DE3444765A1

DE3444765A1 - Immunmodulierendes arzneimittel

Info

Publication number: DE3444765A1
Application number: DE19843444765
Authority: DE
Inventors: Jacques L'Arbresle Armand; Edgardo D. Lyon Carosella
Original assignee: Institut Merieux SA
Current assignee: Institut Merieux SA
Priority date: 1983-12-07
Filing date: 1984-12-07
Publication date: 1985-06-20
Also published as: DE3479398D1; JPH0586378B2; EP0147283B1; CA1229791A; FR2556219A1; EP0147283A2; JPS60185726A; DE147283T1; EP0147283A3; FR2556219B1; ATE45498T1; US4719107A

Description

INSTITUT MERIFUX Lyon / Frankreich

Immunmodulierendes Arzneimittel

3U4765

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein neues immunmodulierendes Arzneimittel auf der Basis von Fragmenten Fc von menschlichen Immunglobulinen G. Das Arzneimittel ist insbesondere brauchbar zur Behandlung von Immun-Disfunktionen und namentlich bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten und auch als Inhibierungsmits-.el für die -Transplantat- ImBunogeaität und zur Behandlung von Krankheiten während oder nach der Transplantation von Organen.

Es ist bekannt, daß die Praktik der Organverpflanzung, insbesondere von Nieren und vom Rückenmark, gegenwärtig in großem umfang verbreitet ist. Ungeachtet des Fortschritts beim Auffinden von Systemen größerer Gewebeverträglichkeit weiß man, daß es durchwegs erforderlich ist, künstlich eine Inhibierung der Immunität hervorzurufen, um eine Abstoßungsreaktion durch diese Organismen zu vermeiden, die danach streben, die Fremdzellen des verpflanten Organs zu zerstören.

Om eine derartige Inhibierung der immunologischen Abwehr zu erzielen, wird allgemein in Verbindung miteinander eine Reihe von Methoden angewendet, die . insbesondere - eine-' kompletter· Bestrahlung, einer Chemotherapie (Alkylierungsmittel, Analoge von Purinbasen), *. . verschiedener. Antibiotika und Äntilymphocytenserum verwendet.

Es ist bekannt, daß diese "Verfahren zur Inhibierung der Immunität verschiedene Nachteile aufweisen; insbesondere

paralysieren sie nicht allein die natürliche Abwehr des Organismus gegen das Implantat, sondern auch die natürliche Abwehr gegen infizierende Mittel, wie Viren oder Mikroben. Diese Krankheitenbtötehen in der Entwaffnung gegenüber Infektionen, und es müssen sehr zwingende Vorsichtsmaßnahmen ergriffen werden, um dieses zu vermeiden.

Die Erfindung hat ein Arzneimittel zum Ziel, das die Reaktionen der immunologischen Abwehr gegen verpflanzte Organe inhibiert und gleichzeitig die Abwehrreaktionen der humoralen Immunität nicht inhibiert, sondern vielmehr erhöht, von denen man weiß, daß sie eine wesentliche Rolle im Kampf gegen die Infektionen spielen.

Der aktive Wirkstoff des erfindungsgemäßen Arzneimittels besteht aus dem Fragment Fc von menschlichen Iiranunglobulinen G oder dessen'Analogen.

Es bekannt, daß die Immunoglobuline (abgekürzt = Ig) Proteine sind, die nach verschiedenen Kriterien in mehrere Klassen eingeteilt werden: IgG, IgM, IgA, IgD und IgE.

Die Immunglobuline IgG, die die häufigsten Immunglobuline des Serums sind, haben wie die anderen ImmungiobuJime eine mehrkettige Struktur und verschiedene Spaltungsreaktionen, insbesondere enzymatische Spaltungsreaktionen erlaubten die Isolierung von verschiedenen Fragmenten dieses Proteins.

Wie auch bei der Hydrolyse mittels Papain oder Plasmin ergibt das Molekül von IgG drei Fragmente: zwei Fragmente besitzen jeweils eine Antikörperstelle, die als Fragment Fab bezeichnet wird, sowie ein Fragment, das keine Antikörperstelle darstellt, sondern bestimmte verschiedene -Wirksamkeitsfunktionen besitzt, das als Fragment Fc bezeichnet wird.

Methoden zur Herstellung des Fragments Pc oder von ' analogen Fragmenten durch enzymatische Spaltung mittels ?apain oder Plasmin usw. sind bekannt und beschrieben z. B, von R. R. Porter in Biochem. J. 73, Seite 119 (1959).

Falls nichts Gegenteiliges erwähnt, bedeutet der Ausdruck "Fragment Fc" ohne nähere Präzisierung Fragmente Fc von menschlichem IgG.

Die pharmakologischen Eigenschaften von Fragmenten Fc und ihre Rolle in den verschiedenen Mechanismen der Immunabwehr sind noch wenig bis heute bekannt. Durch Studien an Tiermodellen ist es nicht möglich, auf die Aktivität bei anderen Spezies zu schließen, denn es ist bekannt, daß einerseits die Immunjglobuline und insbesondere IgG je nach Spezies verschieden sind und daß andererseits das gleiche Immun^globulin unterschiedliche Wirkungen der Immunrespons bei den verschiedenen Spezies zeigt.

Verschiedene Veröffentlichungen haben ergeben, daß die Fragmente Fc der verschiedenen Immunoglobuline eine stimulierende Wirkung auf die Zellteilung und die polyklonale Aktivierung der Lymphozyten von mäuseartigen Tieren und Menschen in Abwesenheit oder in Gegenwart des

haben.
Antigens/ Im Gegensatz zu den Lymphozyten der Maus hat das Immunglobulin-Fragment Fc der Ziege einen schwachen mitogenen Effekt, und das Fragment Fc der Immunglobuline des Hasen;, oder der Gans hat keine stimulierende Wirkung, gleichgültig wie die Dosis ist, vgl. z. B. M. A. Berman et al., The Journal of Experimental Medicine, 146, Seiten 241-256 (1977) und The Journal of Immunology, 122, Seiten 89-96 (1979).

Es ist ebenfalls bekannt, daß das Fragment Fc des menschlischen Myeloms eine Erhöhung der Zellteilung der

Lymphozyten der Maus über eine Lymphozytärreaktion 'gemischter Natur hervorruft, vgl. z. B. E. L. Morgan et al. J. Exp. Med., 153, Seiten 1161-1172 (1981).

Es ist ebenfalls bekannt, daß die Fragmente Fc und des menschlichen Immunglobulins IgG (das Gleiche wie bei intakten IgG) einen Inhibierungseffekt auf die Cytotoxizität durch Zellvermittlung, abhängig vom Antikörper haben (ADCC), vergl. z. B. Wisloff et al. Scand. J. of Immunol., 3, Seiten 29-38 (1974).

Es ist ebenfalls bekannt, daß die Zellen NK ("natural killer") des Menschen, die bei bestimmten Immunreaktionen eingreifen, Rezeptoren für d?,s Fragment Fc des Ige besitzen, daß die cytotoxische Aktivität der Zellen NK nicht in Beziehung zum Rezeptor steht, vgl. M. E. Neville, Journal of Immunol., 125, Seite 2604 (1980).

unter Berücksichtigung der Komplexität des Immunabwehrsystems und unter Berücksichtigung der Vielfalt der Phänomene der Immunitätsregulierung muß im Licht der aktuellen Erkenntnisse auf dem Gebiet der Immunologie berücksichtigt werden, daß die Nutzbarmachung eines aktiven Produkts als immunmodulierendes Arzneimittel vor der Erforschung der Gesamtheit der Aktivitäten £?s aktiven Produkts unter den diversen Immunreaktionen humoraler und zellulärer Art und insbesondere durch Aktivierung oder Inhibierung cytotoxischer und suppressiver Zellen nicht vorhersehbar war. Diese Erforschung muß u. a. notwendigerweise nach einem isologen Modell durchgeführt werden, ohne welches es absolut unmöglich ist, eine auch nur geringste Aktivität als Arzneimittel vorherzusagen aus den Gründen, die vorher erläutert worden sind. Es wurde jetzt gefunden durch Studium der Eigenschaften des Fragments Fc von menschlichem IgG nach dem isologen Modell, daß es interessante pharmakologische Eigenschaften gibt, die es erlauben, die Nutzbarmachung

dieses Fragments als immunmoduli rendes Medikament zu empfehlen, das insbesondere die Behandlung von Autoimmunkrankheiten gestattet und außerdem die Abstoßungsreaktionen von verpflanzten Organen zu vermeiden oder diese Wirkungen zu vermindern gestattet.

