CN115975948A - 一种基于keratin 5双向调控功能的混合上皮间充质表型肿瘤细胞模型及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于keratin5双向调控功能的混合上皮间充质表型肿瘤细胞模型，属于肿瘤模型技术领域，所述模型为对上皮型细胞进行keratin5的基因敲降后获得的稳定的混合E/M表型细胞模型，本发明还公开了上述模型的构建方法；本发明的细胞模型的混合E/M表型细胞干性、体外迁移及侵袭能力、以及对化疗药物顺铂的耐药性均显著增强，从而能够对肿瘤侵袭转移研究提供便利。

Description

一种基于keratin 5双向调控功能的混合上皮间充质表型肿瘤细胞模型及其构建方法

技术领域

本发明涉及肿瘤模型技术领域，尤其涉及一种基于keratin 5双向调控功能的混合上皮间充质表型肿瘤细胞模型及其构建方法。

背景技术

上皮-间充质可塑性包括上皮表型、混合上皮/间充质表型(E/M)和间充质表型之间的可逆转变，是侵袭性肿瘤进展各个方面如转移、治疗抵抗和免疫逃避的基础。细胞获得一种或多种混合E/M表型的过程称为部分上皮间质化(partial EMT)。混合E/M表型的细胞可能较完全上皮表型或间充质表型的细胞更具干性和侵袭性。因此，在肿瘤研究体系中，获得稳定的混合上皮/间充质表型(E/M)细胞模型对肿瘤侵袭转移研究开展至关重要。而其中的关键点在于破译混合E/M表型的关键调节因子，这类因子相当于表型可塑性的变阻器，也是后续肿瘤侵袭转移的加速器。

而目前暂未见具有上述功能的细胞模型的报道。

发明内容

本发明的目的之一，就在于提供一种基于keratin 5双向调控功能的混合上皮间充质表型肿瘤细胞模型，以解决上述问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种基于keratin 5双向调控功能的混合上皮间充质表型肿瘤细胞模型，所述模型为对上皮型细胞进行keratin 5的基因敲降后获得的稳定的混合E/M表型细胞模型。

本申请的发明人通过大量的研究，找到了keratin 5基因，基因序列如下：

atgtctcgcc agtcaagtgt gtccttccgg agcgggggca gtcgtagctt cagcaccgcc

tctgccatca ccccgtctgt ctcccgcacc agcttcacct ccgtgtcccg gtccgggggt

ggcggtggtg gtggcttcgg cagggtcagc cttgcgggtg cttgtggagt gggtggctat

ggcagccgga gcctctacaa cctggggggc tccaagagga tatccatcag cactagtggt

ggcagcttca ggaaccggtt tggtgctggt gctggaggcg gctatggctt tggaggtggt

gccggtagtg gatttggttt cggcggtgga gctggtggtg gctttgggct cggtggcgga

gctggctttg gaggtggctt cggtggccct ggctttcctg tctgccctcc tggaggtatc

caagaggtca ctgtcaacca gagtctcctg actcccctca acctgcaaat cgaccccagc

atccagaggg tgaggaccga ggagcgcgag cagatcaaga ccctcaacaa taagtttgcc

tccttcatcg acaaggtgcg gttcctggag cagcagaaca aggttctgga caccaagtgg

accctgctgc aggagcaggg caccaagact gtgaggcaga acctggagcc gttgttcgag

cagtacatca acaacctcag gaggcagctg gacagcatcg tgggggaacg gggccgcctg

gactcagagc tgagaaacat gcaggacctg gtggaagact tcaagaacaa gtatgaggat

gaaatcaaca agcgtaccac tgctgagaat gagtttgtga tgctgaagaa ggatgtagat

gctgcctaca tgaacaaggt ggagctggag gccaaggttg atgcactgat ggatgagatt

aacttcatga agatgttctt tgatgcggag ctgtcccaga tgcagacgca tgtctctgac

acctcagtgg tcctctccat ggacaacaac cgcaacctgg acctggatag catcatcgct

gaggtcaagg cccagtatga ggagattgcc aaccgcagcc ggacagaagc cgagtcctgg

tatcagacca agtatgagga gctgcagcag acagctggcc ggcatggcga tgacctccgc

aacaccaagc atgagatctc tgagatgaac cggatgatcc agaggctgag agccgagatt

gacaatgtca agaaacagtg cgccaatctg cagaacgcca ttgcggatgc cgagcagcgt

ggggagctgg ccctcaagga tgccaggaac aagctggccg agctggagga ggccctgcag

aaggccaagc aggacatggc ccggctgctg cgtgagtacc aggagctcat gaacaccaag

ctggccctgg acgtggagat cgccacttac cgcaagctgc tggagggcga ggaatgcaga

ctcagtggag aaggagttgg accagtcaac atctctgttg tcacaagcag tgtttcctct

ggatatggca gtggcagtgg ctatggcggt ggcctcggtg gaggtcttgg cggcggcctc

ggtggaggtc ttgccggagg tagcagtgga agctactact ccagcagcag tgggggtgtc

ggcctaggtg gtgggctcag tgtggggggc tctggcttca gtgcaagcag tggccgaggg

ctgggggtgg gctttggcag tggcgggggt agcagctcca gcgtcaaatt tgtctccacc

acctcctcct cccggaagag cttcaagagc taa

该基因是一个E/M双向调控因子，能够抑制肿瘤细胞完整的上皮或间质表型，从而将细胞稳定在混合E/M表型中。通过对上皮型细胞行keratin 5的基因敲降，从而建立了稳定的混合E/M表型细胞模型，并在细胞水平、动物水平和临床数据上进行了验证。

试验证明：上皮型细胞中keratin 5的敲降促进了EMT转化，且保留部分原有的上皮表型属性，成功构建了稳定的混合E/M表型细胞。混合E/M表型细胞干性，体外迁移及侵袭能力，以及对化疗药物顺铂的耐药性均显著增强。在动物水平，裸鼠体内实验中，构建的稳定混合E/M表型细胞较对照组表现出体内致瘤能力和体内侵袭转移能力的显著增强，具有统计学上的意义。临床数据分析表明，keratin 5的表达与相关肿瘤患者的淋巴结转移情况显著相关。

本发明的目的之二，在于提供一种上述的基于keratin 5双向调控功能的混合上皮间充质表型肿瘤细胞模型的构建方法，采用的技术方案为：对上皮型细胞进行keratin 5的基因敲降时采用分别具有如SEQ.ID

NO:1(CCAGAGGAGTTGGACCAGTCAACATCTCGAGATGTTGACTGGTCCAACTCCTTTTTTTG)、SEQ.IDNO:2(CCGGGCTTGTGGAGTGGGTGGCTATCTCGAGATAGCCACCCACTCCACAAGCTTTTTG)和SEQ.IDNO:3(CCGGCCGCAGTTCTATATTCTGCTTCTCGAGAAGCAGAATATAGAACTGCGGTTTTTG)所示核苷酸序列的shKRT5-1、shKRT5-2、shKRT5-3的shRNA干扰载体进行敲降。

本发明构建了三个shRNA干扰载体，进行keratin 5的敲降，分别命名为shKRT5-1，shKRT5-2，shKRT5-3，western blot结果如图1所示，三个干扰载体均能有效敲降keratin5的表达，发明人在后面的实施例中，选择shKRT5-1进行后续细胞水平、动物水平和临床数据研究，即后述实施例及附图(除图1外)中的“shKRT5”均是指采用shKRT5-1进行敲降的结果。Keratin 5与DAPI的荧光复染结果也证实两株细胞中keratin 5被有效敲降。

