CN111386123A - Msc表达的免疫调节剂与car-t结合用于癌症治疗 - Google Patents

Abstract

该技术描述了新颖的基于细胞的联合治疗模式，其在广泛的敏感和抗性肿瘤中诱导基于机制的肿瘤细胞杀伤。这些新试剂是肿瘤特异性的并且靶向广泛的实体瘤。

Description

MSC表达的免疫调节剂与CAR-T结合用于癌症治疗

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C§119(e)要求2017年11月22日提交的美国临时申请第62/590,070号的权益，其内容通过引用整体并入本文中。

技术领域

本发明的领域涉及免疫疗法。

背景

癌症是一种威胁生命的疾病，其中细胞过度增殖，导致功能异常、细胞生长不受调控、分化的缺乏、局部组织侵袭和转移。利用免疫系统破坏表达特定细胞表面标志物的细胞的能力的改变或以免疫系统破坏表达特定细胞表面标志物的细胞的能力为特征的癌症疗法,已在针对未形成实体瘤的癌症(如白血病)方面取得了成功。具体地，使用表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T)，其人为地靶向细胞毒性T细胞以杀死癌细胞。然而，用这种方法靶向实体瘤被证明更具挑战性。实体瘤微环境倾向于是免疫抑制的，通常含有多于一层的保护层，其阻碍免疫细胞有效到达并杀死肿瘤的转化细胞的能力。因此，需要靶向实体瘤的新疗法来治疗癌症。

概述

本文所述技术的一个方面提供了治疗对象的实体瘤癌症的方法，所述方法包括：(a)施用在其细胞表面上表达嵌合T细胞抗原受体的基因修饰的T细胞，所述嵌合T细胞抗原受体包含异源结合结构域和细胞内信号传导结构域，所述异源结合结构域特异性结合在癌症的细胞表面上表达的肿瘤抗原，其中所述异源结合结构域与癌细胞表面上的肿瘤抗原的结合激活所述细胞内信号传导结构域和所述T细胞；和(b)施用表达异源免疫调节多肽的第一基因修饰的间充质干细胞，其中所述异源免疫调节多肽增强所述基因修饰的T细胞的癌细胞杀伤。

在一个实施方案中，所述方法还包括在施用步骤之前，从对象切除实体瘤的步骤，其中所述切除产生先前被肿瘤组织占据的腔。

在另一个实施方案中，所述第一基因修饰的间充质干细胞是全身性施用的。

在另一个实施方案中，在通过切除所述肿瘤形成的腔中施用所述第一基因修饰的间充质干细胞。

在另一个实施方案中，所述第一基因修饰的间充质干细胞被包封在基质中。

在另一个实施方案中，所述基质允许细胞迁移出基质。

在另一个实施方案中，所述基质包括合成的细胞外基质。

在另一个实施方案中，所述基质包含巯基修饰的透明质酸和巯基反应性交联剂分子。

在另一个实施方案中，所述巯基反应性交联剂分子是聚乙二醇二丙烯酸酯。

在另一个实施方案中，所述异源免疫调节多肽是检查点抑制剂多肽。

在另一个实施方案中，所述异源免疫调节多肽是白介素(IL)IL-12、IL-2、IL-5、IL-15、干扰素α、干扰素β、干扰素γ或它们的组合。

在另一个实施方案中，所述检查点抑制剂多肽包含结合选自以下的检查点多肽的抗体或其抗原结合结构域：PD-L1、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3或TIGIT。

在另一个实施方案中，检查点抑制剂多肽包含结合PD-L1的抗体或其抗原结合结构域。

在另一个实施方案中，所述异源结合结构域包含纳米抗体或scFv。

在另一个实施方案中，特异性结合在癌症的细胞表面上表达的肿瘤抗原的所述异源结合结构域特异性结合选自以下的多肽：EGFRvIII、HER2、CD133、EGFR、IL13RA2、HER2、CSF1-R、L1-CAM、CTAG1B、GD2和EGFR。

在另一个实施方案中，所述异源结合结构域特异性结合EGFRvIII。

在另一个实施方案中，所述基因修饰的T细胞被包封在基质中。

在另一个实施方案中，所述基质允许细胞迁移出基质。

在另一个实施方案中，将所述基因修饰的T细胞施用于通过切除所述肿瘤形成的所述腔。

在另一个实施方案中，所述癌症是转移性癌症。

在另一个实施方案中，所述癌症是成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、乳腺癌、黑素瘤或非小细胞肺癌。

在另一个实施方案中，所述第一基因修饰的间充质干细胞另外表达异源多肽，或编码并递送溶瘤病毒，所述异源多肽选自：TRAIL、EGFR纳米抗体-TRAIL融合物、血小板反应蛋白(TSP)-1、HSV-TK、胞嘧啶脱氨酶(CD)或它们的组合。

在另一个实施方案中，所述溶瘤病毒是oHSV、oHSV-TRAIL、oHSV粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)或溶瘤腺病毒。

在另一个实施方案中，所述方法还包括施用第二基因修饰的间充质干细胞，所述第二基因修饰的间充质干细胞表达不同于由所述第一间充质干细胞表达的异源多肽的异源多肽，或编码并递送溶瘤病毒，或它们的组合，其中所述异源多肽选自：白介素(IL)-12、IL-2、IL-5、IL-15、TRAIL、EGFR纳米抗体-TRAIL融合物、血小板反应蛋白(TSP)-1、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、HSV-TK和胞嘧啶脱氨酶(CD)。

在另一个实施方案中，所述溶瘤病毒是oHSV、oHSV-TRAIL、oHSV-GMCSF或溶瘤腺病毒。

在另一个实施方案中，所述第二基因修饰的间充质干细胞被包封在基质中。

在另一个实施方案中，所述基质允许细胞迁移出所述基质。

在另一个实施方案中，在肿瘤切除6天内施用所述基因修饰的间充质干细胞和/或基因修饰的T细胞。

本文所述技术的另一方面提供了组合物，其包含(a)在其细胞表面上表达嵌合T细胞抗原受体的基因修饰的T细胞，所述嵌合T细胞抗原受体包含异源结合结构域和细胞内信号传导结构域，所述异源结合结构域特异性结合在癌性肿瘤的细胞表面上表达的肿瘤抗原，其中所述异源结合结构域与癌细胞表面上的肿瘤抗原的结合激活所述细胞内信号传导结构域和所述T细胞；和(b)表达异源免疫调节多肽的第一基因修饰的间充质干细胞。

在一个实施方案中，所述组合物还包含第二基因修饰的间充质干细胞，所述第二经基因修饰的间充质干细胞表达不同于由所述第一间基因修饰的MSC表达的异源多肽的异源多肽，或编码并表达溶瘤病毒、或它们的组合，其中所述异源多肽选自：TRAIL、EGFR纳米抗体-TRAIL融合物、血小板反应蛋白(TSP)-1、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、HSV-TK、胞嘧啶脱氨酶(CD)。

在另一个实施方案中，所述第一基因修饰的间充质干细胞和所述第二基因修饰的间充质干细胞，如果存在的话，被包封在基质中。

在另一个实施方案中，所述基因修饰的T细胞被包封在基质中。

在另一个实施方案中，所述基质允许细胞迁移出所述基质。

在另一个实施方案中，所述异源免疫调节多肽是检查点抑制剂多肽。

在另一个实施方案中，所述检查点抑制剂多肽包含结合选自以下的检查点多肽的抗体或其抗原结合结构域：PD-L1、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3或TIGIT。

在另一个实施方案中，所述检查点抑制剂多肽包含结合PD-L1的抗体或其抗原结合结构域。

在另一个实施方案中，特异性结合在癌症的细胞表面上表达的肿瘤抗原的所述异源结合结构域特异性结合选自以下的多肽：EGFRvIII、HER2、CD133、EGFR、IL13RA2、HER2、CSF1-R、L1-CAM、CTAG1B、GD2和EGFR。

在另一个实施方案中，所述异源结合结构域特异性结合EGFRvIII。

在另一个实施方案中，本文所述的组合物还包含药学上可接受的载体。

在另一个实施方案中，本文所述的组合物用于治疗实体瘤癌症。

在另一个实施方案中，癌症是转移性癌症。

在另一个实施方案中，癌症是成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、乳腺癌、黑素瘤或非小细胞肺癌。

本文所述技术的另一方面提供了用于治疗实体瘤的试剂盒，所述试剂盒包含组合物的实施方案及用于其的包装材料，所述组合物包含(a)在其细胞表面上表达嵌合T细胞抗原受体的基因修饰的T细胞，所述嵌合T细胞抗原受体包含异源结合结构域和细胞内信号传导结构域，所述异源结合结构域特异性结合在癌性肿瘤的细胞表面上表达的肿瘤抗原，其中所述异源结合结构域与癌细胞表面上的肿瘤抗原的结合激活所述细胞内信号传导结构域和所述T细胞；和(b)表达如本文所述的异源免疫调节多肽的第一基因修饰的间充质干细胞。在一个实施方案中，所述试剂盒还包含表达不同的异源多肽，或编码并递送溶瘤病毒；或它们的组合的第二基因修饰的MSC，所述异源多肽例如包括但不限于：IL-12、IL-2、IL-5、IL-15、TRAIL、EGFR纳米抗体-TRAIL融合物、血小板反应蛋白(TSP)-1、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、HSV-TK和胞嘧啶脱氨酶(CD)。在一个实施方案中，将所述基因修饰的间充质干细胞、所述基因修饰的T细胞或两者包封在如本文所述的基质中。在另一个实施方案中，所述基质允许细胞迁移出所述基质。

定义

本文中所使用的术语“降低”、“减少”、“抑制”或它们的其它语法形式意指减少统计学上显著的量。在一些实施方案中，“减少”或“降低”或“抑制”通常意指与参考水平(例如，在不存在给定的治疗或试剂的情况下)相比至少10％的降低，并且可以包括例如至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或更多的降低。如本文中所使用的，“抑制”不包括与参考水平相比的完全抑制。“完全抑制”是指与参比水平相比100％的抑制。在适用的情况下，对于未患有给定疾病(例如，癌症)的对象，降低可以优选地将降至在正常范围内接受的水平。

本文中所使用的术语“增加的”、“增加”、“增强”或它们的语法形式意指增加静态显著量。在一些实施方案中，术语“增加的”、“增加”或“增强”可以意指与参考水平相比至少10％的增加，例如与参考水平相比，至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的增加或高达且包括100％的增加或10-100％的任何增加，或与参考水平相比，至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍增加，或2倍至10倍的任何增加、或更大的增加。

如本文中所使用的，“对象”意指人或动物。通常，所述动物是脊椎动物，诸如灵长目动物、啮齿目动物、家畜或狩猎动物。灵长目动物包括例如黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(例如恒河猴)。啮齿目动物包括例如小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔和仓鼠。家畜和狩猎动物包括例如牛、马、猪、鹿、野牛、猫科动物物种(例如家猫)、犬科动物物种(例如狗、狐狸、狼)、禽类物种(例如鸡、鸸鹋、鸵鸟)和鱼(例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。在一些实施方案中，对象是哺乳动物，例如灵长目动物，例如人。

优选地，对象是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长目动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人类以外的哺乳动物可有利地用作代表疾病(例如癌症)的动物模型的对象。对象可以是雄性或雌性。

对象可以是先前已经被诊断患有或被鉴定为患有或具有需要治疗的病况(例如成胶质细胞瘤或另一种类型的癌症等)或与此类病况相关的一种或多种并发症的对象，并且任选地已经经历了对所述病况或与所述病况相关的一种或多种并发症的治疗。可替代地，对象也可以是先前未被诊断为患有此类病况或相关并发症的对象。例如，对象可以是表现出病况的一种或多种风险因素或与病况相关的一种或多种并发症的对象或不表现出风险因素的对象。

如本文中所使用的，术语“嵌合的”是指至少两种或更多种不同多核苷酸分子的部分融合的产物。在一个实施方案中，术语“嵌合的”是指通过操纵已知元件或其它多核苷酸分子产生的基因表达元件。

如本文中所使用的，“基因修饰的”是指已经被改变以引入其基因组成的变化的细胞(例如，T细胞或MSC)。细胞可以是基因修饰以含有和/或表达来自一个或多个在其基因组中未发现的外源核酸序列的基因产物(例如经基因修饰以表达嵌合T细胞抗原受体的T细胞，或经基因修饰以表达来自异源核酸序列的基因产物的MSC)。可替代地，可以对细胞进行基因修饰，以过表达或灭活或破坏一种或多种基因或多肽的表达。本领域技术人员将知道如何使用标准基因编辑方法将变化引入细胞基因组。

在一些实施方案中，“激活”可以指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。T细胞激活诱导细胞因子产生，其包括但不限于IL-2的产生。T细胞激活也可以指可检测的效应子功能的上调，其包括但不限于靶细胞的细胞毒性。最低限度地，如本文中所使用的“激活的T细胞”是增殖性T细胞。

