat (die entsprechenden Daten sind nicht gezeigt).
- Um ausschließen zu konnen, daß die Valenz der Bindung an die CD3 oder CD4-Antigene für die Effekte des CD3/CD4-Heterokonjugats auf (Ca²&spplus;)i verantwortlich war, wurden CD3/CD3 und CD4/CD4-Homokonjugate konstruiert, um einen Vergleich mit dem CD3/CD4-Heterokonjugat durchführen zu können. Die Homokonjugate wurden wie oben im Zusammenhang mit dem CD3/CD4- Heterokonjugat konstruiert und wurden als G19-4/G19-4 bzw. G17-2/G17-2 bezeichnet. Wie aus der nachstehenden Tabelle 1 ersichtlich ist, konnte weder mit dem CD3/CD3-Homokonjugat noch mit der Mischung CD3/CD3 plus CD4/CD4-Homokonjugaten die verstärkten Effekte des CD3/CD4-Heterokonjugats auf (Ca²&spplus;)i erzielt werden. Diese Daten deuten daraufhin, daß die verstärkte Aktivität des CD3/CD4-Heterokonjugats keine Funktion der Valenz des Heterokonjugats ist und daher wahrscheinlich auf der physikalischen Nähe der CD3 und CD4- Moleküle beruht, die bei der Interakten dieser Antigene mit dem Heterokonjugat eintritt. Außerdem waren Heterokonjugate und Homokonjugate geringfügig weniger aktiv als freie Antikörper in Bindungsassays, wobei indirekt gefärbt wurde und bei der Flußcytometrie (Daten nicht gezeigt). Die einzigartige Aktivität des CD3/CD4-Heterokonjugats scheint daher nicht in Verbindung zu stehen mit einem Effekt auf die CD3-Bindungsaffinität, die durch die zweite Spezifität des Heterokonjugats beigesteuert wird. Tabelle 1 CD4&spplus;T-Zellen-[Ca²&spplus;]i-Antwort auf CD3/CD4-Heterokonjugat, verglichen mit CD3/CD3 und CD4/CD4-Homokonjugaten* Stimulation Konzentration (µg/ml) Peak (Mittel) (Ca²&spplus;)i (nM) Zunahme über Basis keine CD3/CD4-Heterokonjugat CD3/CD3-Homokonjugat CD4/CD4-Homokonjugat
- Bei den Assays auf (Ca²&spplus;)i-Signale wurden Peripherblutlymphocyten eingesetzt, die mit Indo-1 beladen und mit PE-konjugiertem Anti-CD20, Anti-CD8 und Anti-CD16 wie oben beschrieben angefärbt wurden. Die ungefärbten Zellen, welche mehr als 95 % CD4&spplus;-Zellen umfaßten wurden analysiert. Der Ansprech-Peak (Mittel) war innerhalb der ersten 5 Min. nach der Stimulation zu beobachten.
- Da angenommen wird, daß die Mobilisierung von cytoplasmischem Calcium in T-Zellen durch die Generation von Inosittriphosphat (InsP&sub3;) übermittelt wird, wurde die Zunahme an Inositphosphaten nach Stimulation von gereinigten CD4&sbplus;-T-Zellen mit entweder einem monoklonalen Antikörper für CD3 alleine oder mit dem CD3/CD4-Heterokonjugat gemessen.
- Die CD4&spplus;-T-Zellen wurden gereinigt, wie dies beschrieben wurde von C.H. June et al., "T-Cell Proliferation Involving The CD28 Pathway Is Associated With Cyclosporine-Resistant Interleukin 2 Gene Expression", Mol. Cell. Biol., 7 "Nr. 12): 4472-4481 (1987). Dazu wurden Peripherblut-Lymphocyten durch Leukophorese von Laborpersonal entnommen. Anschließend wurde eine Ficoll/Hypaque-Dichtepgradientenzentrifugation durchgeführt. Die CD4&spplus;-Untergruppe der T-Zellen wurden dann mittels negativer Selektion durch Magnetkügelchen- Immunabsorption isoliert, nachdem zuerst die CD8&spplus;, CD11&spplus;, CD16&spplus;, CD14&spplus; und CD20&spplus;-Zellen mit sättigenden Mengen des geeigneten monoklonalen Antikörpers belegt worden waren (der größte Teil der Antikörper wurde bereits weiter oben erläutert, bis auf den Anti-CD40-monoklonalen Antikörper, 20.3, der hergestellt wurde, wie dies beschrieben ist von M. Kamoun et al., "Human Monocyte-Histiocyte Differentation Antigens Identified By Monodonal Antibodies", Clin. Immunology and Immunopathology, 29:181-195 (1983)). Bei dieser Strategie wurde der Vorteil der reciproken und nicht überlappenden Verteilung der CD4&spplus;und CD8-Oberflächenantigene auf ruhende Peripherblut-T-Lymphocyten ausgenutzt. Die Zellen wurden dreimal gewaschen, um nicht-gebundenen Antikörper zu entfernen, und dann mit magnetischen Kügelchen, die mit Ziegen-Anti-Mausimmunoglobulin beschichtet waren, inkubiert (Advanced Magnetics Institute, Cambridge, MA). Die auf den Kügelchen in Form eines Überzuges befindlichen Zellen wurden magnetisch abgetrennt. In etwa 500 x 106 CD4&spplus;-T-Zellen wurden üblicherweise gewonnen (> 98 % CD4&spplus;,bestimmt durch Flußcytometrie).Weniger als 0,1 Monocyten waren darin enthalten, bestimmt durch Anfärben auf nicht-spezifische Esterase.
- Die gereinigten CD4&spplus;-T-Zellen wurden dann resuspendiert auf 2 - 4 x 10&sup6;-Zellen/ml in RPMI 1640 ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum ("medium"), ergänzt mit 4 µg/ml PHA und 40 µCi/ml myo-2 (³H)-Inosit (37 MBq/ml; Amersham Corp., Arlington Heights, IL) und bei 37ºC unter Luft mit 5 % CO inkubiert. Nach 72 h wurden die Zellen dreimal gewaschen und auf 5 x 10&sup6;-Zellen/ml in "medium" (versetzt mit 10 mM LiCl) resuspendiert. Nach 20-minütiger Inkubation wurden G19-4 oder das G19-4/G17-2- Heterckonjugat bei t=0 bis zu einer Endkonzentration von 1 µg/ml hinzugegeben. Dann wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Proben von 5 x 10&sup6;-Zellen entfernt und 10 Sek. in einer Eppendorf 5414 Zentrifuge sedimentiert. Nach Absaugen des Mediums wurde 1 ml eiskalte 10%-iges TCA (w/v) zum Zellulären Pellet hinzugegeben. Nach Entfernen unlöslichen Materials durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 900 g wurde der Überstand mit 6 Volumen Diethylether extrahiert und dann neutralisiert. Die (³H)-Inositphosphate wurden durch Anionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung von Dowex 1-X8 in Formiatform (100 bis 200 Mesh) (Bio-Rad, Richmond, CA) abgetrennt und mittels Flüssigkeitsszintillationsspektroskopie in Bio-Safe 2 (Research Products, Int. Mt. Prospect, IL) quantifiziert. Dieses Verfahren zur Bestimmung von tritilertem Inositphosphat wurde beschrieben von J.B.Imoden et al., "Transmembrane Signaling By The T Cell Antigen Receptortt, siehe oben und J.B. Imoden et al., "Antigen Recognition By A Human T Cell Clone Leads To Increases In Inositol Trisphosphate", siehe oben.
- Aus Fig 4 ist ersichtlich, daß das Heterokönjugat bei 1µg/ml substantielle Zunahmen hinsichtlich der Bildung von Inositphosphat 1, 2 und 3 stimulierte, während G19-4 alleine nur eine geringe Zunahme an Inositphosphat 1 verursachte. Der Gehalt von trituertem Inositphosphatinnichtstimulierten Zellen beim Beginn (t=0) und am Ende des Experiments (t=10 Min.) ist auch angegeben.
- In weiteren Experimenten, deren Ergebnisse in Fig. 5 zusammengefaßt sind, wurde festgestellt, daß der freie monoklonale Antikörper für CD4, G17-2, das durch das Heterokonjugat verursachte Inositphosphatsignal inhibierte. G17-2 inhibierte die Inositphosphatantwort auf den freien monoklonalen Anti-CD3-Antikörper G19-4 nicht. Gemäß diesen Untersuchungen wurden CD4&spplus;-T-Zellen 72 h in Medium inkubiert, das (H)-Inosit (40 µCi/ml) und PHA (4 µg/ml) enthielt, ausführlich gewaschen und dann in Medium mit 10 mM LiCl unter Resuspension für 20 Min. bei 37ºC inkubiert. G17-2 (Biotin-konjugiert, wie beschrieben von J.W. Goding, In Monodonal Antibodies Principles And Practices, S. 230, Academic Press (1983)) wurde dann zu ausgewählten Proben hinzugegeben. Nach 5 Min. wurden G19-4, G17-2, das G19-4/G17-2-Heterokonjugat und Avidin wie angegeben hinzugefügt; es wurde für weitere 10 Min. inkubiert. Nach der Lysis der cellulären Proben (10&sup7; Zellen/Probe) in 10 % TCA wurde (³H)-Inositphosphate extrahiert, mittels Anionenaustausch-Chromatographie aufgetrennt und wie oben beschrieben quantifiziert. Die Fig. 5 bezieht sich auf zwei unabhängige Experimente. In der Figur ist der mittlere +/- sem (Standardfehler) für triplicate celluläre Proben gezeigt; die Endkonzentration in µg/ml des monoklonalen Antikörpers und von Avidin ist ebenfalls in der Figur gezeigt.
