CN113402616B - 巨噬细胞专属嵌合抗原受体、表达该受体的可控极化单核/巨噬细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

巨噬细胞专属嵌合抗原受体、表达该受体的可控极化单核/巨噬细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种巨噬细胞专属嵌合抗原受体、表达该受体的可控极化单核/巨噬细胞及其制备方法和应用，涉及生物技术领域。本发明提供了一种嵌合抗原受体，包括依次连接的胞外抗原结合域、跨膜结构域和胞内激活结构域，其中胞外抗原结合域包括信号肽和/或scFv，能够异性识别GBM特异表达的细胞膜表面蛋白EGFRvIII；跨膜结构域包括CD8α，链接胞外抗原结合域和胞内激活结构域；胞内激活结构域包括TIR、CD3ZETA或GM‑CSFRα/β，促进巨噬细胞向M1型极化，将本发明的嵌合抗原受体引入到巨噬细胞中，赋予了该巨噬细胞对GBM的靶向杀伤作用，有效的促进并维持其M1极化状态。

Description

巨噬细胞专属嵌合抗原受体、表达该受体的可控极化单核/巨 噬细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种巨噬细胞专属嵌合抗原受体、表达该受体的可控极化单核/巨噬细胞及其制备方法和应用。
背景技术
胶质母细胞瘤(GBM)被认为起源于神经胶质祖细胞，是目前已发现的最普遍、最具侵袭性的原发性脑肿瘤。其发病率占具了颅内肿瘤的12％-15％和星型细胞肿瘤的50％-60％。罹患该肿瘤的患者中位数生存期约为15个月，5年生存率不到10％。因此，该肿瘤对人类生命健康构成了极大的威胁。虽然目前针对GBM的治疗方法有外科手术、放疗和化疗等手段，但由于该肿瘤向脑叶深部浸润生长，并具备生长迅速、易复发等特点，因此收效甚微，且容易对患者大脑造成难以恢复的二次伤害。
近年来兴起的以嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)为代表的肿瘤免疫细胞疗法已逐步在肿瘤的临床治疗中发挥越来越重要的作用，尤其是在血液癌的治疗中展现出了较好的治疗效果。同时，已有研究试图通过开发靶向GBM特异抗原EGFRvIII的CAR-T来延长GBM携带小鼠的生存期。然而，尽管目前利用CAR-T疗法在针对GBM在内的诸多实体瘤的治疗中做了大量探索，但其效果并不理想。其中的主要原因在于：1.过继移植的CAR-T细胞在治疗中可能发生的脱靶效应；2.T细胞对实体肿瘤浸润性较差；3.T细胞难以穿透血脑屏障；4.实体肿瘤高度复杂性和厌氧的微环境等因素导致细胞毒性T细胞出现的难以恢复的耗竭。因此急需找到新的免疫细胞治疗替代方案。
巨噬细胞，这一类同样具有肿瘤细胞杀伤能力的非特异性免疫细胞，由于在过继性免疫系统和先天性免疫系统的相互作用中起着核心作用，且备较强的可塑性，易于突破血脑屏障，以及更有效的向肿瘤组织部位浸润并长时间驻存的特性，正在成为免疫细胞工程化改造的新选择。然而以巨噬细胞进行过继移植存在着如下问题：1.具有细胞免疫功能的M1型巨噬细胞在肿瘤微环境容易的影响下容易向M2状态极化，进而失去免疫功能并转而促进肿瘤的发生发展；2.传统的病人自体免疫细胞回输治疗的方法面临细胞来源少，分离效率低，改造难度大，耗时耗力等问题，并且原代巨噬细胞很难过慢病毒感染的途径进行基因工程化改造。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种嵌合抗原受体，能够赋予巨噬细胞靶向GBM的特性，降低脱靶效应，促进和维持巨噬细胞在肿瘤微环境的M1极化状态，提高其杀伤效率。
本发明的第二目的在于提供一种巨噬细胞的极化方法，该方法简单，能够实现巨噬细胞的M1极化。
本发明的第三目的在于提供一种巨噬细胞，以解决上述问题中的至少一种。
本发明的第四目的在于提供一种巨噬细胞的制备方法。
本发明的第五目的在于提供一种多能干细胞。
本发明的第六目的在于提供一种单核细胞。
本发明的第七目的在于提供一种巨噬细胞或多能干细胞在制备用于治疗神经胶质瘤的产品中的应用。
本发明的第八目的在于提供一种用于治疗神经胶质瘤的产品。
第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，包括依次连接的胞外抗原结合域、跨膜结构域和胞内激活结构域；
所述胞外抗原结合域包括信号肽和/或靶向EGFRvIII的scFv；
跨膜结构域包括CD8α；
所述胞内激活结构域包括TIR、CD3ZETA或GM-CSFRα/β中的至少一种。
作为进一步技术方案，所述信号肽由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列表达；
所述scFv由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达。
作为进一步技术方案，所述CD8α由SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列表达。
作为进一步技术方案，所述TIR包括来源于TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR13或TLR19的胞内信号转导结构域；
所述TLR4的胞内信号转导结构域由SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列表达；
所述CD3ZETA由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列表达；
所述GM-CSFRα/β由SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列表达。
第二方面，本发明提供了一种巨噬细胞的极化方法，将嵌合抗原受体在巨噬细胞中表达。
第三方面，本发明提供了一种巨噬细胞，包括嵌合抗原受体。
第四方面，本发明提供了一种巨噬细胞的制备方法，包括如下步骤：构建含有所述嵌合抗原受体的基因表达序列的慢病毒表达体系，利用慢病毒表达体系将嵌合抗原受体的基因表达序列整合到多能干细胞中，经诱导分化后制备得到巨噬细胞；
优选地，所述多能干细胞先诱导分化为单核细胞，再分化得到巨噬细胞。
第五方面，本发明提供了一种能够分化得到上述巨噬细胞的多能干细胞，所述多能干细胞含有编码所述嵌合抗原受体的基因。
第六方面，本发明提供了一种能够分化得到上述巨噬细胞的单核细胞，所述单核细胞含有编码所述嵌合抗原受体的基因；
所述单核细胞由多能干细胞分化得到。
第七方面，本发明提供了一种巨噬细胞、多能干细胞或单核细胞在制备用于治疗神经胶质瘤的产品中的应用。
第八方面，本发明提供了一种用于治疗神经胶质瘤的产品，所述产品包括上述巨噬细胞。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种专属于巨噬细胞的嵌合抗原受体，包括依次连接的胞外抗原结合域、跨膜结构域和胞内激活结构域。其中胞外抗原结合域包括信号肽和/或scFv，信号肽可帮助CAR蛋白序列定位到细胞膜表面，scFv能够异性识别GBM特异表达的细胞膜表面蛋白EGFRvIII；跨膜结构域包括CD8α，连接胞外抗原结合域和胞内激活结构域；胞内激活结构域包括TIR、CD3ZETA或GM-CSFRα/β中的至少一种，促进巨噬细胞向M1型极化，将本发明提供的嵌合抗原受体引入到巨噬细胞中，在赋予该巨噬细胞对GBM的靶向杀伤作用的同时，也增强了该免疫细胞抵御肿瘤微环境的免疫抑制效应，有效的促进并维持其M1极化状态。
本发明提供了一种巨噬细胞的极化方法，通过将上述嵌合抗原受体在巨噬细胞中表达，以实现巨噬细胞的M1极化，该方法简单有效。
本发明提供了一种巨噬细胞，该巨噬细胞能够表达上述本发明提供的嵌合抗原受体，能够维持M1极化状态，对GBM的靶向杀伤性强。
