KR20160015195A - 인간화 항-EGFRvIII 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료 - Google Patents

인간화 항-EGFRvIII 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료 Download PDF

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칼 에이치. 준
안드레아스 뢰브
마셀라 마우스
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히데호 오카다
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Abstract

본 발명은 EGFRvIII의 발현과 연관된 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, EGFRvIII에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR), 이를 코딩하는 벡터, 및 항-EGFRvIII CAR을 포함하는 재조합 T 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 항-EGFRvIII 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 유전자 변형된 T 세포를 투여하는 방법을 포함한다.

Description

인간화 항-EGFRvIII 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료 {TREATMENT OF CANCER USING HUMANIZED ANTI-EGFRVIII CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR}
본 출원은 2013년 10월 8일에 출원된 미국 출원 번호 61/888,255 및 2013년 2월 20일에 출원된 미국 출원 번호 61/767,071을 우선권 주장하며, 이들 출원 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
정부 지원 연구 또는 개발에 관한 설명
본 발명은 국립 보건 연구소 (NIH)가 수주한 2R01 NS055140 및 1P01 CA1322714 하의 정부 지원으로 만들어졌다. 정부가 본 발명에 대한 특정 권리를 갖고 있다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되었던 서열 목록을 함유하고 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2014년 2월 20일에 만든 상기 ASCII 카피는 N2067-7000WO_SL.txt로 명명되고 그 크기는 228,605 바이트이다.
본 발명의 분야
본 발명은 일반적으로, 표피 성장 인자 수용체 III의 발현과 연관된 질환을 치료하기 위하여 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 조작된 T 세포의 용도에 관한 것이다.
중추 신경계 (CNS)가 종종 면역학적으로 특권을 지닌 것으로 간주되기는 하지만 (문헌 [Okada et al., 2009, Crit Rev Immunol 29:1-42]), 악성 신경교종 환자에 대한 최근의 백신 연구는 긍정적인 결과를 명확히 보여주었다 (Aguilar et al., 2012, Curr Treat Options Oncol 13:437-450; Ruzevick, et al., 2012, Neurosurg Clin N Am 23:459-470;15; and Okada et al., 2011, J Clin Oncol 29:330-336). 그러나, 온전한 숙주-면역 활성에 의존하는 백신 효능은 면역억제성 시토카인의 종양 발현과 화학요법 및 방사선 요법에 기인한 전신 면역 억제를 겪을 수 있다. 다른 한편으로는, 자가 T-세포, 특히 키메라 항원 수용체 (CAR)로 형질도입된 T-세포를 이용한 양자 세포 전이 (ACT) 요법이 시험적인 혈액암 시도에서 장래성이 있는 것으로 밝혀졌다 (Kalos et al., 2011, Sci Transl Med 3(95):95ra73; and Porter et al., 2011, New England Journal of Medicine 365:725-733).
표피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 발현 증강이 유방암, 폐암, 두경부암뿐만 아니라 교모세포종을 포함한 각종 암종에서 자주 검출되고 있다. EGF 수용체 유전자 내에서의 자발적인 재배열이 원발성 인간 교모세포종 종양에서 처음으로 확인되었고, 거의 모든 증례에서 이러한 변경이 EGFR 증폭을 수반한 종양에서 보고되었다. 이들 재배열로부터 3가지 상이한 유형의 돌연변이체가 발생된다. 이들 중 가장 흔한 것이 유형 III EGF 결실-돌연변이체 수용체 (EGFRvIII)이며, 이는 EGFR mRNA 내의 엑손 2-7이 결실되는 것을 특징으로 한다. 이들 결실은 아마도 대체 스플라이싱 또는 재배열을 통하여, 아미노산 6-276을 코딩하는 cDNA 뉴클레오티드 275-1075에 상응한다. EGFR 유전자의 세포외 도메인 내의 801 bp를 결실시키면, 정상 EGFR 단백질의 프레임내 절단이 유발되어, 145-kDa 수용체가 생성됨으로써, 종양 특이적이고 면역원성인 에피토프가 창출된다 (문헌 [Hatanpaa et al., 2010, Neoplasia 12:675-684]; [Mukasa et al., 2010, Proc Natl Acad Sci USA 107:2616-2621]에서 고찰됨). EGFRvIII 발현은 다형성 교모세포종 (GBM)을 포함한 많은 종양 유형에서 관찰되었지만, 정상 조직에서는 거의 관찰되지 않는다. EGFRvIII은 GBM 증례의 24% 내지 67%에서 발현되고, ≥1년 생존하는 환자에서는 EGFRvIII의 발현이 독립적인 음성 예후 지표이다 (Heimberger et al., 2005, Clin. Cancer Res. 11:1462-1466; Heimberger et al., 2005, J Transl. Med 3:38).
본 발명은 특히, 키메라 항원 수용체 (CAR) 구축물 내로 통합된 표피 성장 인자 수용체 III (EGFRvIII)과 결합하는 최적화 및/또는 인간화 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, scFv)을 제공함으로써 환자에서 면역 반응을 제어하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 EGFRvIII의 발현과 연관된 암을 치료하기 위하여 CAR 내로 통합된, EGFRvIII과 결합하는 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 EGFRvIII과 결합하는 인간화 항체 또는 항체 단편을 발현하도록 조작된 T 세포의 용도에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 발명은 생체 외에서 제조된 세포의 특이성, 수 및 기능적 표현형이, 생체내 면역에 의해 유도된 천연 T-세포 보다 훨씬 더 우수하게 조작되고 제어될 수 있기 때문에, 신경교종 환자에 대해 특히 적합할 수 있는 양자 세포 전이에 관한 것이다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이며, 여기서 상기 CAR은 항-EGFRvIII 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, EGFRvIII과 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 항체 단편), 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 및/또는 일차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인)을 포함한다. 한 실시양태에서, CAR은 본원에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 EGFRvIII과 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 항체 단편), 본원에 기재된 막횡단 도메인, 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 및/또는 일차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인)을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 항-EGFRvIII 결합 도메인은 본원에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2) 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3) 중 하나 이상 (예를 들어, 3개 모두), 및 본원에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2) 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3) 중 하나 이상 (예를 들어, 3개 모두)을 포함하며, 예를 들어 1개 이상, 예를 들어 3개 모두의 LC CDR과 1개 이상, 예를 들어 3개 모두의 HC CDR을 포함하는 인간화 항-EGFRvIII 결합 도메인일 수 있다. 한 실시양태에서, 코딩된 항-EGFRvIII 결합 도메인은 본원 (예를 들어, 표 2 또는 서열 11)에 기재된 경쇄 가변 영역 및/또는 본원 (예를 들어, 표 2 또는 서열 11)에 기재된 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 항-EGFRvIII 결합 도메인은 표 2 또는 서열 11의 아미노산 서열의 경쇄와 중쇄를 포함하는 scFv이다. 특정 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 표 2 또는 서열 11에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 2 또는 서열 11의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 표 2 또는 서열 11에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 2 또는 서열 11의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 38, 서열 44, 서열 50, 서열 56, 서열 62, 서열 68, 서열 74, 서열 80 및 서열 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열 68의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열 39, 서열 45, 서열 51, 서열 57, 서열 63, 서열 69, 서열 75, 서열 81, 및 서열 98로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 코딩된 항-EGFRvIII 결합 도메인은 scFv이고, 본원, 예를 들어 표 2 또는 서열 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어 본원에 기재된 링커를 통하여 본원, 예를 들어 표 2 또는 서열 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 한 실시양태에서, 상기 코딩된 항-EGFRvIII 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커 (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게 4 (서열 110)이다)를 포함한다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어 다음 배향 중 어느 것으로도 존재할 수 있다: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역.
한 실시양태에서, 코딩된 CAR은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인을 포함하는 막횡단 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 막횡단 도메인은 서열 15의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 막횡단 도메인은 서열 15의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 15의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열 8의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 코딩된 항-EGFRvIII 결합 도메인은 힌지(hinge) 영역, 예를 들어 본원에 기재된 힌지 영역에 의해 막횡단 도메인과 연결된다. 한 실시양태에서, 코딩된 힌지 영역은 서열 14 또는 서열 104 또는 서열 106 또는 서열 108, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 힌지 영역을 코딩하는 핵산 서열은 서열 7 또는 서열 105 또는 서열 107 또는 서열 109의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 추가로, 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 공동자극 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 공동자극 도메인은 서열 16의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 공동자극 도메인은 서열 102의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 공동자극 도메인은 서열 16 또는 서열 102의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 16 또는 서열 102의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열 9의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 추가로, 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 CD27의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열 16 또는 서열 102의 서열 및/또는 서열 17 또는 서열 99의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열 16의 아미노산 서열 및/또는 서열 17 또는 서열 99의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 16 또는 서열 102의 아미노산 서열 및/또는 서열 17 또는 서열 99의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 서열 16 또는 서열 102의 서열 및 서열 17 또는 서열 99의 서열을 포함하며, 이러한 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열 9 또는 서열 103의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열, 및/또는 서열 10 또는 서열 100의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 리더 서열, 예를 들어 본원에 기재된 리더 서열, 예를 들어 서열 13의 리더 서열; 본원에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 표 2 또는 서열 11에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열; 본원에 기재된 힌지 영역, 예를 들어 서열 14 또는 서열 104 또는 서열 106 또는 서열 108의 힌지 영역; 본원에 기재된 막횡단 도메인, 예를 들어 서열 15의 서열을 갖는 막횡단 도메인; 및 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인, 예를 들어 서열 16의 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인, 및/또는 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 서열 17 또는 서열 99의 서열을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인, 예를 들어 서열 102의 서열을 갖는 CD27 공동자극 도메인, 및/또는 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 서열 17 또는 서열 99의 서열을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인, 예를 들어 서열 16의 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인, 및 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 서열 17 또는 서열 99의 서열을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인, 예를 들어 서열 102의 서열을 갖는 CD27 공동자극 도메인, 및 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 서열 17 또는 서열 99의 서열을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 서열 6의 핵산 서열, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩된 리더 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 서열 39, 서열 45, 서열 51, 서열 57, 서열 63, 서열 69, 서열 75, 서열 81, 또는 서열 98의 핵산 서열, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩된 항-EGFR 결합 도메인 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 서열 69의 핵산 서열, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩된 항-EGFR 결합 도메인 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 서열 4의 핵산 서열, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩된 항-EGFR 결합 도메인 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 서열 8의 핵산 서열, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩된 막횡단 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 서열 9의 핵산 서열, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열 및/또는 서열 10의 핵산 서열, 또는 그와 95-99% 동일성을 갖는 서열에 의해 코딩된 세포내 신호전달 도메인 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 43, 서열 49, 서열 55, 서열 61, 서열 67, 서열 73, 서열 79, 서열 85 또는 서열 90의 CAR 아미노산 서열, 또는 서열 43, 서열 49, 서열 55, 서열 61, 서열 67, 서열 73, 서열 79, 서열 85 또는 서열 90의 아미노산 서열 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 15개, 20개 또는 30개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 60개, 50개 또는 40개 미만의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 43, 서열 49, 서열 55, 서열 61, 서열 67, 서열 73, 서열 79, 서열 85 또는 서열 90의 아미노산 서열과 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함한다 (예를 들어, 이루어진다). 한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 1 또는 서열 2의 CAR 아미노산 서열, 또는 서열 1 또는 서열 2의 아미노산 서열 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 15개, 20개 또는 30개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 60개, 50개 또는 40개 미만의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 1 또는 서열 2의 아미노산 서열과 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함한다 (예를 들어, 이루어진다).
한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 42, 서열 48, 서열 54, 서열 60, 서열 66, 서열 72, 서열 78, 서열 84 또는 서열 89의 핵산 서열, 또는 서열 42, 서열 48, 서열 54, 서열 60, 서열 66, 서열 72, 서열 78, 서열 84 또는 서열 89의 핵산 서열과 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다 (예를 들어, 이루어진다). 한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 18 또는 서열 19의 핵산 서열, 또는 서열 18 또는 서열 19의 핵산 서열과 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다 (예를 들어, 이루어진다).
한 측면에서, 본 발명은 항-EGFRvIII 결합 도메인을 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이며, 이러한 항-EGFRvIII 결합 도메인은 본원에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2) 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3) 중 하나 이상 (예를 들어, 3개 모두), 및 본원에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2) 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3) 중 하나 이상 (예를 들어, 3개 모두)을 포함하며, 예를 들어 1개 이상, 예를 들어 3개 모두의 LC CDR과 1개 이상, 예를 들어 3개 모두의 HC CDR을 포함하는 인간화 항-EGFRvIII 결합 도메인일 수 있다. 한 실시양태에서, 코딩된 항-EGFRvIII 결합 도메인은 본원 (예를 들어, 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80)에 기재된 경쇄 가변 영역 및/또는 본원 (예를 들어, 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80)에 기재된 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80의 아미노산 서열의 경쇄와 중쇄를 포함하는 scFv이다. 특정 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 38, 서열 44, 서열 50, 서열 56, 서열 62, 서열 68, 서열 74, 서열 80 및 서열 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 서열 39, 서열 45, 서열 51, 서열 57, 서열 63, 서열 69, 서열 75, 서열 81 및 서열 98로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 코딩된 항-EGFRvIII 결합 도메인은 scFv이고, 본원, 예를 들어 표 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어 본원에 기재된 링커를 통하여 본원, 예를 들어 표 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 한 실시양태에서, 상기 코딩된 항-EGFRvIII 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커 (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게 4 (서열 110)이다)를 포함한다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어 다음 배향 중 어느 것으로도 존재할 수 있다: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역.
또 다른 측면에서, 본 발명은 핵산 분자에 의해 코딩된 단리된 폴리펩티드 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드 분자는 서열 43, 서열 49, 서열 55, 서열 61, 서열 67, 서열 73, 서열 79, 서열 85 및 서열 90으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 73의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 79의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항-EGFRvIII 결합 도메인(예를 들어, EGFRvIII과 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 항체 단편), 막횡단 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 및/또는 일차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 단리된 키메라 항원 수용체 (CAR) 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 이러한 CAR은 본원에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 EGFRvIII과 특이적으로 결합하는 인간화 항체 또는 항체 단편); 본원에 기재된 막횡단 도메인; 및 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 본원에 기재된 공동자극 도메인 및/또는 일차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달)을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 본원에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2) 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3) 중 하나 이상 (예를 들어, 3개 모두), 및 본원에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2) 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3) 중 하나 이상 (예를 들어, 3개 모두)을 포함하며, 예를 들어 1개 이상, 예를 들어 3개 모두의 LC CDR과 1개 이상, 예를 들어 3개 모두의 HC CDR을 포함하는 인간화 항-EGFRvIII 결합 도메인일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 본원 (예를 들어, 표 2 또는 서열 11)에 기재된 경쇄 가변 영역 및/또는 본원 (예를 들어, 표 2 또는 서열 11)에 기재된 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 표 2 또는 서열 11에 열거된 아미노산 서열의 경쇄와 중쇄를 포함하는 scFv이다. 특정 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 표 2 또는 서열 11에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 2 또는 서열 11에 제공된 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 표 2 또는 서열 11에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 2 또는 서열 11에 제공된 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 38, 서열 44, 서열 50, 서열 56, 서열 62, 서열 68, 서열 74, 서열 80 및 서열 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 scFv이고, 본원, 예를 들어 표 2 또는 서열 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어 본원에 기재된 링커를 통하여 본원, 예를 들어 표 2 또는 서열 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커 (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게 4 (서열 110)이다)를 포함한다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어 다음 배향 중 어느 것으로도 존재할 수 있다: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역.
한 실시양태에서, 단리된 CAR 분자는 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 15의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 15의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 15의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 힌지 영역, 예를 들어 본원에 기재된 힌지 영역에 의해 막횡단 도메인과 연결된다. 한 실시양태에서, 코딩된 힌지 영역은 서열 14 또는 서열 104 또는 서열 106 또는 서열 108, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 CAR 분자는 추가로, 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열 16 또는 서열 102의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열 16 또는 서열 102의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 16 또는 서열 102의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 단리된 CAR 분자는 추가로, 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB 또는 CD27의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열 16 또는 서열 102의 서열 및/또는 서열 17의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열 16 또는 서열 102의 서열 및/또는 서열 99의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열 16 또는 서열 102의 아미노산 서열 및/또는 서열 17 또는 서열 99의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 16 또는 서열 102의 아미노산 서열 및/또는 서열 17 또는 서열 99의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열 16 또는 서열 102의 서열 및 서열 17 또는 서열 99의 서열을 포함하며, 이러한 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다.
한 실시양태에서, 단리된 CAR 분자는 추가로, 리더 서열, 예를 들어 본원에 기재된 리더 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 리더 서열은 서열 13의 아미노산 서열, 또는 서열 13의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 리더 서열, 예를 들어 본원에 기재된 리더 서열, 예를 들어 서열 13, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열의 리더 서열; 본원에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 표 2 또는 서열 11에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열; 힌지 영역, 예를 들어 본원에 기재된 힌지 영역, 예를 들어 서열 14 또는 서열 104 또는 서열 106 또는 서열 108, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열의 힌지 영역; 막횡단 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 막횡단 도메인, 예를 들어 서열 15의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 막횡단 도메인; 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 세포내 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동자극 도메인 및/또는 일차 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인)을 포함하는 단리된 CAR 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인, 예를 들어 서열 16의 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인, 또는 서열 102, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 CD27 공동자극 도메인, 및/또는 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 서열 17 또는 서열 99의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 공동자극 도메인, 예를 들어 서열 16의 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인 또는 서열 102의 서열을 갖는 CD27 공동자극 도메인, 및/또는 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 본원에 기재된 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 서열 17 또는 서열 99의 서열을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 단리된 CAR 분자는 서열 43, 서열 49, 서열 55, 서열 61, 서열 67, 서열 73, 서열 79, 서열 85 또는 서열 90의 아미노산 서열, 또는 서열 43, 서열 49, 서열 55, 서열 61, 서열 67, 서열 73, 서열 79, 서열 85 또는 서열 90의 아미노산 서열 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 15개, 20개 또는 30개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 60개, 50개 또는 40개 미만의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 43, 서열 49, 서열 55, 서열 61, 서열 67, 서열 73, 서열 79, 서열 85 또는 서열 90의 아미노산 서열과 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다 (예를 들어, 이루어진다). 한 실시양태에서, 단리된 CAR 분자는 서열 1 또는 서열 2의 아미노산 서열, 또는 서열 1 또는 서열 2의 아미노산 서열 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 15개, 20개 또는 30개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 60개, 50개 또는 40개 미만의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 1 또는 서열 2의 아미노산 서열과 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다 (예를 들어, 이루어진다). 한 실시양태에서, 단리된 CAR 분자는 서열 73의 아미노산 서열, 또는 서열 73의 아미노산 서열 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 15개, 20개 또는 30개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 60개, 50개 또는 40개 미만의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 73의 아미노산 서열과 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다 (예를 들어, 이루어진다). 한 실시양태에서, 단리된 CAR 분자는 서열 79의 아미노산 서열, 또는 서열 79의 아미노산 서열 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 15개, 20개 또는 30개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 60개, 50개 또는 40개 미만의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 79의 아미노산 서열과 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다 (예를 들어, 이루어진다).
한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2) 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3) 중 하나 이상 (예를 들어, 3개 모두), 및 본원에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2) 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3) 중 하나 이상 (예를 들어, 3개 모두)을 포함하는 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 1개 이상, 예를 들어 3개 모두의 LC CDR과 1개 이상, 예를 들어 3개 모두의 HC CDR을 포함하는 인간화 항-EGFRvIII 결합 도메인에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 본원 (예를 들어, 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80)에 기재된 경쇄 가변 영역 및/또는 본원 (예를 들어, 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80)에 기재된 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80의 아미노산 서열의 경쇄와 중쇄를 포함하는 scFv이다. 특정 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 38, 서열 44, 서열 50, 서열 56, 서열 62, 서열 68, 서열 74, 서열 80 및 서열 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 scFv이고, 본원, 예를 들어 표 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역은 링커, 예를 들어 본원에 기재된 링커를 통하여 본원, 예를 들어 표 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역에 부착된다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 (Gly4-Ser)n 링커 (여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게 4 (서열 110)이다)를 포함한다. scFv의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은, 예를 들어 다음 배향 중 어느 것으로도 존재할 수 있다: 경쇄 가변 영역-링커-중쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역-링커-경쇄 가변 영역.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 핵산 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 한 실시양태에서, 벡터는 추가로, 프로모터를 포함한다. 한 실시양태에서, 프로모터는 EF-1 프로모터이다. 한 실시양태에서, EF-1 프로모터는 서열 97의 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 벡터는 시험관내 전사된 벡터, 예를 들어 본원에 기재된 핵산 분자의 RNA를 전사하는 벡터이다. 한 실시양태에서, 벡터 내의 핵산 서열은 추가로, 폴리(A) 꼬리(tail), 예를 들어 본원에 기재된 폴리 A 꼬리, 예를 들어 약 150개의 아데노신 염기를 포함하는 (서열 111) 폴리 A 꼬리를 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터 내의 핵산 서열은 추가로, 3' UTR, 예를 들어 본원에 기재된 3' UTR, 예를 들어 인간 베타-글로불린으로부터 유래된 3' UTR의 하나 이상의 반복 서열을 포함하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 세포는 본원에 기재된 세포, 예를 들어 인간 T 세포, 예를 들어 본원에 기재된 인간 T 세포이다. 한 실시양태에서, 인간 T 세포는 CD8+ T 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 세포, 예를 들어 본원에 기재된 T 세포를, CAR, 예를 들어 본원에 기재된 CAR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질도입하는 것을 포함하는, 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 외인성 RNA를 일시적으로 발현하는 RNA-조작된 세포, 예를 들어 본원에 기재된 세포, 예를 들어 T 세포의 집단을 생성시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 상기 RNA는 본원에 기재된 CAR 분자를 코딩하는 핵산을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 특정 포유동물에게, CAR 분자를 발현하는 세포, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에 항-종양 면역을 제공하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 세포는 자가 T 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 동종 T 세포이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 EGFRvIII의 발현과 연관된 질환이 있는 포유동물에게, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, EGFRvIII의 발현과 연관된 질환 (예를 들어, EGFRvIII의 발현과 연관된, 증식성 질환, 전암성 병태 및 비-암 관련 징후)이 있는 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 상기 질환은 본원에 기재된 질환이다. 한 실시양태에서, EGFRvIII과 연관된 질환은 교모세포종이다. 한 실시양태에서, EGFRvIII과 연관된 질환은 암, 예를 들어 다형성 교모세포종 (GBM), 역형성 성상세포종, 거대 세포 교모세포종, 신경교육종, 역형성 핍지교종, 역형성 상의세포종, 맥락총 암종, 역형성 신경절교종, 송과체모세포종, 수질상피종, 상의모세포종, 수모세포종, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 비정형 기형양/횡문근양 종양, 폐암 (예를 들어, 비소세포 폐 암종), 유방 암종, 전립선 암종, 난소 암종, 결장직장 암종 및 방광 암종, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암, 및 상기 암 중 어느 것의 전이이다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는, CAR 분자를 발현하는 세포의 효능을 증가시키는 작용제, 예를 들어 본원에 기재된 작용제와 조합하여 투여한다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는, CAR 분자를 발현하는 세포의 투여와 연관된 하나 이상의 부작용을 완화시키는 작용제, 예를 들어 본원에 기재된 작용제와 조합하여 투여한다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는, EGFRvIII과 연관된 질환을 치료하는 작용제, 예를 들어 본원에 기재된 작용제와 조합하여 투여한다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는 본원에 기재된 용량 및/또는 투여 스케줄로 투여한다.
한 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는 상기 질환, 예를 들어 암, 예를 들어 본원에 기재된 암에 대한 1차 치료로서 투여한다. 또 다른 실시양태에서, CAR 분자, 예를 들어 본원에 기재된 CAR 분자를 발현하는 세포는 상기 질환, 예를 들어 암, 예를 들어 본원에 기재된 암에 대한 2차, 3차, 4차 치료로서 투여한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CAR을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 본 발명의 CAR의 단리된 폴리펩티드 분자, 본 발명의 CAR을 포함하는 벡터, 및 의약, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 CAR을 포함하는 세포에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CAR을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 본 발명의 CAR의 단리된 폴리펩티드 분자, 본 발명의 CAR을 포함하는 벡터, 및 EGFRvIII을 발현하는 질환, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 EGFRvIII을 발현하는 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 CAR을 포함하는 세포에 관한 것이다.
도 1a 및 1b는 3C10-CAR 및 miR-17-92에 대한 렌티바이러스 벡터의 일련의 개략적 다이어그램이다. 도 1a는 3C10-CAR 발현성 벡터 pELNS-3C10-CAR을 도시한 것이고, 도 1b는 miR-17-92-발현성 렌티바이러스 벡터를 도시한 것이다.
도 2a 내지 2c는 인간 T 세포에서 렌티바이러스적으로 형질도입된 3C10-CAR 및 miR-17-92의 기능적 발현을 나타내는 일련의 영상이다. CD3+ T 세포는 pELNS-3C10-CAR 단독으로, 또는 pELNS-3C10-CAR과 FG12-EF1a-miR-17/92 둘 다로 형질도입하였다.
도 3a 내지 3d는 CAR-T-세포에서의 miR17-92의 공동-발현이 TGF-β 및 TMZ의 억제 효과에 대한 저항성을 부여한다는 것을 입증하는 일련의 영상이다. CAR-T-세포 (흰색 막대), 및 miR-17-92로 공동-형질도입된 세포 (흑색 막대)를, TGF-β 및 TMZ의 표시된 농도의 존재 하에 EGFRvIII을 발현하는 APC와 함께 공동-배양하였다.
도 4a 및 4b는 U87-EGFRvIII 종양을 보유하고 있는 마우스에서 CAR-T-세포의 강건한 치료 효과를 도시하는 영상이다.
도 5a 내지 5c는 CAR-T 세포에서 공동-형질도입된 miR-17-92가 재-시험감염된 신경교종 세포에 대항하여 개선된 보호를 부여한다는 것을 입증하는 일련의 영상이다.
도 6은 대표적인 EGFRvIII CAR (외관 순서상 각각 서열 1, 121 및 2)의 비교를 보여주는 영상이다.
도 7은 EGFRvIII CAR로 형질도입된 인간 T-세포가 EGFRvIII-발현성 U87 인간 GBM 세포 (U87-EGFRvIII)의 특이적이고도 강력한 용해를 나타냈다는 것을 보여주는 영상이다.
도 8은 모든 항-EGFRvIII CART가 종양 세포를 제거하지만, 구축물 3C10.BBz CART는 종양을 7일째에 가장 신속하게 제거한다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 9는 인간화 EGFRvIII의 VH 및 VL 서열 (외관 순서상 각각 서열 122-127)을 보여주는 표이다.
도 10은 EGFRvIII + 세포주와 결합하는 가용성 인간화 scFv 구축물의 시험관내 결합을 보여주는 그래프이다.
도 11은 EGFR 야생형 세포주와 결합하는 가용성 인간화 scFv 구축물의 시험관내 결합을 보여주는 그래프이며, 클론 73 (CAR6으로서 지칭되기도 함) 및 클론 74 (CAR7로서 지칭되기도 함)가 더 안전한 프로파일을 보여준다.
도 12는 Jurkat 세포의 일시적 형질감염 및 Fc 융합 단백질로의 검출에 있어서 EGFRvIII 및 야생형 EGFR에 대한 뮤린 CAR9 및 인간 CAR10의 특이성을 비교한 그래프이다.
도 13은 포화량의 EGFRvIII로 염색된, 인간화 EGFRvIII CAR 구축물 mCAR19 (대조군), CAR10, CAR9, 및 CAR6을 이용한 공여자 T 세포의 일차 T 세포 형질도입을 보여주는 그래프이다.
도 14는 BHK-EGFRvIII에 의한 인간화 EGFRvIII CAR 구축물의 루시페라제 활성을 보여주는 그래프이다 (야생형 세포에 의해서는 그렇지 못하다).
도 15는 인간화 EGFRvIII CAR 구축물이 U87vIII 시험감염에 반응하여 증식되지만, 야생형 EGFR에 대한 배경 증식이 없다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 16은 인간화 EGFRvIII CAR 구축물이 U87vIII 시험감염의 존재 하에 시험관내에서 증식된다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 17은 인간화 EGFRvIII CAR 구축물, 2173 (CAR6) 및 CAR9가 EGFRvIII 발현성 세포를 특이적으로 사멸시키지만, 야생형 EGFR 세포는 그렇지 않은, 4시간 51-크롬 방출 종양 사멸 검정을 보여주는 그래프이다.
도 18은 인간화 EGFRvIII CAR 구축물 (CAR6)로 형질도입된 CAR+ T 세포로 처리된 마우스에서 생체내에서 종양 크기의 진행 (㎤, 상단 좌측 패널), 및 종양 방사휘도(radiance) 평균 (p/s/㎠/sr, 상단 우측 패널) 및 카플란-마이어(Kaplan-meier) 생존 곡선 (하단)의 진행을 보여주는 그래프이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야에서의 통상의 기술자에게 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
단수 형태의 용어는 1개 또는 1개 초과 (즉, 1개 이상)을 지칭한다. 한 예로서, "요소"는 1개의 요소 또는 1개 초과의 요소를 의미한다.
측정 가능한 값, 예컨대 양, 지속 시간 등을 언급하는 경우의 용어 "약"은 명시된 값으로부터의 ±20%, 또는 일부 경우에 ±10%, 또는 일부 경우에 ±5%, 또는 일부 경우에 ±1%, 또는 일부 경우에 ±0.1%의 변동을 포괄하는 것을 의미하는데, 이는 이러한 변동이 본원에 개시된 방법을 수행하는 데 적당하기 때문이다.
용어 "키메라 항원 수용체" 또는 또 다른 한편으론 "CAR"은 적어도 세포외 항원 결합 도메인; 막횡단 도메인; 및 다음에 정의되는 바와 같은 자극성 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 신호전달 도메인 (본원에서 "세포내 신호전달 도메인"으로서 지칭되기도 함)을 포함하는 재조합 폴리펩티드 구축물을 지칭한다. 한 측면에서, 자극성 분자는 T 세포 수용체 복합체와 연합된 제타 쇄이다. 한 측면에서, 세포질 신호전달 도메인은 다음에 정의되는 바와 같은 하나 이상의 공동자극성 분자로부터 유래된 하나 이상의 기능적 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 공동자극성 분자는 4-1BB (즉, CD137) 및/또는 CD28로부터 선택된다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인; 막횡단 도메인; 및 자극성 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인; 막횡단 도메인; 및 공동자극성 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인 및 자극성 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인; 막횡단 도메인; 및 하나 이상의 공동자극성 분자(들)로부터 유래된 2개의 기능적 신호전달 도메인 및 자극성 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인; 막횡단 도메인; 및 하나 이상의 공동자극성 분자(들)로부터 유래된 2개 이상의 기능적 신호전달 도메인 및 자극성 분자로부터 유래된 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 CAR 융합 단백질의 아미노-말단 (N-말단)에서 임의의 리더 서열을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 세포외 항원 인식 도메인의 N-말단에서 리더 서열을 추가로 포함하며, 이러한 리더 서열은 세포성 막에 대한 CAR의 세포성 프로세싱 및 국재화 동안 항원 인식 도메인 (예를 들어, scFv)으로부터 임의로 절단된다.
용어 "신호전달 도메인"은 세포 내의 정보를 전달함으로써 작용하여, 제2의 메신저를 생성시키거나 또는 이러한 메신저에 대해 반응하여 이펙터로서 기능함으로써 규정된 신호전달 경로를 통하여 세포성 활성을 조절하는, 단백질의 기능적 부분을 지칭한다.
용어 "EGFR"은 인간 및 비-인간 형태를 포함한, 모든 포유동물의 성숙한 전장 표피 성장 인자 수용체를 지칭한다. 1186개 아미노산 인간 EGFR이 문헌 [Ullrich et al., Nature 309:418-425 (1984)] 및 유전자은행 수탁 번호 AF125253 및 스위스프로트(SwissProt) 수탁 번호 P00533-2에 기재되어 있다.
용어 "EGFRvIII"은 표피 성장 인자 수용체 변이체 III을 지칭한다. EGFRvIII은 인간 종양에서 관찰되는 EGFR의 가장 흔한 변이체이지만, 정상 조직에서는 거의 관찰되지 않는다. 이러한 단백질은 엑손 2-7의 프레임내 결실로부터 비롯되고, EGFR의 세포외 도메인 내의 엑손 1과 8의 연접부에 신규 글리신 잔기가 생성됨으로써, 종양 특이적 에피토프가 창출된다. EGFRvIII은 GBM의 24% 내지 67%에서 발현되지만, 정상 조직에서는 그렇지 않다. EGFRvIII은 유형 III 돌연변이체, 델타-EGFR, EGFRde2-7, 및 ΔEGFR로서 공지되기도 하고, 이는 미국 특허 번호 6,455,498, 6,127,126, 5,981,725, 5,814,317, 5,710,010, 5,401,828, 및 5,212,290에 기재되어 있다. EGFRvIII의 발현은 염색체 결실로부터 비롯될 수 있고, 이는 또한, 이상한 대체 스플라이싱으로부터 비롯될 수 있다 (문헌 [Sugawa et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:8602-8606] 참조).
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 분자로부터 유래된 단백질, 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날, 다중 또는 단일 쇄, 또는 온전한 이뮤노글로불린일 수 있고, 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 항체는 이뮤노글로불린 분자의 사량체일 수 있다.
용어 "항체 단편"은 온전한 항체, 또는 그의 재조합 변이체의 적어도 한 부분을 지칭하고, 항원 결합 도메인, 예를 들어 특정 표적, 예컨대 항원에 대한 항체 단편의 인식과 특이적 결합을 부여하기에 충분한, 온전한 항체의 항원성 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, scFv 항체 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 예컨대 sdAb (VL 또는 VH), 카멜리드(camelid) VHH 도메인, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 용어 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 하나 이상의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 하나 이상의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하는데, 상기 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 짧은 가요성 폴리펩티드 링커를 통하여 연속적으로 연결되고, 단일 쇄 폴리펩티드로서 발현될 수 있으며, 상기 scFv는 그것이 유래되는 온전한 항체의 특이성을 보유하고 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 scFv는 VL 및 VH 가변 영역을 어느 한 순서로, 예를 들어 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단 끝을 기준으로 하여 어느 한 순서로 가질 수 있고, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 또는 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
항체 또는 그의 항체 단편을 포함하는 본 발명의 CAR 조성물의 일부는 각종 형태로 존재할 수 있는데, 항원 결합 도메인은, 예를 들어 단일 도메인 항체 단편 (sdAb), 단일 쇄 항체 (scFv) 및 인간화 항체를 포함한, 연속되는 폴리펩티드 쇄의 일부로서 발현된다 (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). 한 측면에서, 본 발명의 CAR 조성물의 항원 결합 도메인은 항체 단편을 포함한다. 추가 측면에서, CAR은 scFv를 포함하는 항체 단편을 포함한다.
용어 "항체 중쇄"는 그의 자연 발생적 입체 형태에서 항체 분자에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드 쇄 중 더 큰 것을 지칭하고, 이는 정상적으로, 항체가 속하는 부류를 결정한다.
용어 "항체 경쇄"는 그의 자연 발생적 입체 형태에서 항체 분자에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩티드 쇄 중 더 작은 것을 지칭한다. 카파 (κ) 및 람다 (λ) 경쇄는 2개의 주요 항체 경쇄 이소형을 지칭한다.
용어 "재조합 항체"는 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성되는 항체, 예컨대 예를 들어 박테리오파지 또는 효모 발현 시스템에 의해 발현된 항체를 지칭한다. 상기 용어는 또한, 항체를 코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되었던 항체를 의미하는 것으로 이해되어야 하고, DNA 분자는 이러한 항체를 구체화하는 아미노산 서열 또는 항체 단백질을 발현하며, 이러한 DNA 또는 아미노산 서열은 당해 분야에서 이용 가능하고 널리 공지되어 있는 재조합 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 이용하여 수득하였다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 일으키는 분자로서 정의된다. 이러한 면역 반응은 항체 생성 또는 특이적 면역학적-적격 세포의 활성화 중 어느 하나, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함한, 어떠한 거대분자도 항원으로서 제공될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 더욱이, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 통상의 기술자는 면역 반응을 유발시키는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 어떠한 DNA도, 본원에 사용되는 바와 같은 그 용어로서의 "항원"을 코딩한다는 것을 이해할 것이다. 더욱이, 통상의 기술자는 항원이 특정 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 코딩될 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 본 발명이 2개 이상의 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 이들 뉴클레오티드 서열이, 목적하는 면역 반응을 유발시키는 폴리펩티드를 코딩하기 위하여 각종 조합으로 배열된다는 것은 용이하게 명백하다. 더욱이, 통상의 기술자는 항원이 "유전자"에 의해 코딩될 필요가 전혀 없다는 것을 이해할 것이다. 항원이 합성적으로 생성될 수 있거나 또는 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있거나, 또는 이것이 폴리펩티드 이외의 거대분자일 수 있다는 것은 용이하게 명백하다. 이러한 생물학적 샘플은 기타 생물학적 성분을 지닌 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 유체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "항-종양 효과"는 각종 수단에 의해 분명히 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭하는데, 이는 예를 들어, 종양 용적의 감소, 종양 세포 수의 감소, 전이 수의 감소, 수명 증가, 종양 세포 증식의 감소, 종양 세포 생존 저하, 또는 암성 병태와 연관된 각종 생리학적 증상의 완화를 포함하지만, 그에 제한되지 않는다. "항-종양 효과"는 또한 우선, 종양의 발생을 방지하는 데 있어서의 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 분명히 나타낼 수 있다.
용어 "자가"는 동일한 개체로부터 유래되어, 이것이 나중에 그 개체 내로 재도입되는 모든 물질을 지칭한다.
용어 "동종"은 물질이 도입되는 개체와 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 모든 물질을 지칭한다. 하나 이상의 유전자 자리에서의 유전자가 동일하지 않은 경우, 둘 이상의 개체는 서로 동종인 것으로 간주된다. 일부 측면에서, 동일한 종의 개체로부터의 동종 물질은 항원과 관련하여 상호 작용하기에 충분히 유전적으로 다를 수 있다.
용어 "이종"은 상이한 종의 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
용어 "암"은 이상한 세포의 신속하고도 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 암 세포는 국소적으로 확산되거나 또는 혈류와 림프계를 통하여 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다. 각종 암의 예는 본원에 기재되어 있고, 교모세포종, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "EGFRvIII의 발현과 연관된 질환"은 각종 암, 예컨대 예를 들어, 교모세포종 (교모세포종 줄기 세포 포함); 유방, 난소 및 비소세포 폐 암종; 두경부 편평 세포 암종; 수모세포종, 결장직장암, 전립선암, 및 방광 암종의 종양 세포를 포함한, EGFRvIII을 발현하는 세포와 연관된 병태 또는 EGFRvIII의 발현과 연관된 질환을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특별한 이론이나 기전에 얽매이는 것은 아니지만, EGFRvIII에 대항한 항원-특이적 반응을 유발시킴으로써, 본원에 개시된 CAR은 다음 중 한 가지 이상을 제공하는 것으로 여겨진다: EGFRvIlI-발현성 종양 세포를 표적화하여 파괴시키고; 종양을 감소시키거나 없애며; 면역 세포를 종양 부위에 침윤시키는 것을 촉진시키고; 항-종양 반응을 증강/확장시킨다. EGFRvIII은 정상 (즉, 비-암성) 조직에서는 검출 가능한 수준으로 발현되지 않기 때문에, 본 발명의 CAR은 유리하게도, 정상 조직 및 세포를 표적화/파괴시키는 것을 실질적으로 피하는 것으로 고려된다.
용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 항체 단편의 결합 특징에 상당한 영향을 미치지 않거나 또는 이를 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭하는 것으로 의도된다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 당해 분야에 공지된 표준 기술, 예컨대 부위-지시된 돌연변이 유발 및 PCR-매개된 돌연변이 유발에 의해 본 발명의 항체 또는 항체 단편 내로 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 계열은 당해 분야에 정의되었다. 이들 계열은 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 본 발명의 CAR 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 계열로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체시킬 수 있고, 이와 같이 변경된 CAR은 본원에 기재된 기능적 검정을 이용하여 시험할 수 있다.
용어 "자극"은 자극성 분자 (예를 들어, TCR/CD3 복합체)를 그의 동족 리간드와 결합시킴으로써 신호 변환 현상, 예컨대 TCR/CD3 복합체를 통한 신호 변환 (이에 제한되지 않는다)을 매개함으로써 유도된 일차 반응을 지칭한다. 자극은 특정 분자의 변경된 발현, 예컨대 TGF-β의 하향 조절 및/또는 세포골격 구조의 재편성 등을 매개할 수 있다.
용어 "자극성 분자"는 T 세포 신호전달 경로의 적어도 일부 측면을 위해 자극성 방식으로 TCR 복합체의 일차 활성화를 조절하는 일차 세포질 신호전달 서열(들)을 제공하는 T 세포에 의해 발현된 분자를 지칭한다. 한 측면에서, 일차 신호는, 예를 들어 펩티드가 부하된 MHC 분자를 수반한 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 개시되고, 증식, 활성화, 분화 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 T 세포 반응의 매개를 초래한다. 자극성 방식으로 작용하는 일차 세포질 신호전달 서열 ("일차 신호전달 도메인"으로서 지칭되기도 함)은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 공지되는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 본 발명에 특히 사용되는 ITAM 함유 일차 세포질 신호전달 서열의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 ("ICOS"로서 공지되기도 함) 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 특이적 CAR에서, 본 발명의 어느 하나 이상의 CAR 내의 세포내 신호전달 도메인은 세포내 신호전달 서열, 예를 들어 CD3-제타의 일차 신호전달 서열을 포함한다. 본 발명의 특이적 CAR에서, CD3-제타의 일차 신호전달 서열은 서열 17로서 제공된 서열, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가의 잔기이다. 본 발명의 특이적 CAR에서, CD3-제타의 일차 신호전달 서열은 서열 99로서 제공된 서열, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가의 잔기이다.
용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 그의 표면 상에 주요 조직적합성 복합체 (MHC)와 복합체를 형성한 외래 항원을 디스플레이하는 보조 세포 (예를 들어, B-세포, 수지상 세포 등)와 같은 면역계 세포를 지칭한다. T-세포는 그들의 T-세포 수용체 (TCR)를 이용하여 이들 복합체를 인식할 수 있다. APC는 항원을 프로세싱하고 이들을 T-세포에 제시한다.
본원에 사용된 용어로서의 "세포내 신호전달 도메인"은 분자의 세포내 부분을 지칭한다. 이러한 세포내 신호전달 도메인은 CAR 함유 세포, 예를 들어 CART 세포의 면역 이펙터 기능을 증진시키는 신호를 발생한다. 예를 들어, CART 세포에서 면역 이펙터 기능의 예는 세포용해 활성 및 헬퍼 활성 (시토카인의 분비 포함)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예시되는 일차 세포내 신호전달 도메인은 일차 자극 또는 항원 의존성 자극에 대해 책임이 있는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공동자극성 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 예시되는 공동자극성 세포내 신호전달 도메인은 공동자극성 신호 또는 항원 비의존성 자극에 대해 책임이 있는 분자로부터 유래된 것을 포함한다. 예를 들어, CART의 경우, 일차 세포내 신호전달 도메인은 T 세포 수용체의 세포질 서열을 포함할 수 있고, 공동자극성 세포내 신호전달 도메인은 공-수용체 또는 공동자극성 분자로부터의 세포질 서열을 포함할 수 있다.
일차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 공지되는 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. ITAM 함유 일차 세포질 신호전달 서열의 예는 CD3 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d DAP10 및 DAP12로부터 유래된 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "제타" 또는 또 다른 한편으론 "제타 쇄", "CD3-제타" 또는 "TCR-제타"는 유전자은행 수탁 번호 BAG36664.1로서 제공된 단백질, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가의 잔기로서 정의되고, "제타 자극 도메인" 또는 또 다른 한편으론 "CD3-제타 자극 도메인" 또는 "TCR-제타 자극 도메인"은 T 세포 활성화에 필요한 초기 신호를 기능적으로 전송하기에 충분한 제타 쇄의 세포질 도메인으로부터의 아미노산 잔기로서 정의된다. 한 측면에서, 제타의 세포질 도메인은 유전자은행 수탁 번호 BAG36664.1의 잔기 52 내지 164, 또는 그의 기능적 오르소로그(ortholog)인, 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가의 잔기를 포함한다. 한 측면에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 서열 17로서 제공된 서열이다. 한 측면에서, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 서열 99로서 제공된 서열이다.
용어 "공동자극성 분자"는 공동자극성 리간드와 특이적으로 결합함으로써, T 세포에 의한 공동자극성 반응 (예를 들어, 증식이지만, 이에 제한되지 않는다)을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 공동자극성 분자는 유효한 면역 반응에 요구되는 항원 수용체 또는 그들의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 공동자극성 분자는 MHC 부류 I 분자, BTLA 및 톨(Toll) 리간드 수용체뿐만 아니라 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) 및 4-1BB (CD137)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
공동자극성 세포내 신호전달 도메인은 공동자극성 분자의 세포내 부분으로부터 유래될 수 있다. 공동자극성 분자는 다음 단백질 계열로 나타낼 수 있다: TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린(integrin), 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질), 및 활성화 NK 세포 수용체. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다.
세포내 신호전달 도메인은 이것이 유래되는 분자의 전체 세포내 부분 또는 전체 천연 세포내 신호전달 도메인, 또는 그의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
용어 "4-1BB"는 유전자은행 수탁 번호 AAA62478.2로서 제공된 아미노산 서열, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가의 잔기를 수반한 TNFR 초분자군의 구성원을 지칭하고; "4-1BB 공동자극 도메인"은 유전자은행 수탁 번호 AAA62478.2의 아미노산 잔기 214-255, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가의 잔기로서 정의된다. 한 측면에서, "4-1BB 공동자극 도메인"은 서열 16으로서 제공된 서열, 또는 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 등가의 잔기이다.
용어 "코딩"은 뉴클레오티드의 규정된 서열 (예를 들어, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 아미노산의 규정된 서열을 갖는 생물학적 과정 중의 기타 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 제공되는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA 내의 뉴클레오티드의 특이적 서열의 고유 특성, 및 이들로부터 비롯된 생물학적 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자, cDNA, 또는 RNA는, 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역으로 인해 세포 또는 기타 생물학적 시스템에서 단백질이 생성된다면, 이러한 단백질을 코딩한다. 코딩 가닥 (그의 뉴클레오티드 서열은 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록에 제공된다)과, 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용된 비-코딩 가닥 둘 다가, 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 기타 생성물을 코딩하는 것으로서 지칭될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 변성 버전이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이란 또한, 이러한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "치료상 유효량"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 특별한 생물학적 결과를 달성하는 데 유효한, 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 제제, 물질 또는 조성물의 양을 지칭한다.
용어 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 내부로부터의 모든 물질 또는 이들 내부에서 생성된 모든 물질을 지칭한다.
용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 외부로부터 도입된 모든 물질 또는 이들 외부에서 생성된 모든 물질을 지칭한다.
용어 "발현"은 프로모터에 의해 구동된 특별한 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭한다.
용어 "전이 벡터"는 단리된 핵산을 포함하고, 이러한 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 연합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 수많은 벡터가 당해 분야에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "전이 벡터"는 자가 복제성 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 세포 내로의 핵산의 전이를 촉진시키는 비-플라스미드 및 비-바이러스성 화합물, 예컨대 예를 들어, 폴리리신 화합물, 리포솜 등을 추가로 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스성 전이 벡터의 예는 아데노바이러스성 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스성 벡터, 렌티바이러스성 벡터 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "발현 벡터"는 발현될 뉴클레오티드 서열과 작동적으로 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현에 충분한 시스-작용성 요소를 포함하고; 발현을 위한 기타 요소가 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 당해 분야에 공지된 모든 것을 포함하고, 이는 재조합 폴리뉴클레오티드를 혼입한 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 있는 그대로의 플라스미드 또는 리포솜에 함유된 플라스미드) 및 바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 관련 바이러스)를 포함한다.
용어 "렌티바이러스"는 레트로비리다에(Retroviridae)과의 한 속이다. 렌티바이러스는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스들 중에서 독특하고; 이들은 상당량의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA 내로 전달할 수 있으므로, 유전자 전달 벡터의 가장 유효한 방법 중 하나이다. HIV, SIV, 및 FIV가 모두, 렌티바이러스의 예이다.
용어 "렌티바이러스성 벡터"는 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래된 벡터를 지칭하고, 이는 특히, 문헌 [Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)]에 제공된 바와 같은 자기-불활성화 렌티바이러스성 벡터를 포함한다. 임상에서 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 기타 예는, 예를 들어 옥스포드 바이오메디카(Oxford BioMedica)로부터의 LENTIVECTOR® 유전자 전달 기술, 렌티젠(Lentigen)으로부터의 LENTIMAX™ 벡터 시스템 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 렌티바이러스성 벡터의 비-임상 유형이 또한 이용 가능하고, 통상의 기술자에게 공지될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 두 중합체성 분자, 예를 들어 두 핵산 분자, 예컨대 두 DNA 분자 또는 두 RNA 분자, 또는 두 폴리펩티드 분자 간의 소단위 서열 동일성을 지칭한다. 이러한 두 분자 모두에서의 소단위위치가 동일한 단량체성 소단위에 의해 점유된 경우; 예를 들어, 두 DNA 분자 각각에서의 위치가 아데닌에 의해 점유된 경우, 이들 분자는 그 위치에서 상동성이거나 동일하다. 두 서열 간의 상동성은 매칭되거나 상동성인 위치의 수에 비례하는 함수인데; 예를 들어, 두 서열 내의 위치의 절반 (예를 들어, 길이가 10개 소단위인 중합체 내의 5개 위치)이 상동성인 경우, 이들 두 서열은 50% 상동성이고; 위치의 90% (예를 들어, 10개 중 9개)가 매치되거나 상동성인 경우, 이들 두 서열은 90% 상동성이다.