如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指两个分子、化合物、细胞和/或颗粒之间的物理相互作用，其中第一实体以比其与非靶标的第三实体结合更高的特异性和亲和力与第二靶标实体结合。在一些实施方案中，特异性结合可以指第一实体对第二靶标实体的亲和力，其在相同条件下比对第三非靶标实体的亲和力高至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍或更多。对特异性针对给定靶标的试剂是在所利用的测定条件下对该靶标展现出特异性结合的试剂。非限制性实例包括抗体或配体，其识别并结合同源结合配偶体(例如，肿瘤抗原或检查点多肽)蛋白。为了避免疑问，如本文中所使用的，“特异性结合”还需要结合因子(如多肽或抗体结合结构域)结合靶标(如存在于细胞表面上的分子)的能力，其中K_D为10^-5M(10000nM)或更低，例如10^-6M或更低、10^-7M或更低、10^-8M或更低、10^-9M或更低、10^-10M或更低、10^-11M或更低、或10^-12M或更低。特异性结合可能受例如多肽试剂的亲和力和亲合力以及多肽试剂的浓度的影响。本领域普通技术人员可以确定合适的条件，在该条件下，本文中所述的结合剂使用任何合适的方法(如在合适的细胞结合测定中滴定多肽试剂)选择性地结合靶标。

在一个实施方案中，如本文中所使用的术语“工程化的”及其语法等价物可以指核酸(例如生物体基因组或基因组成内的核酸)的一种或多种人类设计的改变。该术语可指基因的改变、添加和/或缺失。“工程化的细胞”可以指具有添加的、缺失的和/或改变的基因的细胞(例如，工程化以表达嵌合T细胞抗原受体的T细胞)。如本文中所使用的术语“细胞”或“工程化的细胞”和它们的语法等价物可以指人或非人动物来源的细胞。

如本文中所使用的术语“多肽”是指氨基酸的聚合物。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。肽是相对短的多肽，通常长度在约2至60个氨基酸。本文中所使用的多肽通常含有最常见于蛋白质中的氨基酸(如20个L-氨基酸)。然而，可以使用本领域已知的其它氨基酸和/或氨基酸类似物。多肽中的一个或多个氨基酸可以被修饰，例如，通过添加化学实体(如碳水化合物基团、磷酸基团、脂肪酸基团，用于缀合、官能化等的连接子)。具有与其共价或非共价缔合的非多肽部分的多肽仍然被认为是“多肽”。示例性的修饰包括糖基化和棕榈酰化。多肽可以从天然来源纯化，使用重组DNA技术产生或通过化学方法(如常规固相肽合成等)合成。如本文中所使用的术语“多肽序列”或“氨基酸序列”可以指多肽材料本身和/或生化表征多肽的序列信息(即，用作氨基酸名称缩写的连续的字母或三字母代码)。除非另有说明，否则本文所呈现的多肽序列以N-末端至C-末端的方向呈现。

在一些实施方案中，编码如本文所述多肽(例如免疫调节多肽)的核酸包含在载体中。在本文所述的一些方面，编码如本文所述的给定多肽或其任何模块的核酸序列与载体可操作地连接。如本文中所使用的术语“载体”是指被设计用于递送至宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文中所使用的，载体可以是病毒或非病毒的。术语载体”包括当与适当的控制元件缔合时能够复制并且能够将基因序列转移到细胞中的任何遗传元件。载体可以包括但不限于克隆载体、表达载体、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、人工染色体、病毒、病毒体等。

如本文中所使用的，术语“表达载体”是指指导RNA或多肽从与载体上转录调节序列连接的序列中表达的载体。表达的序列通常但不一定是细胞异源的。表达载体可以包含另外的元件，例如，表达载体可以具有两个复制系统，从而允许其在两个生物体(例如在用于表达的人细胞和在用于克隆和扩增的原核生物宿主)中维持。术语“表达”是指涉及产生RNA和蛋白质以及适当地分泌蛋白质的细胞过程，其在适用的情况下包括但不限于例如转录、转录加工、翻译和蛋白质折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA，和通过翻译从基因转录的mRNA获得的多肽。术语“基因”意指当与适当的调节序列可操作地连接时，在体外或体内被转录(DNA)成RNA的核酸序列。基因可以包括或可以不包括编码区之前和之后的区域，例如5’非翻译(5'UTR)或“前导”序列和3’UTR或“尾随”序列，以及各编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。

如本文中所使用的，术语“病毒载体”是指核酸载体构建体，其包括病毒来源的至少一个元件并具有包装到病毒载体颗粒中的能力。病毒载体可以含有编码本文中所述多肽的核酸来代替非必需病毒基因。载体和/或颗粒可被用于在体外或体内将核酸转移到细胞中的目的。许多形式的病毒载体是本领域已知的。

“重组载体”意指包括能够在体内表达的异源核酸序列或“转基因”的载体。应当理解，在一些实施方案中，本文中所述的载体可以与其它合适的组合物和疗法联合。在一些实施方案中，载体是附加型的。合适的附加型载体的使用提供了将对象中目的核苷酸维持在高拷贝数的染色体外DNA中从而消除染色体整合的潜在影响的方法。

如本文中所使用的，术语“治疗(treat/treatment/treating)”或“改善”是指治疗性治疗，其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与疾病或病症(例如成胶质细胞瘤或其它实体瘤癌症)相关的病况的进展或严重性。术语“治疗”包括减少或减轻病况、疾病或病症的至少一种副作用或症状。如果一个或多个症状或临床标志物减少，治疗通常是“有效的”。可替代地，如果疾病的进展减少或停止，治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，而且包括与在没有治疗的情况下预期的相比，停止或至少减缓症状的进展或恶化。有益的或期望的临床结果包括但不限于减轻一种或多种症状，缩小疾病程度，稳定(即不恶化)疾病状态，延迟或减缓疾病进展，改善或缓和疾病状态，缓解(不论是部分或全部)和/或降低死亡率(无论是可检测的还是不可检测的)。术语疾病的“治疗”还包括减轻疾病的RS或副作用(包括姑息治疗)。

如本文中所使用的，术语“施用”是指通过使试剂在所期望的部位至少部分递送的方法或途径将如本文中所公开的治疗或药物组合物置于对象中。包含如本文中所公开的试剂的药物组合物可以通过任何适当的途径施用，其产生对象的有效治疗。

单数术语“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指示。类似地，词语“或”旨在包括“和”，除非上下文另外清楚地指示。尽管与本文中所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可被用于本公开的实践或测试中，但合适的方法和材料描述如下。缩写词“例如(e.g.)”衍生自拉丁文例如(exempli gratia)，并且在本文中被用于表示非限制性实例。因此，缩写词“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。

在以下技术的各个方面和实施方案的描述中定义了其它术语。

附图简述

该专利或申请文件包含至少一张彩色附图。经请求并支付必要的费用，专利局将提供具有彩色附图的该专利或专利申请公开的副本。

图1A-E描绘了显示外科手术的GBM肿瘤切除减少骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)并增强DC和T细胞的浸润的实验数据。从来自不同无肿瘤(TF)的全脑和携带CT2A-FmC肿瘤的切除前后的脑中分离单核细胞，并用识别CD45、CD11b、Gr-1、CD11c、CD4和CD8的抗体染色，并通过流式细胞术分析。显示了(图1A)MDSC(CD45^高CD11b^高Gr-1^高)和(图1B)淋巴细胞(CD45^高CD11b^低)的百分比。图1C-E显示了流式细胞术图(C)和显示不同时间点的CD4+和CD8+效应T细胞的图(D-E)。

图2A-E描绘了显示MSC-IFNβ具有双重细胞毒性和免疫调节功能的实验数据。图2A显示了CT-2A和GL261 cDNA提取物中IFNAR1/2转录物的RT-PCR分析。图2B显示了用mIFN13处理后对CT2A细胞裂解物的蛋白质印迹分析，其显示STAT1、p38的磷酸化状态。图2C显示了细胞周期分析的代表性流式细胞术密度图。图2D显示了显示用MSC-mIFN13和MSC-GFP条件培养基处理的CT2A细胞的存活率的图。显示了表达mIFN13的MSC的代表性荧光图像。图2E显示了瘤内注射MSC-mIFN13或MSC-GFP的携带CT2A-FmC的C57/B6或SCID小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。

图3A-E描绘了显示小鼠GBM细胞表达PD-L1和MSC-ScFv-PD-L1在切除的GBM中具有抗肿瘤功效的实验数据。图3A-B显示了对小鼠GBM细胞的(A)蛋白质印迹和(B)流式细胞术分析以评估PD-L1的表达。显示为蓝色的未染色细胞被用于比较。图3C描绘了表达可分泌ScFv-PD-L1的逆转录病毒载体的设计。图3D描绘了显示用来自MSC-ScFV-PD-L1和EGFRvIIICAR T细胞的条件培养基处理的表达EGFRvIII-Fluc的GBM细胞(GBM:T细胞的比率为1:5)的存活的图。显示了用RV-ScFV-PD-L1转导的MSC的荧光图像。图3E显示了瘤内注射MSC-ScFv-PD-L1或MSC-GFP的携带CT2A-FmC肿瘤的C57/B6小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。

图4描绘了显示表达CCL-2的MSC的实验数据。培养小鼠和人MSC和GBM细胞，并在培养细胞24小时后获得的条件培养基上使用抗CCL2抗体进行蛋白质印迹分析。

图5A-C显示了MSC-IFNβ处理在体外和体内上调肿瘤细胞上的PD-L1。图5A-B显示了在存在或不存在10μg/mL IFNaR1阻断抗体的情况下用(A)重组IFNβ处理的Gl261-FmC或(B)与MSC-IFNβ或MSC-GFP共培养的Gl261-FmC，接着在处理后48h进行肿瘤细胞PD-L1表达的FACS分析的MAR1-5A3。图5C显示了FACS分析，其显示在瘤内注射MSC-IFNβ或MSC-GFP后3天，从携带GL261-FmC肿瘤的小鼠分离的肿瘤细胞上的PD-L1的表达。

图6A-F显示了MSC介导的IL-12表达在体外诱导CD4和CD8 T细胞应答并影响体内肿瘤体积。图6A显示了表达IL-12的小鼠MSC的显微照片。图6B显示了蛋白质印迹分析，其显示IL-12在细胞裂解物和条件培养基中的表达。图6C描绘了显示用抗CD3和抗CD28激活并在存在1μL来自MSC-IL-12和MSC-GFP的浓上清液的情况下培养的分选的T细胞的图。图6D-E显示了激活的T细胞后进行IFNγ和颗粒酶B的细胞内染色。图显示了CD4 T细胞(D)中的％IFNγ+细胞和CD8+T细胞(E)中的％颗粒酶B+细胞。插图显示了代表性的流式细胞术图。图6F显示了携带同基因脑肿瘤的小鼠瘤内植入5×10⁵个MSC-IL-12或MSC-GFP。图显示了肿瘤体积随时间变化。

图7A-D显示了Tet可调节系统的效率。图7A显示了可调节的双启动子载体设计。图7B-C显示了显示在体外(1μg/mL)诱导9TB-Dox后(B)和在颅内植入MSC-GFP-Fluc(1×10⁵个)并在MSC植入后12小时开始以初始剂量每天两次腹膜内施用9TB-dox(10mg/kg)的小鼠中(C)表达可调节GFP-Fluc的MSC的活性的图和代表性图像。图7D显示了用LV-TET-IL2转导并用9TB-Dox处理的裂解物MSC-N1KO的蛋白质印迹分析。

图8A-F显示了EGFRvIII CAR工程化的T细胞在培养中具有抗肿瘤作用。图8A显示了人和小鼠的EGFRvIII CAR设计。图8B显示了用于转导T细胞的慢病毒和逆转录病毒构建体。图8C显示了从PBMC中分离T细胞并用抗CD3+28珠激活24小时，然后加入LV-EGFRvIICAR-Fluc上清液。转导后三天，收获T细胞用于流式细胞术分析，其中通过SYTOX^TM活/死染色随后通过GFP表达将细胞门控为活细胞，并将转导的T细胞用作对照(C)。图8D显示了用CD3z抗体进行的蛋白质印迹分析。图8E-F显示了人GBM-vIII-mCherry-fluc细胞与CAR转导的T细胞或未转导的细胞共培养24小时。通过Rluc生物发光和mCherry荧光检测活GBM细胞。计算％特异性裂解。

图9A-B显示了静脉内注射的EGFRvIII CAR工程化的T细胞在携带脑肿瘤的小鼠中没有功效。图10A描绘了实验概况。图9B显示了用EGFRvIII CAR T或表达Fluc的T细胞(1×10⁶个细胞)静脉内处理携带表达EGFR的vIII变体和Rluc的人GBM的小鼠。在体内对小鼠依次成像Fluc(T细胞)和Rluc(肿瘤细胞)。代表性图像包括T细胞成像、肿瘤成像和显示T细胞治疗后肿瘤体积变化的代表性图。

图10A-B显示了经瘤内植入的EGFRvIII CAR工程化的T细胞在携带脑肿瘤的小鼠中具有功效。图10A显示了实验概况。图10B显示了携带表达EGFR的vIII变体和Rluc的人GBM的小鼠肿瘤内植入EGFRvIII CAR T或T细胞(5×10⁵个细胞)。通过体内Rluc成像对小鼠进行肿瘤体积成像。显示了显示T细胞治疗后肿瘤体积变化的代表性图像和图。

