KR20210057781A - 조혈 줄기세포 및 이의 파생체의 생산을 위한 오르가노이드 조성물 - Google Patents

조혈 줄기세포 및 이의 파생체의 생산을 위한 오르가노이드 조성물 Download PDF

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KR20210057781A
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다카노리 다케베
제임스 엠. 웰스
카일 루이스
호르헤 오를란도 무네라
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칠드런즈 호스피탈 메디칼 센터
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Abstract

본 기재 내용은 전구 세포로부터 유래된 조성물, 및 조혈 줄기세포(HSC) 또는 파생 면역세포의 제조를 위해 이러한 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 지정된 분화를 통해 오르가노이드를 포함하는 오르가노이드 조직 또는 배양체로부터 조혈 줄기세포를 얻는 방법이 개시되는데, 상기 오르가노이드 조직 또는 배양체는 전구 세포(예컨대 배아 줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포)로부터 유래된 간 또는 결장 조직을 포함한다.

Description

조혈 줄기세포 및 이의 파생체의 생산을 위한 오르가노이드 조성물
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2018년 9월 12일자 제출된 미국 임시출원 일련번호 제62/730,061호에 대해 우선권의 이익을 주장하며, 상기 문헌은 모든 목적을 위해 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
최근, 조혈계를 재구성할 필요가 있는 개체에게, 골수 이식은 주요한 치료 수단이다. 공여된 골수 내의 줄기 세포 및 전구 세포는 보호성 면역, 조직 수선, 응고, 및 혈액의 다른 기능의 역할을 하는 혈액 세포를 증가시키고 대체할 수 있다. 성공적인 골수 이식의 경우, 공여자로부터 유래된 세포는 혈액, 골수, 비장, 흉선 및 다른 면역 기관에서 재증식할 수 있다. 골수는 특정 타입의 빈혈, 예컨대 재생불량성 빈혈(aplastic anemia), 판코니 빈혈(Fanconi's anemia), 면역 결핍, 암, 예컨대 림프종 또는 백혈병, 암종, 다양한 고형 종양, 및 조혈의 유전적 장애를 포함하는 다양한 질병을 치료하는데 점점 성공적으로 사용되어 왔다. 골수 이식은 또한 유전성 저장 질환, 중증 지중해 빈혈(thalassemia major), 겸상 세포 질환(sickle cell disease) 및 골다공증(osteoporosis)의 치료에도 적용되어 왔다.
조혈 줄기세포(HSC)는 모든 타입의 혈액 세포로 분화할 수 있는 능력이 있고, 혈액 장애를 치료하기 위해 이식될 수 있지만, 공여자가 부족하여 다량의 HSC를 얻기가 어렵다. 추가로, 완벽히 매치되는(유전적으로 동일한) 공여자가 드물기 때문에, 면역세포가 필요한 개체에게 이를 제공하기 위해 골수 이식을 사용하는 것은 매우 제한적이다.
따라서, 당업계에는 이식에 적합한 HSC 조성물, 및 HSC를 제공할 수 있는 방법에 대한 필요성이 있다. 추가로, 이러한 조성물의 개발은 연구 목적으로 유용할 수 있으며, 현재 HSC는 충분한 양으로 이용할 수 없다. 본 기재 내용은 당업계의 상기 필요성들 중 하나 이상을 해결하기 위한 것이다.
본 기재 내용은 전구 세포로부터 유래된 조성물, 및 조혈 줄기세포(HSC) 또는 파생 면역세포의 제조를 위해 이러한 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 지정된 분화를 통해 오르가노이드를 포함하는 오르가노이드 조직 또는 배양체로부터 조혈 줄기세포를 얻는 방법이 개시되는데, 상기 오르가노이드 조직 또는 배양체는 전구 세포(예컨대 배아 줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포)로부터 유래된 간 또는 결장 조직을 포함한다.
당업계의 숙련자는 이하에 기재된 도면이 단지 예시의 목적으로만 제공되었다고 이해할 것이다. 도면은 본 발명의 교시의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하지 않도록 의도된다.
도 1 배양 21일차에 인간의 간 오르가노이드(HLO) 유전자 발현의 특징. a. 알부민 발현은 소폭 감소하나, 알파-태아단백질(AFP) 발현은 성숙한 간 오르가노이드를 분화시키는 이전의 방법(문헌[Ouchi et al., 2019])에 비해 증가한다. b. 내피 마커 CD34 및 KDR(VEGFR2)은 증가한다. c. 에리트로포이에틴(EPO) 및 헤모글로빈 감마(HBG)는 둘 다 증가한다.
도 2 HLO 배양체로부터의 골수 계열의 분화. a. HLO 배양체는 8일차 ~ 20일차에 단일 세포 현탁체로 분리되고, 사이토카인과 함께 메틸셀룰로스 상에 도말되어 골수계 분화를 촉진하고, 콜로니는 7일 ~ 14일 후에 분석되었다. b. 다수의 세포 타입이 생성된 것을 보여주는 대표적인 김사(Giemsa) 염색. c. HLO 배양체로부터의 세포를 제대혈(UCB) CD34+ 세포 및 미분화된 iPSC(N.D. = 미검출)와 비교한 CFC 콜로니 정량화.
도 3 HLO 배양체로부터의 B 세포의 분화. a. HLO 배양체는 8일차 ~ 20 일차에 단일 세포 현탁액으로 분리되고, 융합성(confluent) MS-5 세포와 함께 공동-배양되었다. b. MS-5와 함께 공동-배양한 후, UCB CD34+ 세포 및 HLO의 유세포 분석. 먼저, 세포를 CD45에 대하여 게이팅한(gate) 후, CD19 및CD11b에 대해 게이팅하여, 각각 B 세포 및 골수 세포를 분리하였다.
도 4 조혈 내피는 인간의 결장 오르가노이드 배양체에서 공동-발생한다. (a) 등대동맥(dorsal aorta)(n = 3)에서의 e10.5 마우스 배아 핵 RUNX1 염색의 홀마운트(Wholemount) RUNX1(적색), ENDOMUCIN(녹색) 및CDX2(백색) 염색. (b, c) (a)로부터의 광학 슬라이스. (d) CD34+ 혈관내피 맥관(n = 3) 내의 핵 RUNX1 염색을 나타내는, 22일차 HCO의 홀마운트 RUNX1(적색), CD34(녹색) 및 CDH1(백색) 염색. (e, f) (d)로부터의 광학 슬라이스. DA=등대동맥. (g) 21일차 HIO 및 HCO(각 그룹에 대해 n = 3)의 RNAseq 데이터의 TPM(백만당 전사체 수) 값의 그래프. (h) CD45 및 CD73에 의해 염색된, 게이팅된 CD34+ 세포의 유세포 분석 플롯. CD34+/CD45-/CD73- 세포는 흑색 박스 내에 나타나 있다. CD34+/CD45+/CD73- 세포는 녹색 박스 내에 나타나 있다.
도 5 적혈-골수계 및 림프계 전구체는 HCO 배양체 내에 생성된다. (a) HCO 배양체로부터의 사이토스핀(cytospin) 실시된 세포의 현미경 사진. (b) MethocultTM 배지에 형성된 콜로니의 예. (c) H1 인간 배아 줄기세포 및 (d) IPSC 263-10 유래 HCO로부터의 세포의 MethocultTM 내 콜로니 형성의 정량화. (e) T-세포 분화 유도 사이토카인이 처리되거나 미처리된 경우, CD3 및 CD4에 의해 염색된 CD45 게이팅된 세포의 유세포 분석 플롯.
도 6 HCO는 공동-발생하는 대식세포를 함유한다. (a) DAPI로 대비 염색된, 인간 결장 생검의 CD163(적색) 및 CDH1(녹색)의 면역형광 염색. (a') (a)의 박스 부위의 삽도. DAPI로 대비 염색되고, CD163 (적색) 및 CDH1 (녹색)에 대해 염색된 (b) HIO 및 (c) HCO의 홀마운트. 35일차 HIO 및 HCO(각 그룹당 n = 3)로부터의 RNAseq 데이터의 (d) SPI1(PU.1) 및 (e) CD163에 대한 TPM(백만당 전사체 수) 값의 그래프. DAPI로 대비 염색되고 hCD163(적색) 및 F4/80(녹색)에 대해 염색된, (f) 마우스 결장, (g) 인간 결장 생검 및 이식된 HCO의 면역형광 염색.
도 7 HCO는 염증유발성(pro-inflammatory) 사이토카인을 분비할 수 있는 염증성 대식세포를 갖는다. (a) 35일차 HIO 및 HCO의 RNAseq 데이터로부터 생성된 염증 관련 유전자의 히트맵(Heatmap). (b) DAPI로 대비 염색된, 35일차 HCO의 CD163(녹색), iNOS(적색) 및 CDH1(백색)에 대한 면역형광 염색. (b') b의 박스 부위의 삽도(DAPI 배제). (c ~ d) IL-6, IL-8, MIP1A(CCL3) 및 MIP1B(CCL4)에 대한 루미넥스 어레이(Luminex array) 데이터. 각 지점은 개별 분화로부터의 루미넥스 값을 나타낸다. (동일한 분화로부터의) 한 쌍의 HIO 및 HCO 샘플이 나란히(with lines) 나타나있다.
도 8 HCO 대식세포는 기능성을 갖는다. (a) LPS를 처리한 HCO의 생체 이미지 시간 경과(live imaging timecourse)의 현미경 사진. (b-e) HCO, 또는 LPS를 처리한 HCO의 IL-6, IL-8, MIP1A(CCL3) 및 MIP1B(CCL4)에 대한 루미넥스 어레이 데이터. (f) -/+ pHRODO E. coli 입자(녹색), 및 CD14(적색)에 대한 35일차 HCO의 면역형광 염색. (g) 식세포 작용으로 삼켜진 입자의 정량화(녹색)(그룹당 n = 3 웰의 오르가노이드).
도 9 HCO 대식세포는 박테리아에 반응하여 오르가노이드 내강으로 이동한다. (a) PBS, (b) 공생 E. coli, 및 (c) EHEC를 주입한 지 24 시간 후, DAPI로 대비 염색된 35일차 HCO의 CDH1(녹색) 및 MUC2(적색)에 대한 면역형광 염색. (d) PBS, (e) 공생 E. coli, 및 (f) EHEC를 주입한 지 24 시간 후, DAPI로 대비 염색된 35일차 HCO의 CDH1(녹색), HAM56(적색) 및 E. coli(백색)에 대한 면역형광 염색. (g) MUC2 형광 강도의 정량화(그룹당 n = 3). (h) E. coli 형광 강도의 정량화(그룹당 n = 3). (i) HAM56 대식세포 분포의 정량화(그룹당 n = 3).
도 10 실험의 작업 흐름도.
도 11 BMP 신호전달은 조혈 내피로 특화시킨다(specify).
도 12 내피 및 조혈 세포는 HCO 배양체 내에서 공동-발생한다.
도 13 HCO 배양체 유래 적혈구에서의 헤모글로빈 발현.
도 14 HCO에 존재하는 면역 세포의 유세포(Cytof) 분석.
도 15 WELLS 도 S6. 대식세포는 마우스 신피막으로 이식한 이후에도 HCO 내에 지속된다.
도 16 WELLS 도 S7. 유전자 온톨로지(Gene ontology) 분석으로 HCO에서 유사한 세포분화, 대식세포 성숙 및 염증이 밝혀졌다.
도 17 HCO 내의 대식세포는 E. coli 입자에 반응하여 사상위족(filipodia)을 연장할 수 있다.
도 18 태반, 간, 폐 및 결장의 이미지.
정의
달리 주목된 바 없는 경우, 용어는 관련 분야의 숙련자가 통상 이해하는 바에 따라 이해될 것이다. 분쟁이 있을 때, 정의를 포함한 본 문헌은 조정될 것이다. 바람직한 방법 및 물질이 이하에 기재되어 있지만, 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질도 본 발명의 수행 또는 시험에 사용될 수 있다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌들은 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 본원에 개시된 물질, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이며, 제한적인 것은 아니라고 의도된다.
본원 및 첨부된 청구항에 사용된 단수형 ["하나", "하나의" 및 "그"]은, 문맥에서 명백히 달리 지정되지 않는 경우 복수의 관련형을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 방법(a method)"에 대한 언급은 복수의 이러한 방법들을 포함하고, "하나의 용량(a dose)"에 대한 언급은 하나 이상의 용량 및 당업계의 숙련자들에게 알려진 이의 균등물에 대한 언급 등을 포함한다.
용어 "약(about)" 또는 "대략(approximately)"은 당업계의 숙련자가 결정하는 바와 같이 특정 값에 대해 허용가능한 오차 범위 내라는 것을 의미하는데, 이는 그 값이 측정되거나 결정되는 방법, 예를 들어, 측정 시스템의 제한에 따라 부분적으로 달라질 것이다. 예를 들어, "약"은 당업계에서 관례에 따라 1 표준 편차 이내 또는 1 표준 편차 초과를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 소정의 값의 최대 20%, 또는 최대 10%, 또는 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정에 대하여, 상기 용어는 값의 10-배 내(order of magnitude), 바람직하게는 값의 5-배 내, 및 더욱 바람직하게는 2-배 내에 있음을 의미할 수 있다. 본 출원 및 청구항에 특정 값이 기재될 때, 달리 기술된 바 없는 경우, 용어 "약"은 특정 값에 대해 허용가능한 오차 범위 내라는 것을 의미하는 것으로 추정되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "전능 줄기세포(totipotent stem cell)"(또한 옴니포텐트(omnipotent) 줄기세포로도 알려짐)는 배아 및 배아-외 세포 타입으로 분화할 수 있는 줄기세포이다. 이러한 세포는 완전한 생존가능한 유기체를 구성할 수 있다. 이들 세포는 난자와 정자 세포의 융합으로부터 생성된다. 수정된 난자의 첫 번째 몇 회의 분열로부터 생산된 세포도 또한 전능성을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "만능 줄기세포(PSC: pluripotent stem cell)"는, 또한 통상 PS 세포로도 알려져 있는데, 거의 모든 세포로 분화할 수 있는 임의의 세포, 즉, 내배엽(내부 위벽, 위장관, 폐), 중배엽(근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식기), 및 외배엽(상피 조직 및 신경계)을 포함한 3개의 배엽(생식 상피) 중 어느 것으로부터 유래된 세포를 포함한다. PSC는 배아 줄기세포(배아 생식세포 포함)로부터 유래되거나, 특정 유전자의 발현을 강제함으로써 비-만능 세포, 예컨대 성체 체세포를 유도하여 얻은 전능성 세포의 후손일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유도 만능 줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cell)"은, 또한 통상 iPS 세포로도 약칭되는데, 특정 유전자의 "강제된" 발현을 유도함으로써 정상적으로 비(非)만능성 세포, 예컨대 성체 체세포로부터 인공적으로 유도된 만능성 줄기세포의 타입을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "배아 줄기세포(ESC: embryonic stem cell)"는, 또한 통상 ES 세포로도 약칭되는데, 만능성이며, 초기-단계 배아인 배반포(blastocyst)의 내세포괴(inner cell mass)로부터 유래된 세포를 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "ESC"는 또한 때때로 넓게 사용되어, 배아 생식 세포도 포함한다.