- Diese experimentellen Daten zeigen nicht nur den verstärkten Effekt des erfindungsgemäßen Heterokonjugats auf die Inositphosphatproduktion, sondern auch, daß der lösliche Antikörper gegen CD4&spplus;diese T-Zellenantwort inhibiert. Diese Daten lassen daher erkennen, welche wichtige Rolle das CD4-Antigen bei der Stimulierung der Antwort von T-Zellen spielt.
- Es wurde gefunden, daß das erfindungsgemäß bereitgestellte CD3/CD4-Heterokonjugat eine neue funktionale Aktivität hinsichtlich der T-Zellenaktivierung besitzt, wie dies mit Hilfe von Proliferationsassays unter Verwendung von CD3/CD3 und CD4/CD4-Homokonjugaten als Kontrolle gezeigt wurde. In diesen Assays wurden CD4&spplus;-T-Zellen in vierfachen Proben in flachbödigen Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen bei 5 x 10&sup4;-Zellen pro Vertiefung in RPMI 1640 Medium kultiviert, das 5 % hitzeinaktiviertes fetales Kälberserum (Hydone, Logan, UT) enthielt. Die CD4&spplus;-Zellen wurden 3 Tage entweder mit G19-4 (Anti-CD3), C19-5/G19-4 (CD3/CD3-Homokonjugat), G19-4/G17-2 (CD3/CD4- Heterokonjugat) oder G17-2/G17-2 (CD4/CD4-Homokonjugat) mit oder ohne PMA (Phorbolmyristatacetat) (1 µg/m1) oder monoklonalem Antikörper 9.3 kultiviert, einem Antikörper, der mit dem CD28-Antigen auf der T-Zellenoberfläche ((Balb/c X C57BL/6)FI, IgGa) (man vergleiche z.B. J.A. Hansen et al., "Monoclonal Antibodies Identifying A Novel T Cell Antigen And Ia Antigens Of Human Lymphocytes", Immunogenetics 10:247-52 (1989)) reagiert. Alle Antikörper und Konjugate wurden zu de 1 µg/ml eingesetzt. Die Inkorporation von Thymidin (Mittelwert cpm ± sem) wurde am Tag 3 nach dem Pulsen der Zellen während der letzten 8 h der dreitägigen Kultivierung mit 1 µCi ³H-Thymidin (New England Nudear Corp., Boston, MA) /Vertiefung in einem Flüssigkeitsszintillationszähler bestimmt.
- Aus der Fig. 6 ist ersichtlich, daß, falls gereinigte CD4&spplus;-T-Zellen entweder mit den Anti-CD3-Reagentien alleine oder mit PMA alleine kultiviert werden, keine Proliferation zu beobachten war. In Anwesenheit von PMA induzierten alle Antikörperpräparate, die den monoklonalen Antikörper gegen CD3 enthielten, vergleichbare Niveaus hinsichtlich der (³H)-Thymidininkorporation, während das CD4-Homokonjugat nicht mitogen war. Bei der Untersuchung verschiedener Reagentien auf eine Synergie mit dem monoklonalen Antikörper gegen CD28, 9.3, wurden jedoch beträchtliche Unterschiede beobachtet. Lediglich das CD3/CD4-Heterokonjugat induzierte eine Reaktion auf den CD28- Antikörper. Frühere Untersuchungen hatten gezeigt, daß die CD28-Stimulierung für gereinigte T-Zellen nicht mitogen ist, obwohl der monoklonale Antikörper für CD28 mehr als 95 % der T-Zellen veranlaßt, den Zellzyklus in Anwesenheit von PMA zu durchschreiten (man vergleiche beispielsweise C.H. June et al., Mol. Cell. Biol., wie oben). Das nunmehr festgestellte Ergebnis, nämlich daß die CD28-Stimulation von gereinigten T-Zellen nicht komitogen mit Flüssigphasen-CD3-Antikörpern ist, bestätigt die früheren Untersuchungen (man vergleiche beispielsweise A. Weiss et al., "Synergy Between The T3/Antigen Receptor Complex And Tp44 In The Activation of Human T Cells", J. Immunol. 137 (Nr. 3):819-825 (1986)).
- Um zu bestimmen, ob der Unterschied zwischen dem CD3/CD4- Heterokonjugat und dem CD3/CD3-Homokonjugat bezüglich der CD28-Stimulation qualitativ oder quantitativ ist, wurden CD4&spplus;-T-Zellen mit G19-4, dem G19-4/G17-2-Heterokonjugat oder dem G19-4/G19-4-Homokonjugat bei verschiedenen Konzentrationen mit entweder PMA (1 µg/ml) oder monoklonalem Anti-CD28-Antikörper, 9.3 (1 µg/ml) kultiviert. Wie aus der Fig. 7 ersichtlich ist, konnte festgestellt werden, daß das G19-4/G17-2-Heterokonjugat mit der CD28- Stimulation völlig komitogen ist, sogar bei so niedrigen Konzentrationen wie 100 ng/ml, während das CD3/CD3-Homokonjugat bei 10 µg/ml nicht mitogen war. Im Gegensatz dazu war das komitogene Ansprechen der Zellen auf PMA und CD3-Stimulation für CD3-Antikörperkonjugate bei den untersuchten Konzentrationen ähnlich. Außerdem zeigten kinetische Untersuchungen, daß der Unterschied zwischen dem CD3/CD3-Homokonjugat und dem CD3/CD4-Heterokonjugat bezüglich der CD28-Stimulation nicht auf einer Verschiebung im Zeitverlauf der Proliferation beruhte (diese Daten sind nicht gezeigt.
- Es scheint somit so zu sein, daß CD4&spplus;-Zellen auf den löslichen Antikörper, der mit CD3 reagieren kann, nicht mit einer Proliferation antworten, während sie auf das erfindungsgemäß bereitgestellte CD3/CD4-Heterokonjugat dadurch ansprechen, daß sie in Anwesenheit des Antikörpers gegen CD28 proliferieren.
- Zur weiteren Untersuchung der Effekte des CD3/CD4-Heterokonjugats auf die T-Zellenproliferation wurden Zellzykluskinetiken mittels einer Technik untersucht, die es ermöglicht, Zellen in jeder Phase der drei aufeinanderfolgenden Zellzyklen nach der Stimulation zu unterscheiden. CD4&spplus;-T-Zellen wurden mittels Flußcytometrie auf einerm Cytofluorograph 50 HH-Zellsorter (Ortho Diagnostic Systems, Inc., Westwood, MA) nach Anfärben der Zellen mit PE-konjugierten CD8, CD16 und CD20-Antikörpern (diese wurden vorher bereits erwähnt) sortiert. Negative Zellen wurden sortiert; diese waren 97 % CD4 positiv bei der erneuten Analyse der sortierten Population. Zusätzlich zum Immunofluoreszenz-Parameter wurden Vorwärtsstreuung und Rechtwinkelstreuung bestimmt und dazu benutzt, die Lymphocytenpopulation einzugrenzen und Monocyten, Zellfragmente und tote Zellen auszuschließen. Die Zellen wurden bei einer Flußrate von 2000 Zellen/Sek. bei 20 ºC sortiert.