图11A-B显示了sECM包封的EGFRvIII CAR工程化T细胞和置于肿瘤切除腔中的释放IL-12的MSC在携带脑肿瘤的小鼠中具有治疗益处。图11A显示了实验概况。图11B显示了携带表达EGFR的vIII变体和Fluc的人GBM的小鼠被切除并植入sECM包封的EGFRvII CAR T和MSC-IL-12或MSC-GFP(每个群体5×10⁵个)。在体内通过Fluc成像对小鼠进行肿瘤体积成像。代表性图显示了治疗后肿瘤体积的变化。

详述

利用免疫系统破坏表达特定细胞表面标记物的细胞的能力的癌症疗法对不形成实体瘤的癌症(如白血病)显示成功作用。特别地，使用表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T)，其通过将修饰的T细胞受体构建体引入T细胞而人为靶向细胞毒性T细胞以杀死肿瘤细胞，其中受体的天然抗原结合域被结合结构域(最常涉及结合肿瘤抗原的抗体的抗原结合结构域)替代。CAR T证明能非常有效地针对非实体瘤癌症。然而，用这种方法靶向实体瘤被证明更具挑战性。事实上，实体瘤微环境是免疫抑制性的，通常含有多于一层的保护层，其阻碍免疫细胞有效到达并杀死肿瘤的转化细胞的能力。仅作为一个实例，许多肿瘤表达免疫检查点配体(如PD-L1)，其正常功能是帮助维持免疫稳态并由此避免自身免疫性。表达PD-L1的肿瘤将倾向于通过与T细胞上表达的负免疫调节子PD-1相互作用来抑制到达肿瘤的细胞毒性T细胞的活性。

在脑肿瘤(如成胶质细胞瘤、神经胶质瘤和成神经管细胞瘤)的情况下，提出了特别困难的情况。其中，血脑屏障倾向于限制全身性施用的试剂接近脑组织和其中的肿瘤。不仅成胶质细胞瘤难以与全身性施用的试剂接触，其中它们生长并侵入正常脑组织的形式使得它们难以手术去除，特别是成胶质细胞瘤倾向于使卷须从肿瘤块中延伸出来，这基本上确保手术不能捕获所有肿瘤细胞。

克服实体瘤中肿瘤表达的免疫检查点分子的免疫抑制作用的一种方法是使用免疫检查点分子的抑制剂，其被称为检查点抑制剂。预期将检查点抑制剂(如抗体或包括其抗原结合结构域的构建体)递送至肿瘤微环境以抵抗检查点分子的抑制信号并允许CAR T有效靶向肿瘤细胞。

检查点抑制剂的全身性递送在一些情况下是有效的，但伴随有不希望的副作用的可能性，以及由于循环半衰期引起的限制。解决这一问题的一种方法是施用表达检查点抑制剂多肽的细胞，从而提供抑制剂的连续供应。

增加T细胞对肿瘤募集的方法可改善CAR T的抗肿瘤作用。已知间充质干细胞既驻留于实体瘤部位，又促进T细胞募集。因此，MSC将倾向于是将治疗分子递送至肿瘤部位的有吸引力的候选物。然而，MSC也由于其免疫抑制作用而是众所周知的-即，MSC抑制T细胞增殖和细胞因子产生，抑制树突细胞扩增和发挥功能，降低自然杀伤(NK)细胞的活性，并增强免疫抑制Treg细胞的活性。参见，例如，Lee等人，Scientific Reports(2017)。已知MSC将T细胞募集到肿瘤部位，但它们在肿瘤微环境中的整体作用可能阻碍此类募集的细胞的作用。因此，尽管MSC具有细胞递送抗肿瘤治疗所期望的特性，但考虑到其众所周知的免疫抑制活性，人们不必预期通过MSC将抗肿瘤剂或甚至检查点抑制剂递送至肿瘤部位以帮助CAR T介导的癌细胞杀伤。相反，人们将预期MSC的免疫抑制活性限制或阻碍CAR T的功效。然而，如本文中所述的，使用MSC递送免疫调节剂可加强CAR-T细胞介导的癌细胞杀伤。

此外，肿瘤的切除促进骨髓来源的抑制性细胞的减少和CD4/CD8 T细胞的同时募集。这样，除了简单地去除癌组织之外，切除还可以有助于抵制免疫抑制肿瘤微环境，并且可以与如本文中所述的施用修饰的MSC和CAR T细胞的方法联合，以达到有益的效果。

基于工程化干细胞和CAR T的疗法被用于癌症研究。然而，本领域没有教导产生和使用表达免疫调节剂和免疫检查点抑制剂的双模MSC和CAR T细胞的功效。本文中所描述的是：(1)工程化的干细胞的局部递送和定向肿瘤细胞表面的CAR T的全身性递送，以用于CART的有效募集和功能性；和(2)在切除的肿瘤微环境内局部释放免疫调节剂和免疫检查点抑制剂并影响肿瘤进展的双模免疫调节干细胞。

本文中所述的MSC是经工程化以递送例如细胞因子、免疫调节剂、病毒或其它与靶向实体瘤的共同施用的CAR T细胞的活性互补的试剂。CAR T细胞被工程化以定向，例如，表达EGFRvIII和IL13Ra2(在肿瘤细胞中特异性表达的细胞表面受体)的肿瘤。工程化的干细胞靶向肿瘤细胞上的细胞表面受体以增强免疫功能并同时在不同条件和不同递送模式下全身性募集注射的CAR T细胞的能力可允许该方法成为癌症疗法中广泛使用的工具。因此，本文中所描述的技术是一类新的治疗剂ESC-CAR T(工程化的干细胞和CAR T)并在本文中教导了在癌症治疗中使用它们的方法。

因此，本文中所述技术的一个方面提供了治疗实体瘤的方法，其包括施用在其细胞表面上表达嵌合T细胞抗原受体的基因修饰的T细胞，所述嵌合T细胞抗原受体包含异源结合结构域和细胞内信号传导结构域，所述异源结合结构域特异性结合在癌症的细胞表面上表达的肿瘤抗原，其中所述异源结合结构域与癌细胞表面上的肿瘤抗原的结合激活细胞内信号传导结构域和T细胞；和施用表达异源免疫调节多肽的第一基因修饰的间充质干细胞，其中所述异源免疫调节多肽增强所述基因修饰的T细胞的癌细胞杀伤。

如本文中所使用的“癌症”可以指展现出正常细胞控制丧失的细胞过度增殖，其导致不受调节的生长、分化的缺乏、局部组织侵袭和转移。癌症可以是实体瘤、白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。本文中所述的方法和组合物主要涉及实体瘤的治疗。如本文中所使用的，术语“肿瘤”是指细胞或组织(例如恶性类型或良性类型)的异常生长。实体瘤的非限制性实例包括肾上腺皮质肿瘤、肺泡软体部分肉瘤、癌、软骨肉瘤、结肠直肠癌、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、内分泌肿瘤、内胚层窦瘤、上皮样血管内皮瘤、尤因氏肉瘤、生殖细胞肿瘤(实体瘤)、骨和软组织的巨细胞瘤、成胶质细胞瘤、肝母细胞瘤，肝细胞癌、黑素瘤、肾瘤、神经母细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤(NRSTS)、骨肉瘤、椎旁肉瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤和Wilms肿瘤。实体瘤可以在骨、肌肉、脑或器官中发现，并且可以是肉瘤或癌，其中本文中所述的技术可以克服用CAR T细胞治疗实体瘤的障碍。预期本文中所述的技术的方面可以被用于治疗所有类型的实体瘤癌症，包括本说明书中未列出的癌症。

CAR T细胞

如本文中所使用的，“嵌合抗原受体”或“CAR”是指人工构建的杂合多肽，其包含抗原结合域(例如，抗体(例如，scFV)的抗原结合部分)、跨膜结构域和T细胞信号传导结构域和/或T细胞激活结构域(例如，细胞内信号传导结构域)。利用单克隆抗体的抗原结合特性，CAR具有以非MHC限制的方式将T细胞特异性和反应性重定向至所选靶标的能力。非MHC限制性抗原识别给予了表达CAR的T细胞不依赖于抗原加工识别抗原的能力，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源性T细胞受体(TCR)α链和β链二聚化。最常见地是，CAR的细胞外结合结构域由单链可变片段(scFv)组成，所述单链可变片段衍生自融合鼠或人源化的单克隆抗体的可变重链区和轻链区。可替代地，可以使用衍生自Fab的(而不是来自抗体，例如从Fab文库获得的)的scFv，在各种实施方案中，该scFv与跨膜结构域融合，然后与细胞内信号传导结构域融合。“第一代”CAR包括在抗原结合时提供CD3ζ信号的那些CAR，“第二代”CAR提供共刺激(例如，CD28或CD137)和激活(CD3ζ)。“第三代”CAR提供多个共刺激(例如，CD28和CD137)结构域和激活结构域(例如，CD3ζ)。在一个实施方案中，选择本技术的CAR多肽对抗原具有高亲和力或亲合力。CAR的进一步讨论可以发现于例如Maus等人，Blood 2014123:2624-35；Reardon等人，Neuro-Oncology 2014 16:1441-1458；Hoyos等人，Haematologica 2012 97:1622；Byrd等人，J Clin Oncol 201432:3039-47；Maher等人，Cancer Res 2009 69:4559-4562；和Tamada等人，Clin Cancer Res2012 18:6436-6445；其中的每一个都通过引用整体并入本文中。

在一些实施方案中，嵌合T细胞抗原受体包含细胞外结合结构域(其包含特异性结合EGFRvIII的异源结合结构域)；跨膜结构域；一个或多个细胞内共刺激信号传导结构域；以及初级信号传导结构域。如本文中所使用的术语“结合结构域”、“细胞外结构域”、“细胞外结合结构域”、“抗原特异性结合结构域”和“细胞外抗原特异性结合结构域”可互换使用，并提供了嵌合T细胞抗原受体，其具有能够特异性结合目的靶标抗原(例如EFGRvIII)的能力。结合结构域可以来源于天然的、合成的、半合成的或重组的来源。

在一些实施方案中，嵌合T细胞抗原受体的结合结构域之后可以是一个或多个“间隔区结构域”，其指移动抗原结合结构域远离效应细胞表面以使适当的细胞/细胞接触、抗原结合和激活成为可能的区域。间隔区结构域可以来源于天然的、合成的、半合成的或重组的来源。

嵌合T细胞抗原受体的结合结构域通常后面是一个或多个“铰链结构域”，其在将抗原结合结构域定位成远离效应细胞表面以允许适当的细胞/细胞接触、抗原结合和激活中起作用。嵌合T细胞抗原受体通常在结合结构域和跨膜结构域(TM)之间包含一个或多个铰链结构域。铰链结构域可以来源于天然的、合成的、半合成的或重组的来源。铰链结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。适用于本文中所述的嵌合T细胞抗原受体的示例性铰链结构域包括来源于1型膜蛋白(如CD8α、CD4、CD28和CD7)的细胞外区的铰链区，其可以是来自这些分子的野生型铰链区或可以被改变。在一个实施方案中，铰链结构域包含人CD8α铰链区。在另一个实施方案中，铰链区包括小鼠CD28铰链区。

“跨膜结构域”是融合细胞外结合部分和细胞内信号结构域并将嵌合T细胞抗原受体锚定到免疫效应细胞的质膜上的嵌合T细胞抗原受体的部分。TM结构域可以来源于天然的、合成的、半合成的或重组的来源。TM结构域可以来源于(即至少包含以下的跨膜区)T细胞受体的α、β或ζ链，CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154和PD1。在一个实施方案中，跨膜结构域包含人CD8α跨膜结构域。在另一个实施方案中，跨膜结构域包含小鼠CD28跨膜结构域。

在一些实施方案中，本文中所预期的嵌合T细胞抗原受体包含细胞内信号传导结构域。“细胞内信号传导结构域”是指嵌合T细胞抗原受体的一部分，其参与将有效的嵌合T细胞抗原受体结合靶抗原的消息转导到免疫效应细胞的内部以引起效应细胞功能(例如激活、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性)，包括将细胞毒性因子释放到嵌合T细胞抗原受体结合的靶细胞，或通过抗原结合嵌合T细胞抗原受体的细胞外结构域而引起的其它细胞应答。在一些实施方案中，本文中所预期的嵌合T细胞抗原受体包含细胞内信号传导结构域，其包含一个或多个“共刺激信号传导结构域”和“初级信号传导结构域”。

如本文中所使用的，术语“共刺激信号结构域”或“共刺激结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体以外的细胞表面分子，其在与抗原结合后提供T淋巴细胞的有效激活和功能所需的第二信号。此类共刺激分子的说明性实例包括CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD270(HVEM)、CD273(PD-L2)、CD274(PD-L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM和ZAP70。在一个实施方案中，细胞内结构域是人4-1BB的细胞内结构域。在另一个实施方案中，细胞内结构域是小鼠CD28的细胞内结构域。

初级信号传导结构域以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级信号传导结构域可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。特别用于本发明的含有初级信号传导结构域的ITAM的说明性实例包括来源于以下的那些ITAM：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一个实施方案中，初级信号传导结构域是小鼠CD3ζ。在另一个实施方案中，初级信号传导结构域是人CD3ζ。