본원에 사용된 용어 "전구 세포(precursor cell)"는, 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있는 임의의 세포를 포함하는데, 이를 통해 하나 이상의 전구 세포는 자체 재생되거나, 하나 이상의 특화된 세포 타입으로 분화하는 능력을 얻는다. 일부 양태에서, 전구 세포는 만능성이거나, 만능성이 될 능력을 갖는다. 일부 양태에서, 전구 세포는 외부 인자(예를 들어, 성장 인자)가 처리되면, 만능성을 얻는다. 일부 양태에서, 전구 세포는 전능 (또는 옴니포텐트) 줄기세포; (유도 또는 비-유도된) 만능 줄기세포; 다능(multipotent) 줄기세포; 올리고포텐트(oligopotent) 줄기세포 및 단능(unipotent) 줄기세포일 수 있다. 일부 양태에서, 전구 세포는 배아, 유아(infant), 소아(child) 또는 성체로부터 유래될 수 있다. 일부 양태에서, 전구 세포는 유전자 조작 또는 단백질/펩티드 처리를 통해 만능성이 부여되도록 처리된 체세포일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "세포 구성요소(cellular constituent)"는, 개별 유전자, 단백질, 유전자를 발현하는 mRNA, 및/또는 임의의 다른 가변성 세포 구성요소 또는 단백질 활성, 예컨대 단백질 변형(예를 들어, 인산화)의 정도인데, 이는 예를 들어, 당업계의 숙련자들에 의해 (예를 들어, 마이크로어레이 또는 면역조직화학에 의한) 생물학적 실험에서 통상 측정된다. 생체 시스템, 흔한 인간의 질병, 및 유전자 발견과 구조 결정의 바탕이 되는 생화학적 과정의 복잡한 네트워크와 관련된 유의한 발견들은, 이제 연구 과정의 일부로서 세포 구성요소 풍부도(abundance) 데이터의 응용에 기인할 수 있다. 세포 구성요소 풍부도 데이터는 생체마커를 식별하고, 질병 성향을 구별하고, 독성의 메커니즘을 식별하는데 도움을 줄 수 있다.
FGF 신호전달 경로 활성자: 섬유아세포 성장 인자(FGF)는 혈관 생성, 상처 치유 및 배아 발생에 관여하는 성장인자의 패밀리이다. 일부 양태에서, 당업계의 숙련자는 임의의 FGF가 Wnt 신호전달 경로의 단백질과 함께 사용될 수 있다는 사실을 이해할 것이다. 예시적인 FGF 신호전달 경로 활성자는 소분자 또는 단백질 FGF 신호전달 경로 활성자, FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. FGF 신호전달 경로와 관련된 세포 구성요소를 표적화하는 siRNA 및/또는 shRNA가 이 경로들을 활성화하는데 사용될 수 있다. 당업계의 숙련자는 적절한 양과 지속 시간을 용이하게 인식할 것이다.
WNT 신호전달 경로 활성자: Wnt 신호전달 경로의 조절자/활성자는, Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, 및 Wnt16를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 경로의 조작은 상기 경로를 활성화하는 소분자 조절자 또는 단백질 조절자, 또는 상기 언급된 경로를 활성화하는 단백질을 사용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, Wnt 경로의 소분자 조절자는 염화리튬; 2-아미노-4,6-이치환된 피리미딘(헤테로) 아릴피리미딘; IQ1; QS11; NSC668036; DCA 베타-카테닌; 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)-벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐) 피리미딘을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 외부 분자는 소분자, 예컨대 WAY-316606; SB-216763; 또는 BIO(6-브로모인디루빈-3'-옥심)을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, Wnt 및/또는 FGF 신호전달 경로 관련 세포 구성요소를 표적화하는 siRNA 및/또는 shRNA가, 이 경로들을 활성화하는데 사용될 수 있다. 당업계의 숙련자는 표적 세포 구성요소가 SFRP 단백질; GSK3, Dkk1, 및 FrzB를 포함하나, 이에 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 추가적인 조절자는 Wnt 신호전달 경로를 활성화하는 GSK3를 억제하는 분자 또는 단백질을 포함한다. 예시적인 GSK3 억제제는 키론/CHIR99021를 포함할 수 있는데, 이는 예를 들어, GSK3β를 억제한다. 당업계의 숙련자는 개시된 방법을 수행하는데 적합한 GSK3 억제제를 인식할 것이다. WNT 신호전달 경로 활성자는 개시된 방법을 수행하는데 충분한 양으로 투여될 수 있다. 당업계의 숙련자는 적절한 양과 지속 시간을 용이하게 인식할 것이다.
BMP 활성자: 예시적인 BMP 신호전달 경로 활성자는 BMP2, BMP4, BMP7, BMP9, BMP 경로를 활성화하는 소분자, BMP 경로를 활성화하는 단백질로부터 선택될 수 있고, 이하의 것들을 포함할 수 있다: 노긴(Noggin), 도르소모르핀(Dorsomorphin), LDN189, DMH-1, 벤트로모핀(ventromophin), 및 이들의 조합.
오르가노이드 기술은 개발 중인 분야이다. 간략히, 오르가노이드는 "장기-유사 조직(organ-like tissue)", 또는 상응하는 자연적 장기와 유사한 구조적 구성을 갖는 3-차원 조직이다. 오르가노이드는 전구 세포, 예컨대 배아 줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포로부터 유래될 수 있다. 오르가노이드는 통상적으로 관심 대상의 장기 조직에 대한 배아 발생을 모방하는 일시적인 일련의 성장 인자 조작을 사용하여 시험관내에서 배양된다 - 일반적으로 전구 세포의 지정된 분화(directed differentiation)라고 지칭되는 과정. 일반적으로, 오르가노이드는 많은 경우, 기능성을 갖는 분화된 세포 타입, 예를 들어, 산을 분비할 수 있는 위벽세포(gastric parietal cell)를 함유할 수 있다. 즉, 상기 문헌에 기재된 오르가노이드는 현재 자연발생적인 장기 조직과 그 범위가 동일하지 않다. 예를 들어, 오르가노이드는 오르가노이드가 모방하도록 의도될 수 있는 원래 장기의 맥관 구조 또는 하나 이상의 다른 특징들이 결핍될 수 있다. 지금까지, 오르가노이드는 발생된 조혈계를 갖거나, 유의한 양의 면역세포를 생산한다고는 인식되지 않았다. 본 기재 내용은 당업계의 이러한 필요성들 중 하나 이상을 해결하기 위한 것이다.
상기 기재된 방법 및 시스템은 일시적인 일련의 성장 인자 조작을 사용하여 배양체에서 조직의 배아 발생을 모방하려는 목적으로 확립되었고, 면역계 세포를 발생시키기 위한 변형, 및 본원에 기재된 것들의 변화물을 포함한다.
조혈 줄기 세포 및 전구 세포
혈액 세포 생산은 단일 타입의 세포인 조혈 줄기세포로부터 유래하고, 이는 증식 및 분화를 통해 전체 조혈계를 생성한다. 조혈 줄기세포는 자가-재생을 할 수 있어서, 줄기세포의 자체 집단을 확장할 수 있다고 여겨지는데, 이들은 (조혈계에서 어떠한 세포로도 분화할 수 있는) 만능성을 갖는다. 이러한 희귀한 세포 집단으로부터, 림프계(면역계의 B 및 T 세포) 및 골수계 세포(적혈구, 거핵구, 과립구 및 대식세포)를 포함하는 성숙한 전체 조혈계가 형성된다. B 세포 및 T 세포를 포함하는 림프구 계열은, 항체의 생산, 세포성 면역계의 조절, 혈액 내 외부 물질의 탐지, 숙주에 대해 이질적인 세포의 탐지 등을 제공한다. 단핵구, 과립구, 거핵구 뿐만 아니라 다른 세포를 포함하는 골수 계열은, 이물질의 존재에 대해 모니터링하고, 신생 세포(neoplastic cell)에 대한 보호를 제공하고, 외부 물질을 제거하고(scavenge), 혈소판 등을 생산한다. 적혈구 계열은 산소 운반체로서 작용하는 적혈구를 제공한다.
상기 제시된 바와 같이, HSC의 대체에 대한 현재의 치료는 골수 이식과 관련된다. 환자의 "매칭(matching)"이 어려울 수 있으므로, 당업계에는 이러한 필요성을 해결할 조성물 및 방법에 대한 필요성이 있다. 이를 위해, 조혈 세포를 생산하는 오르가노이드 조성물, 및 조혈 세포를 생산하는 오르가노이드의 제조 방법이 본원에 개시된다.
개시된 조성물 및 방법은 조혈 세포를 생산하는데 사용될 수 있는데, 이는 조혈 세포를 투여하면 유리한 임의의 질병 상태의 치료에 사용될 수 있다. 또한, 상기 방법은 개시된 오르가노이드 조성물로부터 조혈 세포를 분리하거나, 수확하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, CRISPR기술을 사용하여 야생형 유전자를 줄기세포에 도입함으로써, 개시된 오르가노이드-유래 조혈 세포를 사용하여 치료될 수 있는 질병 상태는, 예를 들어, 유전병, 예컨대 베타-지중해 빈혈(thalassemia), 겸상 세포 빈혈, 아데노신 데아미나제 결핍(adenosine deaminase deficiency), 재조합효소(recombinase) 결핍, 재조합효소 조절 유전자 결핍을 포함한다. 본원에 개시된 오르가노이드 및/또는 조혈 세포는 특정 양태에서, 방사선 조사된 숙주 또는 화학 요법이 실시된 숙주를 재구성하는데 사용될 수 있다.
조성물
또한, 조혈 줄기세포 조성물, 예를 들어, 분화 또는 전용된(dedicated) 조혈 세포를 실질적으로 포함하지 않은 매우 농축된 조혈 줄기세포 조성물이 본원에 개시되어 있다. [실질적으로 포함하지 않는(substantially free of)]은, 10% 미만, 또는 5% 미만 또는 1% 미만의 세포가 집단에 존재한다는 것을 의미할 수 있다. 오르가노이드 조성물로부터 유래된 조혈 세포는, 실질적으로 동일한(substantially homogenous) 생존가능한 포유류 또는 인간의 조혈 세포 조성물일 수 있으며, 다양한 목적, 예를 들어, 골수 이식을 위해 생산될 수 있고, 세포가 신생 세포 또는 병원성인 다른 세포, 예를 들어, HIV-감염된 세포를 포함하지 않을 수 있고, 이를 이식할 때 이식편-대-숙주 질환(graft-versus-host disease)의 회피가 요망된다. 실질적으로 동일한(substantially homogenous)은, 조성물 중의 대부분의 세포, 예를 들어, 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 특정 상황에서는, 95% 초과의 원하는 세포 타입이 동일한 세포 타입이라는 것을 의미하는데, 상기 세포 타입은 조혈 줄기세포일 수 있다. 특정 양태에서, 조혈 세포는 상동 재조합 또는 비-상동 재조합 중 어느 하나인 적절한 재조합에 의해 변형되어, 유전적 결함을 고치거나, 줄기세포에서 원래 결핍된 유전자 능력을 개체 또는 일반적으로 줄기세포에 대해 제공한다. (즉, 당업계에 잘 알려진 CRISPR 방법들을 사용하여) 이러한 유전적으로 변형된 세포는 이를 필요로 하는 개체에 추가로 투여될 수 있다.
면역세포를 생산하는 HCO 배양체
제1 양태에서, 조혈 줄기세포(HSC) 또는 이의 파생 세포의 제조 방법이 개시된다. 상기 방법은 전장 세포가 형성될 때까지 전구 세포로부터 유래된 최종 내배엽을 wnt 신호전달 경로 활성자 및 FGF 신호전달 경로 활성자와 접촉시키는 단계; 및 상기 전장 세포를 레티노산의 부재 하에 배양하여, 조혈 세포를 생산하는 간 오르가노이드를 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 임의의 선행 단락의 전구 세포는 배아 줄기세포 및 유도 만능성 줄기세포(iPSC) 중 하나 또는 둘 다로부터 선택될 수 있다.
일 양태에서, 임의의 선행 단락의 wnt 신호전달 경로 활성자는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16, wnt 신호전달 경로의 소분자 활성자, (예를 들어 염화리튬; 2-아미노-4,6-이치환된 피리미딘(헤테로) 아릴피리미딘; IQ1; QS11; NSC668036; DCA 베타-카테닌; 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)-벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐) 피리미딘), WAY-316606; SB-216763; 또는 BIO (6-브로모인디루빈-3'-옥심)), Wnt 신호전달 경로의 siRNA 및/또는 shRNA 활성자, GSK3 억제제(예를 들어 키론/CHIR9902), 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
일 양태에서, 임의의 선행 단락의 FGF 신호전달 경로 활성자는 소분자 또는 단백질 FGF 신호전달 경로 활성자, FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF 신호전달 경로의 siRNA 및/또는 shRNA 활성자, 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
일 양태에서, 임의의 선행 단락의 경로는 간 오르가노이드를 형성하기 전에 전장 세포로부터 스페로이드를 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 전장 세포는 간 오르가노이드를 형성하기 전에 스페로이드를 형성할 수 있고, 상기 방법은 스페로이드를 파쇄하여, 스페로이드로부터 유래한 복수의 세포를 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 파쇄는 화학적 파쇄 및/또는 기계적 파쇄 중 하나 또는 둘 다를 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 일 양태에서, 파쇄는 효소, 예컨대, 단백질 분해 효소 활성 및 콜라겐 분해 효소 활성 중 하나 또는 둘 다를 갖는 효소, 예를 들어, 아큐타제(accutase), 트립신, 콜라겐 분해효소(collagenase), 히알루로니다제(hyaluronidase), DNase, 파파인, 트립제안(trypzean)(Sigma 제조), 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 효소에 의한 처리를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 임의의 선행 단락은 사이토카인의 존재 하에 전장을 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 사이토카인은 당업계에서 허용가능한 임의의 사이토카인, 예를 들어, 트랜스페린, 줄기세포 인자(SCF), 인터루킨 3(IL-3), 인터루킨 6(IL-6), 에리트로포이에틴(EPO), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF) 및 이들의 조합으로부터 선택된 사이토카인일 수 있다. 특정 양태에서, 전장은 배양되기 전에 단일 세포로부터 분리될 수 있다. 배양은, 사이토카인과 함께 특정 기간 동안, 예를 들어, 약 1일, 또는 약 2일, 또는 약 3일, 또는 약 4일, 또는 약 5일, 또는 약 6일, 또는 약 7일, 또는 약 8일, 또는 약 9일, 또는 약 10일, 또는 약 11일, 또는 약 12일, 또는 약 13일, 또는 약 14일, 또는 약 15일, 또는 약 16일, 또는 약 17일, 또는 약 18일, 또는 약 19일, 또는 약 20일, 또는 약 21 일, 또는 약 3주, 또는 약 4주, 또는 약 5주, 또는 약 6주, 또는 약 7주, 또는 약 8주 동안, 또는 약 9주 동안, 또는 약 10주, 또는 약 11주, 또는 약 12주, 또는 12주 초과 동안 수행될 수 있다.