"인간화" 형태의 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는, 키메라 이뮤노글로불린, 그의 이뮤노글로불린 쇄 또는 단편 (예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 항체의 기타 항원-결합성 아서열)이다. 대부분의 경우, 인간화 항체 및 그의 항체 단편은, 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체시킨 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체 또는 항체 단편)이다. 일부 경우에는, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체시킨다. 더욱이, 인간화 항체/항체 단편은 수용자 항체에서 발견되지 않거나, 또는 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 또는 항체 단편 성능을 추가로 정련시키고 최적화할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체 또는 그의 항체 단편은 1개 이상, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 CDR 영역에 상응하고, FR 영역의 모두 또는 상당 부분은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체 또는 항체 단편은 또한, 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 추가의 상세 내역에 대해서는, 문헌 ([Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986]; [Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988]; [Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992])을 참조할 수 있다.
용어 "인간" 항체는 완전 인간 항체를 지칭할 뿐만 아니라 유효한 인간 항체를 지칭한다. "완전 인간"은 완전 분자가 인간 기원의 것이거나 또는 항체 또는 이뮤노글로불린의 인간 형태와 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 이뮤노글로불린, 예컨대 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. "유효한 인간" 항체는 이러한 항체가 정상 인간에서 면역원성 반응을 유발시키지 않도록 하기에 충분한 수의 인간 아미노산 위치를 포함하는 항체이다.
용어 "단리된"은 자연 상태로부터의 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에서 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 그의 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된, 상기 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 또는 비-천연 환경, 예컨대 예를 들어, 숙주 세포에 존재할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 흔히 발생하는 핵산 염기에 대한 다음 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하며, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하며, "U"는 우리딘을 지칭한다.
용어 "작동적으로 연결된" 또는 "전사 제어"는 조절성 서열과 이종 핵산 서열 간의 기능적 연쇄를 지칭하는데, 이로써 이종 핵산 서열이 발현된다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 배치되는 경우, 이러한 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동적으로 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 이러한 프로모터는 상기 코딩 서열과 작동적으로 연결된다. 작동적으로 연결된 DNA 서열은 서로 연속될 수 있고, 예를 들어 연결시킬 필요가 있는 경우, 두 단백질 코딩 영역은 동일한 판독 프레임 내에 있다.
용어 면역원성 조성물의 "비경구" 투여는, 예를 들어 피하 (s.c.), 정맥내 (i.v.), 근육내 (i.m.), 또는 흉골내 주사, 종양내 또는 주입 기술을 포함한다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일 가닥 형태 또는 이중 가닥 형태의, 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA) 및 그의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 지니고 자연 발생적 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 자연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 표시되지 않는 한, 특별한 핵산 서열은 또한, 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 변성 코돈 치환물), 대립 유전자, 오르소로그, SNP 및 상보적 서열뿐만 아니라 명쾌하게 표시된 서열을 암시적으로 포괄한다. 구체적으로 언급하면, 변성 코돈 치환은 선택된 1개 이상 (또는 모든) 코돈의 세 번째 위치를 혼합된-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환시킨 서열을 생성시킴으로써 달성될 수 있다 [Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)].
용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호 교환적으로 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 2개 이상의 아미노산을 함유해야만 하고, 단백질의 서열 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 대한 제한은 없다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 어떠한 펩티드 또는 단백질도 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 상기 용어는 단쇄 (이는 또한 당해 분야에서, 예를 들어 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로서 흔히 지칭된다)와 보다 장쇄 (이는 일반적으로, 당해 분야에서 많은 유형의 단백질로서 지칭된다) 둘 다를 지칭한다. "폴리펩티드"는 예를 들어, 특히 생물학상 활성 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종-이량체, 이종-이량체, 폴리펩티드의 변이체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 자연 펩티드, 재조합 펩티드, 또는 그의 조합물을 포함한다.
용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오티드 서열의 특이적 전사를 개시하는 데 요구되는, 세포의 합성 조직 또는 도입된 합성 조직에 의해 인식된 DNA 서열을 지칭한다.
용어 "프로모터/조절성 서열"은 이러한 프로모터/조절성 서열과 작동적으로 연결된 유전자 생성물의 발현을 위해 요구되는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 경우에, 상기 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있고, 기타 경우에 상기 서열은 증강인자 서열, 및 유전자 생성물의 발현을 위해 요구되는 기타 조절성 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절성 서열은, 예를 들어 유전자 생성물을 조직 특이적 방식으로 발현하는 것일 수 있다.
용어 "구성적 프로모터"는 특정 유전자 생성물을 코딩하거나 구체화하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결된 경우에, 상기 유전자 생성물을, 세포의 대부분 또는 모든 생리학적 조건 하에 이러한 세포에서 생성시키는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "유도성 프로모터"는 특정 유전자 생성물을 코딩하거나 구체화하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결된 경우에, 상기 유전자 생성물을, 프로모터에 상응하는 유도제가 세포 내에 존재하는 경우에만 실질적으로 이러한 세포에서 생성시키는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
용어 "조직-특이적 프로모터"는 특정 유전자 생성물을 코딩하거나 구체화하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결된 경우에, 상기 유전자 생성물을, 세포가 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 실질적으로 이러한 세포에서 생성시키는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
scFv의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "가요성 폴리펩티드 링커" 또는 "링커"는 가변 중쇄 영역과 가변 경쇄 영역을 함께 연결하기 위하여, 단독으로 또는 조합하여 사용된 글리신 및/또는 세린 잔기와 같은 아미노산으로 이루어진 펩티드 링커를 지칭한다. 한 실시양태에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 Gly/Ser 링커이고, 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n (서열 112) (여기서, n은 1 이상의 양성 정수이다)을 포함한다. 예를 들어, n=1, n=2, n=3. n=4, n=5 및 n=6, n=7, n=8, n=9 및 n=10. 한 실시양태에서, 가요성 폴리펩티드 링커는 (Gly4 Ser)4 (서열 113) 또는 (Gly4 Ser)3 (서열 114)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 상기 링커는 (Gly2Ser), (GlySer) 또는 (Gly3Ser) (서열 112)의 다수 반복 서열을 포함한다. 또한, WO2012/138475 (본원에 참조로 포함된다)에 기재된 링커가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은, 5' 캡 (또한, RNA 캡, RNA 7-메틸구아노신 캡 또는 RNA m7G 캡으로 명명됨)은 전사의 개시 직후 진핵성 메신저 RNA의 "전방" 또는 5' 말단에 부가되었던, 변형된 구아닌 뉴클레오티드이다. 이러한 5' 캡은 첫 번째로 전사된 뉴클레오티드에 연결되는 말단 기로 이루어진다. 그의 존재는 리보솜에 의한 인식과 RNase로부터의 보호에 있어 결정적이다. 캡 부가는 전사와 커플링되고, 공동-전사적으로 일어나므로, 각각은 다른 것에 영향을 미친다. 전사의 개시 직후, 합성되는 mRNA의 5' 말단은 RNA 중합효소와 연합된 캡-합성화 복합체에 의해 결합된다. 이러한 효소적 복합체는 mRNA 캡핑에 요구되는 화학적 반응을 촉매한다. 합성은 다-단계 생화학적 반응으로서 진행된다. 캡핑 부분을 변형시켜 mRNA의 기능성, 예컨대 그의 안정성 또는 번역 효율을 조정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "시험관내 전사된 RNA"는 시험관내에서 합성된 RNA, 바람직하게 mRNA를 지칭한다. 일반적으로, 이와 같이 시험관내에서 전사된 RNA는 시험관내 전사 벡터로부터 생성된다. 이러한 시험관내 전사 벡터는 시험관내 전사된 RNA를 생성하기 위해 사용되는 주형을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "폴리(A)"는 폴리아데닐화에 의해 mRNA에 부착된 일련의 아데노신이다. 일시적 발현을 위한 구축물의 바람직한 실시양태에서, 폴리A는 50 내지 5000 (서열 115), 바람직하게 64 초과, 보다 바람직하게 100 초과, 가장 바람직하게 300 또는 400 초과이다. 폴리(A) 서열은 화학적 또는 효소적으로 변형시켜 mRNA 기능성, 예컨대 국재화, 안정성 또는 번역 효율을 조정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "폴리아데닐화"는 메신저 RNA 분자에 대한 폴리아데닐릴 부분 또는 그의 변형된 변이체의 공유적 연쇄를 지칭한다. 진핵 유기체에서, 대부분의 메신저 RNA (mRNA) 분자는 3' 말단에서 폴리아데닐화된다. 3' 폴리(A) 꼬리는 효소, 즉 폴리아데닐레이트 중합효소의 작용을 통하여 전-mRNA에 부가된 아데닌 뉴클레오티드의 긴 서열 (종종 수백)이다. 보다 고등 진핵생물에서는, 폴리(A) 꼬리를, 폴리아데닐화 신호인 특이적 서열을 함유하는 전사체 상으로 부가한다. 폴리(A) 꼬리 및 이와 결합된 단백질은 엑소뉴클레아제에 의한 분해로부터 mRNA를 보호하는 데 도움을 준다. 폴리아데닐화는 또한, 전사 종결, 핵으로부터의 mRNA의 수송, 및 번역에 중요하다. 폴리아데닐화는 DNA가 RNA로 전사된 직후에 핵에서 발생하지만, 부가적으로 세포질에서 나중에 발생할 수도 있다. 전사가 종결된 후, mRNA 쇄는 RNA 중합효소와 연합된 엔도뉴클레아제 복합체의 작용을 통하여 절단된다. 절단 부위는 통상적으로, 절단 부위 근처에 염기 서열 AAUAAA가 존재하는 것을 특징으로 한다. mRNA를 절단한 후, 아데노신 잔기를 절단 부위의 자유 3' 말단에 부가한다.
본원에 사용된 바와 같은, "일시적"은 일정 시간, 일 또는 주 동안 비-통합된 트랜스진의 발현을 지칭하는데, 이러한 발현 기간은 숙주 세포 내의 안정한 플라스미드 레플리콘(replicon) 내에 함유되거나 또는 게놈 내로 통합되는 경우에는, 유전자의 발현 기간 보다 짧다.
용어 "신호 변환 경로"는 신호를 세포의 한 부분으로부터 세포의 또 다른 부분으로 전달하는 데 있어서 일정 역할을 하는 각종 신호 변환 분자들 간의 생화학적 관계를 지칭한다. "세포 표면 수용체"는 신호를 수용하고 신호를 세포의 막 전반에 걸쳐 전달할 수 있는 분자 및 분자 복합체를 포함한다.
용어 "대상체"는 면역 반응이 유발될 수 있는 살아 있는 유기체 (예를 들어, 포유동물, 인간)를 포함한다.
용어 "실질적으로 정제된" 세포는 기타 세포 유형이 본질적으로 없는 세포를 지칭한다. 실질적으로 정제된 세포는 또한, 그의 자연 발생적 상태에서는 정상적으로 연합되는 기타 세포 유형으로부터 분리시킨 세포를 지칭한다. 일부 경우에, 실질적으로 정제된 세포 집단은 균질한 세포 집단을 지칭한다. 다른 경우에, 상기 용어는 간단히, 그의 자연 상태에서는 자연적으로 연합되는 세포로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 측면에서, 세포는 시험관내에서 배양한다. 다른 측면에서, 세포는 시험관내에서 배양하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료적"은 치료를 의미한다. 치료적 효과는 특정 질환 상태의 감소, 억제, 차도 또는 박멸에 의해 획득된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "예방"은 특정 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 이에 대한 보호적 치료를 의미한다.
본 발명의 맥락에서, "종양 항원" 또는 "과증식성 장애 항원" 또는 "과증식성 장애와 연관된 항원"은 특이적 과증식성 장애에 통상적인 항원을 지칭한다. 특정 측면에서, 본 발명의 과증식성 장애 항원은 원발성 또는 전이성 흑색종, 흉선종, 림프종, 육종, 폐암, 간암, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 비-호지킨 림프종, 백혈병, 자궁암, 자궁경부암, 방광암, 신장암 및 선암종, 예컨대 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 암으로부터 유래된다.
용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산을 숙주 세포 내로 전이시키거나 도입하는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염되거나, 형질전환되거나 또는 형질도입된 세포이다. 이 세포는 일차 대상체 세포 및 그의 자손을 포함한다.
용어 "특이적으로 결합하는"은 특정 샘플에 존재하는 동족 결합 파트너 (예를 들어, T 세포 상에 존재하는 자극성 및/또는 공동자극성 분자) 단백질을 인식하고 이와 결합하는 항체 또는 리간드를 지칭하지만, 이러한 항체 또는 리간드는 상기 샘플 중의 다른 분자는 실질적으로 인식하지 않거나 결합하지 않는다.
범위: 본 개시내용 전반에 걸쳐, 본 발명의 각종 측면은 범위 포맷으로 제시될 수 있다. 범위 포맷의 설명은 단지 편리함과 간결함을 위한 것이고, 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로서 해석되지 않아야 하는 것으로 이해해야 한다. 따라서, 특정 범위의 설명은 구체적으로 개시된 가능한 모든 아범위뿐만 아니라 그러한 범위 내의 개별적 수치를 갖는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 특정 범위, 예를 들어 1 내지 6의 범위의 설명은 구체적으로 개시된 아범위, 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등뿐만 아니라 그러한 범위 내의 개별적 수치, 예를 들어 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 또 다른 예로서, 95-99% 동일성과 같은 범위는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 것을 포함하고, 96 내지 99%, 96 내지 98%, 96 내지 97%, 97 내지 99%, 97 내지 98% 및 98 내지 99% 동일성과 같은 아범위를 포함한다. 이는 상기 범위의 폭에 상관없이 적용된다.
설명
항-EGFRvIII 키메라 항원 수용체 (CAR)를 이용하는, 암과 같은 질환의 치료를 위한 사용 방법 및 성분의 조성물이 본원에 제공된다.
한 측면에서, 본 발명은 EGFRvIII 단백질과 특이적으로 결합하도록 조작된 항체 또는 항체 단편을 포함하는 수많은 키메라 항원 수용체를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 CAR을 발현하도록 조작된 세포 (예를 들어, T 세포)를 제공하는데, CAR T 세포 ("CART")는 항종양 특성을 나타낸다. 한 측면에서 세포는 CAR로 형질전환시키고, 이러한 CAR은 세포 표면 상에 발현된다. 일부 실시양태에서, 세포 (예를 들어, T 세포)는 CAR을 코딩하는 바이러스성 벡터로 형질도입한다. 일부 실시양태에서, 바이러스성 벡터는 레트로바이러스성 벡터이다. 일부 실시양태에서, 바이러스성 벡터는 렌티바이러스성 벡터이다. 이러한 일부 실시양태에서, 세포는 CAR을 안정적으로 발현할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 세포 (예를 들어, T 세포)는 CAR을 코딩하는 핵산, 예를 들어 mRNA, cDNA, DNA로 형질감염시킨다. 이러한 일부 실시양태에서, 세포는 CAR을 일시적으로 발현할 수 있다.
한 측면에서, CAR의 EGFRvIII 단백질 결합성 부분은 scFv 항체 단편이다. 한 측면에서, 상기 항체 단편은 이들이 등가의 결합 친화성을 보유하고 있다는 점에서, 예를 들어 항원이 유래되는 IgG 항체와, 거의 동등한 수준의 효능을 지닌 동일한 항원과 결합한다는 점에서 기능적이다. 한 측면에서, 상기 항체 단편은 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 면역 반응의 활성화, 그의 표적 항원으로부터의 신호-변환 유래의 억제, 키나제 활성의 억제 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않을 수 있는 생물학적 반응을 제공한다는 점에서 기능적이다.
한 측면에서, CAR의 EGFRvIII 항원 결합 도메인은 뮤린 scFv 항체 단편이다. 또 다른 측면에서, CAR의 EGFRvIII 항원 결합 도메인은, 그것이 유래되는 scFv의 뮤린 서열과 비교해서 인간화되는 scFv 항체 단편이다. EGFRvIII에 대항하여 예시되는 모 뮤린 모노클로날 항체 (3C10)의 생성은 문헌 [Okamoto et al., British J. Cancer 1996, 73:1366-1372]에 개시되어 있다. EGFRvIII에 대항하여 예시되는 완전 인간 항체 (139)는 본원에 참조로 포함된 문헌 [Morgan et al. (2012) Human Gene Therapy, 23:1043-1953]에 개시되어 있다. 한 측면에서, 뮤린 서열에 대한 scFv는 서열 11을 포함한다. 이러한 마우스 scFv의 인간화는 임상 환경을 위해 요망될 수 있는데, 마우스-특이적 잔기는 EGFRvIII 치료, 예를 들어 EGFRvIII 구축물로 형질도입된 T 세포로의 치료를 받고 있는 환자에서 인간-항-마우스 항원 (HAMA) 반응을 유도시킬 수 있다.
한 측면에서, CAR의 항-EGFRvIII 결합 도메인 부분은, 그의 서열을 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화시킨 트랜스진에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 본 발명의 전체 CAR 구축물은, 그의 전체 서열을 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화시킨 트랜스진에 의해 코딩된다. 코돈 최적화는 코딩 DNA에서의 동의 코돈 (즉, 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈)의 발생 빈도가 상이한 종에서 편재된다는 발견을 지칭한다. 이러한 코돈 축중(degeneracy)으로 인해 동일한 폴리펩티드가 각종 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 각종 코돈 최적화 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 적어도 미국 특허 번호 5,786,464 및 6,114,148에 개시된 방법을 포함한다.
한 측면에서, CAR의 항-EGFRvIII 결합 도메인은 인간화 항-EGFRvIII 결합 도메인이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 38에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 44에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 50에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 56에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 62에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 68에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 74에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 80에 제공된 scFv 부분을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 86에 제공된 scFv 부분을 포함한다.
한 측면에서, 본원에 개시된 CAR은 세포내 신호전달 도메인을 수반한 특이적 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타 쇄, 4-1BB 및 CD28 신호전달 모듈 및 그의 조합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
한 측면에서, 항원 결합 도메인은 EGFRvIII과 결합한다. 한 측면에서, CAR은 서열 43에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 서열 49에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 서열 55에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 서열 61에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 서열 67에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 서열 73에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 서열 79에 제공된 서열을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 서열 85에 제공된 서열을 포함한다.
한 측면에서, CAR은 CD137 (4-1BB) 신호전달 도메인, CD28 신호전달 도메인, CD3제타 신호 도메인, 및 그의 모든 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 측면에서, CAR은 CD137 (4-1BB) 또는 CD28, CD3제타 신호 도메인, 및 그의 모든 조합물 이외의 하나 이상의 공동자극성 분자(들)의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
더욱이, 본 발명은 CAR 조성물 및 그의 의약에 있어서의 용도, 또는 특히, EGFRvIII을 발현하는 세포 또는 조직을 포함하는 질환, 암 또는 모든 악성 종양 또는 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 예를 들어 CAR-발현성 세포, 예를 들어, T 세포에서 miR-17-92를 과발현하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 한 측면에서, miR-17-92의 트랜스진-유래된 과발현은 종양-유도된 면역억제 및 화학요법에 대항하여 개선된 저항성을 지닌 CAR-형질도입된 T-세포를 제공함으로써, 장시간 지속되는 치료 효과를 증진시킨다.
키메라 항원 수용체 (CAR)
본 발명은 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 DNA 구축물을 포괄하는데, 이러한 CAR은 EGFRvIII과 특이적으로 결합하는 항체 단편, 예를 들어 EGFRvIII과 특이적으로 결합하는 인간 항체 단편을 포함한다. 한 측면에서, EGFRvIII은 인간 EGFRvIII이고, 항체 단편을 코딩하는 핵산 서열은, 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열과 연속되고, 이러한 핵산 서열과 동일한 판독 프레임 내에 있다. 세포내 신호전달 도메인은 공동자극성 신호전달 도메인 및/또는 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 제타 쇄를 포함할 수 있다. 공동자극성 신호전달 도메인은 공동자극성 분자의 세포내 도메인의 적어도 일부를 포함하는 CAR의 부분을 지칭한다.
구체적 측면에서, 본 발명의 CAR 구축물은 서열 38, 서열 44, 서열 50, 서열 56, 서열 62, 서열 68, 서열 74, 서열 80 및 서열 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 scFv 도메인을 포함하며, 이러한 scFv는 서열 13에 제공된 바와 같은 임의의 리더 서열이 선행될 수 있고, 그 다음에 서열 14 또는 서열 104 또는 서열 106 또는 서열 108에 제공된 바와 같은 임의의 힌지 서열, 서열 15에 제공된 바와 같은 막횡단 영역, 서열 16 또는 서열 102를 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 및 서열 17 또는 서열 99를 포함하는 CD3 제타 서열이 배열될 수 있으며, 상기 도메인들은 단일 융합 단백질을 형성하기 위하여 연속되고 동일한 판독 프레임 내에 있다. 또한, 서열 38, 서열 44, 서열 50, 서열 56, 서열 62, 서열 68, 서열 74, 서열 80 및 서열 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 각각의 scFv 단편, 및 서열 13 내지 17의 각각의 도메인의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 본 발명에 포함된다. 또한, 서열 38, 서열 44, 서열 50, 서열 56, 서열 62, 서열 68, 서열 74, 서열 80 및 서열 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 각각의 scFv 단편, 및 서열 13 내지 16 및 서열 99의 각각의 도메인의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 본 발명에 포함된다. 한 측면에서, EGFRvIII CAR 구축물은 임의의 리더 서열, EGFRvIII과 특이적으로 결합하는 세포외 항원 결합 도메인, 힌지, 막횡단 도메인, 및 세포내 자극 도메인을 포함한다. 한 측면에서, EGFRvIII CAR 구축물은 임의의 리더 서열, EGFRvIII과 특이적으로 결합하는 세포외 항원 결합 도메인, 힌지, 막횡단 도메인, 및 공동자극 도메인과 일차 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 인간화 scFv 도메인을 함유하는 특이적 EGFRvIII CAR 구축물은 서열 43, 서열 49, 서열 55, 서열 61, 서열 67, 서열 73, 서열 79, 서열 85, 및 서열 90에 제공된다. 뮤린 scFv 도메인을 함유하는 특이적 EGFRvIII CAR 구축물은 서열 1 및 서열 2에 제공된다.
예시되는 리더 서열은 서열 13으로서 제공된다. 예시되는 힌지/스페이서 서열은 서열 14 또는 서열 104 또는 서열 106 또는 서열 108로서 제공된다. 예시되는 막횡단 도메인 서열은 서열 15로서 제공된다. 4-1BB 단백질의 공동자극 도메인의 예시되는 서열은 서열 16으로서 제공된다. CD27 단백질의 공동자극 도메인의 예시되는 서열은 서열 102로서 제공된다. CD3제타 도메인 서열의 예시되는 일차 신호전달 도메인은 서열 17로서 제공된다. CD3제타 도메인 서열의 또 다른 예시되는 일차 신호전달 도메인은 서열 99로서 제공된다.
한 측면에서, 본 발명은 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 포괄하는데, 이러한 핵산 분자는 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열과 연속되고, 이러한 핵산 서열과 동일한 판독 프레임 내에 존재하는, 예를 들어 본원에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 38, 서열 44, 서열 50, 서열 56, 서열 62, 서열 68, 서열 74, 서열 80 및 서열 86 중 하나 이상으로부터 선택된다. 한 측면에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 39, 서열 45, 서열 51, 서열 57, 서열 63, 서열 69, 서열 75, 서열 81, 및 서열 98로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 39에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인 서열 45에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 51에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 57에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 63에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 69에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 75에 의해 코딩된다. 한 측면에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 81에 의해 코딩된다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명은 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 구축물을 포괄하는데, 이러한 핵산 분자는 서열 42, 서열 48, 서열 54, 서열 60, 서열 66, 서열 72, 서열 78, 서열 84, 및 서열 90으로 이루어진 군으로부터 선택된 항-EGFRvIII 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 서열은 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열과 연속되고, 이러한 핵산 서열과 동일한 판독 프레임 내에 존재한다. CAR에 사용될 수 있는 예시되는 세포내 신호전달 도메인은, 예를 들어 CD3-제타, CD28, 4-1BB 등의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, CAR은 CD3-제타, CD28, 4-1BB 등의 세포내 신호전달 도메인의 모든 조합을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 핵산 구축물은 서열 42를 포함한다. 한 측면에서, CAR 구축물의 핵산 서열은 서열 48이다. 한 측면에서, 핵산 구축물은 서열 54를 포함한다. 한 측면에서, 핵산 구축물은 서열 60을 포함한다. 한 측면에서, 핵산 구축물은 서열 66을 포함한다. 한 측면에서, 핵산 구축물은 서열 72를 포함한다. 한 측면에서, 핵산 구축물은 서열 78을 포함한다. 한 측면에서, 핵산 구축물은 서열 84를 포함한다.
목적하는 분자를 코딩하는 핵산 서열은 당해 분야에 공지된 재조합 방법을 이용하여, 예컨대 예를 들어, 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝하거나, 상기를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 유전자를 유도시키거나, 또는 표준 기술을 이용하여 상기를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써 수득할 수 있다. 또 다른 한편으론, 관심 핵산을 클로닝하기 보다는 합성적으로 생성시킬 수 있다.
본 발명은 세포 내로 직접적으로 형질도입시킬 수 있는 CAR을 발현하는 레트로바이러스성 및 렌티바이러스성 벡터 구축물을 포함한다.
본 발명은 또한, 세포 내로 직접적으로 형질감염시킬 수 있는 RNA 구축물을 포함한다. 형질감염에 사용하기 위한 mRNA를 생성시키는 방법은 특이적으로 설계된 프라이머를 이용하여 주형을 시험관내 전사 (IVT)한 다음, 폴리A를 부가하여, 3' 및 5' 비번역 서열 ("UTR"), 5' 캡 및/또는 내부 리보솜 유입 부위 (IRES), 발현시키고자 하는 핵산, 및 폴리A 꼬리 (전형적으로, 길이가 50 내지 2000개 염기이다)를 함유하는 구축물을 생성시키는 것을 포함한다. 이로써 생성된 RNA는 상이한 종류의 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 주형은 CAR에 대한 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, RNA CAR 벡터는 전기천공에 의해 T 세포 내로 형질도입한다.
항원 결합 도메인
한 측면에서, 본 발명의 CAR은 항원 결합 도메인으로서 달리 지칭된 표적-특이적 결합성 요소를 포함한다. 부분의 선택은 표적 세포의 표면을 규정하는 리간드의 유형과 수에 좌우된다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 특별한 질환 상태와 연관된 표적 세포 상의 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명의 CAR 내의 항원 결합 도메인에 대한 리간드로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스성, 박테리아성 및 기생충 감염, 자가면역 질환 및 암 세포와 연관된 것을 포함한다.
한 측면에서, CAR-매개된 T-세포 반응은 목적 항원과 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 조작함으로써 관심 항원을 CAR 내로 지시할 수 있다.
한 측면에서, 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR의 부분은 EGFRvIII을 표적으로 하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 인간 EGFRvIII을 표적으로 한다. 예를 들어, 마우스 모노클로날 항체 (IgG2b) 3C10는 마우스를, EGFRvIII-특이적 융합 연접부를 포함한 14개 아미노산 펩티드 (LEEKKGNYVVTDHC; 서열 101)로 면역시킴으로써 EGFRvIII에 대항하여 생성시켰는데, 야생형 EGFR과의 검출 가능한 결합 없이 EGFRvIII을 고도로 특이적으로 인식하는 것으로 입증되었다 [Okamoto et al., British J. Cancer 1996, 73:1366-1372]. 따라서, 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 아미노산 서열, 예를 들어 EGFRvIII 융합 연접부 도메인 내에 글리신 잔기가 부가된 아미노산 서열을 표적으로 한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 서열 101의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 서열을 표적으로 한다.
항원 결합 도메인은 항원과 결합하는 어떠한 도메인일 수도 있는데, 이는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 및 그의 기능적 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 기능적 단편은 단일-도메인 항체, 예컨대 중쇄 가변 도메인 (VH), 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 카멜리드 유래된 나노바디의 가변 도메인 (VHH), 및 항원 결합 도메인으로서 기능하는 것으로 당해 분야에 공지된 대체 스캐폴드(scaffold), 예컨대 재조합 피브로넥틴 도메인 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 항원 결합 도메인은, CAR이 궁극적으로 사용될 것인 동일한 종으로부터 유래되는 것이 유익하다. 예를 들어, 인간에게 사용하는 경우, CAR의 항원 결합 도메인이 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 도메인에 대한 인간 또는 인간화 잔기를 포함하는 것이 유익할 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 인간 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 또 다른 측면에서, 항원 결합 도메인은 인간화 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 본원에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2) 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3) 중 하나 이상 (예를 들어, 1개, 2개, 또는 3개 모두); 및 본원에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2) 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3) 중 하나 이상 (예를 들어, 1개, 2개, 또는 3개 모두)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 본원에 기재된 경쇄 가변 영역 및/또는 본원에 기재된 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역, 예를 들어 본원에 기재된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 scFv이다. 특정 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인 (예를 들어, scFv)은 본원에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 본원에 제공된 아미노산 서열과 85 내지 99% (예를 들어, 90 내지 99%, 또는 95-99%) 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 본원에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 갖는 아미노산 서열, 또는 본원에 제공된 아미노산 서열과 85 내지 99% (예를 들어, 90 내지 99%, 또는 95-99%) 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 서열 38, 서열 44, 서열 50, 서열 56, 서열 62, 서열 68, 서열 74, 서열 80 및 서열 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다. 한 측면에서, 인간화 CAR은 서열 43, 서열 49, 서열 55, 서열 61, 서열 67, 서열 73, 서열 79, 서열 85, 및 서열 90으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열로부터 선택된다.
일부 측면에서, 비-인간 항체는 인간화되는데, 항체의 특이적 서열 또는 영역은 인간에서 자연적으로 생성된 항체 또는 그의 단편과의 유사성을 증가시키도록 변형된다. 한 측면에서, 항원 결합 도메인은 인간화된다.
인간화 항체는 CDR-이식화 (예를 들어, 유럽 특허 번호 EP 239,400; 국제 공개 번호 WO 91/09967; 및 미국 특허 번호 5,225,539, 5,530,101, 및 5,585,089 참조; 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다), 화장판 만들기 또는 재포장하기 (예를 들어, 유럽 특허 번호 EP 592,106 및 EP 519,596; 문헌 [Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498]; [Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814]; 및 [Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973] 참조; 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다), 연쇄 셔플링(shuffling) (예를 들어, 미국 특허 번호 5,565,332 참조; 그 전문이 본원에 참조로 포함된다), 및 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0042664, 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0048617, 미국 특허 번호 6,407,213, 미국 특허 번호 5,766,886, 국제 공개 번호 WO 9317105; 문헌 [Tan et al., 2002, J. Immunol., 169:1119-25]; [Caldas et al., 2000, Protein Eng., 13(5):353-60]; [Morea et al., 2000, Methods, 20:267-79]; [Baca et al., 1997, J. Biol. Chem., 272:10678-84]; [Roguska et al., 1996, Protein Eng., 9(10):895-904]; [Couto et al., 1995, Cancer Res., 55:5973s-5977]; [Couto et al., 1995, Cancer Res., 55(8):1717-22]; [Sandhu 1994 Gene, 150(2):409-10]; 및 [Pedersen et al., 1994, J. Mol. Biol., 235(3):959-73]; 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 개시된 기술을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 당해 분야에 공지된 각종 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 종종, 프레임워크 영역 내의 프레임워크 잔기는 항원 결합성을 변경시키기 위하여, 예를 들어 개선시키기 위하여, CDR 공여자 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환될 것이다. 이들 프레임워크 치환은 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 확인되는데, 예를 들어 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR과 프레임워크 잔기의 상호 작용의 모델링, 및 특별한 위치에서의 색다른 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다 (예를 들어, Queen et al., 미국 특허 번호 5,585,089; 및 문헌 [Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323] 참조; 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다).
인간화 항체 또는 항체 단편은 비인간인 공급원으로부터 그 안에 남아있는 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종, "유입" 잔기로서 지칭되는데, 이는 전형적으로, "유입" 가변 도메인으로부터 취한다. 본원에 제공된 바와 같이, 인간화 항체 또는 항체 단편은 비인간 이뮤노글로불린 분자로부터의 하나 이상의 CDR, 및 프레임워크 영역을 포함하며, 이러한 프레임워크를 차지하는 아미노산 잔기는 완전히 또는 대개 인간 생식세포계로부터 유래된다. 항체 또는 항체 단편을 인간화하는 다수의 기술이 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 본질적으로, 인간 항체의 CDR 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환시킴으로써, 즉 CDR-이식화 (EP 239,400; PCT 공개 번호 WO 91/09967; 및 미국 특허 번호 4,816,567; 6,331,415; 5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 6,548,640; 이들 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)함으로써, 윈터(Winter)와 그 동료의 방법 (문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)])에 따라서 수행할 수 있다. 이러한 인간화 항체 및 항체 단편에서는, 실질적으로 온전한 인간 가변 도메인이 아닌 것을 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환시켰다. 인간화 항체는 종종, 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 (FR) 잔기를 설치류 항체 내의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환시킨 인간 항체이다. 항체 및 항체 단편의 인간화는 또한, 화장판 만들기 또는 재포장하기 (EP 592,106 및 EP 519,596; 문헌 [Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498]; [Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994)]; 및 [Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)]), 또는 연쇄 셔플링 (미국 특허 번호 5,565,332) (이들 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다)에 의해 달성할 수 있다.
인간화 항체를 제조하는데 사용될, 경쇄와 중쇄 둘 다의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 저하시키기 위한 것이다. 소위 "최량 적합 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대항하여 스크리닝한다. 이어서, 설치류 항체의 서열에 가장 근접한 인간 서열을 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 (FR)로서 허용한다 (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987); 이들 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특별한 아군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특별한 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크를 여러 개의 상이한 인간화 항체에 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)]; [Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조; 이들 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다).
일부 측면에서, 항체 단편을 포함하는 본 발명의 CAR 조성물의 일부는 표적 항원에 대한 고 친화성을 보존하고 다른 유리한 생물학적 특성을 지니면서 인간화된다. 본 발명의 한 측면에 따라서, 인간화 항체 및 항체 단편은 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 모 서열 및 각종 개념적 인간화 생성물의 분석 공정에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 입수 가능하고, 통상의 기술자에게 친숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 예상되는 3차원 입체 형태적 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 입수 가능하다. 이들 디스플레이를 검사하여, 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에 있어서의 잔기의 예상 역할을 분석할 수 있는데, 예를 들어 표적 항원과 결합할 수 있는 후보 이뮤노글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, FR 잔기를 수용자 및 유입 서열로부터 선별하고 합하여, 목적하는 항체 또는 항체 단편 특징, 예컨대 표적 항원에 대한 친화성 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합성에 영향을 미치는 데 직접적이고도 가장 실질적으로 관여한다.
한 측면에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은, 예를 들어 Fv, Fab, 또는 (Fab')2, 또는 이-관능성 (예를 들어, 이중-특이적) 혼성체 항체이다 (예를 들어, 문헌 [Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)]). 한 측면에서, 본원에 제공된 항체 단편은 scFv이다. 한 측면에서, scFv는 EGFRvIII 단백질과 결합하지만, 야생형 EGFR과는 그렇지 못하다. 일부 경우에, 인간 scFv는 효모 디스플레이 라이브러리로부터 유래될 수도 있다.
일부 경우에, scFv는 당해 분야에 공지된 방법에 따라서 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., (1988) Science 242:423-426] 및 [Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). ScFv 분자는 가요성 폴리펩티드 링커를 이용하여 VH 영역과 VL 영역을 함께 연결함으로써 생성시킬 수 있다. scFv 분자는 최적화된 길이 및/또는 아미노산 조성을 갖는 링커 (예를 들어, Ser-Gly 링커)를 포함한다. 링커 길이는 scFv의 가변 영역이 폴딩하고 상호 작용하는 방식에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 사실상, 짧은 폴리펩티드 링커가 이용된 경우 (예를 들어, 5 내지 10개 아미노산), 쇄내 폴딩이 방지된다. 기능적 에피토프 결합 부위를 형성하기 위하여 상기 두 가변 영역을 합치기 위해서는 쇄간 폴딩이 또한 요구된다. 링커 배향과 크기의 예에 관해서는, 예를 들어 다음 문헌을 참조할 수 있다 [Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794, 및 PCT 공개 번호 WO2006/020258 및 WO2007/024715; 본원에 참조로 포함된다].
scFv는 그의 VL 영역과 VH 영역 사이에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 초과의 아미노산 잔기의 링커를 포함할 수 있다. 이러한 링커 서열은 어떠한 자연 발생적 아미노산도 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 서열은 아미노산 글리신 및 세린을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 링커 서열은 글리신 및 세린 반복 서열의 세트, 예컨대 (Gly4Ser)n (서열 37) (여기서, n은 1 이상의 양성 정수이다)를 포함한다. 한 실시양태에서, 링커는 (Gly4Ser)4(서열 113) 또는 (Gly4Ser)3 (서열 114)일 수 있다. 링커 길이 상의 변동은 활성을 보유하거나 증강시켜, 활성 연구에서 탁월한 효능을 초래할 수 있다.
안정성 및 돌연변이
항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv 분자 (예를 들어, 가용성 scFv)의 안정성은 통상적인 대조군 scFv 분자 또는 전장 항체의 생물물리학적 특성 (예를 들어, 열 안정성)을 참조로 하여 평가할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간화 scFv는 본원에 언급된 검정에서 대조군 결합성 분자 (예를 들어, 통상적인 scFv 분자) 보다 약 0.1℃, 약 0.25℃, 약 0.5℃, 약 0.75℃, 약 1℃, 약 1.25℃, 약 1.5℃, 약 1.75℃, 약 2℃, 약 2.5℃, 약 3℃, 약 3.5℃, 약 4℃, 약 4.5℃, 약 5℃, 약 5.5℃, 약 6℃, 약 6.5℃, 약 7℃, 약 7.5℃, 약 8℃, 약 8.5℃, 약 9℃, 약 9.5℃, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 또는 약 15℃ 초과하는 열 안정성을 갖는다.
항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 개선된 열 안정성을 연속해서, 전체 EGFRvIII CAR 구축물에 부여하면, EGFRvIII CAR 구축물의 치료 특성이 개선된다. 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 열 안정성은 통상적인 항체와 비교해서 약 2℃ 또는 3℃ 이상 개선될 수 있다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 통상적인 항체와 비교해서 1℃ 개선된 열 안정성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 통상적인 항체와 비교해서 2℃ 개선된 열 안정성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 통상적인 항체와 비교해서 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15℃ 개선된 열 안정성을 갖는다. 예를 들어, 본원에 개시된 scFv 분자와, scFv VH 및 VL이 유래되는 항체의 scFv 분자 또는 Fab 단편 간을 비교할 수 있다. 열 안정성은 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, Tm을 측정할 수 있다. Tm을 측정하는 방법, 및 단백질 안정성을 결정하는 기타 방법이 다음에 보다 상세히 기재되어 있다.
scFv 상의 돌연변이 (가용성 scFv의 인간화 또는 직접 돌연변이 유발을 통하여 유발됨)는 scFv의 안정성을 변경시키고, scFv 및 EGFRvIII CAR 구축물의 전반적인 안정성을 개선시킨다. 인간화 scFv의 안정성을, Tm, 온도 변성 및 온도 응집과 같은 측정치를 이용하여 뮤린 scFv에 대항하여 비교한다. 돌연변이체 scFv의 결합 능력은 본 실시예에 기재된 검정을 이용하여 결정할 수 있다.
한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 인간화 과정으로부터 발생하는 한 가지 이상의 돌연변이를 포함하므로, 이와 같이 돌연변이된 scFv는 EGFRvIII 구축물에 개선된 안정성을 부여해 준다. 또 다른 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 인간화 과정으로부터 발생하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10가지 이상의 돌연변이를 포함하므로, 이와 같이 돌연변이된 scFv는 EGFRvIII 구축물에 개선된 안정성을 부여해 준다.
단백질 안정성을 평가하는 방법
항원 결합 도메인의 안정성은, 예를 들어 다음에 기재된 방법을 이용하여 평가할 수 있다. 이러한 방법으로, 다수의 열 전개(unfolding) 전이를 결정할 수 있는데, 안정성이 가장 낮은 도메인이 처음으로 전개되거나 또는 협력해서 전개되는 다도메인 단위 (예를 들어, 단일 전개 전이를 나타내는 다도메인 단백질)의 전반적인 안정성 역치를 제한한다. 안정성이 가장 낮은 도메인은 수많은 부가 방식으로 확인할 수 있다. 돌연변이 유발을 수행하여, 전반적인 안정성을 제한하는 도메인을 프로빙할 수 있다. 부가적으로, 다도메인 단백질의 프로테아제 저항성은, 안정성이 가장 낮은 도메인이 DSC 또는 기타 분광법을 통하여 본질적으로 전개되는 것으로 공지된 조건 하에 수행할 수 있다 [Fontana, et al., (1997) Fold. Des., 2: R17-26; Dimasi et al. (2009) J. Mol. Biol. 393: 672-692]. 일단 안정성이 가장 낮은 도메인이 확인되면, 이러한 도메인 (또는 그의 일부)을 코딩하는 서열을 본 방법에서 시험 서열로서 이용할 수 있다.
a) 열 안정성
조성물의 열 안정성은 당해 분야에 공지된 수많은 비-제한적 생물물리학적 또는 생화학적 기술을 이용하여 분석할 수 있다. 특정의 실시양태에서, 열 안정성은 분석적 분광법에 의해 평가한다.
예시되는 분석적 분광 방법은 시차 주사 열량측정법 (DSC)이다. DSC는 대부분의 단백질 또는 단백질 도메인의 전개를 동반하는 열 흡수에 대해 민감한 열량계를 이용한다 (예를 들어, 문헌 [Sanchez-Ruiz, et al., Biochemistry, 27:1648-52, 1988] 참조). 단백질의 열 안정성을 결정하기 위하여, 이러한 단백질의 샘플을 열량계 내로 삽입하고, Fab 또는 scFv가 전개될 때까지 온도를 상승시킨다. 단백질이 전개되는 온도가 전반적인 단백질 안정성을 표시한다.
또 다른 예시되는 분석적 분광 방법은 원편광 이색성 (CD) 분광법이다. CD 분광측정법은 증가 온도의 함수로서의 조성물의 광학 활성을 측정한다. 원편광 이색성 (CD) 분광법은 구조적 비대칭으로 인해 야기되는 좌편광 대 우편광의 흡수 차이를 측정한다. 무질서하거나 전개된 구조로 인해, 정돈되거나 폴딩된 구조의 것과 매우 상이한 CD 스펙트럼이 생긴다. 이러한 CD 스펙트럼은 증가 온도의 변성 효과에 대한 단백질의 민감도를 반영하므로, 단백질의 열 안정성을 표시한다 (문헌 [van Mierlo and Steemsma, J. Biotechnol., 79(3):281-98, 2000] 참조).
열 안정성을 측정하기 위한 또 다른 예시되는 분석적 분광 방법은 형광 방출 분광법이다 (상기 문헌 [van Mierlo and Steemsm] 참조). 열 안정성을 측정하기 위한 또 다른 예시되는 분석적 분광 방법은 핵 자기 공명 (NMR) 분광법이다 (예를 들어, 상기 문헌 [van Mierlo and Steemsm] 참조).
특정 조성물의 열 안정성은 생화학적으로 측정할 수 있다. 열 안정성을 평가하는 것으로 예시되는 생화학적 방법은 열 챌린지 검정이다. "열 챌린지 검정"에서는, 조성물을 특정 범위의 상승 온도에 일정 시간 동안 둔다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 시험 scFv 분자, 또는 scFv 분자를 포함하는 분자를 특정 범위의 증가 온도에, 예를 들어 1 내지 1.5시간 동안 둔다. 이어서, 단백질의 활성을 관련 생화학적 검정에 의해 검정한다. 예를 들어, 이러한 단백질이 결합성 단백질 (예를 들어, scFv 또는 scFv-함유 폴리펩티드)인 경우, 그 결합성 단백질의 결합 활성은 기능적 또는 정량적 ELISA에 의해 결정할 수 있다.
상기 검정은 이. 콜라이 (E. coli) 및 고 처리량 스크리닝을 이용하여 고 처리량 포맷 및 본 실시예에 개시된 포맷으로 수행할 수 있다. 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv, 변이체의 라이브러리는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 창출시킬 수 있다. 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv, 발현을 유도시킬 수 있고, 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv를 열 챌린지시킬 수 있다. 이와 같이 챌린지된 시험 샘플을 대상으로 하여, 결합에 관하여 검정할 수 있고, 안정한 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv를 확대하여, 추가로 명확히 규명할 수 있다.
열 안정성은 상기 기술 중 어느 것 (예를 들어, 분석적 분광 기술)을 이용하여 조성물의 융점 (Tm)을 측정함으로써 평가한다. 융점은 조성물의 분자의 50%가 폴딩된 상태에 있는 열 전이 곡선의 중간점에 있는 온도이다 (예를 들어, 문헌 [Dimasi et al. (2009) J. Mol Biol. 393: 672-692] 참조). 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv에 대한 Tm 값은 약 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃이다. 한 실시양태에서, IgG에 대한 Tm 값은 약 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃이다. 한 실시양태에서, 다가 항체에 대한 Tm 값은 약 40℃, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃, 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃, 67℃, 68℃, 69℃, 70℃, 71℃, 72℃, 73℃, 74℃, 75℃, 76℃, 77℃, 78℃, 79℃, 80℃, 81℃, 82℃, 83℃, 84℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃이다.
열 안정성은 또한, 분석적 열량측정 기술 (예를 들어, DSC)을 이용하여 조성물의 비열 또는 열 용량 (Cp)을 측정함으로써 평가한다. 조성물의 비열은 1몰의 물의 온도를 1℃씩 상승시키는 데 요구되는 에너지 (예를 들어, kcal/mol)이다. 큰 Cp가 변성되거나 불활성인 단백질 조성물의 특징이기 때문이다. 조성물의 열 용량 상의 변화 (ΔCp)는 그의 열 전이 전 및 후의 조성물의 비열을 결정함으로써 측정한다. 열 안정성은 또한, 전개의 깁스(Gibbs) 자유 에너지 (ΔG), 전개의 엔탈피 (ΔH), 또는 전개의 엔트로피 (ΔS)를 포함한 열역학적 안정성의 기타 파라미터를 측정 또는 결정함으로써 평가할 수 있다. 상기 생화학적 검정 중 한 가지 이상 (예를 들어, 열 챌린지 검정)을 이용하여, 조성물의 50%가 그의 활성 (예를 들어, 결합 활성)을 보유하고 있는 온도 (즉, Tc 값)를 결정한다.
또한, 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv에 대한 돌연변이는 돌연변이되지 않은 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv와 비교해서 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 열 안정성을 변경시킨다. 인간화 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv를 항-EGFRvIII CAR 구축물 내로 혼입하는 경우, 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 인간화 scFv는 전반적인 항-EGFRvIII CAR 구축물에 열 안정성을 부여한다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv에 열 안정성을 부여해 주는 단일 돌연변이를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv는 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv에 열 안정성을 부여해 주는 다수의 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv에서의 다수의 돌연변이는 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 열 안정성에 대한 부가 효과를 지니고 있다.
b) % 응집
조성물의 안정성은 응집하려고 하는 그의 경향을 측정함으로써 결정될 수 있다. 응집은 수많은 비-제한적 생화학적 또는 생물물리학적 기술에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 조성물의 응집은 크로마토그래피, 예를 들어 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)를 이용하여 평가할 수 있다. SEC는 크기를 기준으로 하여 분자를 분리시킨다. 칼럼에 중합체성 겔의 반고체 비드를 채우는데, 이는 이온과 소분자는 그의 내부 내로 허용하지만 대분자는 그렇지 못하다. 단백질 조성물을 칼럼 상부에 적용하는 경우, 조밀하고 폴딩된 단백질 (즉, 응집되지 않은 단백질)은 큰 단백질 응집체에 이용 가능하기보다는 더 큰 용적의 용매를 통하여 분배된다. 결과적으로, 큰 응집체는 칼럼을 통하여 보다 신속하게 이동되고, 이러한 방식으로 혼합물은 그의 성분으로 분리되거나 분획화될 수 있다. 각 분획이 겔로부터 용출됨에 따라, 이러한 분획을 별개로 정량화할 수 있다 (예를 들어, 광 산란에 의해 수행된다). 따라서, 조성물의 % 응집은 특정 분획의 농도를, 겔에 적용된 단백질의 총 농도와 비교함으로써 결정할 수 있다. 안정한 조성물은 본질적으로 단일 분획으로서 상기 칼럼으로부터 용출되고, 용출 프로파일 또는 크로마토그램에서 거의 단일 피크로서 나타난다.
c) 결합 친화도
조성물의 안정성은 그의 표적 결합 친화도를 결정함으로써 평가할 수 있다. 결합 친화도를 결정하는 광범위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 결합 친화도를 결정하는 것으로 예시되는 방법은 표면 플라스몬 공명을 이용한다. 표면 플라스몬 공명은, 예를 들어 비아코어(BIAcore) 시스템 [파마시아 바이오센서 AB (Pharmacia Biosensor AB; 스웨덴 웁살라 및 미국 뉴저지주 피스카타웨이)]을 이용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도 상의 변경을 검출함으로써 실시간 생체특이적 상호 작용을 분석할 수 있게 해주는 광학 현상이다. 추가 설명에 관해서는, 다음 문헌을 참조할 수 있다 (문헌 [Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26]; [Jonsson, U., i (1991) Biotechniques 11:620-627]; [Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131]; 및 [Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277]).
한 측면에서, CAR의 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 항원 결합 도메인 아미노산 서열과 상동성인 아미노산 서열을 포함하고, 이러한 항원 결합 도메인은 본원에 기재된 항-EGFRvIII 항체 단편의 목적하는 기능적 특성을 보유하고 있다. 한 특이적 측면에서, 본 발명의 CAR 조성물은 항체 단편을 포함한다. 추가 측면에서, 그러한 항체 단편은 scFv를 포함한다.