发明人研究发现，原代巨噬细胞很难被慢病毒感染，很难被编辑和进行工程化改造，基于此，本发明提供了一种上述巨噬细胞的制备方法，包括构建含有所述嵌合抗原受体的基因表达序列的慢病毒表达体系，利用慢病毒表达体系将嵌合抗原受体的基因表达序列整合到多能干细胞中，经诱导分化后制备得到巨噬细胞，该巨噬细胞能够长期稳定的过表达嵌合抗原受体，能够解决目前免疫细胞治疗所存在的编辑效率低、周期长、工作量大和治疗不及时等方面的问题。
本发明提供了一种多能干细胞，该多能干细胞含有编码上述嵌合抗原受体的基因，其状态更倾向于促炎抑肿瘤的M1状态，能够进一步分化得到巨噬细胞，更有利于抑制肿瘤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为构建U87MGEGFRvIII细胞系；A：构建EGFRvIII慢病毒表达体系；B：WesternBlotting检测慢病毒感染后总的EGFR在U87MG细胞中的表达水平；C：Western Blotting检测慢病毒感染后总的EGFRvIII在U87MG细胞中的表达水平；D：免疫荧光检测实验表明EGFRvIII在U87MG细胞中过表达后定位在了细胞膜表面；
图2为CAR-iMAC的构建及其非特异性基础吞噬功能的检验；A：构建3种带有不同胞内激活信号转导结构域并能靶向GBM特异的膜蛋白EGFRvIII的CAR；B：稳定过表达了CAR的iPSC诱导分化成CAR-iMAC；C：CAR-iMAC(EGFP)体外吞噬U87MG(tdTomato)细胞；
图3为CAR-iMAC体外靶向杀伤U87MGEGFRvIII细胞系；A：体外共培养12小时后结果；B：共聚焦扫描结果；
图4为CAR-iMAC体外靶向杀伤U87MGEGFRvIII细胞系的流式分析和ELISA实验结果；A：流式分析技术统计共培养24小时后肿瘤细胞存活的数量；B：数据统计分析A中剩余肿瘤细胞比例；C：肿瘤细胞的存活率；D：ELISA实验检测免疫激活因子的释放情况；
图5为iPSC来源的iMAC在体内生存时间和实体肿瘤组织浸润性的检验；A：活体成像检测iMAC的存活信号和时间；B：数据统计A中iMAC的存活曲线；C：实验流程图；D：肿瘤组织中iMAC的浸润情况；E：免疫组化实验检测肿瘤组织内部iMAC的浸润情况；
图6为GBM小鼠肿瘤模型中验证CAR-iMAC的肿瘤杀伤效果；A：三种CAR-iMAC分别对GBM(Luciferin生物素发光)的杀伤效果；B：肿瘤信号的变化情况；C：不同CAR-iMAC治疗后GBM小鼠生存的时间；
图7为CD8-GM-CSFRα/β-CAR的结构图及其激活示意图；
图8为体外验证CD8-GM-CSFRα/β-CAR-iMAC靶向杀伤和依赖CAR免疫激活的效果；
图9为本发明中设计的三代CAR的结构示意图，以及不同CAR-iMAC依赖CAR而免疫激活的对比示意图。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本申请中，术语“巨噬细胞(Macrophage)”通常是指一种由单核细胞(Monocyte)穿出血管后发育而来的髓样免疫细胞，广泛分布于机体组织的各个脏器中。其在正常组织中的主要生理作用是：通过加工和呈递抗原的方式介导特异性免疫反应；以固定细胞或游离细胞的形式吞噬并降解坏死细胞、碎片和异物，继而参与机体内非特异性反应；通过分泌炎症因子激活淋巴球或其他免疫细胞，进而协调炎症过程。
在本申请中，术语“嵌合性抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)”通常是指主要由胞膜外抗原结合区、跨膜区和胞内信号传导区三部分构成。膜外区是一段具有靶向并结合肿瘤特异性抗原TAA功能的单链可变区结构域(single chain Fv domain,scFv)。跨膜区通常是由免疫球蛋白超家族组成,如CD8或CD28。胞内信号传导区主要是由可活化免疫细胞的激活受体的胞内信号转导结构域构成，如T细胞专属的共刺激因子(4-1BB或CD28)、信号活化区CD3ζ。装载嵌合性抗原受体的免疫细胞与肿瘤细胞表面抗原特异性结合后，膜外抗原结合区将信号传递到胞内信号活化区，继而启动免疫细胞活化反应。
在本申请中，术语“巨噬细胞的极化”通常是指在响应各种环境因素(例如，微生物产物，受损细胞，活化的淋巴细胞)或在不同的病理生理条件下，巨噬细胞转化为不同的功能表型，即经典活化性巨噬细胞(classically activated macrophages，M1)和选择活化性巨噬细胞(alternatively activated macrophages，M2)。成熟的巨噬细胞在各种因素下出现表型及形态分化，即巨噬细胞的极化现象。根据对环境刺激反应的不同，巨噬细胞主要被激活为M1和M2两种表型。在长期肿瘤微环境下，经IFN-γ和LPS等信号活化得到M1型，主要具有抗肿瘤和增强免疫的作用，能分泌炎症因子、趋化因子、效应分子和TNF-α等，其中以膜分子CD80、表面标记CD64等为代表。经IL-4和IL-13等因子活化得到M2型，主要具有抑制免疫反应、促进血管发生、组织修复和促进肿瘤生长的潜能，更多地分泌IL-10、TGF-β、VEGF等因子，以CD163和CD206相对高表达。
在本申请中，术语“诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)”通常是指是通过在成体细胞中转入多能性因子继而起始基因组表达谱重新编程得到的具有分化为多种细胞潜能的多能性干细胞。
在本申请中，术语“iMAC”通常是指由iPSC诱导分化而来的Macrophage。
在本申请中，术语“单核细胞”是指由骨髓中的造血干细胞分化而来，并在骨髓中发育的细胞。可进一步分化为成熟的巨噬细胞和树突状细胞的。单核细胞具有明显的变形运动的特点，具有吞噬和清除受伤、衰老的细胞及其碎片的能力。此外，单核细胞还参与免疫反应，将吞噬抗原后所携带的抗原决定簇转交给淋巴细胞，继而诱导淋巴细胞的特异性免疫性反应。单核细胞还具有识别和杀伤肿瘤细胞的能力。
第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，包括依次连接的胞外抗原结合域、跨膜结构域和胞内激活结构域；
所述胞外抗原结合域包括信号肽和/或靶向EGFRvIII的scFv；
跨膜结构域包括CD8α；
所述胞内激活结构域包括TIR、CD3ZETA或GM-CSFRα/β中的至少一种。
本发明提供了一种嵌合抗原受体中，胞外抗原结合域包括信号肽和/或scFv，信号肽可帮助CAR蛋白序列定位到细胞膜表面，scFv能够异性识别GBM特异表达的细胞膜表面蛋白EGFRvIII；跨膜结构域包括CD8α，连接胞外抗原结合域和胞内激活结构域；胞内激活结构域包括TIR、CD3ZETA或GM-CSFRα/β，促进巨噬细胞向M1型极化，将本发明提供的嵌合抗原受体引入到巨噬细胞中，在赋予该巨噬细胞对GBM的靶向杀伤作用的同时，也增强了该免疫细胞抵御肿瘤微环境的免疫抑制效应，有效的促进并维持其M1极化状态。
作为进一步技术方案，所述信号肽由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列表达；
所述scFv由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达。
作为进一步技术方案，所述CD8α由SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列表达。
作为进一步技术方案，所述TIR包括但不限于来源于TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR13或TLR19的胞内信号转导结构域；
所述TLR4的胞内信号转导结构域由SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列表达；
