WO2021123627A1 - Variants de l'adalimumab au potentiel immunogène réduit - Google Patents

Variants de l'adalimumab au potentiel immunogène réduit Download PDF

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WO2021123627A1
WO2021123627A1 PCT/FR2020/052485 FR2020052485W WO2021123627A1 WO 2021123627 A1 WO2021123627 A1 WO 2021123627A1 FR 2020052485 W FR2020052485 W FR 2020052485W WO 2021123627 A1 WO2021123627 A1 WO 2021123627A1
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substitution
substitutions
sequence
cdrh3
variant
Prior art date
Application number
PCT/FR2020/052485
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Hervé NOZACH
Coline SIVELLE
Raphaël SIEROCKI
Bernard Maillere
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Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the invention relates to variants of adalimumab with reduced immunogenic potential and preserved or increased affinity and their therapeutic applications.
  • Adalimumab is now widely used in the treatment of ankylosing spondylitis, rheumatoid arthritis, ulcerative colitis, psoriatic arthritis, Crohn's disease, skin psoriasis and juvenile arthritis (Feldmann , M. & Maini, Nat. Med. 9, 1245-1250 (2003)).
  • Adalimumab is, however, immunogenic in a significant proportion of patients (up to 50% for certain conditions) who produce antibodies directed against the therapeutic protein (ADA for anti-drug antibody), which can be detected in the serum (Strand, V. et al., BioDrugs 31, 299-316 (2017)). ADAs cause the formation of immune complexes that accelerate the elimination of therapeutic antibodies.
  • ADA inversely correlated with the response to treatment. Patients with a good response to treatment will be those in whom tests do not reveal ADA (van Schouwenburg, PA, Rispens, T. & Wolbink, GJ, Nat. Rev. Rheumatol. 9, 164-172 (2013)) .
  • de-immunization The removal of T epitopes by disrupting the interaction with HLA II molecules, called de-immunization, has been shown as an effective method for reducing the immunogenicity of various proteins for therapeutic purposes, such as enzymes and immunotoxins (Mazor, R. et al. Oncotarget 7, 29916-29926 (2016); Cantor, JR et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 1272-1277 (2011); Ettinger, RA et al. , Blood Adv. 2, 309-322 (2016); Mazor, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, E3597-603 (2012)).
  • T epitopes have previously been identified in the sequence of adalimumab (Meunier, S. et al., Cellular & Molecular Immunology, 2019, Oct 28. doi: 10.1038 / s41423-019-0304-3). These are mainly located on the heavy chain of the antibody on which they are divided into two regions. The first region concentrates the majority of T epitopes and is very overlapping with CDR-H3 (residues L82c to T107 according to Kabat numbering; Figure 1).
  • the second region is located at CDR-H2 and has two T epitopes ( residues E46 to E64 according to the Kabat numbering; Figure 1) These T epitopes are potentially responsible for the immunogenicity of adalimumab. As this has significant repercussions for patients, the development of alternatives that are less immunogenic than adalimumab seems a necessity.
  • variants of adalimumab in which the framework regions (FR) of the variable domains of the heavy and light chains have been replaced by less immunogenic framework regions of other human immunoglogulins G (IgG) are described in Application EP 3 178847. Such variants do not have a de- satisfactory immunization for therapeutic use since they comprise the majority of T epitopes present in CDRs.
  • Adalimumab variants comprising mutations in a region containing putative CD4 T epitopes extending on either side of CDR1 of the light chain (CDR-L1; positions C23 to K45, according to the numbering of Kabat) are described in Application WO 2010/121140.
  • CDR-L1 positions C23 to K45, according to the numbering of Kabat
  • all the variants obtained have a reduced affinity for TNF-alpha compared to adalimumab, this reduction in affinity being drastic (at least 50%). for the majority (70%) of the variants obtained.
  • the inventors have identified mutations in the immunogenic regions overlapping the CDR-H2 (or CDRH2) and CDR-H3 (or CDRH3) regions of adalimumab which reduce immunogenicity while retaining the affinity of binding to TNF -alpha. From combinatorial libraries, they isolated variants which surprisingly exhibit a reduced immunogenic potential and a TNF-alpha binding affinity greater than that of adalimumab. Some of the variants have an affinity 5 to 50 times that of adalimumab. Since the biological activity of anti-TNF antibodies - namely the neutralization of TNF-alpha - depends on their affinity for TNF, the variants of the invention can be expected to have a higher biological activity. to that of adalimumab.
  • the present invention relates to a variant of an anti-TNF-alpha therapeutic antibody comprising variable domains VFI and VL of sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, said variant comprising at least two amino acid substitutions in at least one sequence overlapping one of the CDRH2 or CDRH3 regions determining the complementarity of said VH variable domain; said at least two substitutions of amino acids in the sequence overlapping the CDRH2 region being selected from the group consisting of:
  • T52 by another amino acid chosen from A, N or S; preferably N or S;
  • T100 by another amino acid chosen from P or S; excluding variants comprising residues V89 or L89, V95, K96, Y97, L98, P99 and S100; V89, V95, A96, Y97, L98, P99 and S100; the positions of said amino acid residues being indicated with reference to the Kabat numbering; and said variant exhibiting a reduced immunogenic potential and a binding affinity for TNF-alpha at least equal to or greater, with respect to the anti-TNF-alpha therapeutic antibody from which it is derived.
  • said variant comprises at least 3 substitutions in one of the sequences overlapping the CDRFI2 or CDRFI3 region; preferably in each of said sequences overlapping the CDRFI2 and CDRH3 regions.
  • said variant comprises a combination of substitutions in the sequence overlapping the CDRFI2 region chosen from: - S54G and I57R;
  • I57Q or I57N optionally A50T, A50G or A50S;
  • said variant comprises a combination of substitutions in the sequence overlapping the CDRH2 region chosen from:
  • said variant comprises a combination of substitutions in the sequence overlapping the CDRH3 region chosen from:
  • said variant comprises a combination of substitutions in the sequence overlapping the CDRH3 region chosen from:
  • V89L, V95T, S96K and S99P V95T, S96K, S99P and T100S; V95T, S96R L98T and S99P; V89L, V95T, S96R and S99P; V89L; V95T, S96T and S99P;
  • V95T, S96K, S99P and T1 OOS V89L, V95T, S96R, S99P and T1 OOS.
  • said variant comprises a combination of substitutions in the sequence overlapping the CDRH3 region chosen from: V95T, S96T and S99P; V95T, S96N and S99P; V95S, S96Q and S99P; V95A, S96H and S99P; V95T, S96G and S99P; S96T, L98T, S99P and T100S; V95T, S96R, L98T and S99P; S96K, S99P and T100P; V89L, V95T, S96T and S99P; preferably chosen from: V95T, S96T and S99P; V95T, S96N and S99P; V95S, S96Q and S99P; V95A, S96H and S99P; V89L, V95T, S96T and S99P.
  • said variant comprises one of the following combinations of substitutions in the sequences overlapping the CDRH2 and CDRH3 regions:
  • said variant further comprises the R90K substitution in the CDRL3 region determining the complementarity of the VL variable domain.
  • said variant comprises a human IgG heavy chain and a human Kappa light chain.
  • said variant is derived from adalimumab.
  • said variant comprises a light chain of sequence SEQ ID NO: 2 or 32 and a heavy chain of sequence SEQ ID NO: 24 to 31.
  • Another aspect of the invention relates to an expression vector comprising a polynucleotide encoding a variant according to the invention.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one variant according to the invention or a vector according to the invention, and a pharmaceutically acceptable vehicle and / or a carrier substance.
  • Another aspect of the invention relates to a composition according to the invention, for use in the treatment of an inflammatory or autoimmune disease.
  • the present invention relates to a variant of an anti-TNF-alpha therapeutic antibody comprising VH and VL variable domains of sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, which variant comprising a reduced immunogenic potential and a binding affinity for TNF-alpha at least equal to or greater, relative to the anti-TNF-alpha therapeutic antibody from which it is derived. Due to its binding affinity at least equal or greater, one can expect that the variant according to the invention has a biological activity at least equal to or greater than that of the parent antibody.
  • sequence SEQ ID NO: 1 corresponds to the sequence of the heavy chain variable domain (VH) of adalimumab and the sequence SEQ ID NO: 2 to the sequence of the light chain variable domain (VL) of the adalimumab ( Figure 1).
  • sequence of the heavy chain of adalimumab corresponds to the sequence SEQ ID NO: 3
  • sequence of the light chain of adalimumab corresponds to the sequence SEQ ID NO: 4.
  • therapeutic antibody is understood to mean a human or humanized antibody.
  • antibody means a whole antibody, an antibody fragment comprising at least the domain of binding to the antigen or a molecule derived from an antibody.
  • TNF-alpha or TNFalpha (“Tumor Necrosis Factor Alpha”) is meant a multifunctional pro-inflammatory cytokine produced predominantly by monocytes and macrophages. Preferably, it is human TNF alpha.
  • Human TNF alpha corresponds to the GenBank sequence QCI55793.1.
  • immunogenic potential reduced relative to an antibody variant according to the invention means a decrease in the number of HLA II molecules which can be linked by at least one of the CD4 T epitopes of the variant compared to the parent antibody of which it is. issued.
  • the number of HLA II molecules which can be bound by a variant according to the invention is evaluated according to standard techniques known to those skilled in the art such as those described in particular in the examples. These include in silico methods using MHC-II binding prediction tools, such as the netMHCIIpan 3.2 algorithm. (Jensen, K. K. et al., Immunology 154, 394-406 (2016)). Binding to HLA II is expressed as a score defined by the following formula:
  • / is the first anchor position of the core and y is the allele for which the core is predicted.
  • the variant according to the invention is characterized by an HLA II binding score reduced by at least 10% (1.1 times or factor 1.1) relative to the parent antibody from which it is derived.
  • the binding affinity of the variant to TNF-alpha is evaluated according to standard techniques known to those skilled in the art such as those described in particular in the examples.
  • Affinity can be evaluated by the value of the equilibrium dissociation constant KD of the variant, measured by conventional techniques as described in the examples.
  • Affinity can also be evaluated by the relative enrichment factor of the variant with respect to the parent antibody which corresponds to the ratio between the enrichment values of the variant and of the parent antibody as defined in the examples.
  • the variant according to the invention is characterized by a relative enrichment factor greater than or equal to 5 or a KD at least 1.1 times less (less by a factor of 1, 1 or 10%) relative to the antibody parent he is from.
  • the term “individual” means a human or animal individual, preferably a human individual.
  • Amino acids are shown in a one-letter code.
  • a means at least one, and or means and / or.
  • said variant comprises at least two substitutions of amino acids in at least one sequence overlapping one of the CDRH2 or CDRH3 regions determining the complementarity of said VH variable domain.
  • the sequence overlapping the CDRH2 region extends from residues E46 to E64 according to the Kabat numbering (SEQ ID NO: 8).
  • the sequence overlapping the CDRH3 region extends from residues V89 to G104 according to the Kabat numbering (SEQ ID NO: 9).
  • Said variant advantageously comprises at least two substitutions in each of the two sequences overlapping the CDRH2 or CDRH3 region.
  • said variant comprises at least 3 substitutions, generally 3, 4 or 5 substitutions in one of the overlapping sequences; preferably, in each of the two sequences overlapping the CDRH2 and CDRH3 regions.
  • said at least two substitutions of amino acids in the sequence overlapping the CDRH2 region are selected from the group consisting of:
  • the variants according to the invention are functional variants, that is to say they comprise a reduced immunogenic potential and a binding affinity to TNF-alpha at least equal or greater, relative to the antibody anti-TNF-alpha therapy from which it is derived.
  • the invention excludes non-functional variants such as in particular variants comprising only two substitutions chosen from T52N and A50G or T52N and I57T.
  • - T52 is substituted by N or S;
  • - 157 is substituted by A, H, S, N, Q, R, T, preferably R, H, S or T.
  • said substitutions in the sequence overlapping the CDRH2 region are chosen from the substitutions in positions S49, A50, T52, S54, H56 and I57.
  • said substitutions are at positions S54 and I57; S49, T52 and I57; S49, S54 and I57; T52, S54 and I57; S49, A50, T52 and I57; S49, A50, S54 and I57; S49, T52, S54 and I57; A50, T52, S54 and I57; or S49, A50, T52, S54 and I57; preferably at positions S49, T52 and I57; S49, S54 and I57; T52, S54 and I57; S49, A50, S54 and I57; S49, T52, S54 and I57; A50, T52, S54 and I57; or S49, A50, T52, S54 and I57.
  • said variant comprises a combination of substitutions in the sequence overlapping the CDRH2 region chosen from:
  • I57Q or I57N optionally A50T, A50G or A50S;
  • said variant comprises a combination of substitutions in the sequence overlapping the CDRH2 region chosen from:
  • said variant comprises a combination of substitutions in the sequence overlapping the CDRH2 region chosen from:
  • Particularly preferred variants according to the invention comprise one of the following combinations of substitutions in the sequence overlapping the CDRH2 region: S49G, T52N, S54G and I57R; S49G, A50T, T52N, S54G and I57S; S49G, T52N, S54G and I57H; S49G, T52N and 157H; S49G, A50D, T52S, S54G and I57T.
  • said at least two substitutions of amino acids in the sequence overlapping the CDRH3 region are selected from the group consisting of:
  • S96 is substituted by T, Q, N or H.
  • said substitutions in the sequence overlapping the CDRH3 region are chosen from the substitutions in positions: V89, V95, S96, Y97, L98, S99 and T100.
  • said substitutions are at positions V89, V95, S96 and S99 or V95, S96 and S99.
  • said variant comprises a combination of substitutions in the sequence overlapping the CDRH3 region chosen from:
  • Said variant advantageously comprises a combination of substitutions in the sequence overlapping the CDRH3 region chosen from:
  • V89L, V95T, S96K and S99P V95T, S96K, S99P and T100S; V95T, S96R L98T and S99P; V89L, V95T, S96R and S99P; V89L; V95T, S96T and S99P;
  • V95T, S96K, S99P and T100S V89L, V95T, S96R, S99P and T100S.
  • said variant comprises a combination of substitutions in the sequence overlapping the CDRH3 region chosen from: V95T, S96T and S99P; V95T, S96N and S99P; V95S, S96Q and S99P; V95A, S96H and S99P; V95T, S96G and S99P; S96T, L98T, S99P and T100S; V95T, S96R, L98T and S99P; S96K, S99P and T1 OOP; V89L, V95T, S96T and S99P.
  • Particularly preferred variants according to the invention comprise one of the following combinations of substitutions in the sequence overlapping the CDRH3 region: V95T, S96T and S99P; V95T, S96N and S99P; V95S, S96Q and S99P; V95A, S96H and S99P; V89L, V95T, S96T and S99P.
  • said variant comprises at least two substitutions in each of the two sequences overlapping the CDRH2 or CDRH3 region as defined above.
  • said variant comprises a combination of substitutions in the sequence overlapping the CDRH2 region and a combination of substitutions in the sequence overlapping the CDRH3 region chosen from the combinations as defined above.
  • V95T, S96T and S99P V95T, S96N and S99P; V95S, S96Q and S99P; V95A, S96H and S99P; V89L, V95T, S96T and S99P.
  • Examples of particularly preferred variants according to the invention comprise one of the following combinations of substitutions in the sequences overlapping the CDRH2 and CDRH3 regions:
  • said variant further comprises the R90K substitution in the CDRL3 region determining the complementarity of the VL variable domain.
  • the variant according to the invention comprises a heavy chain of human immunoglobulin of any isotype or class, preferably an IgG, preferably an IgG 1.
  • the variant according to the invention also comprises a light chain d human immunoglobulin of any class, preferably human Kappa light chain.
  • said variant is derived from adalimumab.
  • said variant is selected from the group consisting of:
  • a variant of adalimumab comprising a light chain of sequence SEQ ID NO: 2 or 32 and a heavy chain of sequence SEQ ID NO: 24, corresponding to mutant 1 of the examples;
  • adalimumab comprising a light chain of sequence SEQ ID NO: 2 or 32 and a heavy chain of sequence SEQ ID NO: 25, corresponding to mutant 2 of the examples;
  • a variant of adalimumab comprising a light chain of sequence SEQ ID NO: 2 or 32 and a heavy chain of sequence SEQ ID NO: 26, corresponding to mutant 3 of the examples;
  • a variant of adalimumab comprising a light chain of sequence SEQ ID NO: 2 or 32 and a heavy chain of sequence SEQ ID NO: 27, corresponding to mutant 4 of the examples;
  • a variant of adalimumab comprising a light chain of sequence SEQ ID NO: 2 or 32 and a heavy chain of sequence SEQ ID NO: 28, corresponding to mutant 5 of the examples;
  • a variant of adalimumab comprising a light chain of sequence SEQ ID NO: 2 or 32 and a heavy chain of sequence SEQ ID NO: 29, corresponding to mutant 6 of the examples;
  • a variant of adalimumab comprising a light chain of sequence SEQ ID NO: 2 or 32 and a heavy chain of sequence SEQ ID NO: 30, corresponding to mutant 7 of the examples; and a variant of adalimumab comprising a light chain of sequence SEQ ID NO: 2 or 32 and a heavy chain of sequence SEQ ID NO: 31, corresponding to mutant 8 of the examples.
  • said variant is characterized by an HLA II binding score reduced by at least 1.5; 2; 2.5; 3; 3.5; 4; 4.5; 5 times or more of the parent antibody from which it is derived.
  • said variant is characterized by a relative enrichment factor of at least 10 1 to 10 7 (10 1 , 5.10 1 , 10 2 , 5.10 2 , 10 3 , 5.10 3 , 10 4 , 5.10 4 , 10 5 , 5.10 5 , 10 6 , 5. 10 6 , 10 7 ) or a KD at least 1.2 to 40 times lower (2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35) relative to the parent antibody from which it is derived.
  • the present invention also encompasses variants further comprising at least one additional amino acid mutation (insertion, deletion, substitution) and / or at least one conservative modification of function, that is to say which preserve the reduced immunogenic potential and greater or equal affinity of the variant.
  • additional mutations mention may be made in particular of:
  • the variant can be modified by the introduction of any conservative modification of function at the level of amino acid residue (s), of the peptide bond or of the ends of the peptides.
  • This or these modification (s), in particular one or more chemical modifications which are introduced into the peptides by conventional methods known to those skilled in the art include in particular; fusion of the sequence of said variant with that of a peptide (label useful for the purification of the variant, in particular in form cleavable by a protease) or of a protein of interest, and coupling to a molecule or a agent of interest.
  • the antibody can be coupled to a PEG molecule by conventional methods known to those skilled in the art.
  • the variant is in the form of a whole antibody, of an antibody fragment comprising at least the domain of binding to the antigen or of a molecule derived from an antibody.
  • the whole antibodies can be of any isotype, in particular of human isotype (IgG (lgG1, lgG2, lgG3, lgG4), IgA (lgA1, lgA2), IgE, IgM, IgD).