- Sortierte Zellen wurden vierfach in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit rundem Boden (Nunc, Kampstrip, Denmark) zu je 5 x 10&sup4; Zellen/Vertiefung kultiviert. Das G19-4/G17-2-Heterokonjugat oder CD3 oder CD4-Homokonjugate wurden zu den Kulturen zu je 5 µg/ml hinzugegeben oder PHA wurden bei 10 µg/ml hinzugegeben. Die Zellen wurden in RPMI 1640, ergänzt mit 10 FBS in Anwesenheit von 0,6 µg/ml mondklonalem Anti-CD28-Antikörper 9.3, 1,5 x 10&supmin;&sup4; M Brdu, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin und 5 x 10&supmin;&sup5; M 2-Mercaptoethanol wachsen gelassen. 3 Tage nach der Inkubation bei 37ºC (5 % CO) wurde das Medium aus den Vertiefungen vorsichtig abgesaugt und durch 0,2 ml färbende Lösung ersetzt, die 0,1 M Tris, pH 7,4, 0,9 % NaCl, 1 mM CaCl, 1,0 mM MgCl, 0,2 % BSA, 0,1 % NP40 und 1 µg/ml Hoechst 33258 (Sigma) und 5 µg/ml Ethidiumbromid, EB (Calbiochem.) enthielt. Die Zellen wurden 30 Min. bei 4ºC inkubiert, resuspendiert und einer Flußcytometrie auf einem ICP-22 (Ortho Diagnostic Systems, Inc.) unterworfen, das mittels eines Interface mit einem PDP11/03-Computer (Digital Equipment, Maynard, MA) verbunden war, wie dies zuvor von P.S. Rabinovitch beschrieben wurde, "Deteation Of An Unusally Stable Fibrinolytic Inhibitor Produced By Bovine Endothelial Cells", Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 80:2956-60 (1983). Eine Ultraviolett-Anregung (UG1-Filter) wurde verwendet, wobei die Hoechst 33258-Emission bei 425 bis 500 nm detektiert und die Fluoreszenz oberhalb 600 nm detektiert wurde. Die Fluoreszenz von etwa 3 bis 4 x 10³-Zellen wurde analysiert und als Bivariate-Histogramm von Hoechstversus EB-Fluoreszenz aufgezeichnet. Die Größenbestimmung der individuellen Zellzyklusphasen wurde durch Anlayse und Kurvenangleichung vorgenommen, wie dies zuvor von P.S. Rabinovitch, id., berichtet worden ist.
- Die Prozentsätze an Zellen nach dem ersten, zweiten oder dritten Zellzyklus sind in der Fig. 8 gezeigt. Wie man aus der Figur entnehmen kann, war nur das CD3/CD4-Heterokonjugat in der Lage, die Zellen in signifikanter Weise durch den Zellzyklus zu steuern, da 45 % der Zellen in die S-Phase eintraten oder weitergelangten und 39 % der Zellen in einen zweiten Zyklus der Proliferation nach 3-tägiger Stimulation mit dem Heterokonjugat eintraten. Somit stellt die Inkorparation von ³H-Thymidin durch gereinigte CD4&spplus;- Zellen als Ansprechen auf das CD3/CD4-Heterokonjugat zusammen mit der Anti-CD28-Stimulation (wie dies in den Fig. 6 und 7 gezeigt ist) eine substantielle proliferative Antwort dar, das in einer zweiten und dritten Generation fortwährte Im Gegensatz dazu konnte keines der anderen Antikörperpräparate eine signifikante Zellzyklustransition (man vergleiche Fig. 8) induzieren. Figur 8 zeigt auch, daß im Vergleich mit der PHA plus Anti-CD28-Kontrolle, wobei 70 % der sortierten Zellen nach 3-tägigem Kultivieren in die S-Phase eingetreten waren, 45 % der durch das CD3/CD4-Heterokonjugat stimulierten Zellen angesprochen hatten. Dies deutet an, daß eine signifikante Zahl der CD4&spplus;-Zellen nach der Stimulation mit dem CD3/CD4-Heterokonjugat eine Zellzyklusprogression aufwiesen.
- Die Modulation der CD3- und CD4-Antigene auf der T-Zellenoberfläche durch das CD3/CD4-Heterokonjugat, CD3 oder CD4- Homokonjugat oder durch den Antikörper für CD4 oder CD3 alleine, wurde bestimmt, indem die Dichte des Antikörpers oder der Antikörperkonjugate auf der Oberfläche der CD4&spplus;- T-Zellen nach einer 18-stündigen Inkubation bei 37ºC in Anwesenheit von 10 µg/ml Antikörper oder Antikörperkonjugat gemessen wurde, wobei die Immunofluoreszenz zur Anwendung kam sowie eine zweite Stufe mit Anti-Maus-Ig durchgeführt und eine Messung auf einem FACS IV-Flußcytometer vorgenommen wurde. Die Ergebnisse sind in der unten aufgeführten
- Tabelle II zusammengestellt, in der die Dichte als Einheiten der mittleren Fluoreszenzintensität gegenüber dem Untergrund ausgedrückt ist und auf einer linearen Skala gemessen wurde. TABELLE II Modulation durch Konjugate Spezifizität Oberflächendichte vor der Modulation Oberflächendichte nach der Modulation Modulation in % CD4/CD4-Homokonjugat CD3/CD3-Homokonjugat CD3/CD4-Heterokonjugat
- Aus der Tabelle geht hervor, daß eine Inkubation über Nacht mit dem Antikörper für CD3 oder einem CD3/CD3-Homokonjugat zu einer fast nicht detektierbaren Oberflächenexpression von CD3 führte, während signifikante Mengen von Oberflächen-CD4 sogar noch nach einer ähnlichen Inkubation mit einem Antikörper für CD4 oder einem CD4/CD4-Homokonjugat zurückblieb. Das CD3/CD4-Heterokonjugat hingegen führte zu einer Modulation von sowohl CD3 als auch CD4 und schien die Oberflächenexpression von CD4 zu verringern. Alle in diesen Assays eingesetzten Antikörper und Konjugate lagen im Überschuß vor, da keine Zelloberfläche, die frei von CD3 oder CD4-Antigen war (d.h. durch den Antikörper nicht gebunden), nach der Modulation detektierbar war, sofern Assays unter Verwendung direkter Fluoreszenzkonjugate von monoklonalen Anti-CD3- oder Anti-CD4-Antikörpern (Daten sind nicht aufgeführt) durchgeführt wurden. Somit komoduliert das erfindungsgemäß erhältliche CD3/CD4- Heterokonjugat die CD3- und CD4-Antigene auf der Oberfläche der T-Zellen. Dies zeigt an, daß das Heterokonjugat den T-Zellenrezeptor nicht nur in einfacher Weise an die Zellenoberfläche verankert, wie dies für den Fall des immobilisierten Antikörpers für CD3 vorgeschlagen worden ist (man vergleiche z.B. 3.A. Ledbetter et al., J. Immunol., siehe oben). Außerdem zeigten Untersuchungen mit löslichem Anti-CD3 an, daß, wenn CD3 von der Zellenoberfläche moduliert wird, der CD3/Ti-Rezeptor internalisiert wird (man vergleiche z.B. O.W. Press et al., "Evaluation Of Ricin A Chain Immunotoxins Directed Against Human T Cells", Cellular Immunol., 102:10-20 (1986) und O.W. Press et al., "Endocytosis And Degradation Of Murine Anti-Human CD3 Monodonal Antibodies By Normal And Malignant T Lymphocytes", Cancer Research, 48:2249-2257 (1988). Dies führt zur Inhibierung der T-Zellenaktivierung.Die erfindungsgemäßen Heterokonjugate führen ebenso zu der Internalisierung des Rezeptors, wobei die T-Zellenaktivierung verstärkt wird.
- Das hier vorliegende Beispiel zeigt, daß das erfindungsgemäß erhältliche CD3/CD4-Heterokonjugat sowohl die Ca²&spplus;Mobilisierung als auch die Inositphosphatproduktion bei der Aktivierung von CD4&spplus;-T-Zellen verstärkt. Außerdem besitzt das Heterokonjugat eine neue funktionale Aktivität bei der Proliferation von Cd4&spplus;- Zellen in Anwesenheit des Antikörpers für CD28, was dazu führt, daß eine signifikante Fraktion der Zellen dazu veranlaßt wird, in einen zweiten Zellzyklus innerhalb der ersten drei Tage der Stimulation einzutreten. Außerdem scheint das Heterokonjugat die Antigene, mit denen es reagieren kann, zu komodulieren, wodurch die Hypothese gestützt wird, daß es derart wirkt, daß es diese Antigene in eine nahe Nachbarschaft bei der Aktivierung der T-Zellen bringt.
- Im nachstehenden Beispiel ist die Konstruktion und Charakterisierung weiterer erfindungsgemäß erhältlicher Heterokonjugate beschrieben, die einen Antikörper aufweisen, der mit dem CD3-Antigen reagieren kann und der mit irgendeinem einer Vielzahl anderer Antikörper, die mit dem CD-T-Zellenantigen reagieren können, vernetzt ist.