作为优选的技术方案，具体构建步骤包括：

1.重组序列的合成及shKRT5质粒的构建与鉴定；

2.扩增shKRT5-1、shKRT5-2、shKRT5-3单克隆菌液；

2.1LB液体培养基的配制：称量酵母粉0.5g、蛋白胨1g、氯化钠1g到锥形瓶内，加入100mL蒸馏水,用纱布包好锥形瓶口，121℃高温灭菌20分钟，冷却后加入100μL氨苄青霉素(Amp)，Amp的作用浓度为100μg/mL；

2.2将配制好的LB液体培养基于250rpm，37℃摇床上孵育0.5h；

2.3取200μL shKRT5-1、shKRT5-2、shKRT5-3单克隆菌液分别接种于3个含有LB液体培养基的锥形瓶中，置于250rpm，37℃摇床摇床上振摇过夜；

3.Hispeed Plasmid Midi kit试剂盒抽提shKRT5质粒；

3.1将菌液收集到50mL离心管中，放到离心机4℃6000g离心15min去上清；

3.2加入6mL P1溶液反复吹打混匀至沉淀完全溶解，加入6mL P2溶液，盖上离心管盖子颠倒混匀4-6次，室温放置5min，若加入LyseBlue液体直至液体变成蓝色；

3.3加入6mL P3溶液颠倒混匀，直至液体变成无色，将溶液倒入QIA滤筒中，室温孵育10min；

3.4准备QIAGEN-tip柱，加入4mL QBT缓冲液使其自然流下，待QBT缓冲液流完后将QIA滤筒中的液体加压过滤到tip柱里让其自然过滤；

3.5加入20mL QC洗涤tip过滤柱；

3.6加入5mL QF洗脱并收集质粒DNA于一干净15mL离心管中；

3.7加入3.5mL异丙醇颠倒混匀，室温放置5min；

3.8将溶液用过滤膜进行过滤使质粒DNA吸附在滤膜上，加入2mL 70％乙醇过滤洗涤滤膜，重复洗涤2次；

3.9加入800μL的DEPC水溶解DNA，通过Nano Drop检测质粒浓度。

4.慢病毒包装

4.1离心收集293T细胞，细胞计数，将细胞接种于10cm平皿，每皿接种200万个细胞，将细胞放到37℃5％C0₂细胞培养箱培养24h备用；

4.2按照病毒质粒:dR8.9:VSV-G＝3:2.7:0.3的比例制备病毒质粒混合液，接着向质粒混合液中加入580μL opti-MEM，室温放置5min，加入18μL X-tremeGene HP DNATransfection Reagent室温孵育15min，孵育完毕后将混合液加入到293T细胞中，37℃,5％C0₂培养10h后，换为20％FBS完全培养基；

4.324h后第一次收集上清到15mL离心管中，-80℃冻存，加入9mL 20％FBS完全培养基继续培养48h后第二次收集上清，并与第一次收集的上清混合，1500rpm离心5min，收集上清并分装，分装后-80℃冻存备用；

5.肿瘤细胞转染及阳性筛选

5.1消化收集肿瘤细胞，细胞计数，将细胞接种于10cm平皿，每皿接种20万个细胞，加入完全培养基后放入37℃5％C0₂细胞培养箱培养24h；

5.2取一只15mL离心管，在离心管中加入9mL无双抗10％FBS的培养基、1mL包装病毒、10μL浓度10μg/mL的polybrene，混匀后加到铺有肿瘤细胞的培养皿中，孵育培养；

5.3转染24h后，将培养基换成含青霉素-硫酸链霉素和puromycin 2μg/mL新鲜完全培养基进行筛选。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的细胞模型的混合E/M表型细胞干性、体外迁移及侵袭能力、以及对化疗药物顺铂的耐药性均显著增强，从而能够对肿瘤侵袭转移研究提供便利。

附图说明

图1为头颈鳞癌细胞株FaDu与CAL 27的keratin 5(KRT5)基因敲降结果，图1中，左边分别为Keratin 5和DAPI复染荧光形貌图；右边为Keratin 5蛋白western blot实验结果；

图2为FaDu与CAL 27细胞keratin 5敲降前后上皮(E)/间质(M)相关指标蛋白表达变化的western blot结果；

图3为FaDu与CAL 27细胞keratin 5敲降前后干细胞表面标记流式分析结果；

图4为FaDu与CAL 27细胞keratin 5敲降前后干细胞上清中IL-6的ELISA分析实验结果(***p<0.001)，VEGFA表达及Stat3信号通路蛋白表达western blot结果；

图5为FaDu与CAL 27细胞keratin 5敲降前后体外迁移划痕实验结果(**p<0.01)；

图6为FaDu与CAL 27细胞keratin 5敲降前后体外侵袭transwell实验结果(**p<0.01)；

图7为FaDu与CAL 27细胞keratin 5敲降前后对顺铂的药物敏感性CCK-8实验结果；

图8为FaDu与CAL 27细胞keratin 5敲降前后NF-κb信号通路蛋白表达westernblot结果及PDTC敏感性CCK-8实验结果。

图9为keratin 5敲降前后FaDu与CAL 27细胞裸鼠体内成瘤实验结果(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

图10为keratin 5敲降前后FaDu与CAL 27细胞裸鼠尾静脉注射体内侵袭转移实验结果(**p<0.01)。

图11为TCGA头颈鳞癌样本数据分析KRT5表达与头颈鳞癌患者淋巴结转移相关性结果。

上述图中，“scramble”均是指敲降前的对照例。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1

一种上述的基于keratin 5双向调控功能的混合上皮间充质表型肿瘤细胞模型的构建与鉴定

1.1基于keratin 5双向调控功能的混合上皮间充质表型肿瘤细胞模型的构建

1.1.1重组序列的合成及shKRT5质粒的构建与鉴定，具体实验流程如下所示:

1.1.1.1根据目标序列合成38条引物

1.1.1.2 PCR获取克隆目标序列

a.全长PCR一轮

反应体系：引物1-38(FVCD0029331-1_1817-38)约50pmol/μL各0.5μL、聚合酶(pv2)0.5μL、5×PV2 buffer 10μL、10mM dNTP 1μL、ddH₂O加至50μL；

反应程序:95℃3min、[95℃25s、62℃20s、72℃40s，共计25个循环]、72℃1min、4℃结束；

b.全长PCR二轮

反应体系：模板PCR一轮产物(约100ng/μL)0.3μL、引物1 FVCD0029331-1_1(约50pmol/μL)0.5μL、引物2 FVCD0029331-1_38(约50pmol/μL)0.5μL、聚合酶pv2 0.5μL、5×PV2 buffer 10μL、10mM dNTP1μL、ddH₂O加至50μL；