  • the antibody fragments include in particular the Fab, Fab ', F (ab') 2, Fv, scFv, Fabc or Fab fragments comprising a portion of the Fc region and the single chain antibody fragments derived from camelid immunoglobulins or shark (single domain antibody VHH and V-NAR).
  • Derived antibody molecules include polyspecific or multivalent antibodies and immunoconjugates.
  • multispecific scFvs dia, tria or tetrabodies
  • diabodies of the scDb single-chain diabodies
  • taFv tandem scFv fragments
  • minibodies are in particular of the scFv-HLX type; scFv-ZIP; scFv-CH3; scFv -Fc or other.
  • Another aspect of the present invention relates to an isolated polynucleotide encoding a variant in accordance with the invention as defined above.
  • Said polynucleotide is DNA, RNA or a mixture of DNA and RNA, recombinant or synthetic.
  • the DNA sequence can advantageously be modified so that the use of codons is optimal in the host in which it is expressed.
  • Another aspect of the present invention relates to a vector comprising said polypeptide.
  • Many vectors are known per se; the choice of an appropriate vector depends on the use envisaged for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of this sequence under extrachromosomal form, or integration into the chromosomal material of the host), as well as the nature of the host cell.
  • naked nucleic acids DNA or RNA
  • viral or bacterial vectors can be used.
  • the viral vectors are in particular the adenoviruses, the retroviruses, the lentiviruses and the AAVs in which the sequence of interest has been inserted beforehand; it is also possible to combine said sequence (isolated or inserted into a plasmid vector) with a substance allowing it to cross the membrane of host cells, such as a transporter such as a nanotransporter or a preparation of liposomes, or of cationic polymers, or else the 'introducing into said host cell using physical methods such as electroporation or microinjection. In addition, one can advantageously combine these methods, for example by using electroporation associated with liposomes.
  • said vector is an expression vector comprising all the elements necessary for the expression of the variant as defined above.
  • said vector comprises an expression cassette including at least one polynucleotide as defined above, under the control of appropriate transcriptional and possibly translation regulatory sequences (promoter, activator, intron, initiation codon ( ATG), stop codon, polyadenylation signal, splice site), to allow expression of the variant according to the invention in a host cell.
  • transcriptional and possibly translation regulatory sequences promoter, activator, intron, initiation codon ( ATG), stop codon, polyadenylation signal, splice site
  • Another aspect of the present invention relates to a prokaryotic or eukaryotic host cell modified with a polynucleotide or a vector in accordance with the invention as defined above, the cell possibly being modified in a stable or transient manner.
  • Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one derivative variant, polynucleotide, vector, and / or cell as defined above and a pharmaceutically acceptable vehicle and / or a carrier substance.
  • Pharmaceutically acceptable vehicles and carrier substances are those conventionally used.
  • the carrier substances are advantageously selected from the group consisting of: unilamellar or multilamellar liposomes, ISCOMS, virosomes, viral pseudoparticles, saponin micelles, microspheres solids of a saccharide (poly (lactide-co-glycolide)) or gold-bearing nature, and nanoparticles.
  • the pharmaceutical composition may further comprise at least one other therapeutic agent, in particular an anti-inflammatory or immunomodulatory agent.
  • the pharmaceutical composition comprises a therapeutically active amount of variant, polynucleotide, vector, cell.
  • a therapeutically active amount means a dose sufficient to produce a therapeutic effect on the disease to be treated, that is to say to reduce the symptoms of this disease. This effective dose is determined and adjusted depending on factors such as the age, sex and weight of the subject.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is in a galenic form suitable for the administration chosen.
  • the composition is generally administered according to the usual immunotherapy protocols at doses and for a period sufficient to induce an effective response against the pathology to be treated.
  • the administration can be subcutaneous, intramuscular, intravenous, in particular by infusion; intradermal, intraperitoneal, oral, sublingual, rectal, vaginal, intranasal, by inhalation or by transdermal application.
  • the composition is in a galenic form suitable for a chosen administration.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is used in immunotherapy in the treatment of inflammatory or autoimmune pathologies. It can be used in combination with other therapeutic or surgical treatments, in particular in combination with other therapeutic agents as defined above, the composition according to the invention and the other therapeutic agents which can be administered simultaneously, separate or sequential.
  • Inflammatory or autoimmune pathologies are those which are conventionally treated with anti-TNF-alpha.
  • pathologies mention may be made of ankylosing spondylitis, rheumatoid arthritis, ulcerative colitis, psoriatic arthritis, Crohn's disease, skin psoriasis and juvenile arthritis.
  • a subject of the present invention is also a variant, polynucleotide, vector, and / or cell derived as defined above for use as medicament, in particular in immunotherapy, in the treatment of inflammatory or autoimmune pathologies as defined above.
  • a subject of the present invention is also an immunotherapy method, in particular intended for the treatment of inflammatory or autoimmune pathologies as defined above, characterized in that it comprises the administration of an effective dose of a variant, polynucleotide, vector, and / or cell derived in accordance with the invention as defined above, to an individual, by any suitable means as defined above.
  • the method comprises the administration of a pharmaceutical composition according to the invention as defined above.
  • the polynucleotides according to the invention are obtained by conventional methods, known in themselves. For example, they can be obtained by amplification of a nucleic acid sequence by PCR or RT-PCR or else by total or partial chemical synthesis.
  • Recombinant eukaryotic or prokaryotic expression vectors are constructed and introduced into host cells by conventional recombinant DNA and genetic engineering methods, which are known per se. These are in particular the expression vectors conventionally used for the production of antibodies, in particular human or humanized therapeutic antibodies such as vectors of the tandem type allowing the simultaneous expression of the heavy and light chains of antibodies.
  • the variants produced by the host cells modified by the recombinant vector are purified by conventional methods of purification of immunoglobulins, in particular by affinity chromatography.
  • FIG. 1 shows the sequences of the variable parts of adalimumab.
  • the sequences are numbered according to the Kabat nomenclature. Non-germinal residues denote mutations relative to alleles with the highest homology. The residues involved in the direct interaction with TNF ⁇ are derived from the structure published in Hu et al. J. Biol. Chem. 288, 27059-27067 (2013).
  • the heavy chain variable domain (VH) corresponds to the sequence SEQ ID NO: 1 and the light chain variable domain (VL) corresponds to the sequence SEQ ID NO: 2.
  • FIG. 3 presents the prediction of substitutions reducing immunogenicity scores on the interaction with HLA II molecules.
  • the netMHCIIpan prediction algorithm is used in a parallel fashion to predict the average effect that each substitution has on peptide binding for HLA class II molecules.
  • Fig. 4 presents the prediction of substitutions reducing immunogenicity scores on the interaction with HLA II molecules.
  • the netMHCIIpan prediction algorithm is used in a parallel fashion to predict the average effect that each substitution has on peptide binding for HLA class II molecules.
  • FIG. 4 presents the expression and selection of Fab libraries by Yeast Surface Display.
  • DMS libraries are sorted by rectangular windows based only on PE fluorescence.
  • FIG. 5 presents the substitutions of CDRH2 and CDRH3 having no impact on the function of adalimumab by Deep Mutational Scanning. Permissivity matrices of CDRH2 and CDRH3 from positively sorted populations. Mutants having an enrichment greater than or equal to the parental sequence are indicated in shades of gray. The darker the gray, the stronger the enrichment, indicating a good affinity for TNF ⁇ . Sequence of positions E46 to E64 overlapping CDRH2 (SEQ ID NO: 8); Sequence of positions V89 to G104 overlapping CDRH3 (SEQ ID NO: 9).
  • FIG. 6 shows the substitutions of CDRH2 and CDRH3 combining lower predicted immunogenicity and maintenance of functionality (DMS), corresponding to the combination of Figures 3 and 5. Sequence of positions E46 to E64 overlapping CDRH2 (SEQ ID NO: 8); Sequence of positions V89 to G104 overlapping CDRH3 (SEQ ID NO: 9).
  • FIG. 7 represents combinatorial libraries for deimmunization.
  • the major interaction cores and their anchor positions are shown in gray.
  • the banks were designed to be located on these interaction cores.
  • For the CDRH2 library the indicated degenerate codons were used.
  • FIG. 8 presents the screening of combinatorial libraries by FACS.
  • the two combinatorial libraries relating to CDRH2 and CDRH3 were screened independently.
  • the first phase of equilibrium selection comprises three successive sorts at decreasing concentrations of biotinylated TNF ⁇ . The first sort at 3nM and the last at 500pM are shown in this figure.
  • the second phase of selection consists in selecting the mutants on their dissociation rate. For this, the banks are incubated for 3 hours with biotinylated TNF ⁇ and then put into competition for 24 hours with non-biotinylated TNF ⁇ . At the end of the 24 hours, the banks are sorted to select the mutants for which the dissociation rate is the slowest.
  • FIG. 9 presents the evolution of amino acid diversity during the various stages of selection.
  • the amino acid diversity for the CDRH2 (A) region is shown before and after the equilibrium and kinetic selection steps.
  • CDRH3 (B) the diversity is represented at the end of the first magnetic selection step then after the equilibrium and kinetic selection steps.
  • Amino acids are represented as a function of their percentage in a sample of 1000 sequences. The native amino acid is shown in gray and the substitutions in black. Sequence of positions E46 to A60 including CDRH2 (SEQ ID NO: 10); Sequence of positions D86 to S100C including CDRH3 (SEQ ID NO: 11).
  • FIG. 10 presents the screening of the CDRH2-CDRH3 combinatorial library.
  • the first phase of equilibrium selection comprises three successive sorts at decreasing concentrations of biotinylated TNF ⁇ .
  • the first sort at 3nM and the last at 500pM are shown in this figure.
  • the second phase of selection consists in selecting the mutants on their dissociation rate.
  • the bank is incubated for 3 hours with biotinylated TNF ⁇ and then put into competition for 24 hours with non-biotinylated TNF ⁇ .
  • the bank is sorted to select the mutants for which the dissociation rate is the slowest.
  • FIG. 11 presents the analysis of the immunogenic potential of the mutants of interest.
  • A Prediction by netMHCIIpan of the probability of interaction with HLA II molecules at a threshold of 20% for the selected mutants and the native sequence. Predictions are given independently for the CDRH2 area and that of CDRH3.
  • B Sequence of mutated cores (mutation in red) and effect of these different mutations on the prediction of these cores.
  • ITWNSGHID (SEQ ID NO: 12); INWNGGHRD (SEQ ID NO: 13); INWNGGHSD (SEQ ID NO: 14); YYCAKVSYL (SEQ ID NO: 15); VSYLSTASS (SEQ ID NO: 16); YLSTASSLD (SEQ ID NO: 17); YYCAKSQYL (SEQ ID NO: 18); YYCAKTTYL (SEQ ID NO: 19); YYCAKAHYL (SEQ ID NO: 20); SQYLSTASS (SEQ ID NO: 21); TTYLSTASS (SEQ ID NO: 22); AHYLSTASS (SEQ ID NO: 23); YLPTASSLD (SEQ ID NO: 33).
  • FIG. 12 presents the detail of the netMHCIIpan prediction for adalimumab and the 3 mutants of interest
  • DMS libraries were constructed by PCR assembly. For each position, a forward primer comprising the degenerate codon NNS was used to randomize the amino acid concerned. At the end of the PCR assembly, the mutated genes are purified on gel independently and then pooled to form a library.
  • PCR assembly was also used.
  • CDRH2 diversity was introduced using degenerate codons chosen using the CodonCalculator tool (http://guinevere.otago.ac.nz/cgi- bin / aef / CodonCalculator.pl) and indicated in Figure 7.
  • CDRH3 a trinucleotide synthesized primer (Ella Biotech GmbH, Martinsread, Germany) was used in order to insert the desired diversity.
  • the final deimmunization bank was constructed by PCR assembly from the plasmids extracted from the CDRH2 and CDRH3 banks at the end of the selection.
  • the libraries were cloned into a bicistronic plasmid derived from the plasmid pCT-L7.5.126 (Addgene plasmid # 429000) and described in Figure 4. Like pCT-L7.5.126, it has a CEN / ARS yeast origin of replication. , a TRP auxotrophy gene, a colE1 bacterial origin of replication, an ampicillin resistance gene and a galactose-inducible GLA1 / GAL10 bidirectional promoter.
  • the cloning of the library in the YSD expression plasmid was carried out by homologous recombination during the transformation of EBY100 cells (ATCC ⁇ MYA- 4941 TM; a GAL1-AGA1 :: URA3 ura3-52 trp1 Ieu2 D1 his3 D200 pep4: : HIS2 prb1 D1 6R can1 GAL) as described in the previous part.
  • 3 ⁇ g of linearized plasmid Nhel and SalI for VH, Ncol and Pfl23ll for VL
  • 6 ⁇ g of insert were used for each of the transformations.
  • the libraries thus cloned into the plasmid were cultured in SD-CAA medium [6.7 g / L yeast nitrogen base without casamino acids, 20 g / L dextrose, 5 g / L casamino acids, 100 mM sodium phosphate pH 6.0] and were run twice before inducing expression in SG-CAA medium [6.7 g / L yeast nitrogen base without casamino acids, 20 g / L galactose, 5 g / L casamino acids, 100 mM sodium phosphate, pH 6.0] in order to minimize double transformants.
  • the culture and expression steps were carried out according to the description given in the previous part.
  • the selection of the DMS libraries was made in a single step by FACS on an ARIA III device (Becton Dickinson, Franklin Lakes, United States). After induction of expression, the libraries were incubated for 3 hours at 20 ° C. with biotinylated TNF ⁇ (ACROBiosystems, Newark, United States) at a concentration of 80 pM. After washing cells with PBS 0.1% BSA these were labeled with an antibody directed against the APC coupled CK domain (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA; 1: 100 dilution) and PE-coupled streptavidin (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA; 1: 100 dilution).
  • the selection of the libraries was made using a rectangular sorting window containing 5% of the clones of interest according to the optimal parameters described by Kowalski et al. PLoS One 10, 1-23 (2015)).
  • the selection of the deimmunization banks was carried out in several stages. After optional magnetic sorting using anti-biotin magnetic beads (Miltenyi Biotec, Bergisch, Germany) after 3 hours of incubation at 20 ° C. at a concentration of 10 nM of biotinylated TNF ⁇ as described by Chao et al. Nat Protoc 1, 755-768 (2006).
  • the banks have undergone different sorting steps by FACS.
  • the plasmids were extracted from the cells by enzymatic lysis using the Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II kit (Zymo Research, Irvine, United States). The corresponding fragments were then amplified and the illumina adapters and multiplexing tags added by 2 steps of PCR as described by Kowalsky, C. A. et al. PLoS One 10, 1-23 (2015).
  • the libraries were paired-end sequenced on a MiSeq using a 2x150 cycle V2 kit or on an iSeq still in 2x150 cycles (Illumina, San Diego, USA). For the DMS libraries a minimum sequencing depth of 50X was respected.
  • sequences were demultiplexed and processed independently on the Galaxy platform (https://usegalaxy.org/) using the functions described by Blankenberg et al., Bioinformatics 26, 1783-1785 (2010).
  • the sequences are paired (fasrq-join) and only the sequences having a quality score greater than or equal to 30 are kept (FASTQ Quality Trimmer).
  • the sequences are then aligned (Align.seqs) and only the region of interest is kept (Chop.seqs).
  • sequences are translated (transeq) and the identical sequences are counted and aggregated (Group).
  • the evolution of diversity at each position was represented in the form of weblogo (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) generated from a sample of one thousand sequences.
  • mutants are represented by a selective value taking into account the enrichment of the native sequence:
  • Or is the frequency of the native sequence before the selection e at the end of the selection.
  • the scores are given in a relative manner compared to the native sequence, the negative scores reflect a decrease in the number of peptides below the 20% threshold.
  • the panel of 46 alleles published by McKinney et al. , covering more than 80% of the phenotypes for each locus, which was used (McKinney, DM et al., Immunogenetics 65, 357-370 (2013)). ([Table 1]).
  • Mutants 1 to 8 as well as native adalimumab were produced in Fab format, mutants of interest (1, 2 and 7) and adalimumab were also produced in IgG format.
  • the heavy and light variable chains of the antibodies were cloned into the plasmids AbVec2.0-IGHG1 and AbVed .1 -IGKC respectively.
  • 24 For the production of Fab the heavy chain was cloned into a plasmid derived from AbVec2.0-IGHG1 for which the CH2 and CH3 domains were removed and replaced by a 6His tag.
  • Fab and IgG were carried out transiently with HEK293 Freestyle cells (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) and cultured in the associated medium.
  • the transfection was carried out at a density of 2.5 ⁇ 10 6 cells per ml of culture, a solution of PEI (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, United States) was used as transfection agent.
  • the plasmids were added to the culture at a 1: 1 ratio and at a final concentration in the culture of 1.5 ⁇ g / mL for each plasmid. After 5 minutes of stirring at 37 ° C. and 8% CO2, the PEI was added dropwise to a final concentration of 9 ⁇ g / mL of culture.
  • the culture was diluted to half.
  • the production was stopped 7 days after transfection and the supernatant was recovered by centrifugation at 4 ° C, 10 min at 3000G then 20 min at 20000G.
  • the proteins were then purified on an AKTA system (GE Healthcare, Pittsburgh, USA).
  • AKTA GE Healthcare, Pittsburgh, USA
  • the purification was carried out using a HisTrap Excel column (GE Healthcare, Pittsburgh, United States) with elution in 20 mM imidazole buffer. Following the purification, the Fabs were dialyzed in order to decrease the concentration of imidazole.
  • IgGs were purified using a HiTrap Protein A HP column (GE Healthcare, Pittsburgh, USA), followed by SEC a second time on a Sephacryl S-200 HR column (GE Healthcare, Pittsburgh, USA). United) in order to keep only the monomeric form of IgG. 6. Affinity measurement
  • the affinity measurements were carried out kinetically with a Red96 octet (Molecular Devices, San Jose, United States) according to the protocol described by Schroter et al. (MAbs 7, 138-151 (2015)). Briefly, the biotinylated TNF ⁇ is immobilized on streptavidin sensors (Streptavidin (SA) Biosensor) at a concentration of 20nM. After saturating the sensors in a blocking solution containing biotin (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, United States) at 10 ⁇ g / mL, the association and the dissociation are measured for 20 and 40 minutes respectively.
  • SA streptavidin
  • mutants 3 to 6 and mutant 8 the affinity measurements were made at three concentrations of Fab: 10nM, 5nM and 2.5nM, plus a reference to 10nM without TNF ⁇ .
  • analyzes were carried out for six concentrations of Fab: 15nM, 10nM, 5nM, 2.5nM, 1, 25nM and 0.625nM, plus a reference to 15nM without TNFa.
  • the reference is subtracted from each curve and a global 1: 1 Langmuir model is applied to obtain the affinity parameters.
  • the masses of the IgG products (adalimumab, Mutants 1, 2 and 7) and of adalimumab in its commercial version (Humira) were determined by mass spectrometry.