- Die Antikörper-Heterokonjugate, die gemäß Beispiel 1 konstruiert wurden, waren folgende:
- (a) ein CD3/CD2-Heterokonjugat, das monoklonale Antikörper G19-4 (Anti-CD3) (wird weiter oben erläutert) und 9.6 (Anti-CD2) umfaßt, (man vergleiche z.B. P.J. Martin et al., "Identification And Functional Characterization Of Two Distinct Epitopes On The Human T-Cell Surface Protein Tp50", J. Immunol., 131:180 (1983)),
- (b) ein CD3/CD5-Heterokonjugat, das monoklonale Antikörper G19-4 und 10.2 (Anti-CD5) umfaßt (man vergleiche z.B. P.J. Martin et al., "A New Human T-Cell Differentiation Antigen, Unexpected Expression On Chronic Lymphocytic Leukemic Cells", Immunogenetics, 11:429 (1980) und P.J. Martin et al., "Monodonal Antibodies Recognizing Normal Human T Lymphocytes And Malignant B Lymphocytes A Comparative Study", J. Immunolc 12:1920 (1981));
- (c) ein CD3/CD6-Heterokonjugat, das monoklonale Antikörper G19-4 und G3-6 (Anti-CD6) umfaßt (G3-6 ist ein Anti-CD6-monoklonaler Antikörper des IgG&sub1;-Isotyps und wird hergestellt durch Immunisieren von Balb/c-Mäusen mit der T-Leukämie-Zellinie HSB2. Hybridome wurden durch die Fusion von Milzzellen von Mäusen mit der NSI-Myelomalinie produziert und durch Bindung an normale T-Zellen und Krauz-Blockierung mit einem CD6- Referenzantikörper 12.1 gescreent (man vergleiche z.B. P.J. Martin et al., J. Immunol., 127, siehe oben));
- (d) ein CD3/CD7-Heterokonjugat, das monoklonale Antikörper G19-4 und G3-7 (Anti-CD7) umfaßt (G3-7 ist ein monoklonaler Anti-CD7-Antikörper des IgG&sub1;-Isotyps, produziert durch I-Immunisieren von Balb/c-Mäusen mit der T-Leukämie-Zellinie HSB2. Hybridoma wurden durch die Fusion von Milzzellen aus Mäusen mit der NS1- Myelomalinie produziert und durch Binden an normale T-Zellen und cross-blocking mit einem CD7-Referenz- Antikörper, 3Al, erhältlich von der American Type Culture Collection, gescreent. Ein monoklonaler Anti- CD7-Antikörper ist zudem kommerziell erhältlich, (Becton Dickinson, Mountainview, CA) (man vergleiche auch beispielsweise E.L. Reinherz et al., Hrsg., Leukocyte Typing II, Bd. 1, S. 3-30 (1986):
- (e) ein CD3/CD8-Heterokonjugat, das monoklonale Antikörper G19-4 und GIO-1 (anti-CD8) (weiter oben beschrieben) umfaßt; und
- (f) ein CD3/CD28-Heterokonjugat, das monoklonale Antikörper Gl9-4 und 9.3 (weiter oben beschrieben) umfaßt.
- Diese Heterokonjugate wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Mobilisierung von cytoplasmischem Ca²&spplus; in T-Zellen zu verstärken, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist. Jedes Heterokonjugat wurde bei 1 µg/ml getestet, somit bei einer Konzentration, bei der die Aktivität des Antikörpers für CD3 alleine suboptimal ist. Eine verstärkte Aktivität der Konjugate wurde detektiert. (Ca²+)i-Ansprech- Peaks von Indo-1-beladenen Peripherblutlymphocyten waren innerhalb der ersten 5 Min. nach der Stimulation der Zellen mit dem Heterokonjugat zu beobachten. Nicht stimulierte Zellen zeigten ein (Ca²&spplus;)i von 130 nM. In den Experimenten mit dem CD3/CD4 und CD3/CD8-Heterokonjugat wurde die Aktivität des Konjugats auf CD4&spplus; bzw. CD8&spplus;-T-Zellenuntergruppen gemessen. Die Aktivität dieser Heterokonjugate bezüglich der Calciummobilisierung ist in der nachstehenden Tabelle III wiedergegeben. TABELLE III Aktivität der Anti-CD3-Heterokonjugate bei der Calciummobilisierung Konjugat Peak (Ca²&spplus;) (nM)
- Aus der Tabelle III ist ersichtlich, daß die CD3/CD2, CD3/CD6, CD3/CD7 und CD3/CD8-Heterokonjugate (sowie das CD3/CD4-Heterokonjugat) ein ausgeprägtes Ansteigen hinsichtlich der Calciummobilisierung innerhalb der T-Zellen verursachten, die mit solchen Heterokonjugaten behandelt wurden, verglichen mit der Aktivität von nicht-stimulierten oder CD3/CD4-stimulierten Zellen. Es wird angenommen, daß diese Heterokonjugate ebenso wie das im Beispiel 1 beschriebene CD3/CD4-Heterokonjugat dadurch ihre Wirkung entfalten, daß sie die entsprechenden Antigene, mit denen sie reagieren, in enge Nachbarschaft miteinander bringen, was zu einer verstärkten Transmembransignalisierung und T-Zellen-Aktivierung führt.
- In diesem Beispiel ist die Konstruktion und Charakterisierung weiterer erfindungsgemäß erhältlicher Heterokonjugate beschrieben, wobei ein Antikörper vorhanden ist, dermit dem CD5-T-Zellenoberflächenantigen reagieren kann, das mit irgendeinem einer Vielzahl von anderen CD-T-Zellenantigenen vernetzt ist.
- Diese Antikörper-Heterokonjugate, die wie im Beispiel 1 konstruiert wurden, waren die folgenden:
- (a) ein CD5/CD2-Heterokonjugat, das monoklonale Antikörper 10.2 und 9.6 umfaßt;
- (b) ein CD5/CD28-Heterokonjugat, das monoklonale Antikörper 10.2 und 9.3 umfaßt;
- (c) ein CD5/CD4-Heterokonjugat, das monoklonale Antikörper 10.2 und G17-2 umfaßt;
- (d) ein CD5/CD6-Heterokonjugat, das monoklonale Antikörper 10.2 und G3-6 umfaßt;
- (e) ein CD5/CD7-Heterokonjugat, das monoklonale Antikörper 10.2 und G3-7 umfaßt; und
- (f) ein CD5/CD8-Heterokonjugat, das monoklonale Antikörper 10.2 und G10-1 umfaßt.
- Alle zur Konstruktion der Heterokonjugate dieser Ausführungsform eingesetzten monoklonalen Antikörper sind weiter oben beschrieben worden.
- Diese Heterokonjugate wurden ebenfalls aufihre Fähigkeit getestet, die Mobilisierung von cytoplasmischem Ca²&spplus; in T-Zellen zu verstärken, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in der nachstehenden Tabelle IV zusammengefaßt. Die Konzentration jedes der in diesen Experimenten eingesetzten Heterokonjugate ist in der Tabelle angegeben. Ein (Ca²&spplus;)i-Peak der Indo-1-beladenen peripheren Blutlymphocyten war innerhalb der ersten 10 Min. nach der Stimulation zu beobachten. Nichtstimulierte Zellen zeigten ein (Ca²&spplus;)i von 130 nM. Wie aus der Tabelle ferner hervorgeht, zeigte ein CD5/CD5-Homokonjugat ein (Ca²&spplus;)i von 180 nM. Die CD5/CD4 und CD5/CD8-Heterokonjugate wurden an CD4&spplus; bzw. CD8&spplus; -T-Zellen-Untergruppen getestet. TABELLE IV Aktivität der Anti-CD5-Heterokonjugate bei der Calciummobilisierung Konjugat Peak (Ca²&spplus;)i (nM)
- Aus der Tabelle IV ist ersichtlich, daß die CD5/CD4, CD5/CD6 und CD5/CD8-Heterokonjugate eine signifikante Zunahme der Calciummobilisierung zeigten, verglichen mit nicht-stimulierten oder CD5/CD5-stimulierten Zellen. Es wird angenommen, daß diese Heterokonjugate ebenso wie die anderen hier beschriebenen Heterokonjugate hinsichtlich der verstärkten Aktivierung von T-Zellen nützlich sind.
- In diesem Beispiel wurde eine mAb-induzierte Interaktion zwischen CD3 und CD45-Antigenen auf der T-Zellenoberfläche und einem Heterokonjugat von Antikörpern, die mit CD3 und CD45-Antigenen reagieren können, zur Untersuchung des Effektes dieser Verfahren auf die Aktivierung der T-Zellen eingesetzt.
- Mononukleare Peripherblutzellen und an Nylongewebe nicht haftende Lymphocyten von Peripherblut wurden hergestellt wie dies schon früher beschrieben wurde (Clark et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 82:1766-1770 (1985) und Clark et al., Hum. Immunol. 16:100-113 (1986), auf beide Literaturstellen wird hiermit bezug genommen). An Nylongewebe bzw. Nylonwolle nicht-haftende Lymphocyten wurden durch Trennung an Nylonwolle wie folgt erhalten: eine Nylonsäule (hergestellt bei Oncogen, Seattle, WA) wurde mit RPMI-Medium beladen, das 5 % fetales Kälberserum enthielt, und wurde nach Vorinkubation während eines Zeitraums von 45 Min. bei 37ºC verwendet. Die Zellen wurden auf die Säule aufgebracht und konnten in die Säule fließen und wurden dann bei 37ºC 45 Min. inkubiert. Unter Verwendung von warmen Medien wurden 6 ml von der Säule isoliert, zweimal bei 1200 UpM während eines Zeitraums von 8 Min. zentrifugiert und dann in Proliferationspuffer (15 % Human AB-Sera) (in etwa 1,5 ml) resuspendiert. Die nicht-haftenden Zellen wurden gezählt und das Volumen wurde entsprechend dem Einsatz in den Assays eingestellt.