反应程序:95℃3min、[95℃25s、62℃20s、72℃40s，共计25个循环]、72℃1min、4℃至结束；

1.1.1.3胶回收上述步骤1.1.1.2.1 PCR产物(参考Axygen产品说明书)，准备连接实验；PCR产物跑胶条带证实产物(理论大小1846bp)。

1.1.1.4重组连接实验

PCR的同时，用EcoRI/XbaI处理pLVX-puro质粒,进行胶回收，跑胶条带证实(理论大小8059kb)；

重组反应体系：1.1.1.3中胶回收产物4μL、pLVX-puro(线性化载体)3.5μL、重组酶2.5μL；

50℃水浴25min，放置2-3min使温度降低，进行转化及菌液涂布实验，37℃温育过夜。

1.1.1.5菌落筛选实验

a.挑取过夜平板中单菌落；

b.用FVCD0029331-1_1/FVCD0029331-1_38引物进行菌落PCR；PCR条带证实(理论大小1846bp)；

c.电泳鉴定阳性克隆；

d.随机选择4个阳性菌用4mL单管37℃摇床培养过夜。

1.1.1.6提取质粒送测将1.1.1.5中过夜菌液提取质粒，并送测序。

阳性菌液用以下引物测序：

CMV-F CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG

PLVX-puro-seqR CCATTGCTCAGCGGTGCTGT

VCD0029331-1-SEQ2 TAGTGGATTTGGTTTCGGCG

VCD0029331-1-SEQ3 TGATGGATGAGATTAACTTC

1.1.1.7获得正确质粒

1.1.1.8获得单克隆菌液:用10μL高压灭菌枪头对准测序正确的3个单菌落挑出后放入15mL离心管中，加入5mL含抗生素的LB液体培养基，置于250rpm，37℃摇床摇床上振摇过夜，分别命名为shKRT5-1、shKRT5-2、shKRT5-3。

1.1.2扩增单克隆菌液shKRT5-1、shKRT5-2、shKRT5-3(单克隆菌液来自步骤1.1.1.8由北京擎科生物科技有限公司提供)；

称量酵母粉0.5g、蛋白胨1g、氯化钠1g到锥形瓶内，加入100mL蒸馏水,用纱布包好锥形瓶口，121℃高温灭菌20分钟，冷却后加入100μL氨苄青霉素(Amp),Amp的作用浓度为100μg/mL；将配制好的LB液体培养基于250rpm，37℃摇床摇床(SYK-2102C)上孵育0.5h；取200μL shKRT5-1、shKRT5-2、

shKRT5-3单克隆菌液(单克隆菌液来自步骤1.1.1.8由北京擎科生物科技有限公司提供)分别接种于3个含有LB液体培养基的锥形瓶中，置于250rpm，37℃摇床摇床(SYK-2102C)上振摇过夜。

1.1.3.Hispeed Plasmid Midi kit试剂盒(QIAGEN)抽提shKRT5质粒：

1.1.3.1将菌液收集到50mL离心管中，放到贝克曼Avanti J-26S XP离心机4℃6000g离心15min去上清；

1.1.3.2加入6mL P1溶液反复吹打混匀至沉淀完全溶解，加入6mL P2溶液，盖上离心管盖子颠倒混匀4-6次，室温放置5min，若加入LyseBlue液体直至液体变成蓝色；

1.1.3.3加入6mL P3溶液颠倒混匀，直至液体变成无色，将溶液倒入QIA滤筒中，室温孵育10min；

1.1.3.4准备QIAGEN-tip柱，加入4mL QBT缓冲液使其自然流下，待QBT缓冲液流完后将QIA滤筒中的液体加压过滤到tip柱里让其自然过滤；

1.1.3.5加入20mL QC洗涤tip过滤柱；

1.1.3.6加入5mL QF洗脱并收集质粒DNA于一干净15mL离心管中；

1.1.3.7加入3.5mL异丙醇颠倒混匀，室温放置5min；

1.1.3.8将溶液用过滤膜进行过滤使质粒DNA吸附在滤膜上，加入2mL 70％乙醇过滤洗涤滤膜，重复洗涤2次；

1.1.3.9加入800μL的DEPC水溶解DNA，通过Nano Drop检测质粒浓度。

1.1.4慢病毒包装

1.1.4.1离心收集293T细胞，细胞计数，将细胞接种于10cm平皿，每皿接种200万个细胞，将细胞放到37℃5％C0₂细胞培养箱(Thermo)培养24h备用；

1.1.4.2按照病毒质粒:dR8.9:VSV-G＝3:2.7:0.3(dR8.9、VSV-G均由北京擎科生物科技有限公司提供)的比例制备病毒质粒混合液，接着向质粒混合液中加入580μL opti-MEM(gibco:31985-062)，室温放置5min，加入18μL X-tremeGene HP DNATransfectionReagent(Roche:51572200)室温孵育15min，孵育完毕后将混合液加入到293T细胞中，37℃5％C0₂细胞培养箱(Thermo)培养10h后，换为20％FBS完全培养基(gibco)；

1.1.4.3 24h后第一次收集上清到15mL离心管中，-80℃冻存，加入9mL 20％FBS完全培养基继续培养48h后第二次收集上清，并与第一次收集的上清混合，1500rpm离心5min，收集上清并分装，分装后-80℃冻存备用。

1.1.5.肿瘤细胞转染及阳性筛选

1.1.5.1消化收集肿瘤细胞，细胞计数，将细胞接种于10cm平皿，每皿接种20万个细胞，加入完全培养基后放入37℃5％C0₂细胞培养箱(Thermo)培养24h；

1.1.5.2取一只15mL离心管，在离心管中加入9mL无双抗10％FBS的培养基、1mL包装病毒、10μL浓度10μg/mL的polybrene，混匀后加到铺有肿瘤细胞的培养皿中，孵育培养；

1.1.5.3转染24h后，将培养基换成含青霉素-硫酸链霉素(BOSTER:PYG0016)和puromycin(biofroxx)2μg/mL新鲜完全培养基进行筛选。

1.2免疫荧光染色鉴定肿瘤细胞keratin 5敲降结果

1.2.1细胞接种:消化收集对数生长期的细胞，计数，调整细胞浓度为2.5×10⁵/mL；吸取200μL细胞悬液接种于35mm玻底培养皿的15mm观察区，待细胞贴壁后补加2mL培养基，将玻底培养皿放入37℃、5％CO2细胞培养箱(Thermo)培养48h；

1.2.2荧光染色：

1.2.2.1从培养箱中取出培养皿，吸掉上层培养基，用预冷的PBS洗涤细胞，重复洗涤3次，每次5min；

1.2.2.2用4％多聚甲醛室温下固定细胞30min；

1.2.2.3吸掉多余的多聚甲醛，停止固定，添加PBS-glycine作用10min，PBS洗涤一次；

1.2.2.4加入blocking溶液(10mLblocking溶液＝9mL IF buffer+1mL山羊血清配制而成)，室温下孵育2h；

1.2.2.5用IF buffer(称取0.1g BSA溶于80mL PBS，量取0.2mL TritonX-100、0.05mLTween20加入溶液，PBS定容至100mL)，按照1：100比例稀释一抗Keratin 5RabbitmAb(CST:25807)，将一抗溶液加入细胞4℃孵育过夜；

1.2.2.6用IF buffer室温下洗涤3次，每次10min。后续步骤均避光进行；

1.2.2.7用IF buffer按照1：1000比例稀释二抗Goat Anti-Rabbit IgG/HRP(BIOSS)，将二抗溶液加入细胞室温孵育60min；

1.2.2.8用IF buffer室温下洗涤1次，每次10min，PBS洗涤2次，每次5min；

1.2.2.9将DAPI储备液用PBS稀释至300nM，吸取200μL DAPI工作液完全覆盖细胞，室温下孵育5min；PBS洗涤3次，每次5min；

1.2.2.10吸掉多余液体，加入1-2滴抗荧光衰减封片剂使其完全覆盖细胞；

1.2.2.11将培养皿置于共聚焦显微镜(尼康:Nikon A1)下观察并采图。

1.3 Western Blot鉴定肿瘤细胞keratin 5敲降结果

1.3.1提取蛋白：消化收集细胞，用预冷1×PBS重悬细胞，600g离心5min收集细胞，尽量吸尽上清，加入预冷的增强型RIPA裂解液(BOSTER：AR0102-30)5×10⁶个细胞加入500μL裂解液，用移液枪吹打数下，冰上孵育30min,12000rpm离心20min,取上清，即为蛋白提取物；