  • the analysis was carried out on a high resolution apparatus of the Q-Orbitrap type (Thermo Fisher Scientific, Waltham, United States) by UHPLC-MS as described by Contrepois et al. (J. Proteome Res. 9, 5501-5509 (2010)).
  • the SEC-MALS analysis was carried out within the GIPSI platform of the University of Paris-Sud, on an HPLC (Shimadzu) with a Superdex 200 10/300 GL increase column (GE Healthcare, Pittsburgh, United States).
  • T epitopes of adalimumab were identified in vitro by specific activation tests of CD4 T lymphocytes using overlapping peptides with a length of 15 or 20 amino acids.
  • the regions comprising T epitopes are mainly located within the heavy chain, CDR2 on a zone between residues E46 and E64 and CDR3 between amino acids L82c and T107 (Meunier, S. et al., Cellular & Molecular Immunology, 2019, Oct 28. doi: 10.1038 / s41423-019-0304-3).
  • a T epitope is also described on the light chain upstream of CDR3 (S76 to R90).
  • peptides identified by MAPPS those corresponding to the T epitopes identified by cell test (in bold) are represented in the form of overlapping peptide clusters.
  • the 9-mer “ITWNSGHID” (SEQ ID NO: 12) comprising residues 51 to 58 (in dark gray in FIG. 2) predicted by netMHCIIpan is probably the core of interaction of the T epitopes of CDRH2 among the predicted cores (in light gray in Figure 2).
  • CDRH3 is more dense in T epitopes, a set of 6 overlapping T epitopes have been predicted on this region. The overlapping nature of these epitopes also suggests that these areas of overlap could be of particular interest for destabilizing the peptide / HLA II interaction of several T epitopes simultaneously.
  • netMHCIIpan The modifications proposed by netMHCIIpan are generally substitutions towards a hydrophilic amino acid, with an effect which is all the stronger if the native residue is hydrophobic. netMHCIIpan taking into account neither the structure nor the functionality of the antibody, these predictions must be put into perspective with the tolerance to the mutation of these amino acids. Indeed, the deletion of all the hydrophobic amino acids on regions as important as the CDRs seems extremely risky for the functionality but also for the structure of the antibody. In addition, residues belonging to these two CDRs have been described for their contribution in the interaction with TNFa (Hu et al. J. Biol. Chem. 288, 27059-27067 (2013). In order to take these functional constraints into account and structural, a second systematic approach on the function this time was applied.
  • DMS Deep Mutational Scanning
  • the two immunogenic regions were processed in two independent libraries. They each relate to a region of twenty residues and were constructed by PCR assembly. For each of the twenty residues, the diversity was introduced using a degenerate NNS codon encoding all of the twenty natural amino acids. Degenerate codons were introduced by independent PCRs for each position. The twenty PCR products were mixed equimolarly in order to obtain a library containing all the single substitutions for each of the twenty positions. The libraries were then cloned into an expression plasmid for the Yeast Surface Display (YSD) allowing expression in the form by Fab. ( Figure 4A) The two libraries were cloned independently by homologous recombination during transformation into yeast.
  • YSD Yeast Surface Display
  • the libraries were then expressed in YSD and the mutants of interest selected by FACS.
  • Figure 4B The screening was carried out according to the conditions described by Kowalsky et al. (PLoS One 10, 1-23 (2015)). Libraries were screened once after three hours of incubation at a TNF ⁇ concentration lower than the KD of adalimumab in order to be able to observe both gain and loss of function. The 5% of the mutants expressed having the weakest signal for the interaction were selected (cf. “Negative” sorting window, FIG. 4C), to select the mutations having a deleterious impact on the function. Similarly, the 5% of the mutants demonstrating the strongest interaction were selected (cf. “Positive” sorting window, FIG. 4C). The yeast population before any selection step as well as the two selected populations were then sequenced by NGS.
  • the enrichments of the parental sequence (wild type) as well as those of each of the mutants were calculated. These made it possible to calculate for each of the variants a score called the selective value (fitness in English) which corresponds to the logarithm to base 2 of the relative enrichment of the variant with respect to the native sequence.
  • the mutants are represented in a matrix by a color proportional to their selective value. For negative selection, the amplitude of the selective values is -8 to 3, ie an enrichment 256 times less than 8 times greater than the native sequence. For positive selection the amplitude of the selective values is substantially the same. Mutants having an enrichment greater than or equal to the parental sequence are indicated in shades of gray. The darker the gray, the stronger the enrichment, indicating a good affinity for TNF ⁇ . ( Figure 5).
  • results obtained from the selection of mutants expressed but non-functional are particularly interesting for defining the residues participating in the interaction with TNF ⁇ .
  • the population resulting from the positive selection is necessary for the identification of mutations making it possible to maintain or increase the affinity.
  • the combination of these two result matrices allows to identify the residuals important for the good expression of the antibody (negative selective value in the two selection conditions).
  • mutants of the N-terminal part are not very present in the positive selection so these residues seem rather involved in the folding and the expression of the antibody.
  • Mutants belonging to the C-terminal part are somewhat more enriched in positive selection. ( Figure 5) Many mutations are allowed, including towards residues with different properties, while retaining a selective value equal to or greater than that of the native antibody.
  • Example 2 Generation of mutants of adalimumab with reduced immunogenic potential
  • CDRH2 has two overlapping T epitopes which probably share the “ITWNSGHID” interaction core (in dark gray in FIG. 2). Therefore the mutation strategy focused on this area.
  • the cross-checking of the matrices obtained from the DMS and the prediction by netMHCIIpan made it possible to choose the mutations making it possible both to destabilize the interaction with the HLA II molecules while maintaining the functionality of the antibody (FIG. 6).
  • Residues S49, A50, T52, S54, H56 and I57 were selected because they all have one or more mutations making it possible to destabilize the interaction with the HLA II molecules. For each of these residues, a degenerate codon making it possible to best represent the substitutions of interest was chosen. (FIG.
  • CDRH3 comprises a set of 5 overlapping T epitopes for which we have defined a set of 3 probable interaction cores (in dark gray in FIG. 2).
  • Each of the libraries was constructed by PCR assembly, with primers comprising degenerate codons for CDRH2 and primers synthesized from a mixture of trinucleotides for CDRH3. These banks respectively have a diversity of 1, 2.10 4 for CDRH2 and 3.8.10 6 for CDRH3. As previously, they were cloned by homologous recombination into a plasmid for expression and screening in YSD. After transformation of the yeasts and induction of expression, the FACS screening was carried out independently for the two libraries and each of the libraries underwent different selection steps.
  • the banks were saturated for 3 h with 20 nM of biotinylated TNF ⁇ and then sorted at the end of a 24-hour competition against non-biotinylated TNF ⁇ .
  • 2 to 5% of the cells with the strongest signal in PE were selected by FACS using diagonal sorting windows in order to normalize the binding signal by expression.
  • Figure 8 To understand the evolution of the molecular diversity of the banks during the selection steps, we have chosen to perform NGS sequencing after each of the selection steps. The sequencing data from the CDRH2 library show that all the mutations were indeed present in the library before the start of the screening. (FIG.
  • Adalimumab It is observed that the best mutants were enriched more than two hundred times, in total after screening there are 174 mutants having an enrichment greater than that of adalimumab. The netMHCIIpan algorithm was once again used to classify these mutants and 158 of them are predicted to be potentially less immunogenic.
  • [0122] [Table 4]: Selection of the 30 most enriched mutants from the library relating to CDRH3 It is also observed that the enrichment factors are higher than for CDRH2 with values which can reach several millions. After screening, the library contains 310 mutants which are more enriched than the native sequence of adalimumab and, as for CDRH2, a large part of these (282) have a reduced immunogenic potential according to netMHCIIpan.
  • this combinatorial library contains a minimum of 10 5 variants.
  • This library also incorporates the R90K substitution described as preserving the affinity in the Humira® patent and making it possible to germinate the sequence in the region of CDRH3 and thus to remove a minor epitope (Salfed, JG et al. Human antibodies that bond human TNFa. (US Patent 6258562 B1)).
  • This library was screened according to the same procedure applied to the previous libraries, namely three sorting at equilibrium with decreasing concentrations of TNF ⁇ followed by selection for the dissociation rate. ( Figure 10) As this library is derived from the recombination of sequences already selected, a strong initial enrichment in functional mutants is observed even before the first selection step. The population is also very homogeneous from the early stages of selection, the screening for the dissociation rate subsequently carried out, however, reveals a more heterogeneous population.
  • mutants were evaluated according to their enrichment and 245 of them show a value greater than the native sequence. Among them, more than 200 mutants are predicted to have a lower number of interaction cores with HLA II molecules than adalimumab. Their sequences show, however, a redundancy in their sequences, particularly at the level of CDRH3. ([Table 5]).
  • [0128] Selection of the 30 mutants best classified by netMHCII pan as well as of the 8 mutants of interest obtained from the recombinant CDRH2 and CDRH3 library [0129] At the end of the selection steps, a reduced number of variants of interest were chosen in order to carry out a complete biochemical characterization. The mutants were selected for their enrichment greater than the native sequence and for their reduced immunogenic potential according to netMHCIIpan but also by attaching particular importance to selecting mutants with various sequences. From these criteria, 8 mutants were chosen in order to be characterized. ([Table 6]).
  • [0131] Mutants of interest selected from the CDRH2-CDRH3 combinatorial library For some, such as mutants 2 and 5, an affinity increased by more than ten times is measured. The increase in affinity for the different clones is mainly due to a decrease in the dissociation rate, a parameter selected during the screening. If all these mutants have a higher enrichment than the native antibody, these However, these values do not always seem to be strictly proportional to the affinities measured for these mutants.
  • Mutants 1, 2 and 7 were selected for their reduced predicted immunogenicity in order to carry the characterization further. These three mutants as well as the native antibody were produced in HEK and purified in IgG format. Orbitrap mass spectrometry analysis confirmed that the antibodies have a mass corresponding to that expected, with a resolution of the order of the dalton. On the other hand, an analysis by SEC-MALS (Size Exclusion Chromatography - Multi-Angle Light Scattering) also made it possible to validate the monomeric character of these antibodies.
  • SEC-MALS Size Exclusion Chromatography - Multi-Angle Light Scattering
  • the mutants have a reduction in interaction with the HLA II molecules predicted according to the netMHCIIpan algorithm. As a result, they are less likely to be presented by HLA II molecules and recognized by T lymphocytes compared to adalimumab. These mutants thus constitute variants of adalimumab with reduced immunogenicity and make it possible to overcome the problems of immunogenicity encountered with anti-TNF ⁇ . These variants could represent a clinical improvement in to reduce the immunization rate of patients. In addition, the inventors have been able to demonstrate that they have an increased affinity for TNF ⁇ .
  • mutants of the invention will have a higher biological activity. to that of adalimumab.
  • the mutants obtained at the end of this work could thus be considered as potential drug candidates positioning themselves as an improved version of adalumimab.

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Abstract

L'invention concerne des variants de l'adalimumab au potentiel immunogène réduit et à l'affinité préservée ou augmentée et leurs applications thérapeutiques

Description

Variants de l'adalimumab au potentiel immunogène réduit
Domaine technique
[0001] L'invention concerne des variants de l'adalimumab au potentiel immunogène réduit et à l'affinité préservée ou augmentée et leurs applications thérapeutiques.
Technique antérieure
[0002] Les maladies inflammatoires auto-immunes touchent une très large partie de la population, particulièrement dans les pays développés. La polyarthrite rhumatoïde qui est l'une des affections les plus répandues touche plus d'un million de personnes aux Etats-Unis (Hunter, T. M. ét al., Rheumatol. Int. (2017). doi :10.1007/s00296-017-3726- 1). Les anti-TNF-alpha tels que l'Humira® (adalimumab), un anticorps lgG1 humain neutralisant le TNF-alpha, constituent un traitement symptomatique efficace pour une part importante de ces maladies inflammatoires auto-immunes. De ce fait, l'adalimumab est aujourd'hui largement utilisé dans le traitement de la spondylarthrite ankylosante, l'arthrite rhumatoïde, la rectocolite hémorragique, l'arthrite psoriasique, la maladie de Crohn, le psoriasis cutané et l'arthrite juvénile (Feldmann, M. & Maini, Nat. Med. 9, 1245-1250 (2003)). L'adalimumab s'avère cependant immunogène chez une part non négligeable des patients (jusqu'à 50% pour certaines affections) qui produisent des anticorps dirigés contre la protéine thérapeutique (ADA pour anti-drug antibody), détectables dans le sérum (Strand, V. et al., BioDrugs 31, 299-316 (2017)). Les ADA engendrent la formation de complexes immuns accélérant l'élimination des anticorps thérapeutiques. En clinique, la présence d'ADA est inversement corrélée à la réponse au traitement. Les patients ayant une bonne réponse au traitement seront ceux chez qui les tests ne révèlent pas d'ADA (van Schouwenburg, P. A., Rispens, T. & Wolbink, G. J., Nat. Rev. Rheumatol. 9, 164-172 (2013)).
[0003] En clinique le problème des ADA est traité par différentes approches. Il a été observé que l'augmentation des doses administrées permet de réduire l'effet des ADA. Ainsi les traitements se font souvent avec des doses croissantes au fur et mesure de l'immunisation des patients. D'autre part, les thérapies sont souvent co-administrées avec du méthotrexate, cet agent immunosuppresseur inhibe la production d'ADA et permet d'obtenir des résultats nettement améliorés Ces mesures sont cependant peu satisfaisantes dans la mesure où les patients continuent tout de même à s'immuniser contre la protéine (Emi Aikawa, N. et al., Clin. Rev. Allergy Immunol. 38, 82-89 (2010) ; Radstake, T.R.D.J., Ann. Rheum. Dis., 68, 1739-1745 (2009)).
[0004] La suppression d'épitopes T par disruption de l'interaction avec les molécules HLA II, dénommée dé-immunisation, a été montrée comme une méthode efficace pour réduire l'immunogénicité de différentes protéines à visée thérapeutique, telles que des enzymes et des immunotoxines (Mazor, R. et al. Oncotarget 7, 29916-29926 (2016); Cantor, J. R. ét al., Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 1272-1277 (2011); Ettinger, R. A. ét al., Blood Adv. 2, 309-322 (2018); Mazor, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, E3597-603 (2012)).
[0005] Différents épitopes T ont précédemment été identifiés dans la séquence de l'adalimumab (Meunier, S. et al., Cellular & Molecular Immunology, 2019, Oct 28. doi: 10.1038/s41423-019-0304-3). Ceux-ci sont principalement localisés sur la chaîne lourde de l'anticorps sur laquelle ils se répartissent en deux régions. La première région concentre la majorité des épitopes T et est très chevauchante avec le CDR-H3 (résidus L82c à T107 selon la numérotation de Kabat ; Figure 1) .La seconde région est localisée au niveau du CDR-H2 et comporte deux épitopes T (résidus E46 à E64 selon la numérotation de Kabat ; Figure 1) Ces épitopes T sont potentiellement à l'origine de l'immunogénicité de l'adalimumab. Celle-ci ayant des répercussions importantes chez les patients, le développement d'alternatives moins immunogènes que l'adalimumab semble une nécessité.
[0006] Toutefois, cette approche de dé-immunisation par suppression d'épitopes T n'est pas adaptée aux anticorps thérapeutiques qui sont des anticorps humanisés ou humains, étant donné que leurs épitopes T sont principalement présents au niveau des CDR qui sont essentiels pour l'activité biologique de l'anticorps thérapeutique (Harding et al., mAbs 2, 256-265 (2010)). En effet, ce sont les CDR qui déterminent la spécificité ainsi que l'affinité de l'anticorps pour l'antigène cible de l'anticorps thérapeutique.
[0007] Des variants de l'adalimumab dans lesquels les régions charpentes (FR) des domaines variables des chaînes lourdes et légères ont été remplacées par des régions charpentes moins immunogènes d'autres immunoglogulines G (IgG) humaines sont décrits dans la Demande EP 3 178847. De tels variants ne possèdent pas une dé- immunisation satisfaisante pour une utilisation thérapeutique étant donné qu'ils comprennent la majorité des épitopes T présents dans les CDR.
[0008] Des variants de l'adalimumab comprenant des mutations dans une région contenant des épitopes T CD4 putatifs s'étendant de part et d'autre du CDR1 de la chaîne légère (CDR-L1 ; positions C23 à K45, selon la numérotation de Kabat) sont décrits dans la Demande WO 2010/121140. En dépit du choix des mutations pour ne pas diminuer significativement l'affinité des variants, tous les variants obtenus ont une affinité réduite pour le TNF-alpha par rapport à l'adalimumab, cette réduction d'affinité étant drastique (au moins 50 %) pour la majorité (70%) des variants obtenus.
[0009] En conséquence, il existe un besoin de disposer de nouveaux variants d'adalimumab qui soient mieux adaptés à leur utilisation thérapeutique en ce qu'ils présentent à la fois un potentiel immunogène réduit et une affinité intacte.
Résumé de l'invention
[0010] Les inventeurs ont identifié des mutations dans les régions immunogènes chevauchant les régions CDR-H2 (ou CDRH2) et CDR-H3 (ou CDRH3) de l'adalimumab qui réduisent l'immunogénicité tout en conservant l'affinité de liaison au TNF-alpha. A partir de banques combinatoires, ils ont isolé des variants qui de façon surprenante présentant un potentiel immunogène réduit et une affinité de liaison au TNF-alpha supérieure à celle de l'adalimumab. Certains des variants ont une affinité 5 à 50 fois supérieure à celle de l'adalimumab. Dans la mesure où l'activité biologique des anticorps anti-TNF -à savoir la neutralisation du TNF-alpha- dépend de leur affinité pour le TNF, on peut s'attendre à ce que les variants de l'invention aient une activité biologique supérieure à celle de l'adalimumab..
[0011] En conséquence, la présente invention a pour objet un variant d'un anticorps thérapeutique anti-TNF-alpha comprenant des domaines variables VFI et VL de séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2, ledit variant comprenant au moins deux substitutions d'acides aminés dans au moins une séquence chevauchant l'une des régions CDRH2 ou CDRH3 déterminant la complémentarité dudit domaine variable VH ; lesdites au moins deux substitutions d'acides aminés dans la séquence chevauchant la région CDRH2 étant sélectionnées dans le groupe constitué par :
- la substitution de S49 par un autre acide aminé choisi parmi A ou G; de préférence G
- la substitution de A50 par un autre acide aminé choisi parmi G, S, T ou D ;
- la substitution de T52 par un autre acide aminé choisi parmi A, N ou S ; de préférence N ou S ;
- la substitution S54G ;
- la substitution de 157 par un autre acide aminé choisi parmi A, H, N, Q, R, S, T ou W ; de préférence A, H, S, N, Q, R ou T, de manière préférée R, H, S ou T ; et lorsque le variant comprend le résidu A49 alors il comprend également le résidu N52, S52 ou T52 et le résidu G54 ; lesdites au moins deux substitutions d'acides aminés dans la séquence chevauchant la région CDRH3 étant sélectionnées dans le groupe constitué par :
- la substitution de V89 par L;
- la substitution de V95 par un autre acide aminé choisi parmi A, S ou T;
- la substitution de S96 par un autre acide aminé choisi parmi A, G, H, K, N, Q, R ou T ; de préférence T, Q, N ou H ;
- la substitution de Y97 par H ;
- la substitution de L98 par T ;
- la substitution de S99 par P;
- la substitution de T100 par un autre acide aminé choisi parmi P ou S ; à l'exclusion des variants comprenant les résidus V89 ou L89, V95, K96, Y97, L98, P99 et S100 ; V89, V95, A96, Y97, L98, P99 et S100 ; les positions desdits résidus d'acides aminés étant indiquées en référence à la numérotation de Kabat ; et ledit variant présentant un potentiel immunogène réduit et une affinité de liaison pour le TNF-alpha au moins égale ou supérieure, par rapport à l'anticorps thérapeutique anti-TNF-alpha dont il est issu.
