CN106290885A - 一种血清英夫利西elisa检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血清英夫利西ELISA检测试剂盒和检测方法。包括TNF‑α包被的ELISA板、HRP标记的抗Fc段IgG抗体、四甲基联苯胺(TMB)、H2SO4和辅助试剂组成；所述的TNF‑α包被的ELISA板是通过以下方法制备的：用TNF‑α包被ELISA板，由此得到TNF‑α包被的ELISA板。本发明的检测方法和检测试剂盒敏感度高，操作简便，费用相对HPLC‑HMSA低廉。

Description

一种血清英夫利西ELISA检测试剂盒和检测方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种血清英夫利西ELISA检测试剂盒和检测方法。
背景技术：
英夫利西单克隆抗体(infliximab,IFX)是由75％人源性IgG1κ轻链的恒定区和25％鼠源性的多变区组成的嵌合型单克隆抗体，能够特异性结合游离和膜连的肿瘤坏死因子α(TNF-α)，进而阻断TNF-α激活的NF-κB促炎通路，促发过度活化的淋巴细胞凋亡，最终抑制免疫紊乱引起的组织损伤，是目前广泛应用于治疗风湿性疾病和炎症性肠病的生物制剂药物(Koji Sono,Cytokine 59,2012；Matteo Bosani,Biologics:Targets&Therapy 2009；Gert Van Assche,Gut,2012)。其中尤其对于炎症性肠病的治疗，相比传统药物如5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂(硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤)等，IFX能够迅速诱导并长期维持黏膜愈合，而后者对于延长炎症性肠病的无激素缓解期、减少并发症、减少住院率及手术率，最终延缓疾病的自然病程发展具有重要意义(2012ECCO)。IFX能够发挥促进肠道粘膜愈合的效应主要取决于药物进入患者体内后达到并维持足够的治疗窗浓度，目前研究表明IBD患者维持病情缓解需要IFX浓度维持在3–7μg/mL(Niels Vande CasteeleGastroenterology 2015)，当IBD患者IFX测定浓度低于3μg/mL，采用加大IFX剂量输注或缩短给药间隔的用药方案调整能够显著提升患者的粘膜愈合率，反之，若患者FX测定浓度高于7μg/mL，适当减量能够在不影响患者的粘膜愈合率前提下节约患者花费。因此，准确评估英夫利西的体内浓度对于患者获得更佳疗效及临床医生治疗决策具有极其重要的意义。
目前测量血清IFX浓度主要是基于高效液相色谱法的同质迁移试验(highpressure liquid chromatography-based mobility shift assay，HPLC-HMSA)，尽管该方法能够高效分离IFX，检测灵敏度达微克数量级，选择性好，操作自动化，但是该方法要求价格高昂的液相色谱仪并配备专业人员进行操作及维护，同时每次使用的色谱柱成本需要数万至数十万美元不等，分析时间至少数天，无法在临床上开展。
发明内容：
本发明的目的是提供一种高效、准确、经济的血清英夫利西单克隆抗体(IFX)ELISA检测试剂盒和检测方法。
本发明的血清英夫利西(IFX)的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
首先用TNF-α包被ELISA板，将ELISA板上固定有TNF-α的孔分成待测样本孔和标准曲线孔；
标准曲线孔中加入倍比稀释的已知浓度的标准品IFX，然后加入HRP标记的抗Fc段IgG抗体，而后加入底物TMB，在HRP的催化下变为蓝色，后在酸的作用下变为黄色，最后测定其吸光度值，通过已知浓度的标准品IFX的吸光度值绘制出标准曲线；
在待测样本孔处加入待测血清，使血清中的IFX与TNF-α结合从而固定下来，然后加入HRP标记的抗Fc段IgG抗体，而后加入底物TMB，在HRP的催化下变为蓝色，后在酸的作用下变为黄色，最后测定其吸光度值，根据待测血清的吸光度值与上述标准曲线计算出血清中IFX的浓度。
所述的测定吸光度值是在酶标仪读取450nm的吸光度值。
本发明的第二个目的是提供血清英夫利西单克隆抗体(IFX)ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括TNF-α包被的ELISA板、HRP标记的抗Fc段IgG抗体、四甲基联苯胺(TMB)、H2SO4和辅助试剂组成；