일 양태에서, 임의의 선행 단락의 방법은 상기 간 오르가노이드, 예를 들어, 인간의 간 오르가노이드를 트롬보포이에틴(TPO: thrombopoietin) 및 줄기세포 인자(SCF) 중 하나 또는 둘 다와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있는데, 여기에서 트롬보포이에틴(TPO) 및 줄기세포 인자(SCF) 중 하나 또는 둘 다와의 접촉은 특정 기간 동안, 예를 들어, 약 1일, 또는 약 2일, 또는 약 3일, 또는 약 4일, 또는 약 5일, 또는 약 6일, 또는 약 7 일, 또는 약 8일, 또는 약 9일, 또는 약 10일, 또는 약 11일, 또는 약 12일, 또는 약 13일, 또는 약 14일, 또는 약 15 일, 또는 약 16일, 또는 약 17일, 또는 약 18일, 또는 약 19일, 또는 약 20일, 또는 약 21일, 또는 약 3주, 또는 약 4주, 또는 약 5주, 또는 약 6주, 또는 약 7주, 또는 약 8주 동안, 또는 약 9주 동안, 또는 약 10주, 또는 약 11주, 또는 약 12주, 또는 12주 초과로부터 선택된 기간 동안 수행된다.
일 양태에서, 임의의 선행 단락의 간 오르가노이드는 태아 상태, 예를 들어, 인간 전구 세포로부터 유래한 인간의 간 오르가노이드인 것으로 이해될 수 있는데, 이러한 오르가노이드는 태아 간 조직을 포함한다. 예를 들어, 일 양태에서, 간 오르가노이드는 레티노산이 처리된 인간의 간 오르가노이드에 비해, 감소된 알부민을 생산할 수 있다. 일 양태에서, 간 오르가노이드는 알파-태아단백질(AFP)을 생산한다. 일 양태에서, 간 오르가노이드는 레티노산이 처리된 간 오르가노이드에 비해, 증가된 내피 마커 CD34 및 KDR을 갖는다. 일 양태에서, 간 오르가노이드는 레티노산이 처리된 간 오르가노이드에 비해, 증가된 에리트로포이에틴(EPO) 및 헤모글로빈 감마(HBG)를 갖는다.
일 양태에서, 방법은 임의의 선행 단락의 단계들, 및 추가로 전장 세포를 기저 막 기질, 예를 들어, MatrigelTM에 현탁시키는 단계를 포함할 수 있다. 전장 세포는 간질 세포주(stromal cell line), 예를 들어, 골수 유래 간질 세포주 상에 추가로 배양될 수 있다.
제1항의 방법에서, 상기 파생 세포는 골수계 세포(예컨대 단핵구, 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 및 거핵구 내지 혈소판), 림프계 세포(예컨대, T 세포, B 세포, 및 자연 살해 세포) 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
면역세포를 생성하는 HCO 및 HCO 배양체
일 양태에서, 조혈 내피를 포함하는 인간의 결장 오르가노이드(HCO), 및 이의 제조 방법이 개시된다. 일 양태에서, 상기 기재된 HCO의 조혈 내피는 면역세포, 예를 들어, 적혈-골수계 전구체, 림프계 전구체 및 대식세포 중 하나 이상을 생산한다. 일 양태에서, 기술된 HCO의 조혈 내피는 염증유발성 사이토카인을 분비하는 대식세포를 생산한다. 기술된 HCO는 추가로 조혈 전구 세포를 포함할 수 있는데, 상기 전구 세포는 CD34+이고, 상기 CD34 전구 세포는 오르가노이드 간엽(mesenchyme) 내에 있고, 상기 조혈 전구체는 T-세포를 형성할 수 있다. 다른 양태에서, 개시된 HCO는 혈관내피 맥관(endothelial tube)을 포함할 수 있는데, 상기 혈관내피 맥관(ET)은 CD34+에 대해 양성이고, ET는 RUNX1+ 세포를 포함한다.
전구 세포, 예컨대 인간 전구 세포로부터 유래될 수 있는 결장 오르가노이드는, 면역세포를 얻는데 사용될 수 있다. 이 양태에서, 결장 오르가노이드를 배양하여 오르가노이드 배양체를 형성하는 단계; 및 상기 결장 오르가노이드 배양체로부터 하나 이상의 면역세포를 수확하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다.
이 양태에서, 결장 오르가노이드는 약 1일, 또는 약 2일, 또는 약 3일, 또는 약 4일, 또는 약 5일, 또는 약 6일, 또는 약 7일, 또는 약 8일, 또는 약 9일, 또는 약 10일, 또는 약 11일, 또는 약 12일, 또는 약 13일, 또는 약 14 일, 또는 약 15일, 또는 약 16일, 또는 약 17일, 또는 약 18일, 또는 약 19일, 또는 약 20일, 또는 약 21일, 또는 약 3주, 또는 약 4주, 또는 약 5주, 또는 약 6주, 또는 약 7주, 또는 약 8주 동안, 또는 약 9주 동안, 또는 약 10주, 또는 약 11주, 또는 약 12주, 또는 12주 초과 동안, 또는 결장 오르가노이드가 조혈 전구체/줄기세포를 생산하는 조혈 내피 및 혈관내피 맥관 중 하나 이상을 포함할 때까지 배양될 수 있다.
일 양태에서, 방법은 상기 결장 오르가노이드 배양체로부터 간엽을 분리하는 단계, 및 상기 간엽을 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 간엽 배양 단계는 약 4일 내지 3개월, 또는 약 5일 내지 2개월, 또는 약 6일 내지 약 1개월, 또는 약 7일 내지 약 21일의 기간 동안 수행될 수 있다. 추가적인 양태에서, 간엽 배양은 현탁 배양일 수 있다.
일 양태에서, 상기 결장 오르가노이드는 간엽을 포함할 수 있고, 배양 단계는 특정 기간, 예를 들어, 약 4일 내지 3개월, 또는 약 5일 내지 2개월, 또는 약 6일 내지 약 1개월, 또는 약 7일 내지 약 14일 동안 수행될 수 있다. 배양 단계는 약 1주 내지 4주, 또는 약 1주의 기간 동안 현탁 배양으로 수행되어, 간엽을 확장시킬 수 있다.
일 양태에서, 개시된 방법의 면역세포는 적혈구계, 골수계, 및 혼합 골수계 콜로니로부터 선택될 수 있다. 다른 양태에서, 면역세포는 대식세포, 호중구, 호산구, 호염기구, 적혈구, 백혈구 및 단핵구 중 하나 이상일 수 있다.
일 양태에서, 결장 오르가노이드는 상기 기재된 전구 세포로부터 유래된 최종 내배엽으로부터 유래될 수 있다. 일 양태에서, 전구 세포는 배아 줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포이다.
일 양태에서, 방법은 오르가노이드 배양체를 T-세포 유도 성장 인자와 함께 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가적 양태에서, 방법은 배양체를 파쇄하여 결장 오르가노이드를 단일 결장 오르가노이드로 분산시키고, 간엽을 배양체 내에서 파쇄하는 단계를 포함할 수 있다. 이 단계는 생성되는 파쇄된 오르가노이드 및 간엽을 약 1주 내지 약 4주, 또는 약 2주 내지 약 3주의 기간 동안 기저 막 기질(예를 들어, Matrigel)에서 배양하는 것에 의할 수 있다.
추가적 양태에서, 특정한 인간의 결장 오르가노이드 내의 결장 오르가노이드는, 질병 상태를 모델링하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 괴사성 장결장염(necrotizing enterocolitis), 매우 초기 발병(Very Early Onset) IBD30, 박테리아 병원체(예컨대, 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile))의 감염, 바이러스 병원체(예컨대, 태아의 장 대식세포에 쉽게 감염되는 HIV)의 감염으로부터 선택된 질병 상태를 모델링하기 위한 방법이 개시되어 있다. 이 양태에서, 상기 방법은 결장 오르가노이드, 예를 들어 인간의 결장 오르가노이드에서 질병 상태를 발병시킬 수 있는 단계를 포함할 수 있는데, 이는 본원에 개시된 방법에 따라 이루어졌다.
일 양태에서, 조혈 줄기세포(HSC)를 생산할 수 있는 HCO 또는 HIO의 제조 방법이 개시되는데, 상기 방법은 중장/후장 스페로이드를 생산하기에 충분한 기간 동안 전구 세포로부터 유래된 최종 내배엽을 하나 이상의 인자와 접촉시키는 단계, 선택적으로 상기 중장/후장 스페로이드를 기저 막 기질에 포매시키는 단계, 및 앞쪽 전장 스페로이드를 생산하기에 충분한 양 및 기간 동안 상기 DE를 FGF, CHIR, 노긴 및 SMAD 억제제를 포함하는 인자들의 조합과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있고; 상기 중장/후장 스페로이드 또는 앞쪽 전장 스페로이드는 HSC를 생산한다.
추가적인 양태에서, 면역세포가 필요한 개체를 치료하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 조혈 줄기세포(HSC) 또는 파생 세포를 임의의 선행 단락에 의한 HCO 또는 HLO로부터 수확하는 단계; 및 상기 HSC 또는 파생 세포를 이것이 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 투여는 상기 HSC를 개체의 골수에 이식하는 것을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 치료는 빈혈(재생불량성 빈혈, 판코니 빈혈 포함), 면역 결핍, 암(예컨대 림프종, 백혈병, 암종, 고형 종양), 조혈의 유전적 장애, 유전성 저장 질환, 중증 지중해 빈혈, 겸상 세포 질환, 골다공증, 또는 이들의 조합의 치료일 수 있다.
전구 세포
일부 양태에서, 만능성이거나, 만능성이 되도록 유도될 수 있는 줄기세포가 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 만능 줄기세포는 배아 줄기세포로부터 유래하는데, 이는 다음으로 초기 포유류 배아의 전능성 세포로부터 유래하며, 시험관 내에서 비제한되고 비분화된 증식을 할 수 있다. 배아 줄기세포는 초기-단계 배아인 배반포의 내세포괴로부터 유래된 만능 줄기세포이다. 배아세포로부터 배아 줄기세포를 유도하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 3개의 세포주(H1, H13, 및 H14)는 정상적인 XY 핵형을 갖고, 2개의 세포주(H7 및 H9)는 정상적인 XX 핵형을 갖는다. 인간 배아 줄기세포 H9(H9-hESC)가 본 출원에 기재된 예시적인 양태들에 사용되나, 당업계의 숙련자는 본원에 기재된 방법 및 시스템이 어떠한 줄기세포에도 적용될 수 있다는 점을 이해할 것이다. 본 발명에 따른 양태에 사용될 수 있는 추가적인 줄기세포는, 국립 줄기세포 은행(NSCB), 샌프란시스코 소재의 캘리포니아 대학 인간 배아 줄기세포 연구 센터(UCSF); Wi 세포 연구소의 WISC 세포 은행; 위스콘신 대학 줄기세포 및 재생 의학 센터(UW-SCRMC); Novocell, Inc.(캘리포니아 샌디에고 소재); Cellartis AB(스웨덴 예테보리 소재); ES Cell International Pte Ltd(싱가포르 소재); 이스라엘 공과대학의 테크니온(Technion)(이스라엘 하이파 소재); 및 프린스톤 대학 및 펜실베니아 대학이 주도한 줄기세포 데이터베이스에 제공되거나, 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 양태에 사용될 수 있는 예시적인 배아 줄기세포는, SA01(SA001); SA02(SA002); ES01(HES-1); ES02(HES-2); ES03(HES-3); ES04(HES-4); ES05(HES-5); ES06(HES-6); BG01(BGN-01); BG02(BGN-02); BG03(BGN-03); TE03(I3); TE04(I4); TE06(I6); UC01(HSF1); UC06(HSF6); WA01(H1); WA07(H7); WA09(H9); WA13(H13); WA14(H14)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 줄기세포는 추가적인 특성들을 포함하기 위해 추가로 변형된다. 예시적인 변형 세포주는 H1 OCT4-EGFP; H9 Cre-LoxP; H9 hNanog-pGZ; H9 hOct4-pGZ; H9 inGFPhES; 및 H9 Syn-GFP 를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 배아 줄기세포에 대한 더욱 세부 사항은 예를 들어, 문헌[Thomson et al., 1998, "Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts," Science 282 (5391):1145-1147]; 문헌[Andrews et al., 2005, "Embryonic stem (ES) cells and embryonal carcinoma (EC) cells: opposite sides of the same coin," Biochem Soc Trans 33:1526-1530]; 문헌[Martin 1980, "Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis,". Science 209 (4458):768-776]; 문헌[Evans and Kaufman, 1981, "Establishment in culture of pluripotent cells from mouse embryos," Nature 292(5819): 154-156]; 문헌[Klimanskaya et al., 2005, "Human embryonic stem cells derived without feeder cells," Lancet 365 (9471): 1636-1641]에서 찾아볼 수 있고; 상기 문헌의 각각은 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 대안적으로, 만능 줄기세포는 배아 생식 세포(EGC)로부터 유래될 수 있는데, 이는 유성 생식을 하는 유기체의 생식 세포(gamete)를 발생시키는 세포이다. EGC는 후기 배아의 생식 융기(gonadal ridge)에서 발견되는 원시 생식 세포로부터 유래되며, 배아 줄기세포의 많은 특성들을 갖는다. 배아 내의 원시 생식 세포는 줄기세포로 발달하여, 성체에서 생식 세포(정자 또는 난자)를 생성한다. 마우스 및 인간에서, 적절한 조건 하의 조직 배양으로 배아 생식 세포를 키우는 것이 가능하다. EGC 및 ESC는 둘 다 만능성이다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "ESC"는 때때로 EGC를 포함하여 넓게 사용된다.