[0012] Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit variant comprend au moins 3 substitutions dans l'une des séquences chevauchant la région CDRFI2 ou CDRFI3 ; de préférence dans chacune .desdites séquences chevauchant les régions CDRFI2 et CDRH3.
[0013] Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRFI2 choisie parmi: - S54G et I57R ;
-T52N ou T52S, S54G et I57T, I57R, I57Q ou I57H;
- S49G, T52N et I57H ;
- S49A ou S49G, S54G et I57T ou I57R ;
- S49G, T52N, T52S ou T52A ; S54G ; et I57T , I57R, I57H, I57S,
I57Q ou I57N ; et éventuellement A50T, A50G ou A50S ;
- S49A, T52N ou T52S ; S54G ; et I57T , I57R, I57H, I57Q, I57S ou I57A ;et
- S49G, A50G, S54G et I57R .
[0014] Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH2 choisie parmi:
(i) S49G, T52N et I57H; S49A, S54G et I57T ; S49G, S54G et I57R ; T52N,
S54G et I57T ;
(ii) S49G, T52N, S54G et I57R ; S49G, T52N, S54G et I57H; S49G, T52N,
S54G et I57T ; S49G, T52N, S54G et I57S ; S49G, A50G, T52N et I57H ;
S49G, T52S, S54G et I57R ; S49A, T52N, S54G et I57T ; S49G, T52S,
S54G et I57N; S49G, T52S, S54G et I57Q; S49G, A50G, S54G et I57R ;
S49G, T52S, S54G et I57H ; S49G, T52S, S54G et I57T ; S49G, T52S,
S54G et I57S ; S49A, T52N, S54G et I57H ; et
(iii) S49G, A50T, T52N, S54G et I57S ; S49G, A50G, T52N, S54G et I57R ;
S49G, A50S, T52N, S54G et I57R ; S49G, A50D, T52S, S54G et I57T ;
S49G, A50G, T52S, S54G et I57R; S49G, A50S, T52A, S54G et I57H ;
S49G, A50S, T52S, S54G et I57R ; S49G, A50S, T52A, S54G et I57T ; et S49G, A50S, T52A, S54G et I57S ; de préférence choisie parmi : S49G, T52N, S54G et I57R ; S49G, A50T, T52N, S54G et I57S ; S49G, T52N, S54G et I57H ; S49G, T52N et I57H ; S49G, A50D, T52S, S54G et I57T.
[0015] Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisie parmi:
- V95S, V95T ou V95A ; et - S96T, S96Q, S96N ou S96H ; et
- S99P ; et éventuellement V89L.
[0016] Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisie parmi :
(a) S96K et S99P ;
(b) V95T, S96T et S99P ; V95T, S96K et S99P ; V95T, S96R et
S99P ; V95T, S99P et T100S ; V89L, S96K et S99P ; S96T, S99P et T100S ; S96K, S99P ; V95A, S96K et S99P ; V95S, S96K et S99P ; V95T,
S96G et S99P ; S96K, S99P et T1 OOP ; V95T, S96H et S99P ; V95T,
S96N et S99P ; V95S, S96Q et S99P ; V95A, S96H et S99P ;
(c) V89L, V95T, S96N et S99P ; V95T, S96T, S99P et T1 OOS ; V95A, S96H,
Y97H et S99P ; V89L, S96K, L98T, S99P ; S96T, L98T, S99P et T100S ;
V89L, V95T, S96K et S99P ; V95T, S96K, S99P et T100S ; V95T, S96R L98T et S99P ; V89L, V95T, S96R et S99P ; V89L ; V95T, S96T et S99P ;
(d) V89L, V95T, S96T, S99P et T1 OOS ; V89L, S96K, L98T et S99P ; V89L,
V95T, S96K, S99P et T1 OOS ; V89L,V95T, S96R, S99P et T1 OOS.
[0017] Selon un mode de réalisation plus préféré de l'invention, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisie parmi : V95T, S96T et S99P ; V95T, S96N et S99P ; V95S, S96Q et S99P ; V95A, S96H et S99P ; V95T, S96G et S99P ; S96T, L98T, S99P et T100S ; V95T, S96R, L98T et S99P ; S96K, S99P et T100P ; V89L, V95T, S96T et S99P ; de préférence choisie parmi: V95T, S96T et S99P ; V95T, S96N et S99P ; V95S, S96Q et S99P ; V95A, S96H et S99P ; V89L, V95T, S96T et S99P.
[0018] Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit variant comprend l'une des combinaisons suivantes de substitutions dans les séquences chevauchant les régions CDRH2 et CDRH3 :
- S49G, T52N, S54G, I57R, V95S, S96Q et S99P ;
- S49G, A50T, T52N, S54G, I57S, V95T, S96T et S99P ;
- S49G, T52N, S54G, I57H, V95T, S96T et S99P ;
- S49G, T52N et I57H, V95T, S96T et S99P ; - S49G, A50D, T52S, S54G et I57T , V95T, S96T et S99P ;
- S49G, T52N, S54G, I57R, V89L, V95T, S96T et S99P ;
- S49G, T52N, S54G, I57R, V95T, S96N et S99P ;
- - S49G, T52N, S54G, I57R, V95A, S96H et S99P.
[0019] Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit variant comprend en outre la substitution R90K dans la région CDRL3 déterminant la complémentarité du domaine variable VL.
[0020] Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit variant comprend une chaîne lourde d'IgG humaine et une chaîne légère Kappa humaine.
[0021] Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit variant est issu de l'adalimumab.
[0022] Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit variant, comprend une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 24 à 31.
[0023] Un autre aspect de l'invention concerne un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide codant pour un variant selon l'invention
[0024] Un autre aspect de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant au moins un variant selon l'invention ou un vecteur selon l'invention, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable et/ou une substance porteuse.
[0025] Un autre aspect de l'invention concerne une composition selon l'invention, pour utilisation dans le traitement d'une maladie inflammatoire ou auto-immune .
Exposé de l'invention
[0026] La présente invention a pour objet un variant d'un anticorps thérapeutique anti- TNF-alpha comprenant des domaines variables VH et VL de séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2, lequel variant comprenant un potentiel immunogène réduit et une affinité de liaison au TNF-alpha au moins égale ou supérieure, par rapport à l'anticorps thérapeutique anti-TNF-alpha dont il est issu. [0027] Du fait de son affinité de liaison au moins égale ou supérieure, on peut s'attendre à ce que le variant selon l'invention possède une activité biologique au moins égale ou supérieure à celle de l'anticorps parent.
[0028] La séquence SEQ ID NO : 1 correspond à la séquence du domaine variable de chaîne lourde (VH) de l'adalimumab et la séquence SEQ ID NO : 2 à la séquence du domaine variable de chaîne légère (VL) de l'adalimumab (Figure 1). La séquence de la chaîne lourde de l'adalimumab correspond à la séquence SEQ ID NO : 3 et la séquence de la chaîne légère de l'adalimumab correspond à la séquence SEQ ID NO : 4.
[0029] Définitions
On entend par anticorps thérapeutique, un anticorps humain ou humanisé.
On entend par anticorps, un anticorps entier, un fragment d'anticorps comprenant au moins le domaine de liaison à l'antigène ou une molécule dérivée d'un anticorps..
On entend par TNF-alpha ou TNFalpha (« Tumor Necrosis Factor Alpha ») une cytokine pro-inflammatoire multifonctionnelle produite de façon prédominante par les monocytes et les macrophages. De préférence, il s'agit du TNF alpha humain. Le TNF alpha humain correspond à la séquence GenBank QCI55793.1.
Les termes « variant » et « mutant » sont utilisés de façon interchangeable.
On entend par potentiel immunogène réduit relativement à un variant d'anticorps selon l'invention, une diminution du nombre de molécules HLA II pouvant être liées par au moins l'un des épitopes T CD4 du variant comparativement à l'anticorps parent dont il est issu. Le nombre de molécules HLA II pouvant être lié par un variant selon l'invention est évalué selon les techniques standards connues de l'Homme du métier telles celles décrites en particulier dans les exemples. Il s'agit notamment de méthodes in silico utilisant des outils de prédiction de liaison au CMH-II, tel que l'algorithme netMHCIIpan 3.2. (Jensen, K. K. ét al., Immunology 154, 394-406 (2018)). La liaison à HLA II est exprimée sous la forme d'un score défini par la formule suivante :
[Math 1]
Figure imgf000009_0001
où le core est un core de liaison non-humain prédit par netMHCIIpan3.2; core>20% = 0 and core<20% = 1. / est la première position d'ancrage du core et y est l'allèle pour lequel le core est prédit. Le variant selon l'invention est caractérisé par un score de liaison à HLA II diminué d'au moins 10 % (1 ,1 fois ou facteur 1 ,1) par rapport à l'anticorps parent dont il est issu.
L'affinité de liaison du variant au TNF-alpha est évaluée selon les techniques standards connues de l'Homme du métier telles celles décrites en particulier dans les exemples. L'affinité peut être évaluée par la valeur de la constante de dissociation à l'équilibre KD du variant, mesurée par les techniques conventionnelles telles que décrites dans les exemples. L'affinité peut également être évaluée par le facteur d'enrichissement relatif du variant par rapport à l'anticorps parent qui correspond au rapport entre les valeurs d'enrichissement du variant et de l'anticorps parent telles que définies dans les exemples. Le variant selon l'invention est caractérisé par un facteur d'enrichissement relatif supérieur ou égal à 5 ou un KD au moins 1 ,1 fois inférieur (inférieur d'un facteur 1 ,1 ou de 10 %) par rapport à l'anticorps parent dont il est issu.
On entend par individu, un individu humain ou animal, de préférence un individu humain.
Les acides aminés sont indiqués en code à une lettre.
Les positions des résidus d'acides aminés sont indiquées en référence à la numérotation de Kabat (Figure 1).
- Sauf indication contraire, un, signifie au moins un, et ou signifie et/ou.
[0030] Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit variant comprend au moins deux substitutions d'acides aminés dans au moins une séquence chevauchant l'une des régions CDRH2 ou CDRH3 déterminant la complémentarité dudit domaine variable VH. La séquence chevauchant la région CDRH2 s'étend des résidus E46 à E64 selon la numérotation de Kabat (SEQ ID NO : 8). La séquence chevauchant la région CDRH3 s'étend des résidus V89 à G104 selon la numérotation de Kabat (SEQ ID NO : 9). Ledit variant comprend avantageusement au moins deux substitutions dans chacune des deux séquences chevauchant la région CDRH2 ou CDRH3. De préférence, ledit variant comprend au moins 3 substitutions, généralement 3, 4 ou 5 substitutions dans l'une des séquences chevauchantes ; de manière préférée, dans chacune des deux séquences chevauchant les régions CDRH2 et CDRH3. [0031] Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, lesdites au moins deux substitutions d'acides aminés dans la séquence chevauchant la région CDRH2 sont sélectionnées dans le groupe constitué par :
- la substitution de S49 par un autre acide aminé choisi parmi A ou G ;
- la substitution de A50 par un autre acide aminé choisi parmi G, S, T ou D ;
- la substitution de T52 par un autre acide aminé choisi parmi A, N ou S ;
- la substitution S54G ;
- la substitution de I57 par un autre acide aminé choisi parmi A, H, N, Q, R, S, T, ou W ; et lorsque le variant comprend le résidu A49 alors il comprend également le résidu N52, S52 ou T52 et le résidu G54 ; et les positions desdits résidus d'acides aminés étant indiquées en référence à la numérotation de Kabat.
[0032] Les variants selon l'invention sont des variants fonctionnels, c'est-à-dire qu'ils comprennent un potentiel immunogène réduit et une affinité de liaison au TNF-alpha au moins égale ou supérieure, par rapport à l'anticorps thérapeutique anti-TNF-alpha dont il est issu. L'invention exclut les variants non fonctionnels tels que notamment les variants comprenant uniquement deux substitutions choisies parmi T52N et A50G ou T52N et I57T.
[0033] De préférence,
- S49 est substitué par G ;
- T52 est substitué par N ou S ; et
- 157 est substitué par A, H, S, N, Q, R, T, de préférence R, H, S ou T.
[0034] De manière avantageuse, lesdites substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH2 sont choisies parmi les substitutions en positions S49, A50, T52, S54, H56 et I57. De préférence, lesdites substitutions sont aux positions S54 et I57 ; S49, T52 et I57 ; S49, S54 et I57 ; T52, S54 et I57 ; S49, A50, T52 et I57 ; S49, A50, S54 et I57 ; S49, T52, S54 et I57 ; A50, T52, S54 et I57 ; ou S49, A50, T52, S54 et I57 ; de manière préférée aux positions S49, T52 et I57 ; S49, S54 et I57 ; T52, S54 et I57 ; S49, A50, S54 et I57 ; S49, T52, S54 et I57 ; A50, T52, S54 et I57 ; ou S49, A50, T52, S54 et I57.
[0035] De préférence, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH2 choisie parmi:
- S54G et I57R ; -T52N ou T52S, S54G et I57T, I57R, I57Q ou I57H;
- S49G, T52N et I57H ;
- S49A ou S49G, S54G et I57T ou I57R ;
- S49G, T52N, T52S ou T52A ; S54G ; et I57T , I57R, I57H, I57S,
I57Q ou I57N ; et éventuellement A50T, A50G ou A50S ;
- S49A, T52N ou T52S ; S54G ; et I57T , I57R, I57H, I57Q, I57S ou I57A ;
- S49G, A50G, S54G et I57R .
[0036] De manière préférée, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH2 choisie parmi:
(a) S54G et I57R ;
(b) S49G, T52N et I57H;
(c) S49A, S54G et I57T ; S49A, S54G et I57R ; S49G, S54G et I57R
(d) T52S, S54G et I57R ; T52S, S54G et I57Q ; T52S, S54G et
I57T ; T52S ; S54G et I57H ; T52N, S54G et I57R ; T52N, S54G et I57T ;
(e) S49G, A50G, T52N et I57H ;
(f) S49G, A50G, S54G et I57R ;
(g) S49A, T52N, S54G et I57R ; S49A, T52N, S54G et I57T ; S49A, T52N,
S54G et I57H ; S49A, T52S, S54G et I57R ; S49G, T52S,
S54G et I57R ; S49G, T52N, S54G et I57R ; S49A, T52S, S54G et I57T ;
S49A, T52S, S54G et I57Q; S49A, T52S, S54G et I57H ; S49G, T52S,
S54G et I57T ; S49A, T52N, S54G et I57H ; S49A, T52S, S54G et I57S ;
S49A, T52S, S54G et I57A ; S49G, T52S, S54G et I57H ; S49G, T52S,
S54G et I57R ; S49G, T52S, S54G et I57N; S49G, T52S, S54G et I57Q;
S49G, T52S, S54G et I57T ; S49G, T52S, S54G et I57S ; S49G, T52N,
S54G et I57T ; S49G, T52N, S54G et I57S ; S49G, T52N, S54G et I57H;
(h) A50S, T52A, S54G et I57W; et
(i) S49G, A50T, T52N, S54G et I57S ; S49G, A50G, T52N, S54G et I57R ;
S49G, A50S, T52N, S54G et I57R ; S49G, A50D, T52S, S54G et I57T ;
S49G, A50G, T52S, S54G et I57R; S49G, A50S, T52A, S54G et I57H ;
S49G, A50S, T52S, S54G et I57R ; S49G, A50S, T52A, S54G et I57T ; et S49G, A50S, T52A, S54G et I57S. [0037] De manière encore plus préférée, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH2 choisie parmi:
(i) S49G, T52N et I57H; S49A, S54G et I57T ; S49G, S54G et I57R ; T52N,
S54G et I57T ;
(ii) S49G, T52N, S54G et I57R ; S49G, T52N, S54G et I57H; S49G, T52N,
S54G et I57T ; S49G, T52N, S54G et I57S ; S49G, A50G, T52N et I57H ;
S49G, T52S, S54G et I57R ; S49A, T52N, S54G et I57T ; S49G, T52S,
S54G et I57N; S49G, T52S, S54G et I57Q; S49G, A50G, S54G et I57R ;
S49G, T52S, S54G et I57H ; S49G, T52S, S54G et I57T ; S49G, T52S,
S54G et I57S ; S49A, T52N, S54G et I57H ; et
(iii) S49G, A50T, T52N, S54G et I57S ; S49G, A50G, T52N, S54G et I57R ;
S49G, A50S, T52N, S54G et I57R ; S49G, A50D, T52S, S54G et I57T ;
S49G, A50G, T52S, S54G et I57R; S49G, A50S, T52A, S54G et I57H ;
S49G, A50S, T52S, S54G et I57R ; S49G, A50S, T52A, S54G et I57T ; et S49G, A50S, T52A, S54G et I57S.
[0038] Des variants particulièrement préférés selon l'invention comprennent l'une des combinaisons de substitutions suivantes dans la séquence chevauchant la région CDRH2 : S49G, T52N, S54G et I57R ; S49G, A50T, T52N, S54G et I57S ; S49G, T52N, S54G et I57H ; S49G, T52N et I57H ; S49G, A50D, T52S, S54G et I57T.
[0039] Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, lesdites au moins deux substitutions d'acides aminés dans la séquence chevauchant la région CDRH3 sont sélectionnées dans le groupe constitué par :
- la substitution de V89 par L;
- la substitution de V95 par un autre acide aminé choisi parmi A, S ou T;
- la substitution de S96 par un autre acide aminé choisi parmi A, G, H, K, N, Q,
R ou T ;
- la substitution de Y97 par H ;
- la substitution de L98 par T ;
- la substitution de S99 par P;
- la substitution de T100 par un autre acide aminé choisi parmi P ou S ; à l'exclusion des variants comprenant les résidus V89 ou L89, V95, K96, Y97, L98, P99 et S100 ; V89, V95, A96, Y97, L98, P99 et S100; les positions desdits résidus d'acides aminés étant indiquées en référence à la numérotation de Kabat.