所述的TNF-α包被的ELISA板是通过以下方法制备的：用TNF-α包被ELISA板，由此得到TNF-α包被的ELISA板。
所述的辅助试剂包括pH9.6的碳酸氢盐缓冲液、质量分数1％BSA的PBS溶液、质量分数0.1％BSA的PBS溶液、体积分数0.05％PBST溶液和蒸馏水。
所述的pH9.6的碳酸氢盐缓冲液每升是这样配制的：将Na2CO3 1.59g和NaHCO32.93g加入1L的蒸馏水中，调pH达到9.6，得到碳酸氢盐缓冲液；
所述的用TNF-α包被ELISA板是用含750ng/ml TNF-α的碳酸氢盐缓冲液包被ELISA板。
所述的质量分数1％BSA的PBS溶液是在pH7.4的PBS溶液(磷酸盐缓冲液)中加入BSA使其质量分数为1％，由此得到质量分数1％BSA的PBS溶液；
所述的质量分数0.1％BSA的PBS溶液是在pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中加入BSA，使其浓度为质量分数0.1％，由此得到质量分数0.1％BSA的PBS溶液。
所述的体积分数0.05％PBST溶液是指含体积分数0.05％Tween-20的PBS溶液，其是在pH7.4PBS溶液(磷酸盐缓冲液)中加入Tween-20，使其体积分数为0.05％，由此得到体积分数0.05％PBST溶液。
本发明首先用TNF-α抗原包被吸附性强的ELISA塑料板，在待测样本孔处加入稀释好的待测血清，使血清中的IFX与TNF-α结合从而固定下来，而标准曲线孔处则加入已知浓度的经倍比稀释的标准品IFX，最后加入HRP标记的抗Fc段IgG抗体(Ben-Horin S,Gut,2010)，而后加入底物TMB，在辣根过氧化物酶(HRP)的催化下变为蓝色，后在酸的作用下变为黄色。最后在酶标仪读取450nm的吸光度值，通过已知浓度的标准品IFX的吸光度值绘制出标准曲线，根据待测血清的吸光度值计算出血清中IFX的浓度。本发明的检测方法和检测试剂盒敏感度高，操作简便，费用相对HPLC-HMSA低廉。
附图说明：
图1是IFX标准曲线示意图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：血清IFX浓度测定：
一、试剂准备：
(1)TNF-α：100μg TNF-α中加入1ml无菌去离子水，在室温下静置2小时，加入4ml质量分数0.1％BSA-PBS溶液，分装到250μl的EP管中，-20℃低温保存，避免反复冻融，工作浓度为含750ng/ml TNF-α的碳酸氢盐缓冲液，使用时，用下面的碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)稀释。
(2)碳酸氢盐缓冲液：将Na2CO3 1.59g和NaHCO3 2.93g加入1L的蒸馏水，调pH达到9.6，4℃保存不能超过1个月，使用前需恢复至室温
(3)IFX标准品：用BCA法测量标准品的IFX浓度，并分装到250μl的EP管保存于-20℃，可冻融2次。
(4)IFX阳性对照：1ml全阴性血清(阿达木、英夫利西、抗阿达木抗体、抗英夫利西抗体都为阴性)+2ug英夫利西
(5)HRP标记的抗Fc段IgG抗体：分装到250ul EP管，-80℃或-20℃低温保存。为了中期存储，可与保护性过氧化物酶溶液按1:100稀释，4℃可保存超过6个月。工作浓度为600ng/ml，2μl加入1ml 1％BSA-PBS溶液即可；
(6)TMB：4℃保存，使用前需恢复至室温
(7)2M H2SO4：4℃保存，使用前需恢复至室温；
所述的1％BSA-PBS是指质量分数1％BSA的PBS溶液，其是在pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中加入BSA使其质量分数为1％，由此得到质量分数1％BSA的PBS溶液；
所述的0.1％BSA-PBS是指质量分数0.1％BSA的PBS溶液，是在pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中加入BSA，使其质量分数为0.1％，由此得到质量分数0.1％BSA的PBS溶液。
二、IFX的测定
(1)用100ul含750ng/ml TNF-α的碳酸氢盐缓冲液包被ELISA板，4℃过夜培育；
(2)用250ul体积分数0.05％PBST洗板2次，洗去未附着于ELISA板上的TNF-α，用150ul 1％BSA-PBS封闭1-2小时，由此得到TNF-α包被的ELISA板，将TNF-α包被的ELISA板的孔分成待测样本孔和标准曲线孔；