각종 측면에서, CAR의 항원 결합 도메인은 하나 또는 양 가변 영역 (예를 들어, VH 및/또는 VL) 내의, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 내의 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내의 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 조작한다. 한 구체적 측면에서, 본 발명의 CAR 조성물은 항체 단편을 포함한다. 추가 측면에서, 그러한 항체 단편은 scFv를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편을 추가로 변형시켜, 이들이 아미노산 서열 (예를 들어, 야생형으로부터의 아미노산 서열) 면에서는 다양해지지만 목적하는 활성 면에서는 그렇지 않다는 것을 통상의 기술자는 이해할 것이다. 예를 들어, "비-필수" 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환을 초래하는 부가의 뉴클레오티드 치환이 단백질에 대해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 분자 내의 비필수 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 계열로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 대체시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 일련의 아미노산을, 측쇄 계열 구성원의 순서 및/또는 조성 면에서 상이한 구조상 유사한 일련의 아미노산으로 대체시킬 수 있는데, 예를 들어 특정 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 보존적 치환을 수행할 수 있다.
유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 계열은 당해 분야에 정의되었는데, 이는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 % 동일성은 동일한 2개 이상의 서열을 지칭한다. 비교 윈도우 전반에 걸쳐, 또는 다음 서열 비교 알고리즘 중 하나를 이용하여 측정된 바와 같은 지명된 영역 전반에 걸쳐, 또는 수동 정렬과 가시적 검사에 의해 최대 상응도를 위해 비교 및 정렬되는 경우, 두 서열이 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 비율(%) (예를 들어, 명시된 영역 전반에 걸쳐, 또는 명시되지 않은 경우에는, 전체 서열에 걸쳐 60% 동일성, 임의로 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성)을 갖는 다면, 이러한 두 서열은 "실질적으로 동일하다". 임의로, 동일성은 길이가 적어도 약 50개 뉴클레오티드 (또는 10개 아미노산)인 영역 전반에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게 길이가 100 내지 500개 또는 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (또는 20, 50, 200개 또는 그 초과의 아미노산)인 영역 전반에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 1개 서열이 참조 서열로서 작용하는데, 이를 시험 서열과 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 이용하는 경우에는, 시험 서열과 참조 서열을 컴퓨터 내로 입력하고, 필요한 경우 아서열 좌표를 설계하며, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 설계한다. 디폴트 프로그램 파라미터를 사용할 수 있거나, 또는 대체 파라미터를 설계할 수 있다. 이때, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터를 근거로 하여, 참조 서열과 비교해서 시험 서열에 대한 % 서열 동일성을 계산한다. 비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 비교를 위해 서열을 최적으로 정렬하는 것은, 예를 들어 문헌 [Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 방법에 관한 조사에 의해, 이들 알고리즘 [GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA; 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지, 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group; 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 닥터 575)]의 컴퓨터 이행에 의해, 또는 수동 정렬과 가시적 검사에 의해 (예를 들어, 문헌 [Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology] 참조) 수행할 수 있다.
% 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 2가지 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이는 문헌 ([Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402]; 및 [Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410])에 각각 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터를 통하여 공개적으로 입수 가능하다.
두 아미노산 서열 간의 % 동일성은 또한, PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티을 이용하여, ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입시킨 문헌 [E. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17]의 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열 간의 % 동일성은 블로솜(Blossom) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 이용하여, GCG 소프트웨어 패키지 (www.gcg.com에서 입수 가능함) 내의 GAP 프로그램 내로 혼입시킨 문헌 [Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453] 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 기능상 등가의 분자를 생성시키는 출발 항체 또는 단편 (예를 들어, scFv) 아미노산 서열의 변형을 고려한다. 예를 들어, CAR에 포함된 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 VH 또는 VL은 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 scFv의 출발 VH 또는 VL 프레임워크 영역의 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 보유하도록 변형될 수 있다. 본 발명은 기능상 등가의 분자를 생성하기 위하여, 전체 CAR 구축물의 변형, 예를 들어 CAR 구축물의 각종 도메인의 하나 이상의 아미노산 서열 내에서의 변형을 고려한다. 이러한 CAR 구축물은 출발 CAR 구축물의 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 보유하도록 변형될 수 있다.
막횡단 도메인
막횡단 도메인과 관련하여, 각종 실시양태에서, CAR은 이러한 CAR의 세포외 도메인에 부착되는 막횡단 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 막횡단 도메인은 막횡단 영역에 인접한 하나 이상의 부가 아미노산, 예를 들어 그로부터 막횡단 도메인이 유래되는 단백질의 세포외 영역과 연관된 하나 이상의 아미노산 (예를 들어, 상기 세포외 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15개 이하의 아미노산) 및/또는 그로부터 막횡단 도메인이 유래되는 단백질의 세포내 영역과 연관된 하나 이상의 부가 아미노산 (예를 들어, 상기 세포내 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15개 이하의 아미노산)을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 막횡단 도메인은 사용되는 CAR의 다른 도메인 중 하나와 연관되는 것이다. 일부 경우에, 막횡단 도메인은 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막횡단 도메인에 대한 상기 도메인의 결합을 피하기 위한, 예를 들어 수용체 복합체의 기타 구성원과의 상호 작용을 최소화하기 위한 아미노산 치환에 의해 선별되거나 변형될 수 있다. 한 측면에서, 막횡단 도메인은 CART 세포 표면 상의 또 다른 CAR과 동종-이량체를 형성할 수 있다. 상이한 측면에서, 막횡단 도메인의 아미노산 서열은 동일한 CART에 존재하는 천연 결합 파트너의 결합 도메인과의 상호 작용을 최소화하도록 변형되거나 치환될 수 있다.
막횡단 도메인은 자연 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 자연인 경우, 상기 도메인은 어떠한 막-결합된 단백질이나 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 한 측면에서, 막횡단 도메인은 CAR이 표적과 결합될 때마다 세포내 도메인(들)으로 신호전달할 수 있다. 본 발명에서 특별히 사용하기 위한 막횡단 도메인은, 예를 들어 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 적어도 막횡단 영역(들)을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 막횡단 도메인은 힌지, 예를 들어 인간 단백질로부터의 힌지를 통하여, CAR의 세포외 영역, 예를 들어 CAR의 항원 결합 도메인에 부착시킬 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 힌지는 인간 Ig (이뮤노글로불린) 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지, 또는 CD8a 힌지일 수 있다. 한 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 서열 14의 아미노산 서열을 포함한다 (예를 들어, 이러한 서열로 이루어진다). 한 측면에서, 막횡단 도메인은 서열 15의 막횡단 도메인을 포함한다 (예를 들어, 이러한 서열로 이루어진다).
한 측면에서, 힌지 또는 스페이서는 IgG4 힌지를 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 다음 아미노산 서열의 힌지를 포함한다:
Figure pct00001
일부 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 다음 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 힌지를 포함한다:
Figure pct00002
한 측면에서, 힌지 또는 스페이서는 IgD 힌지를 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 다음 아미노산 서열의 힌지를 포함한다:
Figure pct00003
일부 실시양태에서, 힌지 또는 스페이서는 다음 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 힌지를 포함한다:
Figure pct00004
한 측면에서, 막횡단 도메인은 재조합일 수 있는데, 이러한 경우 이는 주로 소수성 잔기, 예컨대 루이신 및 발린을 포함할 것이다. 한 측면에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중선이 재조합 막횡단 도메인의 각 말단에서 발견될 수 있다.
임의로, 예를 들어 길이가 2 내지 10개 아미노산인 짧은 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 링커는 CAR의 막횡단 도메인과 세포질 영역 간에 연쇄를 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중선이 적합한 링커의 한 예이다. 예를 들어, 한 측면에서, 링커는 GGGGSGGGGS (서열 108)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (서열 109)의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.
세포질 도메인
CAR의 세포질 도메인 또는 영역은 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 세포내 신호전달 도메인은 일반적으로, CAR이 도입된 면역 세포의 정상 이펙터 기능 중 한 가지 이상의 활성화에 대해 책임이 있다. 용어 "이펙터 기능"은 세포의 특수 기능을 지칭한다. 예를 들어, T 세포의 이펙터 기능은 시토카인의 분비를 포함한 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 이펙터 기능 신호를 변환시키고 세포가 특수 기능을 수행하도록 지사하는 단백질의 일부를 지칭한다. 통상적으로 전체 세포내 신호전달 도메인이 이용될 수 있긴 하지만, 많은 경우에 있어서 전체 쇄를 사용하는 것이 필요하지 않다. 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부분이 사용되는 정도로, 이러한 절단된 부분은 온전한 쇄 대신 사용될 수 있는데, 단 이는 이펙터 기능 신호를 변환시켜야 한다. 따라서, 용어 세포내 신호전달 도메인은 이펙터 기능 신호를 변환시키기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 어떠한 절단된 부분도 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 CAR에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 예는 항원 수용체 진입기전 후에 신호 변환을 일제히 개시하는 작용을 하는 공-수용체 및 T 세포 수용체 (TCR)의 세포질 서열뿐만 아니라 이들 서열의 모든 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 지닌 모든 재조합 서열을 포함한다.
TCR 단독을 통하여 발생된 신호는 T 세포의 완전한 활성화를 위해 불충분하고, 이차 및/또는 공동자극성 신호가 또한 요구되는 것으로 공지되어 있다. 따라서, T 세포 활성화는 2가지 별개 부류의 세포질 신호전달 서열, 즉 TCR을 통한 항원-의존성 일차 활성화를 개시하는 것 (일차 세포내 신호전달 도메인)과, 이차 또는 공동자극성 신호를 제공하기 위해 항원-비의존성 방식으로 작용하는 것 (이차 세포질 신호전달 도메인, 예를 들어 공동자극 도메인)에 의해 매개되는 것으로 여겨질 수 있다.
일차 신호전달 도메인은 TCR 복합체의 일차 활성화를 자극성 방식으로 또는 억제성 방식으로 조절한다. 자극성 방식으로 작용하는 일차 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 공지되는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
본 발명에서 특별히 사용되는 ITAM 함유 일차 세포내 신호전달 도메인의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d의 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 CAR, 예를 들어 서열 43, 서열 49, 서열 55, 서열 61, 서열 67, 서열 73, 서열 79, 및 서열 85로 이루어진 군으로부터 선택된 CAR은 CD3-제타의 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 일차 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 일차 신호전달 도메인은 변형된 ITAM 도메인, 예를 들어 천연 ITAM 도메인과 비교해서 변경된 (예를 들어, 증가되거나 감소된) 활성을 갖는 돌연변이된 ITAM 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 일차 신호전달 도메인은 변형된 ITAM-함유 일차 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어 최적화된 및/또는 절단된 ITAM-함유 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 일차 신호전달 도메인은 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 ITAM 모티프를 포함한다.
CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타 신호전달 도메인 그 자체를 포함할 수 있거나 또는 본 발명의 CAR의 맥락에서 유용한 기타 목적하는 세포내 신호전달 도메인(들)과 조합할 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 쇄 부분 및 공동자극성 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 공동자극성 신호전달 도메인은 공동자극성 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부분을 지칭한다. 공동자극성 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응을 위해 요구되는 항원 수용체 또는 그의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 예를 들어, CD27 공동자극은 시험관내에서 인간 CART 세포의 팽창, 이펙터 기능 및 생존을 증강시키고, 생체내에서 인간 T 세포 영속성과 항종양 활성을 증대시키는 것으로 입증되었다 [Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706].
본 발명의 CAR의 세포질 부분 내의 세포내 신호전달 서열은 서로 무작위 순서 또는 명시된 순서로 연결될 수 있다. 임의로, 예를 들어 길이가 2 내지 10개 아미노산 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산)인 짧은 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 링커는 세포내 신호전달 서열 간에 연쇄를 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 글리신-세린 이중선이 적합한 링커로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 단일 아미노산, 예를 들어 알라닌, 글리신이 적합한 링커로서 사용될 수 있다.
한 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 그 초과의 공동자극성 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 특정 실시양태에서, 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5 또는 그 초과의 공동자극성 신호전달 도메인은 링커 분자, 예를 들어 본원에 기재된 링커 분자에 의해 분리된다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개의 공동자극성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 분자는 글리신 잔기이다. 일부 실시양태에서, 링커는 알라닌 잔기이다.
한 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인과 CD28의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 한 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인과 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 한 측면에서, 4-1BB의 신호전달 도메인은 서열 16의 신호전달 도메인이다. 한 측면에서, CD3-제타의 신호전달 도메인은 서열 17의 신호전달 도메인이다.
한 측면에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인과 CD27의 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 한 측면에서, CD27의 신호전달 도메인은 QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP (서열 102)의 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, CD27의 신호전달 도메인은 다음 핵산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00005
한 측면에서, 본원에 기재된 CAR-발현성 세포는 제2의 CAR, 예를 들어 동일한 표적 (EGFRvIII) 또는 상이한 표적에 대한 상이한 항원 결합 도메인을 포함하는 제2의 CAR을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CAR-발현성 세포, 예를 들어 CART 세포의 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, CAR-발현성 세포의 집단은 상이한 CAR을 발현하는 세포의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, CART 세포의 집단은 본원에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 제1 세포; 및 상이한 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 제1 세포에 의해 발현된 CAR 내의 항-EGFRvIII 결합 도메인과 상이한 본원에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인을 갖는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, CAR-발현성 세포의 집단은, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 항-EGFRvIII 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제1 세포; 및 EGFRvIII 이외의 표적에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, CAR-발현성 세포의 집단은, 예를 들어 일차 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제1 세포; 및 이차 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 제2 세포를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 집단 내의 하나 이상의 세포가 본원에 기재된 항-EGFRvIII 도메인을 갖는 CAR을 발현하고, 제2 세포가 또 다른 작용제, 예를 들어 CAR-발현성 세포의 활성을 증강시키는 작용제를 발현하는, 세포 집단을 제공한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 상기 작용제는 억제성 분자를 억제하는 작용제일 수 있다. 억제성 분자, 예를 들어 PD1은 일부 실시양태에서, 면역 이펙터 반응을 증가시킬 수 있는 CAR-발현성 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제성 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다.
RNA 형질감염
시험관내 전사된 RNA CAR을 생성시키는 방법이 본원에 개시되어 있다. 본 발명은 또한, 세포 내로 직접적으로 형질감염될 수 있는 CAR 코딩 RNA 구축물을 포함한다. 형질감염에 사용하기 위한 mRNA를 생성시키는 방법은 특이적으로 설계된 프라이머를 이용하여 주형을 시험관내 전사 (IVT)한 다음, 폴리A를 부가하여, 3' 및 5' 비번역 서열 ("UTR"), 5' 캡 및/또는 내부 리보솜 유입 부위 (IRES), 발현시키고자 하는 핵산, 및 폴리A 꼬리 (전형적으로, 길이가 50 내지 2000개 염기이다) (서열 116)를 함유하는 구축물을 생성시키는 것을 포함할 수 있다. 이로써 생성된 RNA는 상이한 종류의 세포를 효율적으로 형질감염시킬 수 있다. 한 측면에서, 주형은 CAR에 대한 서열을 포함한다.
한 측면에서, EGFRvIII CAR은 메신저 RNA (mRNA)에 의해 코딩된다. 한 측면에서, EGFRvIII CAR을 코딩하는 mRNA는 CART 세포의 생성을 위해 T 세포 내로 도입된다.
한 실시양태에서, 시험관내 전사된 RNA CAR은 일시적 형질감염의 형태로서 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 RNA는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)-발생된 주형을 이용하여 시험관내 전사에 의해 생성된다. 모든 공급원으로부터의 관심 DNA를 PCR에 의해, 적당한 프라이머 및 RNA 중합효소를 이용하여 시험관내 mRNA 합성을 위한 주형으로 직접 전환시킬 수 있다. DNA의 공급원은, 예를 들어 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열, 또는 DNA의 다른 적당한 공급원일 수 있다. 시험관내 전사를 위한 목적하는 주형은 본 발명의 CAR이다. 예를 들어, 상기 RNA CAR에 대한 주형은 항-종양 항체의 단일 쇄 가변 도메인을 포함하는 세포외 영역; 힌지 영역, 막횡단 도메인 (예를 들어, CD8a의 막횡단 도메인); 및 예를 들어, CD3-제타의 신호전달 도메인과 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, PCR을 위해 사용될 DNA는 개방 판독 프레임을 함유한다. 이러한 DNA는 유기체의 게놈으로부터의 자연 발생적 DNA 서열로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산은 5' 및/또는 3' 비번역 영역 (UTR)의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 핵산은 엑손 및 인트론을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, PCR을 위해 사용될 DNA는 인간 핵산 서열이다. 또 다른 실시양태에서, PCR을 위해 사용될 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함한 인간 핵산 서열이다. 상기 DNA는 또 다른 한편으론, 자연 발생적 유기체에서는 정상적으로 발현되지 않는 인공 DNA 서열일 수 있다. 예시되는 인공 DNA 서열은 융합 단백질을 코딩하는 개방 판독 프레임을 형성하기 위해 함께 결찰되는 유전자의 일부를 함유하는 것이다. 함께 결찰되는 DNA의 일부는 단일 유기체로부터 또는 둘 이상의 유기체로부터 유래될 수 있다.
PCR을 이용하여, 형질감염을 위해 사용되는 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 생성시킨다. PCR을 수행하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. PCR에 사용하기 위한 프라이머는, PCR을 위한 주형으로서 사용될 DNA의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 갖도록 설계된다. 본원에 사용된 바와 같은, "실질적으로 상보적"은 프라이머 서열 내의 염기의 대다수 또는 전부가 상보적이거나, 또는 1개 이상의 염기가 비-상보적이거나 미스매치되는 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 실질적으로 상보적인 서열은 PCR을 위해 사용된 어닐링 조건 하에 의도된 DNA 표적과 어닐링되거나 혼성화될 수 있다. 상기 프라이머는 DNA 주형의 어느 부분과도 실질적으로 상보적이 되도록 설계할 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 5' 및 3' UTR을 포함한, 세포에서 정상적으로 전사되는 핵산의 일부 (개방 판독 프레임)를 증폭시키도록 설계할 수 있다. 프라이머는 또한, 특별한 관심 도메인을 코딩하는 핵산의 일부를 증폭시키도록 설계할 수 있다. 한 실시양태에서, 프라이머는 5' 및 3' UTR의 전부 또는 일부를 포함한, 인간 cDNA의 코딩 영역을 증폭시키도록 설계한다. PCR에 유용한 프라이머는 당해 분야에 널리 공지되어 있는 합성 방법에 의해 생성시킬 수 있다. "정배향 프라이머"는 증폭시켜야 하는 DNA 서열의 상류에 있는 DNA 주형 상의 뉴클레오티드와 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "상류"는 코딩 가닥을 기준으로 하여 증폭시키고자 하는 DNA 서열에 대한 위치 5'를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. "역배향 프라이머"는 증폭시켜야 하는 DNA 서열의 하류에 있는 이중 가닥 DNA 주형과 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "하류"는 코딩 가닥을 기준으로 하여 증폭시키고자 하는 DNA 서열에 대한 위치 3'를 지칭하기 위해 본원에 사용된다.
PCR에 유용한 어떠한 DNA 중합효소도 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 시약 및 중합효소는 수많은 공급원으로부터 시판되고 있다.
안정성 및/또는 번역 효율을 증진시킬 수 있는 능력을 지닌 화학적 구조가 사용될 수도 있다. RNA는 바람직하게, 5' 및 3' UTR을 갖는다. 한 실시양태에서, 이러한 5' UTR은 길이가 1개 내지 3000개 뉴클레오티드이다. 코딩 영역에 부가될 5' 및 3' UTR 서열의 길이는 UTR의 상이한 영역과 어닐링되는 PCR용 프라이머를 설계하는 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 상이한 방법에 의해 변경시킬 수 있다. 이러한 접근 방식을 이용하여, 통상의 기술자는 전사된 RNA의 형질감염 후 최적의 번역 효율을 달성하는 데 요구되는 5' 및 3' UTR 길이를 변형시킬 수 있다.
5' 및 3' UTR은 관심 핵산에 대한 자연 발생적, 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 또 다른 한편으론, 관심 핵산에 대해 내인성이 아닌 UTR 서열은 이러한 UTR 서열을 정배향 및 역배향 프라이머 내로 혼입시킴으로써 또는 주형의 기타 모든 변형에 의해 가할 수 있다. 관심 핵산에 대해 내인성이 아닌 UTR 서열을 사용하는 것이 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 변형시키는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열 내의 AU-풍부 요소가 mRNA의 안정성을 저하시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 3' UTR은 당해 분야에 널리 공지되어 있는 UTR의 특성에 근거하여 전사된 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택하거나 설계할 수 있다.
한 실시양태에서, 5' UTR은 내인성 핵산의 코작(Kozak) 서열을 함유할 수 있다. 또 다른 한편으론, 관심 핵산에 대해 내인성이 아닌 5' UTR을 상기 언급된 바와 같은 PCR에 의해 가하는 경우, 컨센서스 코작 서열은 상기 5' UTR 서열을 가함으로써 재설계할 수 있다. 코작 서열은 일부 RNA 전사체의 번역 효율을 증가시킬 수 있지만, 효율적인 번역을 가능하게 하기 위해 모든 RNA에 요구되는 것으로 여겨지지 않는다. 많은 mRNA에 대한 코작 서열에 관한 요구 사항은 당해 분야에 공지되어 있다. 다른 실시양태에서, 5' UTR은 그의 RNA 게놈이 세포에서 안정적인 RNA 바이러스의 5' UTR일 수 있다. 다른 실시양태에서, mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 지연시키기 위하여 3' 또는 5' UTR 내에 각종 뉴클레오티드 유사체를 사용할 수 있다.
유전자 클로닝에 대한 필요성 없이도 DNA 주형으로부터 RNA의 합성을 가능하게 하기 위해서는, 전사 프로모터를 전사하고자 하는 서열의 상류에 있는 DNA 주형에 부착시켜야 한다. RNA 중합효소에 대한 프로모터로서 기능하는 서열을 정배향 프라이머의 5' 말단에 가하는 경우, 이러한 RNA 중합효소 프로모터는 전사시켜야 하는 개방 판독 프레임의 상류에 있는 PCR 생성물 내로 혼입되어 진다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 프로모터는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 T7 중합효소 프로모터이다. 기타 유용한 프로모터는 T3 및 SP6 RNA 중합효소 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 컨센서스 뉴클레오티드 서열은 당해 분야에 공지되어 있다.
바람직한 실시양태에서, mRNA는 세포 내에서의 mRNA의 리보솜 결합, 번역 개시 및 안정성을 결정하는 5' 말단 및 3' 폴리(A) 꼬리 상에 양 캡을 갖는다. 환상 DNA 주형, 예를 들어 플라스미드 DNA 상에서, RNA 중합효소는 진핵 세포에서의 발현에 적합하지 않은 장(long) 콘카타머성(concatameric) 생성물을 생성시킨다. 3' UTR의 말단에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사로 인해, 이것이 전사 후에 폴리아데닐화되는 경우에도 진핵성 형질감염에 유효하지 않는 정상 크기의 mRNA가 생성된다.
선형 DNA 주형 상에서는, 파지 T7 RNA 중합효소가 주형의 마지막 염기를 벗어나서 전사체의 3' 말단을 연장시킬 수 있다 [Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)].
폴리A/T 연장물을 DNA 주형 내로 통합시키는 통상적인 방법은 분자 클로닝이다. 그러나, 플라스미드 DNA 내로 통합된 폴리A/T 서열은 플라스미드 불안정성을 유발시킬 수 있는데, 이는 박테리아성 세포로부터 수득된 플라스미드 DNA 주형이 종종 결실 및 다른 일탈로 고도로 오염되는 이유이다. 이로써, 클로닝 과정은 힘들고 시간 소모적일 뿐만 아니라 종종 신뢰할 수 없다. 이는 클로닝을 이용하지 않고 폴리A/T 3' 연장물을 이용하여 DNA 주형을 구축할 수 있는 방법이 고도로 바람직한 이유이다.
전사 DNA 주형의 폴리A/T 절편은 PCR 동안 폴리T 꼬리, 예컨대 100T 꼬리 (서열 117) (크기는 50 내지 5000 T (서열 118)일 수 있다)를 함유하는 역배향 프라이머를 이용함으로써 생성될 수 있거나, 또는 PCR 후에 다른 어떠한 방법 (DNA 결찰 또는 시험관내 재조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다)에 의해서도 생성될 수 있다. 폴리(A) 꼬리는 또한, RNA에 대한 안정성을 제공하고 그의 분해를 저하시킨다. 일반적으로, 폴리(A) 꼬리의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 긍정적으로 상관이 있다. 한 실시양태에서, 폴리(A) 꼬리는 100개 내지 5000개의 아데노신 (서열 119)이다.
RNA의 폴리(A) 꼬리는 폴리(A) 중합효소, 예컨대 이. 콜라이 폴리A 중합효소 (E-PAP)를 이용하여 시험관내 전사 후에 추가로 연장될 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리(A) 꼬리의 길이를 100개 뉴클레오티드에서 300개 내지 400개 뉴클레오티드 (서열 120)로 증가시키면, RNA의 번역 효율이 약 2배 정도 증가된다. 부가적으로, 상이한 화학적 기를 3' 말단에 부착시키면, mRNA 안정성이 증가될 수 있다. 이러한 부착은 변형된/인공 뉴클레오티드, 앱타머(aptamer) 및 기타 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 폴리(A) 중합효소를 이용하여 ATP 유사체를 폴리(A) 꼬리 내로 혼입할 수 있다. ATP 유사체가 RNA의 안정성을 추가로 증가시킬 수 있다.
5' 캡이 또한, RNA 분자에 대한 안정성을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 5' 캡을 포함한다. 이러한 5' 캡은 당해 분야에 공지되고 본원에 기재된 기술을 이용하여 제공된다 [Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)].
본원에 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 또한, 내부 리보솜 유입 부위 (IRES) 서열을 함유할 수 있다. 이러한 IRES 서열은 mRNA에 대한 캡-비의존성 리보솜 결합을 개시하고 번역 개시를 촉진시켜 주는 모든 바이러스성, 염색체성 또는 인공적으로 설계된 서열일 수 있다. 세포 투과성과 생육성을 촉진시켜 주는 인자, 예컨대 당, 펩티드, 지질, 단백질, 항산화제 및 계면활성제를 함유할 수 있는, 세포 전기천공에 적합한 모든 용질이 포함될 수 있다.
RNA는 수많은 상이한 방법, 예를 들어 전기천공 [아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector)-II (아막사 바이오시스템즈 (Amaxa Biosystems; 독일 쾰른))], [ECM 830 (BTX) (하바드 인스트루먼츠 (Harvard Instruments; 미국 매사추세츠주 보스톤))] 또는 유전자 펄서 (Gene Pulser) II [바이오래드 (BioRad; 미국 콜로라도주 덴버)], 다천공기 (Multiporator) [에펜도르트 (Eppendort; 독일 함부르크)], 리포펙션을 이용한 양이온성 리포솜 매개된 형질감염, 중합체 피막화, 펩티드 매개된 형질감염, 또는 바이오리스틱(biolistic) 입자 전달 시스템, 예컨대 "유전자 총"을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 시판중인 방법 중 어느 것을 이용하여 표적 세포 내로 도입할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)] 참조).
CAR을 코딩하는 핵산 구축물
본 발명은 본원에 기재된 하나 이상의 CAR 구축물을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 한 측면에서, 이러한 핵산 분자는 메신저 RNA 전사체로서 제공된다. 한 측면에서, 핵산 분자는 DNA 구축물로서 제공된다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이며, 상기 CAR은 항-EGFRvIII 결합 도메인 (예를 들어, 인간화 항-EGFRvIII 결합 도메인); 막횡단 도메인; 및 자극 도메인, 예를 들어 공동자극성 신호전달 도메인 및/또는 일차 신호전달 도메인, 예를 들어 제타 쇄를 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 본원에 기재된 항-EGFRvIII 결합 도메인, 예를 들어 서열 38, 서열 44, 서열 50, 서열 56, 서열 62, 서열 68, 서열 74, 및 서열 80으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항-EGFRvIII 결합 도메인이다. 한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 공동자극 도메인을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인이다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열 16의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인이다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 15의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인과 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열 16 또는 서열 102의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열, 및 서열 17 또는 서열 99의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이러한 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 힌지 영역, 예를 들어 본원에 기재된 힌지에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 한 실시양태에서, 힌지 영역은 서열 14 또는 서열 104 또는 서열 106 또는 서열 108, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 13의 리더 서열; 서열 38, 서열 44, 서열 50, 서열 56, 서열 62, 서열 68, 서열 74, 서열 80 및 서열 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 scFv 도메인; 서열 14 또는 서열 104 또는 서열 106 또는 서열 108 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)의 힌지 영역; 서열 15의 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 막횡단 도메인; 서열 16의 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인 또는 서열 102의 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 CD27 공동자극 도메인; 및 서열 17 또는 서열 99의 서열 (또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열)을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함하는 CAR 구축물을 코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 핵산 분자에 의해 코딩된 단리된 폴리펩티드 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 이러한 단리된 폴리펩티드 분자는 서열 43, 서열 49, 서열 55, 서열 61, 서열 67, 서열 73, 서열 79, 서열 85, 및 서열 90으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 73의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 서열 79의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항-EGFRvIII 결합 도메인; 막횡단 도메인; 및 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) 분자를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이며, 상기 항-EGFRvIII 결합 도메인은 서열 38, 서열 44, 서열 50, 서열 56, 서열 62, 서열 68, 서열 74, 서열 80 및 서열 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 상기 코딩된 CAR 분자는 공동자극 도메인을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 이러한 공동자극 도메인은 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인이다. 한 실시양태에서, 공동자극 도메인은 서열 16의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인이다. 한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 서열 15의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인과 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 서열 16의 서열 및 서열 17의 서열을 포함하며, 이러한 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다. 한 실시양태에서, 항-EGFRvIII 결합 도메인은 힌지 영역에 의해 막횡단 도메인에 연결된다. 한 실시양태에서, 힌지 영역은 서열 14를 포함한다. 한 실시양태에서, 힌지 영역은 서열 104 또는 서열 106 또는 서열 108을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 13의 리더 서열; 서열 38, 서열 44, 서열 50, 서열 56, 서열 62, 서열 68, 서열 74, 서열 80 및 서열 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 scFv 도메인; 서열 14 또는 서열 104 또는 서열 106 또는 서열 108의 힌지 영역; 서열 15의 서열을 갖는 막횡단 도메인; 서열 16의 서열을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인 또는 서열 102의 서열을 갖는 CD27 공동자극 도메인; 및 서열 17 또는 서열 99의 서열을 갖는 CD3 제타 자극 도메인을 포함하는 코딩된 CAR 분자에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 코딩된 CAR 분자는 서열 43, 서열 49, 서열 55, 서열 61, 서열 67, 서열 73, 서열 79, 서열 85, 및 서열 90으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 CAR 분자는 서열 73의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 코딩된 CAR 분자는 서열 79의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
목적하는 분자를 코딩하는 핵산 서열은 당해 분야에 공지된 재조합 방법을 이용하여, 예컨대 예를 들어 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝하거나, 상기를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 유전자를 유도시키거나, 또는 표준 기술을 이용하여 상기를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써 수득할 수 있다. 또 다른 한편으론, 관심 유전자를 클로닝하기 보다는 합성적으로 생성시킬 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 DNA를 삽입한 벡터를 제공한다. 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스로부터 유래된 벡터가 장기간 유전자 전이를 달성하는 데 적합한 도구이며, 이는 이들이 트랜스진의 장기간 안정한 통합과 딸 세포에서의 그의 증식을 허용하기 때문이다. 렌티바이러스성 벡터는 비-증식성 세포, 예컨대 간세포를 형질도입시킬 수 있다는 점에서 종양-레트로바이러스, 예컨대 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 부가의 이점을 지니고 있다. 이들 바이러스는 또한, 면역원성이 낮다는 부가의 이점을 지니고 있다.
간략하게 요약하면, CAR을 코딩하는 자연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로, CAR 폴리펩티드 또는 그의 일부를 코딩하는 핵산을 프로모터에 작동적으로 연결시키고, 그 구축물을 발현 벡터 내로 혼입시킴으로써 달성된다. 벡터는 진핵생물의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열, 및 목적하는 핵산 서열의 발현을 조절하는 데 유용한 프로모터를 함유한다.
본 발명의 발현 구축물은 또한, 표준 유전자 전달 프로토콜을 이용하여, 핵산 면역과 유전자 요법에 사용될 수 있다. 유전자 전달을 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466 참조; 그들의 전문이 본원에 참조로 포함된다). 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 유전자 요법 벡터를 제공한다.
핵산은 수많은 유형의 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스, 및 코스미드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 특히 관심있는 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 발생 벡터, 및 서열 분석용 벡터를 포함한다.
추가로, 발현 벡터는 바이러스성 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스성 벡터 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)], 및 기타 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 하나 이상의 유기체에서 기능적인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선별성 마커를 함유한다 (예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193).
포유동물 세포 내로 유전자 전이시키기 위한 수많은 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선별된 유전자를 벡터 내로 삽입하고, 당해 분야에 공지된 기술을 이용하여 레트로바이러스성 입자에 패키징한다. 이어서, 재조합 바이러스를 단리하고, 이를 생체내 또는 생체외에서 대상체의 세포에 전달할 수 있다. 수많은 레트로바이러스성 시스템이 당해 분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 수많은 아데노바이러스 벡터는 당해 분야에 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
부가의 프로모터 요소, 예를 들어 증강인자는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 출발 부위의 30 내지 110 bp 상류에 있는 영역에 위치하지만, 수많은 프로모터가 또한 출발 부위의 하류에 있는 기능적 요소를 함유하는 것으로 최근에 밝혀졌다. 프로모터 요소들 간의 간격은 종종 가요성이므로, 요소들이 서로 역위되거나 이동하는 경우에도 프로모터 기능은 보존된다. 티미딘 키나제 (tk) 프로모터에서는, 활성이 감소되기 시작하기 전에 50 bp 떨어지도록 프로모터 요소들 간의 간격을 증가시킬 수 있다. 프로모터에 따라서, 개개의 요소들은 전사를 활성화시키기 위하여 협력하거나 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 여겨진다.
적합한 프로모터의 한 가지 예는 즉발형 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이러한 프로모터 서열은 그와 작동적으로 연결된 모든 폴리뉴클레오티드 서열의 고 수준의 발현을 구동할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 또 다른 예는 신장 성장 인자-1α (EF-1α)이다. 그러나, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 조기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍증 바이러스 (HIV) 장 말단 반복 서열 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡슈타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 즉발형 프로모터, 라우스(Rous) 육종 바이러스 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 기타 구성적 프로모터 서열뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터, 예컨대 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터 (이에 제한되지 않는다)가 사용될 수도 있다. 추가로, 본 발명은 구성적 프로모터의 사용으로 제한되지 않아야 한다. 유도성 프로모터가 또한, 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터를 사용하면, 발현이 요망되는 경우에는 작동적으로 연결되는 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 켤 수 있거나, 또는 발현이 요망되지 않는 경우에는 상기 발현을 끌 수 있는 분자 스위치가 제공된다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
CAR 폴리펩티드 또는 그의 일부의 발현을 평가하기 위하여, 세포 내로 도입될 발현 벡터는 또한, 바이러스성 벡터를 통하여 형질감염 또는 감염시키고자 하는 세포 집단으로부터 발현성 세포의 확인 및 선별을 촉진시키기 위한 선별성 마커 유전자 또는 리포터 유전자를 함유하거나 둘 다를 함유할 수 있다. 다른 측면에서, 선별성 마커는 별도의 DNA 조각 상에 수반될 수 있고, 공동-형질감염 과정에 사용될 수 있다. 선별성 마커와 리포터 유전자 둘 다는 적당한 조절성 서열과 플랭킹하여 숙주 세포에서의 발현을 가능하게 할 수 있다. 유용한 선별성 마커는, 예를 들어 항생제 내성 유전자, 예컨대 neo 등을 포함한다.
잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고 조절성 서열의 기능성을 평가하기 위한 리포터 유전자를 사용한다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용자 유기체 또는 조직에는 존재하지 않거나 또는 이러한 유기체 또는 조직에 의해서는 발현되지 않고, 그의 발현이 일부 용이하게 검출 가능한 특성, 예를 들어 효소적 활성에 의해 분명히 나타나는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA를 수용자 세포 내로 도입한 후 적합한 시간에 검정한다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제를 코딩하는 유전자, 또는 그린 형광성 단백질 유전자를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82] 참조). 적합한 발현 시스템은 널리 공지되어 있고 공지된 기술을 이용하여 제조하거나 또는 상업적으로 수득할 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 가장 높은 수준의 발현을 나타내는 최소 5' 플랭킹 영역을 수반한 구축물이 프로모터로서 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결될 수 있고, 이를 사용하여 프로모터-구동된 전사를 조정할 수 있는 능력에 관하여 작용제를 평가할 수 있다.
유전자를 세포 내로 도입하고 발현하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 발현 벡터의 맥락에서, 이러한 벡터는 당해 분야의 어떠한 방법에 의해서도 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포 내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전이될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미소주사, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생성시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York] 참조). 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 바람직한 방법은 인산칼슘 형질감염이다.
관심 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스성 벡터, 및 특히 레트로바이러스성 벡터는 유전자를 포유동물, 예를 들어 인간 세포 내로 삽입하기 위하여 가장 광범위하게 사용되어 왔던 방법이다. 기타 바이러스성 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,350,674 및 5,585,362 참조).
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 화학적 수단은 콜리이드성 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드, 및 지질-기반 시스템 (수중유 에멀션, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜 포함)을 포함한다. 시험관내 및 생체내에서 전달 비히클로서 사용하기 위해 예시되는 콜로이드성 시스템은 리포솜 (예를 들어, 인공 막 소포)이다.
비-바이러스성 전달 시스템이 활용되는 경우에는, 예시되는 전달 비히클이 나노입자, 예를 들어 리포솜 또는 기타 적합한 서브-마이크론 크기의 전달 시스템이다. 핵산을 숙주 세포 내로 도입하기 위하여 지질 제제를 사용하는 것이 고려된다 (시험관내, 생체외 또는 생체내). 또 다른 측면에서, 핵산은 지질과 연합될 수 있다. 지질과 연합된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 피막화될 수 있거나, 리포솜의 지질 이층 내에 산재되거나, 리포솜과 올리고뉴클레오티드 둘 다와 연합되는 연결성 분자를 통하여 리포솜에 부착되거나, 리포솜에 봉입되거나, 리포솜과 복합체를 형성하거나, 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 중의 현탁제로서 함유되거나, 미셀에 함유되거나 이와 복합체를 형성하거나, 또는 그 밖에 지질과 연합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 연합된 조성물은 용액 중의 어떠한 특별한 구조로도 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이층 구조로 존재하거나, 미셀로서 존재하거나, 또는 "붕괴된" 구조와 함께 존재할 수 있다. 이들은 또한, 간단히 용액 중에 산재되어, 가능하게는 크기 또는 외형 면에서 균일하지 않는 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 자연 발생적 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에 자연적으로 발생되는 지방 비말뿐만 아니라 장쇄 지방족 탄화수소 및 그의 유도체, 예컨대 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜 및 알데히드를 함유하는 화합물 부류를 포함한다.
사용하기에 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC")은 시그마 (Sigma; 미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 수득할 수 있고; 디세틸 포스페이트 ("DCP")는 케이앤케이 라보라토리즈 (K & K Laboratories; 미국 뉴욕주 플레인뷰)로부터 수득할 수 있으며; 콜레스테롤 ("Choi")은 칼바이오켐-베링거(Calbiochem-Behring)로부터 수득할 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤 ("DMPG") 및 기타 지질은 애반티 폴라 리피드, 인크. (Avanti Polar Lipids, Inc.; 미국 앨라배마주 버밍햄)로부터 수득할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중의 지질의 스톡 용액을 약 -20℃ 하에 저장할 수 있다. 클로로포름이 유일한 용매로서 사용되는데, 이는 이것이 메탄올 보다 더 용이하게 증발되기 때문이다. "리포솜"은 봉입된 지질 이층 또는 응집체의 발생에 의해 형성된 각종 단일 및 다중막 지질 비히클을 포괄하는 일반적 용어이다. 리포솜은 인지질 이층 막과 내부 수성 매질을 수반한 소포 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 다중막 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖고 있다. 이들은 인지질이 과량의 수성 용액에 현탁되는 경우에 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 밀폐된 구조가 형성되기 전에 자가-재배열을 진행하고, 물과 용해된 용질을 지질 이층 사이에 봉입시킨다 (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). 그러나, 정상적인 소포 구조 보다는 용액 중에 상이한 구조를 갖는 조성물이 또한 포괄된다. 예를 들어, 지질은 미셀 구조로 추정되거나 또는 단지 지질 분자의 비균일한 응집체로서 존재할 수 있다. 또한, 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
외인성 핵산을 숙주 세포 내로 도입하거나 또는 그 밖에 세포를 본 발명의 억제제에 노출시키기 위해 사용된 방법에 상관없이, 숙주 세포 내에서의 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위하여, 각종 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어 통상의 기술자에게 널리 공지된 "분자 생물학적" 검정, 예컨대 서던(Southern) 및 노던(Northern) 블롯팅, RT-PCR 및 PCR; "생화학적" 검정, 예컨대 예를 들어, 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해 또는 본 발명의 범위 내에 속하는 작용제를 확인하기 위한 본원에 기재된 검정에 의해, 특별한 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 검정을 포함한다.
본 발명은 추가로, CAR 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 한 측면에서, CAR 벡터는 세포, 예를 들어 T 세포 내로 직접적으로 형질도입시킬 수 있다. 한 측면에서, 벡터는 클로닝 또는 발현 벡터이며, 예를 들어 하나 이상의 플라스미드 (예를 들어, 발현 플라스미드, 클로닝 벡터, 미니서클, 미니벡터, 미소쌍 염색체), 레트로바이러스성 및 렌티바이러스성 벡터 구축물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 벡터이다. 한 측면에서, 벡터는 CAR 구축물을 포유동물 T 세포에서 발현할 수 있다. 한 측면에서, 포유동물 T 세포는 인간 T 세포이다.
T 세포의 공급원
확장 및 유전적 변형 이전에, T 세포의 공급원을 대상체로부터 수득한다. 용어 "대상체"는 면역 반응이 유발될 수 있는 살아있는 유기체 (예를 들어, 포유동물)를 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 그의 트랜스제닉 종을 포함한다. T 세포는 말초혈 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 포함한 수많은 공급원으로부터 수득할 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 당해 분야에서 입수 가능한 수많은 T 세포주를 사용할 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, T 세포는 통상의 기술자에게 공지된 수많은 기술, 예컨대 피콜(Ficoll)™ 분리를 이용하여 대상체로부터 수집된 혈액 유닛(unit)으로부터 수득할 수 있다. 하나의 바람직한 측면에서, 특정 개체의 순환성 혈액으로부터의 세포는 성분채집술 (apheresis)에 의해 수득한다. 이러한 성분채집술 생성물은 전형적으로, 림프구 (T 세포 포함), 단구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 함유한다. 한 측면에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고, 후속 처리 단계를 위해 세포를 적당한 완충액 또는 매질에 놓아둘 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 세포를 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척한다. 대체 측면에서, 세척 용액에는 칼슘이 결여되고, 마그네슘이 결여될 수 있거나 또는 2가 양이온 전부는 아니지만, 많은 것이 결여될 수 있다. 칼슘의 부재 하에서의 초기 활성화 단계로 인해, 확대된 활성화가 초래될 수 있다. 통상의 기술자에게 용이하게 인지되는 바와 같이, 세척 단계는 통상의 기술자에게 공지된 방법, 예컨대 제조업자의 지시에 따라서 반-자동화 "관류" 원심분리기 [예를 들어, 코브(Cobe) 2991 세포 처리기, 박스터 시토메이트(Baxter CytoMate), 또는 해모네틱스 셀 세이버(Haemonetics Cell Saver) 5]를 사용함으로써 달성할 수 있다. 세척 후, 세포를 각종 생체적합성 완충제, 예컨대 예를 들어, Ca-무함유, Mg-무함유 PBS, 플라스마라이트(PlasmaLyte) A, 또는 완충제를 수반하거나 수반하지 않는 기타 식염수 용액에 재현탁시킬 수 있다. 또 다른 한편으론, 성분채집술 샘플의 바람직하지 못한 성분을 제거할 수 있고, 세포를 배양 배지에 직접 재현탁시킬 수 있다.
한 측면에서, T 세포는, 예를 들어 PERCOLLTM 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심 세정에 의해, 적혈구를 용해시키고 단구를 고갈시킴으로써 말초혈 림프구로부터 단리한다. T 세포의 특이적 아집단, 예컨대 CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+ T 세포는 양성 또는 음성 선별 기술에 의해 추가로 단리할 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서, T 세포는 목적하는 T 세포의 양성 선별에 충분한 시간 동안, 항-CD3/항-CD28 (예를 들어, 3x28)-접합된 비드, 예컨대 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와 함께 인큐베이션함으로써 단리한다. 한 측면에서, 시간은 약 30분이다. 추가 측면에서, 시간은 30분 내지 36시간의 범위이거나 이 보다 더 길고, 그들 사이의 모든 정수 값이다. 추가 측면에서, 시간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 또한 또 다른 바람직한 측면에서, 시간은 10 내지 24시간이다. 한 측면에서, 인큐베이션 시간은 24시간이다. 보다 긴 인큐베이션 시간을 이용하여, 종양 조직으로부터 또는 면역기능저하 개체로부터 종양 침윤성 림프구 (TIL)을 단리하는 데 있어서, 기타 세포 유형과 비교해서 T 세포가 거의 없는 어떠한 상황 하에서도 T 세포를 단리할 수 있다. 추가로, 보다 긴 인큐베이션 시간을 이용하면, CD8+ T 세포의 포획 효율이 증가될 수 있다. 따라서, 상기 시간을 단순히 단축시키거나 연장시킴으로써, T 세포를 CD3/CD28 비드와 결합시킬 수 있고/있거나 T 세포에 대한 비드의 비를 증가 또는 감소시킴으로써 (본원에 추가로 기재되는 바와 같음), T 세포의 아집단을 배양 초기에 또는 공정 동안의 다른 시점에서 그에 대해 우선적으로 선별하거나 그에 대항하여 선별할 수 있다. 부가적으로, 상기 비드 또는 기타 표면 상에서의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비를 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 아집단을 배양 초기에 또는 다른 목적하는 시점에서 그에 대해 우선적으로 선별하거나 그에 대항하여 선별할 수 있다. 통상의 기술자는 본 발명의 맥락에서 선별 수 회전을 사용할 수도 있다는 것을 인식할 것이다. 특정 측면에서, 이러한 선별 과정을 수행하고, "선별되지 않은" 세포를 활성화 및 확장 공정에 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "선별되지 않은" 세포를 대상으로 하여 또한, 추가의 선별 회전을 수행할 수 있다.
음성 선별에 의해 T 세포 집단을 강화시키는 것은 음성적으로 선별된 세포에 독특한 표면 마커에 대해 유도된 항체의 조합물을 이용하여 달성될 수 있다. 한 가지 방법은 음성적으로 선별된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 유도된 모노클로날 항체의 칵테일을 이용하는 유동 세포법 또는 음성 자기 면역흡착을 통한 선별 및/또는 세포 분류이다. 예를 들어, 음성 선별에 의해 CD4+ 세포를 강화시키기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 전형적으로, CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 측면에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+, 및 FoxP3+을 발현하는 조절성 T 세포를 강화시키거나 또는 이러한 세포에 대해 양성적으로 선별하는 것이 바람직할 수 있다. 또 다른 한편으론, 특정 측면에서, T 조절성 세포는 항-C25 접합된 비드 또는 기타 유사한 선별 방법에 의해 고갈된다.
한 실시양태에서, IFN-γ, TNFα, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, 그랜자임(granzyme) B, 및 페르포린(perforin), 또는 기타 적당한 분자, 예를 들어 기타 시토카인 중 하나 이상을 발현하는 T 세포 집단을 선별할 수 있다. 세포 발현에 관하여 스크리닝하는 방법은, 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2013/126712에 기재된 방법에 의해 결정할 수 있다.
양성 또는 음성 선별에 의해 목적하는 세포 집단을 단리하기 위하여, 세포 및 표면 (예를 들어, 비드와 같은 입자)의 농도를 다양하게 할 수 있다. 특정 측면에서, 세포와 비드가 반드시 최대로 접촉되도록, 비드와 세포가 함께 혼합되는 용적을 상당히 감소시키는 것이 (예를 들어, 세포의 농도를 증가시키는 것이) 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서, 20억 개 세포/ml의 농도를 사용한다. 한 측면에서, 10억 개 세포/ml의 농도를 사용한다. 추가 측면에서, 1억 개 초과 세포/ml의 농도를 사용한다. 추가 측면에서, 1천만 개, 1천5백만 개, 2천만 개, 2천5백만 개, 3천만 개, 3천5백만 개, 4천만 개, 4천5백만 개 또는 5천만 개 세포/ml의 농도를 사용한다. 또한 한 측면에서, 7천5백만 개, 8천만 개, 8천5백만 개, 9천만 개, 9천5백만 개 또는 1억 개 세포/ml의 농도를 사용한다. 추가 측면에서, 1억2천5백만 개 또는 1억5천만 개 세포/ml의 농도를 사용할 수 있다. 고 농도를 사용하면, 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장이 증가될 수 있다. 추가로, 고 농도의 세포를 사용하면, 많은 종양 세포가 존재하는 샘플 (예를 들어, 백혈병 혈액, 종양 조직 등)으로부터, 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 예컨대 CD28-음성 T 세포를 보다 효율적으로 포획할 수 있다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 지닐 수 있으므로 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 고 농도의 세포를 이용하면, 정상적으로는 보다 약한 CD28 발현을 나타내는 CD8+ T 세포를 보다 효율적으로 선별할 수 있다.
관련 측면에서, 보다 저 농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포와 표면 (예를 들어, 비드와 같은 입자)의 혼합물을 상당히 희석시킴으로써, 입자와 세포 간의 상호 작용을 최소화한다. 이로써, 입자와 결합될 목적 항원을 다량으로 발현하는 세포가 선별된다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 보다 고 수준의 CD28을 발현하고, 희석 농도에서는 CD8+ T 세포 보다 더 효율적으로 포획된다. 한 측면에서, 사용된 세포의 농도는 5 X 106개/ml이다. 다른 측면에서, 사용된 농도는 약 1 X 105개/ml 내지 1 X 106개/ml, 및 그 사이의 모든 정수 값일 수 있다.