Die Fragmente Fc von menschlichem IgG, die die Proliferationsrespons der Lymphozyten stimuliert, hat keine Wirkung auf die «!logen» Prialrreaktion » vielmehr haben die Fragmente Fab und das intakte IgG eine Inhibierungswirkung auf die allogene Primäireaktion und wirken nicht auf die Proliferationsrespons.

Das Fragment Fc von menschlichem IgG hat weder eine stimulierende noch eine inhibierende Wirkung auf die lymphozytäre Respons in Gegenwart des Antigens.

Die Fragmente Fc von menschlichem IgG haben keine inhibierende oder stimulierende Wirkung auf das Phänomen der Erzeugung von cytotoxischen Zellen in der gemischten primären lyphozytären Reaktion (CML I). Jedoch wurde gefunden, daß die Fragmente Fc eine Inhibierungsäktivität auf die Cytotoxizität bei der sekundären gemischten lyiüphosvtären Reaktion (CML II) besitzen, wie das intakte IgG und das Fragment Fab.

Die Entdeckung der letztgenannten Eigenschaft tWaxt» zum Studium des evtl. Einflusses des Fragments Fc auf die Stimulierung oder die Proliferation von suppressiven Zellen und die weiter unten wiedergegebenen Untersuchungen im experimentellen Teil zeigen, daö die Fragmente Fc des menschlichen IgG eine Aktivität haben, die die Entwicklung von suppressiven Lymphozyten begünstigt, ebenso wie eine Ad^uvans - Aktivität der Stimulierung der präsuppressiven Zellen,

Endlich erlaubt die Untersuchung des Einflusses der Fragmente Fc auf die Gesamtproduktion der Immunoglobuline über eine Reaktion des mitogenen Typs zu zeigen, daß die Gesamtproduktion der Immunglobuline erhöht wird, obwohl das Fab inaktiv ist und die intakten IgG im Gegensatz hierzu zu einer Inhibierung der Gesamtproduktion der Immunglobuline führes,vergl. A. Durandy et al., J. Clin. Invest., 67, Seiten 867-877 (März 1981).

Hierzu ist zu bemerken, daß bei der Inhibierung der Aktivität der Antikörper-abhängigen Cytotoxizität (ADCC) und der Differenzierung der suppressiven Zellen ein Proportionaleffekt bezüglich der Dosis des studierten Produkts beobachtet wird. Dies erlaubt den Schluß, daß das Fragment Fc direkt auf bestimmte lymphozytäre T-Unterpopulationen einwirkt.

Die verschiedenen Eigenschaften des Fragments Fc äes IgG des Menschen gestattet, dieses als immunmodulierendes Arzneimittel nutzbar zu machen, das die zelluläre Immunität inhibiert und die humorale Immunität begünstigt und das vorteilhafterweise zur Behandlung von Krankheiten brauchbar ist, die von verpflanzten Organen ausgehen oder durch immunitäre Disfunktionen oder Autoimmunkrankheiten erlitten werden.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel ist dadurch gekennzeichnet, daß sein Wirkstoff aus Fragmenten Fc von ^xintaktem Immunglobulin IgG und/oder Fragmenten Fab

oder daß es nicht mehr als 2 Gew.-% und insbesondere nicht mehr als 1 Gew.-% intaktes IgG und/oder Fragmente Fab, bezogen auf das Gesamtgewicht von (Fc+ Fac+lgG) enthält. ' ι

Erfindungsgemäß wird mit dem Ausdruck "Analoge der Frag-■ mente Fc von IgG des Menschen" alle Fragmente oder Unterfragmente Fc und alle synthetischen oder halbsynthe-

x) menschlichen IgG oder von Analogen dieses Fragments besteht und frei ist von

tischen Peptide verstanden, die Peptidsequenzen enthalten, die im Fragment Fc enthalten sind, sowie auch alle Derivate derartiger Fragmente, ünterfragmente oder Peptide unter der Bedingung, daß diese Fragmente, ünterfragmente, Peptide oder Derivate folgende Bedingungen erfüllen:

daß sie Eigenschaften als Aktivatoren für die Differenzierung von suppressiven Zellen habenj

dajj sie Eigenschaften als Inhibitoren für die äntikörperabhängige-Zytotoxizität Ϊ

daß sie nicht die Eigenschaften von Aktivatoren von Zellen NK besitzen.

Dz¹S erfindungsgemäße Arzneimittel kann oral, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden. Zu diesem Zweck wird es ir*sb- sondere in Form von Kapseln, Gelatinekapseln, Dragees, injizierbaren* Lösungen oder gefriergetrockneten Pulvern für injizierbare Lösungen zur Verfugung gestellt.

Für die orale Verabreichung soll die pharmazeutische Verabreichungsform eine säuraresistente Umhüllung besitzen, die den Durchgang durch die Magenbarriere gestattet.

Im Fall einer Organtransplantation kann die Verabreichung des Arzneimitteis gemäß der Erfindung nach verschiedenen Modalitäten erfolgen, die eine Folge der vom Arzt vor und nach der Verpflanzung angewendeten Technik für die Unterdrückung der Immunreaktion ist.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann vor der Organtransplantation verabreicht werden, um die Unterdrückung der Immunreaktion des Transplantats hervorzubringen, oder sie kann nach der Transplantation verabreicht werden, im Wechsel oder zusammen mit anderen

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Medikationen für die Unterdrückung der Immunreaktion,' wobei Rücksicht genommen werden soll, daß beim erfindungsgemäßen Arzneimittel die Wirkung als immunmodulierende Substanz im allgemeinen erst nach 6 bis 10 Tagen erhalten wird.

Die Verabreichung⁼~onge hängt insbesondere von der Art und Weise der Verabreichung und der Behandlungsphase ab. Sie schwank¹- allgemein von 1 mg bis 10 g des Wirkstoffs je Tag htsi Erwachsenen. Zum Beispiel kan sie bei intravenöser Verabreichung des Fragments Fc von 1 g b~· s 10 g je Tag beim Erwachsenen schwanken.

Die Erfindung hat ebenfalls zitm Ziel, die Verwendung des Fragments Fc von menschlichem IgG und dessen Analoger in Form eines Präparats eines immunmodulierenden Arzneimittels, das in der Lage ist, insbesondere Autoimmunkrankheiten zu behandeln und Abstoßungsreaktionen zu verhindern oder solche Wirkungen zu verringern bei Kranken, die eine Organverpflanzung erhalten sollen oder eine solche erhalten haben; diese Verwendung umfaßt insbesondere die Verabreichung in einer zweckmäßigen pharmazeutischen Form nach üblichen Methoden.

Hierbei ist zu bemerken, daß das erfindungsgemäßü Arzneimittel in Verbindung mit anderen immundepressiven Arzneimittel oder Corticoiden verwendet werden kann.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

In diesen Beispielen werden verschiedene Abkürzungen wie folgt verwendet:

ADCC: Antikörper-abhängige Cytotoxizität durch Zellvermittlung.

BSA: Rinderalbuminserum

CML: Cytotoxizität infolge Vermittlung durch Lymphozyten.

F(ab')2: Fragmente, erhalten durch Spaltung von IgG mit Pepsin.

GRP: Rote Blutkörperchen des Huhns.

Haplotyp DR: D-bezogene Determinante des Systems HLA.

HLA Dr, HLA A, B, HLA D: Antigen-Determinante des gewebeverträglichen menschlichen Leukozytensystems.

Ig: Immunglobulin.

MLR: Gemischte Lymphczytenreaktion.

PBS: Lösung in Phosphatpuffer.

PHA-M: Phytohämagglutin - M.

PWM: Kermesbeerenmitogen.

SVF: Serum von Kälberfötus.

SrAB: Serum AB.

Die Isolierung der Fragmente.Fc und Fab erfolgte durch Aussalzen mit Ammoniumsulfatlösung und Reinigung ti"ber eine Molekularsietkolonne (Gelfiltration).