[0040] De préférence, S96 est substitué par T, Q, N ou H.
[0041] De manière avantageuse, lesdites substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 sont choisies parmi les substitutions en positions : V89, V95, S96, Y97, L98, S99 et T100. De préférence, lesdites substitutions sont aux positions V89, V95, S96 et S99 ou V95, S96 et S99.
[0042] De manière préférée, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisie parmi:
- V95S, V95T ou V95A ; et
- S96T, S96Q, S96N ou S96H ; et
- S99P ; et éventuellement V89L.
[0043] Ledit variant comprend avantageusement une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisie parmi :
(a) S96K et S99P ;
(b) V95T, S96T et S99P ; V95T, S96K et S99P ; V95T, S96R et
S99P ; V95T, S99P et T100S ; V89L, S96K et S99P ; S96T, S99P et T100S ; S96K, S99P ; V95A, S96K et S99P ; V95S, S96K et S99P ; V95T,
S96G et S99P ; S96K, S99P et T1 OOP ; V95T, S96H et S99P ; V95T,
S96N et S99P ; V95S, S96Q et S99P ; V95A, S96H et S99P ;
(c) V89L, V95T, S96N et S99P ; V95T, S96T, S99P et T100S ; V95A, S96H,
Y97H et S99P ; V89L, S96K, L98T, S99P ; S96T, L98T, S99P et T100S ;
V89L, V95T, S96K et S99P ; V95T, S96K, S99P et T100S ; V95T, S96R L98T et S99P ; V89L, V95T, S96R et S99P ; V89L ; V95T, S96T et S99P ;
(d) V89L, V95T, S96T, S99P et T100S ; V89L, S96K, L98T et S99P ; V89L,
V95T, S96K, S99P et T100S ; V89L,V95T, S96R, S99P et T100S.
[0044] De manière plus préférée, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisie parmi : V95T, S96T et S99P ; V95T, S96N et S99P ; V95S, S96Q et S99P ; V95A, S96H et S99P ; V95T, S96G et S99P ; S96T, L98T, S99P et T100S ; V95T, S96R, L98T et S99P ; S96K, S99P et T1 OOP ; V89L, V95T, S96T et S99P.
[0045] Des variants particulièrement préférés selon l'invention comprennent l'une des combinaisons suivantes de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 : V95T, S96T et S99P ; V95T, S96N et S99P ; V95S, S96Q et S99P ; V95A, S96H et S99P ; V89L, V95T, S96T et S99P.
[0046] Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit variant comprend au moins deux substitutions dans chacune des deux séquences chevauchant la région CDRH2 ou CDRH3 telles que définies ci-dessus. De préférence, ledit variant comprend une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH2 et une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisies parmi les combinaisons telles que définies ci-dessus.
[0047] Des variants particulièrement préférés selon l'invention comprennent :
- l'une des combinaisons suivantes de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH2 : S49G, T52N, S54G et I57R ; S49G, A50T, T52N, S54G et I57S ; S49G, T52N, S54G et I57H ; S49G, T52N et I57H ; S49G, A50D, T52S, S54G et I57T ; et
- l'une des combinaisons suivantes de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 : V95T, S96T et S99P ; V95T, S96N et S99P ; V95S, S96Q et S99P ; V95A, S96H et S99P ; V89L, V95T, S96T et S99P .
[0048] Des exemples de variants particulièrement préférés selon l'invention comprennent l'une des combinaisons suivantes de substitutions dans les séquences chevauchant les régions CDRH2 et CDRH3 :
- S49G, T52N, S54G, I57R, V95S, S96Q et S99P ;
- S49G, A50T, T52N, S54G, I57S, V95T, S96T et S99P ;
- S49G, T52N, S54G, I57H, V95T, S96T et S99P ;
- S49G, T52N et I57H, V95T, S96T et S99P ;
- S49G, A50D, T52S, S54G et I57T , V95T, S96T et S99P ;
- S49G, T52N, S54G, I57R, V89L, V95T, S96T et S99P ;
- S49G, T52N, S54G, I57R, V95T, S96N et S99P ;
- - S49G, T52N, S54G, I57R, V95A, S96H et S99P. [0049] Selon un mode de réalisation de l'invention, ledit variant comprend en outre la substitution R90K dans la région CDRL3 déterminant la complémentarité du domaine variable VL.
[0050] Le variant selon l'invention comprend une chaîne lourde d'immunoglobuline humaine de n'importe quel isotype ou classe, de préférence une IgG, de manière préférée une IgG 1. Le variant selon l'invention comprend également une chaîne légère d'immunoglobuline humaine de n'importe quelle classe, de préférence une chaîne légère Kappa humaine.
[0051] Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit variant est issu de l'adalimumab. De préférence, ledit variant est sélectionné dans le groupe constitué par :
- un variant de l'adalimumab comprenant une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 24, correspondant au mutant 1 des exemples ;
- - un variant de l'adalimumab comprenant une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 25, correspondant au mutant 2 des exemples ;
- un variant de l'adalimumab comprenant une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 26, correspondant au mutant 3 des exemples ;
- un variant de l'adalimumab comprenant une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 27, correspondant au mutant 4 des exemples ;
- un variant de l'adalimumab comprenant une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 28, correspondant au mutant 5 des exemples ;
- un variant de l'adalimumab comprenant une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 29, correspondant au mutant 6 des exemples ;
- un variant de l'adalimumab comprenant une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 30, correspondant au mutant 7 des exemples ; et - un variant de l'adalimumab comprenant une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 31 , correspondant au mutant 8 des exemples.
[0052] Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit variant est caractérisé par un score de liaison à HLA II diminué d'au moins 1 ,5 ; 2 ; 2,5 ; 3 ; 3,5 ; 4 ; 4,5 ; 5 fois ou plus par rapport à l'anticorps parent dont il est issu.
[0053] . Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit variant est caractérisé par un facteur d'enrichissement relatif d'au moins 101 à 107 (101, 5.101, 102, 5.102, 103, 5.103, 104, 5.104, 105, 5.105, 106, 5. 106, 107) ou un KD au moins 1 ,2 à 40 fois inférieur (2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35) par rapport à l'anticorps parent dont il est issu.
[0054] La présente invention englobe également les variants comprenant en outre, au moins une mutation (insertion, délétion, substitution) d'acide aminé additionnelle et/ou au moins une modification conservatrices de fonction, c'est-à-dire qui préservent le potentiel immunogène réduit et l'affinité supérieure ou égale du variant. Parmi les mutations additionnelles, on peut citer notamment :
- la substitution de A60 par un autre acide aminé choisi parmi S, N ou D ;
- la substitution de D61 par un autre acide aminé choisi parmi P, G, T, N, Q, E, H ou K ; et
- la substitution de S62 par un autre acide aminé choisi parmi F, Y, W, A, G, Q,
D ou E ;
- la substitution de A100A par S ;
- la substitution de S100B par G, N ou D ;
- la substitution de S100C par Y, W, P ou Q ; et
- la substitution de Y102 par W, I, V, A, G, S, T, Q, E, H, K ou R ;
- la substitution de T52 par G ;
- la substitution de I57 par un autre acide aminé choisi parmi E, K, Y ou V;
- la substitution de V89 par T ;
- la substitution de V95 par un autre acide aminé choisi parmi G, N ou P;
- la substitution de Y97 par W ;
- la substitution de L98 par un autre acide aminé choisi parmi F, Y, M ou H; et
- la substitution de S99 par T ; et les combinaisons des substitutions précédentes. [0055] Le variant peut être modifié par l'introduction de toute modification conservatrice de fonction au niveau de résidu(s) d'acide aminé, de la liaison peptidique ou des extrémités des peptides. Cette ou ces modification(s), en particulier une ou des modifications chimiques qui sont introduites dans les peptides par les méthodes classiques connues de l'Homme du métier, incluent notamment ; la fusion de la séquence dudit variant avec celle d'une d'un peptide (étiquette utile pour la purification du variant, notamment sous forme clivable par une protéase) ou d'une protéine d'intérêt, et le couplage à une molécule ou un agent d'intérêt. Par exemple, l'anticorps peut être couplé à une molécule de PEG par les méthodes conventionnelles connues de l'homme du métier
[0056] Le variant est sous forme d'un anticorps entier, d'un fragment d'anticorps comprenant au moins le domaine de liaison à l'antigène ou d'une molécule dérivée d'un anticorps. Les anticorps entiers peuvent être de n'importe quel isotype, en particulier d'isotype humain (IgG (lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4), IgA (lgA1 ,lgA2), IgE, IgM, IgD). Les fragments d'anticorps incluent notamment les fragments Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fabc ou Fab comprenant une portion de la région Fc et les fragments d'anticorps à chaîne unique dérivés d'immunoglobulines de camélidé ou de requin (anticorps simple domaine VHH et V-NAR). Les molécules d'anticorps dérivées incluent les anticorps polyspécifiques ou multivalents et les immunoconjugués. A titre d'exemple non-limitatif on peut citer les scFv multispécifiques (dia, tria ou tetrabodies), par exemple diabodies du type scDb (« single-chain diabodies ») ou taFv (« tandem scFv fragments) et les minibodies. Les minibodies sont notamment du type scFv-HLX ; scFv-ZIP ; scFv-CH3 ; scFv -Fc ou autre.
[0057] Un autre aspect de la présente invention concerne un polynucléotide isolé codant pour un variant conforme à l'invention tel que défini ci-dessus. Ledit polynucléotide, est un ADN, un ARN ou un mélange d'ADN et d'ARN, recombinant ou synthétique. La séquence de l'ADN peut avantageusement être modifiée de façon à ce que l'usage des codons soit optimal chez l'hôte dans lequel elle est exprimée.
[0058] Un autre aspect de la présente invention concerne un vecteur comprenant ledit polypeptide. De nombreux vecteurs sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser des acides nucléiques nus (ADN ou ARN) ou des vecteurs viraux ou bactériens. Les vecteurs viraux sont notamment les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus et les AAV dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d'intérêt ; on peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules hôtes, telle qu'un transporteur comme un nanotransporteur ou une préparation de liposomes, ou de polymères cationiques, ou bien l'introduire dans ladite cellule hôte en utilisant des méthodes physiques telles que l'électroporation ou la microinjection. En outre, on peut avantageusement combiner ces méthodes, par exemple en utilisant l'électroporation associée à des liposomes.
[0059] De préférence, ledit vecteur est un vecteur d'expression comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression du variant tel que défini ci-dessus. Par exemple, ledit vecteur comprend une cassette d'expression incluant au moins un polynucléotide tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation, site d'épissage), pour permettre l'expression du variant conforme à l'invention dans une cellule de l'hôte.
[0060] Un autre aspect de la présente invention concerne une cellule hôte procaryote ou eucaryote modifiée par un polynucléotide ou un vecteur conforme à l'invention tel que défini ci-dessus, la cellule pouvant être modifiée de façon stable ou transitoire.
[0061] Un autre aspect de la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant au moins un variant, polynucléotide, vecteur, et/ou cellule dérivés tels que définis ci-dessus et un véhicule pharmaceutiquement acceptable et/ou une substance porteuse.
[0062] Les véhicules pharmaceutiquement acceptables et les substances porteuses sont celles classiquement utilisés.
[0063] Les substances porteuses sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par : les liposomes unilamellaires ou multilamellaires, les ISCOMS, les virosomes, les pseudoparticules virales, les micelles de saponine, les microsphères solides de nature saccharidique (poly(lactide-co-glycolide)) ou aurifère, et les nano particules.
[0064] La composition pharmaceutique peut comprendre en outre au moins un autre agent thérapeutique, notamment un agent antiinflammatoire ou immunomodulateur.
[0065] La composition pharmaceutique comprend une quantité thérapeutiquement active de variant, polynucléotide, vecteur, cellule. Une quantité thérapeutiquement active signifie une dose suffisante pour produire un effet thérapeutique sur la maladie à traiter, c'est-à-dire diminuer les symptômes de cette maladie. Cette dose efficace est déterminée et ajustée en fonction de facteurs tels que l'âge, le sexe et le poids du sujet. La composition pharmaceutique selon l'invention se présente sous une forme galénique adaptée l'administration choisie. La composition est généralement administrée selon les protocoles usuels d'immunothérapie à des doses et pendant une durée suffisante pour induire une réponse efficace contre la pathologie à traiter. L'administration peut être sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, notamment par perfusion ; intradermique, intrapéritonéale, orale, sublinguale, rectale, vaginale, intra-nasale, par inhalation ou par application transdermique. La composition se présente sous une forme galénique adaptée à une administration choisie.
[0066] La composition pharmaceutique selon la présente invention est utilisée en immunothérapie dans le traitement de pathologies inflammatoires ou auto-immunes. Elle peut être utilisée en combinaison avec d'autres traitements, thérapeutique ou chirurgical, notamment en combinaison avec d'autres agents thérapeutiques tels que définis ci-dessus, la composition selon l'invention et les autres agents thérapeutiques pouvant être administrés de façon simultanée, séparée ou séquentielle.
[0067] Les pathologies inflammatoires ou auto-immunes sont celles qui sont classiquement traitées par les anti-TNF-alpha. A titre d'exemples non-limitatifs de ces pathologies on peut citer la spondylarthrite ankylosante, l'arthrite rhumatoïde, la rectocolite hémorragique, l'arthrite psoriasique, la maladie de Crohn, le psoriasis cutané et l'arthrite juvénile.
[0068] La présente invention a également pour objet un variant, polynucléotide, vecteur, et/ou cellule dérivés tels que définis ci-dessus pour utilisation comme médicament, en particulier en immunothérapie, dans le traitement de pathologies inflammatoires ou auto-immunes telles que définies ci-dessus.
[0069] La présente invention a également pour objet une méthode d'immunothérapie, en particulier destinée au traitement de pathologies inflammatoires ou auto-immunes telles que définies ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend l'administration d'une dose efficace d'un variant, polynucléotide, vecteur, et/ou cellule dérivés conformes à l'invention tels que définis ci-dessus, à un individu, par tout moyen approprié tel que défini ci-dessus. De préférence, la méthode comprend l'administration d'une composition pharmaceutique selon l'invention telle que définie ci-dessus.
[0070] Le polynucléotides selon l'invention sont obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes. Par exemple, ils peuvent être obtenus par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RT-PCR ou bien par synthèse chimique totale ou partielle. Les vecteurs recombinants d'expression eucaryote ou procaryote sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes. Il s'agit notamment des vecteurs d'expression classiquement utilisés pour la production d'anticorps, en particulier d'anticorps thérapeutiques humains ou humanisés tels que des vecteurs de type tandem permettant l'expression simultanée des chaînes lourde et légère d'anticorps. Les variants produits par les cellules hôte modifiées par le vecteur recombinant sont purifiés par les méthodes conventionnelles de purification des immunoglobulines, notamment par chromatographie d'affinité.
[0071] Les caractéristiques exposées dans les paragraphes précédents peuvent, optionnellement, être mises en œuvre. Elles peuvent être mises en œuvre indépendamment les unes des autres ou en combinaison les unes avec les autres :
Brève description des dessins
[0072] D'autres caractéristiques, détails et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'identification et la caractérisation des variants selon la présente invention, ainsi qu'aux figures annexées, sur lesquels : Fig.1
[0073] [Fig. 1] présente les séquences des parties variables de l'adalimumab.
Les séquences sont numérotées selon la nomenclature Kabat. Les résidus non germinaux désignent les mutations par rapport aux allèles ayant la plus forte homologie. Les résidus impliqués dans l'interaction directe avec le TNFa sont issus de la structure publiée dans Hu et al. J. Biol. Chem. 288, 27059-27067 (2013). Le domaine variable de chaîne lourde (VH) correspond à la séquence SEQ ID NO: 1 et le le domaine variablede chaîne légère (VL) correspond à la séquence SEQ ID NO: 2.
Fig. 2
[0074] [Fig. 2] présente les épitopes T de l'adalimumab et cores d'interaction prédits. Les épitopes T de l'adalimumab ont été identifiés in vitro par test d'activation des lymphocytes T (données issues de Meunier et al.) Ils sont principalement localisés sur les CDR2 et CDR3 de la chaîne lourde. Un épitope isolé a également été identifié sur la chaîne légère au niveau du CDR3. Les cores d'interactions possible ont été prédits par l'algorithme netMHCIIpan en gris. Les cores majeurs, car prédit par un nombre important d'allèles, sont représentés en gris foncé. Séquence des positions P41 à F67 incluant le CDRH2 (SEQ ID NO : 5) ; Séquence des positions N82A à W103 incluant le CDRH3 (SEQ ID NO : 6) ; Séquence des positions L73 à Q100 incluant le CDRL3 (SEQ ID NO : 7).
Fig. 3
[0075] [Fig. 3] présente la prédiction des substitutions réduisant les scores d'immunogénicité sur l'interaction avec les molécules HLA II. L'algorithme de prédiction netMHCIIpan est utilisé de manière parallélisée pour prédire l'effet moyen que chaque substitution sur la liaison des peptides pour les molécules HLA de classe II. Un panel de 46 allèles de molécules HLA II couvrant 80% de la population mondiale a été utilisé ([Tableau 1]) et un seuil d'immunogénicité de 20%. Les mutations baissant les scores d'immunogénicité sont indiquées en dégradé de gris (plus foncé = moindre immunogénicité prédite). Séquence des positions E46 à E64 chevauchant le CDRH2 (SEQ ID NO : 8) ; Séquence des positions V89 à G104 chevauchant le CDRH3 (SEQ ID NO : 9). Fig. 4
[0076] [Fig. 4] présente l'expression et sélection de librairies de Fab par Yeast Surface Display. A : La cassette d'expression est composée d'un promoteur bidirectionnel Gal1/Gal10 avec de part et autre la chaîne lourde et la chaîne légère de l'anticorps associé au peptide signal Aga2. La chaîne lourde est fusionnée au domaine Aga2P. B : L'expression de l'anticorps est analysée à l'aide d'un anticorps couplé APC dirigé contre le domaine Ck, et l'interaction est mesurée par une streptavidine couplée PE. Les banques de DMS sont triées par des fenêtres rectangulaires basées uniquement sur la fluorescence en PE.
Fig. 5
[0077] [Fig. 5] présente les substitutions du CDRH2 et du CDRH3 n'ayant pas d'impact sur la fonction de l'adalimumab par Deep Mutational Scanning. Matrices de permissivité du CDRH2 et du CDRH3 issues des populations triées positivement. Les mutants ayant un enrichissement supérieur ou égal à la séquence parentale sont indiqués en dégradé de gris. Plus le gris est foncé, plus l'enrichissement est fort, indiquant une bonne affinité pour le TNFa. Séquence des positions E46 à E64 chevauchant le CDRH2 (SEQ ID NO : 8) ; Séquence des positions V89 à G104 chevauchant le CDRH3 (SEQ ID NO : 9).