1.3.2BCA试剂盒(BOSTER：AR0146)检测蛋白浓度(微孔板法)：各取25μL标准品和待测样品加入到微孔板中；每孔加入200μLBCA工作液(A液：B液＝50：1混合即为工作液)震荡30s充分混匀；盖上微孔板，37℃孵育30min；冷却至室温，在酶标仪上的570nm处检测吸光度。根据BSA标准品的吸光度(减去标准孔空白孔德OD值即为最终读数)，绘制标准曲线(X-蛋白浓度ug/ml；Y-最终的OD值)。根据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度；

1.3.3蛋白变性：在室温中溶解SDS-PAGE上样缓冲液(5×)；按照每4μL蛋白样品加入1μL上样缓冲液(5×)的比例，混合蛋白样品和上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和上样缓冲液。将混合液置于金属浴锅中100℃加热5min,以充分变性；

1.3.4加样：将8％SDS-PAGE预制胶(碧云天:P0688)固定到电泳装置中，并在装置中加满Running Buffer(称取14.4g Glycine、3.02gTris Base、1gSDS到1L烧杯中，加入0.8L蒸馏水，放到搅拌器上搅拌溶解，充分溶解后，加水定容至1L)，小心拔下梳子；向上样孔中加入30μg的已变性的蛋白样品，向Marker孔中加入5μL Marker；

1.3.5电泳：将电泳装置与电源连接，调节电压(上层：5％浓缩胶电压80V,电泳30min；下层：8％分离胶电压80V,电泳90min),直至溴酚兰接近分离胶的底部，然后关闭电源并撤去连接的导线；

1.3.6转膜(湿转)：小心取出电泳凝胶，切去浓缩胶后将凝胶放入转膜液中；将TransferBuffer(称取14.4g Glycine、3.02gTris Base到1L烧杯中，加入0.6L蒸馏水，放到搅拌器上搅拌溶解，充分溶解后，加入0.2L methanol,加水定容至1L)放入大饭盒内，泡入2片海绵、2片滤纸、1片PVDF膜(PVDF膜事先于甲醇中活化30S，取出置于转膜液中)，按照1层海绵+1层滤纸+凝胶+PVDF膜+1层滤纸+1层海绵的顺序组装转膜装置；将组装好的装置放入电转槽，合上盖子，接通电源，4℃180mA电泳70min；

1.3.7封闭：转膜完毕后，取下PVDF膜用封闭液(5％脱脂奶粉)室温封闭2h；

1.3.8孵育一抗Keratin 5Rabbit mAb(CST:25807)和GAPDH Rabbit mAb(BIOSS)：封闭结束后，根据目的蛋白分子量将膜剪切下来，加入用1×TBST稀释好的一抗(一抗的稀释倍数根据抗体说明书的作用浓度进行稀释)4℃孵育过夜；

1.3.9洗膜：用TBST(称取2.42g Tris Base、8gNacl到1L烧杯中，加入0.8L蒸馏水，放到搅拌器上搅拌溶解，充分溶解后，加入1mL Tween-20，用浓盐酸调PH至7.6，加水定容至1L)洗涤3次，每次10min；

1.3.10孵育二抗Goat Anti-Rabbit IgG/HRP(BIOSS)：加入用1×TBST稀释好的二抗(二抗为一抗对应的抗体，如一抗为鼠抗，二抗为山羊抗鼠，如一抗为兔抗，二抗则为山羊抗兔)，二抗稀释倍数根据抗体说明书的作用浓度进行稀释，室温孵育1h；

1.3.11洗膜：用TBST洗涤3次，每次10min；

1.3.12显影：将膜浸入超敏ECL化学发光底物工作液(四正柏生物:4AW011-100)中,放入天能凝胶成像系统4200中显影。

图1结果显示：无论在细胞水平还是蛋白水平鉴定肿瘤细胞keratin 5表达敲降成功。

实施例2：敲降前后上皮(E)/间质(M)相关指标蛋白表达变化测试

2.1提取蛋白：消化收集细胞，用预冷1×PBS重悬细胞，600g离心5min收集细胞，尽量吸尽上清，加入预冷的增强型RIPA裂解液(BOSTER)5×10⁶个细胞加入500μL裂解液，用移液枪吹打数下，冰上孵育30min,12000rpm离心20min,取上清，即为蛋白提取物；

2.2BCA试剂盒(BOSTER:AR0146)检测蛋白浓度(微孔板法)：各取25μL标准品和待测样品加入到微孔板中。每孔加入200μLBCA工作液(A液：B液＝50：1混合即为工作液)震荡30s充分混匀。盖上微孔板，37℃孵育30min。冷却至室温，在酶标仪上的570nm处检测吸光度。根据BSA标准品的吸光度(减去标准孔空白孔德OD值即为最终读数)，绘制标准曲线(X-蛋白浓度ug/ml；Y-最终的OD值)。根据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度；

2.3蛋白变性：在室温中溶解SDS-PAGE上样缓冲液(5×)，按照每4μL蛋白样品加入1μL上样缓冲液(5×)的比例，混合蛋白样品和上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和上样缓冲液。将混合液置于金属浴锅中100℃加热5min,以充分变性；

2.4加样：将8％SDS-PAGE预制胶(碧云天:P0688)固定到电泳装置中，并在装置中加满Running Buffer(称取14.4g Glycine、3.02gTris Base、1gSDS到1L烧杯中，加入0.8L蒸馏水，放到搅拌器上搅拌溶解，充分溶解后，定容至1L)，小心拔下梳子。向上样孔中加入30μg的已变性的蛋白样品，向Marker孔中加入5μL Marker；

2.5电泳：将电泳装置与电源连接，调节电压(上层：5％浓缩胶电压80V,电泳30min；下层：8％分离胶电压80V,电泳90min),直至溴酚兰接近分离胶的底部，然后关闭电源并撤去连接的导线；

2.6转膜(湿转)：小心取出电泳凝胶，切去浓缩胶后将凝胶放入转膜液中。将TransferBuffer(称取14.4g Glycine、3.02gTris Base到1L烧杯中，加入0.6L蒸馏水，放到搅拌器上搅拌溶解，充分溶解后，加入0.2L methanol,定容至1L)放入大饭盒内，泡入2片海绵、2片滤纸、1片PVDF膜(PVDF膜事先于甲醇中活化30S，取出置于转膜液中)，按照1层海绵+1层滤纸+凝胶+PVDF膜+1层滤纸+1层海绵的顺序组装转膜装置；将组装好的装置放入电转槽，合上盖子，接通电源，4℃180mA电泳70min；

2.7封闭：转膜完毕后，取下PVDF膜用封闭液(5％脱脂奶粉)室温封闭2h；

2.8孵育一抗：封闭结束后，根据目的蛋白分子量将膜剪切下来，加入用1×TBST稀释好的一抗E-cadherin Rabbit mAb(CST:3195T)、N-cadherin Rabbit mAb(CST:13116)、Slug Rabbit mAb(CST:9585T)、GAPDH Rabbit mAb(BIOSS:bs-2188R)，4℃孵育过夜；