Beispiel 1:

untersuchung der pharmakologischen Eigenschaften des Fragments Fc von menschlichen Immunglobulinen

I. untersuchung der Lymphozyten-Proliferation

untersuchung der Aktivität der Lymphozytenzellvermehrung bein Fragmenten Fc und Fab von IgG sowie des Immunglobulins IgG

Material und Methode

1. Herstellung von verschiedenen Lymphozytenpopulationen

a) Gewinnung der Lymphozyten

Die Lymphozyten von peripherem venösem Blut von 60 freiwilligen Spendern wurden abgetrennt auf einem Gradienten von Ficoll-radioselectan (d: 1077) gemäß der Technik von Böyum A. (Scand. J. elin. Lab. Invest. Suppl. 97, 1968, 21, Seite 1).

• ·

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b) Gewinnung einer Lymphozytenpopulation angereichert mit Makrophagen

Die Abtrennung von Monozyten einer Lymphozytenpopulation, wie sie vorher erhalten wurde, wurde nach einem Percoll-Gradienten (d: 1064) erhalten gemäß der Technik von Ulmer und Flad (J. Immunol. Methods, 1979, 30, Seite 1).

c) Gev/innung von Lymphozyten, die arm an anhängenden Zellen sind

Die Population von Lymphozyten, die gemäß a) erhalten worden waren, wurden 1 h bei 37 ⁰C in einer Flasche (Typ Falcon) bebrütet. Die Zellen, die nicht anhafteten, wurden zurückgewonnen. Die drei Typen (a, b, c) der Zellpopulationen wurden bei -260 ⁰C konserviert und im Augenblick des Versuchs aufgetaut.

d) Peroxidasereakfcion

Der Prozentsatz Monocyten jeder Lymphozytenpopulation wurde durch die kombinierte Peroxidasereaktion nach SATO (Traite de biologie appliquee, 1964, Bd. 3, Seite 95) bestimmt über eine Gesamtzahl von 400 Zellen durch Einreiben für jedes Individuum.

2. Fragmente Fc-Fab und IgG

Die Präparate der verschiedenen ünterfragmente werden nach bekannten Methoden ausgehend von einem menschlichen Plasma-Immunglobulin IgG, das mit Plasmin behandelt worden war, hergestellt. Die IgG (PRG) waren vom Typ 1 (30 %) und 2 (70 %). Die Fragmente Fab hatten eine Verunreinigung mit 4,1 % Fc, im Gegensatz hierzu war das Fragment Fc rein.

3. Kultivierung

a) Der Lymphozyten-Transformationstest wurde auf Mikroplaques auf runden Kulturböden (96 Schalen je Placque) mit RPMI, dem 20 % autologes dekomplementiertes Serum zugesetzt worden war, durchgeführt.

Zu jeder Schale wurden 200 000 Zellen in 150 Ul von Fab oder RMPI plus '20 % autologes Serum und 50 Ul von Fc oder PWM (Gibco), verdünnt in RPMI, zugefügt. Jede Verdünnung jedes Fragments wurde 3fach geprüft.

b) Inkubation: Die Placquen wurden 6 Tage in einem Brutofen bsi 37 ⁰C in gesättigt feuchter Atmosphäre in einer Atmosphäre von 5 % CO₂ und 95 % Luft bebrütet.

c) Markierung mit tritiiertem Thymidin: Nach 144 h wird in jede Schale ein Microcurie-tritiiertes Thymidin zugefügt. Der Einbau wurde nach 16 h durchiSstündiges Kühlen auf + 4 ⁰C gestoppt.

d) Ausfällung: Die Zellen wurden durch Ausfällung über Skatron gewonnen und mittels einer szintillierenden Lösung in einem Betastrahlen-Zählrohr ausgezählt.

Ergebnisse

Bei 60 geprüften Individuen zeigten 43,4 % eine große Antwort (S 10 ⁰⁰° ^cP^m)' ¹⁸'^{3 % eine} 9^erin9^e 'Antwort ( jL 10 000 cpm) und bei 38,3 % war eine Antwort abwesend C- 2000 cpm).

Das Kriterium einer großen oder einer geringen Antwort wird festgestellt anhand der zellteilungsrespons bei einer Zellkultur mit dem Fragment Fc (Tabelle 1).

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Der Prozentsatz der gegenüber Peroxidase positiven Zellen innerhalb der drei Gruppen betrug 32 %. Im Gegensatz hierzu betrug dieser bei der Population von Lymphozyten ohne anhängende Zellen 1 bis 2 %.

Die Fragmente Fc, Fab und IgG wurden in Mengen von 6, und 24 ug je Kultur geprüft. 50 und 100 Ug gaben keine erheblichen Unterschiede gegenüber den vorigen Gruppen (D-N-S).

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben.

Ergebnisse

Die Versuche zeigen die stimulierende Wirkung des Fragments Fc über eine Lymphozyten-Proliferationsrespons im Vergleich zum Fragment Fab oder des ganzen IgG und ebenso, daß die unerläßliche Gegenwart von Makrophagen für diese Aktivität nötwendig ist. Diese Resultate nähern sich den Werten der von Weigle an Mäuselymphozyten durchgeführten Arbeiten (J. Exp. Med.'1977, 146, Seite 241) oder die maximale Proliferationsrespons beträgt 5 Tage bei 10 pg je Kultur. Ebenso zieht die Verarmung an anhängenden Zellen die Abwesenheit einer Proliferationsrespons der Lyiaphozyten von Mäusen nach sich (J. Exp. Med. 1979, 150, Seite 256).

II. Untersuchung der allogenen Lymphozytenproliferation

- Untersuchung der Aktivität der Fragmente Fc Fab und von iÄtaktealmmunglobulin IgG als Adjuvans oder Inhibierungsmittel über die primäre allogene Proliferationsrespons.

Material und Verfahren

Die Abtrennungstechnik für die Lymphozyten, die Monozyten und die Gewinnung der verschiedenen Fragmente wird unten beschrieben.

Gewinnung von Lymphozyten T

Die Abtrennung von Lymphozyten T wird über eine Kolonne * mit Nylonvlies (nach der Technik von Julius M. et al., Eur. J. Immunol., 1973, 3, Seite 645) durchgeführt.

Es wurden 40 Millionen Lymphozyten 30 min bei 37 °C mit 0,6 g Nylonvlies In. einer Spritze von 10 ml Inhalt inkubiert.

Die nicht anhaftenden Zellen wurden isoliert. Die Kontrollen der Verfärbung durch Peroxidase und die Rossetten E wurden benutzt zur Bestätigung der Anreicherung an Lymphozyten T.

Die Zellen werden wie respondierende Zellen der gemischten Kulturen verwendet.

Rückgewindung der überstehenden Flüssigkeiten der Lymphozytenkulturen in Gegenwart verschiedener Fragmente von Ig

Gemäß der Technik von Marylin Thoman (J. Immunol., Bd. 128, Seite 590, (1982) wurden die an Monozyten angereicherten Lymphozyten (1 χ 10 /ml) 24 h bei 37 ⁰C im Milieu RPMI 1640 -' 20 %SrAB mit 60 ug Fc, Fab oder Ig inkubiert. Nach 24 h wurden die überstehenden Flüssigkeiten durch Zentrifugieren isoliert.

-is·-:

Mischkultur der Lymphozyten

Die respondierenden Zellen (nichtanhaftende Zellen) wurden ausgezählt und auf eine Konzentration von 1 χ lO⁶/ml eingestellt. Die stimulierenden Zellen (gesamte Lyiaphozytenpopulation oder Lymphozyten, angereichert an Monocyten) wurde mit 25 ug Mitomycin C je ml und je Million Zellen behandelt (gemäß der Technik von Bach in Science, 1966, Bd. 163, Seite 545) 30 min bei 37- ⁰C.

Nach der Behandlung wurden die Zellen zweimal mit RPMI plus 10 % SrAB gewaschen. Die Zellsuspension wurde auf verschiedene Konzentrationen, nämlich 1 χ 10 /ml, 12 χ 10⁴/ml, 6 χ 40⁴/ml und 3 χ 10⁴/ml eingestellt.