所述CD3ZETA由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列表达；
所述GM-CSFRα/β由SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列表达。
第二方面，本发明提供了一种巨噬细胞的极化方法，将嵌合抗原受体在巨噬细胞中表达。
在本发明中，通过将上述嵌合抗原受体在巨噬细胞中表达，以实现巨噬细胞的M1极化，该方法简单有效。
第三方面，本发明提供了一种巨噬细胞，包括嵌合抗原受体。
该巨噬细胞能够表达上述本发明提供的嵌合抗原受体，能够维持M1极化状态，对GBM的靶向杀伤性强。
本发明中设计的三代CAR的结构示意图，以及不同CAR-iMAC依赖CAR而免疫激活的对比示意图如图9所示。
图9中的A展示Truncate CAR主要由胞外特异性识别EGFRvIII蛋白的scFv结构域和CD8α跨膜结构域组成。缺乏胞内信号转导结构域。第一代CAR主要由胞外特异性识别EGFRvIII蛋白的scFv结构域、CD8α跨膜结构域和胞内CD3ZETA信号转导结构域构成。第二代CAR主要由胞外特异性识别EGFRvIII蛋白的scFv结构域、CD8α跨膜结构域和专属于巨噬细胞的胞内信号转导结构域构成。该胞内信号转导结构域分别是单个的TIR或GM-CSFRα/β激活结构域。第三代CAR是在第二代CAR的基础上升级而来。区别在于第三代CAR的胞内信号转导结构域分别由CD3ZETA、TIR和GM-CSFRα/β两两之间通过Linker连接组合而成，以达到更强、更持久的免疫激活效果。
图9中的B-E展示了不同CAR-iMAC依赖CAR而免疫激活的示意图。由于缺乏胞内信号转导结构域，Truncate CAR-iMAC不具备依赖CAR而免疫激活的功能。第一代CAR胞外的scFv靶向识别EGFRvIII后，其胞内的CD3ZETA信号转导结构域被激活，进而起始第一代CAR-iMAC的免疫激活和少量的炎症因子释放。TIR的激活可刺激巨噬细胞免疫激活，释放IL1、IL6、TNFα等炎症因子，并向M1型极化。GM-CSFRα/β的激活可促进巨噬细胞的大量扩增，免疫激活，释放IL12、IL23、TNFα等炎症因子，并向M1型极化。因此，相对第一代CAR-iMAC，第二代CAR-iMAC在靶向EGFRvIII后，在肿瘤微环境中显著的提高了生存扩增，M1极化，以及免疫激活等抗肿瘤能力。当第三代CAR胞外的scFv靶向识别EGFRvIII后，其胞内将有TIR、CD3ZETA和GM-CSFRα/β当中的其中2个信号转导结构域协同发挥免疫激活的作用，可利用不同免疫激活信号通路的优势，进而发挥更强、更持久的免疫激活效果。
第四方面，本发明提供了一种巨噬细胞的制备方法，包括如下步骤：构建含有所述嵌合抗原受体的基因表达序列的慢病毒表达体系，利用慢病毒表达体系将嵌合抗原受体的基因表达序列整合到多能干细胞中，经诱导分化后制备得到巨噬细胞；
优选地，所述多能干细胞先诱导分化为单核细胞，再分化得到巨噬细胞。
发明人研究发现，原代巨噬细胞很难被慢病毒感染，很难被编辑和进行工程化改造，基于此，本发明提供了一种上述巨噬细胞的制备方法，采用本发明方法制备得到的巨噬细胞能够长期稳定的过表达嵌合抗原受体，能够解决目前免疫细胞治疗所存在的编辑效率低、周期长、工作量大和治疗不及时等方面的问题。
第五方面，本发明提供了一种能够分化得到上述巨噬细胞的多能干细胞，所述多能干细胞含有编码所述嵌合抗原受体的基因。
由于该多能干细胞含有编码上述嵌合抗原受体的基因，其状态更倾向于促炎抑肿瘤的M1状态，能够进一步分化得到巨噬细胞，更有利于抑制肿瘤。
第六方面，本发明提供了一种能够分化得到上述巨噬细胞的单核细胞，所述单核细胞含有编码所述嵌合抗原受体的基因；
所述单核细胞由多能干细胞分化得到。
第七方面，本发明提供了一种巨噬细胞、多能干细胞或单核细胞在制备用于治疗神经胶质瘤的产品中的应用。
由于本发明提供的巨噬细胞能够维持M1极化状态，对GBM的靶向杀伤性强，因此，能够用于制备治疗神经胶质瘤的产品，而多能干细胞能够分化得到上述巨噬细胞，因此同样能够用于制备治疗神经胶质瘤的产品。
第八方面，本发明提供了一种用于治疗神经胶质瘤的产品，所述产品包括上述巨噬细胞。
本发明提供的巨噬细胞能够维持M1极化状态，对GBM的靶向杀伤性强，包括该巨噬细胞在内的产品也同样具有治疗神经胶质瘤的作用。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
构建表达EGFRvIII抗原的GBM细胞系。
获取GBM特异性膜蛋白EGFRvIII的表达序列，并借助分子克隆手段将其克隆到慢病毒表达质粒Lenti-EF1A-PGK-Puro中，构建得到的EGFRvIII慢病毒表达体系，如图1中的A所示。借助慢病毒表达体系将GBM特异性的膜蛋白EGFRvIII分别表达在GBM细胞系U87MG和LN-229中，得到稳定表达该膜蛋白的U87MGEGFRvIII细胞系。
采用Western Blotting分别检测慢病毒感染后总的EGFR和EGFRvIII在U87MG细胞中的表达水平，实验步骤如下：
1.细胞总蛋白样品的制备
(1)将野生型U87MG细胞和通过慢病毒过表达了EGFRvIII的U87MG细胞接种到6CM细胞培养皿中，于37℃/5％CO2细胞培养箱中培养至长满培养皿。
(2)用移液器弃去细胞培养液。每个培养皿中加入3ml 4℃预冷的1×PBS(0.01MpH7.2～7.3)。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养皿置于冰上。
(3)每个细胞培养皿中加入500ul含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养皿要置于摇床轻轻摇动。
(4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。
(5)于4℃下12000rpm离心20min。
(6)将离心后的上清分装转移到新的1.5ml的离心管中。
(7)在上一步得到的细胞裂解液中加入使用终浓度为1×，并含有β-巯基乙醇的5×SDS loading buffer。混匀后，与95℃金属浴中加热5分钟，使蛋白变性。-20℃或冰上保存备用。
2.SDS凝胶电泳及转膜
(8)制备好凝胶电泳体系，并将上一步得到的蛋白样品各10ul，以及5ul蛋白marker加入到相应的上样孔中。
(9)设置电泳条件为100V恒压，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
(10)将上一步得到的凝胶置于湿式转膜体系中，于100V恒压条件下，电转约120分钟，使凝胶中的蛋白充分转移到PVDF膜上。
3免疫反应
(11)将上一步转移有蛋白的PVDF膜快速取出，置于TBST溶液中洗净转膜液后，移至用TBST配制5％脱脂牛奶中，室温封闭1个小时。期间要在水平摇床上轻摇。
(12)通过PVDF上蛋白marker的标识，预测目的蛋白(EGFRvIII、EFGR和内参β-ACTIN)的所在位置，用剪刀将含有目的蛋白的膜分别剪至适宜大小。
(13)将以上得到的含有目的蛋白的膜分别置于含有EGFRvIII、EFGR和β-ACTIN一抗的5％脱脂牛奶中，4℃过夜孵育(10-12小时)。
(14)从上一部中取出孵育了一抗的PVDF膜，在室温条件下，于水平摇床上用TBST清洗三次，每次10分钟。
(15)根据种属匹配原则，将上一步清洗后的PVDF膜置于稀释了相同种属来源且偶联了HRP的二抗的5％脱脂牛奶中，室温摇床孵育1小时。
(16)从上一部中取出孵育了一抗的PVDF膜，在室温条件下，于水平摇床上用TBST清洗三次，每次10分钟。
4化学成像
(17)用吸水纸吸干上一步清洗过后的PVDF膜上的TBST，正面朝上，置于化学发光成像仪中。用移液器快速的向膜的正面适量预先配制好的ECL化学发光液。设置好成像条件后，成像保存。