유도 만능 줄기세포(iPSC)
일부 양태에서, iPSC는 특정 줄기세포-관련 유전자를 비-만능 세포, 예컨대 성체 섬유아세포에 형질감염시킴으로써 유도된다. 형질감염은 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스를 통해 획득될 수 있다. 형질감염된 유전자는 마스터 전사 조절자 Oct-3/4(Pouf51) 및Sox2를 포함하나, 다른 유전자가 유도의 효율을 향상시킨다고 암시된다. 3주 ~ 4주 후에, 소수의 형질감염된 세포는 만능 줄기세포와 형태적으로 생화학적으로 유사해지기 시작했고, 통상 형태 선별, 배가 시간(doubling time)을 통해, 또는 리포터 유전자 및 항생제 선별을 통해 분리된다. 본원에 사용된 iPSC는 마우스의 1세대 iPSC, 2세대 iPSC, 및 인간의 유도 만능 줄기세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 비-바이러스 기반 기술은 iPSC를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 일부 양태에서, 아데노바이러스는 마우스의 피부 및 간 세포의 DNA에 필수적인 4개의 유전자를 전달하는데 사용되어, 배아 줄기세포와 동일한 세포를 발생시킬 수 있다. 아데노바이러스는 이들 자신의 유전자 중 어느 것도 표적화 숙주와 결합시키지 않기 때문에, 종양 생성의 위험이 없다. 일부 양태에서, 재프로그래밍은 어떠한 바이러스 형질감염 시스템도 없이 플라스미드를 통해 달성될 수 있지만, 효율성이 매우 낮다. 다른 양태에서는, iPSC를 생성하는데 단백질의 직접 전달이 사용되어, 바이러스 또는 유전자 변형의 필요성을 없앤다. 일부 실시 형태에서, 마우스 iPSC의 생성은 유사한 방법을 사용하여 가능한데: 폴리-아르기닌 앵커를 통하여 세포에 보내지는 특정 단백질을 세포에 반복 처리하는 것으로, 만능성을 유도하기에 충분하다. 일부 양태에서, 만능 유도 유전자의 발현은 또한 저 산소 조건 하에서 체세포에 FGF2를 처리함으로써 증가될 수 있다. 배아 줄기세포에 대한 더욱 세부 사항은 예를 들어, 문헌[Kaji et al., 2009, "Virus free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors," Nature 458:771-775]; 문헌[Woltjen et al., 2009, "piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells," Nature 458:766-770]; 문헌[Okita et al., 2008, "Generation of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors," Science 322(5903):949-953]; 문헌[Stadtfeld et al., 2008, "Induced Pluripotent Stem Cells Generated without Viral Integration," Science 322(5903):945-949]; 및 문헌[Zhou et al., 2009, "Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins," Cell Stem Cell 4(5):381-384]에서 찾아볼 수 있고; 상기 문헌의 각각은 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 일부 양태에서, 예시적인 iPS 세포주는 iPS-DF19-9; iPS-DF19-9; iPS-DF4-3; iPS-DF6-9; iPS(포피); iPS(IMR90); 및 iPS(IMR90)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
최종 내배엽. 본원에 기재된 스페로이드, 오르가노이드 및/또는 조직은, 최종 내배엽(DE: definitive endoderm)이라고 불리는 세포의 단순한 시트로부터 유래될 수 있다. 전구 세포로부터 최종 내배엽을 유도하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있는데, 문헌[D'Armour et al. 2005] 및 문헌[Spence et al.]에서 교시한 바와 같다. 만능 세포(예를 들어, iPSC 또는 ESC)로부터 최종 내배엽을 생산하는 임의의 방법은 본원에 기재된 방법에 응용될 수 있다. 일부 양태에서, 만능 세포는 상실배(morula)로부터 유래된다. 일부 양태에서, 만능 줄기세포는 줄기세포이다. 이들 방법에 사용되는 줄기세포는 배아 줄기세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 배아 줄기세포는 배아 내세포괴 또는 배아 생식 융기로부터 유래될 수 있다. 배아 줄기세포 또는 생식 세포는 인간을 포함한 다양한 포유류 종을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 동물 종으로부터 유래될 수 있다. 일부 양태에서, 인간 배아 줄기세포는 최종 내배엽을 생산하는데 사용된다. 일부 양태에서, 인간 배아 생식 세포는 최종 내배엽을 생산하는데 사용된다. 일부 양태에서, iPSC는 최종 내배엽을 생산하는데 사용된다. 일부 양태에서, 하나 이상의 성장 인자는 만능 줄기세포로부터 DE 세포로의 분화 과정에 사용된다. 분화 과정에 사용된 하나 이상의 성장 인자는 TGF-베타 슈퍼패밀리의 성장 인자를 포함할 수 있다. 이러한 양태에서, 하나 이상의 성장 인자는 노달(Nodal)/액티빈(Activin) 및/또는 성장 인자 TGF-베타 슈퍼패밀리의 BMP 하위 그룹을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 하나 이상의 성장 인자는 노달, 액티빈 A, 액티빈 B, BMP4, Wnt3a 또는 임의의 이들 성장 인자들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 배아 줄기세포 또는 생식 세포 및 iPSC는 6시간 이상; 12시간 이상; 18시간 이상; 24시간 이상; 36시간 이상; 48시간 이상; 60시간 이상; 72시간 이상; 84시간 이상; 96시간 이상; 120시간 이상; 150시간 이상; 180시간 이상; 또는 240시간 이상 동안 하나 이상의 성장 인자로 처리되었다. 일부 양태에서, 배아 줄기세포 또는 생식 세포 및 iPSC는 10 ng/ml 이상; 20 ng/ml 이상; 50 ng/ml 이상; 75 ng/ml 이상; 100 ng/ml 이상; 120 ng/ml 이상; 150 ng/ml 이상; 200 ng/ml 이상; 500 ng/ml 이상; 1,000 ng/ml 이상; 1,200 ng/ml 이상; 1,500 ng/ml 이상; 2,000 ng/ml 이상; 5,000 ng/ml 이상; 7,000 ng/ml 이상; 10,000 ng/ml 이상; 또는 15,000 ng/ml 이상의 농도로 하나 이상의 성장 인자로 처리되었다. 일부 양태에서, 성장 인자의 농도는 전체 치료 기간 동안 일정한 수준으로 유지된다. 다른 양태에서, 성장 인자의 농도는 치료의 경과 기간 동안 변화한다. 일부 양태에서, 성장 인자는 소 태아 혈청(fetal bovine serine)(FBS)을 변화하는 HyClone 농도로 포함하는 배지에 현탁된다. 당업계의 숙련자는 본원에 기재된 요법이 단독으로 또는 조합하여 임의의 알려진 성장 인자에 적용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 둘 이상의 성장 인자들이 사용될 때, 각 성장 인자의 농도는 독립적으로 달라질 수 있다. 일부 양태에서, 최종 내배엽 세포에 풍부한 세포의 집단이 사용된다. 일부 양태에서, 최종 내배엽 세포는 분리되거나, 실질적으로 정제된다. 일부 양태에서, 분리되거나, 실질적으로 정제된 최종 내배엽 세포는 OCT4, AFP, TM, SPARC 및/또는 SOX7 마커보다 더 큰 정도로 SOX17, FOXA2, 및/또는 CXRC4 마커를 발현한다. 최종 내배엽을 갖는 세포 집단을 농축하는(enriching) 방법도 또한 고려된다. 일부 양태에서, 최종 내배엽 세포는 혼합된 세포 집단의 다른 세포의 표면에는 존재하지 않으나 최종 내배엽 세포에는 존재하는 분자에 결합하는 시약과 상기 세포를 접촉시킨 후, 상기 시약에 결합된 상기 세포를 분리함으로써, 혼합된 세포 집단으로부터 분리되거나, 실질적으로 정제될 수 있다. 특정 양태에서, 최종 내배엽 세포의 표면 상에 존재하는 세포 구성요소는 CXCR4이다. 본 발명에서 사용할 수 있는 DE 세포를 얻거나 새로 생성할 수 있는 추가적인 방법은, D'Amour et al.에 부여된 미국 특허 제7,510,876호; Fisk et al.에 부여된 미국 특허 제7,326,572호; 문헌[Kubo1 et al., 2004, "Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture," Development 131:1651-1662]; 문헌[D'Amour et al., 2005, "Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm," Nature Biotechnology 23:1534-1541]; 및 문헌[Ang et al., 1993, "The formation and maintenance of the definitive endoderm lineage in the mouse: involvement of HNF3/forkhead proteins," Development 119:1301-1315]에 기재된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않고; 상기 문헌 각각은 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 일부 양태에서, 용해성 FGF 및 Wnt 리간드를 사용하여 배양체에서 초기 후장 특화(specification)를 모방하고, iPSC 또는 ESC로부터 발생한 DE를 지정 분화를 통해 후장 상피로 전환시키는데, 이는 모든 주요 장 세포 타입을 효율적으로 발생시킨다. 인간에서, DE의 지정된 분화는 장 발생에 중요한 특정 신호전달 경로를 선택적으로 활성화함으로써 달성된다. 당업계의 숙련자들은, 임의의 FGF 리간드에 의해 임의의 Wnt 신호전달 단백질의 발현을 변화시킴으로써, 상기 기재된 지정된 분화를 발생시킬 수 있다는 사실을 이해할 것이다. 일부 양태에서, DE 배양체에는 본원에 기재된 신호전달 경로의 하나 이상의 조절자가 6시간 이상; 12시간 이상; 18시간 이상; 24시간 이상; 36시간 이상; 48시간 이상; 60시간 이상; 72시간 이상; 84시간 이상; 96시간 이상; 120시간 이상; 150시간 이상; 180시간 이상; 200시간 이상, 240시간 이상; 270시간 이상; 300시간 이상; 350시간 이상; 400시간 이상; 500시간 이상; 600시간 이상; 700시간 이상; 800시간 이상; 900시간 이상; 1,000시간 이상; 1,200시간 이상; 또는 1,500시간 이상 동안 처리된다.
일부 양태에서, DE 배양체에는 10 ng/ml 이상; 20 ng/ml 이상; 50 ng/ml 이상; 75 ng/ml 이상; 100 ng/ml 이상; 120 ng/ml 이상; 150 ng/ml 이상; 200 ng/ml 이상; 500 ng/ml 이상; 1,000 ng/ml 이상; 1,200 ng/ml 이상; 1,500 ng/ml 이상; 2,000 ng/ml 이상; 5,000 ng/ml 이상; 7,000 ng/ml 이상; 10,000 ng/ml 이상; 또는 15,000 ng/ml 이상의 농도로 본원에 기재된 신호전달 경로의 하나 이상의 조절자가 처리될 수 있다. 일부 양태에서, 신호전달 분자의 농도는 전체 처리 동안 일정하게 유지된다. 다른 양태에서, 신호전달 경로 조절자의 농도는 처리의 경과 동안 달라진다. 일부 양태에서, 본 발명에 따른 신호전달 분자는 DMEM 및 소태아 혈청(FBS)을 포함하는 배지에 현탁된다. FBS는 2% 이상; 5% 이상; 10% 이상; 15% 이상; 20% 이상; 30% 이상; 또는 50% 이상의 농도일 수 있다. 당업계의 숙련자는 본원에 기재된 요법을 단독으로 또는 조합하여 본원에 기재된 신호전달 경로의 임의의 알려진 조절자(Wnt 및 FGF 신호전달 경로의 임의의 분자 포함하나 제한되지 않음)에 적용할 수 있다는 점을 이해할 것이다.
둘 이상의 신호전달 분자를 사용하여 DE 배양체에 처리하는 양태에서, 신호전달 분자는 동시에 또는 별도로 첨가될 수 있다. 둘 이상의 분자가 사용될 때, 각각의 농도는 독립적으로 달라질 수 있다.
실시예
이하의 비-제한적인 실시예들은 본원에 개시된 본 발명의 실시 형태를 예시하기 위해 추가로 제공된다. 당업계의 숙련자들은 본 실시예에 개시된 이하의 기술들이 본 발명을 실시할 때 기능을 잘 발휘한다고 밝혀진 접근법을 나타내며, 따라서 이의 실시 모드의 실시예를 구성한다고 간주될 수 있다는 점을 인지해야 한다. 그러나, 당업계의 숙련자는 본 기재 내용을 고려하여 개시된 특정 실시 형태에서 많은 변화가 이루어질 수 있고, 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않고도 여전히 동일 또는 유사한 결과를 얻을 수 있다는 점을 인식해야 한다.
인간 만능 줄기세포-유래 결장 오르가노이드 배양체에서의 기능성 면역세포의 확립
최종 조혈 전구 세포는 배아 결장에 밀접하게 근접하여 발생하는 조혈 내피로부터 유래한다. 본원에서, 본 출원인은 골수계 및 림프계 파생체를 형성할 수 있는 조혈 내피 및 조혈 전구체를 공동-발생시키는 인간의 만능 줄기세포-유래 결장 오르가노이드 배양체를 조작하였다. BMP 신호전달은 후장 간엽을 생성하는데 사용될 수 있는데, 이는 조혈 내피를 형성할 수 있고, RUNX1-발현 조혈 전구체를 생성한다. 배양 3주까지 다양한 종류의 골수계 세포 타입 및 림프계 세포가 존재한다. 대식세포는 시험관내 배양에서 확장된 후, 발생 중인 간엽 HCO 내에 유지될 수 있다. HCO의 이식 및 3개월의 생체내 성장 이후, PSC-유래 인간 대식세포는 결장 상피와 밀접한 연관성을 확립하고, 숙주-유래 대식세포로 대체되지 않았다. HCO-관련 대식세포는 기능성을 갖고, 염증성 사이토카인의 생산에 의해 LPS 및 병원성 박테리아 둘 다에 반응하여, 상피를 통과하여 이동하고, 박테리아를 식세포 작용으로 삼키며, 조직 상주성 대식세포의 모든 특성들을 갖는다. 배아에서와 마찬가지로, 본 출원인이 조작한 인간의 후장/결장 오르가노이드 배양체는 골수 및 림프 계열(발생 중인 인간 결장에서 장기간 거주하도록 확립된 대식세포 포함)을 발생시키는 조혈 내피의 형성을 지원한다.
성체 장관에 증식하는 다양한 종류의 면역세포들이 있다. 이들은 골수계 및 림프계 세포 타입을 둘 다 포함하는데, 상기 세포 타입은 상피 및 ENS와 상호 협조하여 장벽 기능을 유지하고, 미생물 군질과 소통하고, 보조 항원과 유해 항원을 구분한다. 대부분의 장 질환, 특히 염증성 장 질환(IBD)은 면역계와 관계가 있다. 이는 소화관의 모든 면역세포가 골수-유래 조혈 줄기세포(HSC)로부터 유래한다는 도그마(Dogma)를 갖는다. 그러나, 동물 연구에서 나온 많은 증거들은 배아 발생 동안 일부 장기들이 공동-발생하는 조직 상주성 대식세포들의 집단을 함유한다는 결론을 뒷받침한다1-3. 최근, 결장이 배아 전구체 및 성체 HSC 둘 다로부터 유래하는, 안정되고 자가-유지되는 대식세포의 집단이 함유한다는 사실이 밝혀졌다4.
조혈 세포는 3개 부위로부터 발생한다. 원시 조혈 세포는 낭배기(gastrulation) 동안 발생하여, 난황낭(yolk sac)으로 이동하고, 짧게 생존한다5. 최종 조혈 전구체(HPC)는 난황낭, 또는 발생 중인 결장에 인접한 배아의 대동맥-생식샘-중신(AGM: aorta-gonado-mesonephros) 부위 내의 조혈 내피로부터 유래한다. 원시 조혈 세포의 하나의 확실한 특징은, 이들이 제한된 분화 잠재성을 가지며, 림프계 잠재성은 갖지 않는다는 점이다. AGM 부위로부터 유래하는 배아내 HPC는 Runx1 및 Tek와 같은 마커를 발현하고, 대동맥의 내피 및 후장에 인접한 주위 혈관으로부터 나타난다6. 배아의 이러한 뒷쪽 부위의 발생에는 BMP 신호전달이 필요하다7-10. 추가로, BMP 신호전달은 조혈 내피 형성에 요구되는 GATA2 전사 인자의 발현을 조절한다11.