Fig. 6
[0078] [Fig. 6] présente les substitutions du CDRH2 et du CDRH3 combinant moindre immunogénicité prédite et maintien de la fonctionnalité (DMS), correspondant à la combinaison des Figures 3 et 5. Séquence des positions E46 à E64 chevauchant le CDRH2 (SEQ ID NO : 8) ; Séquence des positions V89 à G104 chevauchant le CDRH3 (SEQ ID NO : 9).
Fig. 7
[0079] [Fig. 7] représente les banques combinatoires pour la déimmunisation.
Les cores d'interactions majeurs et leurs positions d'ancrage sont représentées en gris. Les banques ont été conçues de manière à être localisées sur ces cores d'interaction. Pour la banque portant sur le CDRH2, les codons dégénérés indiqués ont été utilisés. Pour la banque portant sur le CDRH3, des mix de trinucléotides correspondant pour chacune des positions au panel d'acides aminés indiqués ont été utilisés. Séquence des positions P41 à F67 incluant le CDRH2 (SEQ ID NO : 5) ; Séquence des positions N82A à W103 incluant le CDRH3 (SEQ ID NO : 6).
Fig. 8
[0080] [Fig. 8] présente le criblage des banques combinatoire par FACS. Les deux banques combinatoires portant sur le CDRH2 et le CDRH3 ont été criblée de manière indépendante. La première phase de sélection à l'équilibre comporte trois tris successifs à des concentrations décroissantes de TNFa biotinylé. Le premier tri à 3nM et le dernier à 500pM sont représentés sur cette figure. La seconde phase de sélection consiste à sélectionner les mutants sur leur vitesse de dissociation. Pour cela, les banques sont incubées 3h avec du TNFa biotinylé puis mise en compétition pendant 24h avec du TNFa non biotinylé. A l'issue des 24h, les banques sont triées pour sélectionner les mutants pour lesquels la vitesse de dissociation est la plus lente.
Fig. 9
[0081] [Fig. 9] présente l'évolution de la diversité en acides aminés au cours des différentes étapes de sélection. La diversité des acides aminés pour la zone du CDRH2 (A) est représentée avant et après les étapes de sélection à l'équilibre et cinétique. Pour le CDRH3 (B), la diversité est représentée à l'issue de la première étape de sélection magnétique puis après les étapes de sélection à l'équilibre et cinétique. Les acides aminés sont représentés en fonction de leur pourcentage dans un échantillon de 1000 séquences. L'acide aminé natif est représenté en gris et les substitutions en noir. Séquence des positions E46 à A60 incluant le CDRH2 (SEQ ID NO : 10) ; Séquence des positions D86 à S100C incluant le CDRH3 (SEQ ID NO : 11).
Fig. 10
[0082] [Fig. 10] présente le criblage de la banque combinatoire CDRH2-CDRH3.
La première phase de sélection à l'équilibre comporte trois tris successifs à des concentrations décroissantes de TNFa biotinylé. Le premier tri à 3nM et le dernier à 500pM sont représentés sur cette figure. La seconde phase de sélection consiste à sélectionner les mutants sur leur vitesse de dissociation. Pour cela, la banque est incubée 3h avec du TNFa biotinylé puis mise en compétition pendant 24h avec du TNFa non biotinylé. A l'issue des 24h, la banque est triée pour sélectionner les mutants pour lesquels la vitesse de dissociation est la plus lente. Fig. 11
[0083] [Fig. 11] présente l'analyse du potentiel immunogène des mutants d'intérêt. A : Prédiction par netMHCIIpan de la probabilité d'interaction avec les molécules HLA II à un seuil de 20% pour les mutants sélectionnés et la séquence native. Les prédictions sont données de manière indépendante pour la zone du CDRH2 et celle du CDRH3. B : Séquence des cores mutés (mutation en rouge) et effet de ces différentes mutations sur la prédiction de ces cores. ITWNSGHID (SEQ ID NO : 12) ; INWNGGHRD (SEQ ID NO : 13); INWNGGHSD (SEQ ID NO : 14) ; YYCAKVSYL (SEQ ID NO : 15); VSYLSTASS (SEQ ID NO : 16); YLSTASSLD (SEQ ID NO : 17); YYCAKSQYL (SEQ ID NO : 18); YYCAKTTYL (SEQ ID NO : 19); YYCAKAHYL (SEQ ID NO : 20); SQYLSTASS (SEQ ID NO : 21); TTYLSTASS (SEQ ID NO : 22); AHYLSTASS (SEQ ID NO : 23) ; YLPTASSLD (SEQ ID NO : 33).
Fig. 12
[0084] [Fig. 12] présente le détail de la prédiction netMHCIIpan pour l'adalimumab et les 3 mutants d'intérêt
Exemples
Matériels et méthodes
1. Construction des banques
[0085] Les banques de DMS ont été construites par assemblage PCR. Pour chaque position, une amorce sens comportant le codon dégénéré NNS a été utilisée pour rendre aléatoire l'acide aminé concerné. A l'issue de l'assemblage PCR, les gènes mutés sont purifiés sur gel de manière indépendante puis regroupés pour former une banque.
[0086] Pour les banques de déimmunisation, l'assemblage par PCR a également été utilisé. Pour le CDRH2 la diversité a été introduite à l'aide de codons dégénérés choisi à l'aide de l'outil CodonCalculator (http://guinevere.otago.ac.nz/cgi- bin/aef/CodonCalculator.pl) et indiqués dans la Figure 7. Pour le CDRH3 une amorce synthétisée par trinucléotides (Ella Biotech GmbH, Martinsread, Allemagne) a été utilisée afin d'insérer la diversité souhaitée. La banque finale de déimmunisation a été construite par assemblage PCR à partir des plasmides extraits des banques CDRH2 et CDRH3 à l'issue de la sélection.
2. Transformation et sélection par YSD
[0087] Les banques ont été clonées dans un plasmide bicistronique dérivé du plasmide pCT-L7.5.126 (Addgene plasmide #429000) et décrit dans la Figure 4. Comme le pCT-L7.5.126 il possède une origine de réplication levure CEN/ARS, un gène d'auxotrophie TRP, une origine de réplication bactérienne colE1 , un gène de résistance à l'ampicilline et un promoteur bidirectionnel inductible au galactose GLA1/GAL10. Le clonage de la banque dans le plasmide d'expression en YSD a été réalisé par recombinaison homologue lors de la transformation de cellules EBY100 (ATCCÔ MYA- 4941 TM ;a GAL1-AGA1 :: URA3 ura3-52 trp1 Ieu2 D1 his3 D200 pep4:: HIS2 prb1 D1 6R can1 GAL) comme décrit dans la partie précédente. Pour chacune des transformations 3 pg de plasmide linéarisé (Nhel et Sali pour VH, Ncol et Pfl23ll pour VL) et 6 pg d'insert ont été utilisé pour chacune des transformations. Toutes les banques ont été générées par électroporation selon la méthode décrite par Benatuil et al. Protein Eng. Des. Sel. 23, 155-159 (2010). Chaque banque a été transformée en une seule réaction (environ 5.107 clones indépendants obtenus par réaction) à l'exception de la banque de déimmunisation du CDRH3 ayant nécessité deux réactions compte tenu de sa diversité. Le nombre de clones transformés a été déterminé à partir d'un étalement d'une dilution au 1 : 1000, un nombre de clones transformés au moins dix fois supérieur à la taille de la banque a été respecté. Les banques ainsi clonées dans le plasmide ont été cultivées en milieu SD-CAA [6,7 g/L yeast nitrogen base without casamino acids, 20 g/L dextrose, 5 g/L casamino acids, 100 mM sodium phosphate pH 6.0] et ont été passées deux fois avant d'induire l'expression en milieu SG-CAA [6.7 g/L yeast nitrogen base without casamino acids, 20 g/L galactose, 5 g/L casamino acids, 100 mM sodium phosphate, pH 6.0] afin de minimiser les doubles transformants. Les étapes de culture et d'expression ont été réalisées selon la description faite dans la partie précédente.
[0088] La sélection des banques de DMS a été faite en une seule étape par FACS sur un appareil ARIA III (Becton Dickinson, Franklin Lakes, États-Unis). Après induction de l'expression, les banques ont été incubées 3h à 20°C avec du TNFa biotinylé (ACROBiosystems, Newark, États-Unis) à une concentration de 80pM. Après lavage des cellules avec du PBS 0,1% BSA celles-ci ont été marquées à l'aide d'un anticorps dirigé contre le domaine CK couplé APC (Thermo Fisher Scientific, Waltham, États- Unis; dilution 1 :100) et d'une streptavidine couplée PE (Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis; dilution 1 :100). La sélection des banques a été faite à l'aide de fenêtre de tri rectangulaire contenant 5% des clones d'intérêt selon les paramètres optimaux décrit par Kowalski et al. PLoS One 10, 1-23 (2015)). La sélection des banques de déimmunisation a été réalisée en plusieurs étapes. Après un éventuel tri magnétique à l'aide de billes magnétiques anti-biotine (Miltenyi Biotec, Bergisch, Allemagne) après 3h d'incubation à 20°C à une concentration de 10nM de TNFa biotinylé comme décrit par Chao et al. Nat Protoc 1, 755-768 (2006). Les banques ont subi différentes étapes de tri par FACS. Tout d'abord trois étapes successives de tri à l'équilibre à des concentrations décroissantes de TNFa biotinylé (3nM, 1nM puis 500pM) puis une étape de sélection sur la vitesse de dissociation. Pour chacun des tris l'expression des Fab a été induite puis les cellules ont été incubées 3h à 20°C avec le TNFa biotinylé avant d'être triées par FACS. Pour le tri cinétique sur la vitesse de dissociation, les cellules ont été incubées 3h avec 20nM de TNFa biotinylé, puis elles ont été lavées et incubées 24h avec du TNFa non biotinylé (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Etats-Unis) avant d'être triées par FACS.
3. Séquençage NGS des banques et analyse des données
[0089] Les plasmides ont été extraits des cellules par lyse enzymatique à l'aide du kit Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II (Zymo Research, Irvine, Etats-unis). Les fragments correspondants ont ensuite été amplifiés et les adaptateurs illumina et étiquettes de multiplexage ajoutés par 2 étapes de PCR comme décrit par Kowalsky, C. A. et al. PLoS One 10, 1-23 (2015). Les banques ont été séquencées en paired-end sur un MiSeq à l'aide d'un kit V2 2x150 cycles ou sur un iSeq toujours en 2x150 cycles (Illumina, San Diego, Etats-unis). Pour les banques de DMS une profondeur de séquençage de 50X minimum a été respectée.
[0090] Les séquences ont été démultiplexées et traitées de manière indépendante sur la plateforme Galaxy (https://usegalaxy.org/) à l'aide des fonctions décrites par Blankenberg et al., Bioinformatics 26, 1783-1785 (2010). Les séquences sont appariées (fasrq-join) et seules les séquences ayant un score de qualité supérieure ou égal à 30 sont conservées (FASTQ Quality Trimmer). Les séquences sont ensuite alignées (Align.seqs) et seule la région d'intérêt est conservée (Chop.seqs). Enfin les séquences sont traduites (transeq) et les séquences identiques sont dénombrées et agrégées (Group). L'évolution de la diversité à chacune des positions a été représentée sous forme de weblogo (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) générés à partir d'un échantillon de mille séquences.
[0091] Ces données sont ensuite traitées avec le logiciel R afin de calculer les fréquences des différents mutants et ainsi déterminer leur enrichissement comme suit : [Math 2]
Figure imgf000028_0001
Où
Figure imgf000028_0005
est la fréquence du mutant i avant la sélection et à l'issue de la
Figure imgf000028_0004
sélection.
Pour les résultats du DMS sous forme de matrice, les mutants sont représentés par une valeur sélective tenant compte de l'enrichissement de la séquence native :
[Math 3]
Figure imgf000028_0002
Où
Figure imgf000028_0006
est la fréquence de la séquence native avant la sélection e
Figure imgf000028_0003
à l'issue de la sélection.
4. Prédiction de l'interaction peptide/molécule HLA II
[0092] Les prédictions d'interaction avec les molécules HLA II ont été réalisées à l'aide de l'algorithme netMHCIIpan 3.2. (Jensen, K. K. et al., Immunology 154, 394-406 (2018)). Brièvement cet algorithme prédit la probabilité d'interaction d'une séquence avec des molécules HLA II choisies et fourni un résultat pour chaque allèle relatif à un ensemble de peptide. Une valeur de 1% pour un peptide signifie qu'il se situe parmi les 1% des peptides ayant la plus forte probabilité d'interaction avec les molécules HLA II. Pour cette étude nous avons utilisé une valeur seuil de 20% en dessous de laquelle les peptides sont considérés comme immunogènes, ainsi chaque core non humain en dessous du seuil de 20% pour un allèle compte pour une unité dans le score. Pour les hitmaps les scores sont donnés de manière relative par rapport à la séquence native, les scores négatifs traduisent une diminution du nombre de peptides en dessous du seuil de 20%.. Pour chacune des prédictions réalisées, c'est le panel de 46 allèles publié par McKinney et al. , couvrant plus de 80% des phénotypes pour chaque locus, qui a été utilisé (McKinney, D. M. et al., Immunogenetics 65, 357-370 (2013)). ([Tableau 1]).
[0093] [Tableau 1] Fréquence phénotypique et génotypique du panel de molécules HLA II utilisé (issu (McKinney, D. M. étal., précité)
Figure imgf000029_0001
[0094] De plus, un ensemble de séquences recouvrant les gènes d'immunoglobulines humaines les plus fréquents a été utilisé afin d'évaluer le caractère humain ou non de chacun des cores.
5. Production et Purification de Fab et d'IgG
[0095] Les mutants 1 à 8 ainsi que l'adalimumab natif ont été produit au format Fab, les mutants d'intérêt (1 , 2 et 7) et l'adalimumab ont également été produits au format IgG. Les chaînes variables lourdes et légères des anticorps ont été clonées dans les plasmides AbVec2.0-IGHG1 et AbVed .1 -IGKC respectivement.24 Pour la production de Fab la chaîne lourde a été clonée dans un plasmide dérivé du AbVec2.0-IGHG1 pour lequel les domaines CH2 et CH3 ont été retiré et remplacé par un tag 6His. La production de Fab et d'IgG a été réalisée de manière transitoire avec des cellules HEK293 Freestyle (Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis) et cultivées dans le milieu associé. La transfection a été réalisée à une densité de 2,5.106 cellules par mL de culture, une solution de PEI (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, États-Unis) a été utilisée comme agent de transfection. Les plasmides ont été ajoutés à la culture à un ratio 1 : 1 et à une concentration finale dans la culture de 1 ,5μg/mL pour chaque plasmide. Après 5 minutes d'agitation à 37°C et 8% de CO2, le PEI a été ajouté goutte à goutte à une concentration finale de 9μg/mL de culture. Après 24h sous agitation à 37°C et 8% CO2, la culture a été diluée au demi. La production a été stoppée 7 jours après transfection et le surnageant a été récupéré par centrifugation à 4°C, 10 min à 3000G puis 20 min à 20000G. Les protéines ont ensuite été purifiées sur un système AKTA (GE Healthcare, Pittsburgh, États-Unis). Pour les Fab la purification a été faite à l'aide d'une colonne HisTrap Excel (GE Healthcare, Pittsburgh, États-Unis) avec élution en tampon imidazole 20mM. Suite à la purification les Fab ont été dialysés afin de diminuer la concentration d'imidazole. Les IgG ont été purifiés à l'aide d'une colonne HiTrap Protein A HP (GE Healthcare, Pittsburgh, États-Unis), puis une seconde fois par SEC sur une colonne Sephacryl S-200 HR (GE Healthcare, Pittsburgh, États-Unis) afin de ne garder que la forme monomérique de l'IgG. 6. Mesure d'affinité
[0096] Les mesures d'affinité ont été réalisées de manière cinétique avec un Octet Red96 (Molecular Devices, San José, États-Unis) selon le protocole décrit par Schroter et al. ( MAbs 7, 138-151 (2015)). Brièvement, le TNFa biotinylé est immobilisé sur des sensors streptavidine (Streptavidin (SA) Biosensor) à une concentration de 20nM. Après saturation des sensors dans une solution de blocage contenant de la biotine (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, États-Unis) à 10μg/mL, l'association et la dissociation sont mesurées pendant 20 et 40 minutes respectivement. Pour les mutants 3 à 6 et le mutant 8 les mesures d'affinité ont été faites à trois concentrations de Fab : 10nM, 5nM et 2,5nM, plus une référence à 10nM sans TNFa. Pour l'adalimumab et les mutants 1, 2 et 7 les analyses ont été faites pour six concentrations de Fab : 15nM, 10nM, 5nM, 2,5nM, 1 ,25nM et 0,625nM, plus une référence à 15nM sans TNFa. Lors de l'analyse, la référence est soustraite à chacune courbe et un modèle Langmuir global 1 : 1 est appliqué pour obtenir les paramètres d'affinité.
7. Analyse de la masse des anticorps
[0097] Les masses des IgG produits (adalimumab, Mutants 1 , 2 et 7) et de l'adalimumab dans sa version commerciale (Humira) ont été déterminées par spectrométrie de masse. L'analyse été réalisée sur un appareil à haute résolution de type Q-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Etats-Unis) par UHPLC-MS comme décrit par Contrepois et al. (J. Proteome Res. 9, 5501-5509 (2010)).
L'analyse SEC-MALS a été réalisée au sein de la plateforme GIPSI de l'Université Paris-Sud, sur une HPLC (Shimadzu) avec une colonne Superdex 200 10/300 GL increase (GE Healthcare, Pittsburgh, États-Unis).
Exemple 1 : Analyse des régions immunogènes
Localisation des régions immunogènes
[0098] Préalablement à ces travaux, les épitopes T de l'adalimumab ont été identifiés in vitro par des tests d'activation spécifique des lymphocytes T CD4 à l'aide de peptides chevauchants d'une longueur de 15 ou 20 acides aminés. Les régions comportant des épitopes T sont majoritairement localisées au sein de la chaîne lourde, le CDR2 sur une zone comprise entre les résidus E46 et E64 et le CDR3 entre les acides aminés L82c et T107 (Meunier, S. et al., Cellular & Molecular Immunology, 2019, Oct 28. doi: 10.1038/s41423-019-0304-3). Un épitope T est également décrit sur la chaîne légère en amont du CDR3 (S76 à R90). (Figure 2) On peut également noter que les épitopes T identifiés comportent tous des résidus différents de la lignée germinale (Figure 2 : résidus encadrés) et peuvent par conséquent être perçus comme n'appartenant pas au soi par le système immunitaire. Afin de prédire les possibles modalités d'interaction de ces épitopes T avec les molécules HLA II, l'algorithme netMHCIIpan a été utilisé. Celui prédit quatre cores d'interaction pour les épitopes identifiés dans le CDRH2 (en gris, Figure 2). Au vu des données de MAPPS issues de Meunier et al., précité ([Tableau 2]) montrant que la région chevauchante entre les deux épitopes T du CDRH2 est systématiquement conservée parmi les peptides naturellement apprêtés par les cellules dendritiques, le core d'interaction est très probablement contenu dans cette région.