结果如图1中的B和图1中的C所示，表明构建得到的U87MGEGFRvIII细胞系中，EGFR和EGFRvIII高表达。
免疫荧光实验步骤如下：
第一天：
1.将野生型U87MG细胞和通过慢病毒过表达了EGFRvIII的U87MG细胞接种到铺有细胞爬片的24孔细胞培养板中。
2.于37℃/5％CO2细胞培养箱中培养12个小时。
第二天：
3.在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min。
4.用4％的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min。
5.0.5％Triton X-100(PBS配制)室温通透20min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤)。
6.PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加2.5％BSA，室温封闭30min(或37度20分钟)。
7.吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的；EGFRvIII一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜(一般要大于18小时)，或37度，1-2小时。
第三天：
8.加荧光二抗：PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
9.复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5minx4次洗去多余的DAPI；8.用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
免疫荧光检测实验表明EGFRvIII在U87MG细胞中过表达后定位在了细胞膜表面(图1中的D)。
实施例2
构建CAR-iMAC，并通过体外实验探究其对GBM细胞系的靶向杀伤功能。
1.构建iPSC诱导分化成iMAC的方法
1)将PBMC重编程为iPSC
从新鲜血液中分离出来的PBMC具有数量多、容易获取的优点，是诱导iPSC的绝佳材料。分离得到PBMC后，利用电转法将表达OCT3/4、SOX2、KLF4、L-MYC和LIN28A五种转录因子的表达载体转染至PBMC中，诱发其重编程，最终得到iPSC。
2)基于拟配体(EB)形成诱导iPSC分化为单核细胞(iMONO)和M1型巨噬细胞(iMAC)，实验步骤如下：
1.EB形成(第0天)。当iPSC培养到覆盖培养皿的60-80％的面积的时候，利用versene将其消化成单个细胞或较小的细胞聚集块儿。600rpm/3min离心后，用含有Y-27632的mTeSR1培养基重悬，并以1:2或1：3的比例接种到低吸附六孔板中。于37℃/5％CO2培养箱中，摇床培养约24小时。便可形成EB。
2.原条和中胚层诱导(第1天)。去除步骤1中培养EB的培养基。加入MI培养基(APELII medium+10ng/mL BMP4+5ng/mL bFGF)。继续以步骤1的条件培养24小时。
3.造血干细胞(HSC)诱导(第2-7天)。去除步骤2中的MI培养基。加入HS培养基(APEL II medium+10ng/mL BMP4+5ng/mL bFGF+50ng/ml VEGF+100ng/mL SCF)。以步骤1的条件继续培养。
4.髓系细胞和单核前体细胞(MPC)扩增(第8-10天)。去除步骤3中的HS培养基。加入ME-1培养基(APEL II medium+5ng/mL bFGF+50ng/ml VEGF+100ng/mL SCF+10ng/mLIGF1+25ng/mL IL-3+50ng/mL M-CSF+50ng/mL GM-CSF)。以步骤1的条件继续培养。
5.iMONO的诱导(约第11天)。将步骤4中的EB转移到基质胶(Matrigel)包被的六孔板中。加入ME-2培养基(StemSpan-XF medium+5ng/mL bFGF+50ng/ml VEGF+100ng/mL SCF+10ng/mL IGF1+25ng/mL IL-3+50ng/mL M-CSF+50ng/mL GM-CSF),于37℃/5％CO2培养箱中静置培养。在这个时间段里面会有呈单个细胞状态的iMONO不断的漂浮在培养基中。换液并离心收集iMONO。
6.iMAC的成熟(约第17)。将步骤5中收集到的iMONO收集到新的Matrigel包被的六孔板中。加入MM培养基(StemSpan-XF medium+5ng/mL bFGF+50ng/ml VEGF+100ng/mL SCF+10ng/mL IGF1+25ng/mL IL-3+100ng/mL M-CSF+100ng/mL GM-CSF),于37℃/5％CO2培养箱中静置培养。这个时间段里面会看到体积较小的iMONO向体积较大并呈空泡状的iMAC成熟。
7.iMAC的M1极化。收集步骤6中成熟的iMAC，加入含有100ng/ml LPS和100ng/mlIFN-γ的MS培养基(RPMI1640+100ng/mL M-CSF+100ng/mL GM-CSF)，大约24小时便可得到极化的iMAC。
该过程诱导分化只需要13-28天。这期间会有源源不断的iMONO和iMAC产生。因此分化效率高且活性好的iMONO和iMAC为后续大量的免疫细胞需求提供了保障。
3)检验iPSC来源的iMAC的巨噬细胞特性
通过流式分析技术检测iMAC表面标志性抗原，单细胞RNA-seq术分析iMAC基因表达谱，ELISA技术检测细胞因子分泌等方法确定iPSC成功诱导分化为了M1型iMAC。
2.构建具有靶向GBM功能的CAR-iMONO或CAR-iMAC
1)设计特异识别EGFRvIII的嵌合抗原受体
获取靶向EGFRvIII的sc-Fv的基因表达序列。利用分子克隆的方法将该序列与CD8α的跨膜结构域基因表达序列，以及TIR、CD3ZETA结构域表达序列组合克隆到慢病毒表达质粒Lenti-EF1A-T2A-EGFP-Puro中，形成融合表达的CAR序列(图2中的A)。同时，拟设计不含胞内激活结构域的CAR(scFv-CD8-DELTA-CAR)作为检验胞内信号转导结构域能否发挥免疫激活功能的阴性对照。
其中，信号肽是一段含有疏水性氨基酸序列的短肽链。具有引导新合成的蛋白质跨膜或者分泌到胞外的作用。信号肽的表达序列由SEQ ID NO.1所示的核酸序列表达：
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG(SEQID NO.1)。
sc-Fv的表达序列为由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达：
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGAAACAACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGAGACTGATCTACGCTGCCAGCAATCTGCAGAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCACCGGAAGCGGCTCCGGCACCGAGTTCACCCTGATCGTGTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACCACAGCTACCCTCTGACCAGCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGGACCGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGCCTGGCAGCGGCGAGGGAAGCGAGGTCCAGGTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGTCTTGGGTCCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCAGCGGCTCTGGCGGCTCCACCAACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCGGCAGCAGCGGGTGGAGCGAGTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTGTCTAGC(SEQ ID NO.2)。