2.9洗膜：用TBST洗涤3次，每次10min；

2.10孵育二抗Goat Anti-Rabbit IgG/HRP(BIOSS)：加入用1×TBST稀释好的二抗(二抗为一抗对应的抗体，如一抗为鼠抗，二抗为山羊抗鼠，如一抗为兔抗，二抗则为山羊抗兔)，二抗稀释倍数根据抗体说明书的作用浓度进行稀释，室温孵育1h；

2.11洗膜：用TBST洗涤3次，每次10min；

2.12显影：将膜浸入超敏ECL化学发光底物工作液(四正柏生物)中,放入天能凝胶成像系统4200中显影；

FaDu与CAL 27细胞keratin 5敲降前后上皮(E)/间质(M)相关指标蛋白表达变化的western blot结果见图2：

从图2的结果可以看出：人头颈鳞癌细胞FaDu与CAL 27在keratin 5敲降后，上皮标记蛋白E-cadherin表达显著下调，间质标记蛋白N-cadherin及Slug蛋白显著上调。揭示keratin 5敲降使得上皮细胞FaDu与CAL 27在仍保持上皮特性的同时，获得了间充质样特性，展现出hybrid E/M(混合上皮/间充质表型)细胞表型的蛋白表达。

实施例3：流式检测敲降前后干细胞表面标记

3.1样品制备：消化收集细胞到15mL离心管中，用预冷PBS重悬细胞，800rpm 3min离心洗涤细胞3次，PBS重悬细胞调整浓度为1×10⁷/mL，将细胞转入流式管中，每管加入100μL细胞悬液，每个样品转入4只流式管分别为：阴性对照、PE-CD24单染、FITC-CD44单染、PE-CD24和FITC-CD44双染。

3.2抗体孵育：向流式管中分别加入5μL相应的荧光抗体FITC MouseIgG1 kisotype Ctrl(BioLegend：400108)、PE MouseIgG2a k isotype Ctrl(BioLegend：400212)、PE anti-humanCD24(BioLegend：311106)、FITC anti-humanCD44(BioLegend：338804),4℃避光孵育40分钟。加入1mL预冷PBS 1200rpm 3min离心洗涤3次，加入500μLPBS重悬细胞。

3.3上机检测：将样品于BD FACSCCantoⅡ流式检测仪上进行检测。

FaDu与CAL 27细胞keratin 5敲降前后干细胞表面标记流式分析结果如图3所示，从图3的结果可以看出：人头颈鳞癌细胞FaDu与CAL 27在keratin 5敲降后干细胞表面标记CD44⁺CD24^-的表型细胞亚群比例显著提高，分别从5.17±2.71％和30.63±5.83％提高至19.37±8.29％和69.03±1.07％，揭示keratin 5敲降后FaDu与CAL 27细胞干性显著增强。实施例4：敲降前后干细胞上清中IL-6的ELISA分析、VEGFA表达及Stat3信号通路蛋白表达分析

4.1 Human IL-6ELISA Kit(BOSTER:EK0410)检测敲降前后干细胞上清中IL-6

4.1.1样品制备：消化收集细胞，进行细胞计数，将细胞接种于24孔板中，每孔接种1×10⁵个细胞，接种完毕将孔板放到37℃、5％CO2细胞培养箱(Thermo)中培养24h；次日将培养基换成1ml无血清培养基继续培养24h。离心收集上清；

4.1.2样品稀释：FaDu上清按照1：10稀释，90μL样品稀释液加10μL上清；CAL 27上清按照1：1稀释，即100μL样品稀释液加100μL上清；

4.1.3标准品的制备:取1mL样品稀释液加入10ng的标准品管内，盖好后静置15分钟，反复颠倒以助溶，溶解完全后即得10000pg/mL的标准品。取30μL 10000pg/mL的标准品加入有970μL样品稀释液的EP管中，混匀即得300pg/mL的标准品。准备6只EP管，每管加入300μL样品稀释液,分别标记好150pg/mL，75pg/mL,37.5pg/mL,18.75pg/mL,9.38pg/mL,4.69pg/mL,取300μL 300pg/ml标准品加入标记150pg/ml的管中，混匀后同样取出300μL加入下一管，余此类推，直到最后一只样品管；

4.1.4确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数＝(样品数+9)*3，其余板孔包装好放入冰箱保存。

300pg/mL,150pg/mL,75pg/mL,37.5pg/mL,18.75pg/mL,9.38pg/mL,4.69pg/mL的标准品各100μL依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液作为零孔。其余加入100μL稀释好的上清样品；

4.1.5标酶板加上封板膜，37℃反应90分钟；

4.1.6甩去板内液体，对着吸水纸拍几下，不洗；

4.1.7将准备好的生物素抗人IL-6抗体工作液(1μL生物素标记抗人IL-6加99μL抗体稀释液，轻轻混匀)按每孔100μL依次加入(TMB空白显色孔除外)。标酶板加上封板膜，37℃反应60分钟；

4.1.8每孔加入300μL 1×洗涤缓冲液洗涤3次；

4.1.9将准备好的ABC工作液(1μLABC亲和素-过氧化物酶复合物加99μLABC稀释液，轻轻混匀。)按每孔100μL依次加入(TMB空白显色孔除外)。标酶板加上封板膜，37℃反应30分钟；

4.1.10每孔加入300μL 1×洗涤缓冲液洗涤5次；

4.1.11每孔加入90μL TMB显色液，37℃避光反应20分钟；

4.1.12每孔加入100μL终止液终止反应，此时蓝色溶液变成黄色；

4.1.13用酶标仪在450nm检测OD值；

4.1.14根据标准品的OD值做出标准曲线；

4.1.15根据样品的吸光值在标准曲线的坐标上找出相应IL-6的浓度，并乘以相应的稀释倍数。

4.2Western Blot检测敲减前后VEGFA及Stat3信号通路蛋白表达

4.2.1提取蛋白：消化收集细胞，用预冷1×PBS重悬细胞，600g离心5min收集细胞，尽量吸尽上清，加入预冷的增强型RIPA裂解液(BOSTER：AR0102-30)5×10⁶个细胞加入500μL裂解液，用移液枪吹打数下，冰上孵育30min,12000rpm离心20min,取上清，即为蛋白提取物。

4.2.2BCA试剂盒(BOSTER:AR0146)检测蛋白浓度(微孔板法)：各取25μL标准品和待测样品加入到微孔板中。每孔加入200μLBCA工作液(A液：B液＝50：1混合即为工作液)震荡30s充分混匀。盖上微孔板，37℃孵育30min。冷却至室温，在酶标仪上的570nm处检测吸光度。根据BSA标准品的吸光度(减去标准孔空白孔德OD值即为最终读数)，绘制标准曲线(X-蛋白浓度ug/ml；Y-最终的OD值)。根据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。

4.2.3蛋白变性：在室温中溶解SDS-PAGE上样缓冲液(5×)。按照每4μL蛋白样品加入1μL上样缓冲液(5×)的比例，混合蛋白样品和上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和上样缓冲液。将混合液置于金属浴锅中100℃加热5min,以充分变性。

4.2.4加样：将8％SDS-PAGE预制胶(碧云天：P0688)固定到电泳装置中，并在装置中加满Running Buffer(称取14.4g Glycine、3.02gTris Base、1gSDS到1L烧杯中，加入0.8L蒸馏水，放到搅拌器上搅拌溶解，充分溶解后，定容至1L)，小心拔下梳子。向上样孔中加入30μg的已变性的蛋白样品，向Marker孔中加入5μL Marker。