Die Verteilung der stimulierenden und respondierenden Zellen wurde mit Mikroplaquen in konischen Schalen mit Hilfe eine Hamilton-Spritze festgestellt, wobei 0,05 ml respondierende Zellen, 0,05 ml stimulierende Zellen, 0,05 ml RPMI, 20 % SrAB verwendet wurden.

Die Mikroplaquen wurden 5 Tage in einem Brutofen bei 37 ⁰C und 5 % CO2 inkubiert. Nach der 96. Stunde wurden 2 uCu tritiiertes Thymidin je Schale über 18 h zugegeben. Die Kulturen wurden dann durch Ausfällung Über Filter nach Flow mit Hilfe eines Mikrofällmittels Skatron isoliert. Jeder Filter wurde nach dem Trocknen in ein Kunststoffrohr gegeben; hierzu wurden 3 ml einer szintillierenden Lösung in jedes Rohr gegeben und anschließend in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler ausgezählt. Die Ergebnisse sind in Blitzen je min (cpm) wiedergegeben.

Ergebnisse

MLR und Fc, Fab und Ig bei unterschiedlichen Konzentrationen

Die verschiedenen Fragmente Fc, Fab,-Ig in unterschied liehen Konzentrationen wurden mit MLR I versetzt.

Das Fragment Fc zeigte in verschiedenen Konzentrationen (12, 25, 50 und 100 ug/Kultur) keine Wirkung als Adjuvans oder Inhibierungsmxttel bei MLR I im Vergleich zu RPMI.

Im Gegensatz hierzu zeigte das Fragment Fab in einer Konzentration von 100 ug/Kultur eine Inhibierung von MLR I. Das IgG in Konzentration von 50 und 100 ug zeigte ein^ Inhibierung von MLR I.

Fc, Fab und IgG in einem MLR mit verschiedenen Konzen trationen der stimuliernden Zellen.

Dieses Verfahren wird mittels des Aufzeigens der Wirkung der verschiedenen Fragmente unter optimalen Bedingungen der Proliferationsrespons durchgeführt. Jede erhebliche Differenz zum Vergleich mit RPMI wird beobachtet. Alleine IgG bei einer Konzentration von 50 pg ergab eine Inhibierung von MLR I.

Fc, Fab und Ig mit einer MLR mit silmulierenöen Zellen, die mit Monozyten angereichert sind

Es zeigte sich, daß toei Aktivierung der Lymphozyten T durch Einführen des Fragments Fc durch Makrophagen probiert werden kann, dieses in ein sehr vorteilhaftes System zu bringen unter Beibehaltung der unter* optimalen Bedingungen der Kultur. Es wird kein

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Adjuvans-Effekt bei verschiedenen untersuchten Dosierungen beobachtet. Ein Inhibierungseffekt wird bemerkt bei IgG bei 24 pg/Kultur.

MLR und überstände der inkubierten Zellen mit

Fc, Fab oder Ig

Wie eine Prol'^erationsrespons nach den ersten Stunden, die der B<" führung zwischen den stimulierenden und respondierenden Zellen folgen, ausgelöst wird und "ie die Produktion der Fragmente Fc durch Makrophagen di3 ersten 24 h lang erfolgt, so werden in ein MLR die überstehenden Flüssigkeiten zugegeben, die die Lymphozyten, angereichert J Monocyten enthalten und 24 h bei 37 ⁰C mit verschiedenen Fragmenten inkubiert,

Die überstehenden Flüssigkeiten werden über autologe Zellen der respondierenden und über MLR I unter optimalen Bedingungen und unter—optimalen Bedingungen der Proliferation geprüften Zellen hergestellt.

Es wurde weder ein Inhibierungseffekt noch ein Aujuvanseffekt mit den Fragmenten Fc_? Fab oder Ig festgestellt.

Ergebnis

Mit dem Fragment Fc wird keine erhebliche Adjuvans- oder Inhibierungsaktivitat festgestellt bei menschlichen Lymphozyten in Konzentrationen von 6, 12, 24, 50 und 100 \xq je 50 000 Zellen bei einer primären allogenen Lymphozytenreaktion. Die Wahl der verwendeten Dosierungen wird bestimmt gemäß dem Vorhandensein einer proliferativen Wirkung des Fragments Fc bei den Lymphozyten : (Protokoll I wie folgt).

Y-

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Im Gegensatz hierzu ergibt das ganze Immunglobulin und das Fragment Fab eine Inhibierung der primären allogenen Respons bei allen geprüften Modellen.

III« Untersuchung der Aktivität der zytotoxischen Lymphozyten (CML I und CML II) Untersuchung der Aktivität der Fragmente Fc, Fab und des IgG mit verschiedenen Typen Zytotoxizität.

Material und Methoden

Die Technik der Abtrennung yon Lymphozyten aus peripherem Blut von freiwilligen Spendern und die Erzielung verschiedener Fragmente wird unten beschrieben.

Fc , Fab und IgG

Gamma-Piazentamaterial, in Plasmin digeriert,

IgG Unterklassen: IgGl = 57 %

lgG2 = 39 % lgG3 = 0,2 % igG4 = 3,7 %

Antikörper-Cvtotoxizität durch Zeil vg-rmi-fc-tltmp: fADCC)

Die angewendete Technik ist beschrieben in F. Wisloff, T. E. Michaelsen, S. S. Froland, Scand. J. Immunol., 3, Seiten 29-38, 1974.

Die Targetzellen sind vom Typ GRP, sensibilisiert mit Immunglobulin IgG vom Hasen-Anti-GRP und markiert mit Chrom 51.

-20-Vetsuch ADCC

Die wirksamen Zellen (Lymphozyten aus peripherem Blut) werden gezählt und auf eine Konzen in RPMI plus 10 % SVF eingestellt.

werden gezählt und auf eine Konzentration von 5 χ 10 /ml

Mit Hilfe einer Hamilton-Spritze wurden über die Mikroplaquen in Rundschalen 100 ul wirksame Zellen in 50 ul der zu untersuchenden Produkte in verschiedenen Verdünnungen je dreifach verteilt.

Nach der Inkubierung 20 min bei 37 ⁰C wurden 50 ul GRP, das sensibilisiert und markiert war, verteilt, was eine Endverdünnung von 50 wirksamen Zellen gegen eine &iel- zelle ergab (50 : 1).

Die spontane Verbreiterung wird dadurch bestimmt, daß das GRP in einem Milieu RPMI plus 10 % SVF inkubiert wird und die maximale vergrößerung bei Zugabe von GRP in ln-Salzsäure erhalten wird. Als Beweis für die Aktivität des Antiserums werden die wirksamen Zellen auf mit normalem Hasenserum vorinkubiertem GRP aufgesetzt.

Die Plaquen werden nach einer Inkubierung über 18 h bei 37 ⁰C unter 5 % CO₂ in feuchter Atmosphäre 10 min bei I j

800 U/min zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wird durch Filtrieren über Tampons isoliert (Flow, Ref. 78-21-005).

Cvtotoxizität "Natural Killer" (NK)

Die verwendete Technik ist beschrieben in B. M. Vose, F. Wanky, S. Argov und E. Klein, Eur. J. Immunol. 1977, 7, Seite 753-757.

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Die Targetzellen sind Zellen K 562 (Stamm eines menschlichen Myeloms), markiert mit Chrom 51.

Versuch NK

Die wirksamen Zellen (Lymphozyten aus peripherem Blut) wurden auf eine Konzentration von 5 χ 10 /ml,

2,5 χ 10⁶/ml, 1,2 χ 10⁶/ml und 6 χ 10⁶/ml eingestellt.

Die Verteilung und die Behandlung erfolgten in gleicher methodischer Weise wie nach der Technik ADCC. Die

Tärgerfeellen werden in 50 ul verteilt, was eine Endverdünnung von 50 wirksamen Zellen gegenüber einer . Targetzelle (50 : 1, 25 :1, 12 : 1 und 6:1) ergibt. Die spontane Vergrößerung sowie auch die maximale Vergrößerung und die Gewinnung der überstehenden Flüssigkeit wurden unter den gleichen Bedingungen bewerkstelligt, wie im versuch ADCC.