CD8α由SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列表达：
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC(SEQ ID NO.3)。
TIR由SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列表达：
AACATCTATGATGCCTTTGTTATCTACTCAAGCCAGGATGAGGACTGGGTAAGGAATGAGCTAGTAAAGAATTTAGAAGAAGGGGTGCCTCCATTTCAGCTCTGCCTTCACTACAGAGACTTTATTCCCGGTGTGGCCATTGCTGCCAACATCATCCATGAAGGTTTCCATAAAAGCCGAAAGGTGATTGTTGTGGTGTCCCAGCACTTCATCCAGAGCCGCTGGTGTATCTTTGAATATGAGATTGCTCAGACCTGGCAGTTTCTGAGCAGTCGTGCTGGTATCATCTTCATTGTCCTGCAGAAGGTGGAGAAGACCCTGCTCAGGCAGCAGGTGGAGCTGTACCGCCTTCTCAGCAGGAACACTTACCTGGAGTGGGAGGACAGTGTCCTGGGGCGGCACATCTTCTGGAGACGACTCAGAAAAGCCCTGCTGGATGGT(SEQ IDNO.4)。
CD3ZETA由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列表达：
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO.5)。
GM-CSFRα/β由SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列表达：
AAAAGGTTCCTTAGGATACAGCGGCTGTTCCCGCCAGTTCCACAGATCAAAGACAAACTGAATGATAACCATGAGGTGGAAGACGAGATCATCTGGGAGGAATTCACCCCAGAGGAAGGGAAAGGCTACCGCGAAGAGGTCTTGACCGTGAAGGAAATTACCGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTCGCTTCTGTGGCATCTACGGGTACAGGCTGCGCAGAAAGTGGGAGGAGAAGATCCCCAACCCCAGCAAGAGCCACCTGTTCCAGAACGGGAGCGCAGAGCTTTGGCCCCCAGGCAGCATGTCGGCCTTCACTAGCGGGAGTCCCCCACACCAGGGGCCGTGGGGCAGCCGCTTCCCTGAGCTGGAGGGGGTGTTCCCTGTAGGATTCGGGGACAGCGAGGTGTCACCTCTCACCATAGAGGACCCCAAGCATGTCTGTGATCCACCATCTGGGCCTGACACGACTCCAGCTGCCTCAGATCTACCCACAGAGCAGCCCCCCAGCCCCCAGCCAGGCCCGCCTGCCGCCTCCCACACACCTGAGAAACAGGCTTCCAGCTTTGACTTCAATGGGCCCTACCTGGGGCCGCCCCACAGCCGCTCCCTACCTGACATCCTGGGCCAGCCGGAGCCCCCACAGGAGGGTGGGAGCCAGAAGTCCCCACCTCCAGGGTCCCTGGAGTACCTGTGTCTGCCTGCTGGGGGGCAGGTGCAACTGGTCCCTCTGGCCCAGGCGATGGGACCAGGACAGGCCGTGGAAGTGGAGAGAAGGCCGAGCCAGGGGGCTGCAGGGAGTCCCTCCCTGGAGTCCGGGGGAGGCCCTGCCCCTCCTGCTCTTGGGCCAAGGGTGGGAGGACAGGACCAAAAGGACAGCCCTGTGGCTATACCCATGAGCTCTGGGGACACTGAGGACCCTGGAGTGGCCTCTGGTTATGTCTCCTCTGCAGACCTGGTATTCACCCCAAACTCAGGGGCCTCGTCTGTCTCCCTAGTTCCCTCTCTGGGCCTCCCCTCAGACCAGACCCCCAGCTTATGTCCTGGGCTGGCCAGTGGACCCCCTGGAGCCCCAGGCCCTGTGAAGTCAGGGTTTGAGGGCTATGTGGAGCTCCCTCCAATTGAGGGCCGGTCCCCCAGGTCACCAAGGAACAATCCTGTCCCCCCTGAGGCCAAAAGCCCTGTCCTGAACCCAGGGGAACGCCCGGCAGATGTGTCCCCAACATCCCCACAGCCCGAGGGCCTCCTTGTCCTGCAGCAAGTGGGCGACTATTGCTTCCTCCCCGGCCTGGGGCCCGGCCCTCTCTCGCTCCGGAGTAAACCTTCTTCCCCGGGACCCGGTCCTGAGATCAAGAACCTAGACCAGGCTTTTCAAGTCAAGAAGCCCCCAGGCCAGGCTGTGCCCCAGGTGCCCGTCATTCAGCTCTTCAAAGCCCTGAAGCAGCAGGACTACCTGTCTCTGCCCCCTTGGGAGGTCAACAAGCCTGGGGAGGTGTGT(SEQ ID NO.6)。
2)构建CAR-iMONO或CAR-iMAC
利用慢病毒系统分别将三种不同CAR的表达序列整合到iPSC当中。借助绿色荧光表达和单细胞RNA-seq等技术手段获取稳定表达CAR的细胞系(CAR-iPSC)。而后，进一步将该三种CAR-iPSC诱导分化成依赖CAR激活的CAR-iMONO或CAR-iMAC。
构建CAR-iMAC，并进行非特异性基础吞噬功能检验，实验步骤如下：
1.将一定数量的表达绿色荧光蛋白的CAR-iMAC接种到六孔板中，于含有100ng/mlLPS、100ng/ml人源INF-γ、100ng/ml M-CSF和100ng/ml GM-CSF的RPMI1640培养基中极化24小时。期间置于37℃/5％CO2细胞培养箱中。
2.将以上得到的极化了的CAR-iMAC和表达tdTomato红色荧光蛋白的野生型LN-229细胞以10/1的比例接种到玻璃皿中，用含有100ng/ml M-CSF和100ng/ml GM-CSF的RPMI1640培养基,于37℃/5％CO2细胞培养箱中共培养24小时。
3.将上一步的玻璃皿置于共聚焦荧光扫描显微镜中，设置好参数后，扫描观察红色荧光和绿色荧光的共定位情况，并拍照保存。
CAR-iMAC的构建及其非特异性基础吞噬功能的检验如图2所示，结果表明，CAR-iMAC具有基础性吞噬功能。
实施例3
体外评估CAR-iMAC杀伤GBM细胞系的能力。
