FR3104582A1 - Variants de l’adalimumab au potentiel immunogène réduit - Google Patents

Abstract

L’invention concerne des variants de l’adalimumab au potentiel immunogène réduit et à l’affinité préservée ou augmentée et leurs applications thérapeutiques

Description

Variants de l’adalimumab au potentiel immunogène réduit

L’invention concerne des variants de l’adalimumab au potentiel immunogène réduit et à l’affinité préservée ou augmentée et leurs applications thérapeutiques.

Les maladies inflammatoires auto-immunes touchent une très large partie de la population, particulièrement dans les pays développés. La polyarthrite rhumatoïde qui est l’une des affections les plus répandues touche plus d’un million de personnes aux Etats-Unis (Hunter, T. M.et al.,Rheumatol. Int.(2017). doi:10.1007/s00296-017-3726-1). Les anti-TNF-alpha tels que l’Humira® (adalimumab), un anticorps IgG1 humain neutralisant le TNF-alpha, constituent un traitement symptomatique efficace pour une part importante de ces maladies inflammatoires auto-immunes. De ce fait, l’adalimumab est aujourd’hui largement utilisé dans le traitement de la spondylarthrite ankylosante, l’arthrite rhumatoïde, la rectocolite hémorragique, l’arthrite psoriasique, la maladie de Crohn, le psoriasis cutané et l’arthrite juvénile (Feldmann, M. & Maini,Nat. Med. 9, 1245–1250 (2003)). L’adalimumab s’avère cependant immunogène chez une part non négligeable des patients (jusqu’à 50% pour certaines affections) qui produisent des anticorps dirigés contre la protéine thérapeutique (ADA pour anti-drug antibody), détectables dans le sérum (Strand, V.et al.,BioDrugs 31, 299–316 (2017)). Les ADA engendrent la formation de complexes immuns accélérant l’élimination des anticorps thérapeutiques. En clinique, la présence d’ADA est inversement corrélée à la réponse au traitement. Les patients ayant une bonne réponse au traitement seront ceux chez qui les tests ne révèlent pas d’ADA (van Schouwenburg, P. A., Rispens, T. & Wolbink, G. J.,Nat. Rev. Rheumatol. 9, 164–172 (2013)).

En clinique le problème des ADA est traité par différentes approches. Il a été observé que l’augmentation des doses administrées permet de réduire l’effet des ADA. Ainsi les traitements se font souvent avec des doses croissantes au fur et mesure de l’immunisation des patients. D’autre part, les thérapies sont souvent co-administrées avec du méthotrexate, cet agent immunosuppresseur inhibe la production d’ADA et permet d’obtenir des résultats nettement améliorés Ces mesures sont cependant peu satisfaisantes dans la mesure où les patients continuent tout de même à s’immuniser contre la protéine (Emi Aikawa, N. et al.,Clin. Rev. Allergy Immunol. 38 ,82–89 (2010); Radstake, T.R.D.J.,Ann. Rheum. Dis., 68, 1739–1745 (2009)).

La suppression d’épitopes T par disruption de l’interaction avec les molécules HLA II, dénommée dé-immunisation, a été montrée comme une méthode efficace pour réduire l’immunogénicité de différentes protéines à visée thérapeutique, telles que des enzymes et des immunotoxines (Mazor, R.et al. Oncotarget 7, 29916–29926 (2016); Cantor, J. R.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 1272–1277 (2011); Ettinger, R. A.et al.,Blood Adv. 2, 309–322 (2018); Mazor, R.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, E3597-603 (2012)).

Différents épitopes T ont précédemment été identifiés dans la séquence de l’adalimumab (Meunier, S.et al., Cellular & Molecular Immunology, 2019, Oct 28. doi: 10.1038/s41423-019-0304-3). Ceux-ci sont principalement localisés sur la chaîne lourde de l’anticorps sur laquelle ils se répartissent en deux régions. La première région concentre la majorité des épitopes T et est très chevauchante avec le CDR-H3 (résidus L82c à T107 selon la numérotation de Kabat;Figure 1) .La seconde région est localisée au niveau du CDR-H2 et comporte deux épitopes T (résidus E46 à E64 selon la numérotation de Kabat;Figure 1) Ces épitopes T sont potentiellement à l’origine de l’immunogénicité de l’adalimumab. Celle-ci ayant des répercussions importantes chez les patients, le développement d’alternatives moins immunogènes que l’adalimumab semble une nécessité.

Toutefois, cette approche de dé-immunisation par suppression d’épitopes T n’est pas adaptée aux anticorps thérapeutiques qui sont des anticorps humanisés ou humains, étant donné que leurs épitopes T sont principalement présents au niveau des CDR qui sont essentiels pour l’activité biologique de l’anticorps thérapeutique (Hardinget al.,mAbs 2, 256-265 (2010)). En effet, ce sont les CDR qui déterminent la spécificité ainsi que l’affinité de l’anticorps pour l’antigène cible de l’anticorps thérapeutique.

Des variants de l’adalimumab dans lesquels les régions charpentes (FR) des domaines variables des chaînes lourdes et légères ont été remplacées par des régions charpentes moins immunogènes d’autres immunoglogulines G (IgG) humaines sont décrits dans la Demande EP 3178847. De tels variants ne possèdent pas une dé-immunisation satisfaisante pour une utilisation thérapeutique étant donné qu’ils comprennent la majorité des épitopes T présents dans les CDR.

Des variants de l’adalimumab comprenant des mutations dans une région contenant des épitopes T CD4 putatifs s’étendant de part et d’autre du CDR1 de la chaîne légère (CDR-L1; positions C23 à K45, selon la numérotation de Kabat) sont décrits dans la Demande WO 2010/121140. En dépit du choix des mutations pour ne pas diminuer significativement l’affinité des variants, tous les variants obtenus ont une affinité réduite pour le TNF-alpha par rapport à l’adalimumab, cette réduction d’affinité étant drastique (au moins 50 %) pour la majorité (70%) des variants obtenus.

En conséquence, il existe un besoin de disposer de nouveaux variants d’adalimumab qui soient mieux adaptés à leur utilisation thérapeutique en ce qu’ils présentent à la fois un potentiel immunogène réduit et une affinité intacte.

Les inventeurs ont identifié des mutations dans les régions immunogènes chevauchant les régions CDR-H2 (ou CDRH2) et CDR-H3 (ou CDRH3) de l’adalimumab qui réduisent l’immunogénicité tout en conservant l’affinité de liaison au TNF-alpha. A partir de banques combinatoires, ils ont isolé des variants qui de façon surprenante présentant un potentiel immunogène réduit et une affinité de liaison au TNF-alpha supérieure à celle de l’adalimumab. Certains des variants ont une affinité 5 à 50 fois supérieure à celle de l’adalimumab. Dans la mesure où l’activité biologique des anticorps anti-TNF -à savoir la neutralisation du TNF-alpha- dépend de leur affinité pour le TNF, on peut s’attendre à ce que les variants de l’invention aient une activité biologique supérieure à celle de l’adalimumab..

En conséquence, la présente invention a pour objet un variant d’un anticorps thérapeutique anti-TNF-alpha comprenant des domaines variables VH et VL de séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2, ledit variant comprenant au moins deux substitutions d’acides aminés dans au moins une séquence chevauchant l’une des régions CDRH2 ou CDRH3 déterminant la complémentarité dudit domaine variable VH;
lesdites au moins deux substitutions d’acides aminés dans la séquence chevauchant la région CDRH2 étant sélectionnées dans le groupe constitué par:
- la substitution de S49 par un autre acide aminé choisi parmi A ou G; de préférence G
- la substitution de A50 par un autre acide aminé choisi parmi G, S, T ou D;
- la substitution de T52 par un autre acide aminé choisi parmi A, N ou S; de préférence N ou S;
- la substitution S54G ;
- la substitution de I57 par un autre acide aminé choisi parmi A, H, N, Q, R, S, T ou W; de préférence A, H, S, N, Q, R ou T, de manière préférée R, H, S ou T; et lorsque le variant comprend le résidu A49 alors il comprend également le résidu N52, S52 ou T52 et le résidu G54;
lesdites au moins deux substitutions d’acides aminés dans la séquence chevauchant la région CDRH3 étant sélectionnées dans le groupe constitué par:
- la substitution de V89 par L;
- la substitution de V95 par un autre acide aminé choisi parmi A, S ou T;
- la substitution de S96 par un autre acide aminé choisi parmi A, G, H, K, N, Q, R ou T; de préférence T, Q, N ou H;
- la substitution de Y97 par H;
- la substitution de L98 par T;
- la substitution de S99 par P;
- la substitution de T100 par un autre acide aminé choisi parmi P ou S;
à l’exclusion des variants comprenant les résidus V89 ou L89, V95, K96, Y97, L98, P99 et S100; V89, V95, A96, Y97, L98, P99 et S100 ; les positions desdits résidus d’acides aminés étant indiquées en référence à la numérotation de Kabat; et ledit variant présentant un potentiel immunogène réduit et une affinité de liaison pour le TNF-alpha au moins égale ou supérieure, par rapport à l’anticorps thérapeutique anti-TNF-alpha dont il est issu.

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit variant comprend au moins 3 substitutions dans l’une des séquences chevauchant la région CDRH2 ou CDRH3; de préférence dans chacune .desdites séquences chevauchant les régions CDRH2 et CDRH3.

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH2 choisie parmi:
- S54G et I57R;
-T52N ou T52S, S54G et I57T, I57R, I57Q ou I57H;
- S49G, T52N et I57H;
- S49A ou S49G, S54G et I57T ou I57R;
- S49G, T52N, T52S ou T52A; S54G; et I57T, I57R, I57H, I57S,
I57Q ou I57N; et éventuellement A50T, A50G ou A50S;
- S49A, T52N ou T52S ; S54G; et I57T, I57R, I57H, I57Q, I57S ou
I57A;et
- S49G, T50G, S54G et I57R.

Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH2 choisie parmi:
(i) S49G, T52N et I57H; S49A, S54G et I57T; S49G, S54G et I57R; T52N,
S54G et I57T;
(ii) S49G, T52N, S54G et I57R; S49G, T52N, S54G et I57H; S49G, T52N,
S54G et I57T; S49G, T52N, S54G et I57S; S49G, T50G, T52N et I57H;
S49G, T52S, S54G et I57R; S49A, T52N, S54G et I57T; S49G, T52S,
S54G et I57N; S49G, T52S, S54G et I57Q; S49G, T50G, S54G et I57R;
S49G, T52S, S54G et I57H; S49G, T52S, S54G et I57T; S49G, T52S,
S54G et I57S; S49A, T52N, S54G et I57H; et
(iii) S49G, A50T, T52N, S54G et I57S; S49G, A50G, T52N, S54G et I57R;
S49G, A50S, T52N, S54G et I57R; S49G, A50D, T52S, S54G et I57T;
S49G, A50G, T52S, S54G et I57R;S49G, A50S, T52A, S54G et I57H;
S49G, A50S, T52S, S54G et I57R; S49G, A50S, T52A, S54G et I57T;
et S49G, A50S, T52A, S54G et I57S;
de préférence choisie parmi: S49G, T52N, S54G et I57R; S49G, A50T, T52N, S54G et I57S; S49G, T52N, S54G et I57H; S49G, T52N et I57H; S49G, A50D, T52S, S54G et I57T.

Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisie parmi:
- V95S, V95T ou V95A; et
- S96T, S96Q, S96N ou S96H; et
- S99P; et éventuellement V89L.

Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisie parmi:
(a) S96K et S99P;
(b) V95T, S96T et S99P; V95T, S96K et S99P;V95T, S96R et
S99P; V95T, S99P et T100S; V89L, S96K et S99P; S96T, S99P et
T100S; S96K, S99P; V95A, S96K et S99P; V95S, S96K et S99P; V95T,
S96G et S99P; S96K, S99P et T100P; V95T, S96H et S99P; V95T,
S96N et S99P; V95S, S96Q et S99P; V95A, S96H et S99P;
(c) V89L, V95T, S96N et S99P; V95T, S96T, S99P et T100S; V95A, S96H,
Y97H et S99P; V89L, S96K, L98T, S99P; S96T, L98T, S99P et T100S;
V89L, V95T, S96K et S99P; V95T, S96K, S99P et T100S; V95T, S96R
L98T et S99P; V89L, V95T, S96R et S99P; V89L; V95T, S96T
et S99P;
(d) V89L, V95T, S96T, S99P et T100S; V89L, S96K, L98T et S99P; V89L,
V95T, S96K, S99P et T100S; V89L,V95T, S96R, S99P et T100S.