在一个实施方案中，嵌合T细胞抗原受体包含小鼠CD8α前导序列、3C10 scFv、小鼠CD28铰链区、小鼠CD28跨膜结构域、小鼠CD28细胞内信号传导结构域和小鼠CD3z初级信号传导结构域。

在另一个实施方案中，嵌合T细胞抗原受体包含人CD8α前导序列、139scFv、人CD8α铰链区、人CD8α跨膜结构域、人4-1BB细胞内信号传导结构域和人CD3ζ初级信号传导结构域。

在一个实施方案中，嵌合T细胞抗原受体包含结合肿瘤抗原的异源结合结构域。如本文中所使用的，术语“肿瘤抗原”是指癌细胞差异表达并因此可被用于靶向癌细胞的抗原。肿瘤抗原是能够潜在地刺激肿瘤特异性免疫应答的抗原。这些抗原中的一些由正常细胞编码，尽管不一定被表达。这些抗原可以被表征为在正常细胞中正常沉默(即，不表达的)的那些抗原，仅在分化的某些阶段表达的那些抗原和暂时表达的那些抗原(如胚胎抗原和胎儿抗原)。其它肿瘤抗原由突变的细胞基因(如致癌基因(例如，激活的ras致癌基因)、抑制基因(例如，突变的p53))编码和由内部缺失或染色体易位产生的融合蛋白。其它肿瘤抗原可以由病毒基因编码(如在RNA和DNA肿瘤病毒上携带的那些基因)。已经根据多种实体瘤定义了许多肿瘤抗原：通过免疫定义的MAGE 1、2&3；MART-1/Melan-A、gp100、癌胚抗原(CEA)、HER2、粘蛋白(即MUC-1)、前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)。此外，已经显示病毒蛋白(如由乙型肝炎(HBV)、Epstein-Barr(EBV)和人乳头状瘤(HPV)编码的一些蛋白)分别在肝细胞癌、淋巴瘤和宫颈癌的发展中是重要的。

在一个实施方案中，肿瘤抗原是EGFRvIII。如本文中所使用的，术语“EGFRvII”或“表皮生长因子受体”或“EGFR”是指作为细胞外蛋白配体的表皮生长因子家族成员的受体的跨膜蛋白。EGFR是ErbB受体家族的成员。EGFR序列对于许多物种是已知的，例如人CD28(NCBI基因ID：1956)、mRNA(NCBI参考序列号_001346897.1)和多肽序列(NP_001333826.1，SEQ ID NO：26)和小鼠多肽序列(NP_997538.1，SEQ ID NO：27)。EGFR可以指人EGFR，包括其天然存在的变体和等位基因。例如在兽医应用的一些实施方案中，EGFR可以指例如狗、猫、牛、马、猪等的CD28。人EGFR的同源物和/或直向同源物易于由本领域技术人员针对此类物种进行鉴定，例如使用NCBI直向同源物搜索功能或针对给定物种搜索可用序列数据以寻找与参考EGFR序列类似的序列。结合EGFRvIII的抗体的实例可见于表1中总结的US20140322275A1中。

EGFR信号传导的过度表达和导致EGFR变体的突变已经与疾病状态(如癌症)相关。具体而言，已显示EGFR变体III(EGFRvIII)的异常信号传导在驱动肿瘤进展中是重要的，并且经常与不良预后相关；EGFRvIII与诊断为成胶质细胞瘤的对象的神经胶质瘤细胞的增殖增加有关。

EGFRvIII是EGFR的最常见的细胞外突变，并且也被称为de2-7EGFR和ΔEGFR。EGFRvIII由跨越EGFR编码序列的外显子2-7的801个碱基对的框内缺失导致，导致从细胞外结构域缺失267个氨基酸。

抗体试剂

如本文中所使用的，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。该术语还指由两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链组成的抗体以及各种形式，其包括全长抗体及其抗原结合部分；其包括，例如，免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单结构域抗体(dAb)、双链抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体、抗独特型抗体、双特异性抗体、它们的功能活性表位结合部分、和/或双功能杂合抗体。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分是完全人抗体。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分是人源化抗体或抗体试剂。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分是完全人源化的抗体或抗体试剂。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分是嵌合抗体或抗体试剂。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分是重组多肽。在一些实施方案中，嵌合T细胞抗原受体包含结合EGFRvIII的细胞外结构域，其中细胞外结构域包含人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合部分。

术语“人抗体”是指其可变区和恒定区对应于或来源于人生殖细胞系的免疫球蛋白序列的抗体，如例如Kabat等人(参见Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Healthand Human Services)，NIH出版号91-3242)所述的。然而，人抗体可以含有不由人生殖细胞系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中，并且特别是在CDR3中。如本文中所述的重组人抗体具有可变区，并且还可以含有来源于人生殖细胞系的免疫球蛋白序列的恒定区(参见Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国卫生与公众服务部，NIH出版号91-3242)。然而，根据具体的实施方案，对此类重组人抗体进行体外诱变(或体细胞体内诱变，如果使用由于人Ig序列而被转基因的动物的话)，使得重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是尽管与人生殖细胞系的VH序列和VL序列相关或来源于人生殖细胞系的VH序列和VL序列，但在人抗体生殖细胞系所有组成成分内不是天然存在于体内的序列。根据具体的实施方案，这种重组抗体是选择性诱变或反向突变或两者的结果。优选地，诱变导致对靶标的亲和力更大，和/或对非靶标结构的亲和力小于亲本抗体的亲和力。从本文中所提供的序列和信息产生人源化抗体可以由本领域普通技术人员在不进行过度实验的情况下实施。在一种方法中，存在四个被用于人源化单克隆抗体的一般步骤，参见，例如，美国专利第5,585,089号；第6,835,823号；第6,824,989号。这些是：(1)确定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸和预测氨基酸序列；(2)设计人源化抗体，即决定在人源化过程中使用哪种抗体框架区；(3)实际的人源化方法/技术；和(4)人源化抗体的转染和表达。

通常人源化抗体和人抗体变体中的CDR区与它们所来源的小鼠或人抗体中的相应CDR区基本上相同，并且更通常是相同的。在一些实施方案中，可以进行CDR残基的一个或多个保守性氨基酸取代，而不会明显影响所得人源化免疫球蛋白或人抗体变体的结合亲和力。在一些实施方案中，CDR区的取代可增强结合亲和力。

在一些实施方案中，抗体是纳米抗体。如本文中所使用的，“纳米抗体”是指包含单个单体可变抗体结构域的单结构域抗体。纳米抗体选择性地结合特异性抗原，类似于抗体。纳米抗体的尺寸通常很小，范围为12-15kDa。设计和产生纳米抗体的方法是本领域已知的，并进一步描述于Ghahroudi等人，FEBS Letters.Sept 1997,414:3(521-526)，其通过引用整体并入本文中。

在一些实施方案中，如本文中所述的检查点抑制剂多肽包含抗体或其抗原结合结构域，其结合选自以下的检查点多肽：PD-L1、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3或TIGIT。在一些实施方案中，抗体与与如本文中所描述的序列SEQ ID NO:1-27中的任何一个互补的氨基酸序列结合。表1总结了可被用于本文中所述的组合物和方法的抗体的实例。

表1：抗体靶标和抗体的总结

基因修饰间充质干细胞

间充质干细胞(MSC)是自我更新的多能干细胞，其包含在引入适当的分化提示时分化成各种细胞类型的能力，所述细胞类型包括但不限于白色脂肪细胞、棕色脂肪细胞、成肌细胞、骨骼肌，心肌、平滑肌、软骨细胞和成熟成骨细胞。MSC可以使用本领域已知的技术产生，例如，由通过包括分散胚胎干(ES)细胞集落并用MSC条件培养基培养细胞获得细胞的过程。可以通过评估MSC群体的表面标志物来确认MSC群体。例如，至少95％或更多的MSC细胞群表达CD73/5’-核苷酸酶、CD90/Thy1和CD105/Endoglin，2％或更少的MSC细胞群表达CD34、CD45、CD11b/整合素αM或CD14、CD79α或CD19和HLA II类。可以使用本领域已知的技术(例如FACS分析)来评估这些表面标记物的表达。

MSC可以容易地被提取，并且由于其移动到肿瘤部位的倾向，可用于将治疗剂递送到所述肿瘤和肿瘤微环境。MSC肿瘤趋向性(向肿瘤部位的移动)被认为是由肿瘤微环境和MSC细胞表面上的相应受体之间的旁分泌信号传导驱动的。对MSC治疗用途的进一步讨论可见于例如Sage等人，Cytotherapy 18:1435-1445(2016)。

MSC经由趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2，被称为MCP-1和小诱导型细胞因子A2)的表达将单核细胞、T细胞和树突细胞募集到感染或损伤(例如肿瘤切除)后的炎症部位。CCL2序列对于许多物种是已知的，例如人CD28(NCBI基因ID:6347)。CCL2可以指人CCL2，包括其天然存在的变体和等位基因。在例如兽医应用的一些实施方案中，CCL2可指例如狗、猫、牛、马、猪等的CCL2。人CCL2的同源物和/或直向同源物易于由本领域技术人员针对此类物种进行鉴定，例如使用NCBI直向同源物搜索功能或针对给定物种搜索可用序列数据以寻找与参考CCL2序列类似的序列。预期经基因修饰以表达增加水平的CCL2(与野生型CCL2水平相比)的MSC与野生型MSC相比，将具有更大的将T细胞募集到损伤部位(例如肿瘤切除)的能力。

在一个实施方案中，对细胞(例如T细胞或MSC)进行基因修饰以表达包含免疫调节剂的多肽。“免疫调节剂”是指具有修饰对象免疫系统的能力的试剂，例如，多肽可以诱导、扩增、减弱或预防免疫应答。应当理解，尽管任何抗原可以是免疫调节剂，即诱导免疫应答，但如本文中所用的术语“免疫调节剂”修饰肿瘤的免疫微环境，例如在免疫效应物的募集、免疫效应物的活性或免疫抑制因子的抑制、它们的表达或它们的活性方面。免疫调节剂可以是天然存在的(例如调节性T细胞或细胞信号传导分子)或工程化的(例如免疫疗法)。示例性免疫调节剂包括例如检查点抑制剂、阿夫土珠单抗(afutuzumab)(可获自

)、培非格司亭

IL-12、IL-2、IL-5、IL-15、TRAIL、EGFR纳米抗体-TRAIL融合物、血小板反应蛋白(TSP)-1、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、HSV-TK、胞嘧啶脱氨酶(CD)、溶瘤病毒(如oHSV、oHSV-TRAIL、oHSV-GMCSF或腺病毒)。

在一个实施方案中，免疫调节肽增强癌细胞杀伤。如本文中所使用的，“增强癌细胞杀伤”是指与在不包含免疫调节多肽的MSC存在下，单独的或可替代地，由基因修饰的T细胞杀死癌细胞的能力相比，在包含免疫调节多肽的基因修饰的MSC存在下，由基因修饰的T细胞杀死癌细胞的能力增加。

如本文中所述的免疫调节肽的存在增加了基因修饰的T细胞杀死癌细胞的功效。

在一个实施方案中，免疫调节多肽是检查点抑制剂多肽。在一个实施方案中，检查点抑制剂多肽是特异性结合至少一种免疫检查点多肽的抗体、抗体试剂或其抗原结合片段。靶向治疗的常见检查点包括但不限于PD-1、TIGIT、CTLA4、TIM3、LAG3和PD-L1。它们的检查点活性的抑制剂是本领域已知的。检查点抑制剂的非限制性实例(具有括号中注明的检查点靶标和制造商)可以包括：MGA271(B7-H3：MacroGenics)；易普利姆玛(CTLA-4；BristolMeyers Squibb)；派姆单抗(PD-1；Merck)；纳武单抗(PD-1；Bristol Meyers Squibb)；阿特珠单抗(PD-L1；Genentech)；加利昔单抗(B7.1；Biogen)；IMP321(LAG3：Immuntep)；BMS-986016(LAG3；Bristol Meyers Squibb)；SMB-663513(CD137；Bristol-Meyers Squibb)；PF-05082566(CD137；Pfizer)；IPH2101(KIR；Innate Pharma)；KW-0761(CCR4；KyowaKirin)；CDx-1127(CD27；CellDex)；MEDI-6769(OX40；MedImmune)；CP-870,893(CD40；Genentech)；曲美木单抗(CTLA-4；Medimmune)；匹利珠单抗(PD-1；Medivation)；MPDL3280A(PD-L1；Roche)；MEDI4736(PD-L1；AstraZeneca)；MSB0010718C(PD-L1；EMD Serono)；AUNP12(PD-1；Aurigene)；阿维鲁单抗(PD-L1；Merck)；度伐利尤单抗(PD-L1；Medimmune)；TSR-022(TIM3；Tesaro)。在一个实施方案中，检查点抑制剂多肽包含结合PD-L1的抗体或其抗原结合试剂。

如本文中所使用的，“PD-1”或“程序性细胞死亡1”或“分化簇279”或“CD279”是抑制T细胞和祖B细胞表达的免疫系统的表面受体蛋白。PD-1由PDCD-1基因(基因ID:5133)编码。PD-1的序列对于许多物种是已知的，例如人PD-L1 mRNA序列(例如，NM_005018.2)和多肽序列(例如，NP_005009.2，SEQ ID NO:2)，以及鼠PD-1多肽序列(例如，NP_032824.1，SEQID NO:15)，连同其任何天然存在的等位基因、剪接变体和加工形式。