(3)在待测孔处加入100ul用1％BSA-PBS稀释的血清(一般稀释倍数为100倍，可根据结果减少或增加稀释倍数)，使血清中的IFX与TNF-α特异性结合，以及IFX阳性对照(按1:100稀释)，阴性对照(全阴性血清，按1:100稀释)，空白对照(1％BSA-PBS)，同时在标准曲线处孔加入已知浓度的倍比稀释的标准品IFX，浓度从200ng/ml开始，倍比稀释后得到以下浓度(100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，6.25ng/ml，3.125ng/ml)，最后一孔加入1％BSA-PBS，每个标本设置1-2个副孔，室温下孵育1小时，200rpm振动；
(4)用250ul 0.05％PBST洗板4次，洗去血清中未与IFX结合的成分；
(5)加入100ul HRP标记的抗Fc段IgG抗体，与结合于ELISA板上的IFX结合，室温下孵育1小时，200rpm振动；
(5)用250ul 0.05％PBST洗板4次，洗去未结合的抗Fc段IgG抗体；
(6)避光下，每孔加入100ul TMB，直到4分钟后(通常在3-6分钟变色，根据标准孔的颜色深浅决定是否终止反应)变成蓝色后加入50ul的2M H2SO4终止反应，变成黄色；
(7)在30分钟内于ELISA检测仪上读取波长450nm下的读数。绘制出标准曲线，计算出血清中IFX的浓度。标准曲线如图1所示，从图1可以看出，其检测范围为0-200ng/ml，待测样本的浓度计算方法为将待测样本的OD值带入标准曲线拟合的公式，再乘以稀释倍数即可。
选取28例既往未接受过英夫利西治疗的克罗恩病或正常受试者作为阴性对照，测量阴性对照组的血清IFX浓度，可得出血清IFX浓度的检测下限为0.74±0.73ug/ml。孔间变异系数为0.52％，板间变异系数为6.4％。
所述的0.05％PBST是指含体积分数0.05％Tween-20的PBS溶液，其是在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中加入Tween-20，使其体积分数为0.05％，由此得到体积分数0.05％PBST溶液。

Claims (5)

1.一种血清英夫利西单克隆抗体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
首先用TNF-α包被ELISA板，将ELISA板上固定有TNF-α的孔分成待测样本孔和标准曲线孔；
标准曲线孔中加入倍比稀释的已知浓度的标准品IFX，然后加入HRP标记的抗Fc段IgG抗体，而后加入底物TMB，在HRP的催化下变为蓝色，后在酸的作用下变为黄色，最后测定其吸光度值，通过已知浓度的标准品IFX的吸光度值绘制出标准曲线；
在待测样本孔处加入待测血清，使血清中的IFX与TNF-α结合从而固定下来，然后加入HRP标记的抗Fc段IgG抗体，而后加入底物TMB，在HRP的催化下变为蓝色，后在酸的作用下变为黄色，最后测定其吸光度值，根据待测血清的吸光度值与上述标准曲线计算出血清中IFX的浓度。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的测定吸光度值是在酶标仪读取450nm的吸光度值。
3.一种血清英夫利西单克隆抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括TNF-α包被的ELISA板、HRP标记的抗Fc段IgG抗体、四甲基联苯胺(TMB)、H2SO4和辅助试剂组成；
所述的TNF-α包被的ELISA板是通过以下方法制备的：用TNF-α包被ELISA板，由此得到TNF-α包被的ELISA板。
4.根据权利要求3所述的血清英夫利西单克隆抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的辅助试剂包括pH9.6的碳酸氢盐缓冲液、质量分数1％BSA的PBS溶液、质量分数0.1％BSA的PBS溶液、体积分数0.05％PBST溶液和蒸馏水。
5.根据权利要求3所述的血清英夫利西单克隆抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的用TNF-α包被ELISA板是用含750ng/ml TNF-α的碳酸氢盐缓冲液包被ELISA板。
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