按3:1、5:1、10:1的效靶比分别将表达以上三种不同的CAR-iMAC和对照组细胞iMAC在体外与表达荧光素酶的U87MGEGFRvIII细胞在活细胞工作站中共培养，比对含有不同胞内激活结构域的CAR提升CAR-iMAC靶向GBM的效果和促进其免疫激活的效果。荧光素酶检测实验和肿瘤细胞流式计数实验检测不同的CAR-iMAC靶向杀伤作用。依据以上指标对比scFv-CD8-TIR-CAR相比scFv-CD8-DELTA-CAR和scFv-CD8-CD3ZETA-CAR对CAR-iMAC极化和激活的效果。结果如图3所示。
其中，图3中的A的实验步骤如下：
1.将一定数量的表达绿色荧光蛋白的3种CAR-iMAC和WT-iMAC接种到六孔板中，于含有100ng/mlLPS、100ng/ml人源INF-γ、100ng/ml M-CSF和100ng/ml GM-CSF的RPMI1640培养基中极化24小时。期间置于37℃/5％CO2细胞培养箱中。
2.将以上得到的极化了的3种CAR-iMAC和WT-iMAC分别与表达tdTomato红色荧光蛋白的U87MGEGFRvII细胞以10：1的比例接种到玻底皿中，用含有100ng/ml M-CSF和100ng/ml GM-CSF的RPMI1640培养基,于37℃/5％CO2细胞培养箱中共培养12小时。
3.将上一步的玻底皿置于OLYPUS荧光显微镜中，设置好参数后，观察红色荧光和绿色荧光的分布情况，并拍照保存。
图3中的B的实验步骤如下：
1.将一定数量的表达绿色荧光蛋白的3种CAR-iMAC和WT-iMAC接种到六孔板中，于含有100ng/mlLPS、100ng/ml人源INF-γ、100ng/ml M-CSF和100ng/ml GM-CSF的RPMI1640培养基中极化24小时。期间置于37℃/5％CO2细胞培养箱中。
2.将以上得到的极化了的3种CAR-iMAC和WT-iMAC分别与表达tdTomato红色荧光蛋白的U87MGEGFRvII细胞以10：1的比例接种到玻底皿中，用含有100ng/ml M-CSF和100ng/mlGM-CSF的RPMI1640培养基,于37℃/5％CO2细胞培养箱中共培养24小时。
3.将上一步的玻底皿置于共聚焦荧光扫描显微镜中，设置好参数后，扫描观察红色荧光和绿色荧光的共定位情况，并拍照保存。
图4中的A和B图的实验步骤：
1.将表达绿色荧光蛋白的3种CAR-iMAC和WT-iMAC极化24小时后分别与表达tdTomato红色荧光蛋白的U87MGEGFRvII细胞分别以3：1,5:1,以及10:1的比例于六孔板中共培养24小时(方法同图3中的B图)。
2.胰蛋白酶消化并收集共培养的细胞，于流式分析仪中检测并统计分析3种CAR-iMAC、WT-iMAC和U87MGEGFRvII细胞的数量。设置参数为：绿色荧光蛋白为FITC通道，tdTomato为PE通道。
图4中的C图实验步骤：
1.将表达绿色荧光蛋白的3种CAR-iMAC极化24小时后分别与表达荧光素酶基因luciferase的U87MGEGFRvII细胞以10：1的比例于避光的96孔板中共培养24小时。并设置只有U87MGEGFRvII细胞的培养孔作为阴性对照(NC)(方法同图3中的B图)。
2.在共培养体系中每孔加入100ul浓度为10mg/ml的luciferin，并快速的置于多功能酶标仪中检测荧光信号。
图4中的D图实验步骤：
1.收集A图中共培养体系的培养基上清，1000rpm离心20分钟。
2.将上一步得到的培养基上清100ul加入到白介素12(IL-12)酶联免疫吸附测定试剂盒的相应检测孔中。通过ELISA实验检测3种CAR-iMAC和WT-iMAC分别与表达tdTomato红色荧光蛋白的U87MGEGFRvII细胞以10：1的比例于共培养后，IL-12的分泌情况，统计并分析检测数据。
结果显示，靶向EGFRvIII的三种CAR-iMAC(EGFP)与U87MGEGFRvIII(tdTomato)体外共培养12小时后，显示不同CAR-iMAC相对于WT-iMAC对U87MGEGFRvIII粘附性更强，同时U87MGEGFRvIII细胞胞体要明显大于CAR-iMAC(图3中的A)。共聚焦扫描显示三种CAR-iMAC和WT-iMAC都具有胞啃U87MGEGFRvIII的能力(图3中的B)。
采用流式分析技术统计三种CAR-iMAC和WT-iMAC分别以3:1、5:1以及10:1的效靶比与U87MGEGFRvIII共培养24小时后肿瘤细胞存活的数量。结果显示scFv-CD8-TIR-CAR-iMAC和scFv-CD8-CD3ZETA-CAR-iMAC均具备显著杀伤U87MGEGFRvIII的能力，并随着效靶比的增加杀伤效果越显著(图4中的A和B)。
三种CAR-iMAC按不同的效靶比分别与稳定表达荧光素酶U87MGEGFRvIII细胞体外共培养24小时后，通过检测检测荧光素酶活性来表征该肿瘤细胞的存活率。结果如图4中的C所示，表明在5/1和10/1的效靶比下，scFv-CD8-TIR-CAR-iMAC和scFv-CD8-CD3ZETA-CAR-iMAC相对于scFv-CD8-DELTA-CAR-iMAC具有显著杀伤U87MGEGFRvIII细胞的能力。
三种CAR-iMAC和WT-iMAC按10/1的效靶比分别与U87MGEGFRvIII共培养24小时后，ELISA实验检测免疫激活因子的释放情况。结果如3中的F所示，表明scFv-CD8-TIR-CAR-iMAC和scFv-CD8-CD3ZETA-CAR-iMAC相对WT-iMAC和scFv-CD8-DELTA-CAR-iMAC分泌的促炎因子IL12显著上调。
实施例4
iPSC来源的iMAC在体内生存时间和实体肿瘤组织浸润性的检验，结果如图5所示。NSG小鼠腹腔注射荧光染料Dir标记的iMAC，并通过活体成像检测iMAC的存活信号和时间，如图5中的A所示。数据统计图5中的A图中iMAC的存活曲线(图5中的B)。表明iPSC来源的iMAC可以在肿瘤模型中存在的时间超过30天，满足肿瘤免疫细胞治疗对免疫细胞所需生存时间的要求。
向NSG小鼠腹腔注射1×106个过表达荧光素酶(Luciferase)基因的U87MG细胞，4小时后原位注射相同数量的iMAC，30天后，分离肿瘤组织，并分别通过Dir和Luciferin成像观察肿瘤组织中iMAC的浸润情况。结果如图5中的D所示，表明在GBM中有iMAC的存在。采用免疫组化实验进一步检测肿瘤组织内部iMAC的浸润情况，实验步骤如下：
1.在腹腔GBM小鼠模型中注射iMAC 30天后，分离肿瘤组织。并于4％的PFA中固定一周时间。
2.包埋组织：先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将上一步固定的肿瘤组织置于石蜡之中，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。
3.切片：将包埋好的肿瘤组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为5μm，用手笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40摄氏度温水中。
4.捞组织：赶走水浴中的气泡，组织受热展开后，用载玻片下1/2以同一方向捞取5-6张组织，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入37度温箱中烘干。
5.脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯、100％酒精、100％酒精、95％酒精、90％酒精、80％酒精和70％酒精中脱蜡，每个试剂中放10-15min。
6.抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min(中火)，刚到沸腾即可。室温冷却，然后再蒸煮一次，冷却至室温，以使抗原的位点暴露出来。
7.血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液。马上加上用PBS稀释十倍后的血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入37度温箱中半小时。