如本文中所使用的，“PD-L1”或“程序性细胞死亡1配体1”或“分化簇274”或“CD274”或“B7同源物1”或“B7-H1”是抑制T细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、骨髓树突细胞、上皮细胞、B细胞和血管内皮细胞表达的免疫系统的蛋白质。PD-L1由PD-L1基因(基因ID:29126)编码。PD-L1的序列对于许多物种是已知的，例如人PD-L1同种型a、b和c mRNA序列(例如PD-L1 NCBI参考序列是NM_014143.3、NM_001267706.1、NR_052005.1)和多肽序列(例如NP_054862.1，SEQ ID NO:1，001254635.1，SEQ ID NO:12和NP_001300958.1，SEQ ID NO:13)，以及鼠PD-L1多肽序列(例如，NP_068693.1，SEQ ID NO:14)，连同其任何天然存在的等位基因、剪接变体和加工形式。

PD-L1与其受体PD-1的结合传递抑制信号，该抑制信号降低T细胞的增殖并可诱导细胞凋亡。已经显示异常的PD-L1和/或PD-1信号传导促进各种肿瘤中的癌细胞逃避。PD-L1/PD-1阻断可以通过多种机制实现，包括结合PD-1或其配体PD-L1的抗体。PD-1和PD-L1阻断剂的实例描述于美国专利第7,488,802号；第7,943,743号；第8,008,449号；第8,168,757号；第8,217,149号和PCT公开专利申请：第WO03042402号、第WO2008156712号、第WO2010089411号、第WO2010036959号、第WO2011066342号、第WO2011159877号、第WO2011082400号和第WO2011161699号；其全文通过引用整体并入本文中。在某些实施方案中，PD-1抑制剂包括抗PD-L1抗体。PD-1抑制剂包括抗PD-1抗体和类似的结合蛋白，如抗PD-1抗体克隆RMP1-14、纳武单抗(MDX 1106、BMS 936558、ONO 4538)、完全人IgG4抗体(其通过其配体PD-L1和PD-L2结合并阻断PD-1的激活)；lambrolizumab(MK-3475或SCH 900475)(针对PD-1的人源化单克隆IgG4抗体)；CT-011(结合PD-1的人源化抗体)；AMP-224(B7-DC的融合蛋白)；抗体Fc部分；用于PD-L1(B7-H1)阻断的BMS-936559(MDX-1105-01)。

如本文中所使用的，“TIGIT”或“具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体”是指由TIGIT基因编码的PVR(脊髓灰质炎病毒受体)家族的免疫球蛋白。用于TIGIT的序列对于许多物种是已知的，例如人TIGIT(TIGIT NCBI基因ID是201633)、mRNA序列(例如NM_173799.3)和多肽序列(例如NP_776160.2，SEQ ID NO:6)，以及鼠TIGIT多肽序列(例如NP_001139797.1，SEQ ID NO:7)，连同其任何天然存在的等位基因、剪接变体及加工形式。抗TIGIT抗体是本领域已知的并且在本文中描述，例如在表1和其中的参考文献中。

编码本文中所述或本领域已知的任何检查点抑制剂抗体的结合结构域的核酸可以被用于通过如本文中所述的MSC工程化检查点抑制剂的表达。类似地，编码如本文中所述的或如本领域已知的肿瘤抗原结合抗体的结合结构域的核酸可以被用于工程化如本文中所述的嵌合T细胞抗原受体的表达。

如本文中所使用的，“CTLA-4”或“细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4”或“CD152”是指下调免疫应答并由调节性T细胞组成型表达的蛋白受体。CTLA-4由CTLA-4基因(基因ID:1493)编码。CTLA-4的序列对于许多物种是已知的，例如人CTLA-4mRNA序列(例如NM_005214.5)和多肽序列(例如NP_005205.2，SEQ ID NO:3)以及鼠CTLA-4多肽序列(例如NP_033973.2，SEQ ID NO:8)，连同其任何天然存在的等位基因、剪接变体和加工形式。抗CTLA-4抗体在本领域是已知的，并且在本文中描述，例如，在表1和其中的参考文献中。

如本文中所使用的，“TIM-3”或“含有T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3”或“甲型肝炎病毒细胞受体”或“HAVCR2”是指由CD4+Th1和CD8+Tc1细胞表达的细胞表面蛋白，其介导T细胞耗尽和功能丧失。TIM-3由HAVCR2基因(基因ID:84868)编码。用于TIM-3的序列对于许多物种是已知的，例如人TIM-3mRNA序列(例如，NM_032782.4)，和多肽序列(例如，NP_116171.3，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:9)，以及鼠TIM-3多肽序列(例如，NP_599011.2，SEQID NO:10)，连同其任何天然存在的等位基因、剪接变体及加工形式。抗TIM-3抗体在本领域是已知的，并且在本文中描述，例如，在表1和其中的参考文献中。

如本文中所使用的，“LAG-3”或“淋巴细胞激活基因3”或“分化簇223”或“CD223”是指以与PD-1和CTLA-4类似的机制负调节T细胞的细胞增殖、激活和内稳态的细胞表面分子。LAG-3由激活的T细胞、自然杀伤细胞、B细胞和浆细胞样树突细胞表达。LAG3由LAG3基因(基因ID:3902)编码。LAG-3的序列对于许多物种是已知的，例如人LAG-3mRNA序列(例如，NM_002286.5)和多肽序列(例如，NP_002277.4，SEQ ID NO：5)，以及鼠LAG-3多肽序列(例如，NP_002277.4，SEQ ID NO：11)，连同其任何天然存在的等位基因、剪接变体和加工形式。抗LAG-3抗体在本领域是已知的，并且在本文中描述，例如，在表1和其中的参考文献中。

在一个实施方案中，对第二经基因修饰的MSC进行工程化以递送包含以下的异源多肽：细胞因子(例如白介素(IL)-12B(NCBI基因ID:3593)、IL-2(NCBI基因ID:3558)、IL-5(NCBI基因ID:3567)、IL-15(NCBI基因ID:3600)、TNF相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL；也被称为TNF超家族成员10、TL2、CD253或TNLG6A；NCBI基因ID:8743)、EGFR纳米抗体-TRAIL融合物、血小板反应蛋白(THBS)-1(NCBI基因ID:7057)、干扰素(例如干扰素α-1(NCBI基因ID:3439)、干扰素β-1(NCBI基因ID:3456)或干扰素γ(NCBI基因ID:3458))、单纯疱疹病毒-1胸苷激酶(HSV-TK；NCBI基因ID:7083)、或胞嘧啶脱氨酶(例如，大肠杆菌(E.coli)(CD；NCBI基因ID:944996)。除非另有说明，这些多肽可以指人多肽，包括其天然存在的变体和等位基因。例如在兽医应用中的一些实施方案中，多肽可以指例如狗、猫、牛、马、猪等的多肽。这些多肽的同源物和/或直向同源物易于由本领域技术人员针对此类物种进行鉴定，例如使用NCBI直向同源物搜索功能或者针对给定物种搜索可用序列数据以寻找与给定参考序列类似的序列。

还预期MSC可以被用于递送溶瘤病毒(例如溶瘤HSV)、腺病毒或其它溶瘤构建体。溶瘤病毒的递送还描述于第PCT/US2013/031,949号和第PCT/2014/069,734号申请中，其通过引用整体并入本文中。溶瘤病毒的非限制性实例包括溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV)、HSV-TRAIL和oHSV粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。

局部细胞递送和基质包封

细胞(无论是如本文中所述的基因修饰的MSC还是如本文所述的CAR-T)的局部递送都可以为癌症治疗提供益处。在一个方面，局部递送可以提供治疗性多肽或效应细胞的高局部浓度。然而，CAR-T疗法的一个益处是嵌合受体上的靶向部分允许经由全身递送定位到癌细胞，并且MSC将治疗性多肽递送到肿瘤微环境的一个益处是它们的天然肿瘤归巢活性。对于某些肿瘤类型，特别是脑肿瘤，可阻碍全身性施用的这些益处，其中血脑屏障可以限制全身性施用的细胞接近肿瘤。由于这个原因，局部递送到肿瘤部位，并且特别是考虑到本文所证明的肿瘤切除的免疫刺激作用，局部递送治疗性细胞到肿瘤切除部位，对于治疗脑肿瘤(包括但不限于GBM)是特别有利的，其众所周知难以治疗。

在一个实施方案中，基因修饰的MSC被包封在基质中。在另一个实施方案中，CAR-T细胞被包封在基质中。在另一个实施方案中，MSC和CAR-T细胞都被包封在基质中。这可以帮助将MSC保留在给定的位置(如肿瘤切除腔)中。基质可以最小化从切除腔中洗出的细胞，例如在脑肿瘤的情况下通过CSF洗出。

在本文中所述的方法和组合物中有用的基质将允许MSC和/或CAR-T迁移离开基质，而不是永久地包含基质内的细胞。如本文中所使用的，“基质”是指包含“生物相容性基底”的生物材料，所述生物相容性基底可以被用作适于植入对象或细胞群可沉积于其中的材料。一旦植入对象中，生物相容性基底不会引起毒性或有害作用。生物相容性基底可以但不必须提供允许细胞附着于其上并在其上生长的支持性框架。培养的细胞群(例如，基因修饰的MSC或CAR-T)可以用生物相容性基底(即，基质)制备，其提供例如用于细胞-细胞相互作用所需的适当的间质距离。如本文中所使用的，“包封的”是指包封在基质内的细胞。

基质可以被用于帮助进一步控制和引导本文所述的基因修饰的MSC和CAR T细胞的细胞或群体。可以设计或选择基质以提供环境提示来控制和引导细胞迁移至损伤或疾病部位。结构可以从纳米至微米至毫米至宏观长度工程化，并且还可以包含或基于诸如但不限于以下因素：材料机械性质、材料溶解度、生物活性化合物的空间图案结构、拓扑特征的空间图案结构、可溶性生物活性化合物、机械扰动(循环或静态应变、应力、剪切等)、电刺激和热扰动。

在一个实施方案中，基质包括合成基质。在一个实施方案中，基质包含巯基修饰的透明质酸和巯基反应性交联剂分子。在一个实施方案中，巯基反应性交联剂分子是聚乙二醇二丙烯酸酯。在美国专利申请第15/225,202号中可以找到用于构建基质的组件以及用于制造基质的指导的进一步描述，该专利申请的通过引用整体并入本文中。

干细胞的包封方法是本领域已知的，并且可以例如在Shah等人Biomatter.2013和Kauer等人，Nature Neuroscience.2013中找到。

例如，合成的细胞外基质(ECM)成分(如来自Hystem和Extralink的那些成分(Glycosan Hystem-C,BioTime Inc.)可以根据制造商的方案重构。干细胞(例如1×10⁵个、2×10⁵个或4×10⁵个细胞)可重悬浮于Hystem(例如14μl)中，并且基质通过添加Extralink(例如6μl)交联。在25℃下约20分钟(胶凝化时间)后，可将干细胞和ECM水凝胶置于不同尺寸(35或60mm)的玻璃底皿的中心。生物发光成像可以被用于确定表达可检测标记的MSC的存活率。为了评估表达免疫调节多肽的细胞的数量和所表达的此类多肽的量，可以使用本领域已知的方法(如流式细胞术、蛋白质印迹、免疫组织化学或酶联免疫吸附测定(ELISA))。

可检测标记物

为了追踪的目的，可以用可检测的标记物标记细胞。如本文中所使用的，术语“可检测的标记物”是指能够产生指示靶标存在的可检测信号的组合物。可检测的标记物包括通过光谱学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、电的、光学的或化学的手段可检测的任何组合物。合适的标记物包括荧光分子、放射性同位素、核苷酸发色团、酶、底物、化学发光部分、生物发光部分等。因此，标记物是可以通过本文中所述的方法和装置所需的光谱学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、电的、光学的或化学的手段可检测的任何组合物。

各种各样的荧光报告染料是本领域已知的。通常，荧光团是芳香族或杂芳香族化合物，并且可以是芘、蒽、萘、吖啶、芪、吲哚、苯并吲哚、唑、噻唑、苯并噻唑、花青、羰花青、水杨酸酯、邻氨基苯甲酸酯、香豆素、荧光素、罗丹明或其它类似化合物。