본 출원인은 이전에 인간 만능 줄기세포의 지정 분화를 통해 인간의 결장 오르가노이드(HCO)를 조작해낸 적이 있었다10. 이러한 HCO는 결장 상피와 섬유아세포, 근섬유아세포 및 평활근 세포를 포함하는 주변 간엽 파생체를 둘 다 포함한다. HCO 분화 단계 동안 발생한 전사의 변화에 대한 생물정보학적 분석에서, 조혈계 발생과 연관된 유전자가 놀랍도록 풍부하다는 사실이 밝혀졌다. 도 10에 나타난 바와 같은 HCO 내부에 존재하는 세포 타입의 정도를 확인하기 위해 배양체를 가공하는 방법이 본원에 개시된다.
조혈 전구체는 꼬리-측면(caudal-lateral) 중배엽으로부터 발생한다. 꼬리-측면 중배엽이 특정되는지를 결정하기 위해, 본 출원인은 앞쪽 및 뒷쪽으로 발현된 HOX 유전자의 발현을 조사하였다. 이전의 발견과 일관되게, 뒷쪽의 hox 유전자는 BMP 처리에 의해 유의하게 상향 조절되었다(도 11, 패널 d). 게다가, EHT12를 억제하는 HOXA3을 포함한 앞쪽 hox 인자는, HIO에 비해 HCO에서 하향 조절되었다. 후장 및 결장 운명의 형성이 BMP 신호전달의 일시적인 활성화에 의해 유도될 때(BMP2 처리는 프로토콜의 7일 내지 10일 사이에 발생한다), GATA2, KDR/FLK1을 포함하는 혈맥관(hematovascular) 마커, 뿐만 아니라 범-내피 마커 CD34 및 VEGFR1의 발현은, 마우스 배아의 발생 중인 후장에서 관찰된 것과 유사하게 나타난다(도 11)
HCO 배양체 내의 면역세포의 존재는 이들 세포가 원시적인 것인지, 아니면 조혈 내피로부터 유래하는지에 대한 의문을 일으킨다. 원시 조혈 전구체를 나타내는 GYPA(CD235)의 발현(도 11f)은 관찰되지 않는데13, 이는 조혈 세포의 공급원이 조혈 내피였다는 것을 나타낸다. RUNX1-발현 조혈 전구체는 e10.5 마우스 배아에서 AGM 부위의 내피로부터 발생한 것으로 볼 수 있다(도 4a ~ 도 4c). 유사하게, HCO 배양체는 관련 RUNX1+ 세포의 무리를 갖는 CD34+ 혈관내피 맥관을 가졌다(도 4d ~ 도 4g). 조혈 내피는 추가로 CD73 발현의 결핍에 의해 비-조혈 내피와 구별될 수 있다14. 21-일차 HCO 배양체를 유세포 분석으로 분석하면, CD34+/CD73- 내피 세포의 존재가 나타나는데, 이는 조혈 내피의 존재를 암시한다(도 4h). 배양 21일까지, HCO의 전사 특성은, HIO에 비해, 면역세포 및 이들의 기능과 관련된 경로 용어(pathway terms)라는 점이 밝혀졌다. 이들은 호중구 탈과립화, 선천성 면역계, 혈소판 활성화 및 백혈구 내피 투과성 이동을 포함한다. 면역형광 염색에 의해 21-일차 HCO 배양체를 분석(IF)하여, 장 오르가노이드는 아닌 결장 오르가노이드의 간엽 내에 포매된 PU.1+ 세포 및 CD34+ 혈관내피 맥관의 존재를 확인하였다(도 12). 22-일 HCO 배양체의 명시야 생체 이미지(Brightfield live imaging)는 혈관내피 맥관 내의 난치 세포(refractory cell) 이동을 나타내는데, 이는 간엽 내와 배지 중의 자유-유영하는 것들 둘 다에서 발견될 수 있다. 이 데이터들을 종합하면, HCO 배양체가 조혈 세포를 생성할 수 있는 조혈 내피를 함유한다는 것을 암시한다.
HCO 배양 내의 세포 타입을 결정하기 위해, 배지에서 샘플을 채취하고, 사이토스핀(cytospin) 및 김사 염색을 실시하여, 대식세포, 호중구, 호산구, 및 호염기구를 닮은 세포들을 식별하였다(도 5a). 외인성 인자 또는 마우스 골수 간질 세포는 배양체에 첨가되지 않았는데, 이는 HCO 내의 간엽 세포 타입이 골수 세포 타입의 분화를 지원할 수 있다는 것을 암시한다. HCO에 의해 생산되는 적혈골수계 전구체(erythromyeloid pregenitor)가 있는지를 결정하기 위해, MethocultTM 어세이를 실시하였다. HIO가 아닌 HCO 배양체는, 적혈구계, 골수계 및 혼합 골수계 콜로니를 생성할 수 있는 전구체를 함유한다(도 5b). 인간 배아 및 유도 만능 줄기세포주로부터의 HCO는, 적혈골수계 파생체를 생성할 수 있는데, 이는 이 방법이 전체 PSC 세포주에 대해 확고하다는 것을 입증한다. HCO로부터 생성된 적혈구는 태아(HBG1 및2) 및 태아/성체(HBA1, HBA2) 헤모글로빈을 발현하나, 상당한 수준의 배아 헤모글로빈(HBE1, HBZ)은 발현하지 않는데, 이는 HCO 배양체가 최종 적혈골수계 전구체를 함유한다는 것을 암시한다.
Figure pct00001
배아내 최종 조혈 세포의 특징 중 하나는, T 세포와 같은 림프계 세포 타입을 형성하는 능력이다13,15. 림프계 잠재성을 갖는 조혈 전구체가 배아 발생의 후기 단계에 나타나는 점을 고려하여, 본 출원인은 이들 전구체가 HCO 간엽의 장기 배양 이후에 나타날 것이라는 사실을 받아들였다. 따라서, 본 출원인은 무손상 조혈 혈관 내피 맥관을 더욱 장기간 유지시키는 배양 방법을 개발하였다(도 10c). HCO 배양체를 추가 1주 동안 키워서, 간엽을 확장시켰고, 이를 플레이트로부터 긁어내어, 최대 추가 3 주 동안 현탁 배양체에서 키웠다. 림프계 잠재성을 시험하기 위해, T-세포 유도 성장 인자 IL7 및 FLT3를 첨가하였다. T-세포 유도가 없는 경우, HCO 배양체는 0.2% CD3+/CD4+ 세포를 함유하였다. T-세포 유도 성장 인자를 첨가하면, T-세포의 수가 4-배 증가하였다(도 5e). T 세포 잠재성의 존재는 HCO 배양체로부터 형성된 조혈 세포가 최종적이라는 결론을 추가로 뒷받침한다.
최종 조혈 세포(definitive hematopoiesis)는 발생 동안 태아의 간 및 이후 골수를 포함하는 다른 장기로 이동하나, 조직 상주성 대식세포는 발생 초기에 장기에서 군집을 이루고, 출생시까지 지속할 수 있다. 일부 장기, 예컨대 폐 및 간에서, 배아 대식세포는 전 생애 동안 지속된다5. 다른 장기에서, 출생 후 골수 내의 HSC가 배아 대식세포를 대신하는 대식세포를 발생시킨다. 결장에서, 일부 데이터는 배아 대식세포가 HSC-유래 대식세포로 대체된다는 것을 암시한다16,17. 그러나, 최근 배아 대식세포의 계열 추적은 이들이 HSC-유래 대식세포와 함께 출생 후에 지속된다는 것을 암시한다. 21일차에 분쇄에 의해 결장 오르가노이드를 계대하여, 간엽을 파쇄하고 개별 HCO를 분산시켰다. 이후, HCO를 Matrigel에 재도말하고, 추가 14일 동안 배양하였다. 유전자 온톨로지 분석에 의해 전사 특성을 평가할 때, 백혈구, 호중구를 포함하는 골수 세포 타입과 관련된 GO 용어(terms), 뿐만 아니라 방어 및 염증 반응이 풍부하게 관찰되었다.
Figure pct00002
35일차 HCO를 면역염색하여, 대식세포가 마커 CD68 및 HAM56(데이터 표시 안됨) 뿐만 아니라 조직 상주성 대식세포 마커 CD163를 발현한다는 점을 밝혔다(도 12)18,19. CD163은 폐포 대식세포, 간의 쿠퍼(Kupffer) 세포 및 태반의 호프바우어(Hofbauer) 세포를 포함한 몇몇 조직 상주성 대식세포 집단에서 발현된다20-22. 염증성 대식세포의 존재는, 염증성 대식세포의 알려진 마커인 CD163 및 iNOS를 공동-염색함으로써 조사하였다(도 7). 흥미롭게도, 대부분의 CD163+ 대식세포는 또한 iNOS에 대해서도 양성이었는데, 이는 이 세포들이 염증성임을 암시한다. 이 데이터들을 종합하면, HCO는 조직 상주성 및 염증성 대식세포 마커들을 공동-발현하는 공동-발생 대식세포를 함유한다는 것을 암시한다.
인간의 장에는 다수의 대식세포 유형이 증식하고 있다. HCO 내의 대식세포의 이종성(heterogeneous) 여부를 결정하기 위해, CYTOF를 사용하는 세포 표면 마커의 발현을 평가하였다. CYTOF 분석으로, CD11bhi 집단, CD14-/CD16+ 집단, CD14+/CD16+ 집단 및 CD14+/CD16-를 포함하는 적어도 4개의 상이한 단핵구 집단들의 존재를 밝혔다. 이 데이터들은 HCO 배양체가 원래의 인간 장과 유사하게 다양한 단핵구/대식세포의 세트를 생성할 수 있다는 것을 암시한다.
결장 내의 조직 상주성 대식세포는 골수 유래 단핵구(BMDM)에 의해 연속적으로 보충된다는 가설이 있었다16,17. 그러나, 최근의 연구는 그 패러다임에 도전하여, 비록 일부의 대식세포 유형이 BMDM에 의해 연속적으로 보충되기는 하나, 다른 유형은 오래-살고 자가-유지되는 배아 공급원을 갖는다는 것을 제안하였다4,23,24. HCO 대식세포("HCOMac")가 장기간 유지될 수 있는지를 결정하기 위해, HCO를 마우스 신피막(kidney capsule)으로 이식한 후 인간 CD163+ 대식세포의 존재를 평가하였다(도 8). 본 출원인은 단기-생존하는 대식세포가 마우스 특이적인 마커 F/480을 발현하는 숙주-유래 쥐과의 대식세포에 의해 대체될 것이라는 가설을 세웠다. 단지 몇몇 hCD163+ 세포만이 대조군에서 검출되었으나, NOG HIO 이식체에서는 검출되지 않았고, F/480+ 대식세포는 융모(villi)의 최상부까지 모든 간엽층에 침투하였다(도 5). 반대로, hCD163 대식세포는 심지어 이식한지 12주 후에도, HCO에서 용이하게 검출되었다. 이들 대식세포는 대부분 F/480+ 대식세포의 침윤이 결핍된 점막 고유층(lamina propia)에 위치한다. 근육층(muscularis layer)에서, hCD163+ 세포는 F/480+가 산재되어 있는데, 이는 숙주 대식세포가 이들 조직층에서 집락화한다는 것을 암시한다. HCO 이식된 마우스 유래의 혈액 및 골수를 조사하였더니 인간 유래 세포의 결핍이 밝혀졌는데, 이는 hCD163 대식세포가 HCO 내에 자가-유지되었고, 골수에 집락화한 인간 세포에 의해 보충되지 않았음을 암시한다(도 14). 이들 데이터는 HCO가 BMDM과는 독립적으로 자가-유지 대식세포를 생성한다는 것을 암시한다.
35-일차 HCO로부터의 RNAseq 데이터의 평가로, HIO에 비해 염증 징후를 나타내었다. HCO가 정말로 기능성 염증을 나타내는지를 확인하기 위해, 루미넥스 다중 ELISA를 사용하여 염증유발성 사이토카인이 HCO의 배지로 분비되는지 조사하였다(도 13). 상피 세포에서 시험관내에서 IL1B, IL6 및 IL8 모두가 발현하는 것으로 보고되었고, 이는 상피 세포가 HCO에 나타난 염증 징후에 기여할 수 있다는 것을 암시한다. 대식세포가 염증성이라는 것을 보장하기 위해, 대식세포 염증성 단백질 1A(MIP1A) 및 1B(MIP1B)의 분비를 평가하였다. HCO는 유의하게 더 높은 수준의 MIP1A 및 MIP1B를 분비하였는데, 이는 HCO 내의 대식세포가 기저 수준의 염증을 나타낸다는 것을 암시한다.
성체 결장 대식세포는 통상적으로 그램-음성 박테리아 세포벽 성분인 지질다당류(LPS)에 의한 자극에 내성을 갖는다25. 반대로, 태아 대식세포는 LPS 자극에 반응을 보이는데, 이는 출생 후에 수용성(tolerance)이 달성된다는 것을 암시한다26. HCO 내의 대식세포가 LPS 자극에 민감한 지를 결정하기 위해, HCO에 LPS를 처리하고, 세포 이동성 및 염증성 사이토카인의 분비를 평가하였다. 생체 이미지에서는 대식세포가 LPS에 반응하여 이들의 이동성을 증가시켰으며, 이들은 오르가노이드 내에서 초점에 대한 주화성을 가질 수 있다고 나타났다(도 8a). 사이토카인 분비의 평가에서 IL6, IL8, MIP1A, MIP1B 및 TNFA가 유의하게 증가한 것으로 나타났고, 이는 사이토카인 생산이 대식세포 이동의 유발자일 가능성이 높다는 것을 암시한다(도 8b ~ 도 8e).
LPS에 의한 HCO의 직접 자극은, 오르가노이드 내의 대식세포가 사이토카인 및 박테리아 인자에 반응할 수 있다는 것을 암시한다. 대식세포는 박테리아를 식세포 작용으로 삼킴으로서 선천성 면역에 직접적인 역할을 한다. HCO 대식세포("HCOmac")가 박테리아를 식세포 작용으로 삼킬 수 있는지를 결정하기 위해, HCO에 pH 민감성 형광단으로 표지한 E. coli 입자를 처리하였다. 생체 이미지에서는 HCOMac가 계속적으로 사상위족(filopodia)을 연장하여, 미세 환경을 조사하는 것으로 나타났다. pH 민감성 형광의 증가에서 명백히 나타난 바와 같이, HCOMac는 산성 파고리소좀(phagolysosome) 내에서 박테리아 입자를 식세포 작용으로 삼킨다(도 8f ~ 도 8g). 추가로, 살아있는 공생 E. coli 및 EHEC의 미세주입은, 살모넬라(Salmonella)에 감염된 마우스에서 관찰되었던 것과 유사하게 대식세포가 HCO의 내강으로 누출(transmigration)되도록 유도한다(도 9a ~ 도 9f)27. 추가로, 박테리아를 HCO의 내강으로 도입하면, 박테리아에 의한 점액의 분해 가능성 때문에 MUC2 염색이 감소한다(도 9g). 본 발명자들의 데이터를 종합하면, HCOMac가 박테리아 입자 및 살아있는 박테리아에 반응할 수 있는 기능성의 상주성-유사 대식세포라는 사실을 암시한다.
