JP2021523349A - タンパク質の粘度を定量化および改変するためのシステムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
タンパク質の製剤の粘度に寄与する当該タンパク質の領域を決定するためのシステムおよび方法が提供される。濃縮タンパク質製剤の粘度を改変する方法もまた提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
本発明は、概して、高濃度治療用抗体の粘度を予測する方法に関する。
発明の背景
モノクローナル抗体は、急速に成長している生物学的治療のクラスである。モノクローナル抗体は、炎症性疾患、癌、感染症を含む幅広い範囲の適応症を有している。市販されているモノクローナル抗体の数は急速に増加しており、２０２０年までに約７０のモノクローナル抗体産物が市販されると予測されている（Ｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ，ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，７：９−１４（２０１５）（非特許文献１））。
モノクローナル抗体は、急速に成長している生物学的治療のクラスである。モノクローナル抗体は、炎症性疾患、癌、感染症を含む幅広い範囲の適応症を有している。市販されているモノクローナル抗体の数は急速に増加しており、２０２０年までに約７０のモノクローナル抗体産物が市販されると予測されている（Ｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ，ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，７：９−１４（２０１５）（非特許文献１））。
現在、最も一般的に利用される治療用抗体の投与経路は、静脈内（ＩＶ）注入である。しかしながら、頻回の投与が必要な慢性疾患患者に皮下注射が多く使用されるようになってきている。すぐに使える充填済シリンジまたは自動注射器ペンにより、患者は治療用抗体を自己投与することができる。皮下注射の抗体製剤は、典型的には、ＩＶの場合における抗体の経時的なゆっくりとした注入とは対照的に、皮下注射は１回のボーラス投与（典型的には１〜１．５ｍＬ）であるため、ＩＶ注射よりも濃縮されている。
高度に濃縮された治療用モノクローナル抗体の産生で遭遇する共通の難題は、高粘度である（Ｔｏｍａｒ，Ｄ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，８：２１６−２２８（２０１６）（非特許文献２））。粘度が高いと、注入時間が長くなり、注入部位の痛みが増すことがある。投与の問題に加えて、高粘度抗体もまた、抗体溶液のバイオプロセシングの間に問題を提起する。粘度が高いと、処理時間が長くなり、薬物産物が不安定になり、製造コストが上昇する可能性がある。近距離の静電気的および／または疎水性タンパク質‐タンパク質相互作用および電気粘性作用は、抗体の濃度依存性粘性挙動に影響を及ぼす可能性がある。
抗体の立体配座と構造動力学を特徴づけることは、主要な分析課題となり得る。多くの利用可能な構造技術は高度に洗練されており、非常に専門的な技術と大量の試料（＞μＭ量）を必要とするか、または低分解能であり、詳細な構造解析を困難にしている。したがって、低試料要件、良好分解能、および比較的速いターンアラウンドタイムでタンパク質構造を探索することができる技術が利用可能であることが望ましい。
したがって、本発明の目的は、そのタンパク質の製剤の粘度に寄与する当該タンパク質の領域を同定するための方法を提供することである。
本発明の別の目的は、濃縮タンパク質溶液の粘度を改変するための方法を提供することである。
Ｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ，ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，７：９−１４（２０１５）
Ｔｏｍａｒ，Ｄ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，８：２１６−２２８（２０１６）
タンパク質の製剤の粘度に寄与する当該タンパク質の領域を決定するためのシステムおよび方法が提供される。濃縮タンパク質製剤の粘度を改変する方法もまた提供される。
１つの実施形態は、少なくとも２つの異なる期間にわたって、重水素を含む緩衝液に対して微小透析カートリッジ中でタンパク質の試料を微小透析することによって、タンパク質の粘度に寄与する当該タンパク質中の領域を同定するための方法を提供する。その後、微小透析液が反応停止される。次いで、反応停止された試料を、水素／重水素交換質量分析システムを使用して分析して、タンパク質の他の領域に比べて重水素のレベルが減少した、試料中のタンパク質の領域を決定する。重水素のレベルが減少したタンパク質の領域は、タンパク質の粘度に寄与する。
特定の実施形態では、タンパク質の試料は、タンパク質の１０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。
いくつかの実施形態において、タンパク質の試料は、５．０〜７．５のｐＨを有する緩衝液中で微小透析される。タンパク質の試料に好ましい緩衝液は、ｐＨ６．０の１０ｍＭヒスチジンである。例示的な重水素含有緩衝液は、ｐＨ６．０の１０ｍＭヒスチジン中の重水素を含み、典型的には、微小透析は、２〜６℃、好ましくは４℃で行われる。いくつかの実施形態において、微小透析は、２０〜２５℃で実施される。異なる試料を異なる長さの時間透析することができ、例えば、１つの試料を４時間透析し、別の試料を２４時間微小透析することができる。いくつかの実施形態において、試料は、３０分間、４時間、２４時間または一晩、すなわち２６時間、透析される。