다른 측면에서, 세포는 2 내지 10℃ 또는 실온에서 다양한 속도 하에 다양한 시간 동안 로테이터(rotator) 상에서 인큐베이션할 수 있다.
자극하기 위한 T 세포는 또한, 세척 단계 후에 동결시킬 수 있다. 특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단 중의 과립구를 제거하고 어느 정도는 단구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장과 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포를 동결 용액에 현탁시킬 수 있다. 많은 동결 용액 및 파라미터가 당해 분야에 공지되어 있고 본 맥락에서 유용할 것이지만, 한 가지 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS; 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% 플라스마라이트-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지; 또는 예를 들어, 헤스판(Hespan) 및 플라스마라이트 A를 함유하는 기타 적합한 세포 동결 배지를 사용한 다음, 세포를 분당 1℃의 속도로 -80℃로 동결시키고 액체 질소 저장 탱크의 증기 상 하에 저장하는 것을 포함한다. 기타 제어식 동결 방법을 사용할 수 있을 뿐만 아니라 -20℃ 하에 또는 액체 질소에서 즉시 비제어식 동결을 사용할 수 있다.
특정 측면에서, 냉동보존된 세포를 해동하고, 본원에 기재된 바와 같이 세척하며, 본 발명의 방법을 이용하여 활성화하기 이전에 실온에서 1시간 동안 정지시켜 두었다.
또한, 본 발명의 맥락에서, 본원에 기재된 바와 같이 확장된 세포가 필요해지기 이전의 특정 시간에 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 성분채집술 생성물의 컬렉션이 고려된다. 따라서, 확장시키고자 하는 세포의 공급원을 필요한 어느 시점에 수집할 수 있고, 목적하는 세포, 예컨대 T 세포를, T 세포 요법으로부터 이득을 얻을 것인 수많은 질환 또는 병태, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 병태에 대하여 나중에 T 세포 요법에 사용하기 위하여 단리 및 동결시킬 수 있다. 한 측면에서, 혈액 샘플 또는 성분채집술은 일반적으로, 건강한 대상체로부터 취한다. 특정 측면에서, 혈액 샘플 또는 성분채집술은 일반적으로, 질환 발생 위험이 있지만, 아직까지는 질환이 발생하지 않은 건강한 대상체로부터 취하고, 나중에 사용하기 위하여 관심 세포를 단리 및 동결시킨다. 특정 측면에서, T 세포를 확장시키고, 동결시키며, 나중에 사용할 수 있다. 특정 측면에서, 샘플은 본원에 기재된 바와 같은 특별한 질환의 진단 직후, 어떠한 치료도 받기 이전에 환자로부터 수집한다. 추가 측면에서, 작용제, 예컨대 나탈리주맙(natalizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 및 FK506, 항체 또는 기타 면역제거제, 예컨대 CAMPATH, 항-CD3 항체, 시톡산, 플루다라빈, 시클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228, 및 방사선 요법으로의 치료를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 수많은 관련 치료 양식 이전에, 세포를 대상체로부터의 성분채집술 또는 혈액 샘플로부터 단리한다.
본 발명의 추가 측면에서, T 세포는 대상체에게 기능적 T 세포를 남겨두는 치료 후에 직접적으로 환자로부터 수득한다. 이와 관련하여, 특정 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물로의 치료 후, 치료 직후 환자가 이러한 치료로부터 정상적으로 회복될 것 같은 기간 동안, 수득된 T 세포의 질은 최적일 수 있거나 또는 생체외에서 확장할 수 있는 그의 능력을 개선시킬 수 있는 것으로 관찰되었다. 마찬가지로, 본원에 기재된 방법을 이용하는 생체외 조작 후, 이들 세포는 증강된 생착(engraftment)과 생체내 확장을 위해 바람직한 상태일 수 있다. 따라서, 본 발명의 맥락 내에서, 이러한 회복기 동안, T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계통의 기타 세포를 포함한 혈액 세포를 수집하는 것이 고려된다. 추가로, 특정 측면에서, 가동화 (예를 들어, GM-CSF를 이용한 가동화) 및 컨디셔닝 요법을 이용하여, 특히 요법 후 규정된 시간대 동안, 특별한 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생 및/또는 확장이 선호되는 대상체에서 특정 상태를 창출시킬 수 있다. 예시되는 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 및 기타 면역계 세포를 포함한다.
T 세포의 활성화 및 확장
T 세포는 일반적으로, 예를 들어 미국 특허 번호 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 미국 특허 출원 공개 번호 20060121005에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 활성화 및 확장시킬 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 T 세포는 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포의 표면 상에 공동자극성 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장될 수 있다. 특히, T 세포 집단은 본원에 기재된 바와 같이, 예컨대 항-CD3 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 또는 표면 상에 고정화된 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이온 투과 담체 (ionophore)와 연계해서 단백질 키나제 C 활성화제 (예를 들어, 브리오스타틴)과의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상의 보조 분자를 공동자극하기 위하여, 이러한 보조 분자와 결합하는 리간드를 사용한다. 예를 들어, T 세포 집단을, T 세포의 증식을 자극하기에 적당한 조건 하에 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉시킬 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위하여, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 (항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28 [디아클론 (Diaclone; 프랑스 브장송)]을 포함함)를 당해 분야에 흔히 공지된 기타 방법으로 사용할 수 있다 [Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):1319-1328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999].
특정 측면에서, T 세포에 대한 일차 자극성 신호와 공동자극성 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 있거나 표면과 커플링될 수 있다. 표면과 커플링되는 경우, 상기 작용제는 동일한 표면과 커플링되거나 (즉, "시스" 형태) 별도의 표면과 커플링될 수 있다 (즉, "트랜스" 형태). 또 다른 한편으론, 하나의 작용제는 표면과 커플링될 수 있고 다른 작용제는 용액 중에 있을 수 있다. 한 측면에서, 공동자극성 신호를 제공하는 작용제는 세포 표면과 결합되고, 일차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 용액 중에 있거나 표면과 커플링된다. 특정 측면에서, 양 작용제가 용액 중에 있을 수 있다. 한 측면에서, 작용제는 수용성 형태로 존재한 다음, 표면, 예컨데 Fc 수용체를 발현하는 세포, 또는 상기 작용제와 결합하게 될 항체 또는 기타 결합성 작용제와 가교 결합될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에서 T 세포를 활성화하고 확장하는데 사용하도록 고려되는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)에 관해서는, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 20040101519 및 20060034810을 참조할 수 있다.
한 측면에서, 상기 2개의 작용제를 동일한 비드 상에 (즉, "시스") 또는 별개의 비드 상에 (즉, "트랜스") 고정화시킨다. 한 예로서, 일차 활성화 신호를 제공하는 작용제는 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합성 단편이고, 공동자극성 신호를 제공하는 작용제는 항-CD28 항체 그의 항원-결합성 단편이며; 양 작용제는 등가의 분자량으로 동일한 비드에 공동-고정화시킨다. 한 측면에서, CD4+ T 세포 확장과 T 세포 성장을 위해서는, 비드에 결합된 각 항체의 1:1 비가 사용된다. 본 발명의 특정 측면에서, 1:1의 비를 이용하여 관찰된 확장과 비교해서 T 세포 확장 상의 증가가 관찰되도록, 비드와 결합된 항 CD3:CD28 항체의 비를 사용한다. 한 특별한 측면에서, 1:1의 비를 이용하여 관찰된 확장과 비교해서 약 1배 내지 약 3배의 증가가 관찰된다. 한 측면에서, 비드와 결합된 CD3:CD28 항체의 비는 100:1 내지 1:100의 범위 및 그 사이의 모든 정수 값이다. 본 발명의 한 측면에서, 항-CD3 항체 보다 더 많은 양의 항-CD28 항체가 입자와 결합되는데, 즉 CD3:CD28의 비는 1 미만이다. 본 발명의 특정 측면에서, 비드와 결합된 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비는 2:1 초과이다. 한 특별한 측면에서, 비드와 결합된 항체의 1:100 CD3:CD28 비가 사용된다. 한 측면에서, 비드와 결합된 항체의 1:75 CD3:CD28 비가 사용된다. 추가 측면에서, 비드와 결합된 항체의 1:50 CD3:CD28 비가 사용된다. 한 측면에서, 비드와 결합된 항체의 1:30 CD3:CD28 비가 사용된다. 한 바람직한 측면에서, 비드와 결합된 항체의 1:10 CD3:CD28 비가 사용된다. 한 측면에서, 비드와 결합된 항체의 1:3 CD3:CD28 비가 사용된다. 또한 한 측면에서, 비드와 결합된 항체의 3:1 CD3:CD28 비가 사용된다.
1:500 내지 500:1 및 그 사이의 모든 정수 값의 입자 대 세포의 비를 사용하여 T 세포 또는 기타 표적 세포를 자극할 수 있다. 통상의 기술자가 용이하게 인지할 수 있는 바와 같이, 입자 대 세포의 비는 표적 세포를 기준으로 한 입자 크기에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 작은 크기의 비드는 소수의 세포와만 결합할 수 있는 반면, 보다 큰 비드는 더 많은 세포와 결합할 수 있었다. 특정 측면에서, 세포 대 입자의 비는 1:100 내지 100:1의 범위 및 그 사이의 모든 정수 값이고, 추가 측면에서 상기 비는 1:9 내지 9:1 및 그 사이의 모든 정수 값을 포함하고, 이를 사용하여 T 세포를 자극할 수도 있다. T 세포 자극을 초래하는, 항-CD3-커플된 입자 및 항-CD28-커플된 입자 대 T 세포의 비는 상기 언급된 바와 같이 다양할 수 있지만, 특정의 바람직한 값은 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 및 15:1을 포함하고, 하나의 바람직한 비는 T 세포당 적어도 1:1 입자이다. 한 측면에서, 1:1 또는 그 미만의 입자 대 세포의 비를 사용한다. 한 특별한 측면에서, 바람직한 입자:세포 비는 1:5이다. 추가 측면에서, 입자 대 세포의 비는 자극 일수에 따라서 다양할 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서, 입자 대 세포의 비는 1일째에 1:1 내지 10:1이고, 부가의 입자를 매일 또는 격일로 세포에 가하고, 그 후 10일까지는 1:1 내지 1:10의 최종 비로 가한다 (부가하는 날의 세포 치를 기준으로 함). 한 특별한 측면에서, 입자 대 세포의 비는 자극 1일째에 1:1이고, 자극 3일째와 5일째에는 1:5로 조정한다. 한 측면에서, 자극 1일째에는 1:1의 최종 비를 기준으로 하고, 자극 3일째와 5일째에는 1:5의 최종 비를 기준으로 하여 입자를 매일 또는 격일로 가한다. 한 측면에서, 입자 대 세포의 비는 자극 1일째에는 2:1이고, 자극 3일째와 5일째에는 1:10으로 조정한다. 한 측면에서, 자극 1일째에는 1:1의 최종 비를 기준으로 하고, 자극 3일째와 5일째에는 1:10의 최종 비를 기준으로 하여 입자를 매일 또는 격일로 가한다. 통상의 기술자는 각종의 다른 비도 본 발명에 사용하는 데 적합할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 특히, 비는 입자 크기 및 세포 크기와 유형에 따라서 다양할 것이다. 한 측면에서, 사용하는 데 가장 전형적인 비는 1일째에 대략 1:1, 2:1 및 3:1이다.
본 발명의 추가 측면에서, 세포, 예컨대 T 세포를 작용제-코팅된 비드와 합하고, 이러한 비드와 세포를 연속해서 분리시킨 다음, 세포를 배양한다. 또 다른 측면에서, 배양하기 이전에, 상기 작용제-코팅된 비드와 세포를 분리시키지 않고 함께 배양한다. 추가 측면에서, 비드와 세포를 먼저, 자기력과 같은 힘을 적용함으로써 농축시켜, 세포 표면 마커의 결찰을 증가시킴으로써 세포 자극을 유도시킨다.
한 예로서, 항-CD3 및 항-CD28이 부착되는 상자성 비드 (3x28 비드)를 T 세포와 접촉되게 함으로써 세포 표면 단백질을 결찰시킬 수 있다. 한 측면에서, 상기 세포 (예를 들어, 104 내지 109개 T 세포)와 비드 (예를 들어, 1:1 비의 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)를 완충제, 예를 들어 PBS (2가 양이온, 예컨대 칼슘 및 마그네슘을 수반하지 않음)에서 합한다. 다시 언급하면, 통상의 기술자는 어떠한 세포 농도도 사용될 수 있다는 것을 용이하게 인지할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 샘플 중에 매우 드물 수 있고 샘플의 0.01%만을 차지할 수 있거나 또는 전체 샘플 (즉, 100%)이 관심 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 어떠한 세포 수도 본 발명의 맥락 내에 있다. 특정 측면에서, 세포와 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해서는, 입자와 세포가 함께 혼합되는 용적을 상당히 감소시키는 것이 (즉, 세포의 농도를 증가시키는 것이) 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 측면에서, 약 20억 개 세포/ml의 농도를 사용한다. 한 측면에서, 1억 개 초과 세포/ml의 농도를 사용한다. 추가 측면에서, 1천만 개, 1천5백만 개, 2천만 개, 2천5백만 개, 3천만 개, 3천5백만 개, 4천만 개, 4천5백만 개 또는 5천만 개 세포/ml의 농도를 사용한다. 또한 한 측면에서, 7천5백만 개, 8천만 개, 8천5백만 개, 9천만 개, 9천5백만 개 또는 1억 개 세포/ml의 농도를 사용한다. 추가 측면에서, 1억2천5백만 개 또는 1억5천만 개 세포/ml의 농도를 사용할 수 있다. 고 농도를 사용하면, 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장이 증가될 수 있다. 추가로, 고 농도의 세포를 사용하면, 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 예컨대 CD28-음성 T 세포를 보다 효율적으로 포획할 수 있다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 지닐 수 있으므로 특정 측면에서 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 고 농도의 세포를 이용하면, 정상적으로는 보다 약한 CD28 발현을 나타내는 CD8+ T 세포를 보다 효율적으로 선별할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 상기 혼합물은 수 시간 (약 3시간) 내지 약 14일 동안 또는 그 사이의 모든 시간 정수 값 동안 배양할 수 있다. 한 측면에서, 혼합물은 21일 동안 배양할 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 비드와 T 세포는 약 8일 동안 함께 배양한다. 한 측면에서, 비드와 T 세포는 2 내지 3일 동안 함께 배양한다. T 세포의 배양 시간이 60일 이상일 수 있도록, 자극 수회 주기가 요망될 수도 있다. T 세포 배양에 적당한 조건은 혈청 (예를 들어, 태아 소 또는 인간 혈청), 인터루킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, 및 TNF-α를 포함한, 증식 및 생육성에 필요한 인자, 또는 통상의 기술자에게 공지된 세포의 성장을 위한 기타 어떠한 부가제도 함유할 수 있는 적당한 배지 [예를 들어, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640, 또는 X-비보(vivo) 15, (론자(Lonza))]를 포함한다. 세포의 성장을 위한 기타 부가제는 계면활성제, 플라스마네이트, 및 환원제, 예컨대 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 배지는 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-비보 15, 및 X-비보 20; 아미노산, 소듐 피루베이트 및 비타민이 부가되거나, 혈청 무함유이거나 또는 적당한 양의 혈청 (또는 혈장) 또는 규정된 호르몬 세트로 보충시킨 최적화제; 및/또는 T 세포의 성장과 확장을 위해 충분한 양의 시토카인(들)을 포함할 수 있다. 항생제, 예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험용 배양물에만 포함되고, 대상체 내로 주입될 세포의 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지지하는 데 필요한 조건, 예를 들어 적당한 온도 (예를 들어, 37℃) 및 대기 (예를 들어, 5% CO2가 부가된 공기) 하에 유지시킨다.
다양한 자극 시간에 노출되었던 T 세포는 상이한 특징을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 전형적인 혈액 또는 성분채집된 말초혈 단핵 세포 생성물은 세포독성 또는 억제인자 T 세포 집단 (TC, CD8+) 보다 더 큰 헬퍼 T 세포 집단 (TH, CD4+)을 갖는다. CD3 수용체와 CD28 수용체를 자극함으로써 T 세포를 생체외에서 확장시키면, 약 8일 내지 9일 이전에는 주로 TH 세포로 이루어지는 T 세포 집단이 생성되지만, 약 8일 내지 9일 후, T 세포 집단은 점점 더 증가하는 TC 세포 집단을 포함한다. 따라서, 치료 목적에 따라서, 주로 TH 세포를 포함하는 T 세포 집단을 대상체에게 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원-특이적 서브세트를 단리한 경우에는, 이러한 서브세트를 더 많은 정도로 확장시키는 것이 유익할 수 있다.
추가로, CD4 및 CD8 마커 이외에도, 기타 표현형별 마커가 상당히 다양하지만, 대부분의 경우에는 세포 확장 공정의 과정 동안에 재현 가능한 수준으로 다양하다. 따라서, 이러한 재현 가능성으로 인해, 활성화된 T 세포 생성물을 특이적 목적에 맞게 할 수 있다.
일단 EGFRvIII CAR이 구축되면, 각종 검정을 이용하여 분자의 활성, 예컨대 항원 자극 후 T 세포를 확장시킬 수 있는 능력, 재자극의 부재 하에 T 세포 확장을 지속시킬 수 있는 능력, 및 시험관내 및 동물 모델에서 적당한 항암 활성 (이에 제한되지 않는다)을 평가할 수 있다. EGFRvIII CAR의 효과를 평가하는 검정은 다음에 추가로 상세히 기재되어 있다.
일차 T 세포에서의 CAR 발현의 웨스턴 블롯 분석을 이용하여, 단량체 및 이량체의 존재를 검출할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)] 참조). 매우 간략하게 언급하면, CAR을 발현하는 T 세포 (CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포의 1:1 혼합물)를 시험관내에서 10일 초과하여 확장시킨 다음, 용해시키고 환원성 조건 하에 SDS-PAGE한다. 전장 TCR-ζ 세포질 도메인 및 내인성 TCR-ζ 쇄를 함유하는 CAR은 TCR-ζ 쇄에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅함으로써 검출한다. 동일한 T 세포 서브세트를 비-환원성 조건 하에 SDS-PAGE 분석을 위해 사용하여 공유 이량체 형성을 평가할 수 있다.
항원 자극 후 CAR+ T 세포의 시험관내 확장은 유동 세포법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포의 혼합물을 αCD3/αCD28 aAPC로 자극한 다음, 분석하고자 하는 프로모터의 제어 하에 GFP를 발현하는 렌티바이러스성 벡터로 형질도입시킨다. 예시되는 프로모터는 CMV IE 유전자, EF-1α, 유비퀴틴 C, 또는 포스포글리세로키나제 (PGK) 프로모터를 포함한다. 배양 6일째에 유동 세포법에 의해 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 서브세트에서 GFP 형광을 평가한다 (예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)] 참조). 또 다른 한편으론, CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포의 혼합물을 0일째에 αCD3/αCD28 코팅된 자기 비드로 자극하고, 1일째에 2A 리보솜 스키핑(skipping) 서열을 이용하여 eGFP와 함께 CAR을 발현하는 비시스트로닉(bicistronic) 렌티바이러스성 벡터를 사용하여 CAR로 형질도입시킨다. 배양물을, 세척 후 항-CD3 및 항-CD28 항체의 존재 하에 hCD32 및 4-1BBL을 발현하는 K562 세포 (K562-BBL-3/28), 또는 EGFRvIII+ U-87 세포 (U-87-EGFRvIII) 또는 야생형 U-87 세포 (U-87 야생형)로 재자극한다. 외인성 IL-2를 100 IU/ml로 상기 배양물에 격일로 가한다. 비드-기반 를 이용하여 유동 세포법에 의해 GFP+ T 세포를 계산한다 (예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)] 참조).
재자극의 부재 하에 지속된 CAR+ T 세포 확장을 또한 평가할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8):1453-1464 (2009)] 참조). 간략하게 언급하면, 0일째에 αCD3/αCD28 코팅된 자기 비드로 자극하고, 1일째에 표시된 CAR로 형질도입한 후, 코울터 멀티사이저(Coulter Multisizer) III 입자 기를 이용하여 배양 8일째에 평균 T 세포 용적 (fl)을 측정한다.
세포 증식과 시토카인 생성을 평가하는 것은 기존에, 예를 들어 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]에 기재되었다. 간략하게 언급하면, CAR-매개된 증식을 평가하는 것은, 최종 T 세포:표적 세포 비 1:1을 위하여, 세척된 T 세포를 표적 세포, 예컨대 EGFRvIII 또는 EGFR 야생형 (wt)을 발현하는 U87MG, BHK 또는 CHO 세포, 또는 CD32 및 CD137을 발현하는 세포 (KT32-BBL)와 혼합함으로써 미세역가 판에서 수행한다. 항-CD3 (클론 OKT3) 및 항-CD28 (클론 9.3) 모노클로날 항체를, T-세포 증식을 자극하기 위한 양성 대조군으로서 제공하기 위하여 KT32-BBL 세포와 함께 배양물에 가하는데, 이는 이들 신호가 생체외에서 장기간 CD8+ T 세포 확장을 지지하기 때문이다. 제조업자에 의해 기재된 바와 같은 유동 세포법 및 카운트브라이트(CountBright)™ 형광성 비드 [인비트로젠 (Invitrogen; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)]를 이용하여 T 세포를 배양물에서 계산한다. eGFP-2A 연결된 CAR-발현성 렌티바이러스성 벡터를 이용하여 조작되는 T 세포를 사용하여 GFP 발현에 의해 CAR+ T 세포를 확인한다. GFP를 발현하지 않는 CAR+ T 세포에 대해서는, 바이오티닐화 재조합 EGFRvIII 단백질 및 이차 아비딘-PE 접합체를 이용하여 CAR+ T 세포를 검출한다. T 세포 상에서의 CD4+ 및 CD8+ 발현을 또한, 특이적 모노클로날 항체 [BD 바이오사이언스(Biosciences)]로 동시에 검출한다. 제조업자의 지시에 따라서 인간 TH1/TH2 시토카인 세포 비드 어레이 키트 (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)를 이용하여 재자극한 후 24시간째에 수집된 상등액 상에서 시토카인 측정을 수행한다. FACS칼리버(FACScalibur) 유동 세포기를 이용하여 형광을 평가하고, 제조업자의 지시에 따라서 데이터를 분석한다.
세포독성은 표준 51Cr-방출 검정에 의해 평가할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Milone et al., Molecular Therapy 17(8):1453-1464 (2009)] 참조). 간략하게 언급하면, 표적 세포 (EGFRvIII 또는 EGFR 야생형 (wt)을 발현하는 U87MG, BHK 또는 CHO 세포)에, 자주 진탕시키면서 2시간 동안 37℃ 하에 51Cr [NaCrO4로서; 뉴 잉글랜드 뉴클레어 (New England Nuclear; 미국 매사추세츠주 보스톤)]을 부하하고, 완전 RPMI에서 2회 세척하며, 미세역가 판 내로 도말한다. 이펙터 T 세포를 완전 RPMI 중의 웰에서 표적 세포와 혼합하는데, 이펙터 세포:표적 세포 (E:T)의 비를 다양하게 한다. 배지만을 함유하거나 (자발적 방출, SR) 또는 트리톤-X 100 세정제의 1% 용액을 함유하는 (총 방출, TR) 부가 웰을 또한 제조한다. 37℃에서 인큐베이션한지 4시간 후, 각 웰로부터의 상등액을 수거한다. 이어서, 감마 입자 기 [파카드 인스트루먼트 캄파니 (Packard Instrument Co.; 미국 매사추세츠주 월섬)]를 이용하여 방출된 51Cr을 측정한다. 각 조건을 적어도 세 번 되풀이하여 수행하고, 다음 식을 이용하여 용해 비율 (%)을 계산한다: % 용해 = (ER-SR)/(TR-SR) (여기서, ER은 각 실험 조건에 대해 방출된 평균 51Cr을 나타낸다). 또 다른 세포독성 검정, 예컨대 실시예 8에 기재된 바와 같은 유동-기반 세포독성 검정을 또한 사용할 수 있다.
방아벌레 (Click beetle) 레드 및 방아벌레 그린 루시페라제를 이용하여, 종양 진행과 T 세포 수송을 동시에 추적할 수 있는데, 이는 각각이 동일한 루시페린 기질을 이용하지만, 가시광선 스펙트럼의 반대편 말단에서 빛을 방출하기 때문이다.
본원의 실시예 섹션에 기재된 검정뿐만 아니라 당해 분야에 공지되어 있는 검정을 포함한 기타 검정을 또한 이용하여, 본 발명의 EGFRvIII CAR 구축물을 평가할 수 있다.
EGFRvIII 발현성 질환 및 장애에 대한 치료적 적용
EGFRvIII은 표피 성장 인자 수용체의 종양-특이적, 리간드-비의존성, 구성적으로 활성인 변이체이다. 본 발명은 EGFRvIII과 연관된 질환 및 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. EGFRvIII과 연관된 질환 또는 장애의 한 예는 신경교종이다.
신경교종은 신경교 세포 (예를 들어, 신경 세포를 둘러싸고 있고 이를 지지해주며, 희소돌기아교세포, 성상세포, 미세신경교 세포 및 뇌실막 세포를 포함하는 세포)에서 시작하는 중추 신경계의 암을 지칭한다. 신경교종은 발생률과 악성도 둘 다 측면에서 특히 심각하고, 그들의 상세한 병리학적 조직 유형에 따라서 7가지 이상의 유형, 예컨대 교모세포종 및 역형성 성상세포종으로 분류된다. 원발성 뇌종양의 악성도를 결정하는 경우에는, 질환 병기 (종양 크기, 원위부 전이의 존재)와 조직학적 악성도를 사용한다. 조직학적 악성도는 뇌종양 치료에 관한 지침 [(2002) Kanehara & Co., Ltd.]에 따라서 4가지 수준, 즉 G1 내지 G4로 분류되고, 이들은 각각 WHO1 내지 WHO4에 상응한다. 그 수가 클수록 악성도는 더 높아진다. 예를 들어 교모세포종의 악성도는 G4 (WHO4)인 반면, 역형성 성상세포종의 악성도는 G3 (WHO3)이며, G3과 G4 둘 다는 악성으로서 분류된다. 따라서, 일부 실시양태에 따라서, 본 발명의 방법은 악성 신경교종을 표적으로 한다. 다른 측면에서, 본 발명은 다형성 교모세포종 (GBM)을 표적으로 한다. 추가 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 역형성 성상세포종, 거대 세포 교모세포종, 신경교육종, 역형성 핍지교종, 역형성 상의세포종, 맥락총 암종, 역형성 신경절교종, 송과체모세포종, 수질상피종, 상의모세포종, 수모세포종, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 및 비정형 기형양/횡문근양 종양을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 기타 신경교종의 치료에 사용될 수 있다.
교모세포종은 성인에서 가장 흔한 원발성 뇌종양이다. 미국에서 매년 악성 원발성 뇌종양으로 진단된 18,000명의 환자 중 절반 이상이 다형성 교모세포종 환자이다. 다형성 교모세포종은 높은 증식 지수, 미세혈관성 증식 및 병소 괴사를 수반하는 고도로 세포성인 역형성 종양이다. 징후와 증상들은 여러 요인 (뇌 내에서의 종양의 크기, 성장율 및 국재화)에 좌우되고, 이는 주로 두통, 발작, 신경학적 결손, 정신 상태의 변화로써 나타난다. 다형성 교모세포종 예후는 여전히 암울하다. 대다수 환자에 대한 생존 시간은 2년 미만이다. 카르노브스키(Karnofsky) 수행 상태 (KPS)는 가장 중요한 예후 인자 중 하나이다: KPS>70인 환자는 증례의 대략 18%에서 18개월째 살아있는데, 이는 더 낮은 KPS 스코어를 나타내는 환자의 13%와 비교된다. 원발성 다형성 교모세포종은 신경교 세포로부터 새롭게 발생되고, 전형적으로 임상 병력이 6개월 미만이며, 나이 든 환자에서 더 흔하며 소세포 조직학을 제시한다. 이차 다형성 교모세포종은 기존의 저 악성도 성상세포종으로부터 수개월 또는 수년에 걸쳐 발생되고, 주로 더 어린 사람에게 영향을 미치며 거대 세포 조직학을 제시한다.
악성 신경교종은 또한, 고 악성도 신경교종으로서 공지되어 있다. 이는 뇌와 척수에 영향을 미칠 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여, 뇌 악성 신경교종, 예를 들어 역형성 성상세포종 (AA), 다형성 교모세포종 (GBM), 역형성 핍지교종 (AO) 및 역형성 희소돌기성상세포종 (AOA) 중에서 선택되는 것을 보유하고 있는 대상체를 치료할 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 다형성 교모세포종 (GBM)을 보유하고 있는 대상체를 치료할 수 있다.
다형성 교모세포종은 성상세포종의 가장 악성 병기이고, 대부분의 환자에 대한 생존 시간은 2년 미만이다. 조직학적으로, 이들 종양은 높은 증식 지수, 내피 증식 및 병소 괴사를 특징으로 한다. 이들 병변의 고도로 증식성인 성질은 다수의 분열촉진 효과로부터 비롯되는 것으로 예상된다. GBM의 특징 중 하나는 내피 증식이다. 다수의 혈관형성성 성장 인자와 그들의 수용체가 GBM에서 발견된다.
성상세포종의 생물학적 서브세트가 있는데, 이는 이들 종양에서 관찰된 임상적 이질성을 반영할 수 있다. 이들 서브세트는 소아 확산성 형태인 뇌간 신경교종, 종종 악성 과정을 따르는 섬유성 성상세포종을 포함한다. 뇌간 GBM은 더 젊은 환자에게 영향을 미치는 성인 GBM과 유전적 특색을 공유한다. 다형성 황색성상세포종 (PXA)는 주로 젊은 성인에게 영향을 미치는 표재성 저 악성도 성상세포 종양이다. 이들 종양이 기괴한 조직학적 외관을 지니고 있긴 하지만, 이들은 전형적으로 느리게 자라는 종양이므로, 외과적 치료를 받을 수 있다. 그러나, 일부 PXA는 GBM으로서 재발될 수 있다. 털모양세포의 성상세포종은 어린이의 가장 흔한 성상세포 종양이고, 성인에게 영향을 미치는 확산성, 섬유성 성상세포종과는 임상적 및 조직병리학적으로 상이하다. 털모양세포의 성상세포종은 확산성, 섬유성 성상세포종과 동일한 게놈 변경을 갖고 있지 않다. 뇌실막하 거대 세포 성상세포종 (SEGA)은 통상적으로 결절성 경화증 (TS)과 연관되는 뇌실 주위의 저 악성도 성상세포 종양이고, TS 환자의 뇌실 안을 막처럼 싸고 있는 소위 "캔들-구테링(candle-gutterings)"과 조직학적으로 동일하다. TS 내의 다른 종양성 병변과 유사하게, 이들은 느리게 자라고 있고, 진짜 신생물보다는 과오종에 더 가까울 수 있다. 유아기의 결합 조직 형성 대뇌 성상세포종 (DCAI) 및 결합 조직 형성 유아 신경절교종 (DIGG)은 1세 또는 2세 시기의 어린이에게 영향을 미치는 크고, 표재성이며, 통상적으로 낭포성의 양성 성상세포종이다.
핍지교종과 희소돌기성상세포종 (혼합 신경교종)은 임상적 및 생물학적으로 확산성의 섬유성 성상세포종과 가장 밀접하게 관련이 있는 확산성의 주로 CNS 신경교 종양이다. 그러나, 이 종양은 성상세포종보다 훨씬 덜 흔하고, 일반적으로 확산성 성상세포종 보다 더 우수한 예후를 지닌다. 핍지교종과 희소돌기성상세포종은 WHO 등급 III 역형성 핍지교종 또는 역형성 희소돌기성상세포종으로 진행될 수 있거나, 또는 WHO 등급 IV GBM으로 진행될 수 있다. 따라서, 희소돌기아교세포 종양을 초래하는 유전적 변화가 아직까지도 GBM에 대한 또 다른 경로를 구성한다.
상의세포종은 어린이의 침습성 뇌실내 종양에서부터 성인의 양성 척수 종양까지 다양한, 임상적으로 다양한 신경교종 군이다. 상의세포종이 GBM으로 전이되는 것은 드물다. 맥락총 종양은 또한, 어린이의 침습성 천막상 뇌실내 종양에서부터 성인의 양성 소뇌교각부 종양까지, 심실 시스템에서 우선적으로 발생하는 다양한 종양 군이다. 맥락총 종양은 리-프라우메니(Li-Fraumeni) 증후군과 폰 히펠-린다우(von Hippel-Lindau) (VHL) 질환이 있는 환자에서 가끔 보고되었다.
수모세포종은 주로 어린이의 후두와(posterior fossa)에서 발생하는 악성의 원시 종양이다. 이들 종양은 젊은 성인에서도 발생한다. 수모세포종은 종종, 외과적으로 절제한 후, 화학요법 및/또는 방사선으로 치료한다. 이들은 국소적으로 재발되거나 또는 가끔 후두와에서 척추로 드롭(drop) 전이로서 재발될 수 있다. 수막종은 수막에 발생하고 하층 뇌를 압박하는 흔한 두개내 종양이다. 전형적으로는 양성인 것으로 간주되고 솔직히 드문 경우에만 악성이긴 하지만, 이들 종양을 관리하는 것은 종종, 임상적 문제를 제기한다. 수막종의 조직학적 등급은 대다수 양성인 WHO 등급 I/IV (82%); 덜 일반적으로 비정형인 WHO II/IV (15%); 및 드물게, 역형성 또는 악성으로서 발생될 수 있는 WHO 등급 III/IV (3%)로 다양하다.
신경초종은 말초 신경에서 발생되는 양성 종양이다. 신경초종은 두개 신경, 특히 8번째 두개 신경의 전정 부분에서 발생하는데 (전정 신경초종, 청신경종), 여기서 이들은 소뇌교각부 덩어리로서 존재한다. 혈관모세포종은 내피 세포, 혈관 주위 세포 및 소위 간질 세포로 구성되는 불확실한 기원의 종양이다. 이러한 양성 종양은 젊은 성인의 소뇌와 척수에서 가장 자주 발생한다. 다발성 혈관모세포종은 폰 히펠-린다우병 (VHL)의 특징이다. 혈관주위세포종 (HPC)는 국소적으로 침습성이 강한 행위를 표시할 수 있고 전이될 수 있는 경막 종양이다. 경막-기반 혈관주위세포종 (HPC)의 조직형성은 장기간 논란이 되어 왔는데, 일부 저자는 이를 별개의 실체로서 분류하고 있고, 다른 저자는 이를 수막종의 하위 유형으로서 분류하고 있다.
원발성 뇌종양과 전이성 뇌종양 둘 다의 증상은 종종, 뇌에서의 위치와 종양의 크기에 좌우된다. 뇌의 각종 영역이 특이적 기능에 대해 책임이 있기 때문에, 임상적 증상은 상당히 다양할 것이다. 뇌의 전두엽 내의 종양은 쇠약과 마비, 기분 장애, 사고 곤란, 혼란과 방향 감각 상실, 및 넓은 감정적인 기분 변동을 유발시킬 수 있다. 두정엽 종양은 발작, 저림 또는 마비, 필기 곤란, 간단한 수학 문제를 수행할 수 없음, 특정의 움직임 곤란, 및 터치 감각의 상실을 유발시킬 수 있다. 후두엽 종양은 각 시야의 절반에서의 시력 상실, 시각적 환각, 및 발작을 유발시킬 수 있다. 측두엽 종양은 발작, 지각 및 공간 장애, 및 수용 실어증을 유발시킬 수 있다. 종양이 소뇌에서 발생하는 경우, 그 사람은 운동 실조, 조정 능력의 상실, 두통 및 구토를 수반할 수 있다. 시상 하부의 종양은 감정 변화, 및 더위와 추위에 대한 인식의 변화를 유발시킬 수 있다. 또한, 시상 하부 종양은 어린이의 성장과 영양에 영향을 미칠 수 있다. 소뇌를 제외하고, 뇌의 한쪽에 있는 종양은 신체의 반대편 쪽에 증상과 장애를 야기시킨다.
본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여, EGFRvIII을 발현하는 세포 또는 조직을 갖고 있는 것으로서 명확히 규명되었거나 또는 EGFRvIII을 발현하는 세포 또는 조직을 갖고 있는 것으로 추정되는 대상체를 치료할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따르는 치료로부터 이득을 얻는 대상체는 신경교종에 걸린 대상체, 또는 신경교종을 갖고 있는 것으로 추정되는 대상체를 포함하며, 이는 예를 들어, 두통, 오심 및 구토, 발작, 시력 상실, 통증, 쇠약, 사지의 마비, 및/또는 증가된 두개내 압력에 따른 결과로서의 두개 신경 장애 중 한 가지 이상이 존재함으로써 입증된다. 특별한 실시양태에서, 치료하고자 하는 신경교종은 다형성 교모세포종이다. 이러한 실시양태에 따라서, 다형성 교모세포종은 뇌 또는 척수 내에 존재할 수 있다.
본 발명은 EGFRvIII-발현성 세포를 포함하는 세포 집단을, EGFRvIII-발현성 세포와 결합하는 본원에 기재된 CAR-발현성 세포, 예를 들어 T 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 증식을 억제하거나 또는 EGFRvIII-발현성 세포 집단을 감소시키는 방법을 제공한다. 특이적 실시양태에서, 본 발명은 EGFRvIII-발현성 암 세포 집단을, EGFRvIII-발현성 세포와 결합하는 본원에 기재된 본 발명의 CAR-발현성 세포, 예를 들어 T 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 증식을 억제하거나 또는 EGFRvIII을 발현하는 암 세포 집단을 감소시키는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 EGFRvIII-발현성 암 세포 집단을, EGFRvIII-발현성 세포와 결합하는 본 발명의 EGFRvIII CART 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 증식을 억제하거나 또는 EGFRvIII을 발현하는 암 세포 집단을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 EGFRvIII CART 세포는 음성 대조군과 비교해서 EGFRvIII-발현성 세포와 연관된 신경교종 또는 또 다른 암에 대한 동물 모델 또는 이를 보유한 대상체에서 세포 및/또는 암 세포의 양, 수, 양 또는 비율(%)을 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 65% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 감소시킨다. 한 측면에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 또한, EGFRvIII-발현성 세포와 연관된 장애를 예방, 치료 및/또는 관리할 필요가 있는 대상체에게, EGFRvIII-발현성 세포와 결합하는 본원에 기재된 EGFRvIII CART 세포를 투여하는 것을 포함하는, 상기 EGFRvIII-발현성 세포와 연관된 장애 (예를 들어, 교모세포종)를 예방, 치료 및/또는 관리하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 EGFRvIII-발현성 세포와 연관된 암의 재발을 방지할 필요가 있는 대상체에게, EGFRvIII-발현성 세포와 결합하는 본원에 기재된 EGFRvIII CART 세포를 투여하는 것을 포함하는, 상기 EGFRvIII-발현성 세포와 연관된 암의 재발을 방지하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 EGFRvIII-발현성 세포와 연관된 암의 재발을 방지할 필요가 있는 대상체에게, EGFRvIII-발현성 세포와 결합하는 본원에 기재된 EGFRvIII CART 세포의 유효량을, 또 다른 요법의 유효량과 조합하여 투여하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 포유동물 T 세포에서 발현하기 위하여 프로모터와 작동적으로 연결된 EGFRvIII CAR을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 EGFRvIII-발현성 종양을 치료하는데 사용하기 위한 EGFRvIII CAR을 발현하는 재조합 T 세포를 제공한다. 항-EGFRvIII CAR을 발현하는 재조합 T 세포는 EGFRvIII CART로 명명된다. 한 측면에서, 본 발명의 EGFRvIII CART는 종양 세포를, 그의 표면 상에 발현된 본 발명의 하나 이상의 EGFRvIII CAR과 접촉시킬 수 있으므로, EGFRvIII CART가 항원에 대해 반응하여 활성화되고 이러한 CART는 종양 세포를 표적으로 하며 종양의 성장이 억제된다.
한 측면에서, 본 발명은 EGFRvIII-발현성 종양 세포를 본원에 기재된 EGFRvIII CAR T 세포와 접촉시켜, 이러한 CART가 항원에 반응하여 활성화되고 암 세포를 표적으로 하는 것을 포함하는 (여기서, 종양의 성장이 억제된다), 상기 EGFRvIII-발현성 종양 세포의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 활성화된 CART는 암 세포를 표적으로 하고 이를 사멸시킨다.
한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 대상체에게 본원에 기재된 EGFRvIII CAR T 세포를 투여하여, 이러한 대상체 내의 암을 치료하는 것을 포함한다. 본 발명의 EGFRvIII CAR T 세포에 의해 치료될 수 있는 암의 한 예는 EGFRvIII의 발현과 연관된 암이다. 한 측면에서, EGFRvIII의 발현과 연관된 암은 교모세포종이다.
한 측면에서, EGFRvIII과 연관된 암은 다형성 교모세포종 (GBM), 역형성 성상세포종, 거대 세포 교모세포종, 신경교육종, 역형성 핍지교종, 역형성 상의세포종, 맥락총 암종, 역형성 신경절교종, 송과체모세포종, 수질상피종, 상의모세포종, 수모세포종, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 및 비정형 기형양/횡문근양 종양, 비소세포 폐 암종, 폐 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 난소 암종, 결장직장 암종 및 방광 암종, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 T 세포가 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 이를 유전자 변형시키고, 이러한 CAR T 세포를, 세포성 요법을 필요로 하는 수용자에게 주입하는, 특정 유형의 세포성 요법을 포함한다. 주입된 세포는 상기 수용자 내의 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, CAR-변형된 T 세포는 생체내에서 복제하여, 지속된 종양 제어를 유발시킬 수 있는 장기간 영속성을 초래할 수 있다. 각종 측면에서, 환자 또는 그의 자손에게 투여된 T 세포는, T 세포를 환자에게 투여한지 적어도 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년, 또는 5년 후 동안 상기 환자에게 영속된다.
한 측면에서, 본원에 기재된 CAR-변형된 T 세포는 포유동물에서 생체외 면역 및/또는 생체내 요법을 위한 특정 유형의 백신일 수 있다. 한 측면에서, 포유동물은 인간이다.
생체외 면역과 관련하여, 상기 세포를 포유동물에게 투여하기 이전에 다음 중 한 가지 이상이 시험관내에서 발생한다: i) 세포가 확장하거나, ii) CAR을 코딩하는 핵산을 세포 내로 도입하거나 또는 iii) 세포를 냉동 보존한다.
생체외 과정은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음에 보다 상세히 논의된다. 간략하게 언급하면, 세포를 포유동물 (예를 들어, 인간)로부터 단리하고, 본원에 개시된 CAR을 발현하는 벡터로 유전자 변형시킨다 (예를 들어, 시험관내에서 형질도입시키거나 형질감염시킨다). 이러한 CAR-변형된 세포를 포유동물 수용자에게 투여하여 치료적 이득을 제공할 수 있다. 포유동물 수용자는 인간일 수 있고, CAR-변형된 세포는 상기 수용자와 관련하여 자가일 수 있다. 또 다른 한편으론, 세포가 수용자와 관련하여 동종, 동계 또는 이종일 수 있다.
조혈 줄기 및 전구 세포의 생체외 확장 과정은 미국 특허 번호 5,199,942 (이는 본원에 참조로 포함된다)에 기재되어 있고, 본 발명의 세포에 적용할 수 있다. 기타 적합한 방법이 당해 분야에 공지되어 있으므로, 본 발명은 세포를 생체외 확장하기 위한 어떠한 특별한 방법으로도 제한되지 않는다. 간략하게 언급하면, T 세포의 생체외 배양 및 확장은 (1) 말초혈 채취물 또는 골수 외식편으로부터, 특정 포유동물로부터의 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포를 수집하는 단계; 및 (2) 이러한 세포를 생체외에서 확장시키는 단계를 포함한다. 미국 특허 번호 5,199,942에 기재된 세포성 성장 인자 이외에도, 기타 인자, 예컨대 flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-kit 리간드를 세포의 배양 및 확장에 사용할 수 있다.
생체외 면역 관점에서 세포-기반 백신을 이용하는 것 이외에도, 본 발명은 또한, 환자에서 항원에 대항하여 유도된 면역 반응을 유발시키기 위한 생체내 면역을 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이 활성화되고 확장된 세포를, 면역기능 저하된 개체에서 발생하는 질환의 치료 및 예방에 활용할 수 있다. 특히, 본 발명의 CAR-변형된 T 세포는 EGFRvIII의 발현과 연관된 질환, 장애 및 병태의 치료에 사용된다. 특정 측면에서, 본 발명의 세포는 EGFRvIII의 발현과 연관된 질환, 장애 및 병태를 발생시킬 위험이 있는 환자의 치료에 사용된다. 따라서, 본 발명은 EGFRvIII의 발현과 연관된 질환, 장애 및 병태를 치료하거나 예방시킬 필요가 있는 대상체에게, 치료상 유효량의 본 발명의 CAR-변형된 T 세포를 투여하는 것을 포함하는, 상기 EGFRvIII의 발현과 연관된 질환, 장애 및 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 CAR-변형된 T 세포은 단독으로 투여하거나, 또는 희석제 및/또는 기타 성분, 예컨대 IL-2 또는 기타 시토카인 또는 세포 집단 또는 기타 약물 치료, 예를 들어 본원에 기재된 약물 치료와 조합하여 제약 조성물로서 투여할 수 있다.
본 발명은 또한, EGFRvIII-발현성 세포를 포함하는 세포 집단을, EGFRvIII-발현성 세포와 결합하는 본원에 기재된 EGFRvIII CART 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 증식을 억제하거나 또는 EGFRvIII-발현성 세포 집단을 감소시키는 방법을 제공한다. 구체적 측면에서, 본 발명은 EGFRvIII-발현성 암 세포 집단을, EGFRvIII-발현성 세포와 결합하는 본원에 기재된 EGFRvIII CART 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 증식을 억제하거나 또는 EGFRvIII을 발현하는 암 세포 집단을 감소시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 EGFRvIII-발현성 암 세포 집단을, EGFRvIII-발현성 세포와 결합하는 본원에 기재된 EGFRvIII CART 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 증식을 억제하거나 또는 EGFRvIII을 발현하는 암 세포 집단을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 본 발명의 EGFRvIII CART 세포는 음성 대조군과 비교해서 EGFRvIII-발현성 세포와 연관된 신경교종 또는 또 다른 암에 대한 동물 모델 또는 이를 보유한 대상체에서 세포 및/또는 암 세포의 양, 수, 양 또는 비율(%)을 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 65% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 감소시킨다. 한 측면에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 또한, EGFRvIII-발현성 세포와 연관된 질환을 예방, 치료 및/또는 관리할 필요가 있는 대상체에게, EGFRvIII-발현성 세포와 결합하는 본원에 기재된 EGFRvIII CART 세포를 투여하는 것을 포함하는, 상기 EGFRvIII-발현성 세포와 연관된 질환 (예를 들어, 교모세포종)을 예방, 치료 및/또는 관리하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 EGFRvIII-발현성 세포와 연관된 암의 재발을 방지할 필요가 있는 대상체에게, EGFRvIII-발현성 세포와 결합하는 본원에 기재된 EGFRvIII CART 세포를 투여하는 것을 포함하는, 상기 EGFRvIII-발현성 세포와 연관된 암의 재발을 방지하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 상기 방법은 EGFRvIII-발현성 세포와 연관된 암의 재발을 방지할 필요가 있는 대상체에게, EGFRvIII-발현성 세포와 결합하는 본원에 기재된 EGFRvIII CART 세포의 유효량을, 또 다른 요법의 유효량과 조합하여 투여하는 것을 포함한다.
조합 요법
본원에 기재된 CAR-발현성 세포는 기타 공지된 작용제 및 요법과 조합하여 사용할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "조합하여" 투여하는 것은 장애로 인해 대상체가 고통받고 있는 동안 이러한 대상체에게 2가지 (또는 그 초과의) 상이한 치료를 전달하는 것을 의미하는데, 예를 들어 이러한 2가지 이상의 치료는 대상체가 장애로 진단받은 후 및 장애를 치료하거나 없애기 전 또는 기타 이유로 인해 치료를 중단하기 전에 전달된다. 일부 실시양태에서, 한 가지 치료의 전달은 두 번째 치료의 전달이 시작될 때에도 여전히 이루어지므로, 투여 측면에서 중복이 있다. 이는 종종 본원에서 "동시" 또는 "동시 전달"로서 지칭된다. 다른 실시양태에서, 한 가지 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시작되기 전에 종결된다. 어느 한 경우의 일부 실시양태에서, 치료는 조합 투여로 인해 보다 유효하다. 예를 들어, 두 번째 치료가 더 유효한데, 예를 들어 적은 양의 두 번째 치료를 이용해서 등가의 효과가 관찰되거나, 또는 두 번째 치료가 첫 번째 치료의 부재 하에서 투여된 경우에 관찰되는 것 보다 더 큰 정도로, 두 번째 치료가 증상을 저하시키거나, 또는 첫 번째 치료를 이용한 경우와 유사한 상황이 관찰된다. 일부 실시양태에서, 특정 증상, 또는 장애와 관련된 기타 파라미터 상의 저하가, 다른 치료의 부재 하에서 전달된 한 가지 치료를 이용한 경우에 관찰되는 것 보다 더 크도록 전달된다. 두 치료의 효과는 부분적으로 부가적이거나, 완전히 부가적이거나, 또는 부가적인 것 보다 더 클 수 있다. 전달된 첫 번째 치료의 효과가 두 번째 치료를 전달할 때에도 여전히 검출 가능하도록 전달이 이루어질 수 있다.
본원에 기재된 CAR-발현성 세포와 한 가지 이상의 부가 치료제를 동일한 조성물 또는 별개의 조성물 중에서 동시에 투여하거나 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 순차적으로 투여하는 경우, 본원에 기재된 CAR-발현성 세포를 먼저 투여하고, 부가의 작용제를 두 번째로 투여할 수 있거나, 또는 투여 순서를 바꿀 수 있다.