포유류 후장 및 대동맥-생식샘-중신 부위의 발생은, 서로 밀접히 근접하여 발생한다. BMP 신호전달은 후장 내배엽 및 간엽에서 뒷쪽 HOX 패턴을 활성화할 뿐만 아니라, 조혈 내피 전사 인자 GATA2의 발현도 활성화하는 것으로 나타났다. HCO를 생성하기 위해 이전에 설명된 방법을 사용하여, BMP 신호전달은 또한 최종 조혈 잠재성을 갖는 조혈 내피로 특화시킨다. 이는 최종 조혈 전구체가 복부의 뒷쪽 중배엽으로부터 형성되는 정상적인 인간의 발생과 일관된다. 따라서, 상기 기재된 HCO 배양체는 초기에 생각한 것보다 배아의 뒷쪽 더 큰 부분을 면밀히 모방한다고 여겨진다.
HCO 배양체로부터의 조혈 전구체는, 심지어 조혈 성장 인자 및 마우스 유래 골수 간질 세포(OP9-DLL4 세포)가 없는 경우에도 적혈-골수계 및 림프계 잠재성을 갖는다. 이는 HCO 배양체에서 공동-발생하는 중배엽이, 이들 신호 및 세포 타입의 결핍을 보충한다는 것을 암시한다. 흥미롭게도, 조혈 성장 인자는 HIO 배양체에서 발현되는데, 이는 이들 인자를 발현하는 세포의 발생이 BMP 신호전달에 의존하지 않는다는 사실을 암시한다. 이들 세포 타입은, 쥐과 유래여서 인간 조혈 전구체에 면역원성 특성들을 부여할 가능성이 높은 OP9-DLL4 세포를 사용하는데 대한 대안일 수 있다28,29. 추가로, 최근 연구에서 대식 세포의 하부 세트가 장 내에서 자가-유지되는 것으로 나타났기 때문에, 이들 세포 타입도 또한 정상적인 장 조직에 존재할 수 있다4.
HCO 내의 공동-발생하는 대식세포의 존재는, 선천성 면역세포와 결장 상피 간의 상호 작용을 조사하기 위한 새로운 수단을 제공한다. 추가로, HCO는 조직 상주성 대식세포를 유지하게 하는 틈새 인자(niche factor)를 결정하는데 사용될 수 있다. HCO는 염증 질환, 예컨대 괴사성 장결장염, 매우 초기 발병 IBD30, 박테리아 병원체, 예컨대 클로스트리디움 디피실레 및 태아 장 대식세포에 용이하게 감염되는 HIV 와 같은 바이러스 병원체의 모델링을 가능하게 할 것이다31. 추가로, 다른 면역세포 타입의 포함은 다른 선천성 면역 메커니즘, 예컨대 호중구 유발 염증성 저산소증을 연구하는데 사용될 수 있다32.
방법
DE 유도. 인간 ES 및 iPS 세포를, 단일 세포로서 Matrigel(BD Biosciences)-코팅된 24-웰 플레이트 내의 mTesR1 배지 플러스 ROCK 억제제 Y27632(10 μM; Stemgent)에 웰당 150,000개 세포로 도말하였다. 그 다음날부터 시작해서, 3일 동안 세포에 0%, 0.2%, 및 2.0%의 증가하는 농도로 한정 소태아 혈청(dFBS; Invitrogen)을 함유하는 RPMI 1640(Invitrogen) 중 액티빈 A(100 ng ml-1; Cell Guidance System)를 처리하였다. 내배엽 패턴 형성 및 내장관(gut tube) 형태 형성. DE 유도 이후, 세포에 3일 동안 2.0% dFBS를 포함하는 RPMI 1640 중 성장 인자/길항제를 처리한다. 뒷쪽 전장 스페로이드를 생성하기 위해, DE에 4일 동안 FGF4(500 ng ml-1; R&D System), CHIR99021(3 μM; Stemgent)을 처리하였다. 3-차원 성장. 중장-후장 스페로이드를 이전에 설명된 바와 같이 Matrigel(BD Biosciences)에 포매한 후10,12, N2(Invitrogen), B27(Invitrogen), L-글루타민, 10 μM HEPES, 페니실린/스트렙토마이신, 및 EGF(100 ng ml-1; R&D System)이 보충된 Advanced DMEM/F12(Invitrogen)에서 키웠다. 근위 장 특화를 위해, 노긴(100 ng ml-1; R&D System)을 3-차원 성장의 첫번째 3일 동안 첨가하였다. 결장 특화를 위해, BMP2(100 ng ml-1; R&D System)를 3-차원 성장의 첫번째 3일 동안 첨가하였다.
면역 세포 생산이 증가한 인간 장 오르가노이드(HIO)의 생성 방법
인간 배아 줄기세포 및 유도 만능 줄기세포를 공급 장치(feeder) 없이 mTesR1 배지 중 Matrigel(BD Biosciences) 상에 유지한다. 최종 내배엽으로의 분화는 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다(문헌[D'Amour KA, et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 2005;23:1534-1541.]) 간단히, 3-일 액티빈 A(R&D System) 분화 프로토콜을 사용하였다. 세포에 연속 3일 동안 농도를 0%, 0.2%, 2%로 증가시킨 HyClone 한정 소태아 혈청(dFBS)(Thermo Scientific)을 포함한 RPMI 1640 배지(Invitrogen) 중 액티빈 A(100 ng/mL)을 처리하였다. 후장 분화를 위해, DE 세포를 최대 4일 동안 500 ng/ml FGF4 및 500 ng/ml Wnt3a(R&D System)을 갖는 2% dFBS-DMEM/F12 중에 배양한다. 성장 인자를 처리한지 2일차 내지 4일차에, 3-차원 부유 스페로이드가 형성되고, 그 후에 이전에 장 성장 및 분화를 촉진하는 것으로 나타난 3-차원 배양체로 옮긴다(문헌[Gracz AD, Ramalingam S, Magness ST. Sox9-Expression Marks a Subset of CD24-expressing Small Intestine Epithelial Stem Cells that Form Organoids in vitro. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2010;298:G590-600; 16. Sato T, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 2009;459:262-265.]) 간단히, 스페로이드를 500 ng/mL R-Spondin1(R&D System), 100 ng/mL 노긴(R&D System) 및 50 ng/mL EGF(R&D System)을 함유하는 Matrigel(BD Bioscience) 내에 포매한다. Matrigel이 굳은 후에, L-글루타민, 10 μM Hepes, N2 보충제(R&D System), B27 보충제(Invitrogen), 및 성장 인자를 함유하는 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 배지(Advanced DMEM/F12(Invitrogen)를 덧입히고, 4일마다 교체한다.
면역 세포 생산이 증가한 인간의 결장 오르가노이드 (HCO)의 생성 방법
인간 배아 줄기세포 및 유도 만능 줄기세포를 Matrigel(BD Biosciences)로 코팅된 6-웰 Nunclon 표면 플레이트(Nunc)에서 공급 장치(feeder) 불포함 조건으로 키우고, mTESR1 배지(Stem Cell Technologies)에 유지시켰다. 최종 내배엽(DE)의 유도를 위해, 인간 ES 또는 iPS 세포를 아큐타제(Invitrogen)와 함께 계대하고, Matrigel-코팅된 Nunclon 표면 24-웰 플레이트에 웰당 100,000개 세포의 밀도로 도말한다. 아큐타제 분리 세포에 대해서는, 첫날 동안 10 μM Y27632 화합물(Sigma)을 배지에 첨가하였다. 첫날 이후, 배지를 mTESR1로 바꾸고, 세포를 추가 24 시간 동안 키운다. 이후, 이전에 설명된 바와 같이(문헌[Spence et al., 2011]), 세포에 3일 동안 100 ng/mL의 액티빈 A를 처리한다. DE 유도 이후, 4일 동안 DE에 500 ng/mL FGF4(R&D) 및 3 μM 키론 99021(Tocris, WNT 경로 활성자; GSK3 억제)을 포함하는 후장 유도 배지(RPMI 1640, 2 mM L-글루타민, 2% 보체제거된(decomplemented) FBS, 페니실린-스트렙토마이신)를 처리하여, 중장-후장 스페로이드의 형성을 유도하였다. 24 웰 플레이트로부터 중장/후장 스페로이드를 모아서, 이전에 설명된 바와 같이 Matrigel(BD)에 도말하고, N2(Invitrogen), B27(Invitrogen), L-글루타민, 10 μM HEPES, 페니실린/스트렙토마이신, 및 EGF(100 ng ml-1; R&D System)가 보충된 Advanced DMEM/F12(Invitrogen)에서 키웠다. 인간의 결장 오르가노이드(HCO)를 생성하기 위해, 적어도 3일 동안 스페로이드에 100 ng/mL EGF 플러스 100 ng/mL BMP를 덧입혔다(BMP2 또는 4, R&D 또는 다른 BMP 경로 활성자도 또한 사용될 수 있음). 3일 후 배지를 갈아주되, 단지 EGF만은 모든 패턴 형성 조건을 위해 배지에 유지한다. 이후, 배지를 그로부터 주 2회 바꾸었다.
HCO 배양체로부터 인간 조혈 세포의 분리
적어도 3일(예를 들어, 9일)의 BMP 경로 활성화 이후, HCO는 KDR, FLT1 및 GATA2와 같은 마커를 발현하는 혈맥관 중배엽 세포를 함유하기 시작한다. Matrigel에서의 계속된 성장으로, CD31, CD34를 발현하는 조혈 내피를 형성하였다. 15일차 내지 20일차에, 배양체는 RUNX1를 발현하는 조혈 전구체/줄기세포를 생산하는 혈관내피 맥관을 갖는다. HCO 배양 배지를 수확한 결과, 골수계 세포(호염기구, 호중구, 호산구) 및 단핵구 및 대식세포를 포함한 넓은 범위의 분화된 조혈 세포를 확인하였다. 유세포 분석을 사용하여, 미성숙 B 및 T 세포의 마커를 발현하는 세포도 또한 관찰할 수 있었다.
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Methocult™ H4434 클래식 중의 수확된 배지로부터의 세포를 키워서, 적혈구, 과립구, 및 대식세포로 이루어진 콜로니를 생성한다. Methocult™ H4434 클래식은 이스코브(Iscove) MDM 중의 메틸셀룰로스, 소태아 혈청, 소혈청 알부민, 2-머캅토에탄올, 재조합 인간 줄기세포 인자(SCF), 재조합 인간 인터루킨 3(IL-3), 재조합 인간 에리트로포이에틴(EPO), 재조합 인간 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)를 함유한다.
HCO에서의 기능성 대식세포의 형성
새로운 Matrigel로의 HCO의 계대 및 연속된 배양으로, 기능성 대식세포를 형성한다(약20일 내지 약 34일+). 대식세포는 감염 자극, 예컨대 지질다당류(LPS) 또는 박테리아에 기능적으로 반응하여, 박테리아를 식세포 작용으로 삼킬 수 있고, LPS에 반응하여 IL6, IL8, CCL3, CCL4 및 TNF-알파를 포함한 염증성 사이토카인을 자연 발생적으로 생산한다. 대식세포는 또한 IL10에 반응하여, 염증성 사이토카인 생산을 감소시킨다. 대식세포는 또한 M-CSF 억제 또는 첨가에 대해 반응하여, 각각 대식세포 수가 감소 및 증가한다.
면역 세포 생산이 증가하는 인간의 간 오르가노이드의 생성 방법
이전에 설명된 방법을 일부 변형하여 사용하여, hiPSC의 최종 내배엽으로의 분화를 유도한다(문헌[Spence et al., 2011]). 간략히, hiPSC의 콜로니를 아큐타제(Thermo Fisher Scientific Inc., 미국 메사추세츠주 월섬 소재) 중에서 분리하고, 150,000 ~ 300,000개 세포를 Matrigel 또는 라미닌 코팅된 조직 배양체 24 웰 플레이트(Corning, 노스캐롤라이나주 더럼 소재) 상에 도말한다. 세포가 고-밀도로 되었을 때(90% 초과의 웰이 세포로 덮임), 배지를 1일차에 100 ng/mL 액티빈 A(R&D System, 미네소타주 미네아폴리스 소재) 및 50 ng/mL 골형성 단백질 4(BMP4; R&D System), 2일차에 100 ng/mL 액티빈 A 및 0.2 % 소태아 혈청(FCS; Thermo Fisher Scientific Inc.), 및 3일차에 100 ng/mL 액티빈 A 및 2% FCS를 함유하는 RPMI 1640 배지들(Life Technologies, 캘리포니아주 칼스배드 소재)로 교환하였다. 4일 ~ 6일 동안, 세포를 2% B27(Life Technologies), 1% N2(Gibco, 매릴랜드주 록빌 소재), 2 mM L-글루타민(Gibco), 및 1 mM HEPES(Gibco), 500 ng/ml 섬유아세포 성장 인자(FGF4; R&D System)를 함유하는 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco) 및 3 μM CHIR99021(Stemgent, 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)을 포함하는 Advanced DMEM/F12(Thermo Fisher Scientific Inc.) 중에 배양함으로써, 뒷쪽 중장으로 분화시킨다. 세포 분화용 배양체를 5% CO2/95% 공기의 대기 하에서 37℃로 유지하고, 배지를 매일 교체한다. 분화된 최종 내배엽은 7일차에 플레이트 상에서 출아(budding)를 나타내었다. 스페로이드가 Matrigel에 포매되기에 충분하지 않을 경우, 4일차 ~ 6 일차에 다시 배지를 첨가하고, 37℃에서 밤새 배양하였다.
간 오르가노이드로의 분화. 4개의 방법을 사용하여, DE를 간 오르가노이드로 분화시킬 수 있다: "Matrigel 드롭(drop) 방법", "Matrigel 샌드위치 방법", "Matrigel 무첨가 방법" 및 "스페로이드 생성 트랜스웰(transwell) 방법," 이들 각각은 이하에 기재되어 있다.
Matrigel 드롭 방법: 7일차 ~ 8일차에, 도말된 세포와 함께 최종 내배엽 오르가노이드를 가볍게 피펫팅하여, 디쉬로부터 떼어낸다. 분리된 스페로이드를 800 rpm으로 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거한 후, 디쉬 상의 100% Matrigel 드롭에 포매한다. 250 μL Matrigel(Corning)을 내배엽 배양체의 24 웰 플레이트의 웰마다 사용한다. 80 μL Matrigel 드롭을 24 웰 플레이트(VWR Scientific Products, 펜실베니아주 웨스트 체스터 소재)의 각 웰당 1개씩 만들었다. 플레이트를 5% CO2/95% 공기의 대기 하에 37℃에서 5분 ~ 15분 동안 둔다. Matrigel이 굳은 후, 1일 ~ 5일 동안 B27, N2, L-글루타민, HEPES, 페니실린/스트렙토마이신 및 레티노산 (RA; Sigma, 미주리주 세인트루이스 소재) 2 μM와 함께 Advanced DMEM/F12를 첨가한다. 배지를 이틀마다 교체한다. RA 처리 후에, Matrigel 드롭에 포매된 오르가노이드를 10 ng/mL 간세포 성장 인자(HGF; PeproTech, 뉴저지주 록키 힐 소재), 0.1 μM Dexamethasone(Dex; Sigma) 및 20 ng/mL Oncostatin M(OSM; R&D System)을 포함하는 간세포 배양 배지(HCM Lonza, 메릴랜드주 워커스빌 소재) 중에 배양하였다. 세포 분화용 배양체는 5% CO2/95% 공기의 대기 하에 37℃에서 유지하고, 배지를 3일마다 교체한다. 약 20일차 ~ 30일차에, 임의의 분석을 위해 Matrigel 드롭에 포매된 오르가노이드를 긁어내어 가볍게 피펫팅함으로써 분리할 수 있다.