Selon un mode de réalisation plus préféré de l’invention, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisie parmi: V95T, S96T et S99P; V95T, S96N et S99P; V95S, S96Q et S99P; V95A, S96H et S99P; V95T, S96G et S99P; S96T, L98T, S99P et T100S; V95T, S96R, L98T et S99P; S96K, S99P et T100P; V89L, V95T, S96T et S99P; de préférence choisie parmi: V95T, S96T et S99P; V95T, S96N et S99P; V95S, S96Q et S99P; V95A, S96H et S99P; V89L, V95T, S96T et S99P.

Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ledit variant comprend l’une des combinaisons suivantes de substitutions dans les séquences chevauchant les régions CDRH2 et CDRH3:
- S49G, T52N, S54G, I57R, V95S, S96Q et S99P;
- S49G, A50T, T52N, S54G, I57S, V95T, S96T et S99P;
- S49G, T52N, S54G, I57H, V95T, S96T et S99P;
- S49G, T52N et I57H, V95T, S96T et S99P;
- S49G, A50D, T52S, S54G et I57T, V95T, S96T et S99P;
- S49G, T52N, S54G, I57R, V89L, V95T, S96T et S99P;
- S49G, T52N, S54G, I57R, V95T, S96N et S99P;
- - S49G, T52N, S54G, I57R, V95A, S96H et S99P.

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit variant comprend en outre la substitution R90K dans la région CDRL3 déterminant la complémentarité du domaine variable VL.

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit variant comprend une chaîne lourde d’IgG humaine et une chaîne légère Kappa humaine.

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit variant est issu de l’adalimumab.

Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ledit variant,
comprend une chaîne légère de séquence SEQ ID NO: 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO: 24 à 31.

Un autre aspect de l’invention concerne un vecteur d’expression comprenant un polynucléotide codant pour un variant selon l’invention

Un autre aspect de l’invention concerne une composition pharmaceutique comprenant au moins un variant selon l’invention ou un vecteur selon l’invention, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable et/ou une substance porteuse.

Un autre aspect de l’invention concerne une composition selon l’invention, pour utilisation dans le traitement d’une maladie inflammatoire ou auto-immune.

La présente invention a pour objet un variant d’un anticorps thérapeutique anti-TNF-alpha comprenant des domaines variables VH et VL de séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2, lequel variant comprenant un potentiel immunogène réduit et une affinité de liaison au TNF-alpha au moins égale ou supérieure, par rapport à l’anticorps thérapeutique anti-TNF-alpha dont il est issu.

Du fait de son affinité de liaison au moins égale ou supérieure, on peut s’attendre à ce que le variant selon l’invention possède une activité biologique au moins égale ou supérieure à celle de l’anticorps parent.

La séquence SEQ ID NO: 1 correspond à la séquence du domaine variable de chaine lourde (VH) de l’adalimumab et la séquence SEQ ID NO: 2 à la séquence du domaine variable de chaine légère (VL) de l’adalimumab (Figure 1). La séquence de la chaîne lourde de l’adalimumab correspond à la séquence SEQ ID NO: 3 et la séquence de la chaîne légère de l’adalimumab correspond à la séquence SEQ ID NO: 4.

Définitions
On entend par anticorps thérapeutique, un anticorps humain ou humanisé.
On entend par anticorps, un anticorps entier, un fragment d’anticorps comprenant au moins le domaine de liaison à l’antigène ou une molécule dérivée d’un anticorps..
On entend par TNF-alpha ou TNFalpha («Tumor Necrosis Factor Alpha») une cytokine pro-inflammatoire multifonctionnelle produite de façon prédominante par les monocytes et les macrophages. De préférence, il s’agit du TNF alpha humain. Le TNF alpha humain correspond à la séquence GenBank QCI55793.1.
Les termes «variant» et «mutant» sont utilisés de façon interchangeable.
On entend par potentiel immunogène réduit relativement à un variant d’anticorps selon l’invention, une diminution du nombre de molécules HLA II pouvant être liées par au moins l’un des épitopes T CD4 du variant comparativement à l’anticorps parent dont il est issu. Le nombre de molécules HLA II pouvant être lié par un variant selon l’invention est évalué selon les techniques standards connues de l’Homme du métier telles celles décrites en particulier dans les exemples. Il s’agit notamment de méthodesin silicoutilisant des outils de prédiction de liaison au CMH-II, tel que l’algorithme netMHCIIpan 3.2. (Jensen, K. K.et al.,Immunology 154, 394–406 (2018)). La liaison à HLA II est exprimée sous la forme d’un score défini par la formule suivante:
[Math 1]
où le core est un core de liaison non-humain prédit par netMHCIIpan3.2; core_>20%= 0 and core_<20%= 1.iest la première position d’ancrage du core etjest l’allèle pour lequel le core est prédit. Le variant selon l’invention est caractérisé par un score de liaison à HLA II diminué d’au moins 10 % (1,1 fois ou facteur 1,1) par rapport à l’anticorps parent dont il est issu.
L’affinité de liaison du variant au TNF-alpha est évaluée selon les techniques standards connues de l’Homme du métier telles celles décrites en particulier dans les exemples. L’affinité peut être évaluée par la valeur de la constante de dissociation à l’équilibre K_Ddu variant, mesurée par les techniques conventionnelles telles que décrites dans les exemples. L’affinité peut également être évaluée par le facteur d’enrichissement relatif du variant par rapport à l’anticorps parent qui correspond au rapport entre les valeurs d’enrichissement du variant et de l’anticorps parent telles que définies dans les exemples. Le variant selon l’invention est caractérisé par un facteur d’enrichissement relatif supérieur ou égal à 5 ou un K_Dau moins 1,1 fois inférieur (inférieur d’un facteur 1,1 ou de 10 %) par rapport à l’anticorps parent dont il est issu.
On entend par individu, un individu humain ou animal, de préférence un individu humain.
Les acides aminés sont indiqués en code à une lettre.
Les positions des résidus d’acides aminés sont indiquées en référence à la numérotation de Kabat(Figure 1).
- Sauf indication contraire, un, signifie au moins un, et ou signifie et/ou.

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit variant comprend au moins deux substitutions d’acides aminés dans au moins une séquence chevauchant l’une des régions CDRH2 ou CDRH3 déterminant la complémentarité dudit domaine variable VH. La séquence chevauchant la région CDRH2 s’étend des résidus E46 à E64 selon la numérotation de Kabat (SEQ ID NO: 8). La séquence chevauchant la région CDRH3 s’étend des résidus V89 à G104 selon la numérotation de Kabat (SEQ ID NO: 9). Ledit variant comprend avantageusement au moins deux substitutions dans chacune des deux séquences chevauchant la région CDRH2 ou CDRH3. De préférence, ledit variant comprend au moins 3 substitutions, généralement 3, 4 ou 5 substitutions dans l’une des séquences chevauchantes; de manière préférée, dans chacune des deux séquences chevauchant les régions CDRH2 et CDRH3.

Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, lesdites au moins deux substitutions d’acides aminés dans la séquence chevauchant la région CDRH2 sont sélectionnées dans le groupe constitué par:
- la substitution de S49 par un autre acide aminé choisi parmi A ou G;
- la substitution de A50 par un autre acide aminé choisi parmi G, S, T ou D;
- la substitution de T52 par un autre acide aminé choisi parmi A, N ou S;
- la substitution S54G;
- la substitution de I57 par un autre acide aminé choisi parmi A, H, N, Q, R, S, T, ou W; et lorsque le variant comprend le résidu A49 alors il comprend également le résidu N52, S52 ou T52 et le résidu G54; et les positions desdits résidus d’acides aminés étant indiquées en référence à la numérotation de Kabat.

Les variants selon l’invention sont des variants fonctionnels, c’est-à-dire qu’ils comprennent un potentiel immunogène réduit et une affinité de liaison au TNF-alpha au moins égale ou supérieure, par rapport à l’anticorps thérapeutique anti-TNF-alpha dont il est issu. L’invention exclut les variants non fonctionnels tels que notamment les variants comprenant uniquement deux substitutions choisies parmi T52N et A50G ou T52N et I57T.

De préférence,
- S49 est substitué par G;
- T52 est substitué par N ou S; et
- I57 est substitué par A, H, S, N, Q, R, T, de préférence R, H, S ou T.

De manière avantageuse, lesdites substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH2 sont choisies parmi les substitutions en positions S49, A50, T52, S54, H56 et I57. De préférence, lesdites substitutions sont aux positions S54 et I57; S49, T52 et I57; S49, S54 et I57; T52, S54 et I57; S49, T50, T52 et I57; S49, T50, S54 et I57; S49, T52, S54 et I57; T50, T52, S54 et I57; ou S49, T50, T52, S54 et I57; de manière préférée aux positions S49, T52 et I57; S49, S54 et I57; T52, S54 et I57; S49, T50, S54 et I57; S49, T52, S54 et I57; T50, T52, S54 et I57; ou S49, T50, T52, S54 et I57.

De préférence, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH2 choisie parmi:
- S54G et I57R;
-T52N ou T52S, S54G et I57T, I57R, I57Q ou I57H;
- S49G, T52N et I57H;
- S49A ou S49G, S54G et I57T ou I57R;
- S49G, T52N, T52S ou T52A; S54G; et I57T, I57R, I57H, I57S,
I57Q ou I57N; et éventuellement A50T, A50G ou A50S;
- S49A, T52N ou T52S ; S54G; et I57T, I57R, I57H, I57Q, I57S ou
I57A;
- S49G, T50G, S54G et I57R.

De manière préférée, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH2 choisie parmi:
(a) S54G et I57R;
(b) S49G, T52N et I57H;
(c) S49A, S54G et I57T; S49A, S54G et I57R; S49G, S54G et I57R
(d) T52S, S54G et I57R; T52S, S54G et I57Q; T52S, S54G et
I57T; T52S; S54G et I57H; T52N, S54G et I57R; T52N, S54G et I57T;
(e) S49G, T50G, T52N et I57H;
(f) S49G, T50G, S54G et I57R;
(g) S49A, T52N, S54G et I57R; S49A, T52N, S54G et I57T; S49A, T52N,
S54G et I57H; S49A, T52S, S54G et I57R; S49G, T52S,
S54G et I57R; S49G, T52N, S54G et I57R; S49A, T52S, S54G et I57T;
S49A, T52S, S54G et I57Q; S49A, T52S, S54G et I57H; S49G, T52S,
S54G et I57T; S49A, T52N, S54G et I57H; S49A, T52S, S54G et I57S;
S49A, T52S, S54G et I57A; S49G, T52S, S54G et I57H; S49G, T52S,
S54G et I57R; S49G, T52S, S54G et I57N; S49G, T52S, S54G et I57Q;
S49G, T52S, S54G et I57T; S49G, T52S, S54G et I57S; S49G, T52N,
S54G et I57T; S49G, T52N, S54G et I57S; S49G, T52N, S54G et I57H;
(h) T50S, T52A, S54G et I57W; et
(i) S49G, A50T, T52N, S54G et I57S; S49G, A50G, T52N, S54G et I57R;
S49G, A50S, T52N, S54G et I57R; S49G, A50D, T52S, S54G et I57T;
S49G, A50G, T52S, S54G et I57R;S49G, A50S, T52A, S54G et I57H;
S49G, A50S, T52S, S54G et I57R; S49G, A50S, T52A, S54G et I57T;
et S49G, A50S, T52A, S54G et I57S.

De manière encore plus préférée, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH2 choisie parmi:
(i) S49G, T52N et I57H; S49A, S54G et I57T; S49G, S54G et I57R; T52N,
S54G et I57T;
(ii) S49G, T52N, S54G et I57R; S49G, T52N, S54G et I57H; S49G, T52N,
S54G et I57T; S49G, T52N, S54G et I57S; S49G, T50G, T52N et I57H;
S49G, T52S, S54G et I57R; S49A, T52N, S54G et I57T; S49G, T52S,
S54G et I57N; S49G, T52S, S54G et I57Q; S49G, T50G, S54G et I57R;
S49G, T52S, S54G et I57H; S49G, T52S, S54G et I57T; S49G, T52S,
S54G et I57S; S49A, T52N, S54G et I57H; et
(iii) S49G, A50T, T52N, S54G et I57S; S49G, A50G, T52N, S54G et I57R;
S49G, A50S, T52N, S54G et I57R; S49G, A50D, T52S, S54G et I57T;
S49G, A50G, T52S, S54G et I57R;S49G, A50S, T52A, S54G et I57H;
S49G, A50S, T52S, S54G et I57R; S49G, A50S, T52A, S54G et I57T;
et S49G, A50S, T52A, S54G et I57S.