示例性荧光团包括但不限于：1,5IAEDANS；1,8-ANS；4-甲基伞形酮；5-羧基-2,7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM)；5-羧基萘并荧光素(pH10)；5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)；5-FAM(5-羧基荧光素)；5-羟基色胺(HAT)；5-Rox羧基-X-罗丹明)；5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)；6-羧基罗丹明6G；6-CR 6G；6-JOE；7-氨基-4-甲基香豆素；7-氨基放线菌素D(7-AAD)；7-羟基-4-甲基香豆素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶；ABQ；酸性品红；ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)；吖啶橙；吖啶红；吖啶黄；叮啶黄(Acriflavin)；叮啶黄福尔根SITSA；水母发光蛋白(光蛋白)；Alexa Fluor 350^TM；Alexa Fluor 430^TM；Alexa Fluor488_TM；Alexa Fluor 532^TM；Alexa Fluor 546^TM；Alexa Fluor 568^TM；Alexa Fluor 594^TM；Alexa Fluor633^TM；Alexa Fluor 647^TM；Alexa Fluor 660^TM；Alexa Fluor680^TM；茜素氨羧络合剂；茜素红；别藻蓝蛋白(APC)；AMC、AMCA-S；AMCA(氨基甲基香豆素)；AMCA-X；氨基放线菌素D；氨基香豆素；苯胺蓝；硬脂酸氨酰酯(Anthrocyl stearate)；APC-Cy7；APTS；阿斯屈拉松亮红4G(Astrazon Brilliant Red 4G)；阿斯屈拉松橙R；阿斯屈拉松红6B；阿斯屈拉松黄7GLL；阿的平；ATTO-TAG^TM CBQCA；ATTO-TAG^TM FQ；金胺；Aurophosphine G；Aurophosphine；BAO 9(双氨基苯基恶二唑)；BCECF(高pH)；BCECF(低pH)；硫酸小檗碱；β内酰胺酶；BFP蓝移GFP(Y66H)；BG-647；Bimane；双苯甲酰胺；Blancophor FFG；Blancophor SV；BOBO^TM-1；BOBO^TM-3；Bodipy 492/515；Bodipy 493/503；Bodipy 500/510；Bodipy 505/515；Bodipy530/550；Bodipy 542/563；Bodipy 558/568；Bodipy 564/570；Bodipy 576/589；Bodipy581/591；Bodipy 630/650-X；Bodipy 650/665-X；Bodipy 665/676；Bodipy Fl；Bodipy FLATP；Bodipy Fl-神经酰胺；Bodipy R6G SE；Bodipy TMR；Bodipy TMR-X缀合物；BodipyTMR-X，SE；Bodipy TR；Bodipy TR ATP；Bodipy TR-X SE；BO-PRO^TM-1；BO-PRO^TM-3；亮磺基黄素FF(Brilliant Sulphoflavin FF)；钙黄绿素；钙黄绿素蓝；钙深红^TM(CalciumCrimson^TM)；钙绿(Calcium Green)；钙绿-1Ca2+染料；钙绿-2Ca2+；钙绿-5N Ca2+；钙绿-C18Ca2+；钙橙；钙荧光白(Calcofluor White)；羧基-X-罗丹明(5-Rox)；级联蓝^TM(CascadeBlue^TM)；级联黄(Cascade Yellow)；儿茶酚胺；CFDA；CFP-青色荧光蛋白；叶绿素；色霉素A；色霉素A；CMFDA；腔肠素；腔肠素cp；腔肠素f；腔肠素fcp；腔肠素h；腔肠素hcp；腔肠素ip；腔肠素O；香豆素鬼笔环肽；CPM甲基香豆素；CTC；Cy2^TM；Cy3.18；Cy3.5^TM；Cy3TM；Cy5.18；Cy5.5^TM；Cy5^TM；Cy7^TM；青色GFP；环AMP荧光传感器(FiCRhR)；d2；Dabcyl；丹磺酰；丹磺酰胺；丹磺酰尸胺；丹磺酰氯；丹磺酰DHPE；丹磺酰氟；DAPI；Dapoxyl；Dapoxyl 2；Dapoxyl 3；DCFDA；DCFH(二氯二氢荧光素二乙酸酯)；DDAO；DHR(二氢罗丹明123)；二-4-ANEPPS；二-8-ANEPPS(非比例)；DiA(4-二-16-ASP)；DIDS；二氢罗丹明123(DHR)；DiO(DiOC18(3))；DiR；DiR(DiIC18(7))；多巴胺；DsRed；DTAF；DY-630-NHS；DY-635-NHS；EBFP；ECFP；EGFP；ELF 97；曙红；赤藓红；赤藓红ITC；乙锭同型二聚体-1(EthD-1)；Euchrysin；氯化铕(III)；铕；EYFP；坚固蓝；FDA；福尔根(副蔷薇苯胺)；FITC；FL-645；Flazo橙；Fluo-3；Fluo-4；荧光素二乙酸酯；荧光祖母绿色；荧光金(羟芪巴脒)；荧光红宝石色；FluorX；FM 1-43^TM；FM 4-46；Furared^TM(高pH)；Fura-2，高钙；Fura-2，低钙；Genacryl亮红B；Genacryl亮黄10GF；Genacryl粉红3G；Genacryl黄5GF；GFP(S65T)；GFP红移(rsGFP)；GFP野生型，非UV激发(wtGFP)；GFP野生型，UV激发(wtGFP)；GFPuv；Gloxalic acid；粒蓝；血卟啉；Hoechst 33258；Hoechst 33342；Hoechst 34580；HPTS；羟基香豆素；羟芪巴脒(荧光金)；羟基色胺；吲哚二碳花青(DiD)；吲哚三碳花青(DiR)；Intrawhite Cf；JC-1；JO-JO-1；JO-PRO-1；LaserPro；Laurodan；LDS751；雷可福(Leucophor)PAF；雷可福SF；雷可福WS；丽丝胺罗丹明；丽丝胺罗丹明B；LOLO-1；LO-PRO-1；荧光黄；Mag绿；萘红(竹桃红B)；镁绿；镁橙；孔雀石绿；玛丽娜蓝(Marina Blue)；Maxilon亮黄素10GFF；Maxilon亮黄素8GFF；部花青；甲氧基香豆素；MitoTracker绿FM；MitoTracker橙；MitoTracker红；光神霉素；单溴二胺；单溴二胺(mBBr-GSH)；单氯二胺；MPS(甲基绿吡咯啉芪(Methyl Green Pyronine Stilbene))；NBD；NBD胺；尼罗红；硝基苯并氧杂二吲哚；去甲肾上腺素；核坚固红；核黄；Nylosan Brilliant Iavin E8G；俄勒冈绿^TM(Oregon Green^TM)；俄勒冈绿488-X；俄勒冈绿^TM488；俄勒冈绿^TM500；俄勒冈绿^TM514；太平洋蓝；副蔷薇苯胺(福尔根)；PE-Cy5；PE-Cy7；PerCP；PerCP-Cy5.5；PE-TexasRed(红色613)；竹桃红B(萘红)；Phorwite AR；Phorwite BKL；Phorwite Rev；Phorwite RPA；膦3R；光刻胶；藻红蛋白B[PE]；藻红蛋白R[PE]；PKH26；PKH67；PMIA；Pontochrome蓝黑；POPO-1；POPO-3；PO-PRO-1；PO-PRO-3；樱草灵；普施安黄；碘化丙啶(PI)；PyMPO；芘；派若宁；派若宁B；Pyrozal亮黄素7GF；QSY 7；喹吖因氮芥；试卤灵；RH414；Rhod-2；罗丹明；罗丹明110；罗丹明123；罗丹明5GLD；罗丹明6G；罗丹明B 540；罗丹明B 200；碱性玫瑰精(Rhodamine B extra)；罗丹明BB；罗丹明BG；罗丹明绿；罗丹明Phallicidine；罗丹明鬼笔环肽；罗丹明红；罗丹明WT；玫瑰红；R-藻红蛋白(PE)；红移GFP(rsGFP,S65T)；S65A；S65C；S65L；S65T；蓝宝石GFP；血清素；Sevron亮红2B；Sevron亮红4G；Sevron亮红B；Sevron橙；Sevron黄色L；sgBFP^TM；sgBFP^TM(超级辉光BFP)；sgGFR^TM；SgGFP^TM(超级辉光GFP)；SITS；SITS(樱草灵)；SITS(异硫磺酸芪)；SPQ(6-甲氧基-N-(3-磺丙基)-喹啉)；芪；磺酰罗丹明B can C；Sulphorhodamine G Extra；四环素；四甲基罗丹明；得德克萨斯红^TM；德克萨斯红-X^TM缀合物；噻二碳花青(DiSC3)；噻嗪红R；噻唑橙；硫黄素5；硫黄素S；硫黄素TCN；Thiolyte；噻唑橙；Tinopol CBS(钙荧光白)；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；TriColor(PE-Cy5)；TRITC(四甲基罗丹明异硫氰酸酯)；True Blue；TruRed；UltraLite；Uranine B；Uvitex SFC；wt GFP；WW 781；XL665；X-罗丹明；XRITC；二甲苯橙；Y66F；Y66H；Y66W；黄色GFP；YFP；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；和YOYO-3。这些荧光化合物的许多合适的形式是可获得的并且可以使用。

其它示例性可检测标记物包括发光和生物发光标志物(例如生物素、荧光素酶(例如细菌、萤火虫，叩头虫等)、萤光素和水母发光蛋白)、放射性同位素标记物(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如半乳糖苷酶类、葡萄糖醛酸酶、磷酸酶(例如，碱性磷酸酶)、过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶)和胆碱酯酶)和量热标记物(如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯和乳胶)珠)。教导此类标记物的使用的专利包括美国专利第3,817,837号、第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号、第4,277,437号、第4,275,149号和第4,366,241号，其各自通过引用并入本文。

检测此类标记物的方法是本领域技术人员熟知的。因此，例如，可以使用照相胶片或闪烁计数器来检测放射性同位素标记物，可以使用光检测器来检测荧光标志物以检测发射的光。酶标记物通常通过向酶提供酶底物并检测酶对酶底物的作用所产生的反应产物来检测，并且量热标记物可以通过可视化有色标记物来检测。

施用

在一些实施方案中，本文中所述的方法涉及通过施用包含本文中所述的任何基因修饰的T细胞和表达免疫调节多肽的经修饰的MSC的哺乳动物细胞来治疗患有或诊断为实体瘤癌症的对象。在一个实施方案中，实体瘤在前已经被切除。患有病况(例如成胶质细胞瘤)的对象可由医生使用诊断该病况的当前方法来鉴定。表征这些病况并有助于诊断的病况的症状和/或并发症是本领域熟知的，并且包括但不限于疲劳、持续感染和持续出血。可能有助于诊断例如病况的测试，包括但不限于血液筛查和成像(例如PET扫描)，并且对于给定的病况在本领域中是已知的。病况的家族史或暴露于病况的危险因素也可有助于确定对象是否可能患有该病况或进行该病况的诊断。

在一个实施方案中，本文所述的基因修饰的MSC被直接施用到通过切除肿瘤形成的腔中，并且本文中所述的基因修饰的T细胞被全身性施用。在另一个实施方案中，基因修饰的MSC和基因修饰的T细胞基本上同时直接施用到通过切除肿瘤形成的腔中。在另一个实施方案中，基因修饰的MSC和基因修饰的T细胞基本上同时或在不同的时间点全身性施用。在另一个实施方案中，基因修饰的MSC被全身性施用，并且基因修饰的T细胞被直接施用到通过切除肿瘤形成的腔中。MSC的天然肿瘤归巢活性有助于全身性施用的MSC的肿瘤定位。

本文中所述的组合物可以被施用于患有或诊断为患有病况的对象。在一些实施方案中，本文中所述的方法包括向对象施用有效量的如本文中所述的激活的基因修饰的T细胞和基因修饰的MSC以减轻病况的症状。如本文中所使用的，“减轻病况的症状”是改善与病况相关的任何病症或症状。与等同的未处理对照相比，通过任何标准技术测量，此类减少为至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％、99％或更多。用于将本文中所述的组合物施用至对象的各种方法是本领域技术人员已知的。在一个实施方案中，本文中所述的组合物是全身性或局部施用的。在一个优选的实施方案中，本文中所述的组合物是静脉内施用的。在另一个实施方案中，本文所述的组合物在肿瘤或肿瘤切除部位施用。

如本文中所使用的术语“有效量”是指减轻至少一种或多种疾病(例如成胶质细胞瘤)的症状所需的基因修饰的T细胞和基因修饰的MSC的量，并且涉及提供所期望的效果的细胞制剂或组合物的足够量。因此，术语“治疗有效量”是指当施用至典型对象时，足以提供特定抗病况作用的基因修饰的T细胞和MSC的量。如本文中所使用的在各种上下文中的有效量还包括足以延缓疾病症状发展，改变疾病症状的进程(例如但不限于减缓病况的进展)或逆转病况的症状的量。因此，指定确切的“有效量”通常是不可行的。然而，对于任何给定的情况，合适的“有效量”可以由本领域普通技术人员仅使用常规实验来确定。

可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来评估有效量、毒性和治疗功效。剂量可以根据使用的剂型和使用的给药途径而变化。

尽管MSC最常被局部施用并且CAR T细胞是全身性的，但在一个方面，本文中所述的技术涉及药物组合物，其包含如本文中所述的激活的基因修饰的T细胞和修饰的MSC，以及任选地药学上可接受的载体。药物组合物的活性成分至少包含如本文中所述的基因修饰的T细胞和基因修饰的MSC。在一些实施方案中，药物组合物的活性成分基本上由如本文中所述的基因修饰的T细胞和基因修饰的MSC组成。在一些实施方案中，药物组合物的活性成分由如本文中所述的基因修饰的T细胞和基因修饰的MSC组成。用于基于细胞的治疗性制剂的药学上可接受的载体包括盐溶液和水性缓冲溶液、林格氏溶液和血清组分(例如血清白蛋白、HDL和LDL)。术语如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等在本文中可互换使用。