8.加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片的反面和正面组织周围的血清，分别滴加CD11b、CD86和CD206的一抗。于4度冰箱中保存过夜。
9.加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上相同属种的二抗，然后置于37度温箱中半小时。
10.加SABC：将片子从温箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上用PBS稀释100倍的SABC，然后置于37度温箱中半小时。
11.加显色剂：将片子从温箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。(显色剂的配置：在1ML水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C,摇匀。A:DAB，B:H202，C:磷酸缓冲液。
12.复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组织3-5min。
13.脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70％酒精-80％酒精-90％酒精-95％酒精-100酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。
14.封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片轻轻盖上(要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡)，封好片子后置于通风柜中晾干。
15.成像：将以上的达到的肿瘤组化样品置于OLYMPUS正置显微镜中，设置成像拍照。
结果如图5中的E所示，表明iMAC具备向实体肿瘤内部浸润的能力，并以M2型巨噬细胞的形式存在。
实施例5
构建GBM小鼠腹腔肿瘤模型
分别将2×106个过表达了荧光素酶基因的U87MGEGFRvIII细胞通过腹腔注射的方式接种到NSG小鼠腹腔内，构建腹腔GBM小鼠模型。
GBM模型体内CAR-iMAC抗肿瘤能力的验证
将以上三种不同的CAR-iMAC，及其对照细胞iMAC过继移植到腹腔GBM小鼠模型中。通过小鼠活体成像技术适时观察并记录肿瘤的变化、小鼠体重和生存状态的变化情况。结果如图6所示。
在NSG小鼠GBM腹腔模型分别注射三种CAR-iMAC(scFv-CD8-DELTA-CAR-iMAC、scFv-CD8-TIR-CAR-iMAC、scFv-CD8-CD3ZETA-CAR-iMAC)(DiR)和PBS后，通过活体成像技术展示在效靶比为10/1的情况下，三种CAR-iMAC分别对GBM(Luciferin生物素发光)的杀伤效果如图6中的A所示，并分别GBM在三种CAR-iMAC存在的情况下肿瘤信号的变化情况以及治疗后GBM小鼠生存的时间(图6中的B和C)，结果表明scFv-CD8-TIR-CAR-iMAC相对scFv-CD8-CD3ZETA-CAR-iMAC具备更强的体内抗肿瘤功能。
实施例6
一种嵌合抗原受体CD8-GM-CSFRα/β-CAR，其结构示意图及其激活示意图如图7所示，图7中的A显示，CD8-GM-CSFRα/β-CAR由胞外识别EGFRvIII的scFv蛋白序列，CD8α跨膜结构域，以及胞内的信号转导结构域构成。胞内信号转导结构域由受体GM-CSFRα的胞内信号激活结构域和受体GM-CSFRβ的胞内信号激活结构域通过Linker序列链接构成。Linker序列可以灵活改变构象。图7中的B显示，CD8-GM-CSFRα/β-CAR胞外的scFv在接触EGFRvIII蛋白从而形成免疫突触后，包内的GM-CSFRα和GM-CSFRβ激活结构域便通过Linker构象的改变形成异源二聚体，继而得以激活，最终促进CAR-iMAC的增殖、免疫激活和吞噬作用。
实施例7
体外验证CD8-GM-CSFRα/β-CAR-iMAC靶向杀伤和依赖CAR免疫激活的效果。
按照实施例3图3中的B图的实验方法，将CD8-GM-CSFRα/β-CAR-iMAC和CD8-DELTA-CAR-iMAC在体外与表达荧光素酶的U87MGEGFRvIII细胞在活细胞工作站中共培养，体外共培养24h后，通过共聚焦扫描显示CD8-GM-CSFRα/β-CAR-iMAC(EGFP)和不含胞内信号转导结构域的CD8-DELTA-CAR-iMAC(EGFP)均具有吞噬U87MGEGFRvIII细胞的能力(图8中的A)。将WT-iMAC、CD8-DELTA-CAR-iMAC以及CD8-GM-CSFRα/β-CAR-iMAC以10/1的效靶比，分别与U87MGEGFRvIII细胞体外共培养24h后，通过ELISA实验检测巨噬细胞免疫激活因子IL-12和TNFα的分泌情况。结果如图8中的B和C所示，表明CD8-GM-CSFRα/β-CAR-iMAC相对于WT-iMAC和CD8-DELTA-CAR-iMAC有显著的分泌IL-12和TNFα的能力。将WT-iMAC、CD8-DELTA-CAR-iMAC以及CD8-GM-CSFRα/β-CAR-iMAC以10/1的效靶比，分别与表达荧光素酶luciferase的U87MGEGFRvIII细胞体外共培养24h后，通过多功能酶标仪检测U87MGEGFRvIII细胞中的荧光信号。结果如图8中的D所示，表明，U87MGEGFRvIII细胞与CD8-GM-CSFRα/β-CAR-iMAC共培养后，荧光信号显著下调。进一步证实CD8-GM-CSFRα/β-CAR-iMAC相对于WT-iMAC和CD8-DELTA-CAR-iMAC有更为显著的杀伤U87MGEGFRvIII细胞的能力。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 巨噬细胞专属嵌合抗原受体、表达该受体的可控极化单核/巨噬细胞及其制
备方法和应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 2
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca gggcatcaga aacaacctgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagagact gatctacgct gccagcaatc tgcagagcgg cgtgcccagc 180
agattcaccg gaagcggctc cggcaccgag ttcaccctga tcgtgtccag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgcctgcag caccacagct accctctgac cagcggcgga 300
ggcaccaagg tggagatcaa gcggaccggc agcaccagcg gcagcggcaa gcctggcagc 360
ggcgagggaa gcgaggtcca ggtgctggaa tctggcggcg gactggtgca gcctggcggc 420
agcctgagac tgagctgtgc cgccagcggc ttcaccttca gcagctacgc catgtcttgg 480
gtccggcagg ctcctggaaa gggcctggaa tgggtgtccg ccatcagcgg ctctggcggc 540
tccaccaact acgccgacag cgtgaagggc cggttcacca tcagccggga caacagcaag 600