Matrigel 샌드위치 방법: 7일차 ~ 8일차에, 도말된 세포와 함께 최종 내배엽 오르가노이드를 가볍게 피펫팅하여, 디쉬로부터 떼어낸다. 분리된 스페로이드를 800 rpm으로 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거한 후, 100% Matrigel과 혼합하였다. 동시에, 모든 보충제를 포함하는 간세포 배양 배지를 동일한 부피의 100% Matrigel과 혼합한다. HCM 및 Matrigel 혼합물을 디쉬의 바닥에 도말하여, 플레이트 상에 두꺼운(0.3 cm ~ 0.5 cm) 코팅을 만들고, 37℃에서 5% CO2/95% 공기의 대기 하에 15분 ~ 30분 동안 두었다. Matrigel이 굳은 후, 두껍게 코팅되어 도말된 Matrigel 상에 Matrigel과 혼합된 스페로이드를 도말한다. 플레이트를 5% CO2/95% 공기의 대기 하에 37℃에서 5분 동안 둔다. Advanced DMEM/F12를 B27, N2, L-글루타민, HEPES, 페니실린/스트렙토마이신 및 레티노산(RA; Sigma, 미주리주 세인트루이스 소재) 2 μM과 함께 1 ~ 5 일 동안 첨가한다. 배지를 이틀마다 교체한다. RA 처리 후에, Matrigel 드롭에 포매된 오르가노이드를 10 ng/mL 간세포 성장 인자(HGF; PeproTech, 뉴저지주 록키 힐 소재), 0.1 μM Dexamethasone(Dex; Sigma) 및 20 ng/mL Oncostatin M(OSM; R&D System)을 포함하는 간세포 배양 배지(HCM Lonza, 메릴랜드주 워커스빌 소재) 중에 배양하였다. 세포 분화용 배양체는 5% CO2/95% 공기의 대기 하에 37℃에서 유지하고, 배지를 3일마다 교체한다. 약 20일차 ~ 30일차에, 임의의 분석을 위해 Matrigel 드롭에 포매된 오르가노이드를 긁어내어 가볍게 피펫팅함으로써 분리하였다.
Matrigel 무첨가 방법: 7일차 ~ 8일차에, 최종 내배엽 오르가노이드를 도말된 세포와 함께 B27(Life Technologies), N2(Gibco, 매릴랜드주 록빌 소재), L-글루타민, HEPES, 페니실린/스트렙토마이신, 및 레티노산(RA; Sigma, 미주리주 세인트루이스 소재), 2 μM를 포함하는 Advanced DMEM/F12(Thermo Fisher Scientific Inc.) 중에 4일 동안 연속하여 평판 배양한다. 배지를 이틀마다 교체한다. 4-일간 평판 배양한 후, 오르가노이드는 출아하기 시작하나, 2D 세포는 간세포로 분화한다. 오르가노이드 및 간세포는 둘 다 10일 동안 10 ng/mL 간세포 성장 인자(HGF; PeproTech, 뉴저지주 록키 힐 소재), 0.1 μM Dexamethasone(Dex; Sigma) 및 20 ng/mL Oncostatin M(OSM; R&D System)을 포함하는 간세포 배양 배지(HCM Lonza, 메릴랜드주 워커스빌 소재) 하에 60일 초과 동안 유지될 수 있다. 오르가노이드 어세이를 위해, 부유성 오르가노이드를 초-저부착 6 웰 플레이트 내에 모아서, 적절한 경우 추후의 어세이에 사용할 수 있다. 세포 분화용 배양체는 5% CO2/95% 공기의 대기 하에 37℃에서 유지하고, 배지를 3일마다 교체한다.
스페로이드 생성 트랜스웰 방법: 뒷쪽 중장(midgut) 스페로이드를 상기 기재된 바와 같이 생성하였다. 앞쪽 전장 스페로이드는 4일 ~ 6일간의 분화를 약간 변형함으로써 생성하였다. 앞쪽 전장 스페로이드를 위하여, B27(Life Technologies), N2(Gibco, 매릴랜드주 록빌 소재), L-글루타민, HEPES, 페니실린/스트렙토마이신, 500 ng/ml FGF4, 2 μM CHIR99021 및 200 ng/ml 노긴을 포함하는 Advanced DMEM/F12(Thermo Fisher Scientific Inc.)를 첨가하고, 4일 ~ 7일 동안 매일 교체하였다. 8일차에, 앞쪽 및 뒷쪽으로부터의 세포를 피펫팅 및 트립신 소화에 의해 단일 세포 현탁체로 분리하여, 96 웰 초-저 부착 플레이트 상에 분주하고, 밤새 배양하였다. 9일차에, 세포 응집체를 모아서, 앞쪽 및 뒷쪽을 결합시키고, 밤새 배양하였다. 10일차에, 앞쪽 및 뒷쪽의 Matrigel 드롭이 서로 부착된다. 12개의 웰 플레이트(Denville)를 50 ul Matrigel로 코팅하고, 이를 37℃에서 2분 동안 배양한다. 부착된 앞쪽 및 뒷쪽의 스페로이드 응집체를 최소한의 Matrigel과 함께 넓은 보어 10μL 피펫으로 조심스럽게 취하여, Matrigel 코팅된 12 웰 플레이트에 둔다. 추가 5μL의 Matrigel을 각각의 스페로이드 상에 두었다. B27, N2, L-글루타민, HEPES 및 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 Advanced DMEM/F12를 첨가하였다. 13일차에, 스페로이드를 넓은 보어 피펫으로 모아서, 트랜스웰 플레이트에 옮기고, 추가 5μL의 Matrigel로 덮었다. B27, N2, L-글루타민, HEPES 및 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 Advanced DMEM/F12를 바닥 웰에 첨가하고, 이를 5일마다 교체한다.
조혈 세포를 함유하는 포매된 간 오르가노이드 배양체: 7일차 ~ 8일차에, 도말된 세포와 함께 최종 내배엽 오르가노이드를 가볍게 피펫팅하여, 디쉬로부터 떼어낸다. 세포는 상기 기재된 "Matrigel 드롭 방법" "Matrigel 샌드위치 방법," 또는 "스페로이드 생성 트랜스웰 방법"중 어느 하나를 사용하여 제조한다. 레티노산 없이 B27, N2, L-글루타민, HEPES 및 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 Advanced DMEM/F12를 첨가한다. 세포 분화용 배양체를 37℃에서 5% CO2/95% 공기의 대기 하에 유지하고, 이 배지를 4일마다 교체한다. 13일차 ~ 15일차에, 적혈구는 iPSC의 배양체 내에서 눈으로 볼 수 있게 된다. 7일차에 트롬보포이에틴(TPO)(10 ng/ml) 및 줄기세포 인자(SCF)(100 ng/ml)를 배지에 첨가하면, 조혈 세포 생산이 증가한다(이는 수집될 때까지 배지 내에 유지될 수 있음).
간 오르가노이드 배양체에서 다중 조혈 계열로의 시험관내 분화 어세이: 배양 8일차 내지 18일차에, 오르가노이드를 피펫팅에 의해 기계적인 힘으로 분리시키고, PBS로 씻어낸다. 이후, 세포에 0.05% 트립신-EDTA(Life Technologies)을 처리하여 Matrigel을 제거하고, 단일 세포 현탁액을 새로 얻었다. 세포를 트랜스페린, 줄기세포 인자(SCF), 인터루킨 3(IL-3), 인터루킨 6(IL-6), 에리트로포이에틴(EPO), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)(Stem Cell Technologies)을 포함하는 사이토카인과 함께 메틸셀룰로스 함유 플레이트에 분주하고, 이를 인큐베이터 내의 습윤 챔버 내에 두고, 5% CO2/95% 공기의 대기하에 37℃에서 10일 동안 유지하는데, 이 시점에서 적혈구계 세포, 대식세포 및 호염기구를 포함한 콜로니들이 관찰된다. 세포들을 라이트-김사(Wright-Giemsa) 염색에 의해 식별한다.
참고 문헌
1. Gomez Perdiguero, E. et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature 518, 547-551, doi:10.1038/nature13989 (2015).
2. Hoeffel, G. et al. C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages. Immunity 42, 665-678, doi:10.1016/j.immuni.2015.03.011 (2015).
3. Sheng, J., Ruedl, C. & Karjalainen, K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity 43, 382-393, doi:10.1016/j.immuni.2015.07.016 (2015).
4. De Schepper, S. et al. Self-Maintaining Gut Macrophages Are Essential for Intestinal Homeostasis. Cell 175, 400-415 e413, doi:10.1016/j.cell.2018.07.048 (2018).
5. Perdiguero, E. G. & Geissmann, F. The development and maintenance of resident macrophages. Nat Immunol 17, 2-8, doi:10.1038/ni.3341 (2016).
6. Cumano, A., Dieterlen-Lievre, F. & Godin, I. Lymphoid potential, probed before circulation in mouse, is restricted to caudal intraembryonic splanchnopleura. Cell 86, 907-916 (1996).
7. Wills, A., Dickinson, K., Khokha, M. & Baker, J. C. Bmp signaling is necessary and sufficient for ventrolateral endoderm specification in Xenopus. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists 237, 2177-2186, doi:10.1002/dvdy.21631 (2008).
8. Tiso, N., Filippi, A., Pauls, S., Bortolussi, M. & Argenton, F. BMP signalling regulates anteroposterior endoderm patterning in zebrafish. Mech Dev 118, 29-37 (2002).
9. Roberts, D. J. et al. Sonic Hedgehog Is an Endodermal Signal Inducing Bmp-4 and Hox Genes during Induction and Regionalization of the Chick Hindgut. Development 121, 3163-3174 (1995).
10. Munera, J. O. et al. Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Colonic Organoids via Transient Activation of BMP Signaling. Cell Stem Cell 21, 51-64 e56, doi:10.1016/j.stem.2017.05.020 (2017).
11. Maeno, M. et al. The role of BMP-4 and GATA-2 in the induction and differentiation of hematopoietic mesoderm in Xenopus laevis. Blood 88, 1965-1972 (1996).
12. Iacovino, M. et al. HoxA3 is an apical regulator of haemogenic endothelium. Nature cell biology 13, 72-78 (2011).
13. Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M. & Keller, G. Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology 32, 554-561 (2014).
14. Choi, K. D. et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep 2, 553-567, doi:10.1016/j.celrep.2012.08.002 (2012).
15. Kennedy, M. et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep 2, 1722-1735, doi:10.1016/j.celrep.2012.11.003 (2012).
16. Bain, C. C. et al. Resident and pro-inflammatory macrophages in the colon represent alternative context-dependent fates of the same Ly6Chi monocyte precursors. Mucosal Immunol 6, 498-510, doi:10.1038/mi.2012.89 (2013).
17. Bain, C. C. et al. Constant replenishment from circulating monocytes maintains the macrophage pool in the intestine of adult mice. Nat Immunol 15, 929-937, doi:10.1038/ni.2967 (2014).
18. Bain, C. C. et al. Resident and pro-inflammatory macrophages in the colon represent alternative context-dependent fates of the same Ly6Chi monocyte precursors. Mucosal immunology 6, 498-510 (2013).
19. Takata, K. et al. Induced-Pluripotent-Stem-Cell-Derived Primitive Macrophages Provide a Platform for Modeling Tissue-Resident Macrophage Differentiation and Function. Immunity 47, 183-198.e186 (2017).
20. Uhlen, M. et al. A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics. Molecular & cellular proteomics : MCP 4, 1920-1932 (2005).
21. Bulmer, J. N. & Johnson, P. M. Macrophage populations in the human placenta and amniochorion. Clin Exp Immunol 57, 393-403 (1984).
22. Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E. & Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Immunol 14, 986-995, doi:10.1038/ni.2705 (2013).
23. Shaw, T. N. et al. Tissue-resident macrophages in the intestine are long lived and defined by Tim-4 and CD4 expression. J Exp Med 215, 1507-1518 (2018).
24. Bujko, A. et al. Transcriptional and functional profiling defines human small intestinal macrophage subsets. J Exp Med 215, 441-458 (2018).
25. Smith, P. D. et al. Intestinal macrophages lack CD14 and CD89 and consequently are down-regulated for LPS- and IgA-mediated activities. J Immunol 167, 2651-2656 (2001).
26. Maheshwari, A. et al. TGF-beta2 suppresses macrophage cytokine production and mucosal inflammatory responses in the developing intestine. Gastroenterology 140, 242-253 (2011).
27. Man, A. L. et al. CX3CR1+ Cell-Mediated Salmonella Exclusion Protects the Intestinal Mucosa during the Initial Stage of Infection. J Immunol 198, 335-343, doi:10.4049/jimmunol.1502559 (2017).
28. Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F. & Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med 11, 228-232, doi:10.1038/nm1181 (2005).
29. Lanctot, P. M., Gage, F. H. & Varki, A. P. The glycans of stem cells. Curr Opin Chem Biol 11, 373-380, doi:10.1016/j.cbpa.2007.05.032 (2007).
30. Glocker, E.-O. et al. Inflammatory bowel disease and mutations affecting the interleukin-10 receptor. N Engl J Med 361, 2033-2045 (2009).
31. Tugizov, S. M. et al. Differential transmission of HIV traversing fetal oral/intestinal epithelia and adult oral epithelia. J Virol 86, 2556-2570, doi:10.1128/JVI.06578-11 (2012).
32. Campbell, E. L. et al. Transmigrating neutrophils shape the mucosal microenvironment through localized oxygen depletion to influence resolution of inflammation. Immunity 40, 66-77, doi:10.1016/j.immuni.2013.11.020 (2014).
모든 백분율 및 비는 달리 지정된 바 없는 경우 중량에 의해 계산된다.
모든 백분율 및 비는 달리 지정된 바 없는 경우 총 조성물을 기준으로 계산된다.
본 명세서 전반에 주어진 모든 최대 수치 제한은, 모든 더 낮은 수치 제한을 마치 이것이 명백히 본원에 표기된 것처럼 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다. 본 명세서 전반에 주어진 모든 최소 수치 제한은, 모든 더 높은 수치 제한을 마치 이것이 본원에 명백히 표기된 것처럼 포함할 것이다. 본 명세서 전반에 주어진 모든 수치 범위는, 이러한 더 넓은 수치 범위 내에 속하는 모든 더 좁은 수치 범위를 마치 이것이 본원에 전체가 명백히 표기된 것처럼 포함할 것이다.
본원에 개시된 치수 및 값은, 나열된 정확한 수치값에 엄격히 제한되는 것으로 이해되지 않을 것이다. 그 대신, 달리 특정되지 않는 한, 이러한 각 치수는 나열된 값 및 그 값 주변의 기능적으로 동등한 범위를 둘 다 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, "20 mm"로 개시된 치수는, "약 20 mm"를 의미하는 것으로 의도된다.