Des variants particulièrement préférés selon l’invention comprennent l’une des combinaisons de substitutions suivantes dans la séquence chevauchant la région CDRH2: S49G, T52N, S54G et I57R; S49G, A50T, T52N, S54G et I57S; S49G, T52N, S54G et I57H; S49G, T52N et I57H; S49G, A50D, T52S, S54G et I57T.

Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, lesdites au moins deux substitutions d’acides aminés dans la séquence chevauchant la région CDRH3 sont sélectionnées dans le groupe constitué par:
- la substitution de V89 par L;
- la substitution de V95 par un autre acide aminé choisi parmi A, S ou T;
- la substitution de S96 par un autre acide aminé choisi parmi A, G, H, K, N, Q, R ou T;
- la substitution de Y97 par H;
- la substitution de L98 par T;
- la substitution de S99 par P;
- la substitution de T100 par un autre acide aminé choisi parmi P ou S; à l’exclusion des variants comprenant les résidus V89 ou L89, V95, K96, Y97, L98, P99 et S100; V89, V95, A96, Y97, L98, P99 et S100; les positions desdits résidus d’acides aminés étant indiquées en référence à la numérotation de Kabat.

De préférence, S96 est substitué par T, Q, N ou H.

De manière avantageuse, lesdites substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 sont choisies parmi les substitutions en positions: V89, V95, S96, Y97, L98, S99 et T100. De préférence, lesdites substitutions sont aux positions V89, V95, S96 et S99 ou V95, S96 et S99.

De manière préférée, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisie parmi:
- V95S, V95T ou V95A; et
- S96T, S96Q, S96N ou S96H; et
- S99P; et éventuellement V89L.

Ledit variant comprend avantageusement une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisie parmi:
(a) S96K et S99P;
(b) V95T, S96T et S99P; V95T, S96K et S99P;V95T, S96R et
S99P; V95T, S99P et T100S; V89L, S96K et S99P; S96T, S99P et
T100S; S96K, S99P; V95A, S96K et S99P; V95S, S96K et S99P; V95T,
S96G et S99P; S96K, S99P et T100P; V95T, S96H et S99P; V95T,
S96N et S99P; V95S, S96Q et S99P; V95A, S96H et S99P;
(c) V89L, V95T, S96N et S99P; V95T, S96T, S99P et T100S; V95A, S96H,
Y97H et S99P; V89L, S96K, L98T, S99P; S96T, L98T, S99P et T100S;
V89L, V95T, S96K et S99P; V95T, S96K, S99P et T100S; V95T, S96R
L98T et S99P; V89L, V95T, S96R et S99P; V89L; V95T, S96T
et S99P;
(d) V89L, V95T, S96T, S99P et T100S; V89L, S96K, L98T et S99P; V89L,
V95T, S96K, S99P et T100S; V89L,V95T, S96R, S99P et T100S.

De manière plus préférée, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisie parmi:V95T, S96T et S99P; V95T, S96N et S99P; V95S, S96Q et S99P; V95A, S96H et S99P; V95T, S96G et S99P; S96T, L98T, S99P et T100S; V95T, S96R, L98T et S99P; S96K, S99P et T100P; V89L, V95T, S96T et S99P.

Des variants particulièrement préférés selon l’invention comprennent l’une des combinaisons suivantes de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3: V95T, S96T et S99P; V95T, S96N et S99P; V95S, S96Q et S99P; V95A, S96H et S99P; V89L, V95T, S96T et S99P.

Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ledit variant comprend au moins deux substitutions dans chacune des deux séquences chevauchant la région CDRH2 ou CDRH3 telles que définies ci-dessus.De préférence, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH2 et une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisies parmi les combinaisons telles que définies ci-dessus.

Des variants particulièrement préférés selon l’invention comprennent:
- l’une des combinaisons suivantes de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH2: S49G, T52N, S54G et I57R; S49G, A50T, T52N, S54G et I57S; S49G, T52N, S54G et I57H; S49G, T52N et I57H; S49G, A50D, T52S, S54G et I57T; et
- l’une des combinaisons suivantes de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3: V95T, S96T et S99P; V95T, S96N et S99P; V95S, S96Q et S99P; V95A, S96H et S99P; V89L, V95T, S96T et S99P.

Des exemples de variants particulièrement préférés selon l’invention comprennent l’une des combinaisons suivantes de substitutions dans les séquences chevauchant les régions CDRH2 et CDRH3:
- S49G, T52N, S54G, I57R, V95S, S96Q et S99P;
- S49G, A50T, T52N, S54G, I57S, V95T, S96T et S99P;
- S49G, T52N, S54G, I57H, V95T, S96T et S99P;
- S49G, T52N et I57H, V95T, S96T et S99P;
- S49G, A50D, T52S, S54G et I57T, V95T, S96T et S99P;
- S49G, T52N, S54G, I57R, V89L, V95T, S96T et S99P;
- S49G, T52N, S54G, I57R, V95T, S96N et S99P;
- - S49G, T52N, S54G, I57R, V95A, S96H et S99P.

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit variant comprend en outre la substitution R90K dans la région CDRL3 déterminant la complémentarité du domaine variable VL.

Le variant selon l’invention comprend une chaîne lourde d’immunoglobuline humaine de n’importe quel isotype ou classe, de préférence une IgG, de manière préférée une IgG1. Le variant selon l’invention comprend également une chaîne légère d’immunoglobuline humaine de n’importe quelle classe, de préférence une chaîne légère Kappa humaine.

Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ledit variant est issu de l’adalimumab. De préférence, ledit variant est sélectionné dans le groupe constitué par:
- un variant de l’adalimumab comprenant une chaîne légère de séquence SEQ ID NO: 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO: 24, correspondant au mutant 1 des exemples;
- - un variant de l’adalimumab comprenant une chaîne légère de séquence SEQ ID NO: 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO: 25, correspondant au mutant 2 des exemples;
- un variant de l’adalimumab comprenant une chaîne légère de séquence SEQ ID NO: 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO: 26, correspondant au mutant 3 des exemples;
- un variant de l’adalimumab comprenant une chaîne légère de séquence SEQ ID NO: 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO: 27, correspondant au mutant 4 des exemples;
- un variant de l’adalimumab comprenant une chaîne légère de séquence SEQ ID NO: 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO: 28, correspondant au mutant 5 des exemples;
- un variant de l’adalimumab comprenant une chaîne légère de séquence SEQ ID NO: 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO: 29, correspondant au mutant 6 des exemples;
- un variant de l’adalimumab comprenant une chaîne légère de séquence SEQ ID NO: 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO: 30, correspondant au mutant 7 des exemples; et
- un variant de l’adalimumab comprenant une chaîne légère de séquence SEQ ID NO: 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO: 31, correspondant au mutant 8 des exemples.

Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ledit variant est caractérisé par un score de liaison à HLA II diminué d’au moins 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5 fois ou plus par rapport à l’anticorps parent dont il est issu.

. Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ledit variant est caractérisé par un facteur d’enrichissement relatif d’au moins 10¹à 10⁷(10¹, 5.10¹, 10², 5.10²,10³, 5.10³, 10⁴, 5.10⁴, 10⁵, 5.10⁵, 10⁶, 5. 10⁶, 10⁷) ou un K_Dau moins 1,2 à 40 fois inférieur (2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35) par rapport à l’anticorps parent dont il est issu.

La présente invention englobe également les variants comprenant en outre, au moins une mutation (insertion, délétion, substitution) d’acide aminé additionnelle et/ou au moins une modification conservatrices de fonction, c’est-à-dire qui préservent le potentiel immunogène réduit et l’affinité supérieure ou égale du variant. Parmi les mutations additionnelles, on peut citer notamment:
- la substitution de A60 par un autre acide aminé choisi parmi S, N ou D;
- la substitution de D61 par un autre acide aminé choisi parmi P, G, T, N, Q, E, H ou K; et
- la substitution de S62 par un autre acide aminé choisi parmi F, Y, W, A, G, Q, D ou E;
- la substitution de A100A par S;
- la substitution de S100B par G, N ou D;
- la substitution de S100C par Y, W, P ou Q; et
- la substitution de Y102 par W, I, V, A, G, S, T, Q, E, H, K ou R;
- la substitution de T52 par G;
- la substitution de I57 par un autre acide aminé choisi parmi E, K, Y ou V;
- la substitution de V89 par T;
- la substitution de V95 par un autre acide aminé choisi parmi G, N ou P; - la substitution de Y97 par W;
- la substitution de L98 par un autre acide aminé choisi parmi F, Y, M ou H; et
- la substitution de S99 par T; et les combinaisons des substitutions précédentes.

Le variant peut être modifié par l’introduction de toute modification conservatrice de fonction au niveau de résidu(s) d’acide aminé, de la liaison peptidique ou des extrémités des peptides. Cette ou ces modification(s), en particulier une ou des modifications chimiques qui sont introduites dans les peptides par les méthodes classiques connues de l’Homme du métier, incluent notamment; la fusion de la séquence dudit variant avec celle d’une d’un peptide (étiquette utile pour la purification du variant, notamment sous forme clivable par une protéase) ou d’une protéine d’intérêt, et le couplage à une molécule ou un agent d’intérêt. Par exemple, l’anticorps peut être couplé à une molécule de PEG par les méthodes conventionnelles connues de l’homme du métier

Le variant est sous forme d’un anticorps entier, d’un fragment d’anticorps comprenant au moins le domaine de liaison à l’antigène ou d’une molécule dérivée d’un anticorps. Les anticorps entiers peuvent être de n’importe quel isotype, en particulier d’isotype humain (IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA (IgA1,IgA2), IgE, IgM, IgD). Les fragments d’anticorps incluent notamment les fragments Fab, Fab’, F(ab’)₂, Fv, scFv, Fabc ou Fab comprenant une portion de la région Fc et les fragments d’anticorps à chaîne unique dérivés d’immunoglobulines de camélidé ou de requin (anticorps simple domaine V_HH et V-NAR). Les molécules d’anticorps dérivées incluent les anticorps polyspécifiques ou multivalents et les immunoconjugués. A titre d’exemple non-limitatif on peut citer les scFv multispécifiques (dia, tria ou tetrabodies), par exemple diabodies du type scDb («single-chain diabodies») ou taFv («tandem scFv fragments) et les minibodies. Les minibodies sont notamment du type scFv-HLX; scFv-ZIP; scFv-CH3; scFv –Fc ou autre.

Un autre aspect de la présente invention concerne un polynucléotide isolé codant pour un variant conforme à l’invention tel que défini ci-dessus. Ledit polynucléotide, est un ADN, un ARN ou un mélange d’ADN et d’ARN, recombinant ou synthétique. La séquence de l’ADN peut avantageusement être modifiée de façon à ce que l’usage des codons soit optimal chez l’hôte dans lequel elle est exprimée.

Un autre aspect de la présente invention concerne un vecteur comprenant ledit polypeptide. De nombreux vecteurs sont connus en eux-mêmes; le choix d’un vecteur approprié dépend de l’utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d’intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l’hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser des acides nucléiques nus (ADN ou ARN) ou des vecteurs viraux ou bactériens. Les vecteurs viraux sont notamment les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus et les AAV dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d’intérêt; on peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules hôtes, telle qu’un transporteur comme un nanotransporteur ou une préparation de liposomes, ou de polymères cationiques, ou bien l’introduire dans ladite cellule hôte en utilisant des méthodes physiques telles que l’électroporation ou la microinjection. En outre, on peut avantageusement combiner ces méthodes, par exemple en utilisant l’électroporation associée à des liposomes.

De préférence, ledit vecteur est un vecteur d’expression comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression du variant tel que défini ci-dessus. Par exemple, ledit vecteur comprend une cassette d’expression incluant au moins un polynucléotide tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation, site d’épissage), pour permettre l’expression du variant conforme à l'invention dans une cellule de l’hôte.

Un autre aspect de la présente invention concerne une cellule hôte procaryote ou eucaryote modifiée par un polynucléotide ou un vecteur conforme à l’invention tel que défini ci-dessus, la cellule pouvant être modifiée de façon stable ou transitoire.

Un autre aspect de la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant au moins un variant, polynucléotide, vecteur, et/ou cellule dérivés tels que définis ci-dessus et un véhicule pharmaceutiquement acceptable et/ou une substance porteuse.

Les véhicules pharmaceutiquement acceptables et les substances porteuses sont celles classiquement utilisés.

Les substances porteuses sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par : les liposomes unilamellaires ou multilamellaires, les ISCOMS, les virosomes, les pseudoparticules virales, les micelles de saponine, les microsphères solides de nature saccharidique (poly(lactide-co-glycolide)) ou aurifère, et les nano-particules.

