KR100205833B1 - 임파구 활성 조절에 유용한 항체 이종결합체 - Google Patents

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Abstract

내용없음.

Description

임파구 활성 조절에 유용한 항체 이종 결합체
제1도는 농도를 달리하는 (A) 본 발명의 한 구체예의 CD3/CD4 이종결합체인 G19-4/G17-2 또는 (B) 항-CD3모노클로날 항체 G 19-4로 말초혈액 임파구를 자극할 때의 시간에 따른 세포질의 유리칼슘([Ca2+]i)의 농도증가를 그래프로 비교 도시한 도면임.
제2도는 본 발명의 CD3/CD4 이종 결합체인 G19-4/G17-2를 이용하여 말초 혈액 임파구(PBL: peripheral Blood Lymphocytes)나 또는 CD4+T세포를 자극했을 때 반응세로의 시간에 따른 [Ca2+]i 반응과 백분율을 그래프로 비교도시한 도면임. 항 -CD4 모노클로날 항체인 G17-2로 세포를 전처리한 다음 이종 결합체로 자극했을 때의 억제 효과도 나타나 있다.
제3도는 5mM EGTA존재하에서 CD4+T세포에 대한 본 발명의 G19-4/G17-2 이종결합체나(■) 또는 항-CD3 모노클로날 항체 G19-4(□)의 [Ca2+]i활성의 비교적정을 도시한 도면임.
제4도는 항-CD3인 G19-4(·) 또는 본 발명의 CD3/CD4 이종결합체 G19-4/G17-2(△)1㎍/㎖로 CD4+T세포를 자극했을 때 시간에 따른 이노시톨 포스페이트의 증가를 그래프로 비교도시한 도면임. t=0 및 t=10분에서의 자극받지 않은 대조군(0)의 이노시톨 포스페이트 농도가 나타나 있다. 패널 A는 이노시톨 포스페이트 1(InsP1)의 증가를 패널 B는 이노시톨 포스페이트 2((InsP2)의 증가를 패널 C는 이노시톨 포스페이트 3(InsP3)의 증가를 나타낸다.
제5도는 나타난 바와 같이 바이오틴-결합항 -CD4(G17-2), 항-CD3(G19-4), G17-2, CD3/CD4 이종 결합체(G19-4/G17-2) 또는 아비딘 및 이들의 배합물로 전처리시킨 CD4+T세포를 자극시킨 후 InsP1의 증가를 두가지 독립적인 실험에서 측정하여 도시한 도면임.
제6도는 항-CD3 모노 클로날 항체(CD3 모노), CD3/CD3 동종 결합체(CD3 호모), CD4/CD4 동종 결합체(CD4 호모) 및 본 발명의 CD3/CD4 이종 결합체(CD3+4 헤테로)가 T 세포 증식에 미치는 영향을 PMA(포르볼 미리스테이트 아세테이트: phorbol myristate acetate)나 또는 CD28에 대한 항체의 존재시 혹은 부재시 CD4+T세포에 의한 [3H]-티미딘 인코포레이션으로 표시한 도면임.
제7도는 CD4+T세포의 증식을3H-티미딘 인코포레이션 대 G19-4(CD3모노)+PMA(▼-▼), G19-4+항-CD28(α-CD28)(▽…▽), CD3/CD4 이종 결합체(CD3+4 헤테로)+PMA(▼…▼), CD3/CD4 이종 결합체+α-CD28(▽…▽), CD3/CD3 동종 결합체(CD3 호모)+PMA(▼－·－▼), 또는 CD3/CD3 동종 결합체+α-CD28)(▽-·-▽)의 농도로 나타내어 비교한 그래프 도면임.
제8도는 PHA(피토헤마글루티닌), 본 발명의 CD3/CD4 이종 결합체인 G19-4/G17-2, CD3/CD3 동종결합체 G19-4/G19-4, 대조군인 CD3/CD8 이종결합체 G19-4/G10-1, 및 CD4/CD4 동종 결합체인 G17-2/G17-2를 사용하여 3일동안 T세포를 자극한 후 첫째, 두 번째, 또는 세 번째 세포 사이클을 넘긴 CD4+T세포의 백분율을 나타낸 도면임.
제9도는 고정된 항CD3 mAb G-19-4에 의해 유도된 T세포 증식 반응의 억제를 PMA 부재시(A또는 존재시(B)에 [3H]-티미딘 인코포레이션 단독(·) 또는 [3H]-티미딘 인코포레이션대 항-CD45 mAb 9.4(O)또는 항-p97 mAb 96.5(□)로 나타내어 비교도시한 그래프 도면임(비교들 위해 용액중의 항-CD45 mAb 9.4의 경우의 증식도 나타내었음(△); 평균치를 나타냄; 표준 오차는 15% 였음).
제10도는 CD45 수용체에 의한 T 세포에 있어서의 시그날 형질 도입 조절을 후술하는 실시예4에 기재된 바와 같이 T세포상의 수용체를 단독으로 또는 항 -CD45 mAb 9.4또는 항 CD45R mAb 3AC5와 교차 결합시킨 후 시간에 따른 [Ca2+]i의 증가로서 측정한 그래프 도면임.
본 발명은 신규의 항체 이종결합체 및 T 세포와 B 세포와 같은 임파구의 활성을 조절하는데 있어서의 이들의 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 서로 커플링되어 있는 최소한 2개의 항체로 구성된 이종결합체에 관한 것으로서, 상기의 각 항체는 상이한 임파구 표면 항원과 반응성이다. 이러한 이종결합체는 임파구에 결합해서 이들과 반응성인 상응하는 세포 표면 항원을 물리적으로 서로 근접한 위치까지 접하게 하여 임파구의 촉진되거나 감소된 시그날 형질도입 및 증식을 야기시킨다. 본 발명의 바람직한 구체예에서는, T세포 수용체나 또는 그의 결합 CD3복합체와 반응성인 항체를 CD2, CD4, CD6, 또는 CD8과 같은 제 2T세포 표면 항원과 반응성인 항체와 교차결합시켜 T세포의 활성과 기능을 촉진시킨다. 또 다른 바람직한 구체예에서는, CD5 T세포 표면 항원과 반응성인 항체를 CD4, CD6 또는 CD8과 같은 제2T세포 표면 항원과 반응성인 항체와 교차 결합시켜 임파구의 활성과 기능을 촉진시킨다. 또 다른 바람직한 구체예에서는 CD45군의 항원과 반응성인 항체를 CD2, CD3, CD5, 또는 CD28과 같은 제 2T세포 표면 항원과 반응성인 항체와 교차결합시켜 임파구의활성과 기능을 저해한다. 또 다른 바람직한 구체예에서는, CD4항원과 반응 성인 항체를 CD45항원과 반응성인 항체와 교차결합시켜 임파구의 활성과 기능을 촉진한다. 본 발명의 항체 이종결합체, 방법 및 조성물은 임파구 조절에 유용하며 나아가 감염성, 질병, 암, AIDS 및 자가면역 질환과 같은 질명을 치료하는데 있어서 세포 면역 반응을 개선시킨다.
T세포라도고 불리우는 T임파구는 적어도 2가지의 서로 다른 방식으로 면역 반응을 중개하는 것으로 알려져 있다. 세포 독성 T세포는 특정 표적 세포의 용해(lysis)에 관여하는 반면, 헬퍼(helper) T세포는 B 세포의 증식 및 준화를 도와 항원-특이 항체가 생산되도록 한다[예컨대, J.W. Kimball(편집), Introduction To Immunology 2nd Ed., 11-13 장, Macmillan Publishing Co.(1986,참고]. T세포는 T세포 표면상의 T세포 수용체(Ti)나 또는 그의 결합된 CD3-복합체(CD3/Ti 수용체 복합체라고도 칭함)와 항원-제공 세포상의 항원과의 상호반응을 통해 활성화되어 그의 기능을 수행한다( 예컨대, E.L. Reinherz외, "Clonotypic Surface Structure On Human T Lymphocytes: Functional And Biochemical Analysis of The Human Receptor Complex", Immunol. Rev. 81: 95-129(1984) 참고]. 그러나 , T 세포는 항원-제공 세포상에서 항원이 특정, HMC(주조직 적합성 복합체: major histocompatibility complex)-암호화 항원과 결합되는 경우에만 그 항원에 반응한다. 그러므로 항원의 T 세포 인식은 항원과 결합되 MHC-암호화 생성물의 집단에 의해 제한된다고 일컬어진다: 이러한 MHC-제한의 결과는 세포 독성 T세포는 클래스 I MHC 항원과 결합된 항원에 의해 활성화되고 헬퍼 T 세포는 클래스ⅡMHC항원과 결합된 항원에 의해 활성화된다는 것이다[예컨대, J.W. Kimball(편집), Introduction To Immunology, 상기문헌 pp286-89 및 pp348-58 참고].
또한, 클래스ⅡMHC-제한 T세포는 CD3/Ti 수용체 복합체에 덧붙여서, CD4라 칭해진 세포 표면 항원을 발현시키는 반면, 클래스IMHC-제한 T 세표는 CD8세포 표면 항원을 발현시킨다는 것이 인식되어 있다. MHC제한과 CD항원 발현과의 이러한 관계는 T 세포 활성화에 있어서, 상응하는 MHC항원이 CD항원에 대한 자연적인 리간드라는, 즉, 예컨대, 헬퍼 T 세포상의 CD4항원은 항원-제공 세포(에컨대, 대식세포) 상의 클래스 ⅡMHC 분자와 상호반응하고 세포독성 T세포상의 CD8 항원은 특이 표적 세포(예컨대 바이러스-감염 세포)상의 클래스 Ⅰ MHC분자와 상호반응한다는 가설에 이르게 하였다[예컨대, F.Emmrich 외, "Cross-Linking Of The T Cell Receptor Complex With The Subset-Specific Differentiation Antigen Stimulates Interleukin 2 Receptor Expression In Human CD4 and CD8 T Cells", Eur. J. Immunol., 17:529-34(1987,참고]. 덧붙여, T세포의 의한 항원의 인식은 CD4 또는 CD8과 같은 CD항원과 결합되어 있는 T세포 표면상의 CD3/Ti 수용체 복합체가 적절한 HMC-암호화 항원과 결합된 항원을 "보는(see)" 4차 복합체를 통해 일어나는 것으로 제안되어 왔다[예컨대, P. Anderson외, "Cross-Linking Of T3(CD3) With T4(CD4) Enhances The Proliferation Of Resting T Lymphocytes", J. Immunol., 139(No. 3): 678-82(1987) 참고].
본발명에서 사용되는 cd 항원은 자연발생적인 세포 표면분화 항원으로서, 이 항원들의 통일된 명칭을 제공하는 국제연구회(International Workshop)가 규정한 바와 같이 세포의 표면상의 모노클로날 항체들(mAbs)의 반응성에 의해 정의된다[예컨대, A. J. McMichael(편집), , Leukocyte Typing Ⅲ, Oxford University Press(영국, 옥스퍼드 , 1987) 참고]. CD항원의 다수는 분자적으로 클론되어 완전히 특징화되었다[상기문헌]. 잘 알려진 CD 항원으로는 pan-T항원인 CD3, CD2, CD5, CD6 및 CD7, 헬퍼 T세포 서브세트에 특이적인 CD항원인 CD4, 및 억압자 T세포 서브세트에 특이적인 CD항원인 CD8을 들 수 있다[예컨대, J. A. Ledbetter외, Perspectives In Immunogenetics And Histocompatibility, 6권, E. Heise(편집). Lymphocyte Surface Antigens 1984, pp. 325-40, American Society For Histocompatibility And Immunogentics(뉴욕 1984) 참고]. CD28은 대다수의 T세포상에 존재하는 항원이다. [Yamada 외, Eur. J. Immuno1-1169-1169(1985)참고]비록 이 분화항원들이 상술한 바와 같이 수용체 기능을 하는 것으로 여겨지고 T세포에 있어서 시 그날 형질도입에 연결되었으나, T 세포 활성화에 있어서의 이들의 정확한 기능은 알려져 있지 않으며 집중적인 연구대상이 되고 있다.
예컨대, T세포 활성화에 있어서의 CD항원의 역할을 분자 수준에서 결정하기 위한 연구가 행해지고 잇다. CD3/Ti 수용체 복합체의 mAb나 또는 항원과의 반응은 T 세포내에서 전이막(transmembrane) "시그날"을 발생시키게 한다. 이 시그날은 종종 이노시통 포스트폐이트류 [1,2, 및 3]의 생성과 세포질의 유리칼슘의 농도증가 ([Ca2+]i,로 특징지어 진다[예컨대, J.B. Imboden외, "Transmembrane Signalling By The Cell Antigen Receptor", J. Exp. Med., 161:446-56 (1985) 및 J.B. Imboden외, "Antigen Recognition By A Human T Cell Clone Leads To Increases In Inositol Triphosphate", J. Immunol. 138(No. 5): 1322-24 (1987)참고.
그러나, 이 스그날의 발생은 T세포의 증식을 자극하기에는 충분치 않을 수 있다[상기문헌, 873] 실험적인 조건하에서는, 예컨대 세포를 교차결합된 항체, 즉 보조 세포의 존재하에서 교차 결합된 항체와 반응시키거나 (예컨대, 단구 Fc 수용체와 CD3에 대한 항체의 Fc 부분과의 반응) 또는 고상 지지체상에서 항체의 고정화에 의해 T세포 표면상의 CD3항원을 교차결합시키면, T세포가 증식된다는 것이 밝혀졌다.
이렇게 해서, 고상 지지체에 커플링된 CD3/Ti 수용체 복합체에 대한 mAbs는 부분적으로는, CD3항원의 교차결합 때문에, 또 부분적으로는 T세포 활성화를 억제하는 경향이 있는 CD3/Ti 수용체 복합체의 인터널라이제이션의 억제에 기인하여[예컨대, J. A. Ledbetter외, "Valency of CD3 Binding And Internalization of The CD3 Cell-Surface Complex Control T cell Responses To Second Signals", J. Immunol., 136: 3945-52(1986) 참고] T 세포의 증식을 자극한다. [예컨대, P.Andrson외, 상기 문헌 및 C. Walker외, " Activation of T Cells By Cross-Linking An Anti-CD3 Antibody with A Second Anti-T Cell Antibody: Mechanism And Subset-Specific Activation", Eur. J. immunol., 17:873-80(1987) 참고]. 그러나, 치료적 목적에서 생체내에서 T세포 활성화를 촉진시키기 위해 고상 지지체에 고정된 항-CD3을 사용하는데는 실제로 어려움이 따른다. 이러한 사용에는 환자에게 통상 작은 바이드와 같은 고상 지자체를 주사하는 것이 포함되나 이것은 동맥이 막히거나 응집되는 등 환자의 건강에 어떤 위험을 수반하게 될 수 있다.
또한, 생리적 조건하에서는, CD3 항원의 교차결합을 통한 이 CD3/Ti 자극조차도 CD3/Ti 및 다른 CD 항원사이의 T세포 표면상에서의 인터널라이제이션에 의한 촉진을 요구할 수 있을지 모르는 최소 시그날만을 발휘하는 것으로 제안되었다[P. Anderson 외, 상기문헌 p. 678 참조].