추가 측면에서, 본원에 기재된 CAR-발현성 세포는 수술, 화학요법, 방사선 요법, 면역억제제, 예컨대 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 및 FK506; 항체 또는 기타 면역제거제, 예컨대 CAMPATH, 항-CD3 항체 또는 기타 항체 요법, 시톡신, 플루다라빈, 시클로스포린, FK506, 라파마이신(rapamycin), 미코페놀산, 스테로이드, FR901228, 시토카인 및 방사선 요법과 조합하여 치료 요법에 사용할 수 있다. 악성 신경교종에 대한 예시되는 면역요법 접근 방식은 문헌 [Johnson et al. 2010 Curr Neurol Neurosci Rep 10:259-266]에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현성 세포는 세포외 매트릭스 단백질을 표적으로 하는 작용제, 예컨대 텐신(tenscin), 예를 들어 항-테나신 항체, 예를 들어 211At-표지된 항-테나신 항체와 조합하여 치료 요법에 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현성 세포는 면역조정제, 예컨대 인터페론 알파, 인터페론 베타, TGF-β2 펩티드 억제제, 또는 폴리-ICLC와 조합하여 치료 요법에 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현성 세포는 WT1 전사 인자 펩티드 백신, 예컨대 문헌 [Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971]에 기재된 백신과 조합하여 치료 요법에 사용할 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현성 세포는 화학요법제와 조합하여 사용할 수 있다. 예시되는 화학요법제는 알킬화제, 백금-기반 작용제, 혈관형성 억제제 (예를 들어, VEGF 경로 억제제), 티로신 키나제 억제제 (예를 들어, EGF 경로 억제제), mTOR 억제제를 포함한다.
조합 요법에 사용하기 위해 고려된 일반적인 화학요법제는 아나스트로졸 [아리미덱스(Arimidex)®], 비칼루타미드 [카소덱스(Casodex)®], 블레오마이신 술페이트 [블레녹산(Blenoxane)®], 부술판 [밀레란(Myleran)®], 부술판 주사제 [부술펙스(Busulfex)®], 카페시타빈 [젤로다(Xeloda)®], N4-펜톡시카르보닐-5-데옥시-5-플루오로시티딘, 카르보플라틴 [파라플라틴(Paraplatin)®], 카르무스틴 (BiCNU)®, 클로람부실 [류케란(Leukeran)®], 시스플라틴 [플라티놀(Platinol)®], 클라드리빈 [류스타틴(Leustatin)®], 시클로포스파미드 [시톡산(Cytoxan)® 또는 네오사르(Neosar)®], 시타라빈, 시토신 아라비노시드 [시토사르-U(Cytosar-U)®], 시타라빈 리포솜 주사제 [데포시트(DepoCyt)®], 다카르바진 [DTIC-돔(DTIC-Dome)®], 닥티노마이신 [액티노마이신 D; 코스메간(Cosmegan)], 다우노루비신 히드로클로라이드 [세루비딘(Cerubidine)®], 다우노루비신 시트레이트 리포솜 주사제 [다우노좀(DaunoXome)®], 엑사메타손, 도세탁셀 [탁소테레(Taxotere)®], 독소루비신 히드로클로라이드 [아드리아마이신(Adriamycin)®, 루벡스(Rubex)®], 에토포시드 [베페시드(Vepesid)®], 플루다라빈 포스페이트 [플루다라(Fludara)®], 5-플루오로우라실 [아드루실(Adrucil)®, 에푸덱스(Efudex)®], 플루타미드 [에울렉신(Eulexin)®], 테자시티빈, 젬시타빈 (디플루오로데옥시시티딘), 히드록시우레아 [히드레아(Hydrea)®], 아다루비신 [이다마이신(Idamycin)®], 이포스파미드 (IFEX)®, 이리노테칸 [캄프토사르(Camptosar)®], L-아스파라기나제 (ELSPAR)®, 류코보린 칼슘, 멜팔란 [알케란(Alkeran)®], 6-머캅토푸린 [푸리네톨(Purinethol)®], 메토트렉세이트 [폴렉스(Folex)®], 미톡산트론 [노반트론(Novantrone)®], 밀로타르그, 파클리탁셀 [탁솔(Taxol)®], 푀닉스 (이트륨90/MX-DTPA), 펜토스타틴, 카르무스틴 이식체를 수반한 폴리페프로산 20 [글리아델(Gliadel)®], 타목시펜 시트레이트 [놀바덱스(Nolvadex)®], 테니포시드 [부몬(Vumon)®], 6-티오구아닌, 티오테파, 티라파자민 [티라존(Tirazone)®], 주사용 토포테칸 히드로클로라이드 [히캄프틴(Hycamptin)®], 빈블라스틴 [벨반(Velban)®], 빈크리스틴 [온코빈(Oncovin)®], 및 비노렐빈 [나벨빈(Navelbine)®]을 포함한다.
예시되는 알킬화제는 질소 머스터드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 니트로소우레아 및 트리아젠; 우라실 머스터드 [아미노우라실 머스터드((Aminouracil Mustard)®, 클로르에타민아실(Chlorethaminacil)®, 데메틸도판( Demethyldopan)®, 데스메틸도판(Desmethyldopan)®, 하에만타민(Haemanthamine)®, 노르도판(Nordopan)®, 우라실 질소 머스터드(Uracil nitrogen mustard)®, 우라실로스트(Uracillost)®, 우라실모스타자(Uracilmostaza)®, 우라무스틴(Uramustin)®, 우라무스틴®], 클로르메틴 [무스타르겐(Mustargen)®], 시클로포스파미드 [시톡산®, 네오사르®, 클라펜(Clafen)®, 엔독산(Endoxan)®, 프로시톡스(Procytox)®, 레빔무네(Revimmune)™], 이포스파미드 [미톡사나(Mitoxana)®], 멜팔란 (알케란)®, 클로람부실 (류케란)®, 피포브로만 [아메델(Amedel)®, 베르시트(Vercyte)®], 트리에틸렌멜라민 [헤멜(Hemel)®, 헥살렌(Hexalen)®, 헥사스타트(Hexastat)®], 트리에틸렌티오포스포르아민, 테모졸로미드 [테모다르(Temodar)®], 티오테파 [티오플렉스(Thioplex)®], 부술판 [부실벡스(Busilvex)®, 밀레란®], 카르무스틴 (BiCNU)®, 로무스틴 (CeeNU)®, 스트렙토조신 [자노사르(Zanosar)®], 및 다카르바진 (DTIC-돔)®를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 부가의 예시되는 알킬화제는 옥살리플라틴 [엘록사틴(Eloxatin)®]; 테모졸로미드 [테모다르(Temodar)® 및 테모달(Temodal)®]; 닥티노마이신 [액티노마이신-D로서 공지되기도 함, 코스메겐(Cosmegen)®]; 멜팔란 [L-PAM, L-사르코리신 및 페닐알라닌 머스터드로서 공지되기도 함, 알케란®]; 알트레타민 [헥사메틸멜라민 (HMM)으로서 공지되기도 함, 헥살렌(Hexalen)®]; 카르무스틴 (BiCNU)®; 벤다무스틴 [트레안다(Treanda)®]; 부술판 (부술펙스® 및 밀레란)®; 카르보플라틴 (파라플라틴)®; 로무스틴 [CCNU로서 공지되기도 함, CeeNU®]; 시스플라틴 (CDDP로서 공지되기도 함, 플라티놀® 및 플라티놀®-AQ); 클로람부실 (류케란)®; 시클로포스파미드 (시톡산® 및 네오사르)®; 다카르바진 (DTIC, DIC 및 이미다졸 카르복사미드로서 공지되기도 함, DTIC-돔)®; 알트레타민 [헥사메틸멜라민 (HMM)으로서 공지되기도 함, 헥살렌®]; 이포스파미드 [이펙스(Ifex)®]; 프레드누무스틴; 프로카르바진 [마툴란(Matulane)®]; 메클로르에타민 (질소 머스터드, 무스틴 및 메클로로에타민 히드로클로라이드로서 공지되기도 함, 무스타르겐)®; 스트렙토조신 [자노사르(Zanosar)®]; 티오테파 [티오포스포아미드, TESPA 및 TSPA로서 공지되기도 함, 티오플렉스®]; 시클로포스파미드 [엔독산®, 시톡산®, 네오사르®, 프로시톡스®, 레빔무네®]; 및 벤다무스틴 HCl (트레안다)®를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예시되는 백금 기반 작용제는 카르보플라틴, 시스플라틴 및 옥살리플라틴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예시되는 혈관형성 억제제는 A6 [앙스트롬 파마슈티칼즈(Angstrom Pharmacueticals)], ABT-510 [애보트 라보라토리즈(Abbott Laboratories)], ABT-627 [아트라센탄(Atrasentan)] [애보트 라보라토리즈/신레이(Xinlay)], ABT-869 (애보트 라보라토리즈), 액티미드(Actimid) [CC4047, 포말리도미드(Pomalidomide] [셀젠 코포레이션(Celgene Corporation)], AdGVPEDF.11D [젠벡(GenVec)], ADH-1 [엑스헤린(Exherin)] [아드헤렉스 테크놀로지(Adherex Technologies)], AEE788 [노바르티스(Novartis)], AG-013736 [액시티닙(Axitinib)] [화이자(Pfizer)], AG3340 [프리노마스타트(Prinomastat)] [아고우론 파마슈티칼즈(Agouron Pharmaceuticals)], AGX1053 [안지오제넥스(AngioGenex)], AGX51 (안지오제넥스), ALN-VSP (ALN-VSP O2) [알니람 파마슈티칼즈(Alnylam Pharmaceuticals)], AMG 386 [암젠(Amgen)], AMG706 (암젠), 아파티닙(Apatinib) (YN968D1) [지앙수 헹루이 메디슨(Jiangsu Hengrui Medicine)], AP23573 [리다포롤리무스(Ridaforolimus)/MK8669] [아리아드 파마슈티칼즈(Ariad Pharmaceuticals)], AQ4N [노바베아(Novavea)], ARQ 197 [아르쿨레(ArQule)], ASA404 [노바르티스/안티소마(Antisoma)], 아티프리모드(Atiprimod) [칼리스토 파마슈티칼즈(Callisto Pharmaceuticals)], ATN-161 [아테누온(Attenuon)], AV-412 [아베오 파마슈티칼즈(Aveo Pharmaceuticals)], AV-951 (아베오 파마슈티칼즈), 아바스틴(Avastin) [베바시주맙(Bevacizumab)] [제넨텍(Genentech)], AZD2171 [세디라닙(Cediranib)/레센틴(Recentin)] [아스트라제네카(AstraZeneca)], BAY 57-9352 [텔라티닙(Telatinib)] [바이엘(Bayer)], BEZ235 (노바르티스), BIBF1120 [베링거 인겔하임 파마슈티칼즈(Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals)], BIBW 2992 (베링거 인겔하임 파마슈티칼즈), BMS-275291 [브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb)], BMS-582664 [브리바닙(Brivanib)] (브리스톨-마이어스 스큅), BMS-690514 (브리스톨-마이어스 스큅), 칼시트리올(Calcitriol), CCI-779 [토리셀(Torisel)] [와이어스(Wyeth)], CDP-791 [임클론 시스템즈(ImClone Systems)], 세플라토닌(Ceflatonin) [호모하링토닌(Homoharringtonine)/HHT] [켐제넥스 더라퓨틱스(ChemGenex Therapeutics)], 셀레브렉스(Celebrex) [셀레콕십(Celecoxib)] (화이자), CEP-7055 [세팔론(Cephalon)/사노피(Sanofi)], CHIR-265 [키론 코포레이션(Chiron Corporation)], NGR-TNF, COL-3 [메타스타트(Metastat)] [콜라게넥스 파마슈티칼즈(Collagenex Pharaceuticals)], 콤브레타스타틴(Combretastatin) [옥시겐(Oxigene)], CP-751,871 [피기투무맙(Figitumumab)] (화이자), CP-547,632 (화이자), CS-7017 [다이이치 산교 파마(Daiichi Sankyo Pharma)], CT-322 [안지오셉트(Angiocept)] [아드넥서스(Adnexus)], 쿠르쿠민(Curcumin), 달테파린(Dalteparin) [프라그민(Fragmin)] (화이자), 디술피람(Disulfiram) [안타부세(Antabuse)], E7820 [에이사이 리미티드(Eisai Limited)], E7080 (에이사이 리미티드), EMD 121974 [실렌기티드(Cilengitide)] (EMD 파마슈티칼즈), ENMD-1198 [엔트레메드(EntreMed)], ENMD-2076 (엔트레메드), 엔도스타르(Endostar) [심세레(Simcere)], 에르비툭스(Erbitux) [임클론(ImClone)/브리스톨-마이어스 스큅], EZN-2208 [엔존 파마슈티칼즈(Enzon Pharmaceuticals)], EZN-2968 (엔존 파마슈티칼즈), GC1008 [젠자임(Genzyme)], 제니스테인(Genistein), GSK1363089 [포레티닙(Foretinib)] [글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)], GW786034 [파조파닙(Pazopanib)] (글락소스미스클라인), GT-111 [바스쿨라 바이오제닉스 리미티드(Vascular Biogenics Ltd.)], IMC--1121B [라무시루맙(Ramucirumab)] (임클론 시스템즈), IMC-18F1 (임클론 시스템즈), IMC-3G3 (임클론 LLC), INCB007839 [인사이트 코포레이션(Incyte Corporation)], INGN 241 [인트로젠 더라퓨틱스(Introgen Therapeutics)], 이레사(Iressa) [ZD1839/제피티닙(Gefitinib)], LBH589 [파리닥((Faridak)/파노비노스트스트(Panobinostst)] (노바르티스), 루센티스(Lucentis) [라니비주맙(Ranibizumab)] (제넨텍/노바르티스), LY317615 [엔자스타우린(Enzastaurin)] [일라이 릴리 앤드 캄파니(Eli Lilly and Company)], 매쿠젠(Macugen) [페갑타닙(Pegaptanib)] (화이자), MEDI522 [아베그린(Abegrin)] [메드임뮨(MedImmune)], MLN518 [탄두티닙(Tandutinib)] [밀레늄(Millennium)], 네오바스타트(Neovastat) [AE941/베네핀(Benefin)] [아에테르나 젠타리스(Aeterna Zentaris)], 넥사바르(Nexavar) [바이엘/오닉스(Onyx)], NM-3 (젠자임 코포레이션), 노스카핀(Noscapine) [코우가르 바이오테크놀로지(Cougar Biotechnology)], NPI-2358 [네레우스 파마슈티칼즈(Nereus Pharmaceuticals)], OSI-930 (OSI), 팔로미드(Palomid) 529 [팔로마 파마슈티칼즈, 인크.(Paloma Pharmaceuticals, Inc.)], 판젬 캡슐(Panzem Capsules) (2ME2) (엔트레메드), 판젬 NCD (2ME2) (엔트레메드), PF-02341066 (화이자), PF-04554878 (화이자), PI-88 [프로젠 인더스트리즈(Progen Industries)/메디젠 바이오테크놀로지(Medigen Biotechnology)], PKC412 (노바르티스), 폴리페논 E (녹차 추출물) [폴리페노 E 인터내셔날, 인크(Polypheno E International, Inc)], PPI-2458 [프라에시스 파마슈티칼즈(Praecis Pharmaceuticals)], PTC299 [PTC 더라퓨틱스(PTC Therapeutics)], PTK787 [바탈라닙(Vatalanib)] (노바르티스), PXD101 [벨리노스타트(Belinostat)] [쿠라젠 코포레이션(CuraGen Corporation)], RAD001 [에베롤리무스(Everolimus)] (노바르티스), RAF265 (노바르티스), 레고라페닙(Regorafenib) (BAY73-4506) (바이엘), 레블리미드(Revlimid) [셀젠(Celgene)], 레타아네(Retaane) [알콘 리서치(Alcon Research)], SN38 [리포소말(Liposomal)] [네오팜(Neopharm)], SNS-032 (BMS-387032) [수네시스(Sunesis)], SOM230 [파시레오티드(Pasireotide)] (노바르티스), 스쿠알라민(Squalamine) [제나에라(Genaera)], 수라민(Suramin), 수텐트(Sutent) (화이자), 타르세바(Tarceva) (제넨텍), TB-403 [트롬보제닉스(Thrombogenics)], 템포스타틴(Tempostatin) [콜라드 바이오파마슈티칼즈(Collard BioPharmaceuticals)], 테트라티오몰리브데이트(Tetrathiomolybdate) [시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)], TG100801 타르게젠(TargeGen), 탈리도미드(Thalidomide) (셀젠 코포레이션), 틴자파린 소듐(Tinzaparin Sodium), TKI258 (노바르티스), TRC093 [트라콘 파마슈티칼즈 인크.(Tracon Pharmaceuticals Inc.)], VEGF 트랩(Trap) [아플리베르셉트(Aflibercept)] [레제네론 파마슈티칼즈(Regeneron Pharmaceuticals)], VEGF 트랩-아이(Trap-Eye) (레제네론 파마슈티칼즈), 베글린(Veglin) [바스젠 더라퓨틱스(VasGene Therapeutics)], 보르테조밉(Bortezomib) (밀레늄), XL184 [엑셀릭시스(Exelixis)], XL647 (엑셀릭시스), XL784 (엑셀릭시스), XL820 (엑셀릭시스), XL999 (엑셀릭시스), ZD6474 (아스트라제네카), 보리노스타트(Vorinostat) [머크(Merck)], 및 ZSTK474를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예시되는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 수용체 억제제는 베바시주맙(Bevacizumab) [아바스틴(Avastin)®], 악시티닙(axitinib) [인리타(Inlyta)®]; 브리바닙 알라니네이트(Brivanib alaninate) [BMS-582664, (S)-((R)-1-(4-(4-플루오로-2-메틸-1H-인돌-5-일옥시)-5-메틸피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-6-일옥시)프로판-2-일)-2-아미노프로파노에이트]; 소라페닙(Sorafenib) [넥사바르(Nexavar)®]; 파조파닙(Pazopanib) [보트리엔트(Votrient)®]; 수니티닙 말레이트(Sunitinib malate) [수텐트(Sutent)®]; 세디라닙(Cediranib) (AZD2171, CAS 288383-20-1); 바르가테프(Vargatef) (BIBF1120, CAS 928326-83-4); 포레티닙(Foretinib) (GSK1363089); 텔라티닙(Telatinib) (BAY57-9352, CAS 332012-40-5); 아파티닙(Apatinib) (YN968D1, CAS 811803-05-1); 이마티닙(Imatinib) [글리벡(Gleevec)®]; 포나티닙(Ponatinib) (AP24534, CAS 943319-70-8); 티보자닙(Tivozanib) (AV951, CAS 475108-18-0); 레고라페닙(Regorafenib) (BAY73-4506, CAS 755037-03-7); 바탈라닙(Vatalanib) 디히드로클로라이드 (PTK787, CAS 212141-51-0); 브리바닙(Brivanib) (BMS-540215, CAS 649735-46-6); 반데타닙(Vandetanib) [카프렐사(Caprelsa)® 또는 AZD6474]; 모테사닙(Motesanib) 디포스페이트 [AMG706, CAS 857876-30-3, N-(2,3-디히드로-3,3-디메틸-1H-인돌-6-일)-2-[(4-피리디닐메틸)아미노]-3-피리딘카르복사미드 (PCT 공개 번호 WO 02/066470에 기재됨)]; 도비티닙(Dovitinib) 디락트산 (TKI258, CAS 852433-84-2); 린파닙(Linfanib) (ABT869, CAS 796967-16-3); 카보잔티닙(Cabozantinib) (XL184, CAS 849217-68-1); 레스타우르티닙(Lestaurtinib) (CAS 111358-88-4); N-[5-[[[5-(1,1-디메틸에틸)-2-옥사졸릴]메틸]티오]-2-티아졸릴]-4-피페리딘카르복사미드 (BMS38703, CAS 345627-80-7); (3R,4R)-4-아미노-1-((4-((3-메톡시페닐)아미노)피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-5-일)메틸)피페리딘-3-올 (BMS690514); N-(3,4-디클로로-2-플루오로페닐)-6-메톡시-7-[[(3aα,5β,6aα)-옥타히드로-2-메틸시클로펜타[c]피롤-5-일]메톡시]-4-퀴나졸린아민 (XL647, CAS 781613-23-8); 4-메틸-3-[[1-메틸-6-(3-피리디닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-일]아미노]-N-[3-(트리플루오로메틸)페닐]-벤즈아미드 (BHG712, CAS 940310-85-0); 및 아플리베르셉트(Aflibercept) [에일레아(Eylea)®]를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예시되는 EGF 경로 억제제는 티르포스틴(tyrphostin) 46, EKB-569, 에를로티닙(erlotinib) [타르세바(Tarceva)®], 제피티닙(gefitinib) [이레사(Iressa)®], 에르비툭스(erbitux), 니모투주맙(nimotuzumab), 라파티닙(lapatinib) [티케르브(Tykerb)®], 세툭시맙(cetuximab) (항-EGFR mAb), 188Re-표지된 니모투주맙(nimotuzumab) (항-EGFR mAb), 및 WO 97/02266, EP 0 564 409, WO 99/03854, EP 0 520 722, EP 0 566 226, EP 0 787 722, EP 0 837 063, US 5,747,498, WO 98/10767, WO 97/30034, WO 97/49688, WO 97/38983 및 WO 96/33980에 일반적이고도 구체적으로 개시되어 있는 화합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시되는 EGFR 항체는 세툭시맙(Cetuximab) [에르비툭스(Erbitux)®]; 파니투무맙(Panitumumab) [벡티빅스(Vectibix)®]; 마투주맙(Matuzumab) (EMD-72000); 트라스투주맙(Trastuzumab) [헤르셉틴(Herceptin)®]; 니모투주맙(Nimotuzumab) (hR3); 잘루투무맙(Zalutumumab); 테라(Thera)CIM h-R3; MDX0447 (CAS 339151-96-1); 및 ch806 (mAb-806, CAS 946414-09-1)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시되는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 억제제는 에를로티닙 히드로클로라이드 (타르세바)®, 제피트닙(Gefitnib) (이레사)®; N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[[(3''S'')-테트라히드로-3-푸라닐]옥시]-6-퀴나졸리닐]-4-(디메틸아미노)-2-부텐아미드, [토복(Tovok)®]; 반데타닙(Vandetanib) [카프렐사(Caprelsa)®]; 라파티닙(Lapatinib) [티케르브(Tykerb)®]; (3R,4R)-4-아미노-1-((4-((3-메톡시페닐)아미노)피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-5-일)메틸)피페리딘-3-올 (BMS690514); 카네르티닙(Canertinib) 디히드로클로라이드 (CI-1033); 6-[4-[(4-에틸-1-피페라지닐)메틸]페닐]-N-[(1R)-1-페닐에틸]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 (AEE788, CAS 497839-62-0); 무브리티닙(Mubritinib) (TAK165); 펠리티닙(Pelitinib) (EKB569); 아파티닙(Afatinib) (BIBW2992); 네라티닙(Neratinib) (HKI-272); N-[4-[[1-[(3-플루오로페닐)메틸]-1H-인다졸-5-일]아미노]-5-메틸피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-6-일]-카르밤산, (3S)-3-모르폴리닐메틸 에스테르 (BMS599626); N-(3,4-디클로로-2-플루오로페닐)-6-메톡시-7-[[(3aα,5β,6aα)-옥타히드로-2-메틸시클로펜타[c]피롤-5-일]메톡시]-4-퀴나졸린아민 (XL647, CAS 781613-23-8); 및 4-[4-[[(1R)-1-페닐에틸]아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀 (PKI166, CAS 187724-61-4)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예시되는 mTor 억제제는 라파마이신 [라파무네(Rapamune)®], 및 그의 유사체 및 유도체; SDZ-RAD; 템시롤리무스(Temsirolimus) [토리셀(Torisel)®; CCI-779로서 공지되기도 함]; 리다포롤리무스(Ridaforolimus) [이전에 데페롤리무스 (deferolimus)로서 공지됨, (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-디히드록시-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-2,3,10,14,20-펜타옥소-11,36-디옥사-4-아자트리시클로[30.3.1.04,9] 헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-12-일]프로필]-2-메톡시시클로헥실 디메틸포스피네이트; 또한 AP23573 및 MK8669로서 공지되고, PCT 공개 번호 WO 03/064383에 기재됨]; 에베롤리무스(Everolimus) [아피니토르(Afinitor)® 또는 RAD001]; 라파마이신 [AY22989, 시롤리무스(Sirolimus)®]; 시마피모드(Simapimod) (CAS 164301-51-3); (5-{2,4-비스[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일}-2-메톡시페닐)메탄올 (AZD8055); 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-히드록시에톡시)시클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온 (PF04691502, CAS 1013101-36-4); 및 N2-[1,4-디옥소-4-[[4-(4-옥소-8-페닐-4H-1-벤조피란-2-일)모르폴리늄-4-일]메톡시]부틸]-L-아르기닐글리실-L-α-아스파르틸-L-세린-, 내부 염 (SF1126, CAS 936487-67-1)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예시되는 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K) 억제제는 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-6-[[4-(메틸술포닐)피페라진-1-일]메틸]티에노[3,2-d]피리미딘-4-일]모르폴린 (GDC 0941로서 공지되기도 하고 PCT 공개 번호 WO 09/036082 및 WO 09/055730에 기재됨); 2-메틸-2-[4-[3-메틸-2-옥소-8-(퀴놀린-3-일)-2,3-디히드로이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]페닐]프로피오니트릴 (BEZ 235 또는 NVP-BEZ 235로서 공지되기도 하고 PCT 공개 번호 WO 06/122806에 기재됨); 4-(트리플루오로메틸)-5-(2,6-디모르폴리노피리미딘-4-일)피리딘-2-아민 (BKM120 또는 NVP-BKM120으로서 공지되기도 하고 PCT 공개 번호 WO2007/084786에 기재됨); 토자세르팁(Tozasertib) (VX680 또는 MK-0457, CAS 639089-54-6); (5Z)-5-[[4-(4-피리디닐)-6-퀴놀리닐]메틸렌]-2,4-티아졸리딘디온 (GSK1059615, CAS 958852-01-2); (1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(아세틸옥시)-1-[(디-2-프로페닐아미노)메틸렌]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-옥타히드로-11-히드록시-4-(메톡시메틸)-4a,6a-디메틸-시클로펜타[5,6]나프토[1,2-c]피란-2,7,10(1H)-트리온 (PX866, CAS 502632-66-8); 및 8-페닐-2-(모르폴린-4-일)-크로멘-4-온 (LY294002, CAS 154447-36-6)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시되는 단백질 키나제 B (PKB) 또는 AKT 억제제는 8-[4-(1-아미노시클로부틸)페닐]-9-페닐-1,2,4-트리아졸로[3,4-f][1,6]나프티리딘-3(2H)-온 (MK-2206, CAS 1032349-93-1); 페리포신(Perifosine) (KRX0401); 4-도데실-N-1,3,4-티아디아졸-2-일-벤젠술폰아미드 (PHT-427, CAS 1191951-57-1); 4-[2-(4-아미노-1,2,5-옥사디아졸-3-일)-1-에틸-7-[(3S)-3-피페리디닐메톡시]-1H-이미다조[4,5-c]피리딘-4-일]-2-메틸-3-부틴-2-올 (GSK690693, CAS 937174-76-0); 8-(1-히드록시에틸)-2-메톡시-3-[(4-메톡시페닐)메톡시]-6H-디벤조[b,d]피란-6-온 [팔로미드(palomid) 529, P529, 또는 SG-00529]; 트리시르빈(Tricirbine) (6-아미노-4-메틸-8-(β-D-리보푸라노실)-4H,8H-피롤로[4,3,2-de]피리미도[4,5-c]피리다진); (αS)-α-[[[5-(3-메틸-1H-인다졸-5-일)-3-피리디닐]옥시]메틸]-벤젠에탄아민 (A674563, CAS 552325-73-2); 4-[(4-클로로페닐)메틸]-1-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딘아민 (CCT128930, CAS 885499-61-6); 4-(4-클로로페닐)-4-[4-(1H-피라졸-4-일)페닐]-피페리딘 (AT7867, CAS 857531-00-1); 및 아르켁신(Archexin) (RX-0201, CAS 663232-27-7)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
칼슘 의존성 포스파타제 칼시네우린을 억제하는 약물 (시클로스포린 및 FK506) 또는 성장 인자 유도된 신호전달에 중요한 p70S6 키나제를 억제하는 약물 (라파마이신) (문헌 [Liu et al., Cell 66:807-815, 1991]; [Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991]; [Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993])을 사용할 수도 있다. 추가 측면에서, 본 발명의 세포 조성물은 골수 이식, 화학요법제 (예컨대, 플루다라빈)을 이용하는 T 세포 제거 요법, 외부-빔 방사선 요법 (XRT), 시클로포스파미드, 및/또는 항체, 예컨대 OKT3 또는 CAMPATH와 연계해서 (예를 들어, 전에, 동시에 또는 후에) 환자에게 투여할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 세포 조성물은 B-세포 제거 요법, 예컨대 CD20과 반응하는 작용제, 예를 들어 리툭산 투여 후에 투여한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 대상체에게 고 용량의 화학요법을 이용한 표준 치료에 이어 말초혈 줄기 세포 이식을 받게 할 수 있다. 특정의 실시양태에서, 이식 후, 대상체에게 본 발명의 확장된 면역 세포를 주입한다. 부가의 실시양태에서, 확장된 세포는 수술 전 또는 후에 투여한다.
한 실시양태에서, 대상체에게 CAR-발현성 세포의 투여와 연관된 부작용을 저하 또는 완화시켜 주는 작용제를 투여할 수 있다. CAR-발현성 세포의 투여와 연관된 부작용은 CRS, 및 혈구탐식성 림프조직구증식증 (HLH) [또한, 대식세포 활성화 증후군 (MAS)으로 명명됨]을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. CRS의 증상은 고열, 오심, 일시적 저혈압, 저산소증 등을 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 CAR-발현성 세포를 대상체에게 투여하고, CAR-발현성 세포를 이용한 치료로부터 비롯되는 가용성 인자의 상승 수준을 관리하는 작용제를 추가로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체에서 상승된 가용성 인자는 IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-6 중 하나 이상이다. 따라서, 상기 부작용을 치료하기 위해 투여된 작용제는 이들 가용성 인자 중 하나 이상을 중화시키는 작용제일 수 있다. 이러한 작용제는 스테로이드, TNFα의 억제제, 및 IL-6의 억제제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. TNFα 억제제의 한 예는 엔타네르셉트(entanercept)이다. IL-6 억제제의 한 예는 토실리주맙(Tocilizumab) (toc)이다.
한 실시양태에서, 대상체에게 CAR-발현성 세포의 활성을 증강시키는 작용제를 투여할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 이러한 작용제는 억제성 분자를 억제하는 작용제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제성 분자, 예를 들어 프로그램된 사멸 1 (PD1)은 면역 이펙터 반응을 서서히 증가시킬 수 있는 CAR-발현성 세포의 능력을 저하시킬 수 있다. 억제성 분자의 예는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 및 TGFR 베타를 포함한다. 예를 들어, DNA, RNA 또는 단백질 수준을 억제함으로써 억제성 분자를 억제하는 것은 CAR-발현성 세포 성능을 최적화시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 억제성 핵산, 예를 들어 억제성 핵산, 예를 들어 dsRNA, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA를 사용하여, CAR-발현성 세포 중의 억제성 분자의 발현을 억제할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 억제제는 shRNA이다. 특정 실시양태에서, 억제성 분자는 CAR-발현성 세포 내에서 억제된다. 이들 실시양태에서, 억제성 분자의 발현을 억제하는 dsRNA 분자는 CAR의 특정 성분, 예를 들어 모든 성분을 코딩하는 핵산과 연결된다. 한 실시양태에서, 억제성 신호의 억제제는, 예를 들어 억제성 분자와 결합하는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 예를 들어, 상기 작용제는 PD1, PD-L1, PD-L2 또는 CTLA4와 결합하는 항체 또는 항체 단편 [예를 들어, 이필리무맙(ipilimumab) (MDX-010 및 MDX-101로서 지칭되기도 하고, 에르보이(Yervoy)®로서 시판됨; 브리스톨-마이어스 스큅; 트레멜리무맙(Tremelimumab) (화이자로부터 입수 가능한 IgG2 모노클로날 항체; 이전에는 티실리무맙(ticilimumab), CP-675,206으로서 공지됨)]일 수 있다.
PD1은 CD28, CTLA-4, ICOS, 및 BTLA를 또한 포함하는 CD28 계열의 수용체의 억제성 구성원이다. PD-1은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수성 세포 상에서 발현된다 (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). PD1에 대한 2개의 리간드, 즉 PD-L1과 PD-L2는 PD1과의 결합시 T 세포 활성화를 하향 조절하는 것으로 밝혀졌다 (Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1은 인간의 암에 풍부하다 (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). 면역 억제는 PD1과 PD-L1 간의 국소 상호 작용을 억제함으로써 역전시킬 수 있다. PD1, PD-L1 및 PD-L2의 항체, 항체 단편 및 기타 억제제는 당해 분야에서 입수 가능하고, 본원에 기재된 CD123 CAR과 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 니볼루맙(nivolumab) (BMS-936558 또는 MDX1106으로서 지칭되기도 함; 브리스톨-마이어스 스큅)은 PD-1을 특이적으로 차단하는 완전 인간 IgG4 모노클로날 항체이다. 니볼루맙 (클론 5C4) 및 PD-1과 특이적으로 결합하는 기타 인간 모노클로날 항체는 US 8,008,449 및 WO2006/121168에 개시되어 있다. 피딜리주맙(Pidilizumab) [CT-011; 큐어 텍(Cure Tech)]은 PD-1과 결합하는 인간화 IgG1k 모노클로날 항체이다. 피딜리주맙 및 기타 인간화 항-PD1 모노클로날 항체는 WO2009/101611에 개시되어 있다. 람브롤리주맙(Lambrolizumab) (MK03475로서 공지되기도 함; 머크)은 PD1과 결합하는 인간화 IgG4 모노클로날 항체이다. 람브롤리주맙 및 기타 인간화 항-PD1 항체는 US 8,354,509 및 WO2009/114335에 개시되어 있다. MDPL3280A (제넨텍/로슈)는 PD-L1과 결합하는 인간 Fc 최적화 IgG1 모노클로날 항체이다. MDPL3280A 및 PD-L1에 대한 기타 인간 모노클로날 항체는 미국 특허 번호 7,943,743 및 미국 공개 번호 20120039906에 개시되어 있다. 기타 항-PD-L1 결합성 작용제는 YW243.55.S70 (중쇄 및 경쇄 가변 영역은 WO2010/077634 내의 서열 20 및 21에 제시된다) 및 MDX-1 105 (BMS-936559로서 지칭되기도 함, 및 예를 들어, WO2007/005874에 개시된 항-PD-L1 결합성 작용제)를 포함한다. AMP-224 [B7-DCIg; 앰플리뮨(Amplimmune); 예를 들어, WO2010/027827 및 WO2011/066342에 개시됨]는 PD1과 B7-H1 간의 상호 작용을 차단시키는 PD-L2 Fc 융합 가용성 수용체이다. 기타 항-PD1 항체는 특히 AMP 514 (앰플리뮨), 예를 들어 US 8,609,089, US 2010028330, 및/또는 US 20120114649에 개시된 항-PD1 항체를 포함한다. CAR-발현성 세포의 활성을 증강시키는 작용제는, 예를 들어 제1 도메인과 제2 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있는데, 이러한 제1 도메인은 억제성 분자 또는 그의 단편이고, 제2 도메인은 양성 신호와 연관되는 폴리펩티드, 예를 들어 CD28, ICOS, 및 그의 단편, 예를 들어 CD28 및/또는 ICOS의 세포내 신호전달 도메인인 양성 신호와 연관되는 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 융합 단백질은 CAR을 발현하는 동일한 세포에 의해 발현된다. 또 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 세포, 예를 들어 항-EGFRvIII CAR을 발현하지 않는 T 세포에 의해 발현된다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 CAR-발현성 세포의 활성을 증강시키는 작용제는 miR-17-92이다.
제약 조성물 및 치료
본 발명의 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 CAR-발현성 세포, 예를 들어 복수 개의 CAR-발현성 세포를, 하나 이상의 제약상 또는 생리학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 슈크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트제, 예컨대 EDTA 또는 글루타치온; 아주반트 (예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 한 측면에서, 정맥내 투여용으로 제제화된다.
본 발명의 제약 조성물은 치료하고자 (또는 예방하고자) 하는 질환에 적당한 방식으로 투여할 수 있다. 투여 양 및 투여 횟수는 환자의 상태, 및 환자 질환의 유형 및 중증도와 같은 요인에 의해 결정될 것이지만, 적당한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은, 예를 들어 내독소, 미코플라스마(mycoplasma), 복제 적격한 렌티바이러스 (RCL), p24, VSV-G 핵산, HIV gag, 잔류 항-CD3/항-CD28 코팅된 비드, 마우스 항체, 풀링된 인간 혈청, 소 혈청 알부민, 소 혈청, 배양 배지 성분, 벡터 패키징 세포 또는 플라스미드 성분, 박테리아 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택된 오염물질이 실질적으로 없는, 예를 들어 이러한 오염물질이 검출 가능한 수준이 아니다. 한 실시양태에서, 상기 박테리아는 알칼리게네스 파에칼리스 (Alcaligenes faecalis), 캔디다 알비칸스 (Candida albicans), 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli), 하에모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenza), 네이세리아 메닌기티데스 (Neisseria meningitides), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 뉴모니아 (Streptococcus pneumonia), 및 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) 군 A로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이다.
"면역학상 유효량", "항종양 유효량", "종양 억제성 유효량" 또는 "치료량"이 표시되는 경우, 투여될 본 발명의 조성물의 정확한 양은 환자 (대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도, 및 상태에 있어서의 개별적인 차이를 고려하여 의사가 결정할 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 T 세포를 포함하는 제약 조성물은 104 내지 109개 세포/체중 kg의 투여량으로 투여할 수 있고, 일부 경우에는 105 내지 106개 세포/체중 kg의 투여량 (이들 범위 내의 모든 정수 값을 포함한다)으로 투여할 수 있는 것으로 언급될 수 있다. T 세포 조성물은 또한, 이들 투여량을 수회 투여할 수 있다. 상기 세포는 면역요법에 흔히 공지되어 있는 주입 기술을 이용함으로써 투여할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988] 참조).
특정 측면에서, 활성화된 T 세포를 대상체에게 투여한 다음, 혈액을 다시 채취하고 (또는 성분채집술을 수행하고), 본 발명에 따라서 그로부터 T 세포를 활성화시키며, 환자에게 이들 활성화되고 확장된 T 세포를 다시 주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 과정은 몇 주마다 여러 번 수행할 수 있다. 특정 측면에서, T 세포는 10cc 내지 400cc의 혈액 채취액으로부터 활성화시킬 수 있다. 특정 측면에서, T 세포는 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc, 또는 100cc의 혈액 채취액으로부터 활성화시킨다.
대상 조성물을 투여하는 것은 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 주입 또는 이식을 포함한 편리한 모든 방식으로 수행할 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 환자에게 경동맥, 피하, 피내, 종양내, 결절내, 수질내, 근육내, 정맥내 (i.v.) 주사 또는 복강내 투여할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 환자에게 피내 또는 피하 주사에 의해 투여한다. 한 측면에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여한다. 이러한 T 세포의 조성물은 종양, 림프절 또는 감염 부위 내로 직접 주사할 수 있다.
특별히 예시적 측면에서, 대상체에게 백혈구성분 채집술을 수행할 수 있는데, 여기서는 백혈구를 생체외에서 수집하거나, 강화시키거나 또는 고갈시켜 관심 세포, 예를 들어 T 세포를 선별 및/또는 단리한다. 이들 T 세포 단리물은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 확장시킬 수 있고, 본 발명의 하나 이상의 CAR 구축물이 도입됨으로써 본 발명의 CAR T 세포를 창출할 수 있도록 처리할 수 있다. 이를 필요로 하는 대상체에게 연속해서, 고 용량의 화학요법을 이용한 표준 치료에 이어 말초혈 줄기 세포 이식을 받게 할 수 있다. 특정 측면에서, 상기 이식 후 또는 이식과 동시에, 대상체에게 본 발명의 확장된 CAR T 세포를 주입한다. 부가 측면에서, 확장된 세포는 수술 전 또는 후에 투여한다.
환자에게 투여될 상기 치료의 투여량은 치료하고자 하는 병태의 정확한 성질과 치료 수용자에 따라서 다양할 것이다. 인간에게 투여하기 위한 투여량의 스케일링은 당해 기술분야에서 허용된 실시에 따라서 수행할 수 있다.
실시예
본 발명은 다음 실험 실시예를 참조로 하여 추가로 상세히 기재된다. 이들 실시예는 단지 예시 목적으로 제공되고, 달리 명시되지 않는 한은 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 어떠한 방식으로든지 다음 실시예로 제한되는 것으로 해석되지 않아야 하고, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로서 명백한 모든 변동을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
추가의 기재 없이도, 통상의 기술자는 전술된 설명과 다음의 예시되는 실시예를 이용하여, 본 발명의 화합물을 제조 및 활용할 수 있고 청구된 방법을 실시할 수 있는 것으로 여겨진다. 다음 작동 실시예는 본 발명의 각종 측면을 구체적으로 지적하고, 어떠한 방식으로든지 본 개시내용의 나머지 부분을 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: EGFRvIII + 교모세포종으로 진단된 환자에서 EGFRvIII - 표적화 키 메라 항원 수용체를 발현하도록 조작된 재유도된 자가 T 세포
다음 실험은 항체-기반 키메라 항원 수용체 (CAR)를 이용하여 표면 단백질 EGFRvIII에 대해 재유도된 인간 T 세포가 NSG 마우스에서 다형성 교모세포종의 EGFRvIII+ 모델을 제거하는 데 있어서 유효할 것인지에 역점을 두기 위해 설계되었다. 또한, 이들 세포의 생착과 영속성을 평가하도록 실험을 설계하였다. 3가지 상이한 형태의 CAR을 시험하는데, 이는 2가지 상이한 단일 쇄 가변 단편 (EGFRvIII 항원과 결합하는 CAR의 부분)과 세포내 신호전달 도메인 (CD28을 수반하는 및 수반하지 않는 CD3 제타 및 4-1BB)을 포괄한다.
면역결핍성 NOD/scid/γcnull (NSG) 마우스는 인간 종양 세포주 (EGFR+이고, EGFRvIII+가 되도록 조작된 버전을 갖는 뇌종양 주 U87)와 인간 T 세포를 이식하기 위한 우수한 이종 이식 모델이다. 생착한 후, 인간 T 세포를 NSG 마우스에서 대략 2개월 동안 유지시키거나 또는 치명적인 이종 GVHD (xGVHD)가 발생할 때까지 유지시킬 수 있는데, 이는 주입된 인간 T 세포의 용량과 공여자에 좌우된다.
간략하게 언급하면, 렌티바이러스성 플랫폼을 이용하여, 항-EGFRvIII 모노클로날 항체 3C10로부터 유래된 scFv가 혼입된 신규 CAR (3C10 CAR)을 창출시켰다. 이러한 CAR을 시험관내 및 이종 마우스 모델에서 시험하였다. NOD/scid/γc(-/-) (NSG) 마우스 모델은, 주입된 인간 T 세포의 장기 영속성을 평가하는 것을 포함한, CAR 요법의 전임상 평가에 광범위하게 사용되어 왔다. 뇌에 7일 U87-EGFRvIII 종양을 보유하고 있는 NSG 마우스에게 7일 내지 11일째에 매일 테모졸로미드 (1 mg/1회 용량)를 복강내 주사하고; 7일 및 17일째에 3C10 CAR로 생체외 형질도입되거나 또는 증강된 그린 형광 단백질 (EGFP)-벡터로 모의 형질도입된 2 x 106개의 인간 T-세포를 정맥내 주입하였다. 21일째, CAR-형질도입된 T-세포가 투여된 모든 마우스에서는 BLI 신호가 검출될 수 없었던 반면, 모의-형질도입된 T-세포로 처리된 마우스는 테모졸로미드에 의한 일시적인 항종양 효과 후에 5마리 마우스 중 4마리에서 종양의 재증식이 나타났다. 별개의 실험에서는, CAR-T-세포로 처리된 마우스를 21일째에 희생시켰고, 비오틴-접합된 항-F(ab')2 mAb (3C10CAR에 대해 특이적임) 및 스트렙타비딘-피코에리트린 (PE)을 이용한 면역조직화학에 의해, CAR-형질도입된 T-세포의 침윤을 평가하였다. 정맥내 주입된 CAR-T-세포는 강렬한 PE 신호에 근거하여 종양을 심하게 침윤시키는 것으로 보이는 반면, 스트렙타비딘-PE로 염색되었지만 항-F(ab')2 mAb로는 염색되지 않은 대조군 조직은 배경 신호만을 나타내었다.
이들 실험에 이용된 재료 및 방법은 다음과 같다.
재료 및 방법
NSG 마우스 모델
면역결핍성 NOD/scid/γcnull (NSG) 마우스의 집락은 최근에 확립되었다. NSG 마우스에게는 T 및 B 세포와 천연 킬러 세포가 결여되고, 이는 또한 손상된 수지상 세포 기능을 갖고 있다. 활성화된 T 세포의 생착은 기존의 NOD/scid/β2Mnull 마우스 모델 보다는 NSG 마우스에서 탁월한 것으로 확인되었다. 따라서, NSG 모델이 인간 이종 이식 실험에 사용되었다.
생물학적 시스템의 구조 및 특징
EGFRvIII에 대항하여 유도된 많은 모노클로날 및 폴리클로날 Ab가 야생형 EGFR 또는 기타 비-특이적 단백질에 대한 교차 반응성을 지니고 있긴 하지만, EGFRvIII-특이적 융합 연접부를 포함한 14개의 아미노산 펩티드로 마우스를 면역시킴으로써 최초로 발생되었던 모노클로날 항체 (mAb) 3C10이, 야생형 EGFR에 대해서는 무시할만한 수준으로 검출 가능한 결합을 나타내면서 EGFRvIII를 고도로 특이적으로 인식하는 것으로 입증되었다 (Okamoto et al., 1996 Br J Cancer 73:1366-1372). 연구 등급의 렌티바이러스성 벡터가 T 세포의 형질도입에 사용되었다.
마우스 주입을 위한 세포 제조
마우스 내로 주입하기 위한 세포는 인간 T 세포이다. 펜실베니아 인간 면역학 코어 (Pennsylvania Human Immunology Core) 대학에 의해 건강한 자발적 공여자를 대상으로 하여 백혈구성분 채집술함으로써, 인간 단핵 세포 강화된 성분채집술 생성물을 수득한다. 대학 윤리 심의위원회가 승인한 프로토콜 하에 모든 시편을 수집하고, 각 공여자로부터 고지에 입각한 서면 동의서를 받는다. 로제타셉(RosetteSep) 인간 T 세포 강화 칵테일 [스템셀 테크놀로지 (Stemcell Technologies; 캐나다 벤쿠버)]을 이용하여 T 세포를 음성적으로 선별한다. T 세포를 TRP 실험실로 옮기는데, 여기서는 상기 세포를 연구 등급 CD3/28 비드로 활성화시키고, 글루타민, 10% FBS, 20 mM 헤페스(Hepes), 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 수반하는 RPMI에서 확장시킨다. 벡터 형질도입이 24시간 후에 발생하는데, 패키지된 렌티벡터가 활성화 배양물에 직접 부가된다. 5일째에 세포를 탈비드화하고, 농도를 0.7E6 내지 2E6개 세포/ml로 유지하면서, 크기 상의 변화 (fl)와 총 세포 계수를 위해 코울터 멀티사이저(Coulter Multisizer) 3 [벡크만 코울터 (Beckman Coulter; 미국 캘리포니아주 풀러턴)]을 이용하여 확장을 모니터링한다. CAR-형질도입된 T 세포에 대한 형질도입 효율은 염소 항-마우스 항체 (GAM; 3C10-기반 CAR의 경우) 또는 염소-항-인간 항체 (GAH; 139-기반 CAR의 경우)로 염색함으로써 유동 세포측정법에 의해 시험한다. 연구 0일째에 마우스 1마리당 1백만개의 CAR+ T 세포를 마우스의 꼬리 정맥에 주사한다.
테모졸로미드 ( TMZ ) 처리
두개내 U87-EGFRvIII 종양을 보유하고 있고 0일째에 CAR+ T 세포를 투여한 마우스에게 연속해서, 0일 내지 4일째에 TMZ를 5일 동안 매일 복강내 주사하였는데, TMZ는 6.67 mg/ml로 DMEM에 용해시킨다. 각 마우스에게 50 ㎕ TMZ 용액 (333 마이크로그램/1회 용량; 대략 17 mg/kg/1회 용량)을 복강내 주사하였다.
임상 등급 CART
CART-EGFRvIII T 세포를 임상 세포 및 백신 제조 설비 (CVPF)에서 제조하는데, 세포 생성물은 자가 T 림프구이다. CD3+ T-세포는 역류 원심 세정을 통하여 단구를 고갈시킴으로써 백혈구성분 채집술 생성물로부터 강화시킨다. 0일째, 항-CD3/CD28 mAb 코팅된 자기 비드를 이용하여 상기 강화된 T 세포를 활성화시키면서 상기 제조 공정을 개시한다. T 세포 배양물을 EGFRvIII CAR 렌티바이러스 벡터에 노출시키고 확장시킨다. 이러한 T 세포 제조 공정은 정적 조직 배양물에서 개시된 다음 (0일에서 5일까지), 관류 조건 하에 부가의 확장이 필요한 경우에는 웨이브(Wave) 생물반응기에 옮긴다. 배양이 끝날 무렵, 세포를 자기 비드로부터 꺼내고, 세척하며, 농축시킨 다음 냉동 보존한다. 변형된 T 세포 생성물을, 제어 속도 냉동고를 이용하여 세포 수에 의존적인 용적의 냉동 백 내에서 냉동 보존한다 (최대 108/ml의 최종 농도). 냉동 보존된 EGFRvIII CAR T-세포 생성물을 ≤-130℃로 모니터링된 냉동고에 저장한다. 그 실험 결과가 다음에 기재된다.