4.2.5电泳：将电泳装置与电源连接，调节电压(上层：5％浓缩胶电压80V,电泳30min；下层：8％分离胶电压80V,电泳90min),直至溴酚兰接近分离胶的底部，然后关闭电源并撤去连接的导线。

4.2.6转膜(湿转)：小心取出电泳凝胶，切去浓缩胶后将凝胶放入转膜液中。将Transfer Buffer(称取14.4g Glycine、3.02gTris Base到1L烧杯中，加入0.6L蒸馏水，放到搅拌器上搅拌溶解，充分溶解后，加入0.2L methanol,定容至1L)放入大饭盒内，泡入2片海绵、2片滤纸、1片PVDF膜(PVDF膜事先于甲醇中活化30S，取出置于转膜液中)，按照1层海绵+1层滤纸+凝胶+PVDF膜+1层滤纸+1层海绵的顺序组装转膜装置。将组装好的装置放入电转槽，合上盖子，接通电源，4℃180mA电泳70min。

4.2.7封闭：转膜完毕后，取下PVDF膜用封闭液(5％脱脂奶粉)室温封闭2h。

4.2.8孵育一抗：封闭结束后，根据目的蛋白分子量将膜剪切下来，加入用1XTBST稀释好的一抗VEGFA Mouse Monoclonal antibody(proteintech:66828-1-Ig)、P-Stat3RabbitmAb(CST:Y705)、Stat3 Mouse mAb(CST:124H6)、GAPDH Rabbit mAb(BIOSS)，4℃孵育过夜。

4.2.9洗膜：用1×TBST(称取2.42g Tris Base、8gNacl到1L烧杯中，加入0.8L蒸馏水，放到搅拌器上搅拌溶解，充分溶解后，加入1mL Tween-20，用浓盐酸调PH至7.6，加水定容至1L)洗涤3次，每次10min。

4.2.10孵育二抗Goat Anti-Mouse IgG/HRP(BIOSS)、Goat Anti-Rabbit IgG/HRP(BIOSS)：加入用1×TBST稀释好的二抗(二抗为一抗对应的抗体，如一抗为鼠抗，二抗为山羊抗鼠，如一抗为兔抗，二抗则为山羊抗兔)，二抗稀释倍数根据抗体说明书的作用浓度进行稀释，室温孵育1h。

4.2.11洗膜：用TBST洗涤3次，每次10min。

4.2.12显影：将膜浸入超敏ECL化学发光底物工作液(四正柏生物:4AW011-100)中,放入天能凝胶成像系统4200中显影。

FaDu与CAL 27细胞keratin 5敲降前后干细胞上清中IL-6的ELISA分析实验结果(***p<0.001)，VEGFA表达及Stat3信号通路蛋白表达western blot结果如图4所示，

图4中ELISA实验结果显示：伴随着FaDu与CAL 27细胞在keratin 5敲降后干性的显著增强，与肿瘤细胞干性密切相关的细胞因子IL-6在细胞上清液中显著增加；Westernblot结果显示：血管内皮生长因子A(VEGFA)表达显著提高，同时与IL-6密切相关Stat3信号通路重要蛋白Stat3与phospho-Stat3表达均显著提高，提示该信号通路被激活。

实施例5：敲降前后体外迁移划痕实验

5.1培养板画线标记：用marker笔在6孔板背后用直尺比着画横线，每孔穿过5条线，每条线均匀且平行；

5.2细胞铺板：在孔内均匀地接种5×10⁵个细胞，将孔板置于37℃,5％C02培养箱培养过夜；

5.3细胞划线：待细胞铺满板底后，用20μL枪头，垂直孔板背后的黑线划痕，使划痕与标记线相交；

5.4洗涤细胞，去除划下的细胞：划线完成后，使用无菌的PBS洗涤细胞2-3次，去除划下的细胞，使留下的间隙肉眼清晰可见，然后更换1％低血清培养基；

5.5细胞拍照：在显微镜下观察并选取3-4个划痕区进行拍照记录并做好标记(便于24h后拍照时一一对应)；

5.6细胞培养与观察：将细胞放入37℃,5％C02培养箱培养，24h后取出孔板，在显微镜下观察，并与修复前的划痕区一一对应拍照记录；

5.7数据分析：使用ImageJ软件打开图片后，计算细胞修复前后的划痕区面积；

FaDu与CAL 27细胞keratin 5敲降前后体外迁移划痕实验结果如图5所示，

图5的结果显示：与敲降前相比较，FaDu与CAL 27细胞在keratin 5敲降后细胞体外迁移能力显著增强(**p<0.01)。

实施例6：敲降前后体外侵袭transwell实验

6.1铺基质胶：在4℃条件下将Matrigel胶用无血清的细胞培养基或PBS缓冲液按照1：8比例稀释(其稀释比例需要摸索，选择一个细胞穿过适中的浓度即可)，取50μL均匀涂抹于上室的聚碳酸酯膜表面，37℃放置1h，使其聚合成凝胶；

6.2细胞培养：取对数生长期的细胞，并用PBS洗涤2次，接着用无血清培养基悬浮细胞，调整细胞密度为10×10⁵/mL；

6.3接种细胞：在24孔板下室加入700μL含10％FBS的培养基，然后用镊子将Transwell小室置于24孔板内，取细胞悬液150μL加入上室，最后放入细胞培养箱(Thermo)中培养48h；

6.4细胞固定：取出小室，吸走培养基，用棉签轻轻擦拭Matrigel和上室内的细胞。取新的24孔板加入4％多聚甲醛600μL，将小室放入后固定20-30min；

6.5细胞染色及计数：弃固定液，用0.1％结晶紫染色5-10min，PBS洗3遍，除去未与细胞结合的结晶紫，用棉签轻轻擦拭小室的上侧，将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉，以便后续镜检。适当风干后，在高倍显微镜下选取5个视野观察细胞并计数；

FaDu与CAL 27细胞keratin 5敲降前后体外侵袭transwell实验结果如图6所示，

图6的体外侵袭transwell实验结果显示：与敲降前相比较，FaDu与CAL 27细胞在keratin 5敲降后体外侵袭能力显著增强(**p<0.01)。

实施例7：CCK-8检测敲降前后肿瘤细胞对顺铂的药物敏感性

7.1细胞接种：消化收集对数期细胞，细胞计数后，调整细胞悬液浓度，使细胞浓度为5×10⁴/mL，每孔加入100ul细胞悬液于96孔培养板中，使每孔内的细胞数为5000个，将培养板放到37℃5％C0₂细胞培养箱(Thermo)进行培养；

7.2分组及加药：细胞培养24h后，将培养板分为调零组、对照组和实验组，吸出培养基，实验组加入不同浓度梯度的药物各200μL，调零组和对照组各加200μL不含药物的培养基，37℃5％C0₂培养箱进行培养；

7.3CCK-8(四正柏生物:FXP132-3000)呈色：待药物作用48h，于显微镜下观察细胞生长情况后，吸掉培养基,向每孔加入10％CCK-8溶液100μL，细胞培养箱(Thermo)内孵育1小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度；

7.4计算与分析：按照公式计算顺铂对FaDu与CAL 27细胞增殖率的影响。细胞增殖抑制率＝[1-(实验组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)]x100％；

FaDu与CAL 27细胞keratin 5敲降前后对顺铂的药物敏感性CCK-8实验结果如图7所示，

图7的CCK-8实验结果显示：FaDu与CAL 27在keratin 5敲降后对顺铂的敏感性显著降低，耐药性显著增强。IC50分别从1.79μM和2.11μM增加至2.54μM和6.62μM，提示细胞干性增强伴随的耐药性增强。