더욱이, T세포 활성화에 있어서 CD항원반응의 정확한 효과에 대해서는 불명료한 점이 많다. 예컨대, 자연발생적인 CD4손상 베리언트 분석[P Marrack외, 'The Major Histocompatibility Complex Restricted Antigen Receptor On T Cells Ⅱ. Role Of The L3T4 Product, "J. Exp. Med., 158-1077-91 (1983)참고], 및 유전자 전달 실험 [예컨대, D. Gay외, "Fundtional Interaction Between Huma T-Cell Protein CD4 And The Major Histocompatibility Complex HLA-DR Antigen", Nature, 328: 626-29 (1987) 참고]으로부터, CD4의 발현이 특이 항원애 대한 T 세포 반응을 증대시키고, 항원농도가 준최적상태이거나 항원/MHC-암호화 항원에 대한 T 세포의 결합성이 낮은 경우 CD4가 특히 중요한 역할을 한다는 의견이 제시되었다. [A. Regnier-Bigouroux외, "Accessory Molecules And T Cell Activation Ⅰ. Antigen Redeptor Avidity Differentially Influences T Cell Sensitivity To Inhibition By Monoclonal Antibodies To LFA-1 And L3T4", Eur. J. Immunol., 16: 1385-90 (1986) And S. Shaw외., "Susceptibility Of Cytotoxic T Lymphocyte (CTL) Clones To Inhibition By Anti-T3 And Anti-T4 (But Not Anti-LFA-1) Monoclonal Antibodies Varies With The 'Avidity' Of CRL-Target Interaction", J. Immunol., 134(No. 5):3019-26 (1985) 참고]. 더욱이 CD3 및 CD4에 반응성인 mAbs가 동일한 고상지지체에 고정되면, 고정된 항체에 노출된 T세포의 증식이 촉진되었다. 이와 유사하게, CD3 및 CD8에 대한 mAbs가 고상 지지체에 커필링되어도, CD3단독에 대한 항체에 노출된 경우보다 T세포증식이 더 촉진되었다. 예컨대, P. Anderson 외, 상기문헌].
그러나, 가용성 CD4 모노클로날 항체에 대한 연구는 가용성 항체가 T세포반응을 저해함을 지적하였으며, 이것은 CD4가 T세포 활성화를 억제하는 음성 시그날을 전달함을 시사하는 것이다 [예컨대, J. P. Bank외. J. Exp. Med., 163:1294 (1985); J. P. Tite외, "The Role Of L3T4 In T Cell Activation: L3T4 May Be Both An Ia-Binding Protein And A Receptor That Transduces A Negative Signal", J. Cell. Mol. Immunol., 2:179-90 (1986); 및 P.M. Rosoff.외, "The Role Of The L3T4 Molecule In Mitogen And Antigen-Activated Signal Transduction", Cell, 49:845-53 (1987) 참고].
B 세포라고도 알려진 임파구는 항체-생산(플라스마)세포의 전구체이다. B세포가 항원에 의해 자극받는 경우에는, 헬퍼 T 세포와 대식세포의 협력을 요하며, B세포가 증식해서 플라스마 세포와 메모리 B 세포로 분화된다. B세포에 대한 동정된 CD항원에는 CD19, CD20, CDw40, CD45 CD45R 및 Bgp95(아직 CD 표시를 받지 않은 항원) 등을 들 수 있다MaMichael, Leukocyte Typing Ⅲ, 상기 문헌].
또 다른 흥미로운 CD항원은 CD45 밸혈구 공통항원(L-CA, 또한 T200이나 Ly-5로도 알려져 있음)이다. CD45에는 분자량(Mr) 약 180-220 KDa 사이인 주요 당단백질 군이 포함되며 이들은 조혈계통의 세포로 한정된다 [Trowbridge 외., Proc, Nat'1. Acad. Sci. USA 72:157-161 (1975); Komuro 외, Immunogenetics 1:452-456 (1975); Schide 외, Immunogenetics 9: 423-433(1979); Dalchau 외, Eur. J. Immunol. 10:737-744 (1980; 및 Omary 외, J. Exp. Med. 152; 842-852(1980) 참고]. CD45의 독특한 이소형(isoforms)이 대안적인 mRNA 스플라이싱에 의해 일어난다. 이러한 이소형은 T 및 B 임파구의 아군에 분화적으로 발현된다. 인체 CD45 항원에 대한 몇가지 모노클로날 항체(mAbs)는 Mr 220, 205, 190 및 180 k Da의 모든 CD 45 이소형에 의해 공유되는 에피토프톨 인식한다. [Cobold 외, Leunkocyte Typing Ⅲ, 상기 문헌, 15장. pp788-803 참고]. 그러나, 다른 mAbs 는 B임파구와 T 세포의 아군상에 선택적으로 발현되는 CD45의 220kDa 이소형인 CD45R만을 인식한다 [Cobold, 상기 문헌; Dalchau외, J. Exp. Med. 153:753-765 (1981); Moriboto외, J. Immunol. 134:1508-1515 (1985); 및 Ledbetter외, J. Immunol. 135: 1819-1825 (1985) 참고]. 또 다른 mAb인 UCHL-1은 피질흉선세포 및 활성화 또는 메모리 T 세포의 서브세트에 한정되느 180 kDa종류에 선택적으로 결합한다.[Smith 외, Immunology 58:63-70 (1986) 참고].
최근, 래트 [Thomas외, Cell, 41:83-93 (1985) 및 Barclay 외, EMBO J. 6:1259-1264 (1987)], 마우스 [Saga외, Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 83:6940-6944 (1986); W.C. Rascke , Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 84:161-165(1987); Thomas 외, Proc. Nat'1. Acad. Sci, USA 84:5360-5368(1987) 및 Saga외, Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 84:5364-5368 (1987)] 및 인간 [Ralph외, EMBO. J. 6:1251-1257 (1987) 및 Streuli외, J, Exp. Med. 166:1548-1566 (1987)]의 CD45 (L-CA)의 1차구조가 cDNA 뉴클레오티드 배열로부터 연역었다. CD45는 필수 막 단백질로서 705-707 아미노산의 커다란 세포질 부분, 22 아미노산 전이막 부분 및 400-500 아미노산에 달하는 세포외 영역으로 되어 있다. 단일 유전자의 1차 전사체의 대체적인 mRNA 스플라이싱에 의해 생성되는 CD45의 여러 가지 이소형은 상이한 세포의 영역을 갖지만, 전이막과 세포질 부분은 동일하다 [Barclay, 상기문헌; Ralph, 상기문헌 및 Streuli, 상기문헌]. 세포질 부분은 두가지의 유사하고도 고도로 보존된 약 300 잔기의 영역을 갖는다.
CD45의 기능을 정의하기 위한 연구는 혼란한 결과를 야기시켰다. [Cobold, 상기문헌] 인간이나 마우스 항원에 대한 mAbs는 T 및 B 세포 의 증식을 저해하는 것으로 보고되었으며 [Harp 외, J. Immunol. 133:10-15 (1984); Bernabeu 외, Eur. J. Immunol . 17:1461-1466 (1987) 및 Mittler외, J. Immunol. 138:3159-3166 (1987)]. 항체-형성 세포의 생산 [Yakura, J. Exp. Med. 157: 1077-1088 (1983), 및 내츄럴 킬러(NK) 세포 및 세포독성 T세포 활성 Seaman외, J, Immunol. 127:982-986(1981); W. Newman, Proc, Nat'1 Acad. Sci. USA 79:3858-3862 (1982); Nakayama외, Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 76:1977-1981 (1979) 및 Lefrancois외, Nature (London) 314:449-452(1985)]을 억제하는 것으로 보고 되어 왔다. 그러나, 어떤 조건하에서는. 항-CD45 mAbs 역시 T 세포 증식을 증대시키는 것으로 보고되었다 [Cobold, 상기문헌; Ledbetter, 상기문헌 및 Martorell외, Eur. J. Immunol. 17: 1447-1451 (1987) 참고]. Thomas (상기문헌)는 두부분의 보존된 동질 영역을 갖는 80 kD 세포질 분자부분이 CD45 기능에 있어 중요한 역할을 할지 모른다고 시사하였다. 최근, 이 영역들은 인체 태반의 가용성인 부분 및 입자성인 부분으로부터 분리되 주요한 저 분자 단백질인 티로신 포스파타제와 동질적인 것으로 밝혀졌다 [Tonks외, J. Biol. Chem. 263:6722-6730 (1988); 및 Charbonneau 외 , Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 85:7182-7186 (1988)]. 이것은 CD45가 다른 막-결합 분자와 반응함으로써 기능을 수행하는 막-결합 단백질 티로신 포스파타제임을 가리키는 것이다. 본 발명은 상술한 몇 가지의 불명료한 점들을 명확히 밝혀 주며, T 세포와 같은 임파구상에 발현된 상이한 표면 항원과 반응성인 서로 교차결합된 최소한 두 개의 항체로 구성된 항체 이종결합체를 제공한다. 이 이종결합체들 중 어느 것은 CD3항원 단독에 대한 항체의 경우 관찰되는 것보다 2차수정도 낮은 단백질 농도에서 T세포내의 ( [Ca2+]i)를 증가시키는 그들의 능력으로 결정되는 T세포의 활성화에 있어서의 시그날 형질도입을 촉진시킨다.
덧붙여, 본 발명의 이종결합체는 임파구의 활성화와 기능을 제해하는 능력도 갖는다.
본 발명의 바람직한 구체예에서는, CD3/Ti 수용체 복합체나 또는 그의 구성분과 반응성인 모노클로날 항체를 CD2, CD4, CD6, 또는 CD8 항원과 같은 T세포 표면상의 제2 항원과 반응성인 모노클로날 항체와 교차결합시켜 T세포의 활성화에 있어서 시그날 형질도입을 촉진하는 이종결합체를 생성시킨다. 또 다른 바랍직한 구체예에서는, CD5 T세포 표면 항원과 반응성인 모노클로날 항체를 CD4, CD6 또는 CD8 항원과 같은 T세포 표면상의 제 2 항원과 반응성인 모노클로날 항체와 교차 결합시킨다. 특히 바람직한 구체예는 CD4에 대한 항체와 교차 결합된 CD3에 대한 항체로 이루어진 이종결합체에 관한 것이다. 또 다른 바람직한 구체예에서는, CD45 T 세포 표면 항원과 반응성인 모노클로날 항체를 CD2, CD3, CD5 또는 CD28 항원과 같은 T 세포 표면상의 제2 항원과 반응성인 모노클로날 항체와 교차 결합시켜 임파구의 활성화 및 증식을 저해하는 이종 결합체를 생성시킨다. 특히 바람직한 구체예는 CD45 항원이나 또는 CD45의 이소형과 반응성인 항체에 교차결합된 CD3에 대한 항체로 이루어진 이종결합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 이종결합체를 이용하여 세포면역 반응 산생시 임파구의 활성을 촉진하거나 저해하는 임차구의 처리방법도 포함한다, 그러므로 본 발명의 이종결합체는 본 발명의 적어도 한 가지의 이종결합체의 약리적 유효량과 약리적으로 허용되는 담체로 이루어진 약리적 조성물에도 이용할 수 있었다, 그러므로, 본 발명의 이종 결합체, 방법 및 조성물은 예컨대 감염성 질병, 암, AIDS 및 자가면역 질병 치료시 면역 반응을 촉진 및 조절하기 위한 면역요법에 이용할 수 있다.
본 발명의 이해를 돕기 위해, 다음의 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 임파구의 활성화 및 기능을 촉진 또는 저해하는데 있어서의 신규한 항체 이종결합체 및 그들의 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 상이한 임파구 세포 표면 항원과 각각 반응성인 최소한 2개의 항체가 서로 교차결합된 이종결합체에 관한 것이다. 바람직하게는, 활성 촉진을 위해서는, 결합체중의 한 항체는 T세포 수용치(Ti)나 또는 그의 결합된 CD3 항원과 반응성인 것이 좋고 다른 항체는 CD항원(예컨대, CD2, CD4, CD6, CD8)과 같은 제2 T 세포 표면 항원과 반응성인 것이 좋다. 다른 한편, 결합체의 한항체는 CD5항원과 반응성이고 다른 항체는 CD4, CD6 또는 CD8과 같은 제2T세포 표면 항원이다. 이종결합체 CD4/CD45역시 T세포의 활성을 촉진시킨다. 활성저해를 위해서는, 이종결합체중 한 항체는 CD45군의 항체(이소형)와 반응성이고 다른 항체는 CD2, CD3, CD5 또는 CD28과 같은 세포 표면항원인 것이 바람직하다. 이론에 구애됨이 없이, 본 발명에 기재된 이종결합체는 임파구와 반응할 경우, 세포 표면상의 각각의 상응하는 항원과 결합하여 이 항원들을 서로 가까운 위치로 근접시킴으로써 작용하는데, 이는 T 세포 활성화시의 헬퍼 T세포와 항원-산생 세포의 접촉시 T세포 수용체와 CD4사이에 일어나는 코클러스터링을 모사할지 모르는 단계이다. [예컨대, A. Kupfer외, "Coclustering Of CD4 (L3T4) Molecuule With The T-Cell Receptor Is Induced By Specific Direct Interaction Of Helper Interaction Of Helper T Cells And Antige-Presenting Cells", Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA. 84:5888-5892(1987) 참고]. 세포 표면상의 T 세포 항원들간의 이러한 상호 반응은 CD3/Ti-매개 전이막 시그날링을 촉진시켜 T 세포를 활성화시키는 것으로 보여진다.
임파구에 대한 CD 45항원의 영향의 기작은 이해되지 않고 있으나. 본 발명에 기재되 CD45 이종결합체는 예컨대, CD3항원과 같은 특정 CD 수용체의 집합후 억제를 야기시키는 것과 같이, 서로 물리적으로 밀접히 결합되게 될 때 기능적으로 다른 임파구를 변형시키는 듯하다. 최근 설명된 CD45의 세포질 영역과 인체 태반의 주요 단백질 티로신 포스파타제 사이의 동질성은 전자가 사실상 CD3의 제타사슬과 같은 다른 막결합 분자상의 핵심적인 (Key) 티로실잔기를 탈인산화시킴으로써 백혈수에서의 시그날 형질도입을 변형시키는 기능을 하는 막결합 단백질 티로신 포스파타제임을 암시하는 것이다 [Klausner외, J. Biol. Chem 262:12654-12659 (1987) 참고]. CD45 는 또한 정상적으로 항원 추진 형질 도입을 조절하는 기능을 하는 CD4관련 단백질 티로신 키나아제 활성도 변형시킨다 [Rudd 외, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:5190-5194 (1988) 참고]. 다른 한편, CD4-관련 티로신 키나아제는 CD45-항원의 티로실 잔기를 연산화시켜 그의 활성을 변형시킬 수 있다. 이것은 후술하는 실시예에 나타난 비와같이 CD4 및 CD45 수용체의 교차결합 결과로 얻어진 독특한 활성 향상을 설명할 수 있었다. 이 모델은 핵심적인 티로실 잔기의 인산화가 선행되고 이것은 칼슘 이동에 필요한 것이리라는 것을 예견케하는 것이다, 다른 막결합 단백질 과 근접한 위치로 접근해서 만이 그 기능을 하는 효소의 완전한 막형태는 단백질 티로신 키나아제/포스파타제 조절을 특정한 세포 표면 분장 국소화시키는 역할을 할 것이다. 그러므로, 본 발명의 이종결합체는 임파구의 활성화 및 기능을 촉진시키거나 저해하는 작용을 할 수 있는 것으로 믿어진다. 본 발명에 따른 T 세포 조절, 즉 억제는 pan-T세포 조절이거나 또는 특정한 서브세트의 조절 도는 T세포의 클론의 조절일 수 있음을 주지하여야만 한다. pan-T세포 조절은 T세포 집단 또는 총 푸울(pool)을 조절하는 이종결합체와 T세포의 접촉으로부터 일어난다. 이 이종결합체들의 모든 T임파구상에서 발견되는 T 세포 항원과 반응성인 항체로 이루어진다. 이러한 이종결합체 중 하는 본 발명의 CD3/CD2 이종결합체로서, CD3 및 CD2 는 pan-T 세포 항원이다.[예컨대, J. A. Ledbetter외, Perspectives In Immunogenetics And Histocompatibility, 상기문헌, 표 1 참고].