La composition pharmaceutique peut comprendre en outre au moins un autre agent thérapeutique, notamment un agent antiinflammatoire ou immunomodulateur.

La composition pharmaceutique comprend une quantité thérapeutiquement active de variant, polynucléotide, vecteur, cellule. Une quantité thérapeutiquement active signifie une dose suffisante pour produire un effet thérapeutique sur la maladie à traiter, c’est-à-dire diminuer les symptômes de cette maladie. Cette dose efficace est déterminée et ajustée en fonction de facteurs tels que l’âge, le sexe et le poids du sujet. La composition pharmaceutique selon l’invention se présente sous une forme galénique adaptée l’administration choisie. La composition est généralement administrée selon les protocoles usuels d’immunothérapie à des doses et pendant une durée suffisante pour induire une réponse efficace contre la pathologie à traiter. L'administration peut être sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, notamment par perfusion; intradermique, intrapéritonéale, orale, sublinguale, rectale, vaginale, intra-nasale, par inhalation ou par application transdermique. La composition se présente sous une forme galénique adaptée à une administration choisie.

La composition pharmaceutique selon la présente invention est utilisée en immunothérapie dans le traitement de pathologies inflammatoires ou auto-immunes. Elle peut être utilisée en combinaison avec d’autres traitements, thérapeutique ou chirurgical, notamment en combinaison avec d’autres agents thérapeutiques tels que définis ci-dessus, la composition selon l’invention et les autres agents thérapeutiques pouvant être administrés de façon simultanée, séparée ou séquentielle.

Les pathologies inflammatoires ou auto-immunes sont celles qui sont classiquement traitées par les anti-TNF-alpha. A titre d’exemples non-limitatifs de ces pathologies on peut citer la spondylarthrite ankylosante, l’arthrite rhumatoïde, la rectocolite hémorragique, l’arthrite psoriasique, la maladie de Crohn, le psoriasis cutané et l’arthrite juvénile.

La présente invention a également pour objet un variant, polynucléotide, vecteur, et/ou cellule dérivés tels que définis ci-dessus pour utilisation comme médicament, en particulier en immunothérapie, dans le traitement de pathologies inflammatoires ou auto-immunes telles que définies ci-dessus.

La présente invention a également pour objet une méthode d’immunothérapie, en particulier destinée au traitement de pathologies inflammatoires ou auto-immunes telles que définies ci-dessus, caractérisée en ce qu’elle comprend l’administration d’une dose efficace d’un variant, polynucléotide, vecteur, et/ou cellule dérivés conformes à l’invention tels que définis ci-dessus, à un individu, par tout moyen approprié tel que défini ci-dessus. De préférence, la méthode comprend l’administration d’une composition pharmaceutique selon l’invention telle que définie ci-dessus.

Le polynucléotides selon l'invention sont obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes. Par exemple, ils peuvent être obtenus par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RT-PCR ou bien par synthèse chimique totale ou partielle. Les vecteurs recombinants d’expression eucaryote ou procaryote sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes. Il s’agit notamment des vecteurs d’expression classiquement utilisés pour la production d’anticorps, en particulier d’anticorps thérapeutiques humains ou humanisés tels que des vecteurs de type tandem permettant l’expression simultanée des chaînes lourde et légère d’anticorps. Les variants produits par les cellules hôte modifiées par le vecteur recombinant sont purifiés par les méthodes conventionnelles de purification des immunoglobulines, notamment par chromatographie d’affinité.

Les caractéristiques exposées dans les paragraphes précédents peuvent, optionnellement, être mises en œuvre. Elles peuvent être mises en œuvre indépendamment les unes des autres ou en combinaison les unes avec les autres:

D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l’identification et la caractérisation des variants selon la présente invention, ainsi qu’aux figures annexées, sur lesquels:

Fig.1

présente les séquences des parties variables de l’adalimumab. Les séquences sont numérotées selon la nomenclature Kabat. Les résidus non germinaux désignent les mutations par rapport aux allèles ayant la plus forte homologie. Les résidus impliqués dans l’interaction directe avec le TNFα sont issus de la structure publiée dans Hu et al. J. Biol. Chem. 288, 27059–27067 (2013). Le domaine variable de chaîne lourde (VH) correspond à la séquence SEQ ID NO: 1 et le le domaine variablede chaîne légère (VL) correspond à la séquence SEQ ID NO: 2.

Fig. 2

présente les épitopes T de l’adalimumab et cores d’interaction prédits. Les épitopes T de l’adalimumab ont été identifiés in vitro par test d’activation des lymphocytes T (données issues de Meunier et al.) Ils sont principalement localisés sur les CDR2 et CDR3 de la chaîne lourde. Un épitope isolé a également été identifié sur la chaîne légère au niveau du CDR3. Les cores d’interactions possible ont été prédits par l’algorithme netMHCIIpan en gris. Les cores majeurs, car prédit par un nombre important d’allèles, sont représentés en gris foncé. Séquence des positions P41 à F67 incluant le CDRH2 (SEQ ID NO: 5); Séquence des positions N82A à W103 incluant le CDRH3 (SEQ ID NO: 6); Séquence des positions L73 à Q100 incluant le CDRL3 (SEQ ID NO: 7).

Fig. 3

présente la prédiction des substitutions réduisant les scores d’immunogénicité sur l’interaction avec les molécules HLA II. L’algorithme de prédiction netMHCIIpan est utilisé de manière parallélisée pour prédire l’effet moyen que chaque substitution sur la liaison des peptides pour les molécules HLA de classe II. Un panel de 46 allèles de molécules HLA II couvrant 80% de la population mondiale a été utilisé ([Tableau 1]) et un seuil d’immunogénicité de 20%. Les mutations baissant les scores d’immunogénicité sont indiquées en dégradé de gris (plus foncé = moindre immunogénicité prédite). Séquence des positions E46 à E64 chevauchant le CDRH2 (SEQ ID NO: 8); Séquence des positions V89 à G104 chevauchant le CDRH3 (SEQ ID NO: 9).

Fig. 4

présente l’expression et sélection de librairies de Fab par Yeast Surface Display. A : La cassette d’expression est composée d’un promoteur bidirectionnel Gal1/Gal10 avec de part et autre la chaîne lourde et la chaîne légère de l’anticorps associé au peptide signal Aga2. La chaîne lourde est fusionnée au domaine Aga2P. B : L’expression de l’anticorps est analysée à l’aide d’un anticorps couplé APC dirigé contre le domaine Ck, et l’interaction est mesurée par une streptavidine couplée PE. Les banques de DMS sont triées par des fenêtres rectangulaires basées uniquement sur la fluorescence en PE.

Fig. 5

présente les substitutions du CDRH2 et du CDRH3 n’ayant pas d’impact sur la fonction de l’adalimumab par Deep Mutational Scanning. Matrices de permissivité du CDRH2 et du CDRH3 issues des populations triées positivement. Les mutants ayant un enrichissement supérieur ou égal à la séquence parentale sont indiqués en dégradé de gris. Plus le gris est foncé, plus l’enrichissement est fort, indiquant une bonne affinité pour le TNFα. Séquence des positions E46 à E64 chevauchant le CDRH2 (SEQ ID NO: 8); Séquence des positions V89 à G104 chevauchant le CDRH3 (SEQ ID NO: 9).

Fig. 6

présente les substitutions du CDRH2 et du CDRH3 combinant moindre immunogénicité prédite et maintien de la fonctionnalité (DMS), correspondant à la combinaison des Figures 3 et 5. Séquence des positions E46 à E64 chevauchant le CDRH2 (SEQ ID NO: 8); Séquence des positions V89 à G104 chevauchant le CDRH3 (SEQ ID NO: 9).

Fig. 7

représente les banques combinatoires pour la déimmunisation. Les cores d’interactions majeurs et leurs positions d’ancrage sont représentées en gris. Les banques ont été conçues de manière à être localisées sur ces cores d’interaction. Pour la banque portant sur le CDRH2, les codons dégénérés indiqués ont été utilisés. Pour la banque portant sur le CDRH3, des mix de trinucléotides correspondant pour chacune des positions au panel d’acides aminés indiqués ont été utilisés. Séquence des positions P41 à F67 incluant le CDRH2 (SEQ ID NO: 5); Séquence des positions N82A à W103 incluant le CDRH3 (SEQ ID NO: 6).

Fig. 8

présente le criblage des banques combinatoire par FACS. Les deux banques combinatoires portant sur le CDRH2 et le CDRH3 ont été criblée de manière indépendante. La première phase de sélection à l’équilibre comporte trois tris successifs à des concentrations décroissantes de TNFα biotinylé. Le premier tri à 3nM et le dernier à 500pM sont représentés sur cette figure. La seconde phase de sélection consiste à sélectionner les mutants sur leur vitesse de dissociation. Pour cela, les banques sont incubées 3h avec du TNFα biotinylé puis mise en compétition pendant 24h avec du TNFα non biotinylé. A l’issue des 24h, les banques sont triées pour sélectionner les mutants pour lesquels la vitesse de dissociation est la plus lente.

Fig. 9

présente l’évolution de la diversité en acides aminés au cours des différentes étapes de sélection. La diversité des acides aminés pour la zone du CDRH2 (A) est représentée avant et après les étapes de sélection à l’équilibre et cinétique. Pour le CDRH3 (B), la diversité est représentée à l’issue de la première étape de sélection magnétique puis après les étapes de sélection à l’équilibre et cinétique. Les acides aminés sont représentés en fonction de leur pourcentage dans un échantillon de 1000 séquences. L’acide aminé natif est représenté en gris et les substitutions en noir. Séquence des positions E46 à A60 incluant le CDRH2 (SEQ ID NO: 10); Séquence des positions D86 à S100C incluant le CDRH3 (SEQ ID NO: 11).

Fig. 10

présente le criblage de la banque combinatoire CDRH2-CDRH3. La première phase de sélection à l’équilibre comporte trois tris successifs à des concentrations décroissantes de TNFα biotinylé. Le premier tri à 3nM et le dernier à 500pM sont représentés sur cette figure. La seconde phase de sélection consiste à sélectionner les mutants sur leur vitesse de dissociation. Pour cela, la banque est incubée 3h avec du TNFα biotinylé puis mise en compétition pendant 24h avec du TNFα non biotinylé. A l’issue des 24h, la banque est triée pour sélectionner les mutants pour lesquels la vitesse de dissociation est la plus lente.

Fig. 11

présente l’analyse du potentiel immunogène des mutants d’intérêt. A : Prédiction par netMHCIIpan de la probabilité d’interaction avec les molécules HLA II à un seuil de 20% pour les mutants sélectionnés et la séquence native. Les prédictions sont données de manière indépendante pour la zone du CDRH2 et celle du CDRH3. B : Séquence des cores mutés (mutation en rouge) et effet de ces différentes mutations sur la prédiction de ces cores. ITWNSGHID (SEQ ID NO: 12); INWNGGHRD (SEQ ID NO: 13); INWNGGHSD (SEQ ID NO: 14); YYCAKVSYL (SEQ ID NO: 15); VSYLSTASS (SEQ ID NO: 16); YLSTASSLD (SEQ ID NO: 17); YYCAKSQYL (SEQ ID NO: 18); YYCAKTTYL (SEQ ID NO: 19); YYCAKAHYL (SEQ ID NO: 20); SQYLSTASS (SEQ ID NO: 21); TTYLSTASS (SEQ ID NO: 22); AHYLSTASS (SEQ ID NO: 23); YLPTASSLD (SEQ ID NO: 33).

Fig. 12

présente le détail de la prédiction netMHCIIpan pour l'adalimumab et les 3 mutants d'intérêt

Exemples

Matériels et méthodes

1. Construction des banques

Les banques de DMS ont été construites par assemblage PCR. Pour chaque position, une amorce sens comportant le codon dégénéré NNS a été utilisée pour rendre aléatoire l’acide aminé concerné. A l’issue de l’assemblage PCR, les gènes mutés sont purifiés sur gel de manière indépendante puis regroupés pour former une banque.

Pour les banques de déimmunisation, l’assemblage par PCR a également
été utilisé. Pour le CDRH2 la diversité a été introduite à l’aide de codons dégénérés choisi à l’aide de l’outil CodonCalculator (http://guinevere.otago.ac.nz/cgi-bin/aef/CodonCalculator.pl) et indiqués dans laFigure 7 .Pour le CDRH3 une amorce synthétisée par trinucléotides (Ella Biotech GmbH, Martinsread, Allemagne) a été utilisée afin d’insérer la diversité souhaitée.
La banque finale de déimmunisation a été construite par assemblage PCR à partir des plasmides extraits des banques CDRH2 et CDRH3 à l’issue de la sélection.