임의의 교차 참고 또는 관련 특허 또는 출원을 포함하는 본원에 인용된 모든 문헌은, 명백히 배제되거나 제한되지 않는 한, 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 임의의 문헌의 인용은 이것이 본원에 개시되거나 청구된 임의의 발명에 대한 선행기술이거나, 또는 그것이 단독으로 또는 임의의 다른 참고문헌 또는 참고문헌들과 임의의 조합으로 임의의 이러한 발명을 교시, 제안 또는 개시한다고 인정하는 것이 아니다. 추가로, 이 문헌의 용어의 임의의 의미 또는 정의가 참고로 포함된 문헌의 동일한 용어의 임의의 의미 또는 정의와 상충되는 경우, 이 문헌의 그 용어에 할당된 의미 또는 정의가 우세할 것이다.
본 발명의 특정 실시 형태는 예시 및 설명되어 있으나, 당업계의 숙련자들에게는 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않고도 다양한 다른 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 사실이 명백할 것이다. 따라서, 첨부된 청구항에서 본 발명의 범주 내에 있는 모든 이러한 변화 및 변형을 커버하는 것으로 의도된다.

Claims (40)

  1. 조혈 줄기세포(HSC) 또는 이의 파생 세포의 제조 방법으로서,
    a. 전장(foregut) 세포가 형성될 때까지, 전구 세포로부터 유래된 최종 내배엽(definitive endoderm)을 wnt 신호전달 경로 활성자 및 FGF 신호전달 경로 활성자와 접촉시키는 단계;
    b. 상기 전장 세포를 레티노산의 부재 하에 배양하여, 조혈 세포를 생성하는 간 오르가노이드(organoid)를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1 항에 있어서, 상기 전구 세포는 배아 줄기세포 및 유도 만능 줄기세포(iPSC) 중 하나 또는 둘 다로부터 선택되는, 방법.
  3. 제1 항 또는 제2항에 있어서, 상기 wnt 신호전달 경로 활성자는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16, wnt 신호전달 경로의 소분자 활성자, (예를 들어 염화리튬; 2-아미노-4,6-이치환된 피리미딘 (헤테로) 아릴피리미딘; IQ1; QS11; NSC668036; DCA 베타-카테닌; 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)-벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐) 피리미딘), WAY-316606; SB-216763; 또는 BIO (6-브로모인디루빈-3'-옥심)), Wnt 신호전달 경로의 siRNA 및/또는 shRNA 활성자, GSK3 억제제(예를 들어 키론/CHIR9902), 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FGF 신호전달 경로 활성자는 소분자 또는 단백질 FGF 신호전달 경로 활성자, FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF 신호전달 경로의 siRNA 및/또는 shRNA 활성자, 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전장 세포는 상기 간 오르가노이드를 형성하기 전에 스페로이드(spheroid)를 형성하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전장 세포는 상기 간 오르가노이드를 형성하기 전에 스페로이드를 형성하고, 상기 방법은 상기 스페로이드를 파쇄하여 복수의 세포들을 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 파쇄는 화학적 파쇄 및 기계적 파쇄 중 하나 또는 둘 다를 통해 실행되는, 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 파쇄는 효소에 의한 처리를 포함하는데, 바람직하게는 상기 효소는 단백질 분해 효소 활성 및 콜라겐 분해 효소 활성 중 하나 또는 둘 다를 갖는 효소, 바람직하게는 아큐타제(accutase), 트립신, 콜라겐 분해효소, 히알루로니다제, DNase, 파파인, 트립제안(trypzean)(Sigma 제조), 또는 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 효소인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서 상기 전장은 트랜스페린, 줄기세포 인자(SCF), 인터루킨 3(IL-3), 인터루킨 6(IL-6), 에리트로포이에틴(EPO), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 및 이들의 조합으로부터 선택된 사이토카인의 존재 하에 배양되며, 바람직하게는 상기 전장은 상기 배양 전에 단일 세포로 분리되고, 상기 배양은 사이토카인과 함께 약 1일, 또는 약 2일, 또는 약 3일, 또는 약 4일, 또는 약 5일, 또는 약 6일, 또는 약 7일, 또는 약 8일, 또는 약 9일, 또는 약 10일, 또는 약 11일, 또는 약 12일, 또는 약 13일, 또는 약 14일, 또는 약 15일, 또는 약 16일, 또는 약 17일, 또는 약 18일, 또는 약 19일, 또는 약 20일, 또는 약 21일, 또는 약 3주, 또는 약 4주, 또는 약 5주, 또는 약 6주, 또는 약 7주, 또는 약 8주 동안, 또는 약 9주 동안, 또는 약 10주, 또는 약 11주, 또는 약 12주, 또는 12주 초과 동안 수행되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간의 간 오르가노이드를 트롬보포이에틴(TPO) 및 줄기세포 인자(SCF) 중 하나 또는 둘 다와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하되, 상기 트롬보포이에틴(TPO) 및 상기 줄기세포 인자(SCF) 중 하나 또는 둘 다와의 상기 접촉은 약 1일, 또는 약 2일, 또는 약 3일, 또는 약 4일, 또는 약 5일, 또는 약 6일, 또는 약 7일, 또는 약 8일, 또는 약 9일, 또는 약 10일, 또는 약 11일, 또는 약 12일, 또는 약 13일, 또는 약 14일, 또는 약 15일, 또는 약 16일, 또는 약 17일, 또는 약 18일, 또는 약 19일, 또는 약 20일, 또는 약 21일, 또는 약 3주, 또는 약 4주, 또는 약 5주, 또는 약 6주, 또는 약 7주, 또는 약 8주 동안, 또는 약 9주 동안, 또는 약 10주, 또는 약 11주, 또는 약 12주, 또는 12주 초과 동안 수행되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간의 간 오르가노이드는 태아 상태에 있는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간의 간 오르가노이드는 레티노산이 처리된 인간의 간 오르가노이드에 비해 감소된 알부민을 생산하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간의 간 오르가노이드는 알파-태아단백질(AFP)을 생산하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간의 간 오르가노이드는 레티노산이 처리된 인간의 간 오르가노이드에 비해 증가된 내피 마커 CD34 및 KDR을 갖는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간의 간 오르가노이드는 레티노산이 처리된 인간의 간 오르가노이드에 비해 증가된 에리트로포이에틴(EPO) 및 헤모글로빈 감마(HBG)를 갖는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전장 세포는 기저 막 기질(Matrigel)에 현탁되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전장 세포는 골수 유래 간질 세포주 상에 배양되는, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 파생 세포는 골수계 세포(예컨대 단핵구, 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 및 거핵구 내지 혈소판), 림프계 세포(예컨대 T 세포, B 세포, 및 자연 살해 세포) 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 방법.
  19. 방법으로서,
    결장 오르가노이드를 배양하여 오르가노이드 배양체를 형성하는 단계;
    상기 결장 오르가노이드 배양체로부터 하나 이상의 면역세포를 수확하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 결장 오르가노이드는 약 1일, 또는 약 2일, 또는 약 3일, 또는 약 4일, 또는 약 5일, 또는 약 6일, 또는 약 7일, 또는 약 8일, 또는 약 9일, 또는 약 10일, 또는 약 11일, 또는 약 12일, 또는 약 13일, 또는 약 14일, 또는 약 15일, 또는 약 16일, 또는 약 17일, 또는 약 18일, 또는 약 19일, 또는 약 20일, 또는 약 21일, 또는 약 3주, 또는 약 4주, 또는 약 5주, 또는 약 6주, 또는 약 7주, 또는 약 8주 동안, 또는 약 9주 동안, 또는 약 10주, 또는 약 11주, 또는 약 12주, 또는 12주 초과 동안, 또는 상기 결장 오르가노이드가 조혈 전구체/줄기세포를 생산하는 하나 이상의 조혈 내피(hemogenic endothelium) 및 혈관내피 맥관(endothelial tube)을 포함할 때까지 배양되는, 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 결장 오르가노이드 배양체로부터 간엽(mesenchyme)을 분리하는 단계, 및 상기 간엽을 배양하는 단계를 추가로 포함하되, 바람직하게는 상기 간엽 배양 단계는 약 4일 내지 3개월, 또는 약 5일 내지 2개월, 또는 약 6일 내지 약 1개월, 또는 약 7일 내지 약 21 일의 기간 동안 수행되고, 더욱 바람직하게는 상기 간엽 배양은 현탁 배양인, 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결장 오르가노이드는 간엽을 포함하고, 상기 배양 단계는 약 4일 내지 3개월, 또는 약 5일 내지 2개월, 또는 약 6일 내지 약 1개월, 또는 약 7일 내지 약 14 일의 기간 동안 수행되고, 선택적으로 상기 배양 단계는 약 1주 내지 4주, 또는 약 1주의 기간 동안 현탁 배양으로 수행되어, 간엽이 확장되게 하는, 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역세포는 적혈구계, 골수계 및 혼합 골수계 콜로니로부터 선택되는, 방법.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역세포는 대식세포, 호중구, 호산구, 호염기구, 적혈구, 백혈구 및 단핵구 중 하나 이상으로부터 선택되는, 방법.
  25. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결장 오르가노이드는 전구 세포로부터 유래된 최종 내배엽, 바람직하게는 배아 줄기세포 또는 유도 만능 줄기세포로부터 유래되는, 방법.
  26. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, T-세포 유도 성장 인자와 함께 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  27. 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양체를 파쇄하여 상기 결장 오르가노이드를 분산시키고, 상기 배양체에서 간엽을 파쇄하는 단계; 및 이후 약 1주 내지 약 4주, 또는 약 2주 내지 약 3주의 가간 동안 기저 막 기질에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  28. 괴사성 장결장염(necrotizing enterocolitis), 매우 초기 발병(Very Early Onset) IBD30, 박테리아 병원체(예컨대 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile))의 감염, 바이러스 병원체(예컨대, 태아 장 대식세포에 용이하게 감염되는 HIV)의 감염으로부터 선택된 질병 상태를 모델링하는 방법으로서, 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 결장 오르가노이드에서 상기 질병 상태를 발병시키는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 선천성 면역 메커니즘을 모델링하는 방법으로서, 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 결장 오르가노이드를 포함하는, 방법.
  30. 인간의 간 오르가노이드(HLO)로서, 상기 HLO는 태아 간 조직을 포함하는 것을 특징으로 하되, 상기 HLO는 조혈 세포를 생산하는, 인간의 간 오르가노이드(HLO).
  31. 인간의 결장 오르가노이드(HCO)로서, 조혈 내피를 포함하는, 인간의 결장 오르가노이드(HCO).
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 조혈 내피는 면역세포, 바람직하게는 적혈-골수계 전구체, 림프계 전구체 및 대식세포 중 하나 이상을 생산하는, HCO.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 조혈 내피는 염증유발성(pro-inflammatory) 사이토카인을 분비하는 대식세포를 생산하는, HCO.
  34. 제32항에 있어서, 상기 면역세포는 골수계 잠재성을 갖는, HCO.
  35. 제30항에 있어서, 상기 HCO는 T-세포 잠재성을 갖는 조혈 전구체를 포함하는, HCO.
  36. 제30항에 있어서, 상기 HCO는 조혈 전구 세포를 포함하고, 상기 전구 세포는 CD34+이고, 상기 CD34 전구 세포는 오르가노이드 간엽 내에 있고, 상기 조혈 전구체는 T-세포를 형성할 수 있는, HCO.
  37. 제30항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HCO는 혈관내피 맥관을 포함하고, 상기 ET는 CD34+에 대해 양성이고, 상기 ET는 RUNX1+ 세포를 포함하는, 방법.
  38. 조혈 줄기세포(HSC)를 생산할 수 있는 HCO/HIO의 제조 방법으로서, 중장/후장 스페로이드를 생산하기에 충분한 기간 동안 전구 세포로부터 유래된 최종 내배엽을 하나 이상의 인자와 접촉시키는 단계, 및 선택적으로 상기 중장/후장 스페로이드를 기저 막 기질에 포매시키는 단계, 및 앞쪽 전장 스페로이드를 생산하기에 충분한 양 및 기간 동안 상기 DE와 FGF, CHIR, 노긴 및 SMAD 억제제를 포함하는 인자들의 조합을 접촉시키는 단계를 포함하되;
    상기 중장/후장 스페로이드 또는 상기 앞쪽 전장 스페로이드는 HSC를 생산하는, 방법.
  39. 면역세포를 필요로 하는 개체를 치료하는 방법으로서,
    a. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 의한 HCO 또는 HLO로부터 조혈 줄기세포(HSC) 또는 파생 세포를 수확하는 단계; 및
    b. 상기 HSC 또는 상기 파생 세포를 이것이 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 투여는 상기 HSC를 상기 개체의 골수에 이식시키는(engrafting) 것을 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 치료는 빈혈[재생불량성 빈혈(aplastic anemia), 판코니 빈혈(Fanconi's anemia) 포함], 면역 결핍, 암(예컨대 림프종, 백혈병, 암종, 고형 종양), 조혈의 유전적 장애, 유전성 저장 질환, 중증 지중해성 빈혈(thalassemia major), 겸상 세포 질환(sickle cell disease), 골다공증(osteoporosis), 또는 이들의 조합의 치료인, 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3207123A1 (en) 2014-10-17 2017-08-23 Children's Hospital Center D/b/a Cincinnati Children's Hospital Medical Center In vivo model of human small intestine using pluripotent stem cells and methods of making and using same
US11767515B2 (en) 2016-12-05 2023-09-26 Children's Hospital Medical Center Colonic organoids and methods of making and using same
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EP4244336A1 (en) * 2020-11-13 2023-09-20 Oslo Universitetssykehus HF Artifical liver organoids and methods of their production
KR20240042354A (ko) * 2022-09-21 2024-04-02 한국생명공학연구원 생착 및 재생능 강화를 위한 장 오가노이드 주변 기질 세포층 및 이의 용도
CN118240750B (zh) * 2024-05-28 2024-08-13 淇嘉科技(苏州)有限公司 具有免疫细胞的结肠类器官构建方法
CN118374432A (zh) * 2024-06-26 2024-07-23 淇嘉科技(苏州)有限公司 匀质化肠道类器官制备方法
CN118374446A (zh) * 2024-06-26 2024-07-23 淇嘉科技(苏州)有限公司 巨噬细胞包含型结肠类器官批量制备方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2956538B1 (en) * 2013-02-13 2018-11-14 Wake Forest University Health Sciences Bioengineered liver constructs and methods relating thereto
WO2015173425A1 (en) * 2014-05-16 2015-11-19 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Improved culture method for organoids
EP3523422A1 (en) * 2016-10-05 2019-08-14 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Generating mature lineages from induced pluripotent stem cells with mecp2 disruption
EP3534919A4 (en) * 2016-11-04 2020-11-11 Children's Hospital Medical Center LIVER ORGANOID COMPOSITIONS AND METHOD FOR MANUFACTURING AND USING THEREOF
US11767515B2 (en) * 2016-12-05 2023-09-26 Children's Hospital Medical Center Colonic organoids and methods of making and using same

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