CAR-T-세포에 의한 두개내 EGFRvIII - 발현성 교모세포종의 박멸
교모세포종 (GBM)은 가장 흔하고 가장 악성인 원발성 뇌종양이며, 미국에서 매년 대략 12,000명의 암 관련 사망에 대해 책임이 있다. GBM 환자는 화학요법 (테모졸로미드)과 방사선 요법 (RT)의 조합 치료 후의 평균 생존 기간이 15개월 보다 짧다. 자가 T-세포, 특히 키메라 항원 수용체 (CAR)로 형질도입된 T-세포를 이용한 양자 세포 전이 (ACT) 요법이 최근 혈액암 시도에서 장래성이 있는 것으로 밝혀졌다. CART 세포를 이용한 ACT가 GBM 환자에게 특히 적합할 수 있는데, 이는 생체외에서 제조된 세포의 특이성, 수 및 기능적 표현형을, 생체내 면역에 의해 유도된 천연 T-세포 보다 더 우수하게 조작하고 제어할 수 있기 때문이다.
표피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRvIII)은 인간 종양에서 관찰된 EGFR의 가장 흔한 변이체이지만, 정상 조직에서는 거의 관찰되지 않는다. 이러한 단백질은 엑손 2-7의 프레임내 결실로부터 비롯되고, EGFR의 세포외 도메인 내의 엑손 1과 8의 연접부에 신규 글리신 잔기가 생성됨으로써, 종양 특이적 에피토프가 창출된다. EGFRvIII은 GBM의 24% 내지 67%에서 발현되지만, 정상 조직에서는 그렇지 않다.
GBM에 대한 효과적인 CAR 요법을 개발하기 위하여, EGFRvIII을 표적으로 하는 3가지 신규 렌티바이러스성 CAR 구축물을 생성하였다. 이들 벡터 각각은 EGFRvIII-특이적 뮤린 모노클로날 항체 (mAb) 3C10 또는 "139"로 명명된 EGFRvIII-특이적 인간화 모노클로날 항체 (mAb)로부터 유래된 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 코딩한다 (도 6). 3C10 scFv는 CD28 막횡단 및 세포내 도메인을 수반하거나 수반하지 않으면서, CD8a 힌지, 4-1BB 및 CD3ζ 도메인과 커플링시킨다 (각각 3C10BBz28-CAR 및 3C10BBz-CAR). 139 scFv는 CD8a 힌지, 4-1BB 및 CD3ζ 도메인과 커플링시킨다 (139BBz-CAR). 이들 CAR 각각으로 형질도입된 인간 T-세포는 EGFRvIII-발현성 U87 인간 GBM 세포 (U87-EGFRvIII)를 특이적이고도 강력하게 용해시키는 것으로 입증되었다 (도 7 참조). 뇌에 7일 U87-EGFRvIII 종양을 보유하고 있는 면역기능저하 NOD/scid/γc(-/-) (NSG) 마우스에게 생체외에서 1) 139BBz-CAR; 2) 3C10BBz-CAR; 3) 3C10BBz28-CAR; 4) 인간 CD19를 표적으로 하는 대조군 CD19BBz-CAR로 형질도입된 1 x 106개의 인간 T-세포를 정맥내 주입하였다. 이들 마우스에게 또한, 7일 내지 11일째에 매일 테모졸로미드 (330 mcg/1회 용량)을 복강내 주사하였다. 생물발광 영상화 (BLI)에 의해 종양 성장을 모니터링하였는데, 이는 U87-EGFRvIII 세포가 또한 루시페라제를 발현하기 때문이다. 식염수로만 처리된 모든 마우스는 신속한 종양 성장으로 인해 21일경에 사망하였고, ACT를 수반하지 않는 테모졸로미드 치료는 U87-EGFRvIII 종양을 억제하였지만, 박멸하지는 못하였다. CD19BBz-CAR-T-세포와 테모졸로미드가 투여된 마우스는 U87-EGFRvIII에 대항하여 일부 동종 반응을 명확하게 보여주었지만, 이들 마우스에서는 종양이 지속적으로 성장하였다. 또 다른 한편, 139BBz-CAR-, 3C10BBz-CAR-, 또는 3C10BBz28-CAR-형질도입된 T-세포가 투여된 모든 마우스에서는, BLI 신호가 21일경에 기준선 수준 아래로 감소하였는데, 이는 총 종양이 박멸되었다는 것을 제안한다 (도 8). 중요하게도, 3C10BBz-CART 세포가 투여된 마우스에서는 3C10BBz28 또는 139BBz CART 세포가 투여된 마우스에서보다 더 신속하게 종양이 제거되었는데, 이는 3C10을 BBz와 조합하면, 환자에게 더 우수한 반응이 제공될 수 있다는 것을 제안한다. 종양 성장과 말초 면역 반응을 모니터링하여, 상기 3가지 EGFRvIII-CAR 벡터 중 어느 것이 장기간 항종양 효과에 대해 다른 것보다 탁월한지를 결정하였다.
본원에 제시된 결과는 테모졸로미드를 이용한 표준 치료 화학요법을 동시에 받은 GBM 환자에서 EGFRvIII-표적화 CAR-T-세포를 이용한 ACT의 제I상 임상 시험의 개발을 강력하게 뒷받침해준다.
임상 설계
EGFRvIII+로 새로이 진단된 GBM 환자에서 CART-EGFRvIII T 세포의 안전성, 관용성 및 생착 잠재성을 결정하기 위한 단일-암 개방-표지 시험적 연구를 설계하였다. 일반적으로, 모든 대상체에게 자가 CART-EGFRvIII T 세포를 투여하였다. 적격한 대상체에게 백혈구 성분 채집술을 수행하여 CART-EGFRvIII 제조를 위한 다수의 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 수득하였다. T 세포를 PBMC로부터 정제하고, 인간화 3C10-CAR 렌티바이러스성 벡터로 형질도입하며, 시험관내에서 확장시키고 적당한 용량 분취액에서 냉동보존한다. 주입될 세포는 0일째 주입하기 직전에 병상에서 해동한다.
대상체에서 혈액 시험을 수행하여 CART EGFRvIII 세포의 안전성, 및 생착과 영속성을 4주 (28일)에 걸쳐 규칙적인 간격으로 평가한다. 3C10-CAR 벡터를 함유하는 순환성 T 세포의 서브세트는 주입 후 각종 시간에 평가하고 기준선 샘플과 비교한다. 28일 후, 병력, 신체 검사, 뇌 MRI 및 혈액 시험을 이용하여, 또는 표준 치료에 따라서 대상체를 6개월까지는 매월 평가한다.
연구 혈액 시험을 이들의 방문과 동시에 수행한다. 6개월 후, 2년 동안 2개월 마다 환자를 추적한다. 2년 시점 후에는, 대상체에게 전화로 매년 추적하기 위한 롤-오버(roll-over) 연구를 들어가고, 유전자 전이 연구에 관한 FDA 규정에 의해 요구되는 바와 같은, 장기간 건강상의 문제점, 예컨대 새로운 악성 종양의 발생의 진단에 관하여 평가하기 위해 13년 더 설문지 조사를 한다.
어떠한 특별한 이론에 얽매이는 것은 아니지만, EGFRvIII 단백질의 고도로 제한된 발현 때문에, T 세포의 종양을 벗어나 적중하는 어떠한 종류의 활성화도 전혀 예상되지 않는 것으로 여겨진다. 바람직하게, CART-EGFRvIII의 1회 주입제 만을 투여하므로, 알레르기-유형 반응 역시 예상되지 않는다. 그러나, 직면할 수 있는 하나의 독성은 종양 부위에서 T 세포 활성화로부터의 방관자 염증이다. 뇌부종의 증상과 징후가 근접하게 모니터링되고 관리될 것이다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화로부터의 방관자 염증은 소염제, 예컨대 스테로이드제를 투여함으로써 치료할 수 있다.
실시예 2: miR -17-92의 공동-형질도입은 인간 교모세포종 이종이식편을 보유하고 있는 마우스에서 항- EGFRvIII 키메라 항원 수용체로 형질도입된 T-세포의 항-종양 활성을 증강시킨다
miR-17-92 발현은 T-세포의 유형-1 표현형과 증강된 생존을 부여해준다. 그러한 miR-17-92는 교모세포종 (GBM) 환자로부터 유래된 T-세포에서 하향 조절되는 것으로 보고되었다. 키메라 항원 수용체로 형질도입된 T-세포 (CAR-T-세포)를 이용하여 GBM에 대항한 양자 전이 요법의 효능을 개선하기 위하여, T-세포 수용체 CD3ζ 쇄 신호전달 모듈 및 CD137 (4-1BB)과 CD28의 공동자극성 모티프와 직렬로 커플링된 표피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRvIII)-특이적 단일-쇄 가변 단편 (scFv)으로 이루어진 CAR 및 miR-17-92에 대한 신규 렌티바이러스성 벡터 (pELNS-3C10-CAR)를 구축하였다. EGFRvIII을 안정적으로 발현하는 U87 GBM 세포 (U87-EGFRvIII)에 대항한 항원-특이적이고 강력한 세포독성 활성 이외에도, miR-17-92로 공동-형질도입된 CAR-T-세포는 miR-17-92 공동-형질도입을 수반하지 않은 CAR-T-세포와 비교해서 전환 성장 인자 (TGF)-β와 테모졸로미드의 T-세포 억제 효과에 대한 개선된 저항성을 나타내었다. 두개내 U87-EGFRvIII 이종이식편을 보유하고 있는 마우스에서는, 트랜스진-유래된 miR-17-92 발현을 수반하거나 수반하지 않는 CAR-T-세포가, 제어되지 않는 어떠한 CAR-T-세포의 성장도 명확히 보여주지 않으면서 유사한 수준의 강력한 치료 효과를 입증하였다. 그러나, 이들 마우스의 뇌를 U87-EGFRvIII 세포로 다시 시험감염시키면, 공동-형질도입된 CAR-T-세포가 투여된 마우스는 miR-17-92 공동-형질도입을 수반하지 않은 CAR-T-세포로 처리된 마우스와 비교해서 개선된 보호를 나타내었다. 이들 데이터는 miR-17-92가 CAR 내에 통합되어 GBM 환자 내에서의 효능을 개선시킬 수 있다는 것을 뒷받침해준다.
그 실험 결과가 다음에 기재된다.
EGFRvIII -특이적 CAR 및 miR -17-92에 대한 렌티바이러스성 벡터의 구축
인간 EGFRvIII-특이적 모노클로날 항체 (mAb) 3C10으로부터 유래된 단일-쇄 가변 단편 (scFv)을 통하여 EGFRvIII을 인식하는 CAR에 대한 렌티바이러스성 벡터 (pELNS-3C10-CAR)를 생성시켰다 (도 1a 참조). 이러한 구축물에서, EF-1α 프로모터는 3C10-유래된 scFv, CD28 막횡단 (TM) 뿐만 아니라 4-1BB 및 세포내 도메인 (ICD) 및 CD3ζ 도메인을 통합하는 CAR 융합 단백질을 구동시킨다. FG12-기반 자기-불활성화 (SIN) 벡터를 이용하여 렌티바이러스성 miR-17-92 구축물 (FG12-EF1a-miR-17/92)를 또한 창출시켰다 (도 1b 참조). 이러한 벡터에서는, EF-1α 프로모터가 miR-17-92를 구동시키고, 인간 UbiC 프로모터는 형질도입된 세포의 추적을 위해 증강된 그린 형광 단백질 (EGFP) 마커 유전자를 구동시킨다. 도식에 사용된 약어는 다음과 같다: RSV/HIV-1 5' LTR; 혼성체 RSV 프로모터-R/U5 장 말단 반복 서열, EF-1α; 인간 신장 인자 1α-소단위 프로모터, VH; 3C10 이뮤노글로불린의 중쇄 내의 가변 영역, VL; 3C10 이뮤노글로불린의 경쇄 내의 가변 영역, HIV-1 Δ-3' LTR; U3 영역에 결실을 수반한 자기-불활성화 3' 장 말단 반복 서열, CMV/HIV-1 5' LTR; 혼성체 CMV 프로모터-R/U5 장 말단 반복 서열, UbiC; 유비퀴틴 C 프로모터.
CAR 및 miR -17-92로 형질도입된 인간 T-세포의 시험관내 특성화
건강한 공여자-유래된 CD3+ T-세포를 pELNS-3C10-CAR로 형질도입시키고, 이 세포를 대상으로 하여, 항-마우스 (Fab')2 항체 및 EGFP 각각에 의해 3C10-CAR 및 miR-17-92의 발현을 알아보기 위하여 유동 세포측정법에 의해 트랜스진의 발현 수준을 평가하였다 (도 2a, 좌측). 인간 T-세포 상에서 3C10-유래된 scFv에 대해 특이적인 항-마우스 F(ab')2 Ab를 이용하여, 그들의 표면 상에서 3C10-유래된 scFv를 발현하는 T-세포의 거의 절반 (48.9%)을 검출하였다.
CAR과 트랜스진-유래된 miR-17-92 둘 다를 발현하는 인간 T-세포를 수득하기 위하여, 다음 2개의 렌티바이러스성 벡터를 순차적으로 감염시킴으로써 CD3+ T-세포를 pELNS-3C10-CAR 및 FG12-EF1a-miR-17/92로 공동-형질도입하였다. pELNS-3C10-CAR로 초기 형질도입한지 24시간 후, 상기 T-세포를 FG12-EF1a-miR-17-92로 형질도입하였다. 총 T-세포의 대략 1/4 정도 (23.6%)가 CAR과 EGFP 둘 다를 발현한 것으로 관찰되었다 (도 2a, 우측). 후속 시험관내 연구를 위하여, 바이오티닐화 항-마우스 F(ab')2 Ab 및 항-비오틴 MACS를 이용하여, CAR-형질도입된 T-세포 (CAR-T-세포)를 강화시켰다. 공동-형질도입의 효율에 근거하여 (도 2a, 우측), CAR-T-세포의 적어도 50%가 또한 EGFR을 발현하였다 (이에 따라, 트랜스진-유래된 miR-17-92도 발현하였다). 실시간 PCR에 의해, CAR 단독으로 형질도입된 T-세포와 비교해서 F(ab')2 Ab-강화되고, miR-17-92-공동-형질도입된 CAR-T-세포에서 3 내지 4배 더 높은 수준의 miR-17-92 발현이 검출되었다 (도 2b). 도 2b는 qRT-PCR에 의해 측정된 형질도입된 T 세포에서의 miR-17-92 군락 구성원, miR-17-3p, miR-17-5p 및 miR-92a-1의 발현 수준을 명확하게 보여준다. 유사한 결과를 나타내는 3가지 실험 중 하나로부터의 세 번 되풀이한 측정치의 평균 ± SD 값이 도시되어 있다. *는 스튜던트(student) t 시험을 이용한 두 군 간의 p < 0.05를 표시한다. 도 2c는 51Cr-표지된 U87-EGFRvIII 또는 대조군 U87 세포에 대항한 각종 E:T 비에서 12-h 51Cr-방출 검정에 의해 평가된 형질도입된 T 세포의 EGFRvIII 특이적 세포독성 활성을 도시한 것이다. 대조군 세포는 모의 (EGFP)-형질도입된 T-세포이다. 값은 세 번 되풀이한 웰에서의 평균 ± SD를 표시한다.
모의-형질도입된 T-세포가 모 U87 (EGFRvIII-음성) 세포와 U87-EGFRvIII 세포 둘 다에 대항하여 배경 수준의 용해만을 나타내긴 하였지만, CAR로 형질도입된 T-세포는, 모 U87 세포에 대항해서는 배경 수준의 세포독성 효과만을 나타내면서도 EGFRvIII 발현성 U87 인간 GBM 세포 (U87-EGFRvIII)를 강력하고도 특이적으로 용해시킨 것으로 입증되었다 (도 2c). 이들 12h 51Cr-방출 검정에서는, CAR-T-세포를 miR-17-92로 공동-형질도입하면, U87-EGFRvIII 표적 세포에 대항한 그들의 특이적 세포독성 활성이 상당히 증강되지 않았다.
miR -17-92 공동-형질도입은 TGF -β와 테모졸로미드 ( TMZ - 표준 치료 요법)에 의한 억제 효과에 대해 증강된 IFN-γ 방출 및 저항성을 부여해준다
기존의 연구에서는 (문헌 [Sasaki et al., 2010, J. Transl Med 8:17]), miR-17-92 트랜스제닉 마우스로부터 유래된 CD4+ T 세포가, 야생형 마우스로부터 유래된 대응물과 비교한 경우에 증가된 IFN-γ 생성을 명확하게 보여주었고; 인간 Jurkat T 세포를 miR-17-92로 형질감염시키면, 활성화-유도된 세포 사멸 (AICD)에 대해 증강된 저항성이 초래된다.
CAR-T-세포를 miR-17-92로 공동-형질도입하는 것이, 이들을 화학요법제 TMZ 또는 면역억제성 시토카인 TGF-β에 노출시킨 경우에 개선된 IFN-γ 생성, 세포 증식 및 덜한 정도의 아폽토시스성 사멸을 부여하는 지를 평가하기 위한 실험을 수행하였다.
CAR-T-세포를 TGF-β 또는 TMZ 없이 EGFRvIII-형질도입된 인공 항원 제시 세포 (aAPC)로 자극하는 경우, 상기 세포는 공동-형질도입을 수반하거나 수반하지 않으면서 유사한 수준의 IFN-γ를 발현하였다. 그러나, 상기 세포를 단계적 상승 용량의 TGF-β 또는 TMZ에 노출시킨 경우에는, miR-17-92 공동-형질도입을 수반하지 않은 CAR-T-세포가 상당히 감소된 수준의 IFN-γ를 생성시킨 반면, 공동-형질도입된 CAR-T-세포는 IFN-γ의 고 수준 생성을 유지하였다 (도 3a). 흰색 막대 및 흑색 막대는 각각 CAR-T-세포 (miR-17-72를 수반하지 않음) 및 miR-17-92 공동-형질도입된 CAR-T 세포로부터의 결과를 나타낸다. 도 3a는 96h 공동-배양의 마지막 24h 동안 형질도입된 T 세포에 의해 생성된 IFN-γ를 나타낸다. 도 3b는 3일 공동-배양 과정 후 WST1 검정에 의해 평가한 군 간의 상대적 증식 수준을 나타낸다. 도 3c 및 3d는 아넥신(Annexin)-V 및 PI에 의해 평가된 CAR-T-세포의 아폽토시스성 사멸을 나타낸다. 도 3c는 TMZ에 노출된 CAR-T-세포 상에서의 아넥신-V에 대한 평균 형광성 세기를 나타낸다. 값은 세 번 되풀이한 웰에서의 평균 ± SD를 표시한다 (*은 P<0.05를 표시한다). 도 3d는 유사한 결과를 수반하는 3가지 실험 중 한 가지에서 아넥신-V+ 및/또는 PI+에 대한 유동 세포계수 히스토그램을 나타낸다.
배양물 중의 TMZ의 존재 하에 CAR-T-세포의 증식에 대한 miR-17-92 공동-형질도입의 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. EGFRvIII-발현성 aAPC를 이용하여 CAR-T-세포의 증식을 유도시키는 실험을 설계하였고, 그 증식은 WST-1 검정에 의해 평가하였다 (도 3b). TMZ를 이용하지 않고서도, miR-17-92-공동-형질도입된 CAR-T-세포는 대조군 CAR-T-세포와 비교해서 더 신속한 증식 속도 경향을 명확히 보여주었지만, 그 차이는 유의적이지 않았다. CAR-T-세포 증식에 대한 TMZ의 강한 영향력을 구체적으로 평가하기 위하여, 도 3b에서는, TMZ를 수반하지 않는 동일한 세포의 증식을 기준으로 하여 각 군에서의 세포의 증식 속도를 도시하였다. 증가 농도의 TMZ를 배양물에 부가하는 경우, 성장 억제 정도는 대조군 CAR-T-세포와 비교해서 miR-17-92 공동-형질도입된 CAR-T-세포에서 상당히 덜하였다.
miR-17-92-공동-형질도입으로 인해 CAR-T-세포가 TMZ-유도된 아폽토시스에 대해 보다 저항성으로 될 수 있었는지를 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위하여, 아넥신 V+ 및 프로피듐 아이오다이드 (PI)+ CAR-T-세포의 유동-세포계수 평가를 증가 농도의 TMZ에서 수행하였다 (도 3c 및 3d). 초기 아폽토시스성 (아넥신 V+PI-), 아폽토시스성/괴사성 (아넥신 V+PI+) 및 괴사성 (아넥신 V-PI+) 세포와 miR-17-92-공동-형질도입된 CAR-T-세포 둘 다를 용량-의존적으로 증가시키면, 대조군 CAR-T-세포와 비교해서 덜한 정도의 아폽토시스성 변화가 입증된 것으로 관찰되었다.
CAR-T-세포를 TMZ와 조합하여 정맥내 주사하면, NSG 마우스에서 확립된 U87-EGFRvIII 종양의 완전한 차도가 초래된다
확립된 (7일) 두개내 U87-EGFRvIII 종양을 보유하고 있는 면역기능저하 NOD/scid/γc(-/-) (NSG) 마우스에서 CAR-T-세포의 효능을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. miR-17-92 공동-형질도입된 CAR-T-세포, miR-17-92의 공동-형질도입을 수반하지 않은 CAR-T-세포, 또는 모의-형질도입된 T-세포의 단일 정맥내 주입제 (마우스 1마리당 2 x 106개)를 마우스의 꼬리 정맥 내로 투여하였다. 새로이 진단된 GBM 환자에게는 통상적으로 TMZ 요법을 투여하기 때문에, T-세포 주입 당일에 시작하여 5일 동안 TMZ를 매일 복강내 주사 투여하도록 실험을 설계하였다 (도 4a). 도 4b는 카플란-마이어 분석을 나타낸다. CAR-T 세포 (miR-17-92의 공동-형질도입을 수반하거나 수반하지 않음)로 처리된 마우스의 평균 생존율은 모의 형질도입된 T 세포로 처리된 마우스와 비교해서 상당히 더 높았다 (p < 0.05). TMZ 처리 자체는 효과가 없었는데, 이는 TMZ 및 모의-형질도입된 T-세포를 투여한 모든 대조군 마우스가 상기 T-세포 주입 후 3주 (21일) 이내에 사망하였기 때문이다 (도 4b). CAR-T-세포로 처리된 5마리 마우스 중 1마리와, miR-17-92 공동-형질도입된 CAR-T-세포로 처리된 5마리 마우스 중 2마리가 22일경에 종양 진행으로 인해 사망하긴 하였지만, 이들 군 내의 다른 마우스 모두는 40일을 초과하여 생존하였다. 이 결과는 유사한 결과를 나타내는 2가지 독립적인 실험 중 한 가지로부터의 것이다. miR-17-92-공동-형질도입된 CAR-T-세포가 투여된 마우스의 생존율과 miR-17-92 공동-형질도입을 수반하지 않은 CAR-T-세포가 투여된 마우스의 생존율 간에는 통계상 유의적 차이가 없었다 (log-순위 시험: p=0.5485).
miR -17-92 공동-형질도입된 CAR-T-세포는 마우스 내의 U87- EGFRvIII 종양에 대항한 영속적인 보호를 부여해준다
도 4에 제시된 실험에서 마우스에 주입된 CAR-T-세포가 U87-EGFRvIII 종양에 대항하여 숙주의 장기간 보호를 제공할 수 있는지를 결정하기 위하여, 49일째에 뇌의 반대측 반구 내에 U87-EGFRvIII 세포를 접종하여 생존자를 재-시험감염시켰다 (도 5). 이와 같이 재-시험감염된 종양 세포가 CAR-T-세포로 처리된 3마리 마우스 모두에서 성장하였지만, miR-17-92 공동-형질도입된 CAR-T-세포로 처리된 마우스 중 어느 것도 배경 수준을 벗어난 BLI 신호를 명확히 보여주지 않았다. 이들 결과는 miR-17-92 군락의 공동-형질도입이 CAR-T-세포의 장기간 영속성을 부여해줌으로써, 종양 성장에 대항하여 숙주를 장기간 보호해준다는 사실을 강력하게 제안하고 있다. 마우스 2개 군으로부터의 종양-유래된 평균 양자 유속 ± SD의 지속적인 측정. 처리군에서 종양-보유 마우스와 병행해서 영상화된 비-종양-보유 마우스에서 관찰된 수준을 근거로 하여, 배경 발광 수준 (103 p/s 이하)을 규정하였다.
miR -17-92는 CAR 내에 통합되어 효능을 개선시킬 수 있다
본원에 제시된 결과는 3C10 scFv를 CD3ζ 쇄, CD 137 (4-1BB) 및 CD28과 통합하는 신규 항-EGFRvIII-CAR (3C10-CAR)로 형질도입된 T-세포에서의 miR-17-92 공동-발현의 효과를 입증해준다. 이러한 결과는 miR-17-92의 공동-발현이 TGF-β 및 테모졸로미드의 T-세포 성장-억제성 효과에 대한 개선된 저항성을 부여한다는 것을 나타낸다. 생체내에서, 3C10-CAR과 miR-17-92 둘 다로 공동-형질도입된 T-세포는 3C10-CAR 단독으로 형질도입된 T- 세포와 비교해서 더 영속적인 치료 효과를 입증하였다.
본 연구에서 miR-17-92의 렌티바이러스성 형질도입은, 형질도입된 T-세포에서 miR-군락의 이소성 과발현을 부여해준다. 그러나, 생리학적 조건 하에서, T-세포에서의 내인성 miR-17-92의 발현 수준은 엄격하게 조절되는 것으로 여겨진다. 인간 CD8+ T 세포에서, miR-17-92 발현은 타고난 본래의 세포에서는 고 수준으로 검출되지만, 세포가 분화됨에 따라 감소된다 (Salaun et al., 2011, J Transl Med 9:44). 림프구성 맥락수막염 바이러스 감염의 마우스 모델에서는, miR-17-92가 T-세포 활성화 후에 강력하게 상향 조절되지만, 클로날 확장 후에는 하향 조절되고, 기억 발생 동안에는 추가로 침묵하였다 (Wu et al., 2012, Proc Natl Acad Sci USA 109:9965-9970). 이와 같이 참조된 연구에서는, 신속한 T-세포 확장과 그들의 IFN-γ 발현을 위해 miR-17-92가 필요하다. 그러나, miR-17-92의 과발현으로 인해, 단명 말단 이펙터 세포로의 분화가 왜곡된다. miR-17-92를 하향 조절하지 못하면, 기억 세포가 점차적으로 상실되고 결함있는 중추 기억 세포가 발생한다 (Wu et al., 2012, Proc Natl Acad Sci USA 109:9965-9970). 이들 관찰 결과는 본원에 제시된 결과와 반드시 일치하지는 않는데, 이는 miR-17-92-공동-형질도입된 CAR-T-세포의 영속성과 재-시험감염된 U87-EGFRvIII 세포로부터 숙주를 보호해줄 수 있는 그들의 효율적인 능력이 관찰되었기 때문이다. 어떠한 특별한 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 상기 관찰 결과는 CAR 및 miR-17-92에 제공된 동시-자극성 분자의 조합 효과에 기인하는 것으로 여겨진다.
miR-17-92가 발암성 miR로서 보고되긴 하였지만 (문헌 [van Haaften and Agami, 2010, Genes & Development 24:1-4]), miR-17-92 과발현 자체는 림프구에서 발암성이 아닌 것으로 공지되어 있다 (Xiao et al., 2008, Nat Immunol 9:405-414). 실제로, 본 연구에서는 miR-17-92-형질도입된 T-세포의 제어되지 않는 증식이 관찰되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 더 우수한 안전성을 보장하기 위한 대체 접근 방식으로서, 렌티바이러스성 안정한 전이 대신, T-세포를 miR-17-92 자체로 일시적으로 형질도입하고, 이들 T-세포를 수회 주사하는 것이, 바이러스 벡터를 통합하는 것과 관련된 안전성 문제없이 합리적인 접근 방식을 나타낼 수 있다 (Zhao et al., 2010, Cancer Research 70:9053-9061).
GBM 요법을 위한 EGFRvIII-표적화 CAR와 관련하여, 최근 문헌 ([Morgan et al., 2012, Hum Gene Ther 23: 1043-1053])에서는, γ-레트로바이러스성 CAR 중의 7개의 상이한 항-EGFRvIII mAb (3C10 및 인간 139 포함)로부터 유래된 scFv 서열을 평가하였다. 이들 CAR을 시험관내에서 특성화한 결과, EGFRvIII-발현성 표적 세포에 반응해서는 특이적인 IFN-γ 생성을 산출하였지만, 야생형 EGFR 유전자를 발현하는 세포에 반응해서는 그렇지 않은 3개 클론 중 2개로서 3C10 및 139가 밝혀졌다.
EGFRvIII이 GBM 환자 집단에서만 발현되고, 심지어 "EGFRvIII-양성" 증례에서도 GBM 세포 분획에서만 발현된다는 것을 인식하는 것이 또한 중요하다 (Heimberger et al., 2005, Clin. Cancer Res. 11:1462-1466). 단일 표적으로서 EGFRvIII을 표적으로 하는 면역요법은 이러한 면역요법-표적화된 항원을 하향 조절시킨 GBM 세포의 증식을 초래하는 것으로 예상될 것이다 (Sampson et al., 2010, J Clin Oncol 28:4722-4729). 수많은 기존의 연구는 GBM-관련 항원, 예컨대 IL-13Rα2 (문헌 [Kong et al., 2012, Clin Cancer Res 18:5949-5960]; [Kahlon et al., 2004, Cancer Res. 64:9160-9166]), HER-2 (문헌 [Ahmed et al., 2010, Clinical Cancer Research 16:474-485]) 및 EphA2 (문헌 [Chow, K.K. et al. T Cells Redirected to EphA2 for the Immunotherapy of Glioblastoma. Mol Ther (2012)])에 대항한 CAR을 개발하였다. 어떠한 특별한 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 유효한 CAR 요법은 궁극적으로, GBM-유도된 억제 기전에 저항할 수 있고 다수의 항원을 표적으로 할 수 있는 T-세포를 이용해야 하므로, 주입된 T-세포는 이종 항원-발현 프로파일을 나타내면서 GBM에 대항하여 유효하고 지속적인 치료 효과를 나타낼 것으로 여겨진다.
본원에 제시된 결과는 pELNS-3C10-CAR 및 FG12-EF1a-miR-17/92로 공동-형질도입된 T-세포를 이용하는 경우의 이득을 입증해준다. CAR과 miR-17-92 트랜스진의 공동-발현을 달성하기 위한 대체 접근 방식으로서, 단일 전사체로서 3C10-CAR 유전자와 miR-17-92 유전자 둘 다를 발현하는 pELNS-기반 렌티바이러스성 벡터를 구축하였다. 이러한 단일 "직렬식" 벡터를 사용하는 것이 2개의 벡터-기반 접근 방식과 비교해서 비교적 간단한 형질도입 과정 및 쉬운 조절 과정 관점에서 이점을 가질 수 있다. 더욱이, CAR을 발현하는 모든 T-세포는 또한, miR-17-92를 발현해야 한다. 그러나, "직렬식" 벡터의 형질도입 효율은 2개의 벡터 접근 방식에 의한 것 보다 더 낮은 것으로 예상되는데, 이는 삽입물의 크기가 증가함에 따라 렌티바이러스의 역가는 감소하기 때문인 것으로 밝혀졌다. 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 3C10-CAR 유전자의 렌티바이러스성 형질도입과 miR-17-92의 전기천공을 조합하는 것이 실행 가능한 전략일 수 있다.
본 연구에서는, 40% 내지 60%의 CD3+ CAR-T-세포가 CD4+였고, CD4+ CAR-T-세포는 U87-EGFRvIII 세포를 EGFRvIII-특이적 방식으로 효과적으로 용해시킨 것으로 또한 밝혀졌다. 페르포린+ CD4+ T-세포가 페르포린/그랜자임 B 경로를 통하여 세포독성 활성을 매개하지만, Fas/FasL 경로를 통해서는 그렇지 않다고 보고되었다 (Porakishvili et al., 2004, Haematologica 89:435-443). 따라서, 본 연구에서는 CD4+ CAR-T-세포가 페르포린과 그랜자임 B를 발현하여, U87-EGFRvIII 세포에 대항하여 관찰된 용해 활성을 매개하는 것으로 여겨진다.
요약하면, 본 연구는 miR-17-92를 통합하는 CAR 요법을 평가하기 위한 강력한 토대를 제공한다.
실시예 3: CAR 서열
뮤린 모노클로날 항체 (mAb) 3C10은 EGFRvIII-특이적 융합 연접부를 포함한 14개의 아미노산 펩티드 (PEP3)로 마우스를 면역시킴으로써 최초로 발생되었는데, 이는 야생형 EGFR에 대한 검출 가능한 어떠한 결합도 나타내지 않으면서 EGFRvIII을 고도로 특이적으로 인식하는 것으로 입증되었다 (Okamoto et al., British J. Cancer 1996, 73:1366-1372). 연속해서, mAb 3C10의 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 생성시켰고, 3C10 scFv에 대한 cDNA를 수득하였다. 본래의 mAb의 결합 활성도 및/또는 항원-특이성이 종종, scFv 형태에서는 상실될 수 있긴 하지만, 3C10 scFv는 EGFRvIII-특이적 에피토프와의 그의 선택적 반응성을 보유하였다 (Nakayashiki et al., Jpn. J. Cancer Res. 2000, 91:1035-1043).
EGFRvIII CAR은 CD28, 4-1BB, 및 CD3 제타를 수반한 3C10scFv (마우스)를 pELNS 렌티바이러스성 백본 플라스미드 (EF1 프로모터) 내로 클로닝함으로써 구축하였다. 또 다른 EGFRvIII CAR은 상기 3C10scFv를 CD8a 힌지/CD8TM/4-1BB/CD3 제타 pELNS 렌티바이러스성 백본 (이는 EF1a 프로모터에 의해 발현된다) 내로 클로닝함으로써 생성시켰다.
3C10scFv-CD28BB제타 CAR (아미노산) (서열 1)
Figure pct00006
3C10scFv-BBz CAR (아미노산) (서열 2)
Figure pct00007
3C10scFv-CD28BB제타 CAR (핵산) (서열 18)
Figure pct00008
3C10scFv-BBz CAR (핵산) (서열 19)
Figure pct00009
"139"로 명명된 scFv 단편은 EGFRvIII에 대한 인간 항체이다 (Morgan et al., 2012 Hum Gene Ther 23(10):1043-53). 이러한 139 scFv를 포함하는 EGFRvIII CAR은 상기 139 scFv를 초기에 합성함으로써 생성시켰다. 139 scFv에 대한 서열을 리더 서열, CD8 힌지, 막횡단 (TM) 도메인, 및 목적하는 신호전달 도메인과 함께 클로닝하였다. 예를 들어, 139 scFv에 대한 서열을 4-1BB 및 CD3 제타에 대한 신호전달 도메인과 함께 클로닝하였다. 렌티바이러스 생성을 위하여 pELNS 벡터로부터 CAR 구축물 (139scFv-BBZ)이 발현된다.
139scFv-BBz CAR (아미노산) (서열 3)
Figure pct00010
139scFv-BBz CAR (핵산) (서열 20)
Figure pct00011
CAR 성분
핵산 서열:
● 3C10 scFv 뉴클레오티드 서열 (마우스); (서열 4)
Figure pct00012
● 139 scFv 뉴클레오티드 서열 (인간화); (서열 5)
Figure pct00013
● 리더 (핵산 서열); (서열 6)
Figure pct00014
● 힌지 (핵산 서열); (서열 7)
Figure pct00015
● 막횡단 (핵산 서열); (서열 8)
Figure pct00016
● 4-1BB 세포내 도메인 (핵산 서열); (서열 9)
Figure pct00017
● CD3 제타 (핵산 서열); (서열 10)
Figure pct00018
● CD3 제타 (핵산 서열; NCBI 참조 서열 NM_000734.3); (서열 100)
Figure pct00019
아미노산 서열:
● 3C10 scFv 아미노산 서열 (마우스); (서열 11)
Figure pct00020
● 139 scFv 아미노산 서열 (인간); (서열 12)
Figure pct00021
● 리더 (아미노산 서열) (서열 13)
Figure pct00022
● 힌지 (아미노산 서열) (서열 14)
Figure pct00023
● 막횡단 (아미노산 서열) (서열 15)
Figure pct00024
● 4-1BB 세포내 도메인 (아미노산 서열) (서열 16)
Figure pct00025
● CD3 제타 도메인 (아미노산 서열) (서열 17)
Figure pct00026
● CD3 제타 도메인 (아미노산 서열; NCBI 참조 서열 NM_000734.3) (서열 99)
Figure pct00027
서열 11의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드는 서열 4로서 제공된다. 서열 12의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드는 서열 5로서 제공된다. 서열 13의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드는 서열 6으로서 제공된다. 서열 14의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드는 서열 7로서 제공된다. 서열 15의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드는 서열 8로서 제공된다. 서열 16의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드는 서열 9로서 제공된다. 서열 17의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드는 서열 10으로서 제공된다. 서열 1의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드는 서열 18로서 제공된다. 서열 2의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드는 서열 19로서 제공된다. 서열 3의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드는 서열 20으로서 제공된다. 서열 99의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드는 서열 100으로서 제공된다.
실시예 4: EGFRvIII CAR에 대한 예측된 CDR 명칭
카바트(Kabat) 하에 EGFRvIII CAR에 대한 예측된 CDR 명칭은 다음과 같다:
● VH:
Figure pct00028
[여기서, CDR1은 DYYIH (서열 22)이고, CDR2는 RIDPENDETKYGPIFQG (서열 23)이며, CDR3은 RGGVY (서열 24)이다].
● VL:
Figure pct00029
[여기서, CDR1은 KSSQSLLDSDGKTYLN (서열 26)이고, CDR2는 LVSKLDS (서열 27)이며, CDR3은 WQGTHFPGT (서열 28)이다].
코티아(Chothia) 하에 EGFRvIII CAR에 대한 예측된 CDR 명칭은 다음과 같다:
● VH:
Figure pct00030
[여기서, CDR1은 GFNIEDY (서열 30)이고, CDR2는 DPENDE (서열 31)이며, CDR3은 RGGVY (서열 32)이다].
● VL:
Figure pct00031
[여기서, CDR1은 SQSLLDSDGKTY (서열 34)이고, CDR2는 LVS (서열 35)이며, CDR3은 GTHFPG (서열 36)이다].
실시예 5: 뮤린 항- EGFRvIII 항체의 인간화
뮤린 EGFRvIII 항체를 인간화하는 것이 임상적 환경에 요망되는데, 여기서 마우스-특이적 잔기는 뮤린 CAR 구축물로 형질도입된 T 세포로의 치료를 받은 환자에서 인간-항-마우스 항원 (HAMA) 반응을 유도시킬 수 있다. 하이브리도마 유래된 뮤린 EGFRvIII 항체의 VH 서열과 VL 서열은 공개된 문헌으로부터 추출하였다 (Morgan et al. (2012) Human Gene Therapy, 23:1043-1953, 상기 참조). 인간화는 뮤린 EGFRvIII 항체로부터의 CDR 영역을 인간 생식세포계 수용자 프레임워크 VH1_1-f 또는 VH5_5a 뿐만 아니라 VK2_A17 또는 VK4_B3 (vBASE 데이터베이스) 상으로 이식함으로써 달성하였다. 이러한 CDR 영역 이외에도, CDR 영역의 구조적 완전성을 뒷받침하는 것으로 여겨지는 여러 프레임워크 잔기, 즉 VK2 #36, #49, VK4 #2, #36, #46, #49, VH1 #2, #24, #76, #94 및 VH5 #2, #24, #73, #76, #94를 상기 뮤린 서열로부터 보존하였다. 추가로, 인간 J 요소 JH6 및 JK4를 중쇄와 경쇄에 각각 사용하였다. 이로써 생성된 인간화 항체의 아미노산 서열은 도 9에 도시된 경쇄의 경우에는 VK2_A17/Hz1 및 VK4_B3/Hz1로 명명되었고, 중쇄의 경우에는 VH1_1-f/Hz1, VH5_5-a/Hz1로 명명되었다. 잔기 넘버링은 카바트 (상기 문헌 [Kabat E.A. et al., 1991] 참조)에 따른다. CDR 정의에 관해서는, 카바트뿐만 아니라 코티아 (상기 문헌 [Chothia et al., 1987] 참조) 둘 다를 사용하였다. 마우스 EGFRvIII으로부터 보유된 프레임워크 잔기는 박스 안의 볼드체/이탤릭체로 제시되고, CDR 잔기에는 밑줄이 그어져 있다.
도 9에 제시된 바와 같은 인간화 경쇄와 중쇄 서열을 근거로 하여, 총 8개의 프레임워크 조합물을 사용하여, 추가 검증을 위한 가용성 scFv를 생성시켰다. VL 도메인과 VH 도메인이 scFv 내에서 보여지는 순서는 다양하였고 (즉, VL-VH, 또는 VH-VL 배향), "G4S" 소단위 (서열 37)의 4개 카피 [여기서, 각 소단위는 서열 GGGGS (서열 37)를 포함한다]를 사용하여 상기 프레임워크를 연결시켰다. 도 9는 카바트 등 및 코티아 등 (상기 참조)에 의해 계산된 VH 서열과 VL 서열 내의 CDR을 개시한다.
클로닝 :
마우스 및 인간화 VL 도메인과 VH 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 수득하였고, 상기 구축물에 대한 코돈을, 호모 사피엔스 (Homo sapiens)로부터의 세포에서 발현하기 위해 최적화하였다.
VL 및 VH 도메인을 코딩하는 서열을, 포유동물 세포에서의 분비에 적합한 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 이러한 발현 벡터의 요소는 프로모터 [시토메갈로바이러스 (CMV) 증강인자-프로모터], 분비를 촉진시키기 위한 신호 서열, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결인자 [소의 성장 호르몬 (BGH) 유전자], 에피솜 복제와 원핵생물에서의 복제를 허용하는 요소 (예를 들어, SV40 기점 및 ColE1, 또는 당해 분야에 공지된 기타), 및 분비를 허용하는 요소 (앰피실린 내성 유전자 및 제오신 마커)를 포함한다.
실시예 6: 인간화 항- EGFRvIII 가용성 scFv 단편의 특성화
가용성 scFv 단편은 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 상기 언급된 바와 같이 생성하였다. 이들 가용성 scFv를 특성화 연구에 사용하여, scFv의 안정성, 세포 표면 발현 및 결합 특성을 조사하였다.
scFv 발현 및 정제
각 scFv 구축물의 형질감염을 위해, 대략 3e8개의 293F 세포를, 형질감염 시약으로서 PEI를 3:1 (PEI:DNA)의 비로 사용하여 100 ㎍의 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포를 37℃, 125 rpm, 8% CO2 하에 진탕 플라스크 내에서 100 ml EXPi293 발현 배지 (인비트로젠)에서 성장시켰다. 6일 후에 배양물을 수거하고, 이를 단백질 정제에 사용하였다.
3500 g 하에 20분 동안 침강시킴으로써 293F 세포를 수거하였다. 상등액을 수집하고, 이를 배큐캡(VacuCap)90 PF 필터 유닛 (w/0.8/0.2 ㎛ 슈퍼 막, PALL) 내로 여과시켰다. 대략 400 ㎕의 Ni-NTA 아가로즈 비드 [퀴아젠(Qiagen)]를 상등액에 가하였다. 혼합물을 회전시키고 4℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이를 정제 칼럼 상으로 부하하고, 20 mM 히스티딘을 수반한 세척 완충액으로 세척하였다. 단백질을 300 mM 히스티딘을 수반한 500 ㎕ 용출 완충액으로 용출시켰다. 샘플을 4℃ 하에 밤새 PBS 완충액에 대항하여 투석하였다. 나노드롭(nanodrop) 2000c를 이용하여 단백질 샘플을 정량화하였다.
인간 EGFR 야생형 또는 EGFRvIII을 발현하는 세포에 대한 정제된 scFv의 FACS 결합에 의한 EC 50
다음 실험을 수행하여, 모든 인간화 EGFRvIII scFv 변이체가 EGFRvIII에 대해서는 거의 동등한 수준의 결합성을 지니고 있지만, 야생형 EGFR과는 결합하지 않는다는 것을 입증하였다.
HEK293F 현탁 세포를 야생형 hEGFR 또는 hEGFRvIII으로 일시적으로 형질감염시키고, 형질감염시킨지 2일 후에 수거하였다. 웰당 대략 5e5개 세포를 BD 팔콘(Falcon) 96 웰 판으로 옮겼다. 세포를 900 rpm 하에 [소르발 레전드(Sorval Legend) XT 원심분리기] 3분 동안 침강시켰다. 상등액을 제거하였다. 항-EGFRvIII scFv 단백질 샘플을 5% FBS를 수반한 DPBS에 희석시켰다. 샘플을 상기 웰 내로 가하고, 혼합하며 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 5% FBS를 수반한 DPBS에서 2회 세척하였다. 세포를 항-폴리 His PE (R&D)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 2회 세척한 후 FACS 분석하였다 (BD 바이오사이언스로부터의 LSRII).
hEGFRvIII에 대한 마우스 scFv (m3C10)의 EC50은 도 10에 도시된 바와 같이 약 5 nM인 것으로 결정되었다. 모든 인간화 EGFRvIII scFv 변이체는 한 자릿수의 EC50 값 내지 낮은 두 자릿수 nM EC50 범위 (5 내지 50 nM)를 나타내었다. 더욱이, 야생형 EGFR 발현성 세포주에 대한 구축물 2173 및 2174의 인지할 만한 결합이 전혀 검출되지 않았는데, 이는 도 11에 도시된 바와 같이, 뮤린 3C10과 비교해서 개선된 안전성 프로파일을 표시한다. 이들 연구에 근거하여, 클론 2173이 실시예 8에 나타낸 바와 같이, 추가의 임상 특성화를 위해 선별되었다.
실시예 7: 인간화 EGFRvIII CAR 구축물
최종 CAR 구축물에 사용될 scFv는 실시예 1에 기재된 인간화 프레임워크 서열로부터 유래되었다. VL 도메인과 VH 도메인이 scFv 내에서 보여지는 순서는 다양하였다 (즉, VL-VH, 또는 VH-VL 배향). (G4S)4 (서열 113) 링커를 사용하여 가변 도메인을 연결시켜 표 1에 제시된 scFv를 창출하였다.
<표 1>
VH 및 VL 배향과 링커 길이를 나타내는 인간화 EGFRvIII scFv 구축물 (표는 서열 37로서 "G4S"를 개시한다)
Figure pct00032
인간화 scFv 단편의 서열은 다음 표 2에 제공된다 (서열 38, 서열 44, 서열 50, 서열 56, 서열 62, 서열 68, 서열 74, 및 서열 80). 이들 scFv 단편을 부가 서열인 서열 13 내지 17과 함께 사용하여, 서열 43, 서열 49, 서열 55, 서열 61, 서열 67, 서열 73, 서열 79, 및 서열 85를 수반하는 완전한 CAR 구축물을 생성하였다.
이들 클론은 모두, CD3제타 쇄로부터 유래된 공동자극 도메인의 신호 도메인 상의 Q/K 잔기 변화를 함유하였다.
<표 2>
인간화 EGFRvIII CAR 구축물
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
이어서, CAR scFv 단편을 렌티바이러스성 벡터 내로 클로닝하여 단일 코딩 프레임 내에서 및 발현용 EF1 알파 프로모터 (서열 97)를 이용하여 전장 CAR 구축물을 창출하였다.
EF1 알파 프로모터
Figure pct00056
CAR9 , CAR10 및 선별 인간화 EGFRvIII CAR 구축물의 표면 발현 및 FACS에 의한 염색
다음 실험은 Jurkat 세포와 일차 T 세포 둘 다에서 EGFRvIII 기반 시험관내 결합 연구에 대하여 친화성 차이가 있는 것으로 보인다는 것을 나타내었다.
Jurkat E6 세포를, 아막사 셀라인 뉴클레오펙터 키트 V (론자; 독일 쾰른 AG) 및 프로그램 X-001을 이용하여 CAR9 벡터 또는 CAR10 벡터로 전기천공시켰다. 형질감염시킨 그 다음 날, 0.5x106개 세포를 0.2 ml FACS 완충액 (5% FBS를 함유하는 DPBS 완충액)에서 V자형 96 웰 판 [그라이너 바이오-온 (Greiner Bio-One; 독일)]의 각 웰 내로 도말하고, 실온 하에 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 침강시키고, 상이한 농도의 EGFRvIII-Fc 또는 EGFRwt-Fc를 수반하는 0.2 ml의 FACS 완충액에 재현탁시키며, 4℃ 하에 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 FACS 완충액으로 3회 세척하고, 2 ㎕의 PE 항-인간 IgG Fc [잭슨 임뮤노리서치 라보라토리즈 (Jackson ImmunoResearch Laboratories; 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브)]를 수반하는 0.2 ml의 FACS 완충액과 함께 4℃ 암실에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 0.2 ml의 FACS 완충액으로 3회 세척한 후, FACSDiva 소프트웨어 (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세)를 이용하여 LSRII (BD 바이오사이언스; 미국 캘리포니아주 산호세) 기계 상에서 세포를 분석하였다. 면역형광 염색을 살아있는 세포의 상대적 log 형광으로서 분석하였고, PE 양성 세포의 비율(%)을 측정하였다.
도 12에 도시된 바와 같이, Jurkat 세포에서 발현된 CAR9의 EGFRvIII-Fc 융합 단백질에 대한 결합성은 야생형 EGFR-Fc에 대한 것 보다 대략 1,000배 정도 더 강력하다. 더욱이, CAR10을 발현하는 CART 구축물은 CAR9와 비교해서 EGFRvIII에 대한 결합성이 상당히 더 낮은 것으로 (대략 40배) 나타난다. 이는 뮤린 CAR9가 EGFRvIII과 결합하긴 하지만, 야생형 EGFR과도 여전히 일부 결합성을 보유하고 있다는 것을 제안한다. 더욱이, 이는 CAR9가 CAR10 구축물 보다 EGFRvIII에 대한 결합 친화성이 더 높다는 것을 강력하게 표시한다.