그러나 적절한 이종결합체를 사용하면, 보다 특이적인 조직을 얻을 수 있다. 예컨대, 헬퍼 또는 억압 서브세트와 같은 T 세포의 특정한 아군만을 활성화시키고자 하는 경우에는, 항체 중 하나가 그 특정 T 세포 아군과 반응성인 이종결합체, 즉 한 항체가 그 아군에 특이적인 항원과 반응해야만 하는 그러한 이종결합체를 제조함으로써 이를 달성할 수 있다. 결합체의 다른 항체는 pan-T 세포 항원에 특이적인 것이 바람직하다. 이 구체예에 따르면, 본 발명의 CD3/CD4 또는 CD5/CD4 이종결합체는 헬퍼 T세포의 활성화를 특이적으로 촉진시키는 반면(CD4는 헬퍼 T세포 서브세트에 특이적임) CD3/CD8 또는 CD5/CD8 이종결합체는 억압자 T세포 아군의 활성화를 촉진시킨다 (CD8은 억압자 T 세포 서브세트에 특이적임).
다른 한편, 본 발명의 CD3/CD45 이종결합체는 CD45 항원 산생 T세포의 활성화를 특이적으로 억제한다. CD45 수용체의 이소형이 T세포의 서브세트상에도 발현되기 때문에, CD45 이소형과 반응하는 항체를 함유하는 본 발명의 이종 결합체도 T세포의 이러한 서브세트를 조절하는데 사용될 수 있다.
마지막으로 클론타잎(clonotypic)조절이 요망되는 경우, 즉 특정 T세포 클론의 조절이 요망되는 경우에는, 본 발명의 이종결합체에는 그 성분으로서 항-클론타잎(Ti)항체, 즉 조절되어야 할 클론의 T 세포 수용체의 여러 영역과 반응성인 항체가 함유되어야 한다. 그렇게 해서, 클론타잎 T세포가 특정항원, 예컨대 종양 또는 바이러스 항원을 적절하게 보거나 반응하지 못할 경우에는, 그 T 세포에 특이적인 항-클론타잎 항체를 함유하는 본 발명의 이종결합체를 이들 T 세포 클론을 조절하는 데 이용할 수 있을 것이다. 다른 한편, T세포의 특정클론을 억제하기 위해서는. Ti/CD45로 이루어진 이종결합체가 이용될 수 있다 (또는 Ti/CD45 이소형). 이 구체예에 따르면, 이종결합체의 Ti성분은 본질적으로 특정 T세포의 조절시 항원 위치를 취하는 것으로 여겨질 수 있다. 이종결합체의 다른 항체는 pan-T세포-특이항체나 서브세트-특이항체 또는 CD45 나 CD45 이소형과 반응성인 항체일 수 있다.
따라서, 본 발명의 이종결합체를 이루는 항체들로는 임파구 표면 항원과 반응성인 항체면 어느 것이든 무방하다. 바람직한 구체예에서는, 결합체중 한 항체는 Ti 또는 CD3 T 세포 항원과 반응성이다. 더욱 바람직한 구체예에서는, CD3 세포 표면 항원과 반응성인 항체를 T 세포 표면의 CD4 항원과 반응성인 항체와 교차결합시킨다.
본 발명의 이종결합체를 구성하는 다른 항체들로는 예컨대 임파구상의 CD2, CD5, CD6, CD7, CD8, CD28 및 CD28과 같은 기타의 CD항원과 반응성인 항체를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. [예컨대, A. Bernard외, (편집), Leukocyte Typing, Springer Verlag (하이델베르그 1984); 및 J. A. Ledbetter외, Perspectives In Immunogenetics And Histocompatibility, 상기문헌 참고]. 그러므로, 또 다른 바람직한 구체예에서는, CD5 T 세포 표면 항원과 반응성인 항체를 CD4, CD6, 또는 CD8 항원과 반응성인 항체와 교차결합시켜 본 발명의 이종결합체를 생성한다. 또 다른 바람직한 구체예에서는 CD3 T 세포 표면 항원과 반응성인 항체를 임파구 세포 표면의 CD45항원 또는 CD45의 이소형과 반응성인 항체와 교차결합시킨다.
본 발명의 이종결합체를 구성하는 항체들는 폴리클로날, 바람직하게는 모노클로날일 수 있고, 예컨대, Fab또는 F(ab')2와 같이 항체의 활성 결합 영역을 함유하는 항체 단편이나 고유한 항체분자일 수 있으며; 기술분야에 잘 확립된 기술을 이용하여 생산할 수 있다[예컨대, 후술하는 실시예 1-3에 인용된 항-CD3, 항-CD4, 항-CD5 및 항-CD2 모노클로날 항체의 제조법을 기재한 문헌 참조]. 덧붙여, CD2, CD3, CD4, 및 CD5 항원과 같은 여러 가지 CD 항원에 대한 모노클로날 항체들은 상업적으로 구할 수 있거나 (Bection Dickinson, Mountainview, CA) 도는 International Leukocyte Typing Work-Shops에서 구득할 수 있다. 모노클로날 항체가 사용되는 경우, 항체는 마우스 또는 인간 유래 또는 키메릭 항체일 수 있다. [예컨대, V.T. Oi, "Chimeric Antibodies", Biotechniques. 4(No. 3) : 214-221(1986)참고]. 더욱이, 본 발명은 또한 이 중 특이적 또는 재조합 모노클로날 항체도 포함하며, 여기서 항체의 한 특이성은 한가지 T세포 항원과 반응성이고 다른 특이성은 제2 T세포 항원에 지향되어 있다. 이러한 이중특이 항체는 미합중국 특허 제4,474,893 호에 기재된 바와 같이 콰드로마 또는 트리오마 세포로부터 제조되거나 화학적으로 제조될 수 있다[Brennan외, Science: 229: 81-83 (1985) 참고].
본 발명의 이종결합체를 구성하는 항체들은 GMBS (말레이미도부티릴옥시숙신이미드)나 또는 SPDP(N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트)와 같은 이종이기능 교차 결합체를 이용하는 등의 공지기술에 의해 서로 공유결합 시킬 수 있다 [예컨대, R. R. Hardy, "Purification And Coupling Of Fluorecent Proteins For Use In Flow Cytometry", Handbook Of Experimental Immunology, 제1권, Immunochemistry, D.M. Weir 외, (편집), pp.31.4-31.12 제4판, (1986)의 종래의 항체 커플링 기술에 관한 토의 참고].
그러므로, 본 발명은 동일한 임파구상의 상이한 임파구 항원과 반응성인 최소한 두 개의 2개의 분자로 구성되며, 임파구의 활성화 및 기능을 촉진 또는 억제하는 작용을 하는 이종 결합체면 어느 것이든 포괄한다. 본 발명의 이종결합체는 T세포뿐만아니라, B세포상의 항원과도 반응하는 것으로 사료된다.
항체에 덧붙여, 본 발명의 이종결합체는 임파구 수용체에 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 예컨데, CD4 수용체는 리간드 gP120(인체 면역 결핍 바이러스 또는 "HIV"의 당단백질 수용체)과 반응성인 것으로 나타났다. 그러므로, 리간드 gp120에 교차결합된 항-CD3항체로 이루어진 이종결합체는 CD3 및 CD4수용체를 교차결합시킴으로써 T세포 활성화를 촉진하는데 사용될 수 있을 것이다. 상이한 T세포 수용체와 반응성인 리간드에 교차결합된 T 세포 수용체 와 반응하는 리간드로 이루어진 기타의 리간드 결합체들도 고려된다. 본 발명의 이종결합체 및 T세포활성화에 있어서 이들의 용도를 바람직한 구체예를 들어 다음에 예시하였으며 여기서는 T세포 표면 의 CD3항원과 반응성인 항체를 CD4항원과 반응성인 항체와 결합시켜 본 발명의 신규한 CD3/CD4 이종결합체를 생성시킨다. CD4+T세포를 이 이종결합체로 처리하면 T세포의 헬퍼 서브세트에서의 촉진된 시그날 형질도입을 야기시키며 이는 세포를 CD3에 대한 항체로만 처리했을때에 비교하여 세포내 [Ca2+]i 동원에 있어서의 현저한 증가 및 이노시톨 포스페이트 1, 2, 및 3 생성의 실제적인 증가에 의해 알 수 있다. CD3/CD4 이종결합체의 시그날 촉진 활성은 CD3/CD3 및 CD4/CD4 동종결합체 또는 이들의 혼합물이 이러한 혼합물이 이러한 증가된 활성을 보이지 않기 때문에 단순히 올리고머화에 기인하는 것은 아니다. 그리고, 항-CD3 및 항-CD4 항체의 혼합물이 활성을 촉진시키기 보다는 저하시킨다는 것이 기술분야에서 이미 입증된 바 있다[ 예컨대, P.M. Rosoff외, 상기문헌 참고]. 더욱이, 이종결합체에 의해 입증된 증가된 활성은 T 세포를 CD4에 대한 가용성 모노클로날 항체로 전처리하자 저해되었다. 덧붙여, CD3/CD4 이종 결합체는 T 세포 활성화시 새로운 기능 활성을 과시했다. 즉, 이 이종결합체는 CD28과 반응성인 모노 크로날 항체의 존재하에서 CD4+T세포의 증식을 유도하였으며 100ng/ml의 저농도에서 조차 CD28 자극시 완전히 공분열촉진적(Comitogenic)이었다. 이러한 공분열촉진성은 CD3 단독이나CD3/CD3 또는 CD4/CD4 동종결합체에 대한 항체를 이용했을 때는 발견되지 않았다. 더욱이, 본 발명의 CD3/CD4/ 이종결합체는, CD28모노클로날 항체와 결합하여 자극 후 처음 3일이내에 T세포의 세포사이클을 추진시켜 세포의 상당한 분획이 제 2사이클에 들어갈 수 있게 하였다. 이와 대조적으로, CD3 단독이나 CD3/CD3 또는 CD4/CD4 동족결합체에 대한 항체는 별다른 세포 사이클의 전이를 유도하지 않았다.
덧붙여, CD3/CD4 이종결합체는 T 세포 표면상의 CD3 및 CD4 항원 모두의 변형을 일으켜, CD4의 표면 발현을 저하시키기에 이루는 것으로 밝혀졌다. 이 결과는 이종 결합체가 이전의 CD3 에 대한 고정항체를 이용하는 경우 나타난 경우와 같이 T세포 표면에 T세포 수용체를 단순히 고정시키는 것은 아님을 가리키는 것이다. [예컨대 J. A. Ledbetter외, J. Immunol. 상기문헌 참고].
CD3/CD4 이종결합체를 사용하여 얻어진 결과는 T 세포 표면상의 CD4 항원이 CD3/Ti 수용체 복합체 및 CD4 항원사이의 물리적 상호반응을 통한 CD4+헬퍼 T세포의 T세포 활성화시 시그날 형질도입에 있어 활성적으로 포지티브한 역할을 함을 입증하는 것이다.
시그날 형질도입을 개시하는 CD3/CD4 이종결합체의 능력을 지지한 분자기구는 잘 이해되지 않고 있다. CD3/Ti와 CD4 상호반응의 최소한 한가지 영향은 이노시톨 포스페이트 생산의 촉진인 것으로 나타나며, 이는 CD4가 막 포스포이노시티드류의 CD3/Ti-유도성 가수분해를 촉진하여 이노시톨 트리포스페이트의 생산으로 이끌 수 있음을 시사하는 것이다. 이것은 CD3/CD4 이종결합체의 이노시톨 포스페이트-생산 활성이 세포와 가용성CD4 모노클로날 항체와의 반응에 의해 억제됨을 가리키는 본 발명자들의 실험 자료에 의해 뒷받침된다.
이러한 억제는 만일 CD3/Ti 단독이 효울이 덜한 시그날 변환자라며, CD4 및 CD3/Ti 의 항체-유도 해리의 결과일 수 있다. 다른 한편, CD4와 그의 항체의 독립적인 상호반응은 이노시톨 포스페이트의 생산을 저해하는 네가티브 시그날을 전달할 수 있다.
이노시톨 트리포스페이트(InsP3)의 생산은 T 세포에 있어서 세포질의 칼슘 동원을 매개하는 것으로 믿어지기 때문에, CD4와 CD3/Ti의 상호반응도 세포내의 저장원으로부터 칼슘을 방출시키는 것을 촉진시키는 것으로 나타난다. [Ca2+] 동원에 있었 CD3/CD4 이종결합체의 투여량- 반응곡선대 CD3에 대한 항체의 반응곡선을 비교하면 검색가능 한 [Ca2+]i반응은 CD3/Ti 가 단독으로 자극되는 경우보다 CD3/CD4 이종 결합체를 사용함으로써, CD4 및 CD3/Ti가 근접하여 자극될 때 T세포상의 휠씬 적은 수용체의 상호반응으로부터 획득되는 것으로 나타난다(도3 참고). 그러므로, 본 발명의 CD3/CD4 이종결합체의 한가지 특성은 수용체 점유율이 낮은 가운데에서도 T 세포를 활성화시킬 수 있는 그의 능력이라할 수 있다.
이노시톨 포스페이스 생산 및 칼슘 동원 T 세포의 활성화와 관련된 시그날이고, 세포를 증식시키는 것으로 알려져 있기 때문에, 여기에 제시된 자료는 작용기구에 관계없이, 본 발명의 CD3/CD4 이종결합체가 T세포의 활성화 및 증식을 촉진하는데 유용한 것임을 분명히 입증해준다.
본 발명은 또한 CD3/CD4 이종결합체와 같이, T세포 활성화에 있어서 향상된 시그날화 능력을 나타내는 다른 이종결합체도 포괄한다. 예컨대, 본 발명의 CD3/CD2 이종결합체, CD3/CD6 이종결합체, CD3/CD7 이종결합체 및 CD3/CD8 이종결합체 역시 칼슘 동원에 있어 촉진된 활성을 나타낸다. 게다가, 본 발명에 따라, 몇 가지 항-CD5 함유 이종결합체도 제조되고 (예컨대, CD5/CD4 이종결합체, CD5/CD6 이중결합체 및 CD5/CD8 이종결합체) T세포에 있어 [Ca2+]의 동원시 촉진된 활성을 보였다.
CD45 항원 또는 그의 이소형과 반응성인 항체를 포함하고 임파구 활성화 및 기능을 저해하거나 또는 촉진할 수 있는 본 발명의 이종결합체를 CD3항원과 반응성인 항체와 CD45 항원과 반응성인 항체를 결합시켜 본 발명의 신규한 CD3/CD45 이종결합체를 생산하는 바람직한 구체예에 의해 예시한다. 이 이종결합체로 T세포를 처리하면 세포내 칼슘 동원이 심각히 저하되는 것에 의해 나타나는 바와같이 T 세포의 CD3-매개활성(전이막 시그날)의 철폐가 야기되었다.