Cytotoxizität dufdiprimäre I (CML I) und sekundäre (CML II) lymphozytäre

Dieser Versuck wird nach der Methode von Lightbody et al., Gen. Bact. Virol. Immunol., 1971, Bd. 64, Seite durchgeführt.

Wirksame Zellen

Die Phase der allogenen Sensibilisation entspricht der identischen gemischten Kultur, wie sie vorher beschrieben wurde (vgl. unten II)_c

In diesen beiden Versuchen wurde die Sensibilisierung gegen einen einzelnen Haplotyp Dr durchgeführt, unter Berücksichtigung der Differenz zwischen HLA A, B der respondierenden und stimulisierenden Zellen.

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Ta-reet»3ellen

In den beiden Versuchen wird als' (Pargefczelle eine stimulierende Zelle verwendet/ die zur wechselseitigen Sensibilisierung von MLR diente. Die Zellen werden · ~ - 72 h über

PHA-M (Gibco) ^imtaitert und mit Chrom 51 18 h vor dem

mtai

Versuch markiert, ^iner Menge von 200 ul je 10 χ ΙΟ⁶ Zellen.

Mach aufeinanderfolgenden Wäschen werden die Z.ellen gezählt über Trypanblau und auf 200 χ 10³/ml eingestellt. Der Versuch mit CML wird mit Mikroplaquen in Rundgläsern durchgeführt. Die wirksamen.Zellen in 100 ul, wie oben beschrieben behandelt, werden mit 50 μΐ iargetzellen 4 h bei 37 ⁰C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO₂ inkubiert und geben ein Verhältnis von 50 : 1 im Fall von CML I und von 50 : I₁ 25 : 1, 12 : 1 und 6 :1 im Fall von CML II. Die spontane Vergrößerung "ebenso wie die maximale Vergrößerung und die Gewinnung der überstehenden Flüssigkeit werden unter Bedingungen wie oben beschrieben bewerkstelligt. In den vier Versuchen der Cytotoxizität wird die Vergrößerung mittels Chrom-51 gemessen in einem Gamma-Zähler über 2 min. Die Ergebnisse werden in Prozentsätzen Cytotoxizität gemäß folgender Formel ausgedrückt:

Prozentsatz Vergrößerung = — _χ

ρ tjj ep« MaxiBalvergro.ßerung - cpn Spontanvergrößerung

cpa Vergrößerung Test - cp» Spontanvergrößerung

Als positiv wird die gesamte Cytotoxizität über 10 % angesehen.

Ergebnisse

Cytotoxizität abhängiger Antikörper

aniikSrperabhängigen ?

Eine Inhibierung der/Cytotoxizitat - j

mit dem Fragment Fc und von Ig wird

beobachtet bei allen untersuchten Individuen. Diese | Inhibierung steigt direkt proportional mit der Konzentration des Fragments Fc oder IgG an (Tabelle 2). _&,

Die Inhibierung der Aktivität von Killer wird wichtiger S

mit dem Fragment Fc als beim IgG; das is - so, daß 6 \ig ||

Fc eine Inhibierung gleich derjenigen von 50 \iq Ig Ij

ergeben. J

Im Gegensatz hierzu wird, kein Inhibitoreffekt mit dem i Fragment Fab beobachtet, auch nicht bei sehr hohen |

Dosen. 1

Aktivität "Natural Killer"

Irgendeine Inhibierung der Aktivität NK tritt nicht bei
den Fragmenten Fc-Fab oder Ig auf, auch bei sehr wesentlichen Dosen. Diese Resultate zu bestätigen, wurde in
zwei extremen Dosierungen (6 pg und 100 \xg) die Aktivität
NK bei unterschiedlichen wirksamen Zellen - Targetzellen geprüft. Es wurde kein erheblicher unterschied
bei keiner Dosis und in keiner Beziehung beobachtet
(Tabelle 3).

CytotoxizitätAydi primäre . und sekundäre, zelluläre Ver-
-»1-fa-blung

Die CML wird nicht durch die Wirkung .der Fragmente Fc,
Fab und IgG modifiziert, die bei unterschiedlichen
Dosierungen geprüft wurden.

Im Gegenteil wird das CML II durch die Fragmente Fc und Fab bei einer Dosis von 25, 50 und 100 ug inhibiert; das IgG zeigt eine erhebliche Inhibierung bei allen verwendeten Dosierungen {Tabelle 4).

V. Untersuchung der Wirkung der Fragmente Fc, Fab uno Jig des menschen auf die aktivität der suppression und präsuppressiven Zellen bei der primären allogenen Respons

Objekt

Die E-trforschang v^ktivität der Fragmente. Fc, Fab und von Ig bei den suppressiven Zellen T der allogenen Proliferationsrespons und bei der Differenzierung der präsuppressiven Zellen.

Material und Methode

Die Techniken der Trennung der Lymphozyten von peripherem Blut von freiwilligen Spendern und die Erzielung unterschiedlicher Fragmente sind im folgenden beschrieben.

Es wird Gairana-Plazenta in Plasmin digeriert. Die Reinheit der verwendeten Fragmente wird durch Gelfiltration über ACR 44 bestimmt. Es werden folgende Fragmente erhalten: Fc: 100%, Fab: 94,6 %, \5,4 % 73), Ig (PRG) 7S: 95,4 % 10 S: 2,8% 10 S: 1,8 %, IgGl: 57 %, IgG2: 39 %, IgG3: 0,2 %, IgG4: 3,7 %.

Die freiwilligen Blutspender wurden auf prinzipielle Determinanten des Komplex HLA-Dr mittel serologischer und klassischer Lymphotoxizitäts-üntersuchungen und modifizierter Untersuchungen dieser Art (Lymphozyten-

suspension, angereichert an Zellen B) untersucht.

Die Ällosensibilisierung wurde nach M. J. Sheeny. F. H. Bach, Tissue Antigens, 1976, 8, Seiten 157-171 bestimmt.

Zur Bestimmung der allogenen Sensibilisierung in vitro wurden 10 χ 10* Lymphozythen als Respondeure verwendet und in Gegenwart von 10 χ 10 allogenen Mitomycin-bejjajjgelten Zellen geprüft, wobsi letztere unverträglich /gegenüber Ag HLA-Dr (25 pg/10 Zellen/ml), die als Stimulierungsmittel gebraucht wurden. Die Kultur wird in Flaschen gemäß Falcon {CA 3013) mit 20 ml Milieu RPMI 1640 unter Zusatz von 10 % eines Serumpools AB in einem Ofen mit feuchter Luft bei 37 ⁰C in Gegenwart von 5 % CO₂ über einen Zeitraum von 10 Tagen durchgeführt.

Der Suppressi^nstest wurde gemäß ~· Dausset _f Nature/ 1978, 267, Seiten 502 ff. durchgeführt.

Die Suppressionsaktivitat der allosensibilisierten Lymphozyten in vitro wird mit einer MLR I evaluiert in Gegenwart von drei Zellpopulationen: respondierenden Lymphozyten, stimulierenden Mitomycin-behandelten Zellen und aliösensibiliäierten und ebenfalls mit Mitomycin behandelten Zellen. (Diese Zellen sind autolog gegenüber respondierenden Zellen).

Das Zählen wurde mittels eines Flüssigkeits-Szintillationszählers durchgeführt.

Der Prozentsatz der Suppression wird nach folgender Formel berechnet:

* cnnr^cc-inn - ι Experimenteller Mittelwert (CPM) _inn % Suppression - 1 - ^x

• · * · · ι > err«,

untersuchung der Aktivität verschiedener Fragmente der präsuppressiven und suppresiven Zellen

Dm das Vorhandensein einer stimulierenden Wirkung der präsuppressiven"Zeilen zu messen, werden zwei unterschiedliche Modelle untersucht.

Das erste Modell besteht aus der Präinkubation über 1 h von Ly-stp'ao-oV ten, die vollständig aus peripher em Blut ibestanden, mit unterschiedlichen Fragmenten Fc, Fab oder IgG. Nach mehreren Waschen wurden die Zeilen mit -Mitomycin behandelt und als dritte Zellen in MLR I unter den vorher beschriebenen Bedingungen eingesetzt.

Die Vergleichsgruppe wurde mit RPMI präinkubiert.