일차 T 세포에서의 추가 실험 결과, 유사한 결과가 산출되었다. 간략하게 언급하면, 일차 인간 CD3+ T 세포를 항-CD3/CD28 비드로 24시간 동안 자극한 다음, 3:1의 MOI로 CAR9, CAR10, CAR6 또는 대조군 CAR을 코딩하는 렌티바이러스성 벡터로 형질도입하였다. 본 실험에는 또한, 모의 형질도입된 T 세포 집단이 포함되었다. 이들 세포가 휴지기에 들어갈 때까지 배양물 중에서 약 8 내지 9일 동안 확장시켰다. 이 시점에서, 0.5x106개 세포를 V자형 96 웰 판의 각 웰 내로 도말하였다. 세포를 PBS로 1회 세척하고, 생/사 시약 (PBS 중의 1:1000)으로 얼음 상에서 30분 동안 염색하였다. 이어서, 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 1 ㎍/ml 바이오티닐화 EGFRvIII 또는 EGFR wt 단백질과 함께 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 세포를 2회 세척하고, 1:1000 희석도의 스트렙타비딘-PE를 수반한 0.2 ml의 FACS 완충액과 함께 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션하였다. FACS 완충액으로 2회 세척한 후, 세포를 LSRII 상에서 분석하였다. 면역형광 염색을 살아있는 세포의 상대적 log 형광으로서 분석하였고, PE 양성 세포의 비율(%)을, 양성 집단의 기하 평균과 연계해서 측정하였다.
도 13에 도시된 바와 같이, CAR9 및 CAR6 CAR는, 심지어 모든 구축물이 동등하게 형질도입되긴 하지만 (모두에 대한 형질도입 효율 약 50%), 포화량의 EGFRvIII 단백질이 검출을 위해 사용되는 경우에는, EGFRvIII 결합성에 대한 기하 평균이 CAR10 (단지 2K) 보다 10배 더 높은 것으로 나타났다 (CAR9의 경우에는 21K이고, CAR6의 경우에는 27K이다). 유사하게, EGFR wt 단백질에 대한 특이성은 약 10배 더 낮은데, 이는 EGFR wt 단백질로의 염색에 대한 아래쪽으로의 로그 이동으로써 도시된 바와 같다. 이는 CAR9 및 CAR6이 일차 T 세포에서 발현되는 경우에 CAR10과 비교해서 EGFRvIII 단백질에 대한 더 강력한 친화성을 지니고 있다는 것을 표시하고 이들이 임상에서 더 효과적이라는 것을 제안하는 상기 Jurkat 세포에서의 발견 내용을 부가로 뒷받침해준다.
인간화 CAR 구축물의 패널의 기능적 분석을 실시예 8에 기재되는 바와 같이 수행하였다.
실시예 8: T 세포에서 인간화 EGFRvIII -특이적 CAR 구축물의 분석
CAR 기술을 통하여 표적화 EGFRvIII의 실행 가능성을 평가하기 위하여, 인간화 EGFRvIII scFv 단편을 2가지 상이한 입체 배치로 CD3제타 쇄와 4-1BB 공동자극성 분자를 수반하는 렌티바이러스성 CAR 발현 벡터 내로 클로닝하였다. EGFRvIII+ 및 EGFR wt 표적에 반응하여 EGFRvIII CAR 형질도입된 T 세포의 이펙터 T 세포 반응의 양과 질에 근거하여 최적의 구축물을 선별한다. 이펙터 T 세포 반응은 세포성 확장, 증식, 증가, 시토카인 생성 및 표적 세포 사멸 또는 세포용해 활성 (탈과립화)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
재료 및 방법
CAR 기능의 초기 특성화를 위한 Jurkat 리포터 세포주의 생성
일차 T 세포 형질도입 및 활성화에 대한 대안으로서, Jurkat-NFAT 리포터 세포주를 사용하여 CAR 구축물의 기능적 활성을 평가할 수 있다. Jurkat T 세포주 (E6-1)를 NFAT-루시페라제 리포터 구축물로 형질감염시키고, PMA 및 이오노마이신 자극 후 NFAT 리포터의 강력한 유도에 근거하여 추가 특성화하기 위한 안정한 클로날 세포주 (JNL)를 선별하였다. 이러한 JNL 세포를 5:1의 MOI로 렌티바이러스성 벡터로 형질도입한 다음, 5 내지 7일 동안 확장시켰다. 검정에 사용하기 전, 형질도입된 세포의 비율(%) (세포 표면 상에 EGFRvIII CAR을 발현함) 및 이러한 세포의 발현의 상대적 형광 세기를, LSRII 상에서의 유동 세포계수 분석에 의해 결정한다. 히스토그램 플롯으로부터, 형질도입된 비율을 그들의 상대적 형광 세기와 비교함으로써, CAR의 상대적 발현 수준을 조사할 수 있다.
인간화 EGFRvIII -특이적 CAR JNL 세포의 T 세포 활성화를 평가한다
JNL 리포터 세포주에서 T 세포 활성화를 평가하기 위하여, JNL 또는 CAR-형질도입된 JNL 세포를 청정한 바닥이 있는 96 웰 블랙 판 내에 웰당 50,000개 세포로 도말한다. 표적 세포 (BHK 모 세포, 또는 EGFRvIIII 또는 EGFR wt를 발현하도록 조작된 BHK 세포)를 상기 웰에 가하여, 1:2, 1:1, 1:0.3, 1:0.1, 1:0.03, 1:0.01 및 1:0.003의 이펙터 대 표적 (E:T) 비를 창출한다. PMA 및 이오노마이신이 활성화를 위한 양성 대조군으로서 사용된다. 세포를 37℃ 하에 16 내지 24시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션이 끝날 무렵, 등 용적의 브라이트-글로(Bright-Glo) 루시페라제 검정 시약을 각 웰에 가한다. 상기 판을 실온 하에 10분 동안 인큐베이션한 다음, 발광계를 이용하여 발광을 측정한다.
재유도된 인간화 EGFRvIII -특이적 CAR T 세포의 생성
인간화 EGFRvIII-특이적 CAR 렌티바이러스성 전이 벡터를 사용하여, VSVg 가짜형 렌티바이러스성 입자 내로 패키지된 게놈 물질을 생성한다. 렌티바이러스성 전이 벡터 DNA를, VSVg의 3가지 패키징 성분인 gag/pol 및 rev와 혼합하여 (리포펙타민 시약과 조합된다), 이들을 함께 293T 세포 내로 형질감염시킨다. 24시간 및 48시간 후, 배지를 수집하고, 여과한 다음, 초원심분리 또는 크로마토그래피함으로써 농축시킨다. 이로써 생성되는 바이러스성 제제를 -80℃ 하에 저장한다. 형질도입되는 단위의 수는 SupT1 세포 상에서 적정함으로써 결정한다.
재유도된 EGFRvIII-특이적 CART 세포는, CD3x28 비드와 24시간 동안 맞물리게 함으로써 신선한 T 세포를 활성화시킨 다음, 적당한 수의 형질도입성 단위를 가하여 목적하는 비율의 형질도입된 T 세포를 수득함으로써 생성한다. 이들 변형된 T 세포가 휴지기에 들어가고 크기가 줄어들 때까지 (약 300 fl) (이때, 이들은 나중의 분석을 위해 냉동 보존된다) 상기 T 세포를 확장시킬 수 있다. 코울터 멀티사이저 III을 이용하여 세포 수와 크기를 측정한다. 냉동 보전하기 전에, 형질도입된 세포의 비율(%) (세포 표면 상에 EGFRvIII CAR을 발현함) 및 이러한 세포의 발현의 상대적 형광 세기를, LSRII 상에서의 유동 세포계수 분석에 의해 결정한다. 히스토그램 플롯으로부터, 형질도입된 비율을 그들의 상대적 형광 세기와 비교함으로써, CAR의 상대적 발현 수준을 조사할 수 있다.
인간화 EGFRvIII 재유도된 CAR T 세포의 세포용해 활성, 증식 능력 및 시토카인 분비를 평가한다
시토카인을 사멸, 증식 및 분비시킬 수 있는 인간화 EGFRvIII-특이적 CAR T 세포의 기능적 능력을 평가하기 위하여, 세포를 해동시키고 밤새 회복시켜 두었다. 상기 인간화 구축물 이외에도, 뮤린 CAR9를 비교 목적으로 사용한 반면, SS1-BBz는 배경 CAR/T 세포 효과에 대한 비-표적화 발현된 CAR로서 사용하였다. 이러한 유동 기반 세포독성 검정을 위해, 표적 세포를 CSFE로 염색하여 그들의 존재를 정량화한다. 표적 세포를 또한, EGFRvIII 발현을 알아보기 위하여 염색하여 유사한 표적 항원 수준을 확인하였다. EGFRvIII CAR T 세포의 세포용해 활성은 10:1, 3:1, 1:1, 0.3:1 및 0:1의 이펙터:표적 세포 비의 적정 하에 측정하는데, 여기서 이펙터는 항-EGFRvIII CAR을 발현하는 T 세포로서 정의되었다. 적당한 수의 T 세포를 일정한 수의 표적 세포와 혼합함으로써 검정을 개시하였다. 4 또는 16시간 후, 각 혼합물의 총 용적을 제거하고, 각 웰을 세척하였다. CD3을 알아보기 위하여 T 세포를 염색하고, 모든 세포는 생/사 마커 7AAD로 염색하였다. 최종 세척 후, 펠릿화 세포를, 미리 결정된 수의 계수성 비드를 수반한 특이적 용적으로 재현탁시켰다. 세포 염색 데이터를 LSRII 유동 세포측정법에 의해 수집하고, 결과를 정량화해주는 비드를 이용하여 플로우조(FlowJo) 소프트웨어로 분석하였다.
인간화 CAR-EGFRvIII T 세포의 세포 증식과 시토카인 생성을 측정하기 위하여, 세포를 해동시키고 밤새 회복시켜 두었다. 상기 인간화 CAR-EGFRvIII 이외에도, 뮤린 CAR9를 비교 목적으로 사용한 반면, SS1-BBz는 배경 CAR/T 세포 효과에 대한 비-표적화 발현된 CAR로서 사용하였다. T 세포는 EGFRvIII을 발현하거나 발현하지 않는 성상세포종-유래된 교모세포종 세포주인 U87에 대하여 유도된다. 또한, CD3x28 비드를 사용하여, 제2 라운드의 내인성 면역학적 신호에 반응하는 T 세포의 잠재력을 평가하였다. 증식을 분석하기 위하여, T 세포를 CSFE로 염색하였다. 증식으로 인해, CSFE 염색이 희석되었는데, 이는 부모의 표지가 지금 2개의 딸 세포로 분리되는 것을 반영한다. 검정은 1:1 및 1:0의 이펙터:표적 비 만을 시험하였는데, 이펙터는 통상의 비율로 항-EGFRvIII 키메라 수용체를 발현하도록 정규화된 총 T 세포 (CD4 및 8)로서 정의되었다. 검정은 세포를 혼합한지 24시간 후에 두 번 되풀이하여 수행하였다. 시토카인 생성을 위하여 상등액을 제거하였다. 5일 후, T 세포를 생/사 바이올렛 (인비트로젠)으로 생/사를 알아보기 위하여 염색한 다음, CAR 발현을 알아보기 위하여 염색하고 CD4 또는 CD8 세포로서 표현형 검사되었다. 최종 세척 후, 펠릿화 세포를, 미리 결정된 수의 BD 계수성 비드를 수반한 특이적 용적으로 재현탁시켰다. 세포 염색 데이터를 LSRII 유동 세포측정법에 의해 수집하고, 결과를 정량화해주는 비드를 이용하여 플로우조 소프트웨어로 분석하였다. 특이적 수의 비드를 기준을 하여 계수된 세포의 수에, 아직 계수되어야 할 비드의 분율을 곱함으로써 총 세포 계수치를 결정하였다.
결과
EGFRvIII 표적 세포를 인식할 수 있는 인간화 CART- EGFRvIII 세포의 능력을 시험하기 위한 Jurkat 리포터 검정
표적 맞물림 후 활성화를 유도시킬 수 있는 CART 구축물의 능력은 JNL 리포터 세포주를 이용하여 측정하였다. 이러한 JNL 세포주는 CAR의 표적 맞물림 후에 유도되는 NFAT-루시페라제 리포터 구축물로 조작한다. JNL 세포를 각종 CAR-EGFRvIII 구축물 (CAR9, CAR3, CAR6, CAR8 및 CAR10)로 형질도입하였다. 형질도입 효율은 유동 세포측정법에 의해 평가하였는데, 상기 구축물 모두에 대해 약 45 내지 52%인 것으로 밝혀졌다. 이어서, JNL-CAR-EGFRvIII 세포를 3가지 상이한 표적 세포 (BHK 모, BHK-EGFRvIII 또는 BHK-EGFR wt)를 이용하여 7개의 상이한 E:T 비로 자극하였다. JNL 모 세포, 및 대조군 CAR을 발현하는 JNL 세포가 부가 대조군으로서 포함되었다. 도 14에서의 결과는 상당한 표적 유도된 활성화가, 시험된 모든 구축물에 대하여 1:0.01 정도로 낮은 비에서 발생될 수 있다는 것을 보여주며, CAR6 및 CAR10은 보다 높은 E:T 비에서 가장 많은 활성화를 유도한다. EGFR wt 발현성 세포를 이용하거나 또는 대조군 CAR 발현성 JNL 세포에 의해서는 상당한 활성화가 전혀 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 EGFRvIII 표적에 대한 상기 CAR 구축물의 특이성과 EGFR wt 표적에 대한 교차-반응성의 결여를 명확하게 보여준다.
인간화 EGFRvIII CAR 구축물을 이용한 일차 인간 T 세포의 형질도입 및 확장
건강한 공여자로부터의 전혈 또는 성분채집술 생성물로부터 CD3+ T 세포를 수득하였다. 상기 언급된 바와 같이, T 세포를 CD3xCD28 비드로 24시간 동안 자극한 다음, 3의 MOI 하에 진한 렌티바이러스성 상등액으로 형질도입시킨다. 세포를 배양물 중에서 8 내지 10일 동안 확장시켰다.
인간화 EGFRvIII CAR들의 세포 표면 발현은 거의 동등한 수준이고, 그들의 발현 수준은 뮤린 CAR9와 매우 유사하다. 각 인간화 EGFRvIII-특이적 CAR 형질도입된 T 세포의 세포 표면 발현 염색 패턴을 플롯하는 히스토그램의 오버레이(overlay) 및 이들 프로파일로부터 계산된 평균 형광 세기 (MFI)는, 형질도입된 세포의 비율(%)과 매우 상관이 있다.
인간화 EGFRvIII CART 세포를 자극할 수 있는 EGFRvIII 표적 세포의 능력을 시험하기 위한 증식 검정
표적 맞물림에 반응하여 증식할 수 있는 EGFRvIII 특이적 CAR T 세포의 능력을 증식 검정에서 평가하였다. 유동 세포측정법에 의해 아집단을 계산하였다. 공여자 T 세포를 인간화 CAR, 뮤린 CAR9 또는 SS1 (메소텔린 표적화)로 형질도입하였다. CAR을 표적 세포와 1:1 또는 1:0으로 혼합하고, 5일 동안 공동-배양하였다. 도 15는 항원 특이적 방식으로 증식할 수 있는 ND407 EGFRvIII CAR T 세포의 능력을 도시한 것이다. 점선 막대는 시딩된 T 세포의 수를 표시하고, 비교적으로 말하자면, U87을 표적으로 하는 T 세포 수의 증가는 전혀 검출되지 않은 반면, U87-EGFRvIII과의 맞물림으로 인해, EGFRvIII CAR T 세포 집단에 대해 특이적인 증식이 유도되었다. ND407에 대하 상대적 반응은, CAR6 및 CAR8이 CAR9 또는 CAR3 보다 더 강력하다는 것을 표시하였다. CD3x28 비드의 결과는 그들의 자극이 활성화 제2 라운드 상에서 증식을 구동시키기에 충분하지 않았다는 것을 표시하는데, 이는 전혀 자극이 없는 것과 유사하다.
ND407 T 세포를 사용하여, CAR+ T 세포를 우선적으로 확장할 수 있는 그들의 능력을 알아보기 위하여 상이한 huEGFRvIII CAR들을 스크리닝하였다. 도 16은 CAR5 및 CAR6이 각 공여자에서 가장 강력한 CAR+ 확장을 일관되게 나타낸다는 것을 도시한 것이다. CAR+ 증가는 표적과의 성공적인 맞물림, 항원 인식의 활성화 유도된 세포 사멸의 증식 및 생존에 따른 결과이다.
EGFRvIII 표적 세포를 사멸시킬 수 있는 인간화 EGFRvIII CART 세포의 능력을 시험하기 위한 사멸 검정
표적을 사멸시킬 수 있는 EGFRvIII 특이적 CAR T 세포의 능력을 크롬 방출 검정에서 시험하였다. 인간 교모세포종 세포주인 U-87MG를 조작하여 EGFR 야생형 수용체 또는 EGFRvIII 돌연변이체를 발현시켰다. 이들 조작된 세포주는 사멸 검정을 위한 표적으로서 제공되었다. 다음 3개의 이펙터 CAR T 세포를 사용하여 표적 세포 사멸 특이성을 결정하였다: 1) 뮤린 3C10을 발현하도록 형질도입된 인간 T 세포 (CAR9), 2) 뮤린 3C10의 인간화 버전을 발현하도록 형질도입된 인간 T 세포 (CAR6으로서 지칭됨) 및 3) 메소텔린, SS1에 대해 특이적인 CAR로 형질도입된 인간 T 세포. 모든 이펙터 세포가 30% CAR+ 형질도입을 발현하도록 정규화시켰다. 표적 세포를 크롬-51로 표지시키고, 공동-배양 직전에 세척하였다. 이펙터와 표적을 표시된 비 (E:T) 하에 함께 혼합하고, 4시간 동안 인큐베이션하였다.
도 17(a)의 결과는 야생형 EGFR 수용체를 발현하는 U-87 세포와 혼합된 CAR T 세포가 50:1의 E:T 까지는 배경 이상의 세포 사멸을 전혀 나타내지 않았다는 것을 보여준다. 그러나, 도 17(b)의 결과는 이와는 달리, EGFRvIII을 발현하는 U-87 세포와 혼합된 EGFRvIII 특이적 CAR T 세포, CAR9 또는 CAR6이 6.25:1 내지 50:1 이하의 E:T 비에서 특이적 사멸을 나타냈다는 것을 보여준다. 메소텔린 특이적 CAR T 세포를 이펙터로서 사용한 경우에는 상당한 사멸이 전혀 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 CAR9 및 CAR6 T 세포에 의한, EGFRvIII을 발현하는 표적 세포의 표적 사멸에 대한 특이성을 명확하게 보여주지만, 야생형 EGFR을 발현하는 세포의 사멸에 대해서는 그렇지 않거나 또는 비-특이적 CAR T 세포, SS1에 의해서도 그렇지 않다.
항-종양 반응을 증진시키고 특이성을 명확하게 보여줄 수 있는 인간화 EGFRvIII CART 세포의 능력을 시험하기 위한 시토카인 검정
표적 맞물림에 반응하여 시토카인을 유도시킬 수 있는 EGFRvIII 특이적 CAR T 세포의 능력을 공동-배양 검정에서 평가하였다. CAR T 세포를 각종 표적:이펙터 비 (0.3:1, 1:1, 3:1 및 10:1) 하에 18 내지 24시간 동안 표적 발현성 세포와 함께 공동-배양하였다. 표적 세포는 EGFR wt 내인성 단백질을 발현하는 U87 세포 (U87 wt), EGFRvIII을 과발현하는 U87 세포 (U87-vIII), BHK (어린 햄스터 신장 세포) 모 세포, 인간 EGFR wt 단백질을 과발현하는 BHK 세포 (BHK wt), 또는 인간 EGFRvIII 단백질을 과발현하는 BHK 세포 (BHK-vIII)를 포함하였다. 18 내지 24시간 후, 배양물로부터 상등액을 제거하고, 세포계수 비드 검정 (CBA)을 이용하여 시토카인을 분석하였다. 그 결과는 1) CAR6 및 CAR9 T 세포가 EGFRvIII-발현성 세포에 반응하여 유사한 수준의 IFNg를 유도시켰고, 2) 어떠한 CAR T 세포 집단도 EGFR wt 발현성 세포에 반응해서는 IFNg를 유도시키지 못하였다는 것을 명백하게 입증해준다. 중요하게도, 이들 데이터는 상기 사멸 및 증식 데이터와 함께, CAR6 및 CAR9가 EGFRvIII에 대한 기능적 특이성을 나타내고 항-종양 면역 반응을 증진시킬 수 있는 능력을 지니고 있다는 것을 표시한다.
실시예 9: 인간화 항- EGFRvIII CART 세포는 마우스에서의 종양 조직량을 감소시킨다
인간화 항-EGFRvIII CAR T 세포는 마우스 내의 생체내에서 종양 조직량을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, #2173 (CAR6) 인간화 항-EGFRvIII 키메라 항원 수용체 (CAR) 렌티바이러스적으로 형질도입된 인간 T 림프구를, 생체내에서 확립된 U87vIII 신경교종 종양으로 처리된 이종 면역기능저하 NOD/SCID/공통-감마 쇄-/- 마우스에 정맥내 전달하였다. 공여자-매칭된 비-CAR 형질도입된 T 세포의 종양이 투여된, 5일 확립된 U87vIII 피하 옆구리 종양이 있는 대조군 마우스는, 캘리퍼를 이용하는 직접적인 피하 종양 측정에 의해서 (최대 길이 x 최대 폭) 그리고 스펙트럼 생체내 영상화 시스템 (IVIS)에 의해 측정된 광자 방출에 의해서 신속하게 성장하였다. 심지어 적은 수 (0.5 내지 1 x 106개)의 CAR6 형질도입된 세포가 투여 처리된 마우스에서도, 종양 성장이 용량 의존적 방식으로 마우스에서 현저하게 저하되었다.
본 실시예에서는, EGFRvIII, GFP+Luc+를 발현하는 1 x 106개 U87vIII 인간 신경교종을 세척하고, 이를 100 ㎕ 식염수 중에서 30마리의 NSG 면역기능저하 마우스 (N = 군당 10마리)의 옆구리에 피하 주사하였다. 인간 T 세포를 항-CD3/28 코팅된 비드로 자극하고, 인간화 EGFRvIII CAR scFv #2173 (CAR6)으로 렌티바이러스적으로 형질도입하였다. 형질도입, 생체외 확장 및 비드 제거 후, CAR 형질도입된 T 세포 (유동 세포측정법에 의한 약 50% CAR+)를 세척하고, 종양 이식한지 5일 후에 꼬리 정맥을 통하여 100 ㎕ 식염수 중에서 주사하였다. 종양 성장을 캘리퍼 측정 (상단 좌측) 및 루시페린-유도된 광자 방출 (상단 우측)에 의해 평가하였다. T 세포 전이한지 7일 후 및 종양 주사한지 12일 후에 측정을 시작하였다. SEM이 도 18에 제시되어 있다 (N = 군당 10마리 마우스). 각 군의 생존율을 도 18에서 카플란 마이어 곡선으로써 플롯한다 (하단). 대조군 T 세포가 투여된 모든 마우스는 26일경에 사망하였고, 0.5 x 106개 및 1.0 x 106개 CAR6 T-세포가 투여된 군은 실험 30일자로, 각각 30% 및 90%가 생존하였다.
등가
본원에 인용된 각각의 및 모든 특허, 특허 출원 및 공개문헌의 개시내용은 그들의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본 발명이 구체적 측면을 참조로 하여 개시되긴 하였지만, 본 발명의 다른 측면 및 변동이 본 발명의 진정한 요지 및 범위를 벗어나지 않고서도 통상의 기술자에게 권장될 수 있다는 것은 명백하다. 첨부된 청구범위는 상기 측면과 등가 변동 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA UNIVERSITY OF PITTSBURGH - OF THE COMMONWEALTH SYSTEM OF HIGHER EDUCATION <120> TREATMENT OF CANCER USING HUMANIZED ANTI-EGFRVIII CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR <130> N2067-7000WO <140> <141> <150> 61/888,255 <151> 2013-10-08 <150> 61/767,071 <151> 2013-02-20 <160> 127 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 535 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gly Ser Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala 20 25 30 Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Gly Ser 35 40 45 Gly Phe Asn Ile Glu Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Thr 50 55 60 Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu 65 70 75 80 Thr Lys Tyr Gly Pro Ile Phe Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp 85 90 95 Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr Leu Gln 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of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 85 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu 20 25 30 Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln 35 40 45 Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln 50 55 60 Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys Leu 65 70 75 80 Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser 145 150 155 160 Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys 165 170 175 Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Gln Gln 180 185 190 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 92 gatatccaaa tgactcagag cccttcatcc ctgagcgcca gcgtcggaga cagggtgacc 60 atcacgtgcc gggcatccca aggcattaga aataacttgg cgtggtatca gcaaaaacca 120 ggaaaggccc cgaagcgcct gatctacgcg gcctccaacc ttcagtcagg agtgccctcg 180 cgcttcaccg ggagcggtag cggaactgag tttaccctta tcgtgtcgtc cctgcagcca 240 gaggacttcg cgacctacta ctgcctccag catcactcgt acccgttgac ttcgggaggc 300 ggaaccaagg tcgaaatcaa acgcactggc tcgacgtcag ggtccggtaa accgggatcg 360 ggagaaggat cggaagtcca agtgctggag agcggaggcg gactcgtgca acctggcggg 420 tcgctgcggc tcagctgtgc cgcgtcgggt tttactttca gctcgtacgc tatgtcatgg 480 gtgcggcagg ctccgggaaa ggggctggaa tgggtgtccg ctatttccgg ctcgggtgga 540 agcaccaatt acgccgactc cgtgaaggga cgcttcacca tctcacggga taactccaag 600 aatactctgt acctccagat gaactcgctg agagccgagg acaccgcagt gtactactgc 660 gcagggtcaa gcggctggtc cgaatactgg ggacagggca ccctcgtcac tgtcagctcc 720 <210> 93 <211> 807 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 93 atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60 cccgatatcc aaatgactca gagcccttca tccctgagcg ccagcgtcgg agacagggtg 120 accatcacgt gccgggcatc ccaaggcatt agaaataact tggcgtggta tcagcaaaaa 180 ccaggaaagg ccccgaagcg cctgatctac gcggcctcca accttcagtc aggagtgccc 240 tcgcgcttca ccgggagcgg tagcggaact gagtttaccc ttatcgtgtc gtccctgcag 300 ccagaggact tcgcgaccta ctactgcctc cagcatcact cgtacccgtt gacttcggga 360 ggcggaacca aggtcgaaat caaacgcact ggctcgacgt cagggtccgg taaaccggga 420 tcgggagaag gatcggaagt ccaagtgctg gagagcggag gcggactcgt gcaacctggc 480 gggtcgctgc ggctcagctg tgccgcgtcg ggttttactt tcagctcgta cgctatgtca 540 tgggtgcggc aggctccggg aaaggggctg gaatgggtgt ccgctatttc cggctcgggt 600 ggaagcacca attacgccga ctccgtgaag ggacgcttca ccatctcacg ggataactcc 660 aagaatactc tgtacctcca gatgaactcg ctgagagccg aggacaccgc agtgtactac 720 tgcgcagggt caagcggctg gtccgaatac tggggacagg gcaccctcgt cactgtcagc 780 tcccatcacc atcaccacca ccatcac 807 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300 tacaagtgta aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaag 360 gccaagggcc agcctcggga gccccaggtg tacaccctgc cccctagcca agaggagatg 420 accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 480 gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540 gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag 600 gagggcaacg tctttagctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660 aagagcctga gcctgtccct gggcaagatg 690 <210> 106 <211> 282 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 106 Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala 1 5 10 15 Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala 20 25 30 Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys 35 40 45 Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro 50 55 60 Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln 65 70 75 80 Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly 85 90 95 Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val 100 105 110 Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly 115 120 125 Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn 130 135 140 Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro 145 150 155 160 Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys 165 170 175 Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser 180 185 190 Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu 195 200 205 Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro 210 215 220 Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser 225 230 235 240 Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr 245 250 255 Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg 260 265 270 Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His 275 280 <210> 107 <211> 847 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 107 aggtggcccg aaagtcccaa ggcccaggca tctagtgttc ctactgcaca gccccaggca 60 gaaggcagcc tagccaaagc tactactgca cctgccacta cgcgcaatac tggccgtggc 120 ggggaggaga agaaaaagga gaaagagaaa gaagaacagg aagagaggga gaccaagacc 180 cctgaatgtc catcccatac ccagccgctg ggcgtctatc tcttgactcc cgcagtacag 240 gacttgtggc ttagagataa ggccaccttt acatgtttcg tcgtgggctc tgacctgaag 300 gatgcccatt tgacttggga ggttgccgga aaggtaccca cagggggggt tgaggaaggg 360 ttgctggagc gccattccaa tggctctcag agccagcact caagactcac ccttccgaga 420 tccctgtgga acgccgggac ctctgtcaca tgtactctaa atcatcctag cctgccccca 480 cagcgtctga tggcccttag agagccagcc gcccaggcac cagttaagct tagcctgaat 540 ctgctcgcca gtagtgatcc cccagaggcc gccagctggc tcttatgcga agtgtccggc 600 tttagcccgc ccaacatctt gctcatgtgg ctggaggacc agcgagaagt gaacaccagc 660 ggcttcgctc cagcccggcc cccaccccag ccgggttcta ccacattctg ggcctggagt 720 gtcttaaggg tcccagcacc acctagcccc cagccagcca 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for variant positions" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 111 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 111 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 150 <210> 112 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 112 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 113 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 113 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 114 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 114 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 115 <211> 5000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5000) <223> /note="This sequence may encompass between 50 and 5,000 nucleotides" <220> <221> variation <222> (51)..(5000) <223> /replace=" " <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5000) <223> /note="Variant bases given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5000) <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 115 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5000 <210> 116 <211> 2000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2000) <223> /note="This sequence may encompass between 50 and 2,000 nucleotides" <220> <221> variation <222> (51)..(2000) <223> /replace=" " <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2000) <223> /note="Variant bases given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 116 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2000 <210> 117 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 117 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 420 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 480 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 540 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 600 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 660 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 720 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 780 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 840 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 900 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 960 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1020 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1080 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1140 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1200 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1260 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1320 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1380 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1440 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1500 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1560 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1620 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1680 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1740 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1800 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1860 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1920 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 1980 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2040 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2100 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2160 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2220 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2280 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2340 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2400 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2460 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2520 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2580 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2640 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2700 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2760 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2820 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2880 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 2940 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3000 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3060 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3120 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3180 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3240 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3300 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3360 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3420 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3480 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3540 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3600 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3660 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3720 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3780 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3840 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3900 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3960 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4020 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4080 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4140 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4200 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4260 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4320 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4380 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4440 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4500 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4560 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4620 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4680 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4740 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4800 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4860 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4920 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 4980 tttttttttt tttttttttt 5000 <210> 119 <211> 5000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5000) <223> /note="This sequence may encompass between 100 and 5,000 nucleotides" <220> <221> variation <222> (101)..(5000) <223> /replace=" " <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5000) <223> /note="Variant bases given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant 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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2220 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2280 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2340 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2400 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2460 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2520 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2580 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2700 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2760 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2820 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2880 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2940 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3420 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3480 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4620 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4980 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5000 <210> 120 <211> 400 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(400) <223> /note="This sequence may encompass between 100 and 400 nucleotides" <220> <221> variation <222> (101)..(400) <223> /replace=" " <220> <221> misc_feature <222> (1)..(400) <223> /note="Variant bases given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(400) <223> /note="See specification as filed for detailed description of substitutions and preferred embodiments" <400> 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 400 <210> 121 <211> 487 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 121 Met Val Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Ile Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ile Ile Ile Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Arg Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile 85 90 95 Val Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln 100 105 110 His His Ser Tyr Pro Leu Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Phe Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu 130 135 140 Gly Ser Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 145 150 155 160 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 165 170 175 Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 180 185 190 Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp 195 200 205 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 210 215 220 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 225 230 235 240 Tyr Cys Ala Gly Ser Ser Gly Trp Ser Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 245 250 255 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 260 265 270 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 275 280 285 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 290 295 300 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 305 310 315 320 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly 325 330 335 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 340 345 350 Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 355 360 365 Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 370 375 380 Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 385 390 395 400 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 405 410 415 Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 420 425 430 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 435 440 445 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 450 455 460 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 465 470 475 480 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 122 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 122 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Thr Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr Gly Pro Ile Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Pro Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 123 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 123 Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Asp Glu Thr Lys Tyr Gly Pro Ile Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Phe Arg Gly Gly Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 124 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 124 Glu Ile Gln Leu 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Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Ser Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Gly Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

Claims (98)

  1. 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 단리된 핵산 분자이며, 여기서 상기 CAR은 항-EGFRvIII 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 자극 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 여기서 상기 항-EGFRvIII 결합 도메인은 표 2 또는 서열 11에 열거된 임의의 항-EGFRvIII 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2) 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3) 중 하나 이상, 및 표 2 또는 서열 11에 열거된 임의의 항-EGFRvIII 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2) 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3) 중 하나 이상을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 표 2 또는 서열 11에 열거된 임의의 항-EGFRvIII 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, 표 2 또는 서열 11에 열거된 임의의 항-EGFRvIII 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, 표 2 또는 서열 11에 열거된 임의의 항-EGFRvIII 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3, 및 표 2 또는 서열 11에 열거된 임의의 항-EGFRvIII 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서, 표 2 또는 서열 11에 열거된 임의의 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  6. 제1항에 있어서, 표 2 또는 서열 11에 열거된 임의의 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  7. 제1항에 있어서, 표 2 또는 서열 11에 열거된 임의의 경쇄 가변 영역 및 표 2 또는 서열 11에 열거된 임의의 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, EGFRvIII 결합 도메인이 scFv인 단리된 핵산 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 표 2 또는 서열 11에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 내지 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 2 또는 서열 11에 제공된 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 표 2 또는 서열 11에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 내지 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 2 또는 서열 11에 제공된 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFRvIII 결합 도메인이 서열 38, 서열 44, 서열 50, 서열 56, 서열 62, 서열 68, 서열 74, 서열 80 및 서열 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFRvIII 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열이 서열 39, 서열 45, 서열 51, 서열 57, 서열 63, 서열 69, 서열 75, 서열 81 및 서열 98로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 CAR이 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인을 포함하는 막횡단 도메인을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 막횡단 도메인이 서열 15의 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 막횡단 도메인이 서열 15의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 내지 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형을 포함하는 아미노산 서열, 또는 서열 15의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 막횡단 도메인을 코딩하는 핵산 서열이 서열 8의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 항-EGFRvIII 결합 도메인이 힌지 영역에 의해 막횡단 도메인과 연결되는 것인 단리된 핵산 분자.
  18. 제17항에 있어서, 코딩된 힌지 영역이 서열 14, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  19. 제17항에 있어서, 힌지 영역을 코딩하는 핵산 서열이 서열 7의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 공동자극 도메인을 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 단리된 핵산 분자.
  21. 제20항에 있어서, 코딩된 공동자극 도메인이 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 코딩된 공동자극 도메인이 서열 16의 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  23. 제20항 또는 제21항에 있어서, 코딩된 공동자극 도메인이 서열 16의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 (예를 들어, 치환) 내지 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 서열 16의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  24. 제20항 또는 제21항에 있어서, 공동자극 도메인을 코딩하는 핵산 서열이 서열 9의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 단리된 핵산 분자.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인이 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인이 서열 16의 서열 및/또는 서열 17 또는 서열 99의 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 서열 16의 아미노산 서열 및/또는 서열 17 또는 서열 99의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 내지 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 16의 아미노산 서열 및/또는 서열 17 또는 서열 99의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 세포내 신호전달 도메인이 서열 16의 서열 및 서열 17 또는 서열 99의 서열을 포함하며, 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열이 동일 프레임 내에서 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현되는 것인 단리된 핵산 분자.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 핵산 서열이 서열 9의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열, 및/또는 서열 10 또는 서열 100의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 리더 서열을 추가로 포함하는 단리된 핵산 분자.
  32. 제31항에 있어서, 리더 서열이 서열 13을 포함하는 것인 단리된 핵산 분자.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 핵산 분자에 의해 코딩된 단리된 폴리펩티드 분자.
  34. 제33항에 있어서, 서열 43, 서열 49, 서열 55, 서열 61, 서열 67, 서열 73, 서열 79, 서열 85 및 서열 90으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드 분자.
  35. 제34항에 있어서, 서열 73의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드 분자.
  36. 제34항에 있어서, 서열 79의 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드 분자.
  37. 항-EGFRvIII 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 단리된 키메라 항원 수용체 (CAR) 분자.
  38. 제37항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 공동자극 도메인 및/또는 일차 신호전달 도메인을 포함하는 것인 단리된 CAR 분자.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 항-EGFRvIII 결합 도메인이 항-EGFRvIII 결합 도메인을 포함하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 것인 단리된 CAR 분자.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFRvIII 결합 도메인이 표 2 또는 서열 11에 열거된 임의의 항-EGFRvIII 결합 도메인의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2) 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3) 중 하나 이상, 및 표 2 또는 서열 11에 열거된 임의의 항-EGFRvIII 결합 도메인의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2) 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3) 중 하나 이상을 포함하는 것인 단리된 CAR 분자.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 표 2 또는 서열 11에 열거된 임의의 항-EGFRvIII 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3을 포함하는 단리된 CAR 분자.
  42. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 표 2 또는 서열 11에 열거된 임의의 항-EGFRvIII 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 단리된 CAR 분자.
  43. 제37항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 표 2 또는 서열 11에 열거된 임의의 항-EGFRvIII 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3, 및 표 2 또는 서열 11에 열거된 임의의 항-EGFRvIII 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 단리된 CAR 분자.
  44. 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFRvIII 결합 도메인이 scFv인 단리된 CAR 분자.
  45. 제37항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFRvIII 결합 도메인이 표 2 또는 서열 11에 열거된 아미노산 서열의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 것인 단리된 CAR 분자.
  46. 제37항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFRvIII 결합 도메인이 표 2 또는 서열 11에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 내지 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 2 또는 서열 11에 제공된 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 단리된 CAR 분자.
  47. 제37항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFRvIII 결합 도메인이 표 2 또는 서열 11에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 내지 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 표 2 또는 서열 11에 제공된 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것인 단리된 CAR 분자.
  48. 제37항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFRvIII 결합 도메인이 서열 38, 서열 44, 서열 50, 서열 56, 서열 62, 서열 68, 서열 74, 서열 80 및 서열 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 CAR 분자.
  49. 제37항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인을 추가로 포함하는 단리된 CAR 분자.
  50. 제49항에 있어서, 막횡단 도메인이 서열 15의 서열을 포함하는 것인 단리된 CAR 분자.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 막횡단 도메인이 서열 15의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 내지 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 15의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 CAR 분자.
  52. 제37항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFRvIII 결합 도메인이 힌지 영역에 의해 막횡단 도메인과 연결되는 것인 단리된 CAR 분자.
  53. 제52항에 있어서, 코딩된 힌지 영역이 서열 14, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 CAR 분자.
  54. 제37항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 공동자극 도메인을 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 단리된 CAR 분자.
  55. 제54항에 있어서, 공동자극 도메인이 OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 것인 단리된 CAR 분자.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 공동자극 도메인이 서열 16의 서열을 포함하는 것인 단리된 CAR 분자.
  57. 제54항 또는 제55항에 있어서, 공동자극 도메인이 서열 16의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 내지 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 16의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 CAR 분자.
  58. 제37항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인을 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 단리된 CAR 분자.
  59. 제58항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인 및/또는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인을 포함하는 것인 단리된 CAR 분자.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 서열 16의 서열 및/또는 서열 17의 서열을 포함하는 것인 단리된 CAR 분자.
  61. 제58항 또는 제59항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 서열 16의 서열 및/또는 서열 99의 서열을 포함하는 것인 단리된 CAR 분자.
  62. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 서열 16의 아미노산 서열 및/또는 서열 17 또는 서열 99의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 내지 20개, 10개 또는 5개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 16의 아미노산 서열 및/또는 서열 17 또는 서열 99의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 CAR 분자.
  63. 제58항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내 신호전달 도메인이 서열 16의 서열 및 서열 17 또는 서열 99의 서열을 포함하며, 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열이 동일 프레임 내에서 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현되는 것인 단리된 CAR 분자.
  64. 제37항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 리더 서열을 추가로 포함하는 단리된 CAR 분자.
  65. 제64항에 있어서, 리더 서열이 서열 13의 아미노산 서열, 또는 서열 13의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 CAR 분자.
  66. 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80 내의 항-EGFRvIII 결합 도메인의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC CDR1), 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LC CDR2) 및 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LC CDR3) 중 하나 이상, 및 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80 내의 항-EGFRvIII 결합 도메인의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC CDR1), 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HC CDR2) 및 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HC CDR3) 중 하나 이상을 포함하는 항-EGFRvIII 결합 도메인.
  67. 제66항에 있어서, 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80 내의 항-EGFRvIII 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3을 포함하는 항-EGFRvIII 결합 도메인.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80 내의 항-EGFRvIII 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 항-EGFRvIII 결합 도메인.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80 내의 항-EGFRvIII 경쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 LC CDR1, LC CDR2 및 LC CDR3, 및 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80 내의 항-EGFRvIII 중쇄 결합 도메인 아미노산 서열의 HC CDR1, HC CDR2 및 HC CDR3을 포함하는 항-EGFRvIII 결합 도메인.
  70. 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 표 2 내의 경쇄 가변 영역 및 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80 내의 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-EGFRvIII 결합 도메인.
  71. 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80에 제공된 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 내지 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80 내의 아미노산 서열과 95-99% 동일성을 갖는 서열; 및/또는 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80에 제공된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 1개, 2개 또는 3개 이상의 변형 내지 30개, 20개 또는 10개 이하의 변형을 갖는 아미노산 서열, 또는 서열 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74 또는 80 내의 아미노산 서열에 대해 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-EGFRvIII 결합 도메인.
  72. 제66항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 38, 서열 44, 서열 50, 서열 56, 서열 62, 서열 68, 서열 74, 서열 80 및 서열 86으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 또는 그의 95-99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항-EGFRvIII 결합 도메인.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 CAR을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  74. 제73항에 있어서, DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 벡터.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 프로모터를 추가로 포함하는 벡터.
  76. 제75항에 있어서, 프로모터가 EF-1 프로모터인 벡터.
  77. 제76항에 있어서, EF-1 프로모터가 서열 97의 서열을 포함하는 것인 벡터.
  78. 제73항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 전사된 벡터인 벡터.
  79. 제73항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 내의 핵산 서열이 폴리(A) 꼬리를 추가로 포함하는 것인 벡터.
  80. 제73항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 내의 핵산 서열이 3' UTR을 추가로 포함하는 것인 벡터.
  81. 제73항 내지 제80항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포.
  82. 제81항에 있어서, T 세포인 세포.
  83. 제82항에 있어서, T 세포가 CD8+ T 세포인 세포.
  84. 제81항 또는 제82항에 있어서, 인간 세포인 세포.
  85. T 세포를 제73항 내지 제80항 중 어느 한 항의 벡터로 형질도입시키는 것을 포함하는, 세포를 제조하는 방법.
  86. 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 세포 내로 도입하는 것을 포함하며, 여기서 RNA는 본원에 기재된 CAR 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 것인, RNA-조작된 세포 집단을 생성시키는 방법.
  87. 포유동물에게 제37항 내지 제65항 중 어느 한 항의 CAR 분자를 발현하는 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에 항-종양 면역을 제공하는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 세포가 자가 T 세포인 방법.
  89. 제87항 또는 제88항에 있어서, 세포가 동종 T 세포인 방법.
  90. 제87항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
  91. EGFRvIII의 발현과 연관된 질환이 있는 포유동물에게 제37항 내지 제65항 중 어느 한 항의 CAR 분자를 발현하는 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물을 치료하는 방법.
  92. 제91항에 있어서, EGFRvIII과 연관된 질환이 교모세포종인 방법.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, EGFRvIII과 연관된 질환이 다형성 교모세포종 (GBM), 역형성 성상세포종, 거대 세포 교모세포종, 신경교육종, 역형성 핍지교종, 역형성 상의세포종, 맥락총 암종, 역형성 신경절교종, 송과체모세포종, 수질상피종, 상의모세포종, 수모세포종, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 비정형 기형양/횡문근양 종양, 폐암 (예를 들어, 비소세포 폐 암종), 유방 암종, 전립선 암종, 난소 암종, 결장직장 암종 및 방광 암종, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암, 및 상기 암 중 어느 것의 전이인 방법.
  94. 제91항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 분자를 발현하는 세포가 CAR 분자를 발현하는 세포의 효능을 증가시키는 작용제와 조합되어 투여되는 것인 방법.
  95. 제91항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 분자를 발현하는 세포가 CAR 분자를 발현하는 세포의 투여와 연관된 하나 이상의 부작용을 완화시키는 작용제와 조합되어 투여되는 것인 방법.
  96. 제91항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 분자를 발현하는 세포가 EGFRvIII과 연관된 질환을 치료하는 작용제와 조합되어 투여되는 것인 방법.
  97. 의약으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자, 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항의 단리된 폴리펩티드 분자, 제37항 내지 제65항 중 어느 한 항의 단리된 CAR, 제66항 내지 제72항 중 어느 한 항의 항-EGFRvIII 결합 도메인, 제73항 내지 제80항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제81항 내지 제84항 중 어느 한 항의 세포.
  98. EGFRvIII를 발현하는 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 분자, 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항의 단리된 폴리펩티드 분자, 제37항 내지 제65항 중 어느 한 항의 단리된 CAR, 제66항 내지 제72항 중 어느 한 항의 항-EGFRvIII 결합 도메인, 제73항 내지 제80항 중 어느 한 항의 벡터 또는 제81항 내지 제84항 중 어느 한 항의 세포.