덧붙여, CD3, CD2, CD5 또는 CD28 및 CD45 수용체와 같은 T 세포 표면상의 여러 가지 CD 수용체 사이의 상호작용의 유도는 모노클로날 항체를 이용하여 임파구상의 다른 CD 45 수용체를 동일한 임파구상의 다른 CD수용체와 교차결합시키므로써 달성하였다. 이러한 교차결합은 세포 표면상에 공통 수용체를 교차결합시켜 유도된 T세포 항원의 동종집합체 형성으로부터 발생되는 세포질의 유리칼슘 농도([Ca2+]i)의 증가의 철폐를 초래하였다. 고정된 항-CD3 모노클로날 항체 자극에 의해 개시되는 T세포 증식은 동일 표면상에서 고정될 때, (그러나 용액에서는 아님)항-CD45항체나 항-CD45R 항체에 의해 저해되었다.
이와 유사하게, 각각 항-CD2 및 항 CD28 항체에 의한 CD2 및 CD28 수용체의 자극후의 T세포의 증식은 CD45 항체가 항-CD2 항체나 항-CD28 항체에 교차결합되었을 때 저해되었으나, 항 CD45 항체가 세포 표면에 별개로 결합했을 때는 저해되지 않았다. 이러한 결과는 CD45나 또는 CD45R과 같은 CD45의 이소형과 반응성인 항체 및 T세포 상의 CD항원들과 반응성인 항체로 이루어진 이종결합체가 세포를 조절하는데 유용할 수 있음을 제시하는 것이다.
이와는 대조적으로, T세포상의 CD4 수용체의 동종집합체의 생성에 의해 유도된 [Ca2+]i 의 증가는 CD4 수용체를 모노클로날 항체를 이용하여 CD45 접수체에 교차결합시켰을 때 강력히 확대하였다. 그러므로, T세포상의 CD4에 대한 항체 및 CD45나 또는 CD45R 의 이소형과 반응성인 항체로 이루어진 신규의 이종결합체도 CD45 이소형의 발현에 의해 정의되는 CD4 세포의 아군이나 또는 모든 CD4 양성 세포의 T세포 기능을 촉진시키는데 이용될 수 있다.
본 발명의 이종결합체는 임파구 조절에 유용하며 따라서, 감염성 질병, 암, AIDS 및 자가면역 질환과 같은 질병 상태에서 세포성 면역 반응을 조절하는데 사용될 수 있다. 이 면역 결합체들은 T세포가 부족하거나 조절되지 않는 경우 질병상태에서 세포성 면역 반응의 조절에 특히 유용할 수도 있다.
예컨대, CD45 이소형은 어떠한 자가면역질환에서는 비정상적으로 발현되는 것으로 알려져있다 [Rose외, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 82:7389-7393(1985)참고]. 그러므로, CD45 수용체나 CD45 이소형과 반응성인 최소한 한가지의 분자를 함유하는 본 발명의 이종결합체는 자가면역 질환에서 임파구 기능을 조절하는데 유용할 수 있다.
부가해서, 본 발명의 이종결합체는 후천성 면역결핍증후군(AIDS)에 걸린 환자들의 면역 반응성을 증진시키는데 유용할 수도 있다. CD4 항원은 AIDS를 일으키는 인체 면역결핍 바이러스(HIV)의 수용체로서 작용하는 것으로 알려져 있다. CD4는 T세포가 바이러스에 감염되는 동안 HIV의 gp120 엔벨롭 당단백질이 결합하는 수용체인 것으로 믿어지고 있다 [예컨대, L.A. Lasky외, Cell, 50:975 (1987) 및 M. Kowalski외, Science, 237:1351 (1987) 참고]. HIV 감염후, CD4의 세포 표면 발현은 다운(down) 조절되고 CD4 mRNA의 농도는 저하된다 [J.A. Hoxie외, "Alterations In T4 (CD4) Protein And mRNA Synthesis In Cells Infected With HIV", Science, 234:1123-1127 (1986) 참고]. 또한 AIDS 환자들의 가용성 항원에 대한 면역 반응성이 감소되었다는 것은 잘 정립된 일이다 [예컨대, H.C. Lane외, "Qualitative Analysis Of Immune Function in Patients With The Acquired Immunodeficiency Syndrome", New Eng. J. Med. 313 (No. 2): 79-84 (1985) 참고]. 생체외 연구결과 정제된 HIV gp120은 분열 촉진된 자극에 대한 T세포의 반응을 저해할 수 있는 것으로 나타났으며, 이것은 본 발명자들이 CD4에 대한 가용성 모노클로날 항체를 이용해서 나타나는 효과와 유사한 것이다.[D.L.Mann외, J. Immunol., "HTLV-III Large Envelope Protein (gp120) Suppresses PHA-Induced Lymphocyte Blastogene sis", 138:2640-2644 (1987) 참고].
그러므로, AIDS 환자에게서 볼 수 있는 면역억압은 CD4 항원 발현에 미치는 HIV 감염의 영향과 관련있는 것으로 제안될 수 있다. 즉, HIV 감염후에 일어나는 T세포에 대한 CD4의 다운 조절은 세포의 시그날 능력을 저하시킴으로써 면역 반응에 영향을 미치게 되고, 이는 항원에 대한 반응에 있어 T세포 활성화를 감소시키는 것이다. 이 모델을 뒷받침하는 것으로서, 본 발명자들은 CD3-촉진된 유리 칼슘 농도의 증가가 HIV-감염 세포에서는 약화된다는 것을 발견하였다 [G.P. Linette외, "HIV-1 Infected T Cells Exhibit The CD3/Antigen Receptor Pathwway", Science, 241:573-576 (1998)]. 이러한 관찰은 본 발명의 이종결합체, 특히 CD3/CD4 이종결합체가 HIV 감염에 의해 야기되는 T세포 기능장애를 연구하거나 치료하는데 유용할 수 있음을 암시하는 것이다.
본 발명은 또한 생체내 또는 생체외에서, 질병상태중의 세포성 면역 반응을 조절하기 위해 본 명세서에 기재된 이종결합체를 사용하여 임파구를 치료하는 방법도 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 이종결합체는 T세포의 생체외 활성화에 이용될 수 있다. 이 활성화는 환자로부터 채취한 T 임파구를 본 발명의 이종결합체의 최소한 한가지와 생체외에서 접촉시킴으로써 T세포가 활성화되고 자가동족성 공여체로 재주입됨으로해서 수행될 수 있다 [예컨대, S.A. Rosenberg외, "Immunotherapy Of Cancer By Systemic Administration Of Lymphoid Cells Plus Interleukin 2", J. Biol. Resp. Modif., 3:5501-5511 (1984) 참고]. 이 치료방법은 T세포를 다른 면역 모듈레이터와 함께 생체외에서 공동-배양시키거나 예비배양시키는 것을 포함할 수도 있다.
다른 구체예에서는, CD5 [예컨대, E.A. Clerk외, "Amplification Of The Immune Response By Agonistic Antibodies", Immunology Today, 7:267-270(1986) 참고] 및 CD28 (하기 실시예 1 참고)와 같은 아고니스트 항체, 성장인자, 또는 인터류킨-2(IL-2)와 같은 기타 제제와 가능하게 결합시켜 환자에게 이종결합체를 주사함으로써 생체내에서 T세포를 활성화시키는데 이종결합체를 이용할 수 있다. 치료방법과는 별도로, Fab나 F(ab')2와 같은 항체 단편, 키메릭 항체 또는 이중 특이 항체를 함유하는 이종결합체를 이용하는 것이 유용할 수 있다.
본 발명의 이종결합체는 또한 정맥, 경구, 피하, 복강 또는 임파내 투여 등과 같은 통상적인 형태를 사용하여 생체내 투여시킬 수 있으나 결코 이 투여 방법에 한정되는 것은 아니다. 정맥 투여가 바람직하다.
본 발명의 약리적 조성물-이종결합체를 함유하는-은 고체, 반고체 및 정제, 알약, 분말, 액상용액 또는 현탁액, 좌약, 중합 마이크로캡슐제 또는 마이크로베지클제, 리포좀 및 주사가능 하거나 주입가능한 용액 등의 여러 가지 투약형태로 될 수 있으나 이 형태들로 한정되는 것은 아니다. 바람직한 형태는 투여방식 및 치료적 응용에 의존한다.
이종결합체 조성물에는 인체 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 인삼염, 물 또는 염 또는 전해질과 같은 완충액등과 같은 약리적으로 허용되는 담체가 함유될 수 있다.
본 발명의 이종결합체 조성물에 대한 가장 효과적인 투여방식 및 투여섭생은 질병의 위중도, 경과, 환자의 건강상태 및 치료에 대한 반응 및 치료의사의 판단에 따른다. 따라서, 이종결합체의 투여량은 각 환자에 따라 알맞게 적정되어야 한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 이종결합체의 유효량은 약 1 내지 100mg/m2의 범위라 할 수 있다. 생체외에서의 T세포 의 치료시에는 200μg-2mg의 이종결합체/109세포가 사용된다.
덧붙여, 본 발명의 이종결합체는 T세포의 부족이나 비조절과 관련된 질병을 앓고 있는 환자에서, 예컨대 CD항원과 같은 주어진 T세포의 수용체 기능을 진단학적으로 측정하는 데 이용될 수 있다. 시그날 형질도입(실시예 1 참고) 및 적절한 제어 측정을 위해 본 명세서에 기재된 칼슘 분석을 이용하면, 정상적인 공여체 대 병든 공여체이 T세포의 활성을 비교하고, 본 발명의 특이적인 이종결합체에 의해 CD기능에 있어서의 결함을 측정할 수 있다. 예컨대, 본 발명이 CD3/CD4 이종결합체는 가용성 항-CD3 단독의 경우 나타나는 단백질 농도보다 더 낮은 농도에서 [Ca2+]i 동원을 촉진시킨다. 그러므로, 이러한 낮은 투여량에서, CD4 수용체의 기능을 실제로 측정할 수 있다. 이것은 이러한 투여량에서 CD3/CD4 이종결합체의 활성을 차단하는 가용성 항-CD4의 능력에 의해 반영된다(도 2). 이와 유사하게, 낮은 투여량의 CD3/CD8 이종결합체를 이용하는 경우에는 CD8 수용체의 기능을 측정할 수 있다. 이러한 투여량에서, 이종결합체는 암 및 자가면역질환과 같은 여러 가지 질병 상탱서 특정한 CD 수용체 기능에 있어서의 결함은 검색하는데 이용될 수 있다. 다른한편, 칼슘 분석은 적합한 단일 항체 콘트롤이 수행되는 한(즉, 이종결합체의 활성은 그 이종결합체의 성분을 구성하는 비결함 항체들의 활성과 비교되어야만 함) 본 발명의 이종결합체의 모든 투여량에 대해 수행할 수 있다 [예컨대, European Patent Application 221, 768, E.L. Reihnerz외, 1987년 5월 13일 발행 참고].
본 발명을 더욱 구체적으로 이해시키기 위해 다음의 실시예를 들어 상세한 설명을 하였다. 이 실시예들은 단지 설명 목적을 위한 것으로서 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 한정시키고자 하는 의도는 없다.
[실시예 1]
다음의 실시예는 본 발명의 신규한 이종결합체의 제조방법 및 특징화를 설명하는 것이다. 이 구체예에서는, CD3와 반응성인 항체를 CD4와 반응성인 항체와 교차결합시켜 신규의 CD3/CD4 이종결합체를 생산하며, 이 이종결합체는 이것으로 CD4+(즉, 헬퍼) T세포를 활성화시킬 때 촉진된 전이막 시그날링을 일으킨다.
[본 발명의 CD3/CD4 이종결합체의 제조]
이 구체예의 이종결합체를 제조하는 데 사용된 CD3 및 CD4 항체는 각각 G19-4 (Balb/c, IgG)과 G17-2(Balb/c, IgG) 이었다. 이 항체들은 J.A. Ledbetter 및 E. Clark의 "Surface Phenotype And Function Of Tonsillar Germinal Center And Mantle Zone B Cell Subsets", Human Immunology, 15:30-43 (1986) 및 J.A. Ledbetter외, "An Immunoglobulin Light Chain Dimer With CD4 Antigen Specificity", Molecular Immunology, 24(No. 12): 1255-1261 (1987)에 기재된 바와 같이 제조하였다. 덧붙여, 본 구체예의 이종결합체를 구성하는데 사용될 수 있는 항-CD3 및 항-CD4 모노클로날 항체들은 상업적으로 구득할 수 있다(예컨대, 각각 T3, Coulter Co., FL 및 Leu-3, Bection Dickinson, CA). G19-4 및 G17-2 항체는 염침전 및 DEAE 크로마토그래피에 의해 복수로부터 정제한 다음, 투석시키고 사용전에 0.45μ 필터를 통해 여과시켰다.
R.R. Hardy (상기문헌)에 의한 피코에리드린 커플링의 경우와 같이 두가지 모노클로날 항체를 GMBS(Calbiochem, La Jolla, CA) 및 5-이미노티올란 HC1(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)와 같은 이종이기능 교차결합체와 1:1의 몰비율로 결합시켰다. 얻어진 이종결합체를 Superose 6 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) FPLC 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 유리 항체로부터 분리시키고 형광-결합 항-CD3 및 항-CD4 모노클로날 항체의 직접 결합을 차단하는 이종결합체의 능력을 시험함으로써 CD3과 CD4 두가지 모두의 반응성을 시험하였다. 이 CD3/CD4 이종결합체를 G19-4/G17-2로 표시한다.
[본 발명의 CD3/CD4 이종결합체에 의한 촉진된 칼슘 동원]
다음, G19-4/G17-2 이종결합체를 세포중의 세포질 칼슘의 동원을 촉진시키는 그의 능력에 대해 G19-4 (항 CD3) 단독의 활성과 비교해서 시험하였다. 세포는 말초혈액을 Ficoll-Hypaque 상에서 원심불리하여 정제한 다음, 플라스틱에 부착시켜 대부분의 단구를 제거하여 얻은 인체 말초 혈액 임파구를 이용하였다.
세포중의 [Ca2+]i 증가는 P.S. Rabinovitch외, "Hetero-geneity Among T Cells In Intracellular Free Calcium Responses After Mitogen Stimulation With PHA or Anti-CD3. Simultaneous Use Of Indo-1 And Immunofluorescence With Flow Cytometry", J. Immunol., 137 (No. 3):952-961 (1986)에 기채된 바와 같이 인도(indo) 1 (Molecular Probes, Eugene, OR) 및 모델 50 HH/2150 유동 세포계(Ortho Diagnostic Systems, Inc., Weswood, MA)를 이용하여 측정하였다. 간단히, 세포막을 투과할 수 있으며 세포질 중에서 가수분해되어 불투과성 트랩형으로되는 아세톡시-메틸 에스테르(Molecular Probes, Junction City, OR)와 함께 배양시킴으로써 세포(5 x 107ml)를 인도-1로 로딩시켰다. 배양은 지정된 인도-1 농도를 함유하는 매질에서 37℃ 에서 45분동안 수행하였다. 다음 세포를 세척하고 2.5 x 106/ml로 신선한 배지에 재현탁시킨다음 실온의 암실에서 분석할때까지 저장하였다. 각 분석당, 인도-1-로딩된 세포를 배지로 1 x 106ml 까지 희석시킨다음 37℃ 에서 평형시켰다. 측정은 Rabinovitch (상기문헌)에 의해 기재된 바와 같이 유동 세포계와 형광유동계를 이용하여 행하였다. 평균 인도-1 바이올렛/블루 형광대 시간을 산출하는 프로그램에 의해 히스토그램을 분석하였다. 덧붙여, 우선 대조세포에 대한 비율에 대한 두 표준 편차인 인도-1 비율 값을 결정한다음 이 역가를 초과하는 세포의 백분율 대 시간을 플롯팅하여 반응세포의 백분율대 시간을 분석하였다. 모든 유동세포계 자료상의 X(시간) 축에는 100가지 자료 포인트가 있다.