2. Transformation et sélection par YSD

Les banques ont été clonées dans un plasmide bicistronique dérivé du plasmide pCT-L7.5.126 (Addgene plasmide #429000) et décrit dans laFigure 4 .Comme le pCT-L7.5.126 il possède une origine de réplication levure CEN/ARS, un gène d’auxotrophie TRP, une origine de réplication bactérienne colE1, un gène de résistance à l’ampicilline et un promoteur bidirectionnel inductible au galactose GLA1/GAL10. Le clonage de la banque dans le plasmide d’expression en YSD a été réalisé par recombinaison homologue lors de la transformation de cellules EBY100 (ATCCÒ MYA- 4941TM;a GAL1-AGA1:: URA3 ura3-52 trp1 leu2 D1 his3 D200 pep4:: HIS2 prb1D1.6R can1 GAL) comme décrit dans la partie précédente. Pour chacune des transformations 3 µg de plasmide linéarisé (NheI et SalI pour VH, NcoI et Pfl23II pour VL) et 6 µg d’insert ont été utilisé pour chacune des transformations. Toutes les banques ont été générées par électroporation selon la méthode décrite par Benatuilet al. Protein Eng. Des. Sel. 23, 155–159 (2010). Chaque banque a été transformée en une seule réaction (environ 5.10⁷clones indépendants obtenus par réaction) à l’exception de la banque de déimmunisation du CDRH3 ayant nécessité deux réactions compte tenu de sa diversité. Le nombre de clones transformés a été déterminé à partir d’un étalement d’une dilution au 1: 1000, un nombre de clones transformés au moins dix fois supérieur à la taille de la banque a été respecté. Les banques ainsi clonées dans le plasmide ont été cultivées en milieu SD-CAA [6,7 g/L yeast nitrogen base without casamino acids, 20 g/L dextrose, 5 g/L casamino acids, 100 mM sodium phosphate pH 6.0] et ont été passées deux fois avant d’induire l’expression en milieu SG-CAA [6.7 g/L yeast nitrogen base without casamino acids, 20 g/L galactose, 5 g/L casamino acids, 100 mM sodium phosphate, pH 6.0] afin de minimiser les doubles transformants. Les étapes de culture et d’expression ont été réalisées selon la description faite dans la partie précédente.

La sélection des banques de DMS a été faite en une seule étape par FACS sur un appareil ARIA III (Becton Dickinson, Franklin Lakes, États-Unis). Après induction de l’expression, les banques ont été incubées 3h à 20°C avec du TNFα biotinylé (ACROBiosystems, Newark, États-Unis) à une concentration de 80pM. Après lavage des cellules avec du PBS 0,1% BSA celles-ci ont été marquées à l’aide d’un anticorps dirigé contre le domaine Cκ couplé APC (Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis; dilution 1:100) et d’une streptavidine couplée PE (Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis; dilution 1:100). La sélection des banques a été faite à l’aide de fenêtre de tri rectangulaire contenant 5% des clones d’intérêt selon les paramètres optimaux décrit par Kowalskiet al.PLoS One 10, 1–23 (2015)). La sélection des banques de déimmunisation a été réalisée en plusieurs étapes. Après un éventuel tri magnétique à l’aide de billes magnétiques anti-biotine (Miltenyi Biotec, Bergisch, Allemagne) après 3h d’incubation à 20°C à une concentration de 10nM de TNFα biotinylé comme décrit par Chaoet al. Nat Protoc 1, 755–768 (2006). Les banques ont subi différentes étapes de tri par FACS. Tout d’abord trois étapes successives de tri à l’équilibre à des concentrations décroissantes de TNFα biotinylé (3nM, 1nM puis 500pM) puis une étape de sélection sur la vitesse de dissociation. Pour chacun des tris l’expression des Fab a été induite puis les cellules ont été incubées 3h à 20°C avec le TNFα biotinylé avant d’être triées par FACS. Pour le tri cinétique sur la vitesse de dissociation, les cellules ont été incubées 3h avec 20nM de TNFα biotinylé, puis elles ont été lavées et incubées 24h avec du TNFα non biotinylé (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Etats-Unis) avant d’être triées par FACS.
3. Séquençage NGS des banques et analyse des données

Les plasmides ont été extraits des cellules par lyse enzymatique à l’aide du kit Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II (Zymo Research, Irvine, Etats-unis). Les fragments correspondants ont ensuite été amplifiés et les adaptateurs illumina et étiquettes de multiplexage ajoutés par 2 étapes de PCR comme décrit par Kowalsky, C. A.et al. PLoS One 10, 1–23 (2015). Les banques ont été séquencées en paired-end sur un MiSeq à l’aide d’un kit V2 2x150 cycles ou sur un iSeq toujours en 2x150 cycles (Illumina, San Diego, Etats-unis). Pour les banques de DMS une profondeur de séquençage de 50X minimum a été respectée.

Les séquences ont été démultiplexées et traitées de manière indépendante sur la plateforme Galaxy (https://usegalaxy.org/) à l’aide des fonctions décrites par Blankenberg et al.,Bioinformatics 26, 1783–1785 (2010). Les séquences sont appariées (fasrq-join) et seules les séquences ayant un score de qualité supérieure ou égal à 30 sont conservées (FASTQ Quality Trimmer). Les séquences sont ensuite alignées (Align.seqs) et seule la région d’intérêt est conservée (Chop.seqs). Enfin les séquences sont traduites (transeq) et les séquences identiques sont dénombrées et agrégées (Group). L’évolution de la diversité à chacune des positions a été représentée sous forme de weblogo (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) générés à partir d’un échantillon de mille séquences.

Ces données sont ensuite traitées avec le logiciel R afin de calculer les fréquences des différents mutants et ainsi déterminer leur enrichissement comme suit: Où est la fréquence du mutant i avant la sélection et à l’issue de la sélection.
Pour les résultats du DMS sous forme de matrice, les mutants sont représentés par une valeur sélective tenant compte de l’enrichissement de la séquence native : Où est la fréquence de la séquence native avant la sélection et à l’issue de la sélection.
4. Prédiction de l’interaction peptide/molécule HLA II

Les prédictions d’interaction avec les molécules HLA II ont été réalisées à l’aide de l’algorithme netMHCIIpan 3.2. (Jensen, K. K.et al.,Immunology 154, 394–406 (2018)). Brièvement cet algorithme prédit la probabilité d’interaction d’une séquence avec des molécules HLA II choisies et fourni un résultat pour chaque allèle relatif à un ensemble de peptide. Une valeur de 1% pour un peptide signifie qu’il se situe parmi les 1% des peptides ayant la plus forte probabilité d’interaction avec les molécules HLA II. Pour cette étude nous avons utilisé une valeur seuil de 20% en dessous de laquelle les peptides sont considérés comme immunogènes, ainsi chaque core non humain en dessous du seuil de 20% pour un allèle compte pour une unité dans le score. Pour les hitmaps les scores sont donnés de manière relative par rapport à la séquence native, les scores négatifs traduisent une diminution du nombre de peptides en dessous du seuil de 20%.. Pour chacune des prédictions réalisées, c’est le panel de 46 allèles publié par McKinneyet al., couvrant plus de 80% des phénotypes pour chaque locus, qui a été utilisé (McKinney, D. M.et al.,Immunogenetics 65, 357–370 (2013)). ([Tableau 1] ) .

[Tableau 1] Fréquence phénotypique et génotypique du panel de molécules HLA II utilisé (issu (McKinney, D. M.et al., précité)

De plus, un ensemble de séquences recouvrant les gènes d’immunoglobulines humaines les plus fréquents a été utilisé afin d’évaluer le caractère humain ou non de chacun des cores.

5. Production et Purification de Fab et d’IgG

Les mutants 1 à 8 ainsi que l’adalimumab natif ont été produit au format Fab, les mutants d’intérêt (1, 2 et 7) et l’adalimumab ont également été produits au format IgG. Les chaînes variables lourdes et légères des anticorps ont été clonées dans les plasmides AbVec2.0-IGHG1 et AbVec1.1-IGKC respectivement.²⁴Pour la production de Fab la chaîne lourde a été clonée dans un plasmide dérivé du AbVec2.0-IGHG1 pour lequel les domaines CH2 et CH3 ont été retiré et remplacé par un tag 6His. La production de Fab et d’IgG a été réalisée de manière transitoire avec des cellules HEK293 Freestyle (Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis) et cultivées dans le milieu associé. La transfection a été réalisée à une densité de 2,5.10⁶cellules par mL de culture, une solution de PEI (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, États-Unis) a été utilisée comme agent de transfection. Les plasmides ont été ajoutés à la culture à un ratio 1: 1 et à une concentration finale dans la culture de 1,5µg/mL pour chaque plasmide. Après 5 minutes d’agitation à 37°C et 8% de CO₂, le PEI a été ajouté goutte à goutte à une concentration finale de 9µg/mL de culture. Après 24h sous agitation à 37°C et 8% CO₂, la culture a été diluée au demi. La production a été stoppée 7 jours après transfection et le surnageant a été récupéré par centrifugation à 4°C, 10 min à 3000G puis 20 min à 20000G. Les protéines ont ensuite été purifiées sur un système AKTA (GE Healthcare, Pittsburgh, États-Unis). Pour les Fab la purification a été faite à l’aide d’une colonne HisTrap Excel (GE Healthcare, Pittsburgh, États-Unis) avec élution en tampon imidazole 20mM. Suite à la purification les Fab ont été dialysés afin de diminuer la concentration d’imidazole. Les IgG ont été purifiés à l’aide d’une colonne HiTrap Protein A HP (GE Healthcare, Pittsburgh, États-Unis), puis une seconde fois par SEC sur une colonne Sephacryl S-200 HR (GE Healthcare, Pittsburgh, États-Unis) afin de ne garder que la forme monomérique de l’IgG.

6. Mesure d’affinité

Les mesures d’affinité ont été réalisées de manière cinétique avec un Octet Red96 (Molecular Devices, San Jose, États-Unis) selon le protocole décrit par Schroteret al. (MAbs 7, 138–151 (2015)). Brièvement, le TNFα biotinylé est immobilisé sur des sensors streptavidine (Streptavidin (SA) Biosensor) à une concentration de 20nM. Après saturation des sensors dans une solution de blocage contenant de la biotine (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, États-Unis) à 10µg/mL, l’association et la dissociation sont mesurées pendant 20 et 40 minutes respectivement. Pour les mutants 3 à 6 et le mutant 8 les mesures d’affinité ont été faites à trois concentrations de Fab: 10nM, 5nM et 2,5nM, plus une référence à 10nM sans TNFα. Pour l’adalimumab et les mutants 1, 2 et 7 les analyses ont été faites pour six concentrations de Fab: 15nM, 10nM, 5nM, 2,5nM, 1,25nM et 0,625nM, plus une référence à 15nM sans TNFα. Lors de l’analyse, la référence est soustraite à chacune courbe et un modèle Langmuir global 1: 1 est appliqué pour obtenir les paramètres d’affinité.

7. Analyse de la masse des anticorps

Les masses des IgG produits (adalimumab, Mutants 1, 2 et 7) et de l’adalimumab dans sa version commerciale (Humira) ont été déterminées par spectrométrie de masse. L’analyse été réalisée sur un appareil à haute résolution de type Q-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Etats-Unis) par UHPLC-MS comme décrit par Contrepois et al. (J. Proteome Res. 9, 5501–5509 (2010)).
L’analyse SEC-MALS a été réalisée au sein de la plateforme GIPSI de l’Université Paris-Sud, sur une HPLC (Shimadzu) avec une colonne Superdex 200 10/300 GL increase (GE Healthcare, Pittsburgh, États-Unis).

Exemple 1: Analyse des régions immunogènes

Localisation des régions immunogènes

Préalablement à ces travaux, les épitopes T de l’adalimumab ont été identifiésin vitropar des tests d’activation spécifique des lymphocytes T CD4 à l’aide de peptides chevauchants d’une longueur de 15 ou 20 acides aminés. Les régions comportant des épitopes T sont majoritairement localisées au sein de la chaîne lourde, le CDR2 sur une zone comprise entre les résidus E46 et E64 et le CDR3 entre les acides aminés L82c et T107 (Meunier, S.et al., Cellular & Molecular Immunology, 2019, Oct 28. doi: 10.1038/s41423-019-0304-3). Un épitope T est également décrit sur la chaîne légère en amont du CDR3 (S76 à R90).(Figure 2 )On peut également noter que les épitopes T identifiés comportent tous des résidus différents de la lignée germinale(Figure 2: résidus encadrés) et peuvent par conséquent être perçus comme n’appartenant pas au soi par le système immunitaire. Afin de prédire les possibles modalités d’interaction de ces épitopes T avec les molécules HLA II, l’algorithme netMHCIIpan a été utilisé. Celui prédit quatre cores d’interaction pour les épitopes identifiés dans le CDRH2 (en gris, Figure 2 ).Au vu des données de MAPPS issues de Meunieret al., précité( [Tableau 2]) montrant que la région chevauchante entre les deux épitopes T du CDRH2 est systématiquement conservée parmi les peptides naturellement apprêtés par les cellules dendritiques, le core d’interaction est très probablement contenu dans cette région.