- Die folgenden Balb/c-Mäuse mAbs für Humanleukocytenmarker wurden eingesetzt: 9.4 (IgG2a), Anti-CD45 (Cobald, siehe oben); Gl-15 (IgGl) und 3AC5 (IgG2a), Anti-CD4SR (Ledbetter, siehe oben und Ledbetter et al., In Perspectives In Immunogenetics and Histocompatibility, Hrsg., E. Heise (ASHI, New York) S. 325-340); 96.5 (Brown et al., J. Immunol. 127(2):639-546 (1981)). UCHL-1 (IgGl) anti-CD45 (180 Form) freundlicherweise von Dr. P. Beverley bereitgestellt (Smith, siehe oben); G19-4 (IgGl), Anti-CD3 (Ledbetter, siehe oben); 9.6 Anti-CD2 (weiter oben beschrieben); und 9.3, Anti-CD28 (weiter oben beschrieben). Der, Anti-Maus-kappa (K)-spezifische mAb, 187.1 von der Ratte (Ware et al., J. Immunol. Meth. 74:93-104 (1984)) wurde eingesetzt, um Mäuse mAb zu vernetzen.
- Die monoklonalen Antikörper-Heterokonjugate wurden bei einem 1:1 Molverhältnis mit dem heterobifunktionalen Vernetzer GMBS (Calbiochem, La Jolla, CA) und 5-Iminothiolan HC1 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) wie zuvor im Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Dies bedeutet insbesondere, daß Antikörper (1 mg/ml) über Nacht gegen Kopplungspuffer (0,1 M NaHPO&sub4;-dibasisches, siebenfach hydriertes 0,1 M NaCl, pH 7,5) dialysiert wurde. Der erste Antikörper des Konjugats wurde mit Iminothiolan-HCL-Salz thioliert (2-IT von Piercè Chemical Co., Rockford, IL: 50 µl (0,5 mg) der 2-IT- Lösung (10 mg/ml in Kopplungspuffer)), das unter Mischen hinzugefügt wurde. Der zweite Antikörper des Konjugats wurde mit GMBS behandelt: 5 µl (14 µg der GMBS-Lösung (1 mg in 360 µl Dimethylformamid (DMF))). Die Lösungen wurden bei Raumtemperatur 1 h inkubiert. Die Antikörper wurden dann über getrennte PD-10-Säulen (Pharmacia, Uppsala, Schweden) gegeben, die in Kopplungspuffervoräquilibriert worden waren. Nach einem Leervolumen von insgesamt 2,6 ml wurde der Antikörper in dem doppelten des Originalvolumens gesammelt. Die Antikörper wurden gemischt und bei Raumtemperatur 5 h lang inkubiert. Die Reaktionen wurden gequenched durch die Zugabe von 1 µl von 25 mM ß-Mercaptoethanol (1 µl:560 µl Kopplungspuffer) (inkubiert während eines Zeitraums von 15 Min. bei Raumtemperatur). Diese Reaktion wurde durch Zugabe von 11 µl (11 µg) von N-Ethylmaleimid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (aufgefüllt auf 1 mg/ml in DMF) gestoppt.
- Die Konjugate wurden über Nacht gegen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) dialysiert. Das resultierende CD3/ CD45-Heterokonjugat wurde von den freien Antikörpern an Superose 6 FPLC abgetrennt, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist, und mit G19-4/9.4 bezeichnet.
- Die Konjugation der mAbs mit Biotin wurde unter Verwendung von Biotin-succinimid durchgeführt (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), wie dies bereits früher beschrieben wurde (Hardy R.R. (1986) In Handbook of Experimental Immunology, (Hrsg. Weir et al.), (Blackwell, Oxford) S. 31.1-31.2 (1986)). Aufletztere Literaturstellen wird hiermit Bezug genommen. Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) und Avidin stammten von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Rekombinantes Interleukin-2 (RIL2) wurde von Genzyme (Boston, MA) erworben und wurde verwendet, um die Proliferation in einigen Assays zu fördern.
- Die Proliferation der Blut-T-Zellen wurde durch Inkorporation von (³H)-Thymidin (New England Nudear; spezifische Aktivität 27 Ci/mmol; 1 Ci = 37 GBq) gemessen, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist, wobei 10&sup6; Zellen pro ml in 200 µl Mikrotitervertiefungen eingesetzt wurden. Genauer gesagt bedeutet dies, daß für die Proliferationsassays mononukleare Zellen kultiviert wurden, wie dies von Ledbetter et al. beschrieben ist in Journal Immunol. 135:1819-1825 (1985), worauf hiermit bezug genommen wird. Dazu wurden mononukleare Zellen aus dem peripheren Blut durch Dichtezentrifugieren an Ficoll-Hypaque und durch anschließende Anlagerung an Kunststoff zur Entfernung der Hauptmenge der Monocyten isoliert. Die Zellen wurden bei 2,5 x 10&sup5;/ml in vierfachen Proben in Mikrotiterpiatten mit 96 Vertiefungen (Falcon, Becton-Dickenson, Oxnard, CA) in RPMI- Medium kultiviert, das Penicillin, Streptomycin und 15 % Human-AB-Serum (Pel Freez, Brown Deer, WI) enthielt. Entweder wurden das Mitogen-phytohämagglutiminin (PHA, Wellcome Diagnostics, Greenville, NC) oder Anti-CD3- mab (G19-4), an Sepharose gekoppelt, eingesetzt, um die T-Zellen zu stimulieren. Nach 3 oder 4 Tagen in der Kultur, wurden die Vertiefungen 6 h mit 0,5 µci (³H)-Thymidin/Vertiefung (New England Nuclear, Boston, MA; 6,7 Ci/mmol spezifische Aktivität) gepulst. Die Zellen wurden dann unter Verwendung eines "Zellernters" auf Glasfaserfiltern geerntet, die Radioaktivität wurde in einem Flüssigkeits- Szintillationszähler gemessen. In einigen Experimenten wurde rekombinantes IL2 (rIL-2, Genzyme, Boston, MA) bei 25 U/ml eingesetzt. Die Messungen der (³H)-Thymidinaufnahme wurden während der letzten 6 h eines 3-tägigen Experiments unter Verwendung von mAb-G19-4 durchgeführt, der auf die Vertiefungen der Mikrotiterplatte bei 10 µg/ml vor dem Assay als Überzug aufgebracht worden war. Die Konzentration des Anti-CD45-mab 9.4 in Lösung betrug 1 µg/ml; er wurde auf der Mikrotiterplatte zu je 10 mg/ml immobilisiert. Die Zellen wurden vierfach kultiviert; die Mittelwerte sind angegeben. Die Standardabweichungen betrugen weniger als 11 %.
- Die Ergebnisse sind in der Tabelle V zusammengefaßt. TABELLE V CD45 reguliert T-Zellenproliferation nach Stimulation von CD3 Proliferation ((³H)-Thymidin-Inkorporation, cpm x 10-3) Aktivierung Medium Anti-CD45 in Lösung immobilisiert Anti-CD3- - immobilisiert + + rIL-2 (100 Einheiten/ml
- Tabelle V zeigt, daß Anti-CD45, immobilisiert zusammen mit Anti-CD3, die T-Zellenproliferation um mehr als 75 % inhibierte, während Anti-CD45 in Lösung dies nicht tat. Der inhibierende Effekt von immobilisiertemanti-CD45 war sogar noch in Anwesenheit einer suboptimalen Konzentration von PMA oder exogenem rIL2 sichtbar.
- Die Proliferation von T-Zellen nach der Stimulierung mit Anti-CD3 mAb (G19-4) wurde ebenfalls mit immobilisiertem Anti-CD3 mAb und CD45R-mAbs (G1-15 und 3AC5) immobilisiert oder in Lösung gemessen. Die Proliferation wurde bestimmt, wie dies zuvor für Anti-CD45 beschrieben ist. Anti-CD45R mAbs G1-15 und 3AC5 wurden bei 1 µg/ml in Lösung und immobilisiert bei 10 µg/ml eingesetzt. Ein zur Kontrolle eingesetzter IgG2a mab 96.5 gegen Melanom-Antigen p97 wurde als nichtreagierende Kontrolle bei 1 µg/ml in Lösung und in Immobilisierter Form bei 10 µg/ml eingesetzt. Die Tabelle VI zeigt die Ergebnisse dieses Experimentes. TABELLE VI CD45 reguliert T-Zellenproliferation nach Stimulation von CD3 Proliferation (³H)-Thymidin Inkorporation, cpm x 10-3) Aktivierung Medium PMA (1ng/ml) rIL-2 100 Einheiten/ml Anti-CD3 immobilisiert
- Eine Inhibierung war evident, wenn entweder CD45R (3AC5) oder CD45R (G1-15) mAbs zusammen mit Anti-CD3 immobilisiert wurden, war jedoch nicht evident, wenn die CD45R mAbs in Lösung vorlagen. Es sei nochmals betont, daß weder PMA noch rIL2 diese Inhibierung überwinden konnten. Der Kontroll-mab, 96.5, gegen das Melanoma-Antigen p97 führte zu keiner Inhibierung der Proliferation als Antwort aufimmobilisiertes Anti-CD3, wenn entweder in Lösung oder immobilisiert zusammen mit Anti-CD3.