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US61/888,255 2013-10-08
PCT/US2014/017364 WO2014130657A1 (en) 2013-02-20 2014-02-20 Treatment of cancer using humanized anti-egfrviii chimeric antigen receptor

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018124766A3 (ko) * 2016-12-28 2018-12-13 주식회사 녹십자랩셀 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 자연 살해 세포
US11649294B2 (en) 2017-11-14 2023-05-16 GC Cell Corporation Anti-HER2 antibody or antigen-binding fragment thereof, and chimeric antigen receptor comprising same

Families Citing this family (202)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3084919A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for generating a persisting population of t cells useful for the treatment of cancer
CN105358576B (zh) 2013-02-20 2020-05-05 诺华股份有限公司 使用人源化抗EGFRvIII嵌合抗原受体治疗癌症
WO2014130635A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-cd123 chimeric antigen receptor engineered t cells
US9745368B2 (en) 2013-03-15 2017-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
US10676528B2 (en) * 2013-12-06 2020-06-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Thymic stromal lymphopoietin receptor-specific chimeric antigen receptors and methods using same
JP6779785B2 (ja) 2013-12-19 2020-11-04 ノバルティス アーゲー ヒトメソテリンキメラ抗原受容体およびその使用
EP3087101B1 (en) 2013-12-20 2024-06-05 Novartis AG Regulatable chimeric antigen receptor
EP3097117B1 (en) * 2014-01-21 2023-10-04 Novartis Ag Enhanced antigen presenting ability of car t cells by co-introduction of costimulatory molecules
US10189908B2 (en) 2014-02-05 2019-01-29 The University Of Chicago Chimeric antigen receptors recognizing cancer-specific TN glycopeptide variants
CN106132423B (zh) * 2014-02-14 2020-07-31 贝里坤制药股份有限公司 用诱导型嵌合多肽活化t细胞的方法
EP3126006A1 (en) 2014-03-21 2017-02-08 AbbVie Inc. Anti-egfr antibodies and antibody drug conjugates
LT3129470T (lt) 2014-04-07 2021-07-12 Novartis Ag Vėžio gydymas naudojant anti-cd19 chimerinį antigeno receptorių
KR102594343B1 (ko) 2014-07-21 2023-10-26 노파르티스 아게 Cd33 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
RU2751660C2 (ru) 2014-07-21 2021-07-15 Новартис Аг Лечение злокачественного новообразования с использованием гуманизированного химерного антигенного рецептора против всма
AR101829A1 (es) 2014-07-21 2017-01-18 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno cll-1
JP2017522884A (ja) * 2014-07-29 2017-08-17 ファイザー・インク がん免疫療法のためのＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的キメラ抗原受容体
EP3174546B1 (en) 2014-07-31 2019-10-30 Novartis AG Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
EP3183268B1 (en) 2014-08-19 2020-02-12 Novartis AG Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
ES2913865T3 (es) 2014-08-28 2022-06-06 Bioatla Inc Receptores de antígeno quimérico condicionalmente activos para células T modificadas
US11111288B2 (en) 2014-08-28 2021-09-07 Bioatla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
EP3189148A4 (en) 2014-09-02 2018-05-02 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Costimulation of chimeric antigen receptors by myd88 and cd40 polypeptides
ES2777305T3 (es) 2014-09-04 2020-08-04 Cellectis Receptores de antígeno quiméricos específicos de la glicoproteína trofoblástica (5T4, TPBG) para inmunoterapia contra el cáncer
PL3194443T3 (pl) 2014-09-17 2022-01-31 Novartis Ag Nakierowywanie komórek cytotoksycznych za pośrednictwem receptorów chimerycznych do immunoterapii adoptywnej
CA2963935A1 (en) 2014-10-08 2016-04-14 Novartis Ag Biomarkers predictive of therapeutic responsiveness to chimeric antigen receptor therapy and uses thereof
RU2021118125A (ru) 2014-12-29 2022-04-06 Новартис Аг Способы получения экспрессирующих химерный антигенный рецептор клеток
US20180271853A1 (en) * 2015-01-09 2018-09-27 Metastat, Inc. Method of Use for Inhibitors of Epidermal Growth Factor Receptor Variant III
US11459390B2 (en) 2015-01-16 2022-10-04 Novartis Ag Phosphoglycerate kinase 1 (PGK) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
JP6912386B2 (ja) 2015-01-26 2021-08-04 ザ ユニバーシティー オブ シカゴ 癌特異的なＩＬ１３Ｒα２を認識するＣＡＲ Ｔ細胞
US10308719B2 (en) 2015-01-26 2019-06-04 The University Of Chicago IL13Rα2 binding agents and use thereof in cancer treatment
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
US20160228547A1 (en) * 2015-02-06 2016-08-11 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor targeting of tumor endothelium
MY193968A (en) * 2015-02-12 2022-11-03 Beyondspring Pharmaceuticals Inc Use of plinabulin in combination with immune checkpoint inhibitors
JP6769982B2 (ja) 2015-03-06 2020-10-14 ビヨンドスプリング ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ｒａｓ変異と関連するがんの治療方法
LT3280729T (lt) 2015-04-08 2022-08-10 Novartis Ag Terapijos cd20, terapijos cd22 ir kombinuotos terapijos su cd19 chimerinį antigeno receptorių (car) ekspresuojančia ląstele
JP7114457B2 (ja) 2015-04-17 2022-08-08 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア キメラ抗原受容体発現細胞の有効性および増殖を改善するための方法
US20180094058A1 (en) * 2015-04-17 2018-04-05 Bioxcel Corporation Compositions and methods for preventing tumor growth and treating cancer by targeting lectin galactoside-binding soluble 3 binding protein
GB201507368D0 (en) * 2015-04-30 2015-06-17 Ucl Business Plc Cell
US20180117053A1 (en) * 2015-05-27 2018-05-03 Metastat, Inc. The Method of Use for Inhibitors of Epidermal Growth Factor Receptor Variants II, III and VI
US10822419B2 (en) * 2015-06-26 2020-11-03 University Of Southern California Masking chimeric antigen receptor T cells for tumor-specific activation
EP3334726B1 (en) 2015-07-13 2022-03-16 Beyondspring Pharmaceuticals, Inc. Plinabulin compositions
AU2016297014B2 (en) 2015-07-21 2021-06-17 Novartis Ag Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells
WO2017027392A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
CN108780084B (zh) 2015-09-03 2022-07-22 诺华股份有限公司 预测细胞因子释放综合征的生物标志物
MA44909A (fr) 2015-09-15 2018-07-25 Acerta Pharma Bv Association thérapeutique d'un inhibiteur du cd19 et d'un inhibiteur de la btk
CN105331585A (zh) * 2015-11-13 2016-02-17 科济生物医药（上海）有限公司 携带pd-l1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞
MA44140A (fr) 2015-12-22 2021-05-19 Dana Farber Cancer Inst Inc Récepteur d'antigène chimérique (car) contre la mésothéline et anticorps contre l'inhibiteur de pd-l1 pour une utilisation combinée dans une thérapie anticancéreuse
JP2019500394A (ja) 2015-12-30 2019-01-10 ノバルティス アーゲー 有効性が増強された免疫エフェクター細胞治療
CN106967684A (zh) * 2016-01-13 2017-07-21 北京马力喏生物科技有限公司 共表达抗EGFRvIII嵌合抗原受体和无功能EGFR受体的转基因淋巴细胞及其用途
CN106967681B (zh) * 2016-01-13 2020-06-05 北京马力喏生物科技有限公司 治疗脑胶质母细胞瘤的治疗组合物
CN106967685B (zh) * 2016-01-13 2020-06-02 北京马力喏生物科技有限公司 共表达抗EGFRvIII嵌合抗原受体和免疫检查点抑制分子的转基因淋巴细胞及其用途
US10259876B2 (en) * 2016-01-21 2019-04-16 Pfizer Inc. Chimeric antigen receptors targeting epidermal growth factor receptor variant III
ES2904593T3 (es) 2016-01-21 2022-04-05 Pfizer Anticuerpos monoespecíficos y biespecíficos para la variante III del receptor del factor de crecimiento epidérmico y CD3 y sus usos
US20230000912A1 (en) * 2016-01-25 2023-01-05 The Broad Institute, Inc. Genetic, developmental and micro-environmental programs in idh-mutant gliomas, compositions of matter and methods of use thereof
CN107034193B (zh) * 2016-02-03 2020-06-05 北京马力喏生物科技有限公司 治疗b细胞白血病及b细胞淋巴瘤的治疗组合物
WO2017133175A1 (en) * 2016-02-04 2017-08-10 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Engineered mammalian cells for cancer therapy
RU2753543C1 (ru) 2016-02-08 2021-08-17 Бейондспринг Фармасьютикалс, Инк. Композиции, содержащие тукаресол или его аналоги
BR112018067679A2 (pt) 2016-03-04 2019-01-15 Novartis Ag células que expressam múltiplas moléculas do receptor de antígeno quimérico (car) e seu uso
US11111505B2 (en) 2016-03-19 2021-09-07 Exuma Biotech, Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof
US11325948B2 (en) 2016-03-19 2022-05-10 Exuma Biotech Corp. Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes to express polypeptides comprising the intracellular domain of MPL
US11549099B2 (en) 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
EP3988111A1 (en) 2016-04-01 2022-04-27 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Use of chimeric antigen receptor modified cells to treat cancer
US10654934B2 (en) 2016-04-01 2020-05-19 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Use of chimeric antigen receptor modified cells to treat cancer
WO2017176289A1 (en) * 2016-04-08 2017-10-12 Celgene Corporation Uses of lenalidomide and car t-cells
BR112018071096A2 (pt) 2016-04-15 2019-02-26 Novartis Ag composições e métodos para a expressão da proteína seletiva
SI3455261T1 (sl) 2016-05-13 2023-01-31 Bioatla, Inc. Protitelesa proti ROR2, fragmenti protitelesa, njihovi imunokonjugati in uporabe le-teh
KR20230018545A (ko) 2016-06-06 2023-02-07 비욘드스프링 파마수티컬스, 인코포레이티드. 호중구감소증을 줄이는 조성물 및 방법
CN116284404A (zh) 2016-06-08 2023-06-23 艾伯维公司 抗b7-h3抗体和抗体药物偶联物
JP2019524649A (ja) 2016-06-08 2019-09-05 アッヴィ・インコーポレイテッド 抗ｃｄ９８抗体及び抗体薬物コンジュゲート
US20200002432A1 (en) 2016-06-08 2020-01-02 Abbvie Inc. Anti-cd98 antibodies and antibody drug conjugates
BR112018075649A2 (pt) 2016-06-08 2019-04-09 Abbvie Inc. anticorpos anti-b7-h3 e conjugados de fármaco de anticorpo
JP2019522643A (ja) 2016-06-08 2019-08-15 アッヴィ・インコーポレイテッド 抗ｃｄ９８抗体及び抗体薬物コンジュゲート
EP3468993A1 (en) 2016-06-08 2019-04-17 AbbVie Inc. Anti-b7-h3 antibodies and antibody drug conjugates
MA45491A (fr) * 2016-06-27 2019-05-01 Juno Therapeutics Inc Épitopes à restriction cmh-e, molécules de liaison et procédés et utilisations associés
CN107556386A (zh) * 2016-06-30 2018-01-09 中国科学院深圳先进技术研究院 抗EGFRvIII和CD3特异性双靶向抗体、含双靶向抗体表达盒的微环DNA及应用
CA3030003A1 (en) * 2016-07-08 2018-01-11 F1 Oncology, Inc. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof
AU2017296289A1 (en) 2016-07-12 2019-01-31 Revolution Medicines, Inc. 2,5-disubstituted 3-methyl pyrazines and 2,5,6-trisubstituted 3-methyl pyrazines as allosteric SHP2 inhibitors
CN110461315A (zh) 2016-07-15 2019-11-15 诺华股份有限公司 使用与激酶抑制剂组合的嵌合抗原受体治疗和预防细胞因子释放综合征
SG11201900677SA (en) 2016-07-28 2019-02-27 Novartis Ag Combination therapies of chimeric antigen receptors adn pd-1 inhibitors
US20190161542A1 (en) * 2016-08-01 2019-05-30 Novartis Ag Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
JOP20170154B1 (ar) * 2016-08-01 2023-03-28 Omeros Corp تركيبات وطرق لتثبيط masp-3 لعلاج أمراض واضطرابات مختلفة
CN109789164B (zh) * 2016-08-30 2023-04-28 亘喜生物科技（上海）有限公司 具有gitr胞内结构域作为共刺激结构域的嵌合抗原受体
WO2018064387A1 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Novartis Ag Porous membrane-based macromolecule delivery system
SG10201913823VA (en) 2016-10-07 2020-03-30 Novartis Ag Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
CN108203718A (zh) * 2016-12-20 2018-06-26 上海生博生物医药科技有限公司 靶向EGFRvIII干扰PD-1降低肿瘤免疫逃逸的CAR-T载体及构建方法和应用
WO2018129381A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Beyondspring Pharmaceuticals, Inc. Tubulin binding compounds and therapeutic use thereof
CA3048648A1 (en) * 2017-01-10 2018-07-19 The General Hospital Corporation T cells expressing a chimeric antigen receptor
WO2018136264A1 (en) 2017-01-23 2018-07-26 Revolution Medicines, Inc. Pyridine compounds as allosteric shp2 inhibitors
MX2019008695A (es) 2017-01-23 2019-09-11 Revolution Medicines Inc Compuestos biciclicos como inhibidores alostericos de shp2.
CN106636003B (zh) * 2017-01-24 2019-07-12 深圳普瑞金生物药业有限公司 一种全人源化EGFRvIII嵌合抗原受体T细胞及其制备方法
WO2018140725A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Novartis Ag Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
CN110582509A (zh) 2017-01-31 2019-12-17 诺华股份有限公司 使用具有多特异性的嵌合t细胞受体蛋白治疗癌症
BR112019015974A2 (pt) 2017-02-01 2020-03-31 Beyondspring Pharmaceuticals, Inc. Método para reduzir neutropenia
CN110612119A (zh) 2017-02-07 2019-12-24 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 磷脂醚(ple)car t细胞肿瘤靶向(ctct)剂
WO2018160622A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Endocyte, Inc. Compositions and methods for car t cell therapy
JP2020513832A (ja) 2017-03-22 2020-05-21 ノバルティス アーゲー 免疫腫瘍学のための組成物および方法
WO2018183888A2 (en) 2017-03-31 2018-10-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of treating t cell exhaustion by inhibiting or modulating t cell receptor signaling
AU2018251206A1 (en) * 2017-04-14 2019-10-31 The General Hospital Corporation Chimeric antigen receptor T cells targeting the tumor microenvironment
JP2020517259A (ja) 2017-04-19 2020-06-18 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 操作された抗原受容体を発現する免疫細胞
JP2020522489A (ja) 2017-06-02 2020-07-30 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 養子細胞療法を用いる処置のための製造物品および方法
KR20200032174A (ko) * 2017-07-25 2020-03-25 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 강화된 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
EP3662055A1 (en) * 2017-08-02 2020-06-10 Autolus Limited Cells expressing a chimeric antigen receptor or engineered tcr and comprising a nucleotide sequence which is selectively expressed
ES2959953T3 (es) 2017-08-09 2024-02-29 Juno Therapeutics Inc Métodos para producir composiciones celulares genéticamente modificadas y composiciones relacionadas
TW201918260A (zh) 2017-09-07 2019-05-16 美商銳新醫藥公司 Shp2抑制劑組合物以及治療癌症的方法
EP3684408A1 (en) 2017-09-19 2020-07-29 Massachusetts Institute of Technology Compositions for chimeric antigen receptor t cell therapy and uses thereof
TW201930292A (zh) 2017-10-12 2019-08-01 美商銳新醫藥公司 作為變構ｓｈｐ２抑制劑的吡啶、吡嗪和三嗪化合物
EP3697820A4 (en) * 2017-10-17 2022-01-05 The General Hospital Corporation PROCESSES AND COMPOSITIONS RELATING TO GENETICALLY MODIFIED REGULATORY T-LYMPHOCYTES
TWI829655B (zh) 2017-10-18 2024-01-21 瑞士商諾華公司 用於選擇性蛋白質降解的組合物及方法
JP2021500894A (ja) 2017-10-25 2021-01-14 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法
CN109706120A (zh) * 2017-10-26 2019-05-03 深圳宾德生物技术有限公司 一种双靶点特异性t淋巴细胞及其制备方法和应用
US11802163B2 (en) 2017-11-10 2023-10-31 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting glypican-3 or mesothelin
CN111386123A (zh) * 2017-11-22 2020-07-07 布里格姆及妇女医院股份有限公司 Msc表达的免疫调节剂与car-t结合用于癌症治疗
JP2021503885A (ja) 2017-11-22 2021-02-15 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 末梢血からの末梢血リンパ球（ｐｂｌ）の拡大培養
CN109837292A (zh) * 2017-11-25 2019-06-04 深圳宾德生物技术有限公司 一种敲除pd1的靶向egfr的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN109836493A (zh) * 2017-11-25 2019-06-04 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向cd19的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN109836497A (zh) * 2017-11-25 2019-06-04 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向egfr的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN109908176A (zh) * 2017-12-12 2019-06-21 科济生物医药（上海）有限公司 免疫效应细胞和辐射联用在治疗肿瘤中的用途
EP3753952A4 (en) * 2017-12-13 2022-04-13 XDCExplorer (Shanghai) Co., Ltd. EGFRVIII ANTIBODY AND CONJUGATE, METHOD FOR THE PREPARATION AND USE THEREOF
BR112020009757A2 (pt) 2017-12-15 2020-11-03 Revolution Medicines, Inc. compostos policíclicos como inibidores alostéricos de shp2
WO2019122060A1 (en) * 2017-12-21 2019-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Car-t cell assay for specificity test of novel antigen binding moieties
RU2707535C2 (ru) * 2017-12-28 2019-11-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Генетическая конструкция, кодирующая структуру т-клеточного химерного рецептора на основе одноцепочечных vhh-антител, специфичных опухолевому рецептору cd47, для нацеленной иммунотерапии злокачественных новообразований
CN108103105A (zh) * 2017-12-29 2018-06-01 深圳市茵冠生物科技有限公司 一种car-t细胞的制备方法、制得的car-t细胞及其应用
US20200368268A1 (en) 2018-01-08 2020-11-26 Novartis Ag Immune-enhancing rnas for combination with chimeric antigen receptor therapy
JP7068498B2 (ja) 2018-01-12 2022-05-16 クロセル インク． 二重ｓｈＲＮＡを用いて強化された免疫細胞及びそれを含む組成物
SG11202006886VA (en) 2018-01-22 2020-08-28 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Methods of use for car t cells
CN108276495B (zh) * 2018-01-24 2022-03-18 博生吉医药科技(苏州)有限公司 靶向csf1r嵌合抗原受体修饰的nk92mi细胞和t细胞及其制法和应用
CA3089226A1 (en) 2018-01-24 2019-08-01 Beyondspring Pharmaceuticals, Inc. Composition and method for reducing thrombocytopenia via the administration of plinabulin
WO2019152660A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
CN110144328A (zh) * 2018-02-12 2019-08-20 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向性抗肿瘤t细胞及其制备方法和应用
AU2019218989A1 (en) * 2018-02-12 2020-08-27 The General Hospital Corporation Chimeric antigen receptors targeting the tumor microenvironment
CN110157674A (zh) * 2018-02-12 2019-08-23 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用
WO2019160956A1 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
KR20200129108A (ko) * 2018-03-08 2020-11-17 페인스 테라퓨틱스 인코포레이티드 항-tip-1 항체 및 이의 용도
CA3096202A1 (en) * 2018-04-06 2019-10-10 The Regents Of The University Of California Methods of treating egfrviii expressing glioblastomas
US20210047405A1 (en) 2018-04-27 2021-02-18 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
EP3788369A1 (en) 2018-05-01 2021-03-10 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
EP3801769A1 (en) 2018-05-25 2021-04-14 Novartis AG Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
CA3101612A1 (en) * 2018-06-01 2019-12-05 Beyondspring Pharmaceuticals, Inc. Composition and method of treating cancer associated with egfr mutation
WO2019237035A1 (en) 2018-06-08 2019-12-12 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunooncology
WO2019241426A1 (en) 2018-06-13 2019-12-19 Novartis Ag Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof
CN108707198A (zh) * 2018-06-28 2018-10-26 李永海 识别人c-Met蛋白的人源单链抗体、诊断试剂及其CAR-T细胞制剂
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
CN110714018B (zh) * 2018-07-11 2023-10-03 上海恒润达生生物科技股份有限公司 靶向egfrviii的嵌合抗原受体及其用途
CA3107383A1 (en) 2018-07-23 2020-01-30 Magenta Therapeutics, Inc. Use of anti-cd5 antibody drug conjugate (adc) in allogeneic cell therapy
SG11202101169PA (en) 2018-08-10 2021-03-30 Eutilex Co Ltd Chimeric antigen receptor that binds hla-dr and car-t cell
WO2020047449A2 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
MX2021002393A (es) 2018-08-31 2021-07-15 Novartis Ag Metodos de preparacion de celulas que expresan receptores de antigenos quimericos.
CN109265563B (zh) * 2018-09-26 2020-01-31 武汉波睿达生物科技有限公司 一种用于治疗血液肿瘤的人源嵌合抗原受体及其应用
KR20210068478A (ko) 2018-09-28 2021-06-09 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 콜라겐-국재화된 면역조정성 분자 및 그의 방법
WO2020092455A2 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Car t cell transcriptional atlas
CN109485731A (zh) * 2018-11-02 2019-03-19 广东克瑞斯普生物科技有限公司 一种靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体
CN109536455B (zh) * 2018-12-11 2020-02-21 武汉波睿达生物科技有限公司 一种car-nk细胞及其制备方法和应用
KR20210106437A (ko) 2018-12-20 2021-08-30 노파르티스 아게 3-(1-옥소이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체를 포함하는 투약 요법 및 약학적 조합물
CA3125818A1 (en) * 2019-02-01 2020-08-06 Universitat Basel Calcineurin inhibitor resistant immune cells for use in adoptive cell transfer therapy
EP3924054A1 (en) 2019-02-15 2021-12-22 Novartis AG 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-yl)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
CA3123519A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
WO2020172553A1 (en) 2019-02-22 2020-08-27 Novartis Ag Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
WO2020176397A1 (en) 2019-02-25 2020-09-03 Novartis Ag Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
WO2020180733A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof
EP3942025A1 (en) 2019-03-21 2022-01-26 Novartis AG Car-t cell therapies with enhanced efficacy
WO2020210678A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2020219742A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
WO2020263399A1 (en) 2019-06-26 2020-12-30 Massachusetts Institute Of Technology Immunomodulatory fusion protein-metal hydroxide complexes and methods thereof
CN112430577A (zh) * 2019-08-26 2021-03-02 深圳宾德生物技术有限公司 靶向EGFRvⅢ并干扰IL-6表达的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用
WO2021061648A1 (en) 2019-09-23 2021-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for stimulation of endogenous t cell responses
US20220380447A1 (en) * 2019-11-01 2022-12-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Fibronectin targeting chimeric antigen receptors (cars)
TW202134285A (zh) 2019-11-26 2021-09-16 瑞士商諾華公司 Ｃｄ１９和ｃｄ２２嵌合抗原受體及其用途
BR112022010206A2 (pt) 2019-11-26 2022-11-29 Novartis Ag Receptores de antígeno quiméricos e usos dos mesmos
US20230057071A1 (en) 2019-12-20 2023-02-23 Novartis Ag Combination of anti tim-3 antibody mbg453 and anti tgf-beta antibody nis793, with or without decitabine or the anti pd-1 antibody spartalizumab, for treating myelofibrosis and myelodysplastic syndrome
KR20220146530A (ko) 2020-02-27 2022-11-01 노파르티스 아게 키메라 항원 수용체-발현 세포의 제조 방법
BR112022016633A2 (pt) 2020-02-27 2022-12-13 Novartis Ag Métodos para produzir células que expressam receptor de antígeno quimérico
CN115768464A (zh) 2020-03-10 2023-03-07 麻省理工学院 产生工程化记忆样nk细胞及其组合物的方法
WO2021183207A1 (en) 2020-03-10 2021-09-16 Massachusetts Institute Of Technology COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMMUNOTHERAPY OF NPM1c-POSITIVE CANCER
WO2021221782A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Massachusetts Institute Of Technology Chimeric antigen receptor-targeting ligands and uses thereof
US20210340524A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying chimeric antigen receptor-targeting ligands and uses thereof
CN116096862A (zh) 2020-06-11 2023-05-09 诺华股份有限公司 Zbtb32抑制剂及其用途
CA3182346A1 (en) 2020-06-23 2021-12-30 Novartis Ag Dosing regimen comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
AU2021305084A1 (en) 2020-07-07 2023-02-02 Cancure, Llc MIC antibodies and binding agents and methods of using the same
EP4188549A1 (en) 2020-08-03 2023-06-07 Novartis AG Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
JP2023538118A (ja) 2020-08-21 2023-09-06 ノバルティス アーゲー Ｃａｒ発現細胞のインビボ生成のための組成物及び方法
CN112661844B (zh) * 2020-11-18 2022-05-03 贵州医科大学 一种靶向EGFRvIII的单链抗体及应用
JP2023550148A (ja) 2020-11-20 2023-11-30 シンシア・イノベーション・インコーポレイテッド がん免疫治療に用いられる武装二重ｃａｒ－ｔ組成物及び方法
US11661459B2 (en) 2020-12-03 2023-05-30 Century Therapeutics, Inc. Artificial cell death polypeptide for chimeric antigen receptor and uses thereof
CN112480266B (zh) * 2020-12-04 2021-07-06 广州熙帝生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体脐血有核细胞及应用
AU2021401052A1 (en) 2020-12-18 2023-06-22 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity
AR124681A1 (es) 2021-01-20 2023-04-26 Abbvie Inc Conjugados anticuerpo-fármaco anti-egfr
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
JP2024516748A (ja) * 2021-04-26 2024-04-16 ザ ウォルター アンド イライザ ホール インスティテュート オブ メディカル リサーチ ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合タンパク質
CN118056008A (zh) 2021-04-27 2024-05-17 诺华股份有限公司 病毒载体生产系统
CN113402616B (zh) * 2021-06-18 2022-09-23 浙江大学 巨噬细胞专属嵌合抗原受体、表达该受体的可控极化单核/巨噬细胞及其制备方法和应用
AU2022312311A1 (en) * 2021-07-16 2024-02-08 Noile-Immune Biotech Inc. Anti-EGFRviii antibody, polypeptide, cell capable of expressing said polypeptide, pharmaceutical composition comprising said cell, method for producing said cell, and polynucleotide or vector comprising nucleotide sequence encoding said polypeptide
TW202317643A (zh) * 2021-07-29 2023-05-01 美商瑟法隆有限責任公司 用於抗pacap抗體的組合物和方法
CN113980138B (zh) * 2021-08-11 2023-08-11 卡瑞济(北京)生命科技有限公司 EphA2嵌合抗原受体以及其用途
WO2023021477A1 (en) 2021-08-20 2023-02-23 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor–expressing cells
WO2023081715A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Viracta Therapeutics, Inc. Combination of car t-cell therapy with btk inhibitors and methods of use thereof
CN114106201A (zh) * 2021-11-25 2022-03-01 广西医科大学 一种基于纳米抗体靶向EGFRvIII的嵌合抗原受体T细胞的制备方法及其应用
WO2023129929A1 (en) 2021-12-30 2023-07-06 Tr1X, Inc. Cd4+ t cells expressing il-10 and chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
WO2024027835A1 (zh) * 2022-08-05 2024-02-08 北京鼎成肽源生物技术有限公司 靶向EGFRvIII的抗体及其在细胞免疫治疗的应用
WO2024089639A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Novartis Ag Lentiviral formulations
WO2024098024A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes from liquid tumors and therapeutic uses thereof

Family Cites Families (245)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4861757A (en) 1986-11-14 1989-08-29 Institute Of Molecular Biology Wound healing and bone regeneration using PDGF and IGF-I
US5906936A (en) 1988-05-04 1999-05-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Endowing lymphocytes with antibody specificity
US6303121B1 (en) 1992-07-30 2001-10-16 Advanced Research And Technology Method of using human receptor protein 4-1BB
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
WO1991003489A1 (en) 1989-09-08 1991-03-21 The Johns Hopkins University Structural alterations of the egf receptor gene in human gliomas
US5981725A (en) 1989-09-08 1999-11-09 The Johns Hopkins Univiersity Structural alterations of the EGF receptor gene in human tumors
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US6319494B1 (en) 1990-12-14 2001-11-20 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
DK0517895T3 (da) 1990-12-14 1997-04-07 Univ California Kimæriske kæder til receptorforbundne signaltransduktionsveje
IE920716A1 (en) 1991-03-07 1992-09-09 Gen Hospital Corp Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
US6004811A (en) 1991-03-07 1999-12-21 The Massachussetts General Hospital Redirection of cellular immunity by protein tyrosine kinase chimeras
US7049136B2 (en) 1991-03-07 2006-05-23 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
NZ243082A (en) 1991-06-28 1995-02-24 Ici Plc 4-anilino-quinazoline derivatives; pharmaceutical compositions, preparatory processes, and use thereof
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
ATE249840T1 (de) 1991-12-13 2003-10-15 Xoma Corp Verfahren und materialien zur herstellung von modifizierten variablen antikörperdomänen und ihre therapeutische verwendung
AU661533B2 (en) 1992-01-20 1995-07-27 Astrazeneca Ab Quinazoline derivatives
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US8211422B2 (en) 1992-03-18 2012-07-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric receptor genes and cells transformed therewith
IL104570A0 (en) 1992-03-18 1993-05-13 Yeda Res & Dev Chimeric genes and cells transformed therewith
TW225528B (ko) 1992-04-03 1994-06-21 Ciba Geigy Ag
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US7211259B1 (en) 1993-05-07 2007-05-01 Immunex Corporation 4-1BB polypeptides and DNA encoding 4-1BB polypeptides
NZ285395A (en) 1994-05-02 1998-10-28 Novartis Ag Chimeric antibody, cancer treatment
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5786464C1 (en) 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
US5712149A (en) 1995-02-03 1998-01-27 Cell Genesys, Inc. Chimeric receptor molecules for delivery of co-stimulatory signals
US6103521A (en) 1995-02-06 2000-08-15 Cell Genesys, Inc. Multispecific chimeric receptors
PT871495E (pt) 1995-02-24 2005-10-31 Gen Hospital Corp Redireccionamento de imunidade celular atraves de receptores quimericos
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
GB9508538D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
HUP9900330A3 (en) 1995-07-06 2001-08-28 Novartis Ag Pyrrolopyrimidines and processes for the preparation thereof
GB9526131D0 (en) 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Recombinant chimeric receptors
US5760041A (en) 1996-02-05 1998-06-02 American Cyanamid Company 4-aminoquinazoline EGFR Inhibitors
GB9603095D0 (en) 1996-02-14 1996-04-10 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
US5874240A (en) 1996-03-15 1999-02-23 Human Genome Sciences, Inc. Human 4-1BB receptor splicing variant
ES2174250T5 (es) 1996-04-12 2010-04-21 Warner-Lambert Company Llc Inhibidores irreversibles de tirosina quinasas.
WO1997049688A1 (en) 1996-06-24 1997-12-31 Pfizer Inc. Phenylamino-substituted tricyclic derivatives for treatment of hyperproliferative diseases
EP0954315A2 (en) 1996-09-13 1999-11-10 Sugen, Inc. Use of quinazoline derivatives for the manufacture of a medicament in the treatment of hyperproliferative skin disorders
US6114148C1 (en) 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
EP0837063A1 (en) 1996-10-17 1998-04-22 Pfizer Inc. 4-Aminoquinazoline derivatives
EP0937095A4 (en) 1996-10-25 1999-12-22 Cell Genesys Inc TARGETED CYTOLYSIS OF CANCER CELLS
US20030060444A1 (en) 1997-06-25 2003-03-27 Celltech Therapeutics, Ltd. Cell activation process and reagents therefor
GB9713473D0 (en) 1997-06-25 1997-09-03 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
CO4940418A1 (es) 1997-07-18 2000-07-24 Novartis Ag Modificacion de cristal de un derivado de n-fenil-2- pirimidinamina, procesos para su fabricacion y su uso
GB9809658D0 (en) 1998-05-06 1998-07-01 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
CA2343156A1 (en) 1998-09-04 2000-03-16 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Fusion receptors specific for prostate-specific membrane antigen and uses thereof
US6410319B1 (en) 1998-10-20 2002-06-25 City Of Hope CD20-specific redirected T cells and their use in cellular immunotherapy of CD20+ malignancies
EP1171596A1 (en) 1999-04-16 2002-01-16 Celltech Therapeutics Limited Synthetic transmembrane components
AU1086501A (en) 1999-10-15 2001-04-30 Carnegie Institution Of Washington Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
GB9925848D0 (en) 1999-11-01 1999-12-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
JP2004500095A (ja) 2000-02-24 2004-01-08 エクサイト　セラピーズ，　インコーポレイテッド 細胞の同時の刺激および濃縮
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
NZ520622A (en) * 2000-02-25 2004-08-27 Us Gov Health & Human Serv Anti-EGFRvIII scFvs with improved cytotoxicity and yield, immunotoxins based thereon, and methods of use thereof
IL136511A0 (en) 2000-06-01 2001-06-14 Gavish Galilee Bio Appl Ltd Genetically engineered mhc molecules
AU2001275474A1 (en) 2000-06-12 2001-12-24 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
GB0025307D0 (en) 2000-10-16 2000-11-29 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
AU2001297703B2 (en) 2000-11-07 2006-10-19 City Of Hope CD19-specific redirected immune cells
US6995162B2 (en) 2001-01-12 2006-02-07 Amgen Inc. Substituted alkylamine derivatives and methods of use
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
EP1392818A4 (en) 2001-04-30 2005-01-05 Hope City FOR THE TREATMENT OF CANCER DISEASES IN HUMAN CERTAIN IMMUNE RECEPTOR
US7514537B2 (en) 2001-04-30 2009-04-07 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human gliomas
US20030148982A1 (en) 2001-11-13 2003-08-07 Brenner Malcolm K. Bi-spcific chimeric T cells
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
US7638326B2 (en) 2002-01-03 2009-12-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform
WO2003057171A2 (en) 2002-01-03 2003-07-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of t-cells using an engineered multivalent signaling platform
AU2003210787B2 (en) 2002-02-01 2009-04-23 Medinol Ltd. Phosphorus-containing compounds & uses thereof
CN100457181C (zh) * 2002-03-04 2009-02-04 伊姆克罗尼系统公司 用血管内皮生长因子受体拮抗剂抑制肿瘤生长的联合疗法
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
AU2003288675B2 (en) 2002-12-23 2010-07-22 Medimmune Limited Antibodies against PD-1 and uses therefor
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
JP4808614B2 (ja) 2003-06-27 2011-11-02 アムジエン・フレモント・インコーポレイテツド 上皮成長因子受容体の欠失型変異体を認識する抗体、およびそれらの使用
JP5026072B2 (ja) 2003-07-01 2012-09-12 イミューノメディクス、インコーポレイテッド 二重特異性抗体の多価キャリヤー
JP4934426B2 (ja) 2003-08-18 2012-05-16 メディミューン，エルエルシー 抗体のヒト化
US8198020B2 (en) 2003-08-22 2012-06-12 Potentia Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing phagocytosis or phagocyte activity
US20050042664A1 (en) 2003-08-22 2005-02-24 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
US20050113564A1 (en) 2003-11-05 2005-05-26 St. Jude Children's Research Hospital Chimeric receptors with 4-1BB stimulatory signaling domain
WO2005118788A2 (en) 2004-05-27 2005-12-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
WO2006020258A2 (en) 2004-07-17 2006-02-23 Imclone Systems Incorporated Novel tetravalent bispecific antibody
US7994298B2 (en) 2004-09-24 2011-08-09 Trustees Of Dartmouth College Chimeric NK receptor and methods for treating cancer
WO2006060878A1 (en) 2004-12-10 2006-06-15 Peter Maccallum Cancer Institute Methods and compositions for adoptive immunotherapy
PT2161336E (pt) 2005-05-09 2013-10-03 Ono Pharmaceutical Co Anticorpos monoclonais humanos para morte programada 1 (pd-1) e métodos de tratamento do cancro utilizando anticorpos anti- pd-1 sozinhos ou em combinação com outros agentes imunoterapêuticos¿
GB0510390D0 (en) 2005-05-20 2005-06-29 Novartis Ag Organic compounds
KR101607288B1 (ko) 2005-07-01 2016-04-05 이. 알. 스퀴부 앤드 선즈, 엘.엘.씨. 예정 사멸 리간드 1 (피디-엘1)에 대한 인간 모노클로날 항체
US20070036773A1 (en) 2005-08-09 2007-02-15 City Of Hope Generation and application of universal T cells for B-ALL
EP1928506A4 (en) 2005-08-19 2009-10-21 Abbott Lab IMMUNOGLOBULIN HAVING TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF
JO2660B1 (en) 2006-01-20 2012-06-17 نوفارتيس ايه جي Pi-3 inhibitors and methods of use
WO2008045437A2 (en) 2006-10-09 2008-04-17 The General Hospital Corporation Chimeric t-cell receptors and t-cells targeting egfrviii on tumors
US20080131415A1 (en) 2006-11-30 2008-06-05 Riddell Stanley R Adoptive transfer of cd8 + t cell clones derived from central memory cells
SI2856876T1 (en) 2007-03-30 2018-04-30 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Constituent expression of costimulatory ligands on indirectly transmitted T lymphocytes
ES2616355T3 (es) 2007-06-18 2017-06-12 Merck Sharp & Dohme B.V. Anticuerpos para el receptor humano de muerte programada PD-1
TWI471134B (zh) 2007-09-12 2015-02-01 Genentech Inc 肌醇磷脂３－激酶抑制劑化合物及化療劑之組合及使用方法
CN101909631B (zh) 2007-10-25 2012-09-12 健泰科生物技术公司 制备噻吩并嘧啶化合物的方法
US10059923B2 (en) 2008-01-30 2018-08-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods for off-the-shelf tumor immunotherapy using allogeneic T-cell precursors
EP2242773B1 (en) 2008-02-11 2017-06-14 Cure Tech Ltd. Monoclonal antibodies for tumor treatment
US8379824B2 (en) 2008-03-06 2013-02-19 At&T Intellectual Property I, Lp Methods and apparatus to provide a network-based caller identification service in a voice over internet protocol network
US8168757B2 (en) 2008-03-12 2012-05-01 Merck Sharp & Dohme Corp. PD-1 binding proteins
EP2350129B1 (en) 2008-08-25 2015-06-10 Amplimmune, Inc. Compositions of pd-1 antagonists and methods of use
AU2009288289B2 (en) 2008-08-25 2012-11-08 Amplimmune, Inc. PD-1 antagonists and methods of use thereof
HUE058891T2 (hu) 2008-08-26 2022-09-28 Hope City Módszer és készítmények a T-sejtek fokozott tumorellenes effektor mûködésének fokozására
EP3929216A1 (en) 2008-12-09 2021-12-29 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-pd-l1 antibodies and their use to enhance t-cell function
EP2389443B1 (en) 2009-01-23 2018-11-14 Roger Williams Hospital Retroviral vectors encoding multiple highly homologous non-viral polypeptides and the use of same
JP5844159B2 (ja) 2009-02-09 2016-01-13 ユニヴェルシテ デクス−マルセイユＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｄ’Ａｉｘ−Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ Ｐｄ−１抗体およびｐｄ−ｌ１抗体ならびにその使用
EP2483301A1 (en) 2009-10-01 2012-08-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department of Health and Human Services Anti-vascular endothelial growth factor receptor-2 chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
WO2011059836A2 (en) 2009-10-29 2011-05-19 Trustees Of Dartmouth College T cell receptor-deficient t cell compositions
JP2013512251A (ja) 2009-11-24 2013-04-11 アンプリミューン、インコーポレーテッド Ｐｄ−ｌ１／ｐｄ−ｌ２の同時阻害
WO2011097477A1 (en) 2010-02-04 2011-08-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Icos critically regulates the expansion and function of inflammatory human th17 cells
SE535129C2 (sv) 2010-07-13 2012-04-24 Bostik Ab Komposition för vidhäftning av ett golvmaterial
CN103501816A (zh) 2010-10-27 2014-01-08 贝勒医学院 使t细胞重定向针对cd70阳性恶性肿瘤的嵌合cd27受体
DK3214091T3 (en) * 2010-12-09 2019-01-07 Univ Pennsylvania USE OF CHEMICAL ANTIGEN RECEPTOR MODIFIED T CELLS FOR TREATMENT OF CANCER
EP2651442B1 (en) 2010-12-14 2020-04-22 University of Maryland, Baltimore Universal anti-tag chimeric antigen receptor-expressing t cells and methods of treating cancer
MX2013008376A (es) 2011-01-18 2013-08-12 Univ Pennsylvania Composiciones y metodos para el tratamiento de cancer.
MX359513B (es) 2011-03-23 2018-10-01 Hutchinson Fred Cancer Res Metodo y composiciones para inmunoterapia celular.
WO2012127464A2 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Gavish-Galilee Bio Applications Ltd Constitutively activated t cells for use in adoptive cell therapy
JP6082997B2 (ja) 2011-04-01 2017-02-22 メモリアル スローン−ケタリング キャンサー センター Ｈｌａ−ａ２により提示されるｗｔ１ペプチドへのｔ細胞受容体様抗体
NZ616405A (en) 2011-04-08 2015-11-27 Baylor College Medicine Reversing the effects of the tumor microenvironment using chimeric cytokine receptors
CN103596981B (zh) 2011-04-08 2017-06-16 美国卫生和人力服务部 抗‑表皮生长因子受体变体iii嵌合抗原受体及其用于治疗癌症的用途
US20130071414A1 (en) 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
EP3290055A3 (en) 2011-07-25 2018-05-30 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant virus products and methods for inhibition of expression of dux4
EP3915588A1 (en) 2011-07-29 2021-12-01 The Trustees of the University of Pennsylvania Switch costimulatory receptors
US20130078250A1 (en) 2011-08-23 2013-03-28 Oliver Ast Bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2013026833A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2013033626A2 (en) 2011-08-31 2013-03-07 Trustees Of Dartmouth College Nkp30 receptor targeted therapeutics
US20140255363A1 (en) 2011-09-16 2014-09-11 Baylor College Of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells
MX2014003176A (es) 2011-09-16 2015-08-05 Univ Pennsylvania Celulas t diseñadas mediante arn para el tratamiento de cancer.
EP2768863B1 (en) 2011-10-20 2017-09-27 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Anti-cd22 chimeric antigen receptors
JP6074435B2 (ja) 2011-10-26 2017-02-01 ナショナル キャンサー センター 変異ｃｔｌａ４遺伝子移入ｔ細胞及びこれを含む抗がん免疫治療用組成物
WO2013074916A1 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Car+ t cells genetically modified to eliminate expression of t- cell receptor and/or hla
CA2861491C (en) 2012-02-13 2020-08-25 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
CA3084919A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for generating a persisting population of t cells useful for the treatment of cancer
WO2013126726A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Double transgenic t cells comprising a car and a tcr and their methods of use
SG11201404284SA (en) 2012-02-22 2014-10-30 Univ Pennsylvania Use of the cd2 signaling domain in second-generation chimeric antigen receptors
EA201491574A1 (ru) 2012-02-22 2014-12-30 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Применение car, основанных на icos, для усиления противоопухолевой активности и длительного сохранения car
CN103483452B (zh) 2012-06-12 2021-08-13 上海细胞治疗集团有限公司 双信号独立的嵌合抗原受体及其用途
WO2014011993A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Epitope spreading associated with car t-cells
WO2014012001A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of cart19 to deplete normal b cells to induce tolerance
SG11201408787PA (en) 2012-07-13 2015-01-29 Univ Pennsylvania Enhancing activity of car t cells by co-introducing a bispecific antibody
SG11201408398UA (en) 2012-07-13 2015-02-27 Univ Pennsylvania Compositions and methods for regulating car t cells
US9572836B2 (en) 2012-07-13 2017-02-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for assessing the suitability of transduced T cells for administration
EP4019041B1 (en) 2012-07-13 2022-12-28 The Trustees of the University of Pennsylvania Toxicity management for anti-tumor activity of cars
LT2884999T (lt) 2012-08-20 2021-04-12 Fred Hutchinson Cancer Research Center Ląstelinės imunoterapijos būdas ir kompozicijos
WO2014039513A2 (en) 2012-09-04 2014-03-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Inhibition of diacylglycerol kinase to augment adoptive t cell transfer
TW201414837A (zh) 2012-10-01 2014-04-16 Univ Pennsylvania 標定基質細胞以治療癌症之組合物和方法
WO2014055657A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
AU2013204922B2 (en) 2012-12-20 2015-05-14 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors
US20150368360A1 (en) 2013-02-06 2015-12-24 Anthrogenesis Corporation Modified t lymphocytes having improved specificity
CN105358576B (zh) 2013-02-20 2020-05-05 诺华股份有限公司 使用人源化抗EGFRvIII嵌合抗原受体治疗癌症
WO2014130635A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-cd123 chimeric antigen receptor engineered t cells
CN103113470B (zh) 2013-02-27 2015-04-22 四川大学 靶向人egfr的基因工程化淋巴细胞及其制备方法和用途
US9745368B2 (en) 2013-03-15 2017-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
JP6779785B2 (ja) 2013-12-19 2020-11-04 ノバルティス アーゲー ヒトメソテリンキメラ抗原受容体およびその使用
EP3087101B1 (en) 2013-12-20 2024-06-05 Novartis AG Regulatable chimeric antigen receptor
EP3097117B1 (en) 2014-01-21 2023-10-04 Novartis Ag Enhanced antigen presenting ability of car t cells by co-introduction of costimulatory molecules
ES2857226T3 (es) 2014-03-15 2021-09-28 Novartis Ag Receptor de antígeno quimérico regulable
US20170335281A1 (en) 2014-03-15 2017-11-23 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
LT3129470T (lt) 2014-04-07 2021-07-12 Novartis Ag Vėžio gydymas naudojant anti-cd19 chimerinį antigeno receptorių
US20170274014A1 (en) 2014-07-21 2017-09-28 Jennifer Brogdon Combinations of low, immune enhancing, doses of mtor inhibitors and cars
AR101829A1 (es) 2014-07-21 2017-01-18 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno cll-1
EP3193915A1 (en) 2014-07-21 2017-07-26 Novartis AG Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
KR102594343B1 (ko) 2014-07-21 2023-10-26 노파르티스 아게 Cd33 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
US20170226495A1 (en) 2014-07-21 2017-08-10 Novartis Ag Sortase molecules and uses thereof
RU2751660C2 (ru) 2014-07-21 2021-07-15 Новартис Аг Лечение злокачественного новообразования с использованием гуманизированного химерного антигенного рецептора против всма
EP3174546B1 (en) 2014-07-31 2019-10-30 Novartis AG Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
CA2958200A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Novartis Ag Treatment of cancer using a gfr alpha-4 chimeric antigen receptor
EP3183268B1 (en) 2014-08-19 2020-02-12 Novartis AG Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
PL3194443T3 (pl) 2014-09-17 2022-01-31 Novartis Ag Nakierowywanie komórek cytotoksycznych za pośrednictwem receptorów chimerycznych do immunoterapii adoptywnej
CA2963935A1 (en) 2014-10-08 2016-04-14 Novartis Ag Biomarkers predictive of therapeutic responsiveness to chimeric antigen receptor therapy and uses thereof
US20170239294A1 (en) 2014-10-15 2017-08-24 Novartis Ag Compositions and methods for treating b-lymphoid malignancies
RU2021118125A (ru) 2014-12-29 2022-04-06 Новартис Аг Способы получения экспрессирующих химерный антигенный рецептор клеток
US11459390B2 (en) 2015-01-16 2022-10-04 Novartis Ag Phosphoglycerate kinase 1 (PGK) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
US11161907B2 (en) 2015-02-02 2021-11-02 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
ES2876974T3 (es) 2015-04-07 2021-11-15 Novartis Ag Combinación de terapia con receptor de antígeno quimérico y derivados de amino pirimidina
LT3280729T (lt) 2015-04-08 2022-08-10 Novartis Ag Terapijos cd20, terapijos cd22 ir kombinuotos terapijos su cd19 chimerinį antigeno receptorių (car) ekspresuojančia ląstele
JP7114457B2 (ja) 2015-04-17 2022-08-08 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア キメラ抗原受容体発現細胞の有効性および増殖を改善するための方法
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
AU2016297014B2 (en) 2015-07-21 2021-06-17 Novartis Ag Methods for improving the efficacy and expansion of immune cells
WO2017027392A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
CN108780084B (zh) 2015-09-03 2022-07-22 诺华股份有限公司 预测细胞因子释放综合征的生物标志物
KR20180051625A (ko) 2015-09-17 2018-05-16 노파르티스 아게 증진된 효능을 갖는 car t 세포 요법
MA44140A (fr) 2015-12-22 2021-05-19 Dana Farber Cancer Inst Inc Récepteur d'antigène chimérique (car) contre la mésothéline et anticorps contre l'inhibiteur de pd-l1 pour une utilisation combinée dans une thérapie anticancéreuse
JP2019500394A (ja) 2015-12-30 2019-01-10 ノバルティス アーゲー 有効性が増強された免疫エフェクター細胞治療
BR112018067679A2 (pt) 2016-03-04 2019-01-15 Novartis Ag células que expressam múltiplas moléculas do receptor de antígeno quimérico (car) e seu uso
US11549099B2 (en) 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
BR112018071096A2 (pt) 2016-04-15 2019-02-26 Novartis Ag composições e métodos para a expressão da proteína seletiva
WO2017210617A2 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Porter, David, L. Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
CN110461315A (zh) 2016-07-15 2019-11-15 诺华股份有限公司 使用与激酶抑制剂组合的嵌合抗原受体治疗和预防细胞因子释放综合征
SG11201900677SA (en) 2016-07-28 2019-02-27 Novartis Ag Combination therapies of chimeric antigen receptors adn pd-1 inhibitors
US20190161542A1 (en) 2016-08-01 2019-05-30 Novartis Ag Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
JP2019532953A (ja) 2016-09-30 2019-11-14 ノバルティス アーゲー 増強された有効性を有する免疫エフェクター細胞治療
SG10201913823VA (en) 2016-10-07 2020-03-30 Novartis Ag Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
WO2018140725A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Novartis Ag Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
CN110582509A (zh) 2017-01-31 2019-12-17 诺华股份有限公司 使用具有多特异性的嵌合t细胞受体蛋白治疗癌症
EP3589647A1 (en) 2017-02-28 2020-01-08 Novartis AG Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
CN110831619A (zh) 2017-03-22 2020-02-21 诺华股份有限公司 具有增强功效的生物标志和car t细胞疗法
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
TWI829655B (zh) 2017-10-18 2024-01-21 瑞士商諾華公司 用於選擇性蛋白質降解的組合物及方法
JP2021500894A (ja) 2017-10-25 2021-01-14 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法
AU2018369883A1 (en) 2017-11-15 2020-05-28 Novartis Ag BCMA-targeting chimeric antigen receptor, CD19-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapies
KR20200096253A (ko) 2017-11-30 2020-08-11 노파르티스 아게 Bcma-표적화 키메라 항원 수용체, 및 이의 용도
US20200368268A1 (en) 2018-01-08 2020-11-26 Novartis Ag Immune-enhancing rnas for combination with chimeric antigen receptor therapy
WO2019160956A1 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
US20200061113A1 (en) 2018-04-12 2020-02-27 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy characterization assays and uses thereof
US20210047405A1 (en) 2018-04-27 2021-02-18 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
EP3788369A1 (en) 2018-05-01 2021-03-10 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
US20200085869A1 (en) 2018-05-16 2020-03-19 Novartis Ag Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor therapies
EP3801769A1 (en) 2018-05-25 2021-04-14 Novartis AG Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
WO2019232244A2 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
WO2019241426A1 (en) 2018-06-13 2019-12-19 Novartis Ag Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof
MX2021002393A (es) 2018-08-31 2021-07-15 Novartis Ag Metodos de preparacion de celulas que expresan receptores de antigenos quimericos.
WO2020047449A2 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
US20220047633A1 (en) 2018-09-28 2022-02-17 Novartis Ag Cd22 chimeric antigen receptor (car) therapies
EP3856782A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Novartis AG Cd19 chimeric antigen receptor (car) and cd22 car combination therapies
WO2020176397A1 (en) 2019-02-25 2020-09-03 Novartis Ag Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
EP3942025A1 (en) 2019-03-21 2022-01-26 Novartis AG Car-t cell therapies with enhanced efficacy
WO2020210678A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
WO2020219742A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
BR112022010206A2 (pt) 2019-11-26 2022-11-29 Novartis Ag Receptores de antígeno quiméricos e usos dos mesmos
TW202134285A (zh) 2019-11-26 2021-09-16 瑞士商諾華公司 Ｃｄ１９和ｃｄ２２嵌合抗原受體及其用途
WO2021163618A1 (en) 2020-02-14 2021-08-19 Novartis Ag Method of predicting response to chimeric antigen receptor therapy

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cancer Sci., 2010, 제101권, 제12호, 페이지 2518-2524* *
Human Gene Therapy, 2012, 제23권, 페이지 1043-1053* *
Jpn. J. Cancer Res., 2000, 제91권, 페이지 1035-1043* *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018124766A3 (ko) * 2016-12-28 2018-12-13 주식회사 녹십자랩셀 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 자연 살해 세포
US11649294B2 (en) 2017-11-14 2023-05-16 GC Cell Corporation Anti-HER2 antibody or antigen-binding fragment thereof, and chimeric antigen receptor comprising same
US11970547B2 (en) 2017-11-14 2024-04-30 GC Cell Corporation Anti-HER2 antibody or antigen-binding fragment thereof, and chimeric antigen receptor comprising same

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JP6647868B2 (ja) 2020-02-14
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SG11201505896YA (en) 2015-09-29
US20140322275A1 (en) 2014-10-30
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IL240335A0 (en) 2015-09-24
EP2958943B1 (en) 2019-09-11
WO2014130657A1 (en) 2014-08-28
JP2016508725A (ja) 2016-03-24
JP2022191241A (ja) 2022-12-27
CA2901960A1 (en) 2014-08-28
EP3626741A1 (en) 2020-03-25
JP7189860B2 (ja) 2022-12-14
US9394368B2 (en) 2016-07-19
RU2015139874A (ru) 2017-03-24
AU2014218976B2 (en) 2018-11-15
EP2958943A1 (en) 2015-12-30
KR20210126793A (ko) 2021-10-20
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