[Tableau 2] : Peptides présentés par les molécules HLA II obtenus par MAPPS

Ainsi, le 9-mer «ITWNSGHID»(SEQ ID NO:12) comprenant les résidus 51 à 58 (en gris foncé sur laFigure 2) prédit par netMHCIIpan est vraisemblablement le core d’interaction des épitopes T du CDRH2 parmi les cores prédits (en gris clair sur laFigure 2). Le CDRH3 est plus dense en épitopes T, un ensemble de 6 épitopes T chevauchant ont été prédits sur cette région. Le caractère chevauchant de ces épitopes laisse également penser que ces zones de chevauchement pourraient être particulièrement intéressantes pour déstabiliser l’interaction peptide/HLA II de plusieurs épitopes T simultanément. Cependant l’identification d’un core d’interaction commun dans ces zones est moins évidente que dans le cas du CDRH2 en raison de l’absence de peptide correspondant lors de l’analyse en MAPPS. Cependant trois cores d’interaction, «VYYCAKVSYL» (SEQ ID NO: 15), «VSYLSTASS» (SEQ ID NO: 16) et «YLSTASSLD» (SEQ ID NO: 17) sont prédits sur un nombre plus important d’allèles, aussi ils seront considérés comme plus probable que les autres cores prédits par netMHCIIpan. (en gris foncé sur laFigure 2 )Enfin pour l’épitope T situé sur la chaîne légère, curieusement aucun des cores prédits de permet de définir une modalité d’interaction probable. Aussi pour cet épitope T la suppression de l’interaction avec les molécules HLA II présente peu d’intérêt, d’autant plus que celui-ci ne présente qu’une mutation différente de la lignée germinale en R90. Une approche différente sera donc adoptée pour cet épitope T, la mutation R90K vers le résidu germinal étant décrite comme fonctionnelle dans le brevet de l’Humira®, cette substitution sera effectuée afin d’humaniser l’épitope T.

Les CDRH2 et CDRH3 étant les zones majeures d’immunogénicité retrouvés chez plusieurs donneurs, l’action a été focalisée sur ces deux régions afin d’obtenir une diminution d’immunogénicité la plus importante possible.
Identification des mutations réduisant l’immunogénicité

Pour réduire l’affinité épitope T/HLA II et définir ainsi une stratégie de déimmunisation, les inventeurs ont d’abord cherché à connaitre l’influence des substitutions sur la prédiction de l’algorithme netMHCIIpan. Une approche systématique a été adoptée pour évaluer l’influence de toutes les substitutions possibles au niveau du CDRH2 et du CDRH3 sur la présentation par les molécules HLA II. L’algorithme netMHCIIpan a été utilisé de manière parallélisée afin de prédire l’effet moyen de chaque mutation sur un panel de 46 allèles HLA II couvrant plus de 80% de la population mondiale. Ces prédictions, représentées sous forme de matrice présentent l’effet relatif de la mutation par rapport à la séquence native(Figure 3 ) .

Le CDRH2 présente de nombreuses mutations permettant de réduire la probabilité d’interaction avec les molécules HLA II (substitutions colorées en dégradé de gris (plus foncé = moindre immunogénicité prédite,Figure 3). Les substitutions vers des acides aminés hydrophiles ainsi que vers la proline ont généralement tendance à faire baisser les scores de prédiction sur la plupart des positions. L’introduction d’acides aminés hydrophobes en revanche a généralement l’effet inverse. Plusieurs positions présentent des substitutions susceptibles de faire baisser les scores de prédiction, majoritairement des acides aminés hydrophobes (ex: W47, V48, I51) mais également certaines substitution d’acides aminés polaires (ex: T52E, S49D) A l’inverse, la mutation de certains résidus tels que E46, G55 et D58 ne semble pas présenter d’intérêt pour réduire l’immunogénicité.

Les résultats de la prédiction pour le CDRH3 sont assez similaires, les résidus hydrophiles sont à privilégier pour déstabiliser l’interaction peptide/HLA II.(Figure 3) Les deux résidus hydrophobes Y97 et L98 mais également les 6 résidus à partir de la sérine S99, ainsi que les acides aminés V89, Y90 et Y91 sont prédits pour avoir un effet particulièrement intéressant sur l’interaction avec les molécules HLA II. En revanche, comme pour le CDRH2, certains résidus ne présentent pas d’intérêt pour réduire l’immunogénicité comme les résidus C92, D101 et G104.

Les modifications proposées par netMHCIIpan sont globalement des substitutions vers un acide aminé hydrophile, avec un effet d’autant plus fort si le résidu natif est hydrophobe. netMHCIIpan ne tenant compte ni de la structure ni de la fonctionnalité de l’anticorps, ces prédictions sont à mettre en perspective avec la tolérance à la mutation de ces acides aminés. En effet, la suppression de tous les acides aminés hydrophobes sur des régions aussi importantes que les CDR semble extrêmement risquée pour la fonctionnalité mais également pour la structure de l’anticorps. De plus des résidus appartenant à ces deux CDR ont été décrit pour leur contribution dans l’interaction avec le TNFα (Hu et al.J. Biol. Chem. 288, 27059–27067 (2013). Afin de tenir compte de ces contraintes fonctionnelles et structurales, une seconde approche systématique sur la fonction cette fois a été appliquée.
Design, construction et criblage des banques de DMS

Afin d’identifier parmi les substitutions proposées par netMHCIIpan celles qui permettent d’obtenir des mutants fonctionnels, les inventeurs ont décidé de réaliser dans un premier temps une étude fonctionnelle de ces deux régions. Une approche par mutation systématique appelée Deep Mutational Scanning (DMS) a été choisie, pour identifier les acides aminés permissifs au sein de ces zones immunogènes. Cette stratégie permet l’évaluation fonctionnelle de toutes les substitutions possibles à chaque position, chaque variant ne comportant qu’une unique mutation.

Les deux régions immunogènes ont été traitées en deux banques indépendantes. Elles portent chacune sur une région de vingt résidus et ont été construites par assemblage PCR. Pour chacun des vingt résidus la diversité a été introduite à l’aide d’un codon dégénéré NNS codant pour l’ensemble des vingt acides aminés naturels. Les codons dégénérés ont été introduits par des PCR indépendantes pour chaque position. Les vingt produits de PCR ont été mélangés de manière équimolaire afin d’obtenir une banque contenant toutes les substitutions simples pour chacune des vingt positions. Les banques ont ensuite été clonées dans un plasmide d’expression pour le Yeast Surface Display (YSD) permettant l’expression sous forme de Fab. (Figure 4A) Le clonage des deux banques a été réalisé de manière indépendante par recombinaison homologue lors de la transformation en levure. Les banques ont ensuite été exprimées en YSD et les mutants d’intérêts sélectionnés par FACS. (Figure 4 B)Le criblage a été réalisé selon les conditions décrites par Kowalskyet al.(PLoS One 10, 1–23 (2015)). Les banques ont été criblées une seule fois après trois heures d’incubation à une concentration de TNFα inférieure au K_Dde l’adalimumab afin d’être en mesure d’observer à la fois un gain et une perte de fonction. Les 5% des mutants exprimés ayant le plus faible signal pour l’interaction ont été sélectionnés (cf. fenêtre de tri «Négatif»,Figure 4 C), pour sélectionner les mutations ayant un impact délétère sur la fonction. De façon analogue, les 5% des mutants démontrant la plus forte interaction ont été sélectionnés (cf. fenêtre de tri «Positif»,Figure 4 C). La population de levures avant toute étape de sélection ainsi que les deux populations sélectionnées ont ensuite été séquencées par NGS.
Analyse de la permissivité des deux régions immunogènes

A partir des données de séquençage, les enrichissements de la séquence parentale (wild type) ainsi que ceux de chacun des mutants ont été calculés. Ceux-ci ont permis de calculer pour chacun des variants un score appelé valeur sélective (fitness en anglais) qui correspond au logarithme en base 2 de l’enrichissement relatif du variant par rapport à la séquence native. Afin d’obtenir une vision globale de la permissivité de chacune des régions, les mutants sont représentés dans une matrice par une couleur proportionnelle à leur valeur sélective. Pour la sélection négative, l’amplitude des valeurs sélectives est de -8 à 3, soit un enrichissement 256 fois inférieur à 8 fois supérieur à la séquence native. Pour la sélection positive l’amplitude des valeurs sélectives est sensiblement la même. Les mutants ayant un enrichissement supérieur ou égal à la séquence parentale sont indiqués en dégradé de gris. Plus le gris est foncé, plus l’enrichissement est fort, indiquant une bonne affinité pour le TNFα. (Figure 5).

Les résultats obtenus à partir de la sélection des mutants exprimés mais non fonctionnels sont particulièrement intéressants pour définir les résidus participants à l’interaction avec le TNFα. La population issue de la sélection positive est nécessaire pour l’identification des mutations permettant de maintenir ou d’augmenter l’affinité. Enfin la combinaison de ces deux matrices de résultats permet d’identifier les résidus important pour la bonne expression de l’anticorps (valeur sélective négative dans les deux conditions de sélection).

Pour la région du CDRH2, la sélection négative permet d’identifier assez clairement une région centrale de six résidus consécutifs (T52 à H56) dont les valeurs sélectives sont globalement plus élevées. Ce patch de six résidus est complété par l’alanine en position 50 et l’acide aspartique en position 58 de chaque côté. Ces huit résidus particulièrement enrichis dans la sélection négative semblent donc particulièrement importants pour l’interaction. La sélection positive permet cependant d’identifier quelques mutations fonctionnelles pour ces résidus, notamment des résidus de petite taille (alanine, glycine ou sérine) pour T52 et S54.(Figure 5)De chaque côté de cette zone d’interaction, on note également que les extrémités de la banque sont moins enrichies dans la sélection négative et se comportent différemment dans la sélection positive. Les mutants de la partie N-terminale sont peu présents dans la sélection positive aussi ces résidus semblent plutôt impliqués dans le repliement et l’expression de l’anticorps. Les mutants appartenant à la partie C-terminale, en revanche, sont un peu plus enrichis dans la sélection positive. (Figure 5)De nombreuses mutations sont autorisées, y compris vers des résidus aux propriétés différentes, tout en conservant une valeur sélective égale ou supérieure à celle de l’anticorps natif.

Les résidus impliqués dans l’interaction au niveau du CDRH3 semblent se répartir en deux groupes. Les résidus K94 et V95 d’un côté et les résidus S99 à S100c un peu plus loin. De manière assez surprenante et à l’inverse du CDRH2, certains de ces résidus sont permissifs pour des substitutions non conservatives.(Figure 5)C’est notamment le cas dans le tri positif pour le résidu V95 pour lequel la valeur sélective est augmentée lorsqu’il est substitué par un petit acide aminé, de même la mutation du résidu T100 vers des résidus aliphatiques non polaires se traduit par une augmentation de la valeur sélective. La sélection positive révèle également que les résidus Y90 à K94 ne sont pas permissifs bien qu’ils ne semblent pas impliqués directement dans l’interaction avec le TNFα. Ce type de profil est également retrouvé pour les résidus A100A, W103 et G104.

Ces premières banques permettent d’identifier les substitutions permettant une conservation de la fonctionnalité pour les deux régions d’intérêt. Elles ont permis de mettre en évidence la différence de permissivité des résidus des CDRH2 et CDRH3, en particulier ceux impliqués directement dans l’interaction. Ces données ont ensuite été utilisées afin de concevoir des banques combinatoires dans l’objectif de supprimer les épitopes T identifiés sur ces zones, tout en s’assurant que celles-ci contiennent des mutants fonctionnels.
Exemple 2: Génération de mutants de l’adalimumab au potentiel immunogène réduit

Design des banques

Le CDRH2 compte deux épitopes T chevauchants qui partagent vraisemblablement le core d’interaction «ITWNSGHID» (en gris foncé dans laFigure 2). Par conséquent la stratégie de mutation s’est concentrée sur cette zone. Le recoupement des matrices issues du DMS et de la prédiction par netMHCIIpan ont permis de choisir les mutations permettant à la fois de déstabiliser l’interaction avec les molécules HLA II tout en conservant la fonctionnalité de l’anticorps(Figure 6) .Les résidus S49, A50, T52, S54, H56 et I57 ont été sélectionnés car ils possèdent tous une ou plusieurs mutations permettant de déstabiliser l’interaction avec les molécules HLA II. Pour chacun de ces résidus, un codon dégénéré permettant de représenté au mieux les substitutions d’intérêt a été choisi. (Figure 7 )Pour chaque position le nombre de substitution est réduit (1 à 5) à l’exception du résidu I57 particulièrement intéressant pour réduire l’immunogénicité et également très permissif. Ainsi ce résidu a été substitué pas tous les acides aminés non hydrophobes à l’exception de la cystéine.