Das zweite Protokoll gestattet die Messung des evtl. Adjuvanseffekts bei der Entwicklung der suppressiven Zellen. In der Stufe der Allosensibilisation werden die Fragmente Fc, Fab und. IgG am Tag Null mit unterschiedlichen Dosen versetzt. Nach 10 Tagen Sensibilisierung werden die Zellen mit den dritten Zellen in einei» MLR I unter den vorher beschriebenen Bedingungen versetzt.

Zur kurzen Beschreibung der Aktivität dieser Fragmente unter den Suppressivzellen werden unterschiedliche Dosen von Fc, Fab und Ig mit dem Test der drei Zellen hinzugefügt.

Ergebnisse (Tabelle 5)

1. Aktivität der Fragmente Fc, Fab und Ig bei Präinkubation der nicht-sensibilisierten Zellen und nach Hinzufügung der dritten Zellen

In diesem Süppressioastest wurden unterschiedliche Dosen

0m a o mm

von Fragmenten Fc, Fab oder Ig inkubiert über 1 h mit sensibilisierten Zellen, bevor diese gewaschen und mit Mitomycin behandelt werden.

Die vorläufig mit dem Fragment Fc iakubierten

Zellen ergeben eine Erhöhung der Inhibierung von MLR I proportional der angewendeten Dosis von Fc. Diese Erhöhung ist*erheblich für die Dosen 15 und 30 pg/ml. Es wird eine erhebliche Inhibierung von MLR mit prä- f inkubierten Zellen, in Gegenwart von Ig in einer Dosis von 15 pg aufgefunden.

Im Gegensatz hierzu zeigen die mit dem Fragment Fab präinkubierten Zellen keine erhebliche Inhibierung der allogenen Respons.

2. Aktivität der Fragmente Fc, Fab, IgG gegen Allosensibilisierung

Unterschiedliche Dosen von Fragmenten Fc, Fab und IgG in intakter Form werden zum Tag Null einer Allosensibilisation unterworfen.

Die suppressiven Zellen, die in Gegenwart von Fragment Fc sensibilisiert worden waren, zeigen eine Inhibierungsaktivität gegen MLR I, die erheblich und höher ist als bei den Kontrollzellen, nämlich bei 1,5 pg und IQO pg je Kultur. Andererseits zeigen die mit Ig in intakter Form inkubierten Zellen eine erhebliche Erhöhung der Inhibierung von MLR I bei Dosen oberhalb 3 Hg. Im Gegensatz hierzu geben sensibilisierte Zellen in Gegenwart von Fragment Fab keinen erheblichen unterschied.

Im Fall, daß die prozentuale Suppression sehr erhöht ist, ist es folglich schwierig, die Erhöhung zahlenmäßig festzuhalten. Ein zusätzlicher Versuch wurde

hierzu durchgeführt. Die allasensibilisierten und mit Mitomycin behandelten Zellen wurden in verschiedenen Konzentrationen bis zu einem Verhältnis 1 : 1, 2 : 1 Und 4 : 1 von respondierenden Zellen zu suppressiven Zellen hinzugegeben. In diesem Fall wird eine erhebliche Erhöhung der suppressiven Aktivität bei der Verdünnung 8 : 1 bei den Zellen erhalten, die in Gegenwart von

Fragment Fc sensibilisiert worden waren.

3. Aktivität der Fragmente Fc , Fab, Ig im Suppressionstest der allogenen Respons I

Es wurden verschiedene Dosen der Fragmente Fc, Fab und Ig in MLR I eingeführt mit drei Zellen im Moment des Versuchs. Es wurde weder eine Adjuvansaktivität noch eine Inhibierungsaktivität beobachtet.

Ergebnisse

Das erste Anzeichen der Existenz von suppressiven Zellen, die sich über eine sekundäre Respons entwickeln, wird durch die Beobachtung erhalten, daß die zweimal gegen dasselbe Alloantigen allosensibilisierten Zellen eine Proliferationsrespons mindenstens der Größe ergeben, wie sie erhalten wird in dem Fall, in dem eine einzelne Allosensibilisierung .stattfindet, und es wird der aktive Prozeß demonstriert durch Zugabe von allosensibilisierten bestrahlten Zellen zu einer klassischen primären MLR.

Die suppressiven Zellen sind spezifisch für das Antigen HLA-Dr, das durch die stimulierte Zelle dargestellt wird. Sie erscheinen wie Lymphozythen T, da nach 10 Tagen Kultur 95%der allosensibilisierten Zellen Rosetten E

bilden und mindestens 3 % IgG der Oberfläche und mindestens 2 % der Monozyten bilden. Der Mechanismus der Suppression, der durch eine allogene Hyperimmunisation provoziert wird in vitro> erscheint sehr nahe verwandt dem multitJcansfusionalen Prozeß, der in der Praxis vor der Nierentransplantation liegt, der an eine verbesserte Überlebenschance des Transplantats grenzt, wie es von Opelz und Teroski (Transplantation 1980, 29, Seite 153) berichtet wurde.

Die vorher beschriebenen Versuche erbringen den objektiven Nachweis der Aktivität der Fragmente Fc, Fab und IgG bei der Entwicklung von präsuppresiven Lymphozyten ebenso wie bezüglich der direkten Aktivität der Suppressivzellen.

V. Untersuchung dar Produktion der Gesamtimmunglobuline bezüglich der Fragmente Fc, Fab und IgG

Ziel

Nachweis der. Produktion von Immunglobulinen nach der Stimulierung mit Fc, Fab und IgG.

Material und Methoden

1. Herstellung der verschiedenen Lymphozytenpopulafcionen

Die Technik der Trennung von peripheren Blutlymphozyten von freiwilligen Spendern und die Erzielung verschiedener Unterpopulationen sowie die Erzielung verschiedener Fragmente ist wie vorher beschrieben. Gamma-Plazenta digeriert in Plasmin, ergibt eine Reinheit und Charakteristika wie beschrieben, unter V.

2. Markierung des Antiserums mit Jod 125

Es wird F (ab¹) 2 der Siege - menschliches Ig (total) (Laboratorium-Cappel) mit Jod 125 S 4 markiert.

Danach wird das Gemisch von F (ab') 2, das mit Jod markiert ist, im Überschuß in eine Kolonne mit Sephadex gegeben. Das erste Peak entspricht dem F (ab¹) 2 (Molekulargewicht 50 000). Das zweite Peak entspricht einem Volumen von 8 bis 10 ml entsprechend den Ergebnissen der Markierungen in einem Phophatpuffer 0,5 m vom pH-Wert 7,5 mit einem Proteinträger aus 1 %igem Pferde-Finalserum, ohne Gammaglobulin, das zugeführt wird.

Die Ausbeute der Markierung wird nach folgender Formel berechnet:

cpm Peak F (ab' ) 2 _inn

cpm Peak F (ab¹) 2 + cpm I₁, ς (Oberschuß)

Die aktive Spezifität wird wie folgt berechnet:

cpm -

ng F (ab") 2 (markiert)

ng F (ab¹) 2 (markiert) =

,_nnn VoI Probenmenge (ul) χ Menge F (ab¹) 2 (ug) luuu χ _{Vol Endmenge F} (ab¹) 2 (markiert) (yl)

3. Bestimmung von menschlichem IgG durch den Test RIA

Nach einer Nacht bei 4 ⁰C Absorption von F (ab¹) 2 der ZiegirAnti-IG des Menschen in austauschbaren Schüsseln wird die Beatmung und die Sättigung dieser Schüsseln mit PBS + 5 % BSA 1 h lang bei 37 ⁰C vorgenommen.

Λ r - t I * mv * * cc»

A. Inkubation der getesteten Produkte Verdünnung von geeichtem Ganssaglobulin

Als Eichmaß wird ein Plazenta-Garomaglobulin einer Konzentration von 60 ug/ml verwendet. Es werden zehn aufeinanderfolgende Verdünnungen von 1/2 und 1/2 dieser Lösung in PB'S plus 0,5 % BSA plus 0,5 % Tweei^ durchgeführt.