도 1에 나타난 바와 같이, Ca2+의 농도 ([Ca2+]i)를 증가시키는데 요구되는 G19-4/g17-2의 농도는 G-19-4 단독을 이용할 때 요구되는 농도보다 1.5-2차수가 작다. 게다가, G19-4/G17-2 이종결합체의 활성은 CD4+T세포에 한정되어 있는데, 이는 면역 형광에 의한 CD4+세포의 강화가 상응하는 [Ca2+]i 증가활성 및 반응세포의 백분율을 증가시키기 때문이다. 그러므로, 도 2가 나타내는 바와 같이, 말초 혈액 임파구가 G19-4/G17-2 이종결합체에 의해 자극받을 때, 세포에 대한 평균 최대 [Ca2+]i 반응은 약 1300nM이었으며 반응세포가 약 60%였다. 그러나, 세포의 CD4+서브세트만을 분석했을 때, 평균 최대 [Ca2+]i 반응은 10,000nM 이었으며 반응세포가 95% 이었다. 게다가 CD4+세포에 대한 이종결합체의 활성은 세포를 5μg/mℓ G17-2 (항-CD4)로-5분경 전처리한 다음 이종결합체 0.4μg/mℓ 로 처리하자 거의 완전히 저해되었다.
도 2 의 판넬에 나타낸 바와 같이 CD8 음성, CD11 음성, CD16 음성 및 CD20 음성세포를 게이트 온(gating on) 시킴으로써 CD4+세포를 분석하였다. CD4+세포에 대한 이러한 음성 선택(negative selection)은 말초 혈액 임파구를 피코에리드린(PE)-결합 2H7, CD20과 반응성인 모노클로날 항체 [예컨대, E.A. Clark외, "Role Of The Bp35 Cell Surface Polypeptides In Human B-Cell activation", Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 82:1766-1770 (1985) 참고], Fc-2, CD16에 대한 모노클로날 항체 [예컨대, C. Anasetti외, "Induction Of Calcium Flux And Enhancement Of Cytolytic Activity In Natural Killer Cells By Cross-Linking Of The Sheep Erythrocyte Binding Protein (CD2) And The Fc-Receptor (CD16)", J, Immunol., 139(No. 6): 1772-1779(1987) 참고], G10-1, CD8에 대한 모노클로날 항체 [예컨대, J.A. Ledbetter외, "Covalent Association Between Human Thymus Leukemia-Like Antigens And CD8 Molecules", J.Immunol., 134:4250-4254 (1985)참고], 및 60.1, CD11에 반응성인 모노클로날 항체[예컨대, J.P. Bunyon 외, "Differential Participation Of Epitopes On Alpha And Beta Chains Of The LFA Family In Neutrophil Aggregation As Defined By Workshop Monoclonal Antibodies", Leukocyte Typing III, 상기문헌 pp844-47 참고 및]으로 염색시킨다음 비염색 세포를 게이트 온시켜 행하였으며, 이는 95% CD4 양성이었다.
이종결합체에 의해 영향받은 것이 세포질원으로부터 칼슘동원인지를 보기위해, 세포외 칼슘을 킬레이트하여 제거하는 5mM EGTA [에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산]의 존재하에서 G19-4 대 G19-4/G17-2 이종결합체의 비교적정을 수행하였다. 제3도는 EGTA의 존재하에서 G19-4/G17-2 이종결합체로 칼슘을 동원하는데 약 2 로그 증가가 있음을 나타낸다. 세포의 칼슘이 존재하는 경우, 종결점까지의 적정은 활성에서도 약 2 로그 증가가 있음을 나타내었다(자료 싣지 않음).
[Ca2+]i에 미치는 CD3/CD4 이종결합체의 영향에 책임이 있는 CD3 또는 CD4 항원에 결합하는 밸런시(valency)를 배제하기 위해, 본 발명자들은 CD3/CD3 및 CD4/CD4 동종결합체를 CD3/CD4 이종결합체와 비교하였다. 이 동종결합체를 CD3/CD4 이종결합체의 경우와 마찬가지로 제조하였고 각각 G19-4/G19-4 및 G17-2/G17-2로 나타내었다. 다음의 표 1 에 나타낸 바와 같이, CD3/CD3 동종결합체도, CD3/CD3에 CD4/CD4 동종결합체를 더한 혼합물도 [Ca2+]i에 미친 CD3/CD4 이종결합체의 촉진효과를 모방하지 않았다. 이 자료는 CD3/CD4 이종결합체의 촉진된 활성이 이종결합체의 밸런시의 기능이 아니며 따라서 아마도 이종결합체와 이 항원들의 상호반응을 통해 일어나는 CD3/ 및 CD4 분자의 물리적 인접성으로부터 기인함을 암시하는 것이다. 더욱이, 이종결합체와 동종결합체는 간접염색 및 유동세포계를 이용한 결합 분석에 있어서 유리항체보다 약간 덜 활성적이었다(자료 싣지 않음). 그러므로, CD3/CD4의 독특한 활성은 이종결합체의 제 2 특이성에 기인하는 CD3 결합 친화성에 미치는 영향과 관련이 있는 것 같지는 않다.
Figure kpo00002
[Ca ]i 반응 분석은 상술한 바와같이 인도-1로 로딩되고 PE-결합 항-CD20, 항-CD8 및 항-CD16으로 염색시킨 말초 혈액 임파구를 이용하였다. 95% CD4 세포로 구성된 비염색 세포가 분석되었다. 피크 평균 반응은 자극후 처음 5분이내에 일어났다.
[본 발명의 CD3/CD4 이종결합체가 이노시톨 포스페이트 합성에 미친 영향 ]
T세포중의 세포질 칼슘의 동원은 이노시톨 트리포스페이트(InsP3)의 생산에 의해 중개되는 것으로 믿어지기 때문에, 본 발명자들은 CD3에 대한 모노클로날 항체 단독이나 또는 CD3/CD4 이종결합체로 정제도CD4 T세포를 자극한 후 이노시톨 포스페이트의 증가를 측정하였다.
CD4 T세포는 C.H. June등의 T-Cell Proliferation Involving The CD28 Pathway Is Asscociated With Cyclosporine-Resistant Interleukin 2 Gene Expression, Mol. Cell. Biol., 7 (No. 12):4472-4481 (1987)에 기재된 바와 같이 정제하였다. 간단히, 실험실 직원을 류코포레시스 처리한 다음 이를 피콜/하이파크 밀도 구배 원심분리하여 말초 혈액 임파구를 얻었다. CD8 , CD11 , CD16 , CD14 , 및 CD20 세포를 적당한 모노클로날 항체 (M. Kamoun외 Human Monocyte-Histiocyte Differentiation Antigens Identified By Monoclonal Antibodies, Clin. Immunology and Immunopathology, 29:181-195 (1983)에 기재된 바와같이 제조한 항-CD14 모노클로날 항체, 20.3을 제외한 대부분의 항체)로 최초 코팅시킨 후, T세포의 CD4 , 서브세트 자석 비이드 면역흡착으로 네가티브 설렉션에 의해 분리하였다. 이 전략은 말초 혈액 T 임파구상의 CD4 및 CD8 및 CD8 표면 항원의 상호적이고 비중복적인 분포라는 장점을 얻었다. 세포를 3회 세척하여 비결합 항체를 세척한 다음, 염소의 항-마우스 면역글로불린-코팅 자기입자(Advanced Magnetics Institutes, Cambridge, MA)와 배양시킨 후 비이드 피복 세포를 자력 분리에 의해 분리하였다. 일반적으로, 유동 세포계로 평가했을 때 98% CD4 이고 비특이적 에스터라제에 대해 염색 측정했을 때 0.1% 단구를 함유하는 약 500 x 106 CD4 T세포가 회수되었다.
다음 정제된 CD4 T세포를 40μCi/ml myo-2[ H]-이노시톨 (37MBq/ml; Amersham Corp., Arlington Heights, IL) 및 4μg/ml PHA가 보강된 10% 열-불활성화된 송아지 태아 혈청(배지)이 보강된 RPMI 1640에 2-4 x 10 세포/ml로 재현탁시키고 37℃.5% CO대기중에서 배양시켰다. 72시간 후, 세포를 3회 세척하고 10mM LiCl이 보강된 배지 중에 5x10 세포/ml로 재현탁시켰다. 20분간 배양시킨후, G19-4 또는 G19-4/G17-2 이종결합체를 t=0에서 최종농도가 1μg/ml 될 때까지 첨가하였다. 다음, 여러시점에서, 5 x 10 세포 시료를 제거하고 Eppendorf 5414 원심분리기에서 10초간 침전시켰다. 배지를 흡입시킨후, 세포 펠렛에 빙냉한 10% TCA (w/v) 1ml를 첨가하였다. 900 x g로 5분간 원심분리하여 불용성 물질을 제거한 후, 상등액을 6배 부피의 디에틸에테르로 추출한 다음, 중화시켰다. [ H]-이노시톨 포스페이트를 포르메이트 형태의 Dowex 1-x8 (100-200 메쉬)(Bio-Rad, Richmond, CA)를 이용하여 음이온 교환 크로마트 그래피로 분리하고 Bio-Safe 2 (Research Products, Int., Mt.Prospect, IL) 액체 섬광 분광계로 정량하였다. 적정 이노시톨 포스페이트의 이 측정법은 J.B. Imboden외, Transmembrane Signalling By the T Cell Antigen Receptor, 상기문헌 및 J.B. Imboden외, Antigen Recognition By a Human T Cell Clone Leads To Increases In Inositol Triphosphate 상기문헌 등에 기재되어 있다.
제4도에 나타난 바와같이, 1μg/ml에서, 이종결합체는 이노시톨 포스페이트 1, 2 및 3 생성의 실제적 증가를 자극한 반면, G19-4 단독은 이노시톨 포스페이트 1에서 단지 적은 증가를 일으켰을 뿐이다. 실험시작(t=0) 및 실험말기(t=10분)에서 비자극 세포에서의 적정 이노시톨 포스페이트 농도도 나타내었다.
부가 실험에서, 제5도에 도시된 바와같이, 본 발명자들은 CD4에 대한 유리 모노클로날 항체인 G17-2가 이종결합체에 의해 일어난 이노시톨 포스페이트 반응을 저해한다는 것을 관찰하였다. G17-2는 유리 항-CD3 모노클로날 항체인 G19-4에 대한 이노시톨 포스페이트 반응을 저해하지 않았다. 이 실험에 따라서, CD4 T세포를 PHA (4μg/ml) 및 [ H]-이노시톨 (40 Ci/ml)이 함유된 배지에서 72시간 배양시키고, 집중적으로 세척한다음 37℃ 에서 20분동안 배양시키면서 10mM LiCl과 함께 배지에 재현탁시켰다. 다음 G17-2 (J.W. Goding, In Monoclonal Antibodies Principles And Practices, p.230, Academic Press (1983)에 기재된 바와 같이 바이오틴-결함시킴)를 선택 시료에 첨가하였다. 5분후 G19-4, G17-2, G19-4/G17-2 이종결합체, 및 아비딘을 지침된 대로 첨가하고, 추가로 10분간 더 배양시켰다. 10% TCA중 세포 시료 (10 세포/시료)가 용해(lysis)된 후, [ H]-이노시톨 포스페이트를 추출하고, 음이온 교환 크로마토그래피로 분해한 다음 상기와같이 정량화하였다. 두가지 독립적인 실험을 도 5 에 나타내었다. 삼중 세포 시료의 평균 +/- sem (표준 오차)을 나타내고 모노클로날 항체와 아비딘의 최종 농도를 도면에 μg/ml으로 나타내었다.
그러므로, 이 실험자료는 이노시톨 포스페이트에 미치는 본 발명의 이종결합체의 촉진된 영향을 입증할 뿐만 아니라 CD4에 대한 가용성 항체가 이러한 T세포 반응을 저해한다는 것도 입증한다. 따라서 이 자료는 T세포 반응에 있어서 CD4 항원이 중요한 역할을 수행함을 암시해준다.
[CD3/CD4 이종결합체는 T세포 활성화에 있어 신규한 활성을 갖는다]
본 발명의 CD3/CD4 이종결합체는 CD3/CD3 및 CD4/CD4 동종결합체를 대조군으로 이용한 증식 분석에서 입증된 바와 같이 T세포 활성화에 있어서 새로운 기능 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이 분석에서는 CD4 T세포를 평저, 96웰 마이크로타이터판에 5% 열-불활성화된 송아지 태아 혈청(Hyclone, Logan, UT)이 함유된 RPMI 1640 배지중 웰당 5 x 10 세포가 되도록 4중 시료로 배양하였다. CD4 세포를 PMA(포르볼 미리스테이트 아세테이트) (1μg/ml) 나 또는 T세포 표면의 CD28 항원과 반응성인 모노클로날 항체 9.3 [(Balb/c x C57BL/6)F1, IgG]의 존재 또는 부재하에서 G19-4(항-CD3), G19-4/G19-4(CD3/CD3 동종결합체), G19-4/G17-2(CD3/CD4 이종결합체) 또는 G17-2/G17-2(CD4/CD4 동종결합체)와 함께 3일간 배양시켰다. [예컨대, J.A. Hansen외, Monoclonal Antibodies Identifying A Novel T Cell Antigen And Ia Antigens Of Human Lymphocytes, Immunogenetics 10:247-52(1980)참고].
모든 항체와 결합체는 1μg/ml로 사용하였다. 3일간의 배양기간동안 마지막 8시간동안 H-티미딘 (New England Nuclear Corp., Boston, MA) 1μCi/웰로 세포를 펄스시킨 후 액체 섬광 계수기 중에서 제3일에 티미딘 인코포레이션(평균±cpm sem)을 결정하였다.
도 6 에 나타난 바와같이, 정제된 CD4 T세포를 항-CD3 시약 단독이나 또는 PMA 단독과 함께 배양시켰을 경우에는, 증식이 관찰되지 않았다. PMA의 존재하에서는 CD3에 대한 모노클로날 항체를 함유하는 모든 항체 조제는 비교할만한 농도의 [ H]-티미딘 인코포레이션을 유도한 반면, CD4 동종결합체는 분열촉진적이지 않았다. 그러나, CD28에 대한 모노클로날 항체9.3으로 상승작용에 대해 여러 가지 시약을 시험하자 실제적인 차이가 관찰되었다. 오직 CD3/CD4 이종 결합체만이 CD28 항체에 대한 반응성을 유도하였다. 이전의 연구들은 CD28에 대한 모노클로날 항체가 PMA의 존재하에서 95% T세포가 세포사이클을 진행하게 하지만 CD28 자극은 정제된 T세포에 대해 분열촉진적이지 않음을 나타내었다 [예컨대, C.H. June외, Mol. Cell. Biol. 상기문헌 참고]. 정제된 T 세포의 CD28 자극이 유체상 CD3 항체와 공분열 촉진적이지 않다는 이 발견은 이전의 연구결과를 확인해주는 것이다. [예컨대, A. Weiss외, Synergy Between The T3/Antigen Receptor Complex And Tp44 In The Activation Of Human T Cells, J. Immunol. 137 (No.3):819-825(1986) 참고].