实施例8：敲降前后NF-κb信号通路蛋白表达及肿瘤细胞对PDTC的敏感性检测

8.1敲降前后NF-κb信号通路蛋白表达检测

8.1.1提取蛋白：消化收集细胞，用预冷1×PBS重悬细胞，600g离心5min收集细胞，尽量吸尽上清，加入预冷的增强型RIPA裂解液(BOSTER：AR0102-30)5×10⁶个细胞加入500μL裂解液，用移液枪吹打数下，冰上孵育30min,12000rpm离心20min,取上清，即为蛋白提取物；

8.1.2BCA试剂盒(BOSTER：AR0146)检测蛋白浓度(微孔板法)：各取25μL标准品和待测样品加入到微孔板中。每孔加入200μLBCA工作液(A液：B液＝50：1混合即为工作液)震荡30s充分混匀。盖上微孔板，37℃孵育30min。冷却至室温，在酶标仪上的570nm处检测吸光度。根据BSA标准品的吸光度(减去标准孔空白孔德OD值即为最终读数)，绘制标准曲线(X-蛋白浓度ug/ml；Y-最终的OD值)。根据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度；

8.1.3蛋白变性：在室温中溶解SDS-PAGE上样缓冲液(5×)。按照每4μL蛋白样品加入1μL上样缓冲液(5×)的比例，混合蛋白样品和上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和上样缓冲液。将混合液置于金属浴锅中100℃加热5min,以充分变性；

8.1.4加样：将8％SDS-PAGE预制胶(碧云天:P0688)固定到电泳装置中，并在装置中加满Running Buffer(称取14.4g Glycine、3.02gTris Base、1gSDS到1L烧杯中，加入0.8L蒸馏水，放到搅拌器上搅拌溶解，充分溶解后，定容至1L)，小心拔下梳子。向上样孔中加入30μg的已变性的蛋白样品，向Marker孔中加入5μL Marker；

8.1.5电泳：将电泳装置与电源连接，调节电压(上层：5％浓缩胶电压80V,电泳30min；下层：8％分离胶电压80V,电泳90min),直至溴酚兰接近分离胶的底部，然后关闭电源并撤去连接的导线；

8.1.6转膜(湿转)：小心取出电泳凝胶，切去浓缩胶后将凝胶放入转膜液中。将Transfer Buffer(称取14.4g Glycine、3.02gTris Base到1L烧杯中，加入0.6L蒸馏水，放到搅拌器上搅拌溶解，充分溶解后，加入0.2L methanol,定容至1L)放入大饭盒内，泡入2片海绵、2片滤纸、1片PVDF膜(PVDF膜事先于甲醇中活化30S，取出置于转膜液中)，按照1层海绵+1层滤纸+凝胶+PVDF膜+1层滤纸+1层海绵的顺序组装转膜装置。将组装好的装置放入电转槽，合上盖子，接通电源，4℃180mA电泳70min；

8.1.7封闭：转膜完毕后，取下PVDF膜用封闭液(5％脱脂奶粉)室温封闭2h；

8.1.8孵育一抗：封闭结束后，根据目的蛋白分子量将膜剪切下来，加入用1×TBST稀释好的一抗(一抗的稀释倍数根据抗体说明书的作用浓度进行稀释)4℃封闭过夜；

8.1.9洗膜：用1×TBST(称取2.42g Tris Base、8gNacl到1L烧杯中，加入0.8L蒸馏水，放到搅拌器上搅拌溶解，充分溶解后，加入1mL Tween-20，用浓盐酸调PH至7.6，加水定容至1L)洗涤3次，每次10min；

8.1.10孵育二抗：加入用1×TBST稀释好的二抗(二抗为一抗对应的抗体，如一抗为鼠抗，二抗为山羊抗鼠，如一抗为兔抗，二抗则为山羊抗兔)，二抗稀释倍数根据抗体说明书的作用浓度进行稀释，室温孵育1h；

8.1.11洗膜：用TBST洗涤3次，每次10min；

8.1.12显影：将膜浸入超敏ECL化学发光底物工作液(四正柏生物:4AW011-100)中,放入天能凝胶成像系统4200中显影。

8.2CCK-8检测敲降前后肿瘤细胞对PDTC的敏感性

8.2.1细胞接种：消化收集对数期细胞，细胞计数后，调整细胞悬液浓度，使细胞浓度为5×10⁴/mL，每孔加入100μL细胞悬液于96孔培养板中，使每孔内的细胞数为5000个，将培养板放到37℃5％C0₂细胞培养箱(Thermo)进行培养；

8.2.2分组及加药：细胞培养24h后，将培养板分为调零组、对照组和实验组，吸出培养基，实验组加入不同浓度梯度的药物各200μL，调零组和对照组各加200μL不含药物的培养基，37℃5％C0₂细胞培养箱(Thermo)进行培养；

8.2.3CCK-8(四正柏生物)呈色：：待药物作用48h，于显微镜下观察细胞生长情况后，吸掉培养基,向每孔加10％CCK-8溶液100μL，细胞培养箱(Thermo)内孵育1小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度；

8.2.4计算与分析：按照公式计算PDTC对FaDu与CAL 27细胞增殖率的影响。细胞增殖抑制率＝[1-(实验组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)]×100％；

FaDu与CAL 27细胞keratin 5敲降前后NF-κb信号通路蛋白表达western blot结果及PDTC敏感性CCK-8实验结果如图8所示，

图8中Western blot结果显示：FaDu与CAL 27细胞keratin 5敲降后，NF-κb信号通路蛋白p65和pp65表达上调，特别是pp65显著上调，证实NF-κb信号通路激活。使用NF-κb信号通路抑制剂PDTC作用细胞后，图8中的CCK-8实验结果显示：keratin 5敲降后呈现混合E/M表型的细胞对PDTC的敏感性显著增强，IC50分别从28.92μM和16.41μM降低至15.06μM和11.43μM。证明混合E/M表型细胞对NF-κb信号通路依赖性增强，与文献报道的NF-κb信号与干细胞相关性相一致。

实施例9：敲降前后FaDu与CAL 27细胞裸鼠体内成瘤实验

9.1实验准备：购置4周龄BALB/c裸鼠。饲养于四川省肿瘤医院.肿瘤研究所动物房中。对照组scramble细胞株、Krt5基因敲降细胞株进行2D培养，并在显微镜下密切观察肿瘤细胞形态。

9.2小鼠接种(FaDu：2×10⁶/100μL/只CAL 27：1×10⁷/100μL/只)：消化收集细胞，计数，用无菌预冷PBS洗涤细胞，800rpm 3min,洗涤三次,用无菌预冷PBS将细胞稀释成2×10⁶/100μL或1×10⁷/100μL。取6周龄、体重20±2g BALB/c小鼠，随机分为两组，分别为对照组，KRT5组，在小鼠右后肢根部背侧皮下接种100μL细胞悬液。

9.3测量观察：观察小鼠成瘤情况，出现肉眼可见瘤体时开始用游标卡尺进行测量，每周测2-3次并记录瘤体大小。瘤体大小用如下公式：V＝(π/6)*W2*I，式中W、I分别为瘤体的短直径和长直径。