Le CDRH3 comporte un ensemble de 5 épitopes T chevauchants pour lesquels nous avons défini un ensemble de 3 cores d’interaction probables (en gris foncé dans laFigure 2 ).Nous avons choisi de diriger la mutagénèse vers la zone de chevauchement entre les 3 cores les plus fortement prédits, à savoir les résidus V95 à T100. En effet, ces positions regroupent de nombreuses substitutions pour lesquelles une baisse d’immunogénicité est attendue. Bien que relativement peu permissive, cette région regroupe les acides aminés du CDRH3 comme la valine 95, la sérine 96 et la thréonine 100 pour lesquels différentes substitutions semblent tolérées. Pour maximiser la probabilité d’identifier des mutants actifs et potentiellement déimmunisés, nous avons choisi d’introduire dans cette zone de six résidus consécutifs toutes les substitutions par un acide aminé hydrophile et/ou de petite taille à l’exception de la cystéine sur ces six résidus consécutifs. Cette stratégie combinatoire pourra potentiellement mettre en évidence des effets de compensation, rendant ainsi possible la présence de deux substitutions non identifiées individuellement. Par ailleurs, la substitution V89L permettant de germinaliser la partie N-terminale du CDRH3 complète cette banque. (Figure 7 )Du fait de la combinatoire importante, la construction de cette banque avec des codons dégénérés aurait produit une banque d’une trop grande diversité (>10⁷) pour le criblage en YSD. Pour cette raison, lors de la synthèse des amorces utilisées pour la construction de cette banque des codons trinucléotides ont été inclut afin de réduire la diversité à moins de dix millions de mutants.

Construction et criblage

Chacune des banques a été construite par assemblage PCR, avec des amorces comportant des codons dégénérés pour le CDRH2 et des amorces synthétisées à partir de mélange de trinucléotides pour le CDRH3. Ces banques ont respectivement une diversité de 1,2.10⁴pour le CDRH2 et 3,8.10⁶pour le CDRH3. Comme précédemment, elles ont été clonées par recombinaison homologue dans un plasmide pour l’expression et le criblage en YSD. Après transformation des levures et induction de l’expression, le criblage par FACS a été réalisé de manière indépendante pour les deux banques et chacune des banques a subi différentes étapes de sélection.

En raison de sa diversité importante, la banque portant sur le CDRH3 rendait difficile une sélection directement par FACS. Celle-ci a donc été enrichie une première fois par tri magnétique (MACS) avec une concentration de 10nM de TNFα biotinylé. A l’exception de cet enrichissement, les étapes de criblage sont les mêmes pour les deux banques. Une première phase de trois sélections successives à l’équilibre a été réalisée à des concentrations décroissantes de TNFα biotinylé.(Figure 8 )A l’issue de ces étapes, les banques ont été sélectionnées une dernière fois de manière cinétique d’obtenir des mutants ayant une vitesse de dissociation lente. Pour cela, les banques ont été saturées pendant 3h avec 20nM de TNFα biotinylé puis triées à l’issue d’une compétition de 24h contre du TNFα non biotinylé. Lors de chacune des étapes de sélection, 2 à 5 % des cellules ayant le plus fort signal en PE ont été sélectionnées par FACS à l’aide de fenêtres de tri diagonales afin de normaliser le signal de liaison par l’expression.(Figure 8 )

Pour comprendre l’évolution de la diversité moléculaire des banques durant les étapes de sélection, nous avons choisi d’effectuer un séquençage NGS après chacune des étapes de sélection. Les données de séquençage de la banque portant sur le CDRH2 montrent que toutes les mutations étaient bien présentes dans la banque avant le début du criblage. (Figure 8A) A l’issue des trois étapes de sélection à l’équilibre on observe un retour au résidu natif pour certaines positions, comme pour les résidus H56 et A50. En revanche, pour les autres positions mutées plusieurs résidus différents de l’acide aminé natif sont retrouvés. La dernière étape de sélection cinétique sur la vitesse de dissociation diminue quelque peu la diversité des substitutions possibles tout en renforçant globalement les profils observés initialement. A l’issu du processus de criblage, parmi les six résidus ciblés dans la banque, les résidus S49, T52, S54 et I57 sont largement substitués (Figure 9 A). Ces mutations sont pour la plupart conservatives à l’exception du résidu I57 pour lequel les substitutions les plus abondantes sont des acides aminés hydrophiles.

Les données de séquençage nous ont permis de calculer les valeurs d’enrichissement de chacun des mutants à l’issue du processus de sélection. Les 30 mutants les plus enrichis dans cette banque sont présentés dans le [Tableau 3].

[Tableau 3] : Sélection des 30 mutants les plus enrichis issus de la banque portant sur le CDRH2

On observe que les meilleurs mutants ont été enrichis plus de deux cent fois, au total après criblage compte 174 mutants ayant un enrichissement supérieur à celui de l’adalimumab. L’algorithme netMHCIIpan a été une nouvelle fois utilisé afin de classer ces mutants et 158 d’entre eux sont prédits pour êtes potentiellement moins immunogènes.

Pour la banque portant sur le CDRH3 le séquençage de la population après la première sélection par criblage magnétique révèle une forte diversité sur les résidus 95 à 100, validant la construction de la banque. (Figure 9 B) A l’issue des sélections à l’équilibre les résidus Y97 et L98 sont fortement conservés alors que les autres résidus ont des profils plutôt diversifiés avec cependant une dominance forte de la proline en position 99. La dernière étape de sélection sur la vitesse de dissociation (K_off) permet de discriminer encore davantage les mutants selon leur capacité de liaison au TNFα. La sélection par FACS montre en effet pour la banque portant sur le CDRH3 une grande hétérogénéité des propriétés de liaison des mutants après 24h de dissociation en présence de TNFα non biotinylé. (Figure 8) Cette observation se traduit, à l’issue du séquençage des mutants sélectionnés, par une forte évolution des profils de certaines positions. Les positions 89 et 100 subissent un enrichissement important vers l’acide aminé natif et les positions 95 et 96 voient leur diversité réduite. Pour les positions 97 à 98 les tendances observées à l’issue des premières sélections sont fortement renforcées et la diversité sur ces positions est très réduite. De la même manière que pour le CDRH2, à l’issue des sélections seules certaines positions semblent pouvoir être substituées. Ces mutations sont souvent conservatives à l’exception du résidu V95 autorisant la thréonine et l’alanine et le résidu S99 principalement muté en proline. Les 30 mutants les plus enrichis dans cette banque sont présentés dans le[Tableau 4].

[ Tableau 4 ] : Sélection des 30 mutants les plus enrichis issus de la banque portant sur le CDRH3

On observe également que les facteurs d’enrichissement sont plus élevés que pour le CDRH2 avec des valeurs pouvant atteindre plusieurs millions. Après criblage, la banque comporte 310 mutants plus enrichis que la séquence native de l’adalimumab et comme pour le CDRH2 une part importante de ceux-ci (282) ont un potentiel immunogène réduit selon netMHCIIpan.

A l’issue de la sélection de ces deux banques, un nombre important de séquences alternatives potentiellement moins immunogènes ont été obtenues à la fois pour le CDRH2 et le CDRH3. Celles-ci ont été associées dans le but d’obtenir une chaîne lourde entièrement déimmunisée.
Construction d’une banque par recombinaison des mutants sélectionnés

Afin d’éviter l’association de mutations sur le CDRH2 et le CDRH3 non compatibles, le choix a été fait de recombiner l’ensemble des séquences contenues dans les deux banques à l’issue de leur criblage. Les séquences des mutants de chacune des banques ont été extraites par PCR sur les populations finales après tri cinétique. L’association des séquences a ensuite été réalisée par recombinaison aléatoire grâce à un assemblage par PCR. Cette banque combinée CDRH2 + CDRH3 a ensuite été clonée dans le plasmide d’expression en YSD décrit plus tôt par recombinaison homologue lors de la transformation en levure. Les banques CDRH2 et CDRH3 comportant respectivement un minimum de 489 et 234 mutants (retrouvé au moins 10 fois lors du séquençage) à l’issue de leurs sélections, cette banque combinatoire contient un minimum de 10⁵ variants. Cette banque incorpore également la substitution R90K décrite comme préservant l’affinité dans le brevet de l’Humira® et permettant de germinaliser la séquence dans la région du CDRH3 et ainsi de retirer un épitope mineur (Salfed, J. G.et al.Human antibodies that bond human TNFa. (Brevet US 6258 562 B1) ).

Cette banque a été criblée selon le même processus appliqué aux banques précédentes, à savoir trois tris à l’équilibre avec des concentrations décroissantes en TNFα suivi d’une sélection sur la vitesse de dissociation. (Figure 10) Cette banque étant issue de la recombinaison de séquences déjà sélectionnées, on observe un fort enrichissement initial en mutants fonctionnels avant même la première étape de sélection. La population est également très homogène dès les premières étapes de sélection, le criblage sur la vitesse de dissociation réalisé ensuite révèle cependant une population plus hétérogène.
Identification de clones d’intérêt

Après séquençage, les mutants sélectionnés ont été évalués selon leur enrichissement et 245 d’entre eux montrent une valeur supérieure à la séquence native. Parmi eux, plus de 200 mutants sont prédits pour avoir un nombre de core d’interaction avec les molécules HLA II plus faible que l’adalimumab. Leurs séquences montrent cependant une redondance dans leurs séquences, particulièrement au niveau du CDRH3. ([Tableau 5]).

[Tableau 5] : Sélection des 30 mutants les mieux classés par netMHCII pan ainsi que des 8 mutants d’intérêt issus de la banque recombinant CDRH2 et CDRH3

A l’issue des étapes de sélection, un nombre réduit de variants d’intérêt ont été choisis afin d’effectuer une caractérisation biochimique complète. Les mutants ont été sélectionnés pour leur enrichissement supérieur à la séquence native et pour leur potentiel immunogène réduit selon netMHCIIpan mais également en attachant une importance particulière à sélectionner des mutants aux séquences diverses. A partir de ces critères, 8 mutants ont été choisis afin d’être caractérisés. ([Tableau 6]).

Caractérisation des clones d’intérêt

Ces mutants ainsi que l’adalimumab ont été produits sous forme de Fab en cellules HEK afin d’être caractérisés. L’affinité de ces mutants pour le TNFα a été évaluée par Bio Layer Interferometry, tous montrent une affinité supérieure à celle de l’adalimumab. ([Tableau 6])

[Tableau 6 ] : Mutants d’intérêts sélection nés dans la banque combinatoire CDRH2-CDRH3

Pour certains comme les mutants 2 et 5 on mesure une affinité augmentée de plus dix fois. L’augmentation de l’affinité pour les différents clones est majoritairement due à une diminution de la vitesse de dissociation, paramètre sélectionné lors du criblage. Si tous ces mutants ont un enrichissement supérieur à l’anticorps natif, ces valeurs ne semblent cependant pas toujours rigoureusement proportionnelles aux affinités mesurées pour ces mutants.

Les mutants 1, 2 et 7 ont été sélectionnés pour leur immunogénicité prédite réduite afin de pousser la caractérisation plus loin. Ces trois mutants ainsi que l’anticorps natif ont été produits en HEK et purifiés au format IgG. Une analyse en spectrométrie de masse Orbitrap a permis de confirmer que les anticorps ont une masse correspondant à celle attendue, avec une résolution de l’ordre du dalton. D’autre part, une analyse par SEC-MALS (Size Exclusion Chromatography – Multi-Angle Light Scattering) a également permis de valider le caractère monomérique de ces anticorps.