在一些实施方案中，包含如本文中所述的基因修饰的T细胞和基因修饰的MSC细胞的药物组合物可以是肠胃外剂型。由于肠胃外剂型的施用通常绕过患者天然的污染物防御，所以除了基因修饰的T细胞和基因修饰的MSC本身之外的成分优选是无菌的或能够在施用于患者之前被灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于准备注射的溶液、准备溶解或悬浮在药学上可接受的注射用媒介物中的干燥产品、准备注射的混悬液和乳液。可以在施用前，将这些中的任何一种加入到基因修饰的T细胞和MSC的制剂中。

可以被用于提供如本领域所公开的基因修饰的T细胞和MSC的肠胃外剂型的合适媒介物是本领域技术人员熟知的。实例包括但不限于：盐水溶液；葡萄糖溶液；水性媒介物包括但不限于氯化钠注射剂、林格氏注射剂、右旋糖注射剂、右旋糖和氯化钠注射剂以及乳酸化林格氏注射剂；水混溶性媒介物，如但不限于乙醇、聚乙二醇和丙二醇；和非水性媒介物，如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。

剂量

如本文中所使用的术语"单位剂型"是指适于一次施用的剂量。作为实例，单位剂型可以是设置在递送装置(例如注射器或静脉滴注袋)中的治疗剂的量。在一个实施方案中，单位剂型在单次施用中施用。在另一个实施方案中，可以同时施用多于一个单位剂型。

包含本文中所述的基因修饰的T细胞和基因修饰的MSC的药物组合物通常可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重(在一些情况下10⁵至10⁶个细胞/kg体重，包括在那些范围内的所有整数值)的剂量施用。如果必要的话，基因修饰的T细胞和/或基因修饰的MSC也可以以这些剂量多次施用。细胞可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术施用(参见，例如，Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。

在某些方面，可能期望对对象施用基因修饰的T细胞，然后再抽血(或进行过单采)，如本文中所述从其激活T细胞，并用这些激活和扩增的T细胞再输注患者。该过程可以每几周进行多次。在某些方面，可以从10cc至400cc的抽血中激活T细胞。在某些方面，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血激活T细胞。

施用模式可包括例如静脉内(i.v.)注射或输注。可经动脉、瘤内、结节内或髓内将本文中所述的组合物施用至患者。在一些实施方案中，可以将基因修饰的T细胞和基因修饰的MSC的组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。在一个实施方案中，将本文中所述的组合物施用至体腔或体液(例如腹水、胸膜液、腹膜液或脑脊髓液)中。

对患者施用的上述治疗的剂量将随所治疗的病况的确切性质和治疗的接受者而变化。可以根据本领域已接受的实践进行用于人类施用的剂量的缩放。

在一些实施方案中，需要单一治疗方案。在其它实施方案中，可以进行一个或多个后续剂量或治疗方案的施用。例如，在每两周治疗三个月后，可以每月重复治疗一次，持续六个月或一年或更长时间。在一些实施方案中，在初始治疗之后不施用另外的治疗。在一个实施方案中，基因修饰的T细胞被施用一次，并且基因修饰的MSC被另外施用至少一次。在一个实施方案中，基因修饰的MSC被施用一次，并且基因修饰的T细胞被另外施用至少一次。

如本文中所述的组合物的剂量可以由医生确定，并且根据需要调节以适合观察到的治疗效果。关于治疗的持续时间和频率，对于熟练的临床医生来说，通常监测对象以便确定治疗何时提供治疗益处，并确定是否施用其它细胞，中断治疗，恢复治疗，或对治疗方案进行其它改变。剂量不应大到引起不利的副作用，如细胞因子释放并发症状。通常，剂量将随患者的年龄、状况和性别而变化，并且可以由本领域技术人员确定。在任何并发症的情况下，剂量也可以由单独的医生调节。

表2显示了与特定癌症类型相关的已知肿瘤抗原的非限制性实例。

实施例

实施例1：针对切除肿瘤的基于双重干细胞和CAR-T的免疫疗法

由于已知组织损伤导致先天和适应性免疫应答1的激活，流式细胞术分析表明肿瘤切除后第6天单核细胞数量时间依赖性地逐渐增加。此外，对单核细胞的亚分析表明，在CT2A-Fmc肿瘤内存在大量骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)，其在肿瘤切除后显著减少(图1A)。在肿瘤切除后第5天，肿瘤切除增强CD4+和CD8+效应T细胞两者向切除区域的募集(图1B-E)。总之，这些结果表明CT2A肿瘤的外科手术切除大大降低了肿瘤相关MDSC的数量，并且同时增加了募集到剩余肿瘤区域中的效应T淋巴细胞的数量。这些研究是有前途的，并为在此类模型中测试新的基于免疫的治疗提供了新的平台。

IFNβ属于与干扰素-α/β细胞表面受体复合物(IFNAR)²结合并诱导经典的JAK-STAT通路以及PI3K和p38 MAPK通路³的I型干扰素。许多临床前研究已经显示IFNβ具有直接的抗肿瘤活性^4-6，并且还通过经由免疫系统的调节间接地诱发抗肿瘤应答而充当免疫刺激分子^7-9。然而，尽管有这些双功能作用方式，但迄今为止，IFNβ治疗癌症的临床翻译受到其半衰期短和全身性毒性的限制^10-12。尽管不希望受理论束缚，但假设基于干细胞的原位递送可以解决与IFNβ的短半衰期相关的问题，同时实现局部治疗浓度而不引起全身性毒性^13，14。基于该基本原理，产生携带人和小鼠IFNβ的高度可分泌变体的慢病毒载体和逆转录病毒载体，并且转导小鼠MSC以表达mIFNβ(MSC-mIFNβ)。体外数据揭示小鼠GBM细胞表达IFNβ受体，IFNAR1/2和MSC释放的mIFNβ导致STAT1和p38的磷酸化并经由细胞周期停滞的诱导抑制小鼠GBM的增殖(图2A-D)。在体内，与免疫功能低下(SCID)的小鼠相比，向已建立的CT2A-FmC肿瘤瘤内注射MSC-mIFNβ导致免疫活性(C57/B6)的存活期显著延长(图2E)。基于体内发现，考虑了来自mIFNβ的直接抗GBM应答的免疫调节作用。

在肿瘤细胞的小亚组中观察到跨越不同癌症类型的PD-L1表达，并且先前的研究仅显示了基本PD-L1表达水平与免疫检查点阻断功效之间的有限相关性^15，16。此外，GBM被认为在免疫学上是冷的并且具有低水平的T和NK细胞浸润，这可能是它们在GBM中有限的PD-L1水平的原因。尽管IFNβ具有双模免疫调节和细胞毒性功能，但也已知经由JAK/STAT/IRF1信号传导通路上调肿瘤细胞上的PD-L1表达¹⁷，从而影响IFNβ的免疫调节功能。已经表明，重组IFNβ和MSC-IFNβ处理均导致培养物中的GBM肿瘤细胞上的PD-L1表达增加。这种上调可以通过使用IFNaR1阻断抗体、MAR1、5A3来阻断(图5A-B)。在体内，与对照相比，MSC-IFNβ的瘤内植入导致肿瘤细胞上PD-L1的上调(图5C)。这些发现激发并支持在GBM中联合使用MSC介导的IFNβ和ScFV-PD-L1递送的基本原理。

PD-L1已经被鉴定为与一系列癌症中的不良预后相关的因素，并且据报道主要由GBM中的PTEN损失诱导¹⁸。先前的研究已经显示PTEN损失增加结肠直肠癌中的PD-L1表达¹⁹并促进GBM中的免疫抗性²⁰。最近，用靶向PD-1或PD-L1的单克隆抗体阻断免疫检查点已经在多种癌症类型的临床治疗中显示出有利的结果^21,22。尽管有重要的临床益处，但全身性递送的抗PD-1和PD-L1疗法与多种免疫相关不良事件(irAE)有关，所述不良事件偶尔是严重的或甚至是致命的^23,24。因此，理想的是使用同时释放IFNβ和ScFV-PDL1并证明其在GBM的小鼠肿瘤细胞中的治疗功效的MSC。

构建了携带编码鼠Igκ链V-J2-C信号肽和抗鼠PD-L1的YW234.55.S70抗体的单链可变区的人和小鼠特异性ScFv-PDL1逆转录病毒载体，并进行评估因其在体内外的治疗作用。具体地，小鼠GBM表达细胞表面PD-L1，并且经工程化为表达ScFv-PDL1(MSC-scFv-PDL1)的MSC在体外(使用EGFRvIII CAR T测定)和体内抑制肿瘤生长，并增加携带肿瘤的小鼠的存活期(图3A-E)。这些发现赋予了在GBM中使用MSC递送的免疫检查点抑制剂的有效性，并且进一步加强了在切除的实体瘤中局部递送的MSC介导的IFNβ和免疫检查点疗法的基本原理。

嵌合抗原受体(CAR)T细胞²⁵已经证明出对于多种血液癌症的令人印象深刻的临床功效，然而它们在实体瘤中的成功受到限制²⁶。先前的研究已经开发了针对细胞表面受体EGFR的突变变体(EGFRvIII；已知在GBM中特异性表达²⁷)的CAR并且显示它们在完整GBM的小鼠模型中的功效²⁸。尽管这些研究提供了希望，但在开发针对GBM的最佳CAR T治疗方法中，CAR T细胞募集不足及其在肿瘤的免疫逃逸环境中的功能性²⁵仍然是一个严峻的挑战。已知趋化因子CCL2在T细胞向肿瘤的募集中起重要作用^29-31，并且最近的功能丧失研究揭示MSC表达显著水平的CCL2，这允许它们与T细胞持续接触³²。已经证实，人和小鼠MSC表达CCL2(图4)，并且在肿瘤切除腔内植入包封的MSC可以导致过继转移的CAR T细胞的趋性增强。可以在切除的小鼠肿瘤模型中评估全身性递送的可成像EGFRvIII-CAR T的命运。

免疫调节细胞因子可意刺激剧烈的抗肿瘤应答，并且是增加实体瘤中CAR T细胞功效的候选物。尽管任何促进免疫细胞激活或细胞毒性活性的细胞因子都是有益的，但由于IL-12具有激活先天性免疫和适应性免疫的能力，因此特别是IL-12已被选作肿瘤免疫疗法的候选者。然而，其短的半衰期、与全身性施用有关的严重副作用^42,4333,34和非常窄的治疗益处阻碍了其以这种方式使用。本文中描述了证明IL-12直接局部递送至肿瘤微环境中的益处的研究。IL-12是由p35和p40亚基组成的异二聚体蛋白，其桥接先天性免疫系统和适应性免疫系统³⁵。IL-12p35亚基可以同型二聚化，并且IL-12p40亚基可以与IL23a亚基缔合形成IL23³⁵，因此生物活性的IL-12需要表达p40和p35，以及正确的异二聚体组装³⁶。构建了携带IL-12的可分泌p35和p40亚基的双启动子载体，其被先前已经优化的接头序列分开³⁷。将IL-12表达限制在肿瘤微环境内可以降低不希望的毒性同时增强CAR T细胞功能；因此，MSC被工程化以表达和递送IL-12。这里呈现的数据表明MSC可以容易地被工程化以表达功能性IL-12(图6A-E)，并且MSC-IL-12显著影响体内肿瘤生长(图6F)。

用IL-12长期处理已经显示出对T细胞的抗肿瘤活性的有害影响，导致T细胞耗尽³⁸。经由MSC可调节地释放IL-12应该克服与IL-12的全身性和组成型递送相关的问题。利用pCW57.1 Dox诱导型慢病毒载体(Addgene)³⁹，为Tet可调节GFP-Fluc、IL-12的p40和p35亚基以及ScFV-PDL1创建了双启动子慢病毒载体(图7A)。数据表明表达GFP-Fluc的小鼠MSC在体外和体内都使用9-叔丁基强力霉素(9TB-Dox)严格调节(图7B-C)。此外，数据表明用LV-TET-IL12转导的MSC在9TB-Dox处理后显示IL-12表达的严格调节的时间依赖性增加(图7D)。

先前的研究已经显示，由于抑制性回路的上调，肿瘤募集后CAR T细胞的功能丧失⁴⁰。最近的研究已经表明，肿瘤微环境中PD-L1的上调导致PD-1介导的T细胞功能抑制⁴¹。尽管不希望受理论束缚，但假设如果CAR T细胞在实体瘤中耗尽⁴⁰，则免疫检查点阻断可以改善CAR T细胞疗法^21,22对此类肿瘤的效力。检测表达scFV-PDL1的工程化MSC与CAR T疗法在同基因GBM切除模型中的联合功效。用分别带有GFP-Fluc和EGFRvIII特异性ScFv的双启动子慢病毒载体和逆转录病毒载体创建和工程化鼠和人特异性EGFRvIII CAR，以产生人和小鼠CAR T细胞(图8A-B)。数据显示T细胞可以用LV有效地激活和转导(图8C-E)，其功能在体外显示(图8F)。这些发现为使用MSC在将CAR T细胞募集到实体瘤中以及进一步加强在切除的实体瘤中局部递送的MSC和全身性递送的CAR T的基本原理提供了有效性。