CD28 자극에 대한 CD3/CD4 이종결합체와 CD3/CD3 동종 결합체의 차이가 정성적인지 또는 정량적인지를 결정하기 위해, PMA(1 g/ml) 또는 항-CD28 모노클로날 항체 9.3(1μg/ml)과 함께 CD4 T세포를 농도를 달리한 G19-4, G19-4/G17-2 이종결합체 또는 G19-4／G19-4 동종결합체와 배양시켰다. 도 7 에 나타난 바와같이, CD3/CD3 동종결합체는 10μg/ml에서도 분열촉진적이지 않은 반면, G19-4/G17-2 이종결합체는 100ng/ml의 낮은 농도에서도 CD28 자극에 완전히 공분열촉진적인 것으로 밝혀졌다. 이와 대조적으로, PMA 및 CD3 자극에 대한 세포의 공분열촉진적인 반응은 시험된 모든 농도에서 CD3 항체 결합체와 유사하였다. 더욱이, 운동력학 실험은 CD28 자극에 대한 CD3/CD3 동종결합체 및 CD3/CD4 이종결합체 사이의 차이는 증식 경과 시간에서의 전이에 기인한 것이 아닌 것으로 밝혀졌다 (자료싣지 않음).
그러므로, CD4 T세포는 증식에 의해서는 CD3에 반응성인 가용성 항체에 반응하지 않고, CD28에 대한 항체 존재하에서는 증식에 의해 본 발명의 CD3/CD4 이종결합체에 반응하는 것으로 나타난다.
T세포 증식에 대한 CD3/CD4 이종결합체의 효과를 추가로 시험하기 위해, 자극후 세가지 연속적인 세포 사이클의 각 단계에 있어 세포를 구별케하는 기술에 의해 세포 사이클의 동력학을 시험하였다. PE-결합 CD8, CD16 및 CD20 항체로 세포를 염색한 후 세포형광그래프 50 HH 세포 분류기(Ortho Diagnostic System Inc., Westwood, MA)상에서 유동 세포계로 CD4 T세포를 분류하였다(앞서 참고문헌 인용하였음). 음성세포가 분류되었으며 이들은 분류된 집단의 재분석에 의해 97% CD4 양성이었다. 면역형광 변수에 덧붙여, 전방 산란과 우향 산란을 측정하고 임파구군을 게이트 온하는데 이용하고 단구, 파편 및 사멸세포는 배제하였다. 세포를 20℃ 에서 2000 세포/초의 유동비율로 분류하였다.
분류된 세포를 원형 바닥에서 5 x 10 세포/웰로 96웰 마이크로타이터판(Nunc, Kampstrip, Denmark)에서 4중으로 배양하였다. G9-4/G17-2 이종결합체나 CD3 또는 CD4 동종결합체를 5μg/ml로 배양체에 첨가하거나 PHA를 10μg/ml로 첨가하였다. 0.6μg/ml 항-CD28 모노클로날 항체 9.3, 1.5 x 10 M BrdU, 100 U/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신, 및 5 x 10 M 2-메르캅토에탄올의 존재하에서 10FBS가 보강된 RPMI 1640에서 세포를 배양하였다. 37℃ (5% CO)에서 3일간 배양한 후, 배지를 웰로부터 부드럽게 흡입시키고 0.1M 트리스, pH7.4, 0.9% NaCl, 1mM CaCl, 1.0mM MgCl0.2% BSA, 0.1% NP40 및 1μg/ml Hoechst 33258 (Sigma) 및 5μg/ml 에티디움 브로마이드, EB(칼비오켐)가 함유된 0.2ml 염색 용액으로 대체시켰다. 세포를 4℃에서 30분간 배양시키고 현탁시킨 다음, P.S. Rabinovitch의 Detection Of An Unusually Stable Fibrinolytic Inhibitor Produced By Bovine Edothelial Cells, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:2956-60(1983)에 기재된 바와 같이 PDP11/03 컴퓨터(Digital Equipment, Maynard, MA)에 접촉된 ICP-22 (Ortho Diagnostic Systems, Inc.)상에서 유동 세포계로 측정하였다. 425-500nm에서 검출된 Hoechst 33258 방출과 자외선 여기(UGI 필터)를 이용하여, 형광은 600nm 이상에서 검색하였다. 약 3-4 x 10 세포의 형광을 분석하고 Hoechst 대 EB 형광의 이변량 히스토그램으로서 기록하였다. 각 세포 사이클 구획 사이즈의 결정은 P.S. Rabinovitch가 전에 기록한 곡선 피팅 및 분석에 준하였다.
첫 번째, 두 번째 또는 세 번째 세포 사이클을 통과한 세포의 백분율을 도 8 에 나타내었다. 도면이 나타내는 바와 같이, 이종결합체로 자극한지 3일후에 세포의 45%가 S단계 이상으로 진입하였고 세포의 39%는 증식의 두 번째 사이클로 들어간 바와 같이 오직 CD3/CD4 이종결합체만이 세포가 세포 사이클을 진행할 수 있게 하였다. 이리하여, 항-CD28 자극 (도 6 및 도 7 에 나타난 바와같이)에 더하여 CD3/CD4 이종결합체에 대한 반응에 있어서 정체된 CD4 세포에 의한 H-티미딘이 인코포레이션은 제2 및 제3세대까지 지속되는 실제적인 증식반응을 나타내는 것이다. 이와 대조적으로 다른 항체 조제는 그 어느것도 현저한 세포 사이를 전이를 유도할 수 없었다 (도 8 참고). 도 8 은 또한 분류 세포의 70%가 배양 3일후 S 단계로 진입한 항-CD28 대조군 플러스 PHA와 비교해서, CD3/CD4 이종결합체에 의해 자극된 세포의 45%가 반응하였음을 가리킨다. 이것은 CD3/CD4 이종결합체로 자극된 후 꽤 많은 수의 CD4 세포가 세포 사이클 진전을 보였음을 나타내는 것이다.
CD3/CD4 이종결합체는 CD3 및 CD4 T세포 항원을 공변형시킨다.
CD3/CD4 이종결합체, CD3 또는 CD4 동종결합체 또는 CD4 또는 CD3에 대한 항체 단독에 의한 T세포 표면의 CD3 및 CD4 항원의 변형은 10μg/ml 항체 또는 항체 결합체의 존재하에서 항-마우스 Ig 제2단계의 면역형광법을 이용하여 37℃ 에서 18시간 배양시킨후 CD4 T세포 표면상의 항체 또는 항체결합체의 밀도를 결정함으로써 측정하고 FACS IV 유동 세포계에서 측정하였다. 결과는 다음의 표II에 나타내었으며, 여기서 밀도는 직선 눈금상에 배경 측정된 평균 형광 강도 단위로 표시하였다.
Figure kpo00003
표가 나타내듯이, CD3에 대한 항체 또는 CD3/CD3 동종결합체와 함께 밤새 배양시키면 CD3 표면 발현을 거의 검색할 수 없지만, CD4에 대한 항체나 또는 CD4/CD4 동종결합체와 함께 유사하게 배양시키면 상당한 양의 표면 CD4가 잔재하였다. 그러나 CD3/CD4 이종결합체는 CD3 및 CD4 모두의 변형을 야기시켰으며 CD4의 표면 발현을 감소시킨 것으론 나타났다. 이 분석에 사용된 모든 항체 및 결합체는 과량으로했는데 이것은 항-CD3 또는 항-CD4 모노클로날 항체의 직접 형광결합체를 이용하여 분석할때(자료 싣지 않음) 변형 후 세포 표면의 유리 CD3 또는 CD4 항원(즉, 항체와 비결합된 항원)을 검색할 수 없었기 때문이다. 그러므로, 본 발명의 CD3/CD4 이종결합체는 T세포 표면의 CD3 및 CD4 항원을 공동변형시키며, 이것은 이종결합체가 CD3에 대한 고정항체의 경우에 제안된 것만큼 세포 표면에 T세포 수용체를 쉽사리 고정시키지는 않음을 지적하는 것이다. [예컨대, J.A. Ledbetter 외., J.Immunol., 상기문헌]. 더욱이, 가용성 항-CD3에 대한 연구는 CD3이 세포 표면으로부터 변형되는 경우,CD3/Ti 수용체가 인터널라이즈화되며 [예컨대 O.W. Press외, Evaluation of Ricin A Chain Immunotoxins Directed Against Human T Cells, Cellular Immunol., 102:10-20(1986) 및 O.W.. Press외, Endocytosis And Degradation Of Murine Anti-Human CD3 Monoclonal Antibodies By Normal And Malignant T Lymphocytes, Cancer Research, 48:2249-2257 (1988) 참고] 이는 T세포 활성화를 저해시키기에 이른다는 것이 지적되었다. 본 발명의 이종결합체는 또한 T세포 활성화는 촉진시키는 한편, 수용체를 인터널라이즈시킨다.
본 실시예가 입증한 바와 같이, 본 발명의 CD3/CD4 이종결합체는 CD4 T세포의 활성화에 있어 생산된 이노시톨 포스페이트 및 Ca 변형을 모두 촉진시킨다. 덧붙여, 이 이종결합체는 CD28에 대한 항체의 존재하에서 CD4 T세포의 증식에 있어 새로운 기능을 활성을 가지므로, 세포의 상당한 분획이 자극후 최초 3일이내에 두 번째 세포 사이클로 들어갈 수 있게된다. 더욱이, 이 이종결합체는 이것이 반응하는 항체를 공변형시키는 것으로 나타나, 이것이 항원들을 T세포 활성화에 있어 근접한 위치까지 접근시킨다는 가설을 뒷받침 하고 있다.
[실시예 2]
다음의 실시예는 다른 CD T세포 항원과 반응성인 항체와 이에 교차결합된 CD3 항원과 반응성인 항체로 이루어진, 본 발명의 다른 이종결합체의 제조 및 특징화를 설명한 것이다.
상기 실시예 1 에서와 같이 제조한 항체 이종결합체는: (a) 모노클로날 항체 G19-4 (항-CD3) (앞서 언급하였음)와 9.6(항-CD2)로 된 CD3/CD2 이종결합체 [예컨대, P.J. Martin외, Identification And Functional Characterization Of Two Distinct Epitopes On Human T Cells Surface Protein Tp50, J.Immunol., 131:180(1983)참고]; b) 모노클로날 항체 G19-4 및 10.2(항-CD5)로 이루어진 CD3/CD5 이종결합체 [예컨대, P.J. Martin외, A New Huaman T-Cell Differentiation Antigen; Unexpected Expression On Chronic Lymphocytic Leukemic Cells, Immunogenetics. 11:429 (1980) 및 P.J. Martin외, Monoclonal Antibodies Recognizing Normal Human T Lymphocytes And Malignant B Lymphocytes A Comparative Study, J.Immunol.,12:1290(1981) 참고]; c) 모노클로날 항체 G19-4 및 G3-6(항-CD6)으로된 CD3/CD6 이종결합체(G3-6은 Balb/c 마우스를 T 백혈병 세포주 HSB2로 면역화시켜 생산된 IgG이소타잎의 항-CD6 모노클로날 항체임. 하이브리도마는 마우스의 비장세포를 NSI 골수종 세포주와 융합시켜 생산한다음 정상 T세포에 대한 결합 및 CD6 참고 항체 12.1과의 교차결합에 의해 스크리닝하였다 [예컨대, P.J. Martin외, J.Immunol. 127, 상기문헌 고]); d) 모노클로날 항체 G19-4 및 G3-7(항-CD7)로 이루어진 CD3/CD7 이종결합체 (G3-7은 balb/c 마우스를 T 백혈병 세포주 HSB2로 면역화시켜 생산한 IgG이소타잎의 항-CD7 모노클로날 항체임. 하이브리도마는 마우스의 비장 세포를 NSI 골수종 세포주와 융합하여 제조하고 정상 T세포에 대한 결합 및 American Type Culture Collection으로부터 구득할 수 있는 CD7 참고 항체 3A1 과의 교차결합에 의해 스크리닝하였다. 덧붙여 항-CD7 모노클로날 항체는 상업적으로 구득할 수 있다 (Bection Dickinson, Mountainview, CA)[예컨대, E.L. Reinherz외 (편집), Leukocyte Typing II, 제1권, pp.3-30(1986) 참고]; e) 모노클로날 항체 G19-4 및 G10-1 (항-CD8) (앞서 언급함)로된 CD3/CD8 이종결합체; 및 f) 모노클로날 항체 G19-4 및 9.3으로된 CD3/CD28 이종결합체(앞서언급함).
이 이종결합체들을 실시예 1에 기재된 바와같이 T세포에 있어서 세포질의 Ca 의 동원을 촉진시키는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 각 이종결합체는 1μg/ml에서 시험하였는데, 이 농도에서는 CD3에 대한 항체 단독의 활성이 준최적이고 결합체의 촉진된 활성이 검색되었다. 인도-1이 로딩된 말초 혈액 임파구의 피크 [Ca ]i 반응은 이종결합체로 세포를 자극한 처음 5분 이내에 일어났다. 비자극 세포는 [Ca ]i가 130nM이었다. CD3/CD4 및 CD3/CD8 이종결합체로 행한 실험에서는, 결합체의 활성을 각각 CD4 및 CD8 T세포에 대해 측정하였다. 칼슘 동원에 있어서의 이들 이종결합체의 활성을 다음의 표 3에 나타내었다.
Figure kpo00004
표 3이 나타내는 바와같이, CD3/CD2, CD3/CD6, CD3/CD7 및 CD3/CD8 동종결합체 (CD3/CD4 이종결합체 뿐만아니라)들은 자극되지 않거나 또는 CD3/CD3-자극 세포의 활성에 비교했을 때 이 이종결합체로 처리한 T세포에 있어 현저한 칼슘 동원의 증가를 초래하였다. 실시예 1의 CD3/CD4 이종결합체와 마찬 가지로, 이 이종결합체들은 그들이 반응하는 상응하는 항원을 근접한 위치까지 접근시켜 촉진된 전이막 시그날링 및 T 세포 활성화를 야기시키는 것으로 믿어진다.
[실시예 3]
본 실시예는 다른 CD T세포 항원과 반응성인 항체와 이에 교차결합된 CD5 T세포 표면 항원과 반응성인 항체로 이루어진, 본 발명의 다른 이종결합체의 제조 및 특징화를 설명한다.
상기 실시예 1에서와 같이 제조한 항체 이종결합체는;
(a) 모노클로날 항체 10.2 및 9.6으로된 CD5/CD2 이종결합체;
(b) 모노클로날 항체 10.2 및 9.3으로된 CD5/CD28 이종결합체;
(c) 모노클로날 항체 10.2 및 G17-2으로된 CD5/CD4 이종결합체;
(d) 모노클로날 항체 10.2 및 G3-6으로된 CD5/CD6 이종결합체;
(e) 모노클로날 항체 10.2 및 G3-7으로된 CD5/CD7 이종결합체;
및 (f) 모노클로날 항체 10.2 및 G10-1으로된 CD5/CD8 이종결합체였다. 본 구체예의 이종결합체를 제조하는데 사용된 모든 모노클로날 항체는 앞서 언급한 바 있다.