特定の実施形態では、反応停止工程は、典型的には、−２〜２℃で１〜５分間行われる。
いくつかの態様において、本方法は、質量分析の前にタンパク質をペプチドに消化する工程を含む。
別の実施形態は、タンパク質薬物の粘度に寄与する当該タンパク質薬物の領域を開示された方法に従って同定し、タンパク質薬物の粘度を改変するために、タンパク質薬物の粘度に寄与すると同定されたタンパク質薬物の領域を改変することによって、タンパク質薬物の粘度を改変する方法を提供する。薬物の粘度に寄与すると同定された領域は、少なくとも１つの領域内の１つまたは複数のアミノ酸を置換することによって改変され、必要に応じて粘度を減少または増加させることができる。
タンパク質またはタンパク質薬物は、抗体、融合タンパク質、組換えタンパク質、またはこれらの組み合わせであり得る。１つの実施形態において、タンパク質薬物は、濃縮モノクローナル抗体である。
Ｉ．定義
本明細書に別段の指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、本願請求項の発明（特に請求項の文脈において）を説明する文脈における用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「前記（ｔｈｅ）」、および同様の指示対象の使用は、単数形および複数形の両方をカバーするものと解釈される。
本明細書に別段の指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、本願請求項の発明（特に請求項の文脈において）を説明する文脈における用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「前記（ｔｈｅ）」、および同様の指示対象の使用は、単数形および複数形の両方をカバーするものと解釈される。
本明細書中の数値範囲の列挙は、本明細書中で特に指摘しない限り、単にその範囲内に該当する各値を個々に言及するための略記法としての役割を果たすことだけを意図しており、各値は、本明細書中で個々に列挙されるかのように、明細書に組み込まれる。
用語「約」の使用は、約＋／−１０％の範囲で記載された値の上または下のいずれかの値を記載することを意図しており、他の実施形態では、値の範囲は、約＋／−５％の範囲で記載された値の上または下のいずれかの値であり得、他の実施形態では、値の範囲は、約＋／−２％の範囲で記載された値の上または下のいずれかの値であり得、他の実施形態では、値の範囲は、約＋／−１％の範囲で記載された値の上または下のいずれかの値であり得る。前述の範囲は、文脈によって明確にされることが意図されており、それ以上の制限は暗示されていない。本明細書で記載した全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、或いは明らかに文脈に矛盾しない限り、任意の好適な順序で実行され得る。本明細書に提供される任意およびすべての例、または例示的な言い回し（例えば、「〜のような」）の使用は、単に本発明をよりよく理解することを意図したものであり、別段の主張がない限り、本発明の範囲に制限を与えるものではない。明細書中のいかなる言い回しも、本発明の実施に不可欠なものとして、特許請求されていない任意の構成要素を示すものとして解釈されるべきではない。
本明細書で使用される場合、「タンパク質」は、ペプチド結合によって互いに結合された２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。タンパク質にはポリペプチドおよびペプチドが含まれ、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、アルキル化、ヒドロキシル化、およびＡＤＰ−リボシル化などの改変も含まれる。タンパク質は、タンパク質ベースの薬物を含む科学的または商業的目的物であり得、タンパク質は、とりわけ、酵素、リガンド、レセプター、抗体、およびキメラまたは融合タンパク質を含む。タンパク質は、周知の細胞培養法を用いて種々のタイプの組換え細胞によって産生され、通常、遺伝子改変されたヌクレオチドベクター（例えば、キメラタンパク質をコードする配列、またはコドン最適化配列、イントロンレス配列など）のトランスフェクションによって細胞に導入され、ここで、ベクターはエピソームとして存在するか、または細胞のゲノム中に組み込まれ得る。
「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互に連結されている４つのポリペプチド鎖（２つの重（Ｈ）鎖、および２つの軽（Ｌ）鎖）からなる免疫グロブリン分子をいう。それぞれの重鎖には重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）と重鎖定常領域がある。重鎖状定常領域はＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の３つのドメインを含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は一つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域にさらに細分化され、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域の間に散在する。