Les inventeurs se sont ensuite intéressés de manière plus précise aux effets des différentes substitutions que comportent les mutants sur leur potentielle interaction avec les molécules HLA II. Ces effets sont présentés de manière globale pour le CDRH2 et le CDRH3 dans laF igure 11A. Pour chacune des deux régions, une unité de score est comptée pour chaque core non humain prédit en dessous du seuil de 20% pour un allèle du panel([Tableau 1] ).Pour le CDRH2, la prédiction donne un score diminué de plus de 5 fois pour les mutants 1 et 7 qui partagent la même séquence sur cette région, pour le mutant 2 l’effet est encore plus fort avec une absence de cores prédits sous le seuil de 20%. Pour le CDRH3, on observe également une diminution des scores prédits pour les trois mutants, celle-ci est de plus de 50% pour les mutants 1 et 7. L’effet des mutations selon netMHCIIpan semble finalement plus fort sur le CDRH2 que sur le CDRH3. Ce constat est cependant plus nuancé si l’on s’intéresse à l’effet de ces substitutions de manière plus précise sur les cores d’interactions ciblés. (Figure 11B et Figure 12) Pour le CDRH2 le core «ITWNSGHID» (SEQ ID NO: 12) chevauchant les deux épitopes T identifiés par Meunieret al. (précité) constitue de manière probable la modalité d’interaction avec les molécules HLA II. Pour ce core, les résultats de la prédiction sont sensiblement les mêmes que pour la prédiction sur toute la région du CDRH2. Ceci permet donc de valider que l’effet observé est bien porté principalement par le core ciblé. (Figure 11B) Pour le CDRH3 les cores potentiellement responsables de l’interaction des épitopes T identifiés sont multiples avec cependant trois cores majoritaires prédits pour un grand nombre d’allèles. (Figure 11B) On observe une réduction du nombre d’allèles répondeurs à un seuil de 20% pour ces trois cores, cette réduction est cependant plus importante pour les cores B et C. Pour le core A la prédiction par netMHCIIPan donne également une réduction du nombre d’allèles concernés cependant celle-ci est moins marquée que pour les deux autres cores.

Conclusion

Ces travaux ont permis de comprendre de manière plus précise le rôle de chacun des résidus des deux zones dans lesquelles ont été identifiés les épitopes de l’adalimumab (CDRH2 et CDRH3). La plate-forme de YSD au format Fab implémentée avec du séquençage à haut débit ont permis dans un premier temps, l’étude fonctionnelle des régions immunogènes par DMS. Cette première étape a permis aux inventeurs de constater que, comme ils l’avaient envisagé, la réduction stricte de l’immunogénicité par suppression des épitopes T ne tend pas vers des solutions fonctionnelles. L’algorithme netMHCIIpan propose majoritairement de substituer les résidus hydrophobes par de petits acides aminés et/ou des acides aminés hydrophiles. Les résidus hydrophobes sont cependant nombreux dans les CDR et sont particulièrement importants pour la structure de ceux-ci dont dépend directement la fonctionnalité de l’anticorps. Il semble donc difficile d’envisager que la substitution de tous les acides aminés hydrophobes des CDR puissent permettre la conservation de la fonctionnalité. Cette constatation faite, le DMS s’est révélé d’autant plus important pour l’identification de substitutions fonctionnelles. Les banques ainsi générées et criblées à partir des données du DMS et des prédictions de l’algorithme netMHCIIpan ont permis d’identifier des mutants possédant une affinité accrue pour le TNFα et une immunogénicité potentielle réduite. L’obtention de ces mutants permet de répondre à la problématique de préservation de la fonctionnalité lors de la suppression d’épitopes T situés sur des régions majeures de l’interaction avec la cible. Ils montrent ainsi que la stratégie de déimmunisation proposée a permis de concilier les deux objectifs non convergents que sont la fonctionnalité de l’anticorps et la diminution de son immunogénicité.

Les mutants ont une réduction d’interaction avec les molécules HLA II prédite selon l’algorithme netMHCIIpan. De ce fait, ils sont moins susceptibles d’être présentés par les molécules HLA II et reconnus par les lymphocytes T par rapport à l’adalimumab. Ces mutants constituent ainsi des variants de l’adalimumab au pouvoir immunogène réduit et permettent de s’affranchir des problèmes d’immunogénicité rencontrés avec les anti-TNFα. Ces variants pourraient représenter une amélioration clinique en permettant de réduire le taux d’immunisation des patients. De plus, les inventeurs ont pu démontrer qu’ils possèdent une affinité augmentée pour le TNFα. Dans la mesure où l’activité biologique des anticorps anti-TNF -à savoir la neutralisation du TNF-alpha- dépend de leur affinité pour le TNF, on peut s’attendre à ce que les mutants de l’invention aient une activité biologique supérieure à celle de l’adalimumab.. Les mutants obtenus à l’issue de ces travaux pourraient ainsi être considérés comme de potentiels candidats médicaments se positionnant comme une version améliorée de l’adalumimab.
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Claims (15)

1. Variant d’un anticorps thérapeutique anti-TNF-alpha comprenant des domaines variables VH et VL de séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2, ledit variant comprenant au moins deux substitutions d’acides aminés dans au moins une séquence chevauchant l’une des régions CDRH2 ou CDRH3 déterminant la complémentarité dudit domaine variable VH;
   lesdites au moins deux substitutions d’acides aminés dans la séquence chevauchant la région CDRH2 étant sélectionnées dans le groupe constitué par:
   - la substitution de S49 par un autre acide aminé choisi parmi A ou G; de préférence G;
   - la substitution de A50 par un autre acide aminé choisi parmi G, S, T ou D;
   - la substitution de T52 par un autre acide aminé choisi parmi A, N ou S; de préférence N ou S;
   - la substitution S54G ; et
   - la substitution de I57 par un autre acide aminé choisi parmi A, H, N, Q, R, S, T ou W; de préférence A, H, S, N, Q, R ou T; de manière préférée R, H, S ou T; et lorsque le variant comprend le résidu A49 alors il comprend également le résidu N52, S52 ou T52 et le résidu G54;
   lesdites au moins deux substitutions d’acides aminés dans la séquence chevauchant la région CDRH3 étant sélectionnées dans le groupe constitué par:
   - la substitution de V89 par L;
   - la substitution de V95 par un autre acide aminé choisi parmi A, S ou T;
   - la substitution de S96 par un autre acide aminé choisi parmi A, G, H, K, N, Q, R ou T; de préférence T, Q, N ou H;
   - la substitution de Y97 par H;
   - la substitution de L98 par T;
   - la substitution de S99 par P; et
   - la substitution de T100 par un autre acide aminé choisi parmi P ou S;
   à l’exclusion des variants comprenant les résidus V89 ou L89, V95, K96, Y97, L98, P99 et S100; V89, V95, A96, Y97, L98, P99 et S100 ; les positions desdits résidus d’acides aminés étant indiquées en référence à la numérotation de Kabat;
   et ledit variant présentant un potentiel immunogène réduit et une affinité de liaison pour le TNF-alpha au moins égale ou supérieure, par rapport à l’anticorps thérapeutique anti-TNF-alpha dont il est issu.
2. Variant selon la revendication 1, comprenant une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH2 choisie parmi:
   - S54G et I57R;
   -T52N ou T52S, S54G et I57T, I57R, I57Q ou I57H;
   - S49G, T52N et I57H;
   - S49A ou S49G, S54G et I57T ou I57R;
   - S49G, T52N, T52S ou T52A; S54G; et I57T, I57R, I57H, I57S,
   I57Q ou I57N; et éventuellement A50T, A50G ou A50S;
   - S49A, T52N ou T52S ; S54G; et I57T, I57R, I57H, I57Q, I57S ou
   I57A; et
   - S49G, A50G, S54G et I57R.
3. Variant selon la revendication 2, comprenant une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH2 choisie parmi:
   (i) S49G, T52N et I57H; S49A, S54G et I57T; S49G, S54G et I57R; T52N,
   S54G et I57T;
   (ii) S49G, T52N, S54G et I57R; S49G, T52N, S54G et I57H; S49G, T52N,
   S54G et I57T; S49G, T52N, S54G et I57S; S49G, A50G, T52N et I57H;
   S49G, T52S, S54G et I57R; S49A, T52N, S54G et I57T; S49G, T52S,
   S54G et I57N; S49G, T52S, S54G et I57Q; S49G, A50G, S54G et I57R;
   S49G, T52S, S54G et I57H; S49G, T52S, S54G et I57T; S49G, T52S,
   S54G et I57S; S49A, T52N, S54G et I57H; et
   (iii) S49G, A50T, T52N, S54G et I57S; S49G, A50G, T52N, S54G et I57R;
   S49G, A50S, T52N, S54G et I57R; S49G, A50D, T52S, S54G et I57T;
   S49G, A50G, T52S, S54G et I57R;S49G, A50S, T52A, S54G et I57H;
   S49G, A50S, T52S, S54G et I57R; S49G, A50S, T52A, S54G et I57T;
   et S49G, A50S, T52A, S54G et I57S;
   de préférence choisie parmi : S49G, T52N, S54G et I57R; S49G, A50T, T52N, S54G et I57S; S49G, T52N, S54G et I57H; S49G, T52N et I57H; S49G, A50D, T52S, S54G et I57T..
4. Variant selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisie parmi:
   - V95S, V95T ou V95A; et
   - S96T, S96Q, S96N ou S96H; et
   - S99P; et éventuellement V89L.
5. Variant selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisie parmi:
   (a) S96K et S99P;
   (b) V95T, S96T et S99P; V95T, S96K et S99P;V95T, S96R et
   S99P; V95T, S99P et T100S; V89L, S96K et S99P; S96T, S99P et
   T100S; S96K, S99P; V95A, S96K et S99P; V95S, S96K et S99P; V95T,
   S96G et S99P; S96K, S99P et T100P; V95T, S96H et S99P; V95T,
   S96N et S99P; V95S, S96Q et S99P; V95A, S96H et S99P;
   (c) V89L, V95T, S96N et S99P; V95T, S96T, S99P et T100S; V95A, S96H,
   Y97H et S99P; V89L, S96K, L98T, S99P; S96T, L98T, S99P et T100S;
   V89L, V95T, S96K et S99P; V95T, S96K, S99P et T100S; V95T, S96R
   L98T et S99P; V89L, V95T, S96R et S99P; V89L; V95T, S96T
   et S99P;
   (d) V89L, V95T, S96T, S99P et T100S; V89L, S96K, L98T et S99P; V89L,
   V95T, S96K, S99P et T100S; V89L,V95T, S96R, S99P et T100S.
6. Variant selon la revendication 5 ou 6, comprenant une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisie parmi: V95T, S96T et S99P; V95T, S96N et S99P; V95S, S96Q et S99P; V95A, S96H et S99P; V95T, S96G et S99P; S96T, L98T, S99P et T100S; V95T, S96R, L98T et S99P; S96K, S99P et T100P; V89L, V95T, S96T et S99P; de préférence choisie parmi: V95T, S96T et S99P; V95T, S96N et S99P; V95S, S96Q et S99P; V95A, S96H et S99P; V89L, V95T, S96T et S99P.
7. Variant selon l’une quelconque des revendications précédentes comprenant au moins 3 substitutions dans l’une des séquences chevauchant la région CDRH2 ou CDRH3; de préférence dans chacune desdites séquences chevauchant les régions CDRH2 et CDRH3.
8. Variant selon la revendication 7, comprenant l’une des combinaisons suivantes de substitutions dans les séquences chevauchant les régions CDRH2 et CDRH3:
   - S49G, T52N, S54G, I57R, V95S, S96Q et S99P;
   - S49G, A50T, T52N, S54G, I57S, V95T, S96T et S99P;
   - S49G, T52N, S54G, I57H, V95T, S96T et S99P;
   - S49G, T52N et I57H, V95T, S96T et S99P;
   - S49G, A50D, T52S, S54G et I57T, V95T, S96T et S99P;
   - S49G, T52N, S54G, I57R, V89L, V95T, S96T et S99P;
   - S49G, T52N, S54G, I57R, V95T, S96N et S99P;
   - - S49G, T52N, S54G, I57R, V95A, S96H et S99P.
9. Variant selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre la substitution R90K dans la région CDRL3 déterminant la complémentarité du domaine variable VL.
10. Variant selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant une chaîne lourde d’IgG humaine et une chaîne légère Kappa humaine.
11. Variant selon l’une quelconque des revendications précédentes, issu de l’adalimumab.
12. Variant selon la revendication 11, comprenant une chaîne légère de séquence SEQ ID NO: 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO: 24 à 31.
13. Vecteur d’expression comprenant un polynucléotide codant pour un variant selon l’une quelconque des revendications précédentes.
14. Composition pharmaceutique comprenant au moins un variant selon l’une quelconque des revendications 1 à 12 ou un vecteur selon la revendication 13, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable et/ou une substance porteuse.
15. Composition selon la revendication 14, pour utilisation dans le traitement d’une maladie inflammatoire ou auto-immune.
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