9.4取瘤称重并拍照：将小鼠于工作台行颈椎脱臼法处死，后剖出瘤体，瘤体进行称重并拍照。

keratin 5敲降前后FaDu与CAL 27细胞裸鼠体内成瘤实验结果如图9所示，

图9的裸鼠体内成瘤实验结果显示，keratin 5敲降后FaDu与CAL 27细胞的体内成瘤能力显著增强。与scramble对照组相比，shKRT5组瘤重与瘤体积均显著提高，且具有统计学意义。

实施例10：敲降前后FaDu与CAL 27细胞裸鼠尾静脉注射体内侵袭转移实验

10.1实验准备：购置4周龄BALB/c裸鼠。饲养于四川省肿瘤医院.肿瘤研究所动物房中。对照组scramble细胞株、Krt5基因敲降细胞株进行2D培养，并在显微镜下密切观察肿瘤细胞形态。

10.2制备细胞悬液：消化收集细胞，计数，用无菌预冷PBS洗涤细胞，800rpm 3min,洗涤三次,用无菌预冷PBS将细胞稀释成2×10⁶/300μL。

10.3裸鼠接种(2×10⁶/300μL/只)：取6周龄，体重20±2g BALB/c小鼠，随机分为两组，分别为对照组、KRT5组。在超净工作台上，将裸鼠固定在固鼠器内，压住裸鼠尾巴根部，用酒精棉球擦拭尾巴消毒并扩张血管，用1mL注射器吸取单细胞悬液，于尾部中外三分之一处进针，控制注射速度，每只注射300uL即每只2×10⁶个细胞。

10.4结果观察：肿瘤细胞接种21天后处死并解剖小鼠，观察脏器有无转移灶。统计各部位的转移灶数目及大小。

keratin 5敲降前后FaDu与CAL 27细胞裸鼠尾静脉注射体内侵袭转移实验结果如图10所示，

图10的裸鼠尾静脉注射体内侵袭转移实验结果显示：keratin 5敲降显著增强了FaDu与CAL 27细胞的肝转移能力，与scramble对照组相比，shKRT5组裸鼠肝转移发生率及转移灶数量均显著提高，且具有统计学意义。

实施例11：临床数据分析验证

使用R software(version 3.5.1)对数据集GSE65858和TCGA数据库中头颈鳞癌患者的基因表达数据进行分析，GSE65858数据集和TCGA头颈鳞癌样本数据分析keratin 5表达与头颈鳞癌患者淋巴结转移的相关性结果如图11所示，从图11可以看出：淋巴结转移(N+)与keratin 5的表达降低显著相关(分别为p＝0.0135，p＝0.00418)。这一结果与裸鼠体内侵袭转移实验结果相一致，进一步证明了keratin 5的表达下调与头颈鳞癌上皮细胞间质特征增强，侵袭转移能力增强之间的相关性。

以上为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于keratin 5双向调控功能的混合上皮间充质表型肿瘤细胞模型，其特征在于：所述模型为对上皮型细胞进行keratin 5的基因敲降后获得的稳定的混合E/M表型细胞模型。

2.权利要求1所述的基于keratin 5双向调控功能的混合上皮间充质表型肿瘤细胞模型的构建方法，其特征在于：对上皮型细胞进行keratin 5的基因敲降时采用分别具有如SEQ.ID NO:1、SEQ.ID NO:2和SEQ.ID NO:13所示核苷酸序列的shKRT5-1、shKRT5-2、shKRT5-3的shRNA干扰载体进行敲降。

3.根据权利要求2所述的基于keratin 5双向调控功能的混合上皮间充质表型肿瘤细胞模型的构建方法，其特征在于，具体构建步骤包括：

(1)重组序列的合成及shKRT5质粒的构建与鉴定；

(2)扩增shKRT5-1、shKRT5-2、shKRT5-3单克隆菌液；

(3)Hispeed Plasmid Midi kit试剂盒抽提shKRT5质粒；

(4)慢病毒包装；

(5)肿瘤细胞转染及阳性筛选。

4.根据权利要求3所述的基于keratin 5双向调控功能的混合上皮间充质表型肿瘤细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)包括：

(1)LB液体培养基的配制：称量酵母粉0.5g、蛋白胨1g、氯化钠1g到锥形瓶内，加入100mL蒸馏水,用纱布包好锥形瓶口，121℃高温灭菌20分钟，冷却后加入100μL氨苄青霉素；

(2)将配制好的LB液体培养基于250rpm，37℃摇床摇床上孵育0.5h；

(3)取200μL shKRT5-1、shKRT5-2、shKRT5-3单克隆菌液；分别接种于3个含有LB液体培养基的锥形瓶中，置于250rpm，37℃摇床摇床；上振摇过夜。

5.根据权利要求3所述的基于keratin 5双向调控功能的混合上皮间充质表型肿瘤细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)包括：

(1)将菌液收集到50mL离心管中，放到离心机4℃6000g离心15min去上清；

(2)加入6mL P1溶液反复吹打混匀至沉淀完全溶解，加入6mL P2溶液，盖上离心管盖子颠倒混匀4-6次，室温放置5min，若加入LyseBlue液体直至液体变成蓝色；

(3)加入6mL P3溶液颠倒混匀，直至液体变成无色，将溶液倒入QIA滤筒中，室温孵育10min；

(4)准备QIAGEN-tip柱，加入4mL QBT缓冲液使其自然流下，待QBT缓冲液流完后将QIA滤筒中的液体加压过滤到tip柱里让其自然过滤；

(5)加入20mL QC洗涤tip过滤柱；

(6)加入5mL QF洗脱并收集质粒DNA于一干净15mL离心管中；

(7)加入3.5mL异丙醇颠倒混匀，室温放置5min；

(8)将溶液用过滤膜进行过滤使质粒DNA吸附在滤膜上，加入2mL 70％乙醇过滤洗涤滤膜，重复洗涤2次；

(9)加入800μL的DEPC水溶解DNA，通过Nano Drop检测质粒浓度。

6.根据权利要求3所述的基于keratin 5双向调控功能的混合上皮间充质表型肿瘤细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)包括：

(1)离心收集293T细胞，细胞计数，将细胞接种于10cm平皿，每皿接种200万个细胞，37℃5％C0₂细胞培养箱培养24h备用；

(2)按照病毒质粒:dR8.9:VSV-G＝3:2.7:0.3的比例制备病毒质粒混合液，接着向质粒混合液中加入580μL opti-MEM，室温放置5min，加入18μL X-tremeGene HP DNATransfection Reagent室温孵育15min，孵育完毕后将混合液加入到293T细胞中，37℃5％C0₂细胞培养箱培养10h后，换为20％FBS完全培养基；

(3)24h后第一次收集上清到15mL离心管中，-80℃冻存，加入9mL 20％FBS完全培养基继续培养48h后第二次收集上清，并与第一次收集的上清混合，1500rpm离心5min，收集上清并分装，分装后-80℃冻存备用。

7.根据权利要求3所述的基于keratin 5双向调控功能的混合上皮间充质表型肿瘤细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)包括：

(1)消化收集肿瘤细胞，细胞计数，将细胞接种于10cm平皿，每皿接种20万个细胞，加入完全培养基后放入37℃5％C0₂细胞培养箱培养24h；

(2)取一只15mL离心管，在离心管中加入9mL无双抗10％FBS的培养基、1mL包装病毒、10μL浓度10μg/mL的polybrene，混匀后加到铺有肿瘤细胞的培养皿中，孵育培养；

(3)转染24h后，将培养基换成含青霉素-硫酸链霉素和puromycin 2μg/mL新鲜完全培养基进行筛选。

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