이 이종결합체들을 실시예 1에 기재된 바와 같이 T세포에 있어서 세포질 Ca 의 동원을 촉진시키는 그들의 능력에 대해서도 시험하였다. 이 실험의 결과는 다음의 표 IV에 나타내었다. 이 실험에 사용한 각 이종결합체의 농도를 표에 나타내었다. 인도-1 로딩된 말초 혈액 임파구의 피크 [Ca ]i 반응은 자극후 처음 10분이내에 일어났다. 비자극 세포는 [Ca ]i가 130nM였다. 표가 나타내는 바와같이 , CD5/CD5 동종결합체는 180mM의 [Ca ]; 를 나타내었다. CD5/CD4 및 CD5/CD8 이종결합체는 각각 CD4 및 CD8 T세포 서브세트에 대해 시험하였다.
Figure kpo00005
표 4가 나타내는 바와같이, CD5/CD4, CD5/CD6 및 CD5/CD8 이종결합체는 자극되지 않은 세포나 CD5/CD5-자극된 세포에 비해 칼슘 동원의 현저한 증가를 보였다. 이 이종결합체들은, 본 명세서에 기재된 다른 이종결합체들과 마찬가지로, T세포의 활성을 촉진시키는데 유용하다.
[실시예 4]
본 실시예에서는 T세포 표면상의 CD3 및 CD45 항원간의 mAb-유도성 상호 반응과 CD3 및 CD45 항원에 반응하는 향체들의 이종결합체를 이용하여 T세포의 활성화에 미치는 이 방법의 효과를 조사하였다.
[세포 조제]
전술한 바와같이 말초 혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포나 나일론 울 비부착성 임파구를 제조하였다 [(Clark외,Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 82:1766-1770 (1985) 및 Clark외 Hum. Immunol. 16:100-113 (1986) 참고. 두 문헌 모두 본 발명에 참고 삽입하였음]. 간단하게, 나일론 울 비부착성 임파구는 다음과 같이 나일론 울 분리에 의해 얻었다. : 나일론 칼럼 (Oncogen 제조 Seattle, WA)에 5% 송아지 태아 혈청이 함유된 RPMI 배지를 로딩시키고 37℃에서 45분간 예비배양시킨후 사용하였다. 세포를 칼럼에 적용시키고 칼럼내로 흘려보낸 다음 37℃에서 45분간 배양시켰다. 따뜻한 배지 6ml를 칼럼으로부터 수집하고 1200rpm에서 8분 간 2회 회전시킨다음 증식용 완충액(15% 인체 AB 혈청) (약 1.5ml)에 재현탁시켰다. 비부착성 세포를 계수하고 부피를 분석 용도에 따라 적절히 조정하였다.
다음의 인체 백혈구 표식자에 대한 Balb/C 마우스 mAbs를 이용하였다 : 9.4 (IgG2a), 항-CD45 [Cobold, 상기문헌]; G1-15(IgG1) 및 3AC5 (IgG2a), 항-CD45R [Ledbetter, 상기문헌 및 Ledbetter외, In Perspectives In Immunogenetics and Histocompatibility, 편집, Heise, E. (ASHI, New York) pp.325-340]; 96.5 [Brown외, J. Immunol. 127(2):639-546(1981)] P. Beverley 박사가 제공한 UCHL-1 (IgG1) 항-CD45 (180평) [Smith, 상기문헌]; G19-4(IgG1), 항-CD3 (Ledbetter, 상기문헌]; 9.6 항-CD2 (앞어 언급함); 및 9.3, 항-CD28 (앞서 언급함). 래트의 항-마우스 카파(χ)-특이 mAb, 187.1 [Ware외, J. Immuol. Meth. 74:93-104 (1984)]를 이용하여 마우스의 mAb 와 교차결합시켰다.
[mAb 이종결합체의 조제]
실시예 1에 기재된 바와같이 모노클로날 항체 이종결합체를 이종이기능 교차결합체 GMBS (Calbiochem, La Jolla, CA) 및 5-이미노티올란 HCI (Pierce Chemical Co.. Rockford, IL)과 1:1 몰비율로 함께 제조하였다. 더욱 구체적으로는 항체(1mg/ml)를 커플링 완충액(0.1M NaHOP-이염기성, 칠수화물 0.1M NaCl, pH7.5)에 대해 밤새 투석시켰다. 결합체의 제1 항체를 혼합하여 첨가한 이미노티올란-HCl 염 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL로부터 구득한 2IT : 2IT용액 (커플링 완충액중 10mg/ml) 50μl(0.5mg)으로 티올화시켰다. 결합체의 제2 항체는 GBMS로 처리하였다 : GMBS 용액 (360μl 디메틸포름 아미드 (DMF) 360μl중 1mg) 5㎕. 용액을 실온에서 1시간 동안 배양시켰다. 항체를 커플링 완충액에 예비평형시킨 별개의 PD-10 칼럼 (Pharmacia, Uppsala, Swden)을 통해 흘려 보냈다. 총 2.6ml가 배출된 후, 항체는 본래 부피의 두배로 수집되었다. 항체를 혼합하고, 실온에서 5시간 배양시킨다음 25mM B-메르캅토메탄올 (1㎕:560㎕ 커플링 완충액) 1㎕를 첨가하여 반응을 멈추고 실온에서 15분간 배양시켰다. 이 반응을 DMF중 1mg/ml 까지 만들어진 N-에틸말레이미드 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 11㎕ (11㎍)을 첨가하여 정지시켰다.
결합체를 포스페이트 완충염수(PBS)에 대해 하룻밤 투석시켰다. 얻어진 CD3/CD45 이종결합체를 실시예 1에 기재된 바와같이 Superose 6 FPLC상의 유리 항체로부터 분리하고, G19-4/9.4로 나타내었다. mAb와 바이오틴과의 결합은 본 명세서에 참고 삽입하고 앞서 설명한 [Hardy, R.R. (1986) In Handbook of Experimental Immunology, 편집, Weir외), (Blackwell, Oxford) pp. 31.1-31.2 (1986)]기재된 바와같이 바이오틴-숙신이미드(Sigma Chemical Co., St. Louis. MO)를 사용하였다. 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)와 아비딘을 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO로부터 구득하였다. 재조합 인터류킨 2 (rIL2)는 Genzyme (Boston, MA)로부터 구입하고 몇몇 분석에서 증식을 촉진시키는데 이용하였다.
혈액 T세포의 증식은 실시예 1에 기재된 바와 같이 200㎕ 마이크로타이터 웰에서 ml당 10 세포를 사용하여 [ H]티미딘 (New England Nuclear; 비활성 27 Ci/mmol; 1Ci=37 GBq) 인코포레이션으로 측정하였다. 더욱 구체적으로는, 증식 분석을 위해, 본 명세서에서 참고삽입한 Ledbetter외, in Journal Immunol. 135:1819-1825(1985)에 기재된 바와같이, 단핵세포를 배양하였다. 간단히, 단핵세포를 Ficoll-Hypaque상의 밀도 원심분리에 의해 말초혈액으로부터 분리하고 플라스틱에 부착시켜 대부분의 단구를 제거하였다. 페니실린, 스트렙토마이신, 및 15% 인체 AB혈청 (Pel Freez, Brown Deer, WI)이 함유된 RPMI배지에서 96-웰 마이크로타이터판 (Falcon, Becton-Dickenson, Oxnard, CA)에서 2.5 x 10 /ml 로 배양하였다. Sepharose에 커플링된 항-CD3 mAb(G19-4)나 또는 미토겐 피토헤마글루티닌(PHA: Wellcome Diagnostics, Greenville, NC)을 사용하여 T세포를 자극하였다. 배양 3일 또는 4일후, 0.5 uCi [ H]티미딘/웰(New England Nuclear, Boston, MA; 6.7 uCi/mmol 비활성)로 6시간동안 웰을 펄스시켰다. 다음 세포를 세포 수확기를 이용하여 유리섬유 필터위로 수확하고, 액체 섬광계수기에서 방사능을 측정하였다. 몇몇 실험에서는, 재조합 IL2(rIL-2: Genzyme, Boston, MA)를 25 U/ml로 사용하였다. [ H]티미딘 흡수의 측정은 분석전 10㎍/ml로 마이크로타이터판의 웰에 예비코팅한 mAb G19-4를 이용하여 3일간의 실험중 마지막 6시간동안 행하였다. 용액 중항-CD45 mAb 9.4의 농도는 1㎍/㎕였고 10mg/ml로 마이크로 타이터판에 고정시켰다. 세포를 사중 배양하였으며 평균치를 나타내었다. 표준오차는 11%였다.
표 V에 결과를 요약하였다.
Figure kpo00006
표 5는 항-CD3과 함께 고정된 항-CD45는 T세포 증식을 75% 이상으로 억제하는 반면, 용액중의 항-CD45는 그렇지 않음을 나타내고 있다. 고정된 항 -CD45의 억제효과는 PMA나 또는 외인성 rIL2가 준최적 농도로 존재하여도 여전히 분명하였다.
항-CD3 mAb(G19.4)로 자극한 후 T세포의 증식 또한 고정된 항-CD3 mAb( 및 용액중 고정된 CD45R mAbs(G1-15 및 3AC5)로 측정하였다. 증식은 항-CD45의 경우 기재된 바와 같이 측정하였다. 항-CD45R mAbs G1-15 및 3AC5는 용액중 1㎍/ml로 이용하고 10㎍/ml로 고정시켰다. 흑색종항원 p97에 대한 대조군 IgG2a 9.6를 용액 중 1㎍/ml로서 비반응성 대조군으로 사용하고 10㎍/ml 고정시켰다. 표 6은 이 실험의 결과를 나타낸다.
Figure kpo00007
CD45R (3AC5)나 또는 CD45R (G1-15) mAbs가 항-CD3과 함께 고정된 경우에는 억제가 현저하였으나 CD45R mAbs가 용액중에 있을때는 그렇지 않았다. PMA도 rIL2도 이 억제를 극복하지 못했다. 흑생종 항원 p97에 대한 대조군 mAb 96.5는 용액중에서나 항-CD3과 함께 고정되어 있을 때나 고정 된 항-CD3에 대한 반응에 있어 증식을 저해하지 않았다.
고정된 CD45 mAb(9,4)의 경우 보여진 저해가 단순히 플라스틱 표면으로부터 CD3 mAb(G19-4)를 대치한 것에 의한 것이 아님을 분명히 하고자, 마이크로타이터 웰을 항-CD3 단독, 항-CD3 플러스 항-CD45, 또는 항-CD3 플러스 대조군 mAb 96.5로 코팅하였다. 4, 8, 16 및 32 g/ml의 농도로 인산염 완충 염수에서 실온으로 2시간동안 단독으로 또는 항-CD3 mAb와 동농도의 항-CD45 mAb 9.4 또는 대조군 mAb 96.5와 함께 마이크로타이터판의 벽에 고정시킨 항-CD3 mAb G19-4로 말초 혈액 단핵세포를 자극하였다. 소의 혈청 알부민을 첨가하여 추가적인 단백질 부착을 허용하였다. 용액중 CD45 mAb 9.4를 이용한 증식을 대조군의 경우로 사용하였다. 증식은 PMA lng/ml의 존재 또는 부재하에 측정하였다. 세포를 3일간 3중으로 배양하고 마지막 6시간동안 [ H]티미딘으로 펄스시켰다. 도9는 이 실험결과를 나타 낸다 (평균치를 나타냈으며 표준 오차는 각 포인트에서의 평균치의 15% 미만이었다).
도 9 는 (a) 웰을 코팅하는데 항-CD3을 더 많이 이용 할수록, 앞서의 보고와 (Geppert외, J. Immunol. 138:1660-1666 (1987) 일치하는 바와같이 증식이 더 잘 일어나고; (b) CD45 mAb 9.4는 모든 농도에서, 그러나 고정된 경우에만 실제적인 억제를 일으켰으며; (c) 이소타잎 콘트롤 96.5 mAb로 동시에 코팅시킨 것에 의해서는 본질적으로 억제가 일어나지 않음을 나타내며, 이는 항-CD45에 의한 억제가 항-CD3을 대체 시킨 결과가 아님을 가리키는 것이다. 1ng/ml의 PMA를 배양체에 첨가면 mAb가 4㎍/ml 이하로 코팅되었을때만이 (그를 초과한 농도에서는 아님) 고정된 항-CD45에 의해 억제가 역전되었다. (제9b도). 이것은 항 -CD45의 임계 농도가 PMA의 존재하에서 억제를 유지시키기 위해서는 플라스틱 표면의 항-CD3과 매우 근접한 농도로 존재해야함을 가리키는 것이다.
증식을 야기시키는 T세포 활성화는 각가 mAb 9.3 및 9.6을 사용하여 CD28 및 CD2를 자극한다음 2번째 단계로 항-k mAb 187.1을 이용하여 교차결합시킴으로써 진행될 수 있다[Van Lier외 Eur. J. Immunol. 18:167-175 (1988) 및 Ledbetter외, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 84:1384-1388 (1987) 참고]. 이 시스템에서 CD45 연결 효과를 연구하기 위해, mAb 187.1과 교차결합시키거나 시키지 않고 항-CD45를 용액 중의 항-CD28 또는 항-CD2에 첨가하였다 [Ware외, 상기문헌]. 증식은 상술한 바와같이 [ H]티미딘 흡수에 의해 측정하였다. 항-CD28 mAb 9.3과 항-CD2 mAb 9.6을 각각 1㎍/ml 로 하여 활성화에 사용하였다. 항-CD45 mAb 9.4는 1㎍/ml 로 사용하였고 항-k mAb 187.1은 mAb187.1대 마우스 mAb를 최종비율 4:1로 하여 항체와 교차결합시켰다. 증식을 rIL-2 존재 (100 Units/ml) 및 부재하에 측정하였따. 표 VII에 결과를 나타내었다 (표준 오차는 각 포인트에서 12% 였음).
Figure kpo00008
항-CD45를 단독으로 첨가하면 외인성 rIL2를 요구함이 없이 CD2나 또는 CD28 mAbs에 의해 유도된 세포증식 또는 증가를 촉진시킬 수 있었음은 분명하다(표 7). 모든 경우에 있어서, rIL2를 첨가하면 다른 자극원의 부재하에서조차 세포 증식이 증대되었다. 이 현상은 IL2에 대한 고친화성 수용체의 발현에 미치는 CD45 결합의 효과에 기인한 것일 것이다 (Ledbetter, 상기문헌).
이와 대조적으로, 187.1 항-k mAb 첨가에 의한 CD45와 CD2의 교차결합은 rIL2의 존재 또는 부재시 CD2 또는 CD28 (표 7)의 자극을 감소시키고 CD45 단독의 자극 효과를 역전시켰다. 이것은 187.1의 비특이적 억제 활성 때문은 아닌데 이는 CD28 또는 CD2 자극이 CD45 mAb 9.4가 함유되지 않은 경우 모두 187.1에 의해 촉진되었기 때문이다.