- Um sicher zu gehen, daß die mit immobilisiertem CD45 mAb (9.4) beobachtete Inhibierung nicht nur auf einer einfachen Verdrängung des CD3-mAb (G19-4) von der Kunststoffoberfläche beruhte, wurden die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit Anti-CD3 alleine, Anti-CD3 plus Anti-CD45 oder Anti-CD3 plus dem Kontroll-mAb 96.5 beschichtet. Mononukleare Zellen von peripherem Blut wurden mit Anti-CD3 mAb G19-4, der an den Wänden einer Mikrotiterplatte immobilisiert war, stimuliert durch Inkubation bei Raumtemperatur in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung während eines Zeitraums von 2 h bei Konzentrationen von 4, 8, 16 und 32 µg/ml, entweder alleine oder zusammen mit dem Anti-CD45 mab 9.4 oder mit einem Kontroll-mAb 96.5 bei derselben Konzentration wie dem Anti-CD3 mAb. Rinderserumalbumin wurde hinzugegeben, um eine weitere Proteinanlagerung zu ermöglichen. Die Proliferation mit CD45 mab 9.5 in Lösung wurde für Vergleichszwecke eingesetzt. Die Proliferation wurde in Abwesenheit oder in Anwesenheit von PMA bei 1 ng/ml bestimmt. Die Zellen wurden vierfach kultiviert während eines Zeitraums von 3 Tagen und mit (³H)-Thymidin für einen Zeitraum von wenigstens 6 h gepulst. In der Fig. 9 sind die Ergebnisse dieser Experimente wiedergegeben (es sind die Mittelwerte aufgeführt; die Standardabweichungen betrugen weniger als 15 % des Mittels bei jedem Punkt).
- (a) die Proliferation umso ausgeprägter war, je mehr Anti-CD3 zur Beschichtung der Vertiefungen eingesetzt wurden, wie dies auch bereits zuvor berichtet wurde (Geppert et., J. Immunol. 138: 1660-1666 (1987);
- (b) der CD45 mab 9.4 verursachte eine substantielle Inhibierung bei allen Konzentrationen, jedoch nur dann, wenn er immobilisiert war; und
- (c) es fand im wesentlichen keine Inhibierung statt, die durch die simultane Beschichtung mit dem Isotyp- Kontroll 96.5 mab verursacht wurde, was darauf hindeutet, daß die Inhibierung durch Anti-CD45 kein Ergebnis einer Verdrängung (displacement) von Anti-CD3 war.
- Die Zugabe von 1 ng/ml PMA zu den Kulturen kehrte die Inhibierung durch immobilisierten Anti-CD45 dann um, wenn der maAb bei 4 µg/ml oder weniger beschichtet war, jedoch nicht bei höheren Konzentration (Fig. 98). Dies deutet darauf hin, daß eine kritische Konzentration von Anti-CD45 in der engen Nachbarschaft zu Anti-CD3 auf der Kunststoffoberfläche erforderlich sein kann, um die Inhibierung in Anwesenheit von PMA aufrechtzuerhalten.
- Die T-Zellenaktivierung, die zu Proliferation führt, kann über die Stimulierung von CD28 und CD2 vonstatten gehen, unter Verwendung der mAbs 9.3 bzw. 9.6 in Lösung mit anschließendem Vernetzen in einer zweiten Stufe unter Verwendung von Anti-K mab 187.1 (Van Lier et al., Eur. J. Immunol. 18:167-175 (1988) und Ledbetter et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 84:1384-1388 (1987)). Zur Untersuchung der Effekte der CD45-Ligierung in diesem System wurde Anti-CD45 zu Anti-CD28 oder zu Anti-CD2 in Lösung mit oder ohne dem vernetzenden mab 187.1 gegeben (Ware et al., siehe oben). Die Proliferation wurde durch die oben beschriebene (³H)Thymidinaufnahme bestimmt. Anti-CD28 mAb 9.3 und Anti-CD2 mAb 0.6 wurden zur Aktivierung bei mindestens 1 µg/ml jeweils eingesetzt. Anti-CD48 mab 9.4 wurde bei 1 µg/ml eingesetzt und Anti- K mab 187.1 wurde eingesetzt, um die Antikörper bei einem 4:1 Endverhältnis von mAb 187.1 zu Maus-mAb zu vernetzen. Die Proliferation wurde in Anwesenheit (100 Einheiten/ml) und Abwesenheit von rIL-2 bestimmt. In der Tabelle VII sind die Ergebnisse dargestellt (Standardabweichungen betrugen < 12 % des Mitteiwertes bei jedem Punkt). TABELLE VII CD45-regulierte T-Zellenproliferation nach CD2- und CD28- Stimulation Proliferation ((³H)-Thymidin-Inkorporation, cpm x 10-3) Stimulus 100 Einheiten/ml Medium mAb Anti-CD45 Anti-CD45 + mAb 187.1
- Daraus ist ersichtlich, daß die Zugabe von Anti-CD45 alleine die Zeliproliferation fördern oder steigern kann, die durch entweder CD2 oder CD28 mAbs induziert wird, ohne daß exogenes rIL2 (Tabelle VII) erforderlich ist. In allen Fällen erhöhte rIL2 die Zeliproliferation um ein weiteres, sogar in Abwesenheit von anderen Stimulatoren. Diese Phänomene können auf einem Effekt der CD45-Ligation auf die Expression von Rezeptoren mit hoher Affinität für IL2 beruhen (Ledbetter, siehe oben).
- Im Gegensatz dazu kehrte eine Vernetzung von CD45 mit CD2 oder CD28 durch Addition von 187.1 Anti- K mab den stimulierenden Effekt von CD45 alleine um und reduzierte die Stimulation durch CD2 oder CD28 (Tabelle VII) entweder in Anwesenheit oder in Abwesenheit von rIL2. Dies beruhte nicht auf einer nicht-spezifischen inhibierenden Aktivität von 187.1, da CD28 oder CD2-Stimulation beide durch 187.1 verstärkt wurden, wenn der CD45 mab 9.4 nicht zugegen war.
- CD3, CD2 und CD28 sind an Signaltransduktionswege gekoppelt; dies führt zu einer Zunahme von (Ca²&spplus;)i, wenn diese Rezeptoren auf der Zellenoberfläche abgebunden werden (Ledbetter et al., Proc. Natl'. Acad. Sci. USA, 84:1384-1388 (1987)). (Ca²&spplus;)i wurde nach Vernetzen der CD3, CD2 oder CD28-Rezeptoren in Anwesenheit oder Abwesenheit von CD45 mAb 9.4 (Fig. 10) bestimmt. In diesem Experiment wurden Biotin-konjugierte mAbs an Peripherblut-T-Zellen gebunden und dann auf der Zellenoberfläche durch die Zugabe von Avidin vernetzt. Die Zunahmen an (Ca²&spplus;)i in mononuklearen T-Zellen von peripherem Blut (beladen mit Indo-1) (Molecular Probes, Junction City, OR) wurden nach Vernetzen der Rezeptoren an T-Zellen entweder alleine oder zusammen mit Anti-CD45 mab 9.4 oder Anti-CD45R mab 3AC5 wie folgt bestimmt (die Bedingungen sind im Zusammenhang mit der Fig. 10 erläutert).
- 1. Der CD3-Rezeptor wurde mit Biotin-konjugiertem Anti-CD3 mAb G19.4 (2 µg/ml) vernetzt zum Zeitpunkt = 1,5 Min.; im Anschluß daran wurde Avidin (8 µg/ml zum Zeitpunkt = 5,5 Min. hinzugegeben (-). Dies wurde verglichen mit derselben Vernetzung des CD3- Rezeptors in Anwesenheit von Anti-CD45 mAb 9.4 (10 µg/ ml) (----) oder mit Biotin-konjugiertem Anti-CD45 mAb 9.4 (10 µg/ml), worauf Avidin (48 µg) (......) folgte. Eine zusätzliche Kontrolle des Biotin-konjugierten Anti-CD45 mab 9.4 (10 µg/ml) gefolgt von Avidin (40 µg/ml) wurde auch eingesetzt (----) (Fig. 10A).