Verdünnung der zu testenden Produkte

Nachdem Zellen von peripherem Blut 6 Tage kultiviert worden waren, werden die nicht-anhaftenden Zellen und die an Makrophagen angereicherten Zellen in einer Konzentration von 1 χ 10 ml in RPMI plus 10 % SVF in

Cenaniiiarl- xrnrt Vc. Pah. Tn niior TJTJMT -in einer Μρησρ

von 60 pg/ml zusammengebracht und die überstehenden Flüssigkeiten nach dem Zentrifugieren gesammelt.

Es werden getrennt gebraucht 1/5, 1/25 und 1/125 PBS mit 0,5 % BSA plus 0,05 % Tween 20."

Die verteilung jeder Produktverdünnung wurde durchgeführt mit 100 μΐ je Schlichen in dreifacher Ausfertigung.

Die Schälchen wurden anschließend 2 h bei 37 ⁰C inkubiert und mehrmals gespült.

B. Antigenkontakt - F (ab')2 der Ziege-Anti-Ig des Menschen mit: Jod 125 markiert

Es wurden 100 ml F (ab¹) 2, das markiert und verdünnt war_r in jedes Schälchen verteilt. Nach 2 h inkubieren

• ■ »a

^{1 :}

bei 37 ⁰C wurden mehrere Waschen mit PBS-Tween durchgeführt. Danach wurde jedes Schalchen abgesaugt. Das Zählen wurde mit einem Gamma-Zähler durchgeführt.'

C. Bestimmung der Menge Ig in der überstehenden Flüssigkeit

Diese Menge wurde nach folgender Formel bestimmt:

cpm real = cpm (Fc*) + lympho + RPMI Serum) - cpm (FC + RPMI Serum)

■*) Fc oder Fab oder Ig

Danach wurden die cpm-Werte analysiert und als Funktion der Menge in einer Kurve aufgetragen und die Regression analysiert.

Ergebnisse und Schlüsse (Tabelle 6)

Die Produktion von Gesamtimmunglobulinen über verschiedene Lymphoz-yten^ünter populafeionen in Gegenwart des Fragments Fc wird gezeigt und liegt erheblich höher als beim Fragment Fab.

Im Gegensatz hierzu erscheint das IgG inhibierend auf die Gesamt-IgG-Produktion als Stimulationsmittel im Vergleich zur spontanen Produktion von IgG.

Die Einführung von Immunglobulinen und der ünterfragmente nach der Technik von RIA gestattet Parallelkontrollen der überstehenden Flüssigkeiten 5 Tage ohne Zellen, um vergleichbare Werte zu erhalten.

C " · «II*

Diese Methode zielt auf das Messen des Vorhandenseins einer in-vitro-Produkion von IgG über stimulierte Lymphozyten mittels Fc.

Beispiel 2 Darstellung einer pharmazeutischen Zubereitung

Die Fragmente Fc wurden über IgG des Menschen hergestellt, die nach der Technik von Oncley J. L. et.coll., J. of Am.Chem.Soc., 1949, 71, Seite 541 gereinigt und mit menschlichem Plasmin gemäß der Technik von Plan R. und Makula M.F., Vox Sanguinis, 1975, Bd. 28, Seiten 157 - 175 t^haiKieltworden waren« Die IgG stammten aus Blut aus Vei..en oder wurde aus Plazentas ausgedrückt. Die Lösung der Fragmente Fc (Apyrogen) wurde steril filtriert und die gewonnenen 2,5 g Wirkstoff je Flasche aufgefangen und gefriergetrocknet.

Im Moment der Gebrauchnahme wurde die Lösung mit Wasser wie es für injizierbare Präparate gebraucht wird, rekonstituiert.

Kultur

26 26 26

j Responsen

Fc I Fab 1 IaG 1.EEL¹I 1 PWM |

: : : : : ütaergrpße 23308-4507:11446-1665:10985*1440:6930-56° :66Pb4-4322 : _Respons 8324-2026:13641-2339:13715-2199:69 30-569 -66884-4 32?.: 43,4 % 21309*2630:154.10*5093*:10024*1463':6930*56? -66884*432-!; 6161*400 : 8763*631 : 3010*489 -4100*508 ·47319*6898: Niedrige ■

. : : : : : Respons 7278-948 : 3985-1298: 3126*593 -.4100*508 :47319*6898:

8032*671 : 5248*1179: 5128--567 ":4100*508 -47319*6898":

: anhaftende
"•37145*4717:

1385*413 ; 1110*349 : 1483 = 433 ; ^3 34_: 371 ^-4 M #s _Zellen

₁₃69*471 I 1137*288 \ 1 064*334 j U89*334_: 37^5*4717 : ^

₁₄₃5*489 ί 1109*244 ! 1661*423 ! 1 6(39*334 _: 371_45*47 Π :

autologes Serum Peroxidase 32 %

U)

• ■

• I

h * * 41 *

υ t β m ■

CO "■

cn
cn

Tabelle 2

Pr#*ukt

ADCC und Fragment·Pc, Fab, IgG - Test ADCC 50 :

% CytotoxizltSt RE1 Cr 51 M± ES n»7

Pc

25,2- 5,5 >46% * (a)

19,1-4,56 >59% * (b)

15,5-3,5 >67<i * (c)

12,3-3

>74% * (d)

Fab

46,8-8,2 >0,01

47,9-7,6 0

46,4^7 >0,01

IgG

33,1-5,8 >30%*

30,6-5,5 >35* (e)

28,0-5,7

45,0^7,5 Ϊ24,6^4,5 >0,04 >48<i * (g) RPMI/Verglei.ch

47,4-7,4 (h)

47,4-7,4

xx) η = 6j*% Inhibierung Zahl der

Individuen et vs RPMI = ρ <0,025 e vs RPMI = P<0,05

b vs RPMI = ρ <0,010 f vs RPMI = p<0,05 c vs RPMI = ρ <0.005 σ vs RPMI = p<0,02 d vs RPMI = ρ <Q,005 c vs f = ρ <0,05 d vs g = ρ <Q,025

. · · I I «it·

Tabelle 3

NK-Aktivität ,. bei Verschiedenen Konzentrationen der Fragmente Fc, Fab, IgG

π Schach't Produkt

Fc

Fab IgG

RPMI

M-ES % cytotoxizität

_/ug

39,7 *

37,5 - 7,7

33,7 -

37,5 - 8,4.

12

40,0 - 8,9

40,5 - 8,8

35,0 - 8

37,5 - 8,4

24

37,7 - 8,6

38,7 - 8,9

34,2 - 8,2

37,5 - 8,4

IDO

39,5 -

39,2 - 8,5

34,7 - 8,6

37,5 - 8,4

n= 4 Individuen

χ 50 effektive Zellen gegen 1 Target-Zelle

• ■

-37-3U4765

Tabelle 4: CML II

Verhältnis wirksamer Zellen: Target-Zelle SO : 1

% Cytoxizitat ■ M- SS η = 4 Individuen

ug/schacht

Fc

Fab IaG

RPMI η =

μσ

20,2-1,5{k)

21,0¹O,5 15,0-1,9(f)

24,1-2,6

na

21,5-1,75

20,2-1 ,1 16,7-1,4(σ)

24,1-2,6

16,5-2,3(a)

14,0-2,9(d) 16,7-1,3(h)

24,1-2,6

16,7-3 (b)

14,7-2,9(e) 15,5-2,3(1)

24,1-2,6

μg

15,5-2,7(c)

17,7-3,9 12,7-2,1(j)

24,1-2,6

a vs RPMI : p<0,025 e vs RPMI :p<0,025

b vs RPMI : p<0,050 f vs RPMI :p<0,005

c vs RPMI : p<0,025 σ vs RPMI :p<Q,005

d vs RPMI : p<0,025 h VS RPMI :p<0,005

vs RPMI : p<0,02 j vs RPMI : p<0,005 k vs f : p<0,05

Cell. eff. (10 J + 2 J R)

BL* : et 1 (2/6 _a1/6) SP* : _α I (7/- 1/7) GC* : αΰ (2/~ α2/6]

ML* : α 3 (2/5 α 3/5) MC* : _ay.D RP* : --"D

-38-

Tabelle 5: Aktivität von vorxnkubierten Zellen mit Fragmenten Fc, Fab und IgG

Produkt.· Konz._v

7,5ug η = 10

15 ug η = 23

30 ug η = 23

% SUPP. X* E.S.