CD3, CD2, 및 CD28을 시그날 형질도입 경로에 커플링 시키며 이는 이 수용체들이 세포 표면에 결합되면 [Ca ]i의 증가를 초래하게한다. [Ledbetter외, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 84:1384-1388(1987)]. [Ca ]i는 CD45 mAb 9.4의 존재 또는 부재시 CD3, CD2 또는 CD28 수용체를 교차결합시킨 후 측정하였다 (제10도). 이 실험에서는, 바이오틴-결합 mAbs를 말초 혈액 T세포에 결합시킨 다음 아비딘을 첨가함으로써 세포 표면에 교차결합시켰다. 인도-1(Molecular Probes, Junction City, OR)이 로딩된 말초 혈액 단핵 T세포중의 [Ca ]i의 증가는 다음과 같이 T세포의 수용체를 단독으로 또는 항-CD45 mAb 9.4 또는 항-CD45R mAb 3AC5와 함께 교차결합시킨 후 측정하였다 (조건은 제10도에 나타내었음):
1. CD3 수용체를 1.5분경에 바이오틴-결합 항-CD3 mAb G19.4 (2 g/ml)와 교차결합시킨 다음, 아비딘(8㎍/ml)을 5.5 분경에 첨가하였다 (-). 이것을 항-CD45 mAb 9.4 (10㎍/ml)(-·-)의 존재하에서 CD3 수용체와 교차결합시키거나, 또는 바이오틴-결합 항-CD45 mAb 9.4 (10 g/ml)에 CD3 수용체와 교차결합 시킨 다음 아비딘(48ug)을 첨가한 것과 비교하였다.(......) 바이오틴-결합 항-CD45mAb 9.4(10g/ml)및 아비딘(40㎍/ml)의 부가적인 대조군도-사용하였다(.....) (제10a도 ); 2. 25㎍/ml의 항-CD3 mAb G19.4 (-)의 영향을 항-CD3 mAb G19-4 및 항-CD45 mAb 9.4의 50㎍/ml의 CD3/CD45 이종결합체와 비교하였다(.....) (제10b도); 3. CD2 수용체를 -3분경에 첨가된 10 g/ml의 바이오틴-결합 항-CD2 mAb 9.6과 교차결합시킨다음 1.5분경에 아비딘 40 g/ml를 첨가하였다 (-). (제10c도);
4. CD28 수용체를 -3분경에 첨가된 10ug/ml의 바이오틴- 결합 항-CD28 mAb 9.3과 교차결합시킨다음, 1.5분경에 아비딘 40㎍/ml을 첨가한 것을(-)10㎍/ml의 항-CD28mAb 9.3과 10㎍/ml의 항-CD45 mAb 9.4를 이용하여 -3분경에 CD28과 CD45 수용체와 동시 교차결합시킨다음 1.5분 경에 아비딘 80㎍/ml를 첨가한것과(.....) 비교하였다 (제10d도);
5. CD4 수용체를 -3분경에 첨가된 10㎍/ml의 바이오틴-결합 항-CD4 mAb G17-2를 첨가함으로써 교차결합시킨다음, 1.5분경에 40㎍/ml의 아비딘을 첨가하였다 (-). 이것을 10㎍/ml 바이오틴-결합 항-CD4 mAb G17-2와 10㎍/ml의 바이오틴-결합 항-CD45 mAb 9.4와 CD4 및 CD45 수용체를 -3분경에 동시 교차결합시킨다음 1.5분경에 80㎍/ml의 아비딘을 첨가 한 것 (.....)과 비교하였다. 바이오틴-결합 항-CD4 mAb G17-2 (10㎍/ml) 플러스 항-CD45 mAb 9.4 (10㎍/ml) (비결합)과 1.5분경 40㎍/ml의 아비딘을 첨가한 것도 (-·-) 나타내었다 (제 10e도).
제10a-e도는 이 실험의 결과를 나타낸다. CD3, CD2 및 CD28 교차결합후 보여진 [Ca ]i의 증가가 바이오틴 결합 9.4의 존재에 의해 저해되었다는 것은 명확하였다. 9.4가 바이오티닐화되지 않고, 따라서 아비딘에 의해 교차결합되지 않았을 때에는, 항-CD3 유도성 칼슘 동원의 정도에 있어서의 적은 감소가 여전히 관찰되었다 (제10a도). 그러나, 완전한 억제는 CD45와 CD3이 아주 근접하게 되어야만 할 것을 요구하는 것으로 나타났다. 더욱이, 항-CD45와 항-CD3의 이종결합체는 항-마우스 면역글로불린에 대한 면역형광분석이 이 이종결합체가 세포 표면상의 두가지 수용체에 모두 결합할 수 있고 (자료 싣지 않음) 항-CD3 25g이 강력한 칼슘 반응을 끌어낼 수 있음을 입증하였음에도 직접적으로 [Ca ]i를 증가시키지는 못했다 (제10b도). 3AC5와 같은 CD45R mAbs는 CD2의 경우 설명한 바와 같은 세포 수용체와 반응성인 mAbs에 결합되면, 부분적으로 [Ca ]i반응을 저해할 수 있었다 (제10c도). CD45R mAb에 의한 부분적 저해는 일부분의 T세포 (모든 T 세포는 아님)상의 CD45R 발현을 반영하는 것일수도 있다. (Ledbetter, 상기문헌). CD3, CD2 및 CD28에 대한 억제 효과와는 대조적으로 CD45를 CD4에 결합시키면 CD4가 그 자신에 교차결합된 경우에 필적할 만큼 강력하고 재생가능 한 시그날링 증대를 야기시켰다 (제10e도). 이것은 반응 세포수의 증가없이 일어났으며, 이는 동일한 CD4 양성 세포가 CD45 및 CD4 및 CD4의 결합후 보다 반응성이 컸음을 나타 낸다. 그러므로, CD45는 그것이 반응하는 수용체에 따라 전이막 시그날링을 업-조절 또는 다운-조절하는 것으로 나타 난다.
CD45에 대한 이전의 연구는 이것이 임파구 할성을 업-또는 다운-조절하는 기능을 갖는 것으로 제안하였다 (Ledbetter, 상기문헌; Harp, 상기문헌 및 Martorell, 상기문헌). CD45 또는 CD45R에 대한 가용성 mAbs는 IL-2 생산, IL-2 수용체 발현, 및 T-세포 증식에 있어서 비이드에 부착된 항-CD3이나 PHA와 공동-자극적이다. 가용성 항-CD45는 CD2나 또는 CD28 mAb와 협동 작용할 수 있다 (표 6). 이러한 공동-자극적 효과는 CD4 세포로 한정 되며 CD4를 발현 시키지않는 CD8 세포의 경우에는 나타나지 않았다. 이것은 아마도 부분적으로는 CD3이나 CD2와 같은 다른 세포 표면 항원에 대한 그의 작용과 구별되는 CD4에 미치는 독특한 영향을 CD45가 가지고 있다는 사실에 기인하는 것일수도 있다; CD45는 CD4와 근접한 위치로 접하게 되면, CD4를 통해 전달된 칼슘 시그날을 가속 및 증가시키는 반면 CD3 및 CD2에 커플링되면 시그날 형질 도입을 저해한다 (도 10).
상기 실시예(4)는 본 발명의 CD4/CD45 이종결합체를 사용 함으로써 입증된바와 같이 T세표 수용체 CD2, CD3, CD5 또는 CD28과 같은 시그날 형질도입성분에 CD45가 인접하게 되는 조건하에서 항-CD45의 억제효과가 가장 명확히 입증됨을 나타낸다. 항-CD45 항원은 임파구 활성화의 매우 초기단계에 작용할 수 있어서 정상적으로 검색되는 세포내 유리 칼슘의 동원을 30 내지 60초 사이에 억제한다. 항-CD45의 촉진 효과역시 CD45 수용체를 CD4 수용체에 근접시킴으로써 증명된다. 이러한 결과는 임파구상의 수용체와 반응성인 분자를 함유하는 이종결합체가 T세포 및 B세포를 포함 한 임파구의 활성화 및 기능을 촉진하거나 저해하기 위해 수용체간의 상호반응을 유도해내는 또다른 방법을 제공할 수 있음을 시사한다.
비록 이제까지 몇가지 구체예를 들어 본 발명을 설명하였지만, 본 발명의 기본구성을 변형시켜 예컨대 다른 임파구 항원 이종결합체 배합물이라든가 또는 임파구 기능 억제에 이르게하는 다른 구체예를 제공할 수 있음은 분명하다. 그러므로, 본 발명의 범위는 이제까지 실시예에 의해 제시된 특정 구체예에 의해서보다는 첨부된 특허청구의 범위에 의해 한정되어야만 함을 이해하여야 한다.

Claims (37)

  1. 임파구상의 항원과 결합될 수 있는 2개의 분자로 구성되며, 상기 분자는 임파구 표면항원에 특이적으로 결합하는 항체분자이고, 서로 교차결합되어 있으며, 각 임파구 표면에 위치한 상이한 항원과 반응성이며, 임파구 표면 항원의 조합(combination)은 CD3/CD2, CD3/CD4, CD3/CD6, CD3/CD8, CD5/CD4, CD5/CD6, CD5/CD8, CD45/CD2, CD45/CD3, CD45/CD4, CD45/CD5, CD45/CD28, CD45/CD2의 이소형, CD45/CD3의 이소형, CD45/CD4의 이소형, CD45/CD5의 이소형 및 CD45/CD28의 이소형으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 임파구와 결합하여 반응하게될 각각의 상기 세포 표면 항원을 물리적으로 근접하게 하여 시그날 형질도입을 증가 또는 감소시키고 임파구의 증식을 촉진시킴으로써 임파구 조절에 유용한 이종결합제.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 임파구는 T임파구이며 조절은 활성인 것이 특징인 이종결합체.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 항원이 T임파구 표면상의 CD항원인 것이 특징인 이종결합체.
  4. 제1항에 있어서, 항원이 B임파구 표면상의 CD항원인 것이 특징인 이종결합체.
  5. 제1항에 있어서, 항원이 B임파구 표면상의 CD항원인 것이 특징인 이종결합체.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 이종결합체의 어느 한 분자가 CD5 세포표면 항원과 반응성인 것이 특징인 이종결합체.
  7. 제1항에 있어서, 이종결합체가 CD3/CD4 항체 이종결합체인 이종결합체.
  8. 제 1항에 있어서, 이종결합체가 G19-4/G17-2 항체 이종결합체인 이종결합체.
  9. 제 1항에 있어서, 이종결합체가 CD3/CD2, CD3/CD6, CD3/CD7 및 CD3/CD8로 이루어진 군에서 선택된 항체 이종결합체인 것이 특징인 이종결합체.
  10. 제 1항에 있어서, 이종결합체가 CD5/CD4, CD5/CD6 및 CD5/CD8로 이루어진 군에서 선택된 항체 이종결합체인 것이 특징인 이종결합체.
  11. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 이종결합체의 어느 한 항체가 CD45항원이나 또는 CD45 항원의 이소형과 반응성인 것이 특징인 이종결합체.
  12. 제 1항에 있어서, 이종결합체가 CD3/CD45 항체 이종결합체인 이종결합체.
  13. 제 1항에 있어서, 이종결합체가 G19-4/9.4 항체 이종결합체인 이종결합체.
  14. 제 1항에 있어서, 이종결합체가 CD2/CD45, CD3/CD45, CD4/CD45 및 CD28/CD45로 이루어진 군에서 선택된 항체 이종결합체인 것이 특징인 이종결합체.
  15. 제 1항에 있어서, 이종결합체가 CD2/CD45R, CD3/CD45R, CD4/CD45R 및 CD28/CD45R로 이루어진 군에서 선택된 항체 이종결합체인 것이 특징인 이종결합체.
  16. 제 2항에 있어서, 항체가 Fab 및 F(ab')2 단편으로 이루어진 군에서 선택된 항체단편으로 이루어짐을 특징으로 하는 이종결합체.
  17. 제 2항에 있어서, 항체가 모노클로날인 것이 특징인 이종결합체.
  18. 제 2항에 있어서, 항체가 키메릭인 것이 특징인 이종결합체.
  19. 제 1항에 있어서, 항체가 T 임파구 표면상의 서로 다른 2가지 항원에 대한 결합친화성을 갖는 이중특이적 항체인 것이 특징인 이종결합체.
  20. 각 임파구 표면에 위치한 상이한 항원과 반응성이며 임파구상의 항원과 결합될 수 있는 2개의 항체를 교차결합시키는 단계; 이러한 임파구에 대한 이종결합체의 결합으로 인해 임파구내에 변형된 시그날 형질 도입을 야기시키는 단계로 구성됨을 특징으로 하는, 임파구에 결합되어, 이종결합체와 반응하는 각각의 상기 세포 표면 항원들을 서로 물리적으로 근접하게하여 시그날 형질도입을 증가 또는 감소시키고 임파구의 증식을 촉진시킴으로써 임파구 조절에 유용한 이종결합체의 제조방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 항체와 반응성인 상기 임파구가 T임파구인 것이 특징인 이종결합체의 제조방법.
  22. 제 20항에 있어서, 항원이 T임파구 표면상의 CD항원인 것이 특징인 이종결합체의 제조방법.
  23. 제 20항에 있어서, 항원이 B임파구 표면상의 CD항원인 것이 특징인 이종결합체의 제조방법.
  24. 제 20항에 있어서, 이종결합체중의 한 항체가 T 세포 수용체나 또는 그의 결합된 CD3항원과 반응성인 것이 특징인 이종결합체의 제조방법.
  25. 제 20항에 있어서, 이종 결합체중의 한 항체가 CD5 T 세포표면 항원과 반응성인 것이 특징인 이종결합체의 제조방법.
  26. 제 20항에 있어서, 상기 항체들이 CD3항원과 반응성인 항체와 CD4 항원과 반응성인 항체인 것이 특징인 이종결합체의 제조방법.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 항체들이 항체 G19-4와 이에 교차결합된 G17-2인 것이 특징인 이종결합체의 제조방법.
  28. 제 20항에 있어서, 상기 항체들이 CD3항원과 반응성인 항체 및 CD6, CD7 및 CD8 항원으로 이루어진 군에서 선택된 항체인 것이 특징인 이종결합체의 제조방법.
  29. 제 20항에 있어서, 상기 항체들이 CD5항원과 반응성인 항체 및 CD4, CD6 및 CD8 항원과 반응성인 항체로 이루어진 군에서 선택된 항체인 것이 특징인 이종결합체.
  30. 제 20항에 있어서, 상기 항체들 중 한 항체는 CD45항원이나 또는 CD45 항원의 이소형과 반응성인 것이 특징인 이종결합체의 제조방법.
  31. 제 20항에 있어서, 황제들 중 한 항체는 CD2, CD3, CD4 및 CD28항원과 반응성인 항체로 이루어진 군에서 선택된 항체이고 다른 한 항체는 CD45항원과 반응성인 항체인 것이 특징인 이종결합체의 제조방법.
  32. 제 20항에 있어서, 황제들 중 한 항체는 CD2, CD3, CD4 및 CD28 항원과 반응성인 항체로 이루어진 군에서 선택된 항체이고 다른 한 항체는 CD45R항원과 반응성인 항체인 것이 특징인 이종결합체의 제조방법.
  33. 제 20 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인 것이 특징인 이종결합체의 제조방법.
  34. 제 20항에 있어서, 항체가 Fab 및 F(ab')2단편으로 이루어진 군에서 선택된 항체 단편으로 된 것이 특징인 이종결합체의 제조방법.
  35. 제 20항에 있어서, 항체가 키메릭항체인 것이 특징인 이종결합체의 제조방법.
  36. 제 20항에 있어서, 상기 교차결합이 화학적 교차결합인 것이 특징인 이종결합체의 제조방법.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 교차결합을 말레이미도부티릴옥시 숙신이미드 및 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜티오)프로피오네이트로 이루어진 군에서 선택한 시약을 이용하여 수행함을 특징으로 하는 이종결합체의 제조방법.
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