- 2. Der Effekt von 25 µg/ml des Anti-CD3 mab G19.4 (_) wurde mit 50 µg/ml eines CD3/CD4S-Heterokonjugats des Anti-CD3 mAb G19-4 und Anti-CD45 mAb 9.4 (.....) (Fig. 10 B) verglichen;
- 3. Der CD2-Rezeptor wurde mit 10 µg/ml des Biotinkonjugierten Anti-CD2 mAb 9.6 vernetzt, der zum Zeitpunkt = -3 Min. hinzugegeben wurde; im Anschluß daran erfolgte eine Zugabe von 40 µg/ml Avidin zum Zeitpunkt = 1,5 Min. (_) (Fig. 10C);
- 4. Der CD28-Rezeptor wurde mit 10 µg/ml des Biotinkonjugierten Anti-CD28 mAb 9.3 vernetzt (zugegeben zum Zeitpunkt = -3 Min.); im Anschluß daran erfolgte eine Zugabe von 40 µg/ml von Avidin zum Zeitpunkt = -3 Min. (_) verglichen mit der simultanen Vernetzung von CD28 und CD45-Rezeptoren unter Verwendung von 10 µg/ml des Anti-CD28 mAb 9.3 und 10 µg/ml Anti-cD45 mab 9.4 (zugegeben zum Zeitpunkt = -3 Min.); im Anschluß daran erfolgte Zugabe von 80 µg/ml Avidin zum Zeitpunkt = 1,5 Min. (....) (Fig. 10D); und
- 5. Der CD4-Rezeptor wurde durch Zugabe von 10 µg/ml des Biotin-konjugierten Anti-CD4 mAb G17-2 zum Zeitpunkt = -3 Min. vernetzt; im Anschluß daran wurden 40 µg/ml Avidin zum Zeitpunkt = 1,5 Min. (_) hinzugegeben. Dieses wurde mit dem gleichzeitigen Vernetzen der CD4 und CD45-Rezeptoren durch Zugabe von 10 µg/ml des Biotin-konjugierten Anti-CD4 mab G17-2 und 10 µg/ml des Biotin-konjugierten Anti-CD45 mAb 9.4 zum Zeitpunkt = -3 Min. verglichen; im Anschluß daran folgte die Zugabe von 80 µg/ml Avidin zum Zeitpunkt = 1,5 Min. (.....). Der Vergleich des Biotin-konjugierten Anti-CD4 mab G17-2 (10 µg/ml) plus Anti-CD45 mab 9.4 (10 µg/ml) (nicht konjugiert) gefolgt von 40 µg/ml Avidin zum Zeitpunkt = 1,5 Min. ist auch gezeigt (_._) (Fig. 10E). Die Figuren 10A bis E zeigen die Ergebnisse dieser Experimente.
- Es fiel auf, daß die Zunahme an (Ca²&spplus;)i, die nach der CD3, CD2 und CD28 Vernetzung beobachtet wurde, durch die Anwesenheit von Biotin-konjugiertem 9.4 inhibiert wurde. Wenn 9.4 nicht biotinyliert wurde und somit nicht durch Avidin vernetzt wurde, wurde eine geringe Abnahme hinsichtlich des Ausmaßes der durch Anti-CD3 induzierten Calciummobilisierung beobachtet (Fig. 10A). Für eine vollständige Inhibierung schien es jedoch erforderlich zu sein, daß CD45 und CD3 in eine nahe Nachbarschaft miteinander gebrachtwurden. Außerdem war ein Heterokonjugat von Anti- CD45 und Anti-CD3 nicht in der Lage, eine direkte Zunahme von (Ca²&spplus;)i (Fig. 10B) herbeizuführen, obgleich Immunofluoreszenzassays mit einem Anti-Maus-Immunoglobulin zeigten, daß das Heterokonjugat sich an beide Rezeptoren auf der Zellenoberfläche (Daten nicht gezeigt) binden konnte und daß 25 µg von Anti-CD3 ein ausgeprägtes Calciumsignal hervorrufen konnte. CD45R mAbs, wie 3AC5, waren in der Lage, die (Ca²&spplus;)i-Antwort partiell zu inhibieren, sofern sie mit mAbs ligiert waren, die mit dem Zellrezeptoren reagieren konnten, wie dies für CD2 illustriert ist (Fig. 10c). Die durch die CD45R mab teilweise hervorgerufene Inhibierung kann die Expression der CD45R-Isoform auf einigen, jedoch nicht allen T-Zellen wiederspiegeln (Ledbetter, siehe oben). Im Gegensatz zu den inhibierenden Wirkungen auf CD3, CD2 und CD28 kann die Ligation von CD45 auf CD4 eine starke und reproduzierbare Erhöhung der Signalgebung verursachen, verglichen mit dem Fall, in dem CD4 mit sich selber vernetzt ist (Fig. 10E). Dies hat ohne eine Zunahme hinsichtlich der Zahl der ansprechenden Zellen stattgefunden, was darauf hindeutet, daß die gleichen CD4-positiven Zellen nach Ligation von CD45 und CD4 besser ansprachen. Somit scheint CD45 die Transmembransignalgebung entweder hoch- oder herunterzuregulieren, in Abhängigkeit vom Rezeptor, mit dem es interagiert.
- Frühere Untersuchungen von CD45 legten nahe, daß es die Lymphocytenaktivierung entweder hoch- oder herunterregelt (Ledbetter, siehe oben; Harp, siehe oben und Martorell, siehe oben). Lösliche mAbs für CD45 oder CD45R waren co-stimulierend mit PHA oder Anti-CD3 (an Kügelchen angelagert) hinsichtlich der Steigerung der IL-2 Produktion, IL-2-Rezeptorexpression und T-Zellenproliferation. Lösliches Anti-CD45 kann mit CD2 oder CD28 mAb zusammenwirken (Tabelle VI). Diese ko-stimulierenden Effekte sind auf CD4&spplus;-Zellen beschränkt und werden mit CD8&spplus;-Zellen nicht beobachtet, welche kein CD4 exprimieren. Dies kann teilweise auf der Tatsache beruhen, daß CD45 einen charakteristischen Effekt auf CD4 besitzt, unabhängig von dessen Wirkung auf andere Zelloberflächenantigene, wie CD3 oder CD27 wenn CD45 in eine enge Assoziation mit CD4 gebracht wird, dann führt es zu einer Beschleunigung und Zunahme des über CD4 übermittelten Calciumsignals, während die Signaltransduktion inhibiert wird, wenn es an CD3 oder CD2 gekoppelt ist (Fig. 10).
- Obiges Beispiel 4 zeigt, daß die inhibierenden Effekte von Anti-CD45 äußerst klar demonstriert werden können unter Bedingungen, welche CD45 in einen engen Kontakt mit den signaltransduzierenden Elementen bringen, wie den T-Zellenrezeptoren CD2, CD3, CD5 oder CD28, wie dies durch die Verwendung des erfindungsgemäß erhältlichen CD4/CD45-Heterokonjugats gezeigt wurde. Das Anti-CD45-Antigen kann sehr früh auf die Lymphocytenaktivierung wirken, wodurch die Mobilisierung von intrazellulären freien Calcium inhibiert wird, die normalerweise innerhalb von 30 bis 60 Sek. detektierbar ist. Die verstärkenden Wirkungen von Anti- CD45 werden auch dadurch demonstriert, daß der CD45- Rezeptor in die Nähe zu dem CD4-Rezeptor gebracht wird. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß Heterokonjugate, welche Moleküle enthalten, die mit Rezeptoren auf Lymphocyten reagieren können, eine alternative Methode bereitstellen können, um die Interaktion zwischen den Rezeptoren zu indizieren, so daß die Aktivierung und Funktion der Lymphocyten, einschließlich der T-Zellen und B-Zellen, verstärkt oder inhibert wird.
- Es ist ersichtlich, daß das Grundgerüst der Erfindung, trotz der hier bereits erwähnten Reihe von Ausführungsformen, verändert werden kann, um weitere Aussführungsformen zu liefern, die zu einer verbesserten Aktivierung von Lymphocyten (z. B. andere Lymphocyten-Antigen-Heterokonjugatkombinationen) oder zur Inhibierung der Lymphocytenfunktion führen. Daher versteht es sich von selbst, daß der Schutzumfang der Erfindung durch die beigefügten Ansprüche, und nicht durch die spezifischen Ausführungsformen, die hier als Beispiele gegeben wurden, definiert ist.
Claims (46)
1. Heterokonjugat zur Regulation von Lymphozyten, umfassend
wenigstens zwei Moleküle, ausgewählt unter Antikörpern und
Peptidliganden, welche zur Bindung an Antigenen auf
Lymphozyten befähigt sind, wobei die Moleküle miteinander
quervernetzt sind, wobei jedes Molekül mit einem anderen
Antigen auf der Oberfläche einzelner Lymphozyten reagiert.
2. Heterokonjugat nach Anspruch 1, worin das Heterokonjugat
ein Antikörper-Heterokonjugat zur Aktivierung von
T-Lymphozyten ist, das wenigstgens zwei Antikörpermoleküle
umfaßt, die miteinander quervernetzt sind, wobei jeder
Antikörper mit einem anderen Antigen auf der Oberfläche
von T-Lymphozyten reagiert.