[0099] [Tableau 2] : Peptides présentés par les molécules HLA II obtenus par MAPPS
Figure imgf000033_0001
Parmi les peptides identifiés par MAPPS, ceux correspondant aux épitopes T identifiés par test celiuiaire {en gras) sont représentés sous forme de clusters de peptides chevauchant.
[0100] Ainsi, le 9-mer « ITWNSGHID » (SEQ ID NO :12) comprenant les résidus 51 à 58 (en gris foncé sur la Figure 2) prédit par netMHCIIpan est vraisemblablement le core d'interaction des épitopes T du CDRH2 parmi les cores prédits (en gris clair sur la Figure 2). Le CDRH3 est plus dense en épitopes T, un ensemble de 6 épitopes T chevauchant ont été prédits sur cette région. Le caractère chevauchant de ces épitopes laisse également penser que ces zones de chevauchement pourraient être particulièrement intéressantes pour déstabiliser l'interaction peptide/HLA II de plusieurs épitopes T simultanément. Cependant l'identification d'un core d'interaction commun dans ces zones est moins évidente que dans le cas du CDRH2 en raison de l'absence de peptide correspondant lors de l'analyse en MAPPS. Cependant trois cores d'interaction, « VYYCAKVSYL » (SEQ ID NO : 15), « VSYLSTASS » (SEQ ID NO : 16) et « YLSTASSLD » (SEQ ID NO : 17) sont prédits sur un nombre plus important d'allèles, aussi ils seront considérés comme plus probable que les autres cores prédits par netMHCIIpan. (en gris foncé sur la Figure 2) Enfin pour l'épitope T situé sur la chaîne légère, curieusement aucun des cores prédits de permet de définir une modalité d'interaction probable. Aussi pour cet épitope T la suppression de l'interaction avec les molécules HLA II présente peu d'intérêt, d'autant plus que celui-ci ne présente qu'une mutation différente de la lignée germinale en R90. Une approche différente sera donc adoptée pour cet épitope T, la mutation R90K vers le résidu germinal étant décrite comme fonctionnelle dans le brevet de G Hum ira®, cette substitution sera effectuée afin d'humaniser l'épitope T.
[0101] Les CDRH2 et CDRH3 étant les zones majeures d'immunogénicité retrouvés chez plusieurs donneurs, l'action a été focalisée sur ces deux régions afin d'obtenir une diminution d'immunogénicité la plus importante possible.
Identification des mutations réduisant l'immunogénicité
[0102] Pour réduire l'affinité épitope T/HLA II et définir ainsi une stratégie de déimmunisation, les inventeurs ont d'abord cherché à connaître l'influence des substitutions sur la prédiction de l'algorithme netMHCIIpan. Une approche systématique a été adoptée pour évaluer l'influence de toutes les substitutions possibles au niveau du CDRH2 et du CDRH3 sur la présentation par les molécules HLA II. L'algorithme netMHCIIpan a été utilisé de manière parallélisée afin de prédire l'effet moyen de chaque mutation sur un panel de 46 allèles HLA II couvrant plus de 80% de la population mondiale. Ces prédictions, représentées sous forme de matrice présentent l'effet relatif de la mutation par rapport à la séquence native (Figure 3).
[0103] Le CDRH2 présente de nombreuses mutations permettant de réduire la probabilité d'interaction avec les molécules HLA II (substitutions colorées en dégradé de gris (plus foncé = moindre immunogénicité prédite, Figure 3). Les substitutions vers des acides aminés hydrophiles ainsi que vers la proline ont généralement tendance à faire baisser les scores de prédiction sur la plupart des positions. L'introduction d'acides aminés hydrophobes en revanche a généralement l'effet inverse. Plusieurs positions présentent des substitutions susceptibles de faire baisser les scores de prédiction, majoritairement des acides aminés hydrophobes (ex : W47, V48, 151) mais également certaines substitution d'acides aminés polaires (ex : T52E, S49D) A l'inverse, la mutation de certains résidus tels que E46, G55 et D58 ne semble pas présenter d'intérêt pour réduire l'immunogénicité.
[0104] Les résultats de la prédiction pour le CDRH3 sont assez similaires, les résidus hydrophiles sont à privilégier pour déstabiliser l'interaction peptide/HLA II. (Figure 3) Les deux résidus hydrophobes Y97 et L98 mais également les 6 résidus à partir de la sérine S99, ainsi que les acides aminés V89, Y90 et Y91 sont prédits pour avoir un effet particulièrement intéressant sur l'interaction avec les molécules HLA II. En revanche, comme pour le CDRH2, certains résidus ne présentent pas d'intérêt pour réduire l'immunogénicité comme les résidus C92, D101 et G104.
[0105] Les modifications proposées par netMHCIIpan sont globalement des substitutions vers un acide aminé hydrophile, avec un effet d'autant plus fort si le résidu natif est hydrophobe. netMHCIIpan ne tenant compte ni de la structure ni de la fonctionnalité de l'anticorps, ces prédictions sont à mettre en perspective avec la tolérance à la mutation de ces acides aminés. En effet, la suppression de tous les acides aminés hydrophobes sur des régions aussi importantes que les CDR semble extrêmement risquée pour la fonctionnalité mais également pour la structure de l'anticorps. De plus des résidus appartenant à ces deux CDR ont été décrit pour leur contribution dans l'interaction avec le TNFa (Hu et al. J. Biol. Chem. 288, 27059-27067 (2013). Afin de tenir compte de ces contraintes fonctionnelles et structurales, une seconde approche systématique sur la fonction cette fois a été appliquée.
Design, construction et criblage des banques de DMS
[0106] Afin d'identifier parmi les substitutions proposées par netMHCIIpan celles qui permettent d'obtenir des mutants fonctionnels, les inventeurs ont décidé de réaliser dans un premier temps une étude fonctionnelle de ces deux régions. Une approche par mutation systématique appelée Deep Mutational Scanning (DMS) a été choisie, pour identifier les acides aminés permissifs au sein de ces zones immunogènes. Cette stratégie permet l'évaluation fonctionnelle de toutes les substitutions possibles à chaque position, chaque variant ne comportant qu'une unique mutation.
[0107] Les deux régions immunogènes ont été traitées en deux banques indépendantes. Elles portent chacune sur une région de vingt résidus et ont été construites par assemblage PCR. Pour chacun des vingt résidus la diversité a été introduite à l'aide d'un codon dégénéré NNS codant pour l'ensemble des vingt acides aminés naturels. Les codons dégénérés ont été introduits par des PCR indépendantes pour chaque position. Les vingt produits de PCR ont été mélangés de manière équimolaire afin d'obtenir une banque contenant toutes les substitutions simples pour chacune des vingt positions. Les banques ont ensuite été clonées dans un plasmide d'expression pour le Yeast Surface Display (YSD) permettant l'expression sous forme de Fab. (Figure 4A) Le clonage des deux banques a été réalisé de manière indépendante par recombinaison homologue lors de la transformation en levure. Les banques ont ensuite été exprimées en YSD et les mutants d'intérêts sélectionnés par FACS. (Figure 4B) Le criblage a été réalisé selon les conditions décrites par Kowalsky et al. ( PLoS One 10, 1-23 (2015)). Les banques ont été criblées une seule fois après trois heures d'incubation à une concentration de TNFa inférieure au KD de l'adalimumab afin d'être en mesure d'observer à la fois un gain et une perte de fonction. Les 5% des mutants exprimés ayant le plus faible signal pour l'interaction ont été sélectionnés (cf. fenêtre de tri « Négatif », Figure 4C), pour sélectionner les mutations ayant un impact délétère sur la fonction. De façon analogue, les 5% des mutants démontrant la plus forte interaction ont été sélectionnés (cf. fenêtre de tri « Positif », Figure 4C). La population de levures avant toute étape de sélection ainsi que les deux populations sélectionnées ont ensuite été séquencées par NGS.
Analyse de la permissivité des deux régions immunogènes
[0108] A partir des données de séquençage, les enrichissements de la séquence parentale (wild type) ainsi que ceux de chacun des mutants ont été calculés. Ceux-ci ont permis de calculer pour chacun des variants un score appelé valeur sélective (fitness en anglais) qui correspond au logarithme en base 2 de l'enrichissement relatif du variant par rapport à la séquence native. Afin d'obtenir une vision globale de la permissivité de chacune des régions, les mutants sont représentés dans une matrice par une couleur proportionnelle à leur valeur sélective. Pour la sélection négative, l'amplitude des valeurs sélectives est de -8 à 3, soit un enrichissement 256 fois inférieur à 8 fois supérieur à la séquence native. Pour la sélection positive l'amplitude des valeurs sélectives est sensiblement la même. Les mutants ayant un enrichissement supérieur ou égal à la séquence parentale sont indiqués en dégradé de gris. Plus le gris est foncé, plus l'enrichissement est fort, indiquant une bonne affinité pour le TNFa. (Figure 5).
[0109] Les résultats obtenus à partir de la sélection des mutants exprimés mais non fonctionnels sont particulièrement intéressants pour définir les résidus participants à l'interaction avec le TNFa. La population issue de la sélection positive est nécessaire pour l'identification des mutations permettant de maintenir ou d'augmenter l'affinité. Enfin la combinaison de ces deux matrices de résultats permet d'identifier les résidus important pour la bonne expression de l'anticorps (valeur sélective négative dans les deux conditions de sélection).
[0110] Pour la région du CDRH2, la sélection négative permet d'identifier assez clairement une région centrale de six résidus consécutifs (T52 à H56) dont les valeurs sélectives sont globalement plus élevées. Ce patch de six résidus est complété par l'alanine en position 50 et l'acide aspartique en position 58 de chaque côté. Ces huit résidus particulièrement enrichis dans la sélection négative semblent donc particulièrement importants pour l'interaction. La sélection positive permet cependant d'identifier quelques mutations fonctionnelles pour ces résidus, notamment des résidus de petite taille (alanine, glycine ou sérine) pour T52 et S54. (Figure 5) De chaque côté de cette zone d'interaction, on note également que les extrémités de la banque sont moins enrichies dans la sélection négative et se comportent différemment dans la sélection positive. Les mutants de la partie N-terminale sont peu présents dans la sélection positive aussi ces résidus semblent plutôt impliqués dans le repliement et l'expression de l'anticorps. Les mutants appartenant à la partie C-terminale, en revanche, sont un peu plus enrichis dans la sélection positive. (Figure 5) De nombreuses mutations sont autorisées, y compris vers des résidus aux propriétés différentes, tout en conservant une valeur sélective égale ou supérieure à celle de l'anticorps natif.
[0111] Les résidus impliqués dans l'interaction au niveau du CDRH3 semblent se répartir en deux groupes. Les résidus K94 et V95 d'un côté et les résidus S99 à S100c un peu plus loin. De manière assez surprenante et à l'inverse du CDRH2, certains de ces résidus sont permissifs pour des substitutions non conservatives. (Figure 5) C'est notamment le cas dans le tri positif pour le résidu V95 pour lequel la valeur sélective est augmentée lorsqu'il est substitué par un petit acide aminé, de même la mutation du résidu T100 vers des résidus aliphatiques non polaires se traduit par une augmentation de la valeur sélective. La sélection positive révèle également que les résidus Y90 à K94 ne sont pas permissifs bien qu'ils ne semblent pas impliqués directement dans l'interaction avec le TNFa. Ce type de profil est également retrouvé pour les résidus A100A, W103 et G104.
[0112] Ces premières banques permettent d'identifier les substitutions permettant une conservation de la fonctionnalité pour les deux régions d'intérêt. Elles ont permis de mettre en évidence la différence de permissivité des résidus des CDRH2 et CDRH3, en particulier ceux impliqués directement dans l'interaction. Ces données ont ensuite été utilisées afin de concevoir des banques combinatoires dans l'objectif de supprimer les épitopes T identifiés sur ces zones, tout en s'assurant que celles-ci contiennent des mutants fonctionnels.
Exemple 2 : Génération de mutants de l'adalimumab au potentiel immunogène réduit
Design des banques
[0113] Le CDRH2 compte deux épitopes T chevauchants qui partagent vraisemblablement le core d'interaction « ITWNSGHID » (en gris foncé dans la Figure 2). Par conséquent la stratégie de mutation s'est concentrée sur cette zone. Le recoupement des matrices issues du DMS et de la prédiction par netMHCIIpan ont permis de choisir les mutations permettant à la fois de déstabiliser l'interaction avec les molécules HLA II tout en conservant la fonctionnalité de l'anticorps (Figure 6). Les résidus S49, A50, T52, S54, H56 et I57 ont été sélectionnés car ils possèdent tous une ou plusieurs mutations permettant de déstabiliser l'interaction avec les molécules HLA II. Pour chacun de ces résidus, un codon dégénéré permettant de représenté au mieux les substitutions d'intérêt a été choisi. (Figure 7) Pour chaque position le nombre de substitution est réduit (1 à 5) à l'exception du résidu I57 particulièrement intéressant pour réduire l'immunogénicité et également très permissif. Ainsi ce résidu a été substitué pas tous les acides aminés non hydrophobes à l'exception de la cystéine.
[0114] Le CDRH3 comporte un ensemble de 5 épitopes T chevauchants pour lesquels nous avons défini un ensemble de 3 cores d'interaction probables (en gris foncé dans la Figure 2). Nous avons choisi de diriger la mutagénèse vers la zone de chevauchement entre les 3 cores les plus fortement prédits, à savoir les résidus V95 à T100. En effet, ces positions regroupent de nombreuses substitutions pour lesquelles une baisse d'immunogénicité est attendue. Bien que relativement peu permissive, cette région regroupe les acides aminés du CDRH3 comme la valine 95, la sérine 96 et la thréonine 100 pour lesquels différentes substitutions semblent tolérées. Pour maximiser la probabilité d'identifier des mutants actifs et potentiellement déimmunisés, nous avons choisi d'introduire dans cette zone de six résidus consécutifs toutes les substitutions par un acide aminé hydrophile et/ou de petite taille à l'exception de la cystéine sur ces six résidus consécutifs. Cette stratégie combinatoire pourra potentiellement mettre en évidence des effets de compensation, rendant ainsi possible la présence de deux substitutions non identifiées individuellement. Par ailleurs, la substitution V89L permettant de germinaliser la partie N-terminale du CDRH3 complète cette banque. (Figure 7) Du fait de la combinatoire importante, la construction de cette banque avec des codons dégénérés aurait produit une banque d'une trop grande diversité (>107) pour le criblage en YSD. Pour cette raison, lors de la synthèse des amorces utilisées pour la construction de cette banque des codons trinucléotides ont été inclut afin de réduire la diversité à moins de dix millions de mutants.
Construction et criblage
[0115] Chacune des banques a été construite par assemblage PCR, avec des amorces comportant des codons dégénérés pour le CDRH2 et des amorces synthétisées à partir de mélange de trinucléotides pour le CDRH3. Ces banques ont respectivement une diversité de 1 ,2.104 pour le CDRH2 et 3,8.106 pour le CDRH3. Comme précédemment, elles ont été clonées par recombinaison homologue dans un plasmide pour l'expression et le criblage en YSD. Après transformation des levures et induction de l'expression, le criblage par FACS a été réalisé de manière indépendante pour les deux banques et chacune des banques a subi différentes étapes de sélection.
[0116] En raison de sa diversité importante, la banque portant sur le CDRH3 rendait difficile une sélection directement par FACS. Celle-ci a donc été enrichie une première fois par tri magnétique (MACS) avec une concentration de 10nM de TNFa biotinylé. A l'exception de cet enrichissement, les étapes de criblage sont les mêmes pour les deux banques. Une première phase de trois sélections successives à l'équilibre a été réalisée à des concentrations décroissantes de TNFa biotinylé. (Figure 8) A l'issue de ces étapes, les banques ont été sélectionnées une dernière fois de manière cinétique d'obtenir des mutants ayant une vitesse de dissociation lente. Pour cela, les banques ont été saturées pendant 3h avec 20nM de TNFa biotinylé puis triées à l'issue d'une compétition de 24h contre du TNFa non biotinylé. Lors de chacune des étapes de sélection, 2 à 5 % des cellules ayant le plus fort signal en PE ont été sélectionnées par FACS à l'aide de fenêtres de tri diagonales afin de normaliser le signal de liaison par l'expression. (Figure 8) [0117] Pour comprendre l'évolution de la diversité moléculaire des banques durant les étapes de sélection, nous avons choisi d'effectuer un séquençage NGS après chacune des étapes de sélection. Les données de séquençage de la banque portant sur le CDRH2 montrent que toutes les mutations étaient bien présentes dans la banque avant le début du criblage. (Figure 8A) A l'issue des trois étapes de sélection à l'équilibre on observe un retour au résidu natif pour certaines positions, comme pour les résidus H56 et A50. En revanche, pour les autres positions mutées plusieurs résidus différents de l'acide aminé natif sont retrouvés. La dernière étape de sélection cinétique sur la vitesse de dissociation diminue quelque peu la diversité des substitutions possibles tout en renforçant globalement les profils observés initialement. A l'issu du processus de criblage, parmi les six résidus ciblés dans la banque, les résidus S49, T52, S54 et I57 sont largement substitués (Figure 9A). Ces mutations sont pour la plupart conservatives à l'exception du résidu I57 pour lequel les substitutions les plus abondantes sont des acides aminés hydrophiles. [0118] Les données de séquençage nous ont permis de calculer les valeurs d'enrichissement de chacun des mutants à l'issue du processus de sélection. Les 30 mutants les plus enrichis dans cette banque sont présentés dans le [Tableau 3].
[0119] [Tableau 3] : Sélection des 30 mutants les plus enrichis issus de la banque portant sur le CDRH2
Adalimumab
Figure imgf000041_0001
[0120] On observe que les meilleurs mutants ont été enrichis plus de deux cent fois, au total après criblage compte 174 mutants ayant un enrichissement supérieur à celui de l'adalimumab. L'algorithme netMHCIIpan a été une nouvelle fois utilisé afin de classer ces mutants et 158 d'entre eux sont prédits pour êtes potentiellement moins immunogènes.