实施例3：静脉内注射CAR-T细胞对脑肿瘤无效

将CAR T细胞静脉内注射到携带脑肿瘤的小鼠中(图9)。

在肿瘤移植后第10天递送CAR T细胞(图9A)。静脉内施用的CAR T细胞的Fluc成像显示静脉内递送的CAR T细胞与对照T细胞之间没有显著差异(图9B)。

实施例4：瘤内植入的CAR-T细胞具有治疗功效

在肿瘤植入后第8天和第12天进行瘤内植入EGFRγII CAR T细胞(图10A)。作为对照，还将T细胞植入对照动物。Fluc成像揭示瘤内递送的CAR T细胞在患有脑肿瘤的小鼠中具有显著的治疗功效(图10B)。

实施例5：包封在sECM中并植入GBM肿瘤切除腔中的CAR T细胞和产生IL-12的MSC的组合具有治疗功效

尽管原发GBM肿瘤块的切除已经显示出临床益处，但肿瘤切除后的辅助化学疗法已经提供有限的额外益处^42-45。有效递送全身性递送的治疗剂的主要障碍之一是血脑屏障(BBB)⁴⁶和肿瘤中的血管功能障碍⁴⁷。另外，许多目前使用的药物具有短的全身性半衰期和峰浓度，其防止药物最终到达脑并累积到各个脑肿瘤细胞内的治疗浓度⁴⁸。这些因素需要探索治疗剂对脑中肿瘤的局部递送选择。已经显示干细胞展现出有效的亲病灶性(pathotropic)迁移特性，使得它们在肿瘤治疗中用作靶向递送载体是有吸引力的^43,49-53。特别地，MSC对于操作是有吸引力的，因为它们(i)展现出高代谢活性，并因此在体外和体内强表达转基因；(ii)移植后在脑中存活和整合；和(iii)在脑中具有显著低的免疫原性^54,55。已经显示，经工程化以表达双重成像标志物GFP-Fluc的小鼠和人MSC在免疫能力的C57BL/6和免疫受损的SCID小鼠的脑中存活长达至少2周^56,57。

这些属性使得MSC非常适合靶向治疗递送媒介物，并加强了它们在GBM疗法中的使用的基本原理。尽管在颅内肿瘤中直接瘤内注射治疗性干细胞是有效的，但是在模拟肿瘤切除和切除后治疗的临床情况的GBM切除的小鼠模型中测试基于干细胞的治疗干预存在许多限制。这些包括开发将干细胞引入切除腔以防止脑脊液(CSF)对大量细胞的快速“洗脱”的方法。

先前的报道已经描述了第二代⁵⁸和分泌IL-12的铠装CAR T细胞⁵⁹的功效。显示IL-12在体外显著增强CAR T细胞功效，并导致在一部分治疗小鼠中消除播散性疾病⁵⁹。最近，IL-12铠装CAR T细胞显示出克服抑制性腹水微环境，改变腹水细胞因子和TAM微环境，并克服PD-L1介导的抑制⁶⁰。由于它们提供促进T细胞和干细胞存活同时允许容易的体内移植和细胞保留的生理环境的能力，生物可降解的sECM已被用于多种啮齿目动物模型中。已经显示，当植入GBM肿瘤切除腔内时，sECM包封的表达可成像GFP-Fluc的干细胞比未包封的干细胞存活得更长⁶¹。这些数据使得在肿瘤切除后，在肿瘤微环境中使用CAR T细胞和MSC-IL-12靶向细胞具有很强的有效性。本数据表明，切除诱导的免疫反应可以经由局部递送sECM-包封的EGFRvIII CAR T和表达IL-12的MSC来进一步调节为趋向肿瘤特异性免疫应答，从而抑制残余肿瘤的生长(图11A-B)。因此，调节肿瘤缩小后的非特异性免疫反应趋向肿瘤特异性免疫应答在GBM治疗中提供了理想的免疫治疗策略，其中完全切除通常是不可能的，并且其中血脑屏障可能妨碍通过全身性施用的MSC或CAR-T进行的肿瘤定位。在本文中证明其对高度难治性GBM有效的情况下，该方法特别考虑在切除任何实体瘤后使用。

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序列

SEQ ID NO:1(PD-L1-智人(Homo sapiens)-同种型a)

SEQ ID NO:2(PD-1-智人(Homo sapiens))

SEQ ID NO:3(CTLA-4-智人(Homo sapiens))

SEQ ID NO:4(TIM-3-智人(Homo sapiens))

SEQ ID NO:5(LAG-3-智人(Homo sapiens))

SEQ ID NO:6(TIGIT-智人(Homo sapiens))

SEQ ID NO:7(TIGIT-小家鼠(Mus musculus))

SEQ ID NO:8(CTLA-4小家鼠(Mus musculus))

SEQ ID NO:9(TIM-3-智人(Homo sapiens))

SEQ ID NO:10(TIM-3-小家鼠(Mus musculus))

SEQ ID NO:11(LAG-3-小家鼠(Mus musculus))

SEQ ID NO:12(PD-L1-智人(Homo sapiens)-同种型b)

SEQ ID NO:13(PD-L-1-智人(Homo sapiens)-同种型c)

SEQ ID NO:14(PD-L-1-小家鼠(Mus musculus))

SEQ ID NO:15(PD-1-小家鼠(Mus musculus))

SEQ ID NO:16-(易普利姆玛重链-US20150283234)

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:17(易普利姆玛轻链-US20150283234)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:18(派姆单抗重链序列-US2012135408)

QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO:19(派姆单抗轻链序列-US2012135408)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:20(纳武单抗-重链序列-US2013173223)

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO:21(纳武单抗-轻链序列-US2013173223)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:22(阿特珠单抗-重链序列)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:23(阿特珠单抗-轻链序列)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:24(抗TIM抗体重链-WO2018129553A1)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVSTISGGGTYTYYQDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASMDYWGQGTTVTVSSA

SEQ ID NO:25(抗TIM抗体轻链-WO2018129553A1)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRRYLNWYHQKPGKAPKLLIYG ASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQSHSAPLTFGGGTKVEIKR

SEQ ID NO:26(EGFR vIII-智人(Homo sapiens))

SEQ ID NO:27(EGFR vIII-小家鼠(Mus musculus))

Claims (45)

1.治疗对象的实体瘤癌症的方法，所述方法包括：

a.施用在其细胞表面上表达嵌合T细胞抗原受体的基因修饰的T细胞，所述嵌合T细胞抗原受体包含异源结合结构域和细胞内信号传导结构域，所述异源结合结构域特异性结合在癌症的细胞表面上表达的肿瘤抗原，其中所述异源结合结构域与癌细胞表面上的肿瘤抗原的结合激活所述细胞内信号传导结构域和所述T细胞；和

b.施用表达异源免疫调节多肽的第一基因修饰的间充质干细胞，

其中所述异源免疫调节多肽增强所述基因修饰的T细胞的癌细胞杀伤。

2.如权利要求1所述的方法，其还包括在施用步骤之前从对象切除实体瘤的步骤，其中所述切除产生先前被肿瘤组织占据的腔。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一基因修饰的间充质干细胞是全身性施用的。

4.如权利要求2所述的方法，其中在通过切除所述肿瘤形成的腔中施用所述第一基因修饰的间充质干细胞。

5.如权利要求1、2或4中任一项所述的方法，其中所述第一基因修饰的间充质干细胞被包封在基质中。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述基质允许细胞迁移出所述基质。

7.如权利要求5或6所述的方法，其中所述基质包含合成的细胞外基质。

8.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述基质包含巯基修饰的透明质酸和巯基反应性交联剂分子。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述巯基反应性交联剂分子是聚乙二醇二丙烯酸酯。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述异源免疫调节多肽是检查点抑制剂多肽。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述异源免疫调节多肽是白介素(IL)IL-12、IL-2、IL-5、IL-15、干扰素α、干扰素β、干扰素γ或它们的组合。

12.如权利要求10所述的方法，其中所述检查点抑制剂多肽包含结合选自以下的检查点多肽的抗体或其抗原结合结构域：PD-L1、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3或TIGIT。

13.如权利要求10或11所述的方法，其中所述检查点抑制剂多肽包含结合PD-L1的抗体或其抗原结合结构域。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述异源结合结构域包含纳米抗体或scFv。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中特异性结合在癌症的细胞表面上表达的肿瘤抗原的所述异源结合结构域特异性结合选自以下的多肽：EGFRvIII、HER2、CD133、EGFR、IL13RA2、HER2、CSF1-R、L1-CAM、CTAG1B、GD2和EGFR。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述异源结合结构域特异性结合EGFRvIII。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述基因修饰的T细胞被包封在基质中。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述基质允许细胞迁移出所述基质。

19.如权利要求2-18中任一项所述的方法，其中将所述基因修饰的T细胞施用至通过切除所述肿瘤形成的所述腔。

20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移性癌症。

21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述癌症是成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、乳腺癌、黑素瘤或非小细胞肺癌。

22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述第一基因修饰的间充质干细胞另外表达异源多肽，或编码并递送溶瘤病毒，所述异源多肽选自：TRAIL、EGFR纳米抗体-TRAIL融合物、血小板反应蛋白(TSP)-1、HSV-TK、胞嘧啶脱氨酶(CD)或它们的组合。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述溶瘤病毒是oHSV、oHSV-TRAIL、oHSV粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)或溶瘤腺病毒。

24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其还包括施用第二基因修饰的间充质干细胞，所述第二基因修饰的间充质干细胞表达不同于由所述第一间充质干细胞表达的异源多肽的异源多肽，或编码并递送溶瘤病毒，或它们的组合，其中所述异源多肽选自：白介素(IL)-12、IL-2、IL-5、IL-15、TRAIL、EGFR纳米抗体-TRAIL融合物、血小板反应蛋白(TSP)-1、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、HSV-TK和胞嘧啶脱氨酶(CD)。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述溶瘤病毒是oHSV、oHSV-TRAIL、oHSV-GMCSF或溶瘤腺病毒。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述第二基因修饰的间充质干细胞被包封在基质中。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述基质允许细胞迁移出所述基质。

28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中在肿瘤切除6天内施用所述基因修饰的间充质干细胞和/或基因修饰的T细胞。

29.组合物，其包含：

a.在其细胞表面上表达嵌合T细胞抗原受体的基因修饰的T细胞，所述嵌合T细胞抗原受体包含异源结合结构域和细胞内信号传导结构域，所述异源结合结构域特异性结合在癌性肿瘤的细胞表面上表达的肿瘤抗原，其中所述异源结合结构域与癌细胞表面上的肿瘤抗原的结合激活所述细胞内信号传导结构域和所述T细胞；和

b.表达异源免疫调节多肽的第一基因修饰的间充质干细胞。

30.如根据权利要求29所述的组合物，其还包含第二基因修饰的间充质干细胞，所述第二经基因修饰的间充质干细胞表达选自以下的异源多肽：TRAIL、EGFR纳米抗体-TRAIL融合物、血小板反应蛋白(TSP)-1、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、HSV-TK、胞嘧啶脱氨酶(CD)、溶瘤病毒、腺病毒或它们的组合。

31.如权利要求29或30所述的组合物，其中所述第一基因修饰的间充质干细胞和所述第二基因修饰的间充质干细胞，如果存在的话，被包封在基质中。

32.如权利要求29或30所述的组合物，其中所述基因修饰的T细胞被包封在基质中。

33.如权利要求31或32所述的组合物，其中所述基质允许细胞迁移出所述基质。

34.如权利要求29-33中任一项所述的组合物，其中所述异源免疫调节多肽是检查点抑制剂多肽。

35.如权利要求34所述的组合物，其中所述检查点抑制剂多肽包含结合选自以下的检查点多肽的抗体或其抗原结合结构域：PD-L1、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3或TIGIT。

36.如权利要求34或35所述的组合物，其中所述检查点抑制剂多肽包含结合PD-L1的抗体或其抗原结合结构域。

37.如权利要求29-36中任一项所述的组合物，其中特异性结合在癌症的细胞表面上表达的肿瘤抗原的所述异源结合结构域特异性结合选自以下的多肽：EGFRvIII、HER2、CD133、EGFR、IL13RA2、HER2、CSF1-R、L1-CAM、CTAG1B、GD2和EGFR。

38.如权利要求29-37中任一项所述的组合物，其中所述异源结合结构域特异性结合EGFRvIII。

39.如权利要求29-38中任一项所述的组合物，其还包含药学上可接受的载体。

40.如权利要求29-39中任一项所述的组合物，其用于治疗实体瘤癌症中的用途。

41.如权利要求40所述的用于所述用途的组合物，其中所述癌症是转移性癌症。

42.如权利要求40或41所述的用于所述用途的组合物，其中所述癌症是成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、乳腺癌、黑素瘤或非小细胞肺癌。

43.用于治疗实体瘤的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求29-42中任一项所述的组合物及用于其的包装材料。

44.如权利要求43所述的试剂盒，其中所述基因修饰的间充质干细胞、所述基因修饰的T细胞或上述两者被包封在基质中。

45.如权利要求43或44所述的试剂盒，其中所述基质允许细胞迁移出所述基质。

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