3. Heterokonjugat nach Anspruch 1 oder 2, worin das Antigen
ein CD-Antigen auf der Oberfliche eines T-Lymphozyten ist.
4. Heterokonjugat nach Anspruch 1, worin das Antigen ein
CD-Antigen auf der Oberfläche eines B-Lymphozyten ist.
5. Heterokonjugat nach Anspruch 1 oder 2, worin eines der
Moleküle des Heterokonjugates mit dem T-Zellrezeptor oder
dessen assoziierten CD3-Antigen reagiert.
6. Heterokonjugat nach Anspruch 1 oder 2, worin eines der
Moleküle des Heterokonjugates mit dem
T-Zelloberflächenantigen CD5 reagiert.
7. Heterokonjugat nach Anspruch 5, nämlich das
Antikörperheterokonjugat CD3/CD4.
8. Heterokonjugat nach Anspruch 7, nämlich das
Antikörperheterokonjugat G19-4/G17-2
9. Heterokonjugat nach Anspruch 5, nämlich ein
Heterokonjugat, ausgewählt unter CD3/CD2, CD3/CD6, CD3/CD7
und CD3/CD8.
10. Heterokonjugat nach Anspruch 6, nämlich ein
Heterokonjugat, ausgewählt unter CD5/CD4, CD5/CD6 und
CD5/CD8.
11. Heterokonjugat nach Anspruch 1 oder 2, worin eines der
Moleküle des Heterokonjugates mit dem CD45 Antigen oder
Isoformen des CD45 Antigens reagiert.
12. Heterokonjugat nach Anspruch 11, nämlich das
Antikörperheterokonjugat CD3/CD45.
13. Heterokonjugat nach Anspruch 12, nämlich das
Antikörperheterokonjugat G19-4/9.4.
14. Heterokonjugat nach Anspruch 11, nämlich ein
Antikörperheterokonjugat, au&gewählt unter CD2/CD45,
CD4/ CD45 und CD28/CD45.
15. Heterokonjugat nach Anspruch 11, nämlich ein
Heterokonjugat, ausgewählt unter CD2/CD45R, CD3/CD45R,
CD4/CD45R und CD28/ CD45R.
16. Heterokonjugat nach Anspruch 2, worin die Antikörper
Antikörperfragmente umfassen, die ausgewählt sind unter
Fab- und F(ab')-Fragmenten.
17. Antikörperheterokonjugat nach Anspruch 2, worin die
Antikörper monoklonal sind.
18. Heterokonjugat nach Anspruch 2, worin die Antikörper
chimär sind.
19.
Verwendung wenigstens eines Heterokonjugates nach
Anspruch 2 zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels
zur Aktivierung von T-Lymphozyten.
20. Verwendung des Heterokonjugates nach Anspruch 1 oder 2 zur
Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Regulation
der Funktion von T-Lymphozyten und/oder B-Lymphozyten.
21. Verwendung nach Anspruch 20, worin wenigstens einer der
Antikörper des Heterokonjugates mit dem Oberflächenantigen
CD45 oder einer Isoform des CD45 Antigens reagiert.
22. In vitro-Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen,
umfassend die Aktivierung von T-Lymphozyten in vitro,
indem man die Lymphozyten mit wenigstens einem
Heterokonjugat gemäß Anspruch 1 in Kontakt bringt.
23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Erkrankung
ausgewählt ist unter einer infektiösen Erkrankung, Krebs,
AIDS und einer Autoimmunerkrankung.
24. Pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung zur Behandlung
einer Erkrankung, umfassend eine pharinazeutisch wirksame
Menge wenigstens eines Heterokonjugates nach einem der
Ansprüche 1 bis 18.
25. Verwendung wenigstens eines Heterokonjugates nach einem
der Ansprüche 1 bis 18 zur Herstellung eines
pharmazeutischen Mittels zur Krankheitsbehandlung,
insbesondere von einer infektiösen Erkrankung, Krebs, AIDS
und einer Autoimmunerkrankung.
26. In Vitro-Verwendung wenigstens eines Heterokonjugates nach
einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Diagnostizierung eines
Defekts der CD-Rezeptorfunktion in einem Patienten, der an
einer Erkrankung leided, die eine T-Zellfehlregulation
oder -dysfunktion beinhaltet, wobei man, die Calcium-
Mobilisierungsaktivität des Heterokonjugates auf die
T-Lymphozyten in dem Patienten im Vergleich zur Aktivität
der unkonjugierten Antikörper, welche die Komponenten des
Heterokonjugates darstellen, bestimmt.
27. Verwendung eines Heterokonjugates nach Anspruch 7 oder 11
zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur
selektiven Regulation von T- und B-Lymphozyten-
Subpopulationen bei der Behandlung einer
Autoimmunerkrankung.
28. Verfahren zur Herstellung von Heterokonjugaten gemäß
Anspruch 1, brauchbar zur Regulation von Lymphozyten,
umfassend die Quervernetzung wenigstens zweier Moleküle,
die zur Bindung an Antigen auf Lymphozyten befähigt sind,
wobei jedes Molekül mit einem anderen Antigen auf der
Oberfläche einzelner Lymphozyten reagiert.
29. Verfahren nach Anspruch 28, worin die Lymphozyten, mit
denen die Moleküle reagieren T-Lymphozyten sind.
30. Verfahren nach Anspruch 28, worin das Antigen ein CD-
Antigen auf der Oberfläche eines T-Lymphozyten ist.
31. Verfahren nach Anspruch 28, worin das Antigen ein CD-
Antigen auf der Oberfläche eines T-Lymphozyten ist.
32. Verfahren nach Anspruch 28, worin eines der Moleküle des
Heterokonjugates mit dem T-Zellrezeptor oder dem
assoziierten CD3 Antigen davon reagiert.
33. Verfahren nach Anspruch 28, worin eines der Moleküle des
Heterokonjugates mit dem T-Zelloberflächenantigen CD5
reagiert.
34. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, worin die Moleküle der
mit dem CD3-Antigen reagierende Antikörper und der mit dem
CD4-Antigen reagierende Antikörper sind.
35. Verfahren nach Anspruch 34, worin die Antikörper den
Antikörper G19-4 bedeuten, der mit dem Antikörper G17-2
quervernetzt ist.
36. Verfahren nach Anspruch 28, worin die Moleküle ein mit dem
CD3-Antigen reagierender Antikörper und ein Antikörper,
ausgewählt unter Antikörpern, die mit dem Antigen CD6, CD7
und CD8 reagieren, sind.
37. Verfahren nach Anspruch 28, worin die Moleküle der mit dem
CD5-Antigen reagierende Antikörper und ein Antikörper,
ausgewählt unter Antikörpern, die mit dem Antigen CD4, CD6
und CD8 reagieren, sind.
38. Verfahren nach Anspruch 28, worin eines der Moleküle mit
dem CD45-Antigen oder Isoformen des CD45 Antigens
reagiert.
39. Verfahren nach Anspruch 28, worin eines der Moleküle ein
Antikörper ist, ausgewählt unter Antikörpern, die mit dem
Antigen CD2, CD3, CD4 und CD28 reagieren und das andere
Molekül ein mit dem CD45-Antigen reagierender Antikörper ist.
40. Verfahren nach Anspruch 28, worin eines der Moleküle ein
Antikörper ist, ausgewählt unter Antikörpern, die mit dem
Antigen CD2, CD3, CD4 und CD28 reagieren und das andere
Molekül ein mit dem CD45R-Antigen reagierender Antikörper ist.
41. Verfahren nach einem der Ansprüche 28-40, worin die
Moleküle monoklonale Antikörper sind.
42. Verfahren nach Anspruch 28, worin die Moleküle
Antikörperfragmente umfassen, ausgewählt unter Fab- und
F(ab')-Fragmente.
43. Verfahren nach Anspruch 28, worin die Moleküle chimäre
Antikörper sind.
44. Verfahren nach Anspruch 28, worin die Quervernetzung eine
chemische Quervernetzung ist.
45. Verfahren nach Anspruch 441 worin die chemische
Quervernetzung unter Verwendung eines Reagens erfolgt, das
ausgewählt ist unter Maleimidobutryloxysuccinimid und
N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionat.
46. In Vitro-Verfahren zur Diagnostizierung eines Defekts in
der CD-Rezeptorfunktion eines Patienten, der an einer
Erkrankung leided, welche eine T-Zellfehlregulation
oder-dysfunktion beinhaltet, umfassend die Bestimmung der
Calciummobilisierungsaktivität eines Heterokonjugates nach
einem der Ansprüche 1 oder 2 auf T-Lymphozyten des
Patienten im Vergleich zur Aktivität der unkonjugierten
Antikörper, welche die Komponenten des Heterokonjugates
sind.
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