[0121] Pour la banque portant sur le CDRH3 le séquençage de la population après la première sélection par criblage magnétique révèle une forte diversité sur les résidus 95 à 100, validant la construction de la banque. (Figure 9B) A l'issue des sélections à l'équilibre les résidus Y97 et L98 sont fortement conservés alors que les autres résidus ont des profils plutôt diversifiés avec cependant une dominance forte de la proline en position 99. La dernière étape de sélection sur la vitesse de dissociation (Kott) permet de discriminer encore davantage les mutants selon leur capacité de liaison au TNFa. La sélection par FACS montre en effet pour la banque portant sur le CDRH3 une grande hétérogénéité des propriétés de liaison des mutants après 24h de dissociation en présence de TNFa non biotinylé. (Figure 8) Cette observation se traduit, à l'issue du séquençage des mutants sélectionnés, par une forte évolution des profils de certaines positions. Les positions 89 et 100 subissent un enrichissement important vers l'acide aminé natif et les positions 95 et 96 voient leur diversité réduite. Pour les positions 97 à 98 les tendances observées à l'issue des premières sélections sont fortement renforcées et la diversité sur ces positions est très réduite. De la même manière que pour le CDRH2, à l'issue des sélections seules certaines positions semblent pouvoir être substituées. Ces mutations sont souvent conservatives à l'exception du résidu V95 autorisant la thréonine et l'alanine et le résidu S99 principalement muté en proline. Les 30 mutants les plus enrichis dans cette banque sont présentés dans le [Tableau 4],
[0122] [Tableau 4] : Sélection des 30 mutants les plus enrichis issus de la banque portant sur le CDRH3
Figure imgf000043_0001
[0123] On observe également que les facteurs d'enrichissement sont plus élevés que pour le CDRH2 avec des valeurs pouvant atteindre plusieurs millions. Après criblage, la banque comporte 310 mutants plus enrichis que la séquence native de l'adalimumab et comme pour le CDRH2 une part importante de ceux-ci (282) ont un potentiel immunogène réduit selon netMHCIIpan.
[0124] A l'issue de la sélection de ces deux banques, un nombre important de séquences alternatives potentiellement moins immunogènes ont été obtenues à la fois pour le CDRH2 et le CDRH3. Celles-ci ont été associées dans le but d'obtenir une chaîne lourde entièrement déimmunisée.
Construction d'une banque par recombinaison des mutants sélectionnés
[0125] Afin d'éviter l'association de mutations sur le CDRH2 et le CDRH3 non compatibles, le choix a été fait de recombiner l'ensemble des séquences contenues dans les deux banques à l'issue de leur criblage. Les séquences des mutants de chacune des banques ont été extraites par PCR sur les populations finales après tri cinétique. L'association des séquences a ensuite été réalisée par recombinaison aléatoire grâce à un assemblage par PCR. Cette banque combinée CDRH2 + CDRH3 a ensuite été clonée dans le plasmide d'expression en YSD décrit plus tôt par recombinaison homologue lors de la transformation en levure. Les banques CDRH2 et CDRH3 comportant respectivement un minimum de 489 et 234 mutants (retrouvé au moins 10 fois lors du séquençage) à l'issue de leurs sélections, cette banque combinatoire contient un minimum de 105 variants. Cette banque incorpore également la substitution R90K décrite comme préservant l'affinité dans le brevet de l'Humira® et permettant de germinaliser la séquence dans la région du CDRH3 et ainsi de retirer un épitope mineur (Salfed, J. G. et al. Human antibodies that bond human TNFa. (Brevet US 6258562 B1) ).
[0126] Cette banque a été criblée selon le même processus appliqué aux banques précédentes, à savoir trois tris à l'équilibre avec des concentrations décroissantes en TNFa suivi d'une sélection sur la vitesse de dissociation. (Figure 10) Cette banque étant issue de la recombinaison de séquences déjà sélectionnées, on observe un fort enrichissement initial en mutants fonctionnels avant même la première étape de sélection. La population est également très homogène dès les premières étapes de sélection, le criblage sur la vitesse de dissociation réalisé ensuite révèle cependant une population plus hétérogène.
Identification de clones d'intérêt
[0127] Après séquençage, les mutants sélectionnés ont été évalués selon leur enrichissement et 245 d'entre eux montrent une valeur supérieure à la séquence native. Parmi eux, plus de 200 mutants sont prédits pour avoir un nombre de core d'interaction avec les molécules HLA II plus faible que l'adalimumab. Leurs séquences montrent cependant une redondance dans leurs séquences, particulièrement au niveau du CDRH3. ([Tableau 5]).
[0128] [Tableau 5] : Sélection des 30 mutants les mieux classés par netMHCII pan ainsi que des 8 mutants d'intérêt issus de la banque recombinant CDRH2 et CDRH3
Figure imgf000046_0001
[0129] A l'issue des étapes de sélection, un nombre réduit de variants d'intérêt ont été choisis afin d'effectuer une caractérisation biochimique complète. Les mutants ont été sélectionnés pour leur enrichissement supérieur à la séquence native et pour leur potentiel immunogène réduit selon netMHCIIpan mais également en attachant une importance particulière à sélectionner des mutants aux séquences diverses. A partir de ces critères, 8 mutants ont été choisis afin d'être caractérisés. ([Tableau 6]).
Caractérisation des clones d'intérêt
[0130] Ces mutants ainsi que l'adalimumab ont été produits sous forme de Fab en cellules H EK afin d'être caractérisés. L'affinité de ces mutants pour le TNFa a été évaluée par Bio Layer Interferometry, tous montrent une affinité supérieure à celle de l'adalimumab. ([Tableau 6])
[0131] [Tableau 6] : Mutants d'intérêts sélectionnés dans la banque combinatoire CDRH2-CDRH3
Figure imgf000047_0001
[0132] Pour certains comme les mutants 2 et 5 on mesure une affinité augmentée de plus dix fois. L'augmentation de l'affinité pour les différents clones est majoritairement due à une diminution de la vitesse de dissociation, paramètre sélectionné lors du criblage. Si tous ces mutants ont un enrichissement supérieur à l'anticorps natif, ces valeurs ne semblent cependant pas toujours rigoureusement proportionnelles aux affinités mesurées pour ces mutants.
[0133] Les mutants 1 , 2 et 7 ont été sélectionnés pour leur immunogénicité prédite réduite afin de pousser la caractérisation plus loin. Ces trois mutants ainsi que l'anticorps natif ont été produits en HEK et purifiés au format IgG. Une analyse en spectrométrie de masse Orbitrap a permis de confirmer que les anticorps ont une masse correspondant à celle attendue, avec une résolution de l'ordre du dalton. D'autre part, une analyse par SEC-MALS (Size Exclusion Chromatography - Multi-Angle Light Scattering) a également permis de valider le caractère monomérique de ces anticorps.
[0134] Les inventeurs se sont ensuite intéressés de manière plus précise aux effets des différentes substitutions que comportent les mutants sur leur potentielle interaction avec les molécules HLA II. Ces effets sont présentés de manière globale pour le CDRH2 et le CDRH3 dans la Figure 11 A. Pour chacune des deux régions, une unité de score est comptée pour chaque core non humain prédit en dessous du seuil de 20% pour un allèle du panel ([Tableau 1]). Pour le CDRH2, la prédiction donne un score diminué de plus de 5 fois pour les mutants 1 et 7 qui partagent la même séquence sur cette région, pour le mutant 2 l'effet est encore plus fort avec une absence de cores prédits sous le seuil de 20%. Pour le CDRH3, on observe également une diminution des scores prédits pour les trois mutants, celle-ci est de plus de 50% pour les mutants 1 et 7. L'effet des mutations selon netMHCIIpan semble finalement plus fort sur le CDRH2 que sur le CDRH3. Ce constat est cependant plus nuancé si l'on s'intéresse à l'effet de ces substitutions de manière plus précise sur les cores d'interactions ciblés. (Figure 11B et Figure 12) Pour le CDRH2 le core « ITWNSGHID » (SEQ ID NO : 12) chevauchant les deux épitopes T identifiés par Meunier et al. (précité) constitue de manière probable la modalité d'interaction avec les molécules HLA II. Pour ce core, les résultats de la prédiction sont sensiblement les mêmes que pour la prédiction sur toute la région du CDRH2. Ceci permet donc de valider que l'effet observé est bien porté principalement par le core ciblé. (Figure 11 B) Pour le CDRH3 les cores potentiellement responsables de l'interaction des épitopes T identifiés sont multiples avec cependant trois cores majoritaires prédits pour un grand nombre d'allèles. (Figure 11 B) On observe une réduction du nombre d'allèles répondeurs à un seuil de 20% pour ces trois cores, cette réduction est cependant plus importante pour les cores B et C. Pour le core A la prédiction par netMHCIIPan donne également une réduction du nombre d'allèles concernés cependant celle-ci est moins marquée que pour les deux autres cores.
Conclusion
[0135] Ces travaux ont permis de comprendre de manière plus précise le rôle de chacun des résidus des deux zones dans lesquelles ont été identifiés les épitopes de l'adalimumab (CDRH2 et CDRH3). La plate-forme de YSD au format Fab implémentée avec du séquençage à haut débit ont permis dans un premier temps, l'étude fonctionnelle des régions immunogènes par DMS. Cette première étape a permis aux inventeurs de constater que, comme ils l'avaient envisagé, la réduction stricte de l'immunogénicité par suppression des épitopes T ne tend pas vers des solutions fonctionnelles. L'algorithme netMHCIIpan propose majoritairement de substituer les résidus hydrophobes par de petits acides aminés et/ou des acides aminés hydrophiles. Les résidus hydrophobes sont cependant nombreux dans les CDR et sont particulièrement importants pour la structure de ceux-ci dont dépend directement la fonctionnalité de l'anticorps. Il semble donc difficile d'envisager que la substitution de tous les acides aminés hydrophobes des CDR puissent permettre la conservation de la fonctionnalité. Cette constatation faite, le DMS s'est révélé d'autant plus important pour l'identification de substitutions fonctionnelles. Les banques ainsi générées et criblées à partir des données du DMS et des prédictions de l'algorithme netMHCIIpan ont permis d'identifier des mutants possédant une affinité accrue pour le TNFa et une immunogénicité potentielle réduite. L'obtention de ces mutants permet de répondre à la problématique de préservation de la fonctionnalité lors de la suppression d'épitopes T situés sur des régions majeures de l'interaction avec la cible. Ils montrent ainsi que la stratégie de déimmunisation proposée a permis de concilier les deux objectifs non convergents que sont la fonctionnalité de l'anticorps et la diminution de son immunogénicité.
[0136] Les mutants ont une réduction d'interaction avec les molécules HLA II prédite selon l'algorithme netMHCIIpan. De ce fait, ils sont moins susceptibles d'être présentés par les molécules HLA II et reconnus par les lymphocytes T par rapport à l'adalimumab. Ces mutants constituent ainsi des variants de l'adalimumab au pouvoir immunogène réduit et permettent de s'affranchir des problèmes d'immunogénicité rencontrés avec les anti-TNFa. Ces variants pourraient représenter une amélioration clinique en permettant de réduire le taux d'immunisation des patients. De plus, les inventeurs ont pu démontrer qu'ils possèdent une affinité augmentée pour le TNFa. Dans la mesure où l'activité biologique des anticorps anti-TNF -à savoir la neutralisation du TNF-alpha- dépend de leur affinité pour le TNF, on peut s'attendre à ce que les mutants de l'invention aient une activité biologique supérieure à celle de l'adalimumab.. Les mutants obtenus à l'issue de ces travaux pourraient ainsi être considérés comme de potentiels candidats médicaments se positionnant comme une version améliorée de l'adalumimab.

Claims

Revendications
1. Variant d'un anticorps thérapeutique anti-TNF-alpha comprenant des domaines variables VH et VL de séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2, ledit variant comprenant au moins deux substitutions d'acides aminés dans au moins une séquence chevauchant l'une des régions CDRH2 ou CDRH3 déterminant la complémentarité dudit domaine variable VH ; lesdites au moins deux substitutions d'acides aminés dans la séquence chevauchant la région CDRH2 étant sélectionnées dans le groupe constitué par :
- la substitution de S49 par un autre acide aminé choisi parmi A ou G; de préférence G ;
- la substitution de A50 par un autre acide aminé choisi parmi G, S, T ou D ;
- la substitution de T52 par un autre acide aminé choisi parmi A, N ou S ; de préférence N ou S ;
- la substitution S54G ; et
- la substitution de I57 par un autre acide aminé choisi parmi A, H, N, Q, R, S, T ou W ; de préférence A, H, S, N, Q, R ou T ; de manière préférée R, H, S ou T ; et lorsque le variant comprend le résidu A49 alors il comprend également le résidu N52, S52 ou T52 et le résidu G54 ; lesdites au moins deux substitutions d'acides aminés dans la séquence chevauchant la région CDRH3 étant sélectionnées dans le groupe constitué par :
- la substitution de V89 par L;
- la substitution de V95 par un autre acide aminé choisi parmi A, S ou T;
- la substitution de S96 par un autre acide aminé choisi parmi A, G, H, K, N, Q, R ou T ; de préférence T, Q, N ou H ;
- la substitution de Y97 par H ;
- la substitution de L98 par T ;
- la substitution de S99 par P; et
- la substitution de T100 par un autre acide aminé choisi parmi P ou S ; à l'exclusion des variants comprenant les résidus V89 ou L89, V95, K96, Y97, L98, P99 et S100 ; V89, V95, A96, Y97, L98, P99 et S100 ; les positions desdits résidus d'acides aminés étant indiquées en référence à la numérotation de Kabat ; et ledit variant présentant un potentiel immunogène réduit et une affinité de liaison pour le TNF-alpha au moins égale ou supérieure, par rapport à l'anticorps thérapeutique anti-TNF-alpha dont il est issu.
2. Variant selon la revendication 1 , comprenant une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRFI2 choisie parmi:
- S54G et I57R ;
-T52N ou T52S, S54G et I57T, I57R, I57Q ou I57H;
- S49G, T52N et I57H ;
- S49A ou S49G, S54G et I57T ou I57R ;
- S49G, T52N, T52S ou T52A ; S54G ; et I57T , I57R, I57H, I57S,
I57Q ou I57N ; et éventuellement A50T, A50G ou A50S ;
- S49A, T52N ou T52S ; S54G ; et I57T , I57R, I57H, I57Q, I57S ou I57A ; et
- S49G, A50G, S54G et I57R .
3. Variant selon la revendication 2, comprenant une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRFI2 choisie parmi:
(i) S49G, T52N et I57H; S49A, S54G et I57T ; S49G, S54G et I57R ; T52N, S54G et I57T ;
(ii) S49G, T52N, S54G et I57R ; S49G, T52N, S54G et I57H; S49G, T52N, S54G et I57T ; S49G, T52N, S54G et I57S ; S49G, A50G, T52N et I57H ; S49G, T52S, S54G et I57R ; S49A, T52N, S54G et I57T ; S49G, T52S, S54G et I57N; S49G, T52S, S54G et I57Q; S49G, A50G, S54G et I57R ; S49G, T52S, S54G et I57H ; S49G, T52S, S54G et I57T ; S49G, T52S, S54G et I57S ; S49A, T52N, S54G et I57H ; et
(iii) S49G, A50T, T52N, S54G et I57S ; S49G, A50G, T52N, S54G et I57R ; S49G, A50S, T52N, S54G et I57R ; S49G, A50D, T52S, S54G et I57T ; S49G, A50G, T52S, S54G et I57R; S49G, A50S, T52A, S54G et I57H ; S49G, A50S, T52S, S54G et I57R ; S49G, A50S, T52A, S54G et I57T ; et S49G, A50S, T52A, S54G et I57S; de préférence choisie parmi : S49G, T52N, S54G et I57R ; S49G, A50T, T52N, S54G et I57S ; S49G, T52N, S54G et I57H ; S49G, T52N et I57H ; S49G, A50D, T52S, S54G et I57T..
4. Variant selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisie parmi:
- V95S, V95T ou V95A ; et
- S96T, S96Q, S96N ou S96H ; et
- S99P ; et éventuellement V89L.
5. Variant selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisie parmi :
(a) S96K et S99P ;
(b) V95T, S96T et S99P ; V95T, S96K et S99P ; V95T, S96R et
S99P ; V95T, S99P et T100S ; V89L, S96K et S99P ; S96T, S99P et T100S ; S96K, S99P ; V95A, S96K et S99P ; V95S, S96K et S99P ; V95T, S96G et S99P ; S96K, S99P et T1 OOP ; V95T, S96H et S99P ; V95T,
S96N et S99P ; V95S, S96Q et S99P ; V95A, S96H et S99P ;
(c) V89L, V95T, S96N et S99P ; V95T, S96T, S99P et T100S ; V95A, S96H, Y97H et S99P ; V89L, S96K, L98T, S99P ; S96T, L98T, S99P et T100S ; V89L, V95T, S96K et S99P ; V95T, S96K, S99P et T100S ; V95T, S96R L98T et S99P ; V89L, V95T, S96R et S99P ; V89L ; V95T, S96T et S99P ;
(d) V89L, V95T, S96T, S99P et T100S ; V89L, S96K, L98T et S99P ; V89L, V95T, S96K, S99P et T100S ; V89L,V95T, S96R, S99P et T100S.
6. Variant selon la revendication 5 ou 6, comprenant une combinaison de substitutions dans la séquence chevauchant la région CDRH3 choisie parmi : V95T, S96T et S99P ; V95T, S96N et S99P ; V95S, S96Q et S99P ; V95A, S96H et S99P ; V95T, S96G et S99P ; S96T, L98T, S99P et T100S ; V95T, S96R, L98T et S99P ; S96K, S99P et T100P ; V89L, V95T, S96T et S99P ; de préférence choisie parmi : V95T, S96T et S99P ; V95T, S96N et S99P ; V95S, S96Q et S99P ; V95A, S96H et S99P ; V89L, V95T, S96T et S99P.
7. Variant selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant au moins 3 substitutions dans l'une des séquences chevauchant la région CDRH2 ou CDRH3 ; de préférence dans chacune desdites séquences chevauchant les régions CDRH2 et CDRH3.
8. Variant selon la revendication 7, comprenant l'une des combinaisons suivantes de substitutions dans les séquences chevauchant les régions CDRH2 et CDRH3 :
- S49G, T52N, S54G, I57R, V95S, S96Q et S99P ;
- S49G, A50T, T52N, S54G, I57S, V95T, S96T et S99P ;
- S49G, T52N, S54G, I57H, V95T, S96T et S99P ;
- S49G, T52N et I57H, V95T, S96T et S99P ;
- S49G, A50D, T52S, S54G et I57T , V95T, S96T et S99P ;
- S49G, T52N, S54G, I57R, V89L, V95T, S96T et S99P ;
- S49G, T52N, S54G, I57R, V95T, S96N et S99P ;
- - S49G, T52N, S54G, I57R, V95A, S96H et S99P.
9. Variant selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre la substitution R90K dans la région CDRL3 déterminant la complémentarité du domaine variable VL
10. Variant selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une chaîne lourde d'IgG humaine et une chaîne légère Kappa humaine.
11. Variant selon l'une quelconque des revendications précédentes, issu de l'adalimumab.
12. Variant selon la revendication 11 , comprenant une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 2 ou 32 et une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 24 à 31.
13. Vecteur d'expression comprenant un polynucléotide codant pour un variant selon l'une quelconque des revendications précédentes.
14. Composition pharmaceutique comprenant au moins un variant selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 ou un vecteur selon la revendication 13, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable et/ou une substance porteuse.
15. Composition selon la revendication 14, pour utilisation dans le traitement d'une maladie inflammatoire ou auto-immune.
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