Fc

17 - 5,6

31,2- 2,9 (a)

46,2- 5,9 (b)

Fab

18 - 4,7

22 - 3,8 (c)

22 - 3,4 (d)

IgG

20,2 - 3,43

43,5- 5,7 (e)

22,3- 4,2 <f)

RPMI

(Kontr.-)-15 - 2,3

15 - 2,.

15 - 2,3

* Konz. /_mi/₁₀ ⁶LYinpho2y^i_Rp_t.₁i . _p <o,OO5 b vs RPHI : ρ <0,005 c et d vs RPMI : ρ NS e vs RPMI : ρ <0,005 f vs RPMI : ρ

Jf=

Tabelle 5 !Fortsetzung) Aktivität der Fragmente Fc, Fab, IgG gegen Allosensibilisierung

Test Suppr, A + B + Fc

A + (ABFc) + B

% Inhibierunq X

ES

PROD.

24 _/Ug

/"9

Fc

81 : 2,49 η = 12

75 - 5

84 '·■ 1,5

81 '■- 2,76

84 * 1,68

Fab

71 - 5,4

η =

ΐ 7,5

66 - 2,98

74 - 3,3

64,7 -

IgG

72 - 8,1 π -

76 - 2,8

90 - 2,29

89,3 - 2,82

79 - 3,7

63,7 ί 3,7 63,7 ϊ 3,7 I G3.7 - 3,7 63,7 - 3,7 63,7 - 3,7

Dr SC* = 3/7α 1/7 DP* = 1/7 α5/7 BV* = 1/7 αϊ/- MB* = S/-u 1/5

Fc 1,5, ίι, 24, 100 ,ug vs RPMh: ρ <0,005 Fc 3 ^ug vs KPMI : ρ « 0,05

IgG 3 ,u(| vs RPHl : ρ <0,0Si IGg 6, 21, 100 ^g vs Rl¹HI : ρ < 0,005

X) Konzentration 200 000 Cytotoxyten (respond.) die reagieren

CO

cn

Tabelle 5 (Fortsetzung)

Suppressiomstesat bei verschiedenen Konzentrationen von Suppressivzellen

Prod.

! 50.000* ! 25.000* 12.000«

! 6.000·

Fc

D + Sl* + Fc Fab

D + (¹OS+-)♦ + S*. % Supp X-ES

- 2,1

Ϊ 3,9

61,8

t 4,8 (a)

80 - 1,2

153,5 - 2,

51,3 - 8,4

30,6 - 1,5

IgG

74,6 ΐ 2,1

53,3 - 5,3

47 X 9,6

30,S - 7,5

Dr : 3/7 α 7/- η =

a vs b : ρ < 0,025

RPMl

80 - 1,8 !

61.5 ϊ 5,5 !

51,6 ΐ 10 !

24 - 5,6 (b) !

+) 1,5 ug /200 000 Lymphozyten (respondierend)

CO

CD

cn

Tabelle 5 (Fortsetzung)

Aktivität '3er Fragmente Fc, Fab, IgG im Suppressionstest mit allogener Respons I

T ES + supp

f\PROD icofic^x	N⁰ exp	RPHI :	Fc :	Fab :	IgG !
! δ ^ug	8	76,7 - 3 :	75,8 - 3,9 ·:	78,3 ΐ 3,3 :	70,3 ⁺_4,62 ;
j 12 _;ug	13	74,4 - 2,6 '	69*6 - 3,71	74,3 - 2,61	72,7 - 3,24
j 24 /ug	11	48,2 - 4,2	64,6 - 7,4	58,3 - 7,8	49,4 ί 4,83
j 50 _/ug	17	54,1 - 3,9	58,4 - 4,33	581,4 i 4	• 59,2 * 4,6
! 100 ^ug ; J 2	: 48,2 - 4„2	• 59,5 - 6,56	: 55,1 ί 7,4	: 52,3 - 5,5

Cell. Suppr. SB* : 5/7 B* 1/7 y al

BL* : B 2/13 L* 1/6 _ο ^a 1

PoPi* : P2 7/3 Pi* 7/H.^aS

CL* : G 5/7 L 2/5_5 et 2

RP* : R3/5 P 1/7 -, al

CD cn

• ■ ·

t 3ft«

-42-

34"U765

Tabelle 6: Produktion Gesamt-Immun_globuline über verschiedene ünterpopulationenvon Lymphozyten

Lymphozyten Percoll

: Verdünnung χ - ES über— — — —	2700- 1300	ng/ml	η = 4 ind.	RPMI :	PWM :
; stehende _: : Flüssigkei-j'c ■	-f. 255- 130	Fab :	IgG η= 5 :	630	1590-837 :
: 1/1 i	: 44^ 29	lOöoi 350 :	100-40	:205	:2l70-1850 :
I 1/5	: 25,4i 15	: 350- 202	53,4^23	:120	: 135-31 :
*: 1/25	: 81-42,7	ί 47,8^22	i 80	': 42-33 \
; 1/125	t2S,2~ 24	i 42,6^2U

? — I • ; ί ''	Lvmphozyten I	520-	χ i	ΕΞ	η = • : IgG	7 ind.	RPMI :	PWM :
1	-		160		- ·. +	18	200	1210-1000 :
i '	" Verdünnung überstehende Flüssigkeit _Fc	^- -. ⁺	63		; 5οί	20	SO	455-253 i
	1/1 :	13^	2-J		: A4-	Iff	05	11- 5 ]
	i 1/5		1 1		: -D-	16	60
ϊ 1/25
: 1/125	> na/nl Fab
229- 110
110- 47
'23,1- Π,5
:2Q,5- 10

0 0 0 9 · I (

-43-

Tabelle 6 (Fortsetzung) Lymphozyten aus peripherem Blut

	iden ^Fc i siflkeifc !	Fab ;	^Ig :	RFMi ;	pvjM ;
Verdünnung ~ ₊ '. <3er . X-ES ησ/ml η = 4 inc.	750-330 i	207-30 S	115-32 :	485 · :	2320^183 :
Über-j g-n^steheE	: 132- 31 \	•96,7-15	73,2-10	r185	390-197 . \
: 1/1 S	iss,2- 19	i65,7-14	ί 63,5-16	:120	: 74- 21 i
i "1/5	:37,2- 10	; 44-13	: 51/7^16,9	': 60	• 43- 16 1
: 1/25
: 1/125

Claims

Patentansprüche

1. Immunmodulierendes Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß sein Wirkstoff aus Fragmenten Fc von menschlichem Immunglobulin IgG oder Analogen dieser Fragmente zusammengesetzt ist und daß es frei ist von intaktem IgG und/oder von Fragmenten Fab oder daß es davon. nicht mehr als 2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht (Fc+Fab+IgG)f enthält, wobei die Analogen der Fragmente Fc von menschlichem IgG alles Fragmente oder ünterfragmente von Fc und synthetische Peptide oder halbsynthetische Peptide, die Peptidsequenzen enthalten, die im Fragment Fc vorkommen, sowie Derivate solcher Fragmente, ünterfragmente oder Peptide darstellen, mit der Maßgabe, daß diese Fragmente, ünterfragmente. Peptide oder Derivate folgende Bedingungen erfüllen:

daß sie die Eigenschaft von Aktivatoren der Differenzierung von suppressiven Zellen haben;

daß cie dip Eigenschaften von Inhibitoren der antikörperabhängigen Cytotoxyztfeat; haben;

daß sie nicht die Eigenschaften von Aktivatoren der Zellen NK aufweisen.

• 3

2. Arzneimittel nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, daß es nicht mehr als 1 Gew.-% von Fragmenten Fab und/oder intakten IgG enthält,-

3. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es frei ist von Fragmenten Fab und/oder intakten IgG.

4. Arzneimittel nach jedem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff aus Fragmenten Fc besteht,

5. Verwendung eines Fragments Fc von menschlichem IgG oder dessen Analogen, wie sie in Anspruch 1 definiert sind, zur Herstellung eines immunmodulierenden Arneimittels, das insbesondere ,zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten dient und in der Lage ist, Abstoßungsreaktionen %·■· verhüten oder die Wirkungen zu vermindern, die bei Krankheiten während oder nach einer Organverpflanzung auftreten bzw. aufgetreten sind.