aacaccctgt atctgcagat gaacagcctg agagccgagg acaccgccgt gtactactgt 660
gccggcagca gcgggtggag cgagtactgg ggccagggca cactggtcac agtgtctagc 720
<210> 3
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 4
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aacatctatg atgcctttgt tatctactca agccaggatg aggactgggt aaggaatgag 60
ctagtaaaga atttagaaga aggggtgcct ccatttcagc tctgccttca ctacagagac 120
tttattcccg gtgtggccat tgctgccaac atcatccatg aaggtttcca taaaagccga 180
aaggtgattg ttgtggtgtc ccagcacttc atccagagcc gctggtgtat ctttgaatat 240
gagattgctc agacctggca gtttctgagc agtcgtgctg gtatcatctt cattgtcctg 300
cagaaggtgg agaagaccct gctcaggcag caggtggagc tgtaccgcct tctcagcagg 360
aacacttacc tggagtggga ggacagtgtc ctggggcggc acatcttctg gagacgactc 420
agaaaagccc tgctggatgg t 441
<210> 5
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 6
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaaaggttcc ttaggataca gcggctgttc ccgccagttc cacagatcaa agacaaactg 60
aatgataacc atgaggtgga agacgagatc atctgggagg aattcacccc agaggaaggg 120
aaaggctacc gcgaagaggt cttgaccgtg aaggaaatta ccggtggcgg tggctcgggc 180
ggtggtgggt cgggtggcgg cggatctcgc ttctgtggca tctacgggta caggctgcgc 240
agaaagtggg aggagaagat ccccaacccc agcaagagcc acctgttcca gaacgggagc 300
gcagagcttt ggcccccagg cagcatgtcg gccttcacta gcgggagtcc cccacaccag 360
gggccgtggg gcagccgctt ccctgagctg gagggggtgt tccctgtagg attcggggac 420
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ggaggccctg cccctcctgc tcttgggcca agggtgggag gacaggacca aaaggacagc 900
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gtctcctctg cagacctggt attcacccca aactcagggg cctcgtctgt ctccctagtt 1020
ccctctctgg gcctcccctc agaccagacc cccagcttat gtcctgggct ggccagtgga 1080
ccccctggag ccccaggccc tgtgaagtca gggtttgagg gctatgtgga gctccctcca 1140
attgagggcc ggtcccccag gtcaccaagg aacaatcctg tcccccctga ggccaaaagc 1200
cctgtcctga acccagggga acgcccggca gatgtgtccc caacatcccc acagcccgag 1260
ggcctccttg tcctgcagca agtgggcgac tattgcttcc tccccggcct ggggcccggc 1320
cctctctcgc tccggagtaa accttcttcc ccgggacccg gtcctgagat caagaaccta 1380
gaccaggctt ttcaagtcaa gaagccccca ggccaggctg tgccccaggt gcccgtcatt 1440
cagctcttca aagccctgaa gcagcaggac tacctgtctc tgcccccttg ggaggtcaac 1500
aagcctgggg aggtgtgt 1518

Claims (9)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包括依次连接的胞外抗原结合域、跨膜结构域和胞内激活结构域；
所述胞外抗原结合域包括信号肽和/或靶向EGFRvIII的scFv；
跨膜结构域包括CD8α；
所述胞内激活结构域选自TIR、CD3ZETA或GM-CSFRα/β中的一种；
所述信号肽由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列表达；
所述scFv由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列表达；
所述CD8α由SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列表达；
所述TIR由SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列表达；
所述CD3ZETA由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列表达；
所述GM-CSFα/β由SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列表达。
2.一种非疾病诊断和治疗目的的巨噬细胞的极化方法，其特征在于，将权利要求1所述的嵌合抗原受体在巨噬细胞中表达。
3.一种巨噬细胞，其特征在于，包括权利要求1所述的嵌合抗原受体。
4.权利要求3所述的巨噬细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：构建含有所述嵌合抗原受体的基因表达序列的慢病毒表达体系，利用慢病毒表达体系将嵌合抗原受体的基因表达序列整合到多能干细胞中，经诱导分化后制备得到巨噬细胞。
5.权利要求4所述的巨噬细胞的制备方法，其特征在于，所述多能干细胞先诱导分化为单核细胞，再分化得到巨噬细胞。
6.一种能够分化得到权利要求3所述巨噬细胞的多能干细胞，其特征在于，所述多能干细胞含有编码所述嵌合抗原受体的基因。
7.一种能够分化得到权利要求3所述巨噬细胞的单核细胞，其特征在于，所述单核细胞含有编码所述嵌合抗原受体的基因；
所述单核细胞由多能干细胞分化得到。
8.权利要求3所述的巨噬细胞、权利要求6所述的多能干细胞或权利要求7所述的单核细胞在制备用于治疗神经胶质瘤的产品中的应用。
9.一种用于治疗神经胶质瘤的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求3所述的巨噬细胞。
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