各ＶＨとＶＬは３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成され、それらはアミノ末端からカルボキシ末端まで次の順番に並べられている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスの、グリコシル化および非グリコシル化免疫グロブリンの両方を指す。「抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製または単離された抗体分子、例えば、抗体を発現するためにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体を包含する。「抗体」という用語はまた、２つ以上の異なるエピトープに結合することができるヘテロ四量体免疫グロブリンを含む二重特異性抗体を含む。二重特異性抗体は、概して、米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号に記載されており、これは参照により本出願に組み込まれる。
「ＣＤＲ」または相補性決定領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域内に散在する、超可変性の領域である。ＦＲは、ヒト生殖細胞系配列と同一であってもよいし、天然または人工的に改変されていてもよい。
本明細書でいう「粘度」とは、液体の運動量の移動速度をいう。それは、内部の摩擦の大きさを表す量であり、単位距離離れた平行な層が互いに対して単位速度を持っている流れに抵抗する単位面積あたりの力によって測定される。液体では、粘度とは、液体の「厚み」をいう。
「ＨＤＸ−ＭＳ」という用語は、水素／重水素交換質量分析を指す。
本明細書中で使用される場合、「透析」は、半透過性メンブランを通る選択的および受動的拡散によって、溶液中の高分子から、小さな、望ましくない化合物を除去することを容易にする分離技術である。試料と緩衝溶液（透析液と呼ばれ、通常は試料の体積の２００〜５００倍）をメンブランの両側に配置する。メンブランの孔より大きい試料分子はメンブランの試料側に保持されるが、小分子と緩衝塩類は自由にメンブランを通過し、試料中のこれらの分子の濃度が減少する。液-液界面（メンブランの一方の側に試料、他方に透析液）が開始されると、すべての分子がメンブランを横切っていずれかの方向に拡散することになり、平衡状態になる。平衡に達すると透析（拡散）は止まる。透析システムは、緩衝液交換にも使用される。
「微小透析」という用語は、１ミリリットル未満の体積を有する試料の透析をいう。
「Ｄ２Ｏ」は重水素化水の略である。重水または重水素酸化物としても知られている。Ｄ２Ｏは、通常の水中の水素の大部分を占める一般的な水素同位体の代わりに、大量の水素同位体重水素を含んでいる。重水素は水素の同位体で、中性子の付加により重さが２倍になる。
ＩＩ．粘度に寄与するタンパク質の領域を同定する方法
タンパク質の製剤の粘度に寄与する当該タンパク質の領域を決定するためのシステムおよび方法が本明細書に開示されている。濃縮タンパク質製剤の粘度を改変する方法も提供する。高度に濃縮された治療用モノクローナル抗体の開発は、モノクローナル抗体治療薬の皮下送達にとって、最も重要である。しかしながら、濃縮モノクローナル抗体治療薬の製造においては、高粘度が懸念材料である。開発プロセスの早期に候補治療薬の濃度依存性粘度挙動を迅速かつ効率的に決定するために、計算および実験ツールを開発する必要性がある。
タンパク質の製剤の粘度に寄与する当該タンパク質の領域を決定するためのシステムおよび方法が本明細書に開示されている。濃縮タンパク質製剤の粘度を改変する方法も提供する。高度に濃縮された治療用モノクローナル抗体の開発は、モノクローナル抗体治療薬の皮下送達にとって、最も重要である。しかしながら、濃縮モノクローナル抗体治療薬の製造においては、高粘度が懸念材料である。開発プロセスの早期に候補治療薬の濃度依存性粘度挙動を迅速かつ効率的に決定するために、計算および実験ツールを開発する必要性がある。
Ａ．微小透析−水素／重水素交換質量分析
開発過程において、治療用モノクローナル抗体は、他の類似モノクローナル抗体と比較して、例えば１００ｍｇ／ｍＬを超える濃度で、異常に高い粘度を示すことがある。これは、高濃度でのモノクローナル抗体の特徴的な近距離の静電気的および／または疎水性タンパク質‐タンパク質相互作用に起因する可能性がある。水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ‐ＭＳ）は、タンパク質立体配座、動力学、および相互作用を調べるための有益なツールである。しかしながら、従来の希釈標識のＨＤＸ−ＭＳ分析は、高タンパク質濃度でのみ起こる異常な挙動の分析に限界がある。
開発過程において、治療用モノクローナル抗体は、他の類似モノクローナル抗体と比較して、例えば１００ｍｇ／ｍＬを超える濃度で、異常に高い粘度を示すことがある。これは、高濃度でのモノクローナル抗体の特徴的な近距離の静電気的および／または疎水性タンパク質‐タンパク質相互作用に起因する可能性がある。水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ‐ＭＳ）は、タンパク質立体配座、動力学、および相互作用を調べるための有益なツールである。しかしながら、従来の希釈標識のＨＤＸ−ＭＳ分析は、高タンパク質濃度でのみ起こる異常な挙動の分析に限界がある。
高タンパク質濃度でのモノクローナル抗体の高粘度を支配するタンパク質‐タンパク質相互作用をＨＤＸ‐ＭＳで探索するために、Ｄ２Ｏ緩衝液希釈なしでＨＤＸ標識を達成する受動的微小透析ベースのＨＤＸ‐ＭＳ方法を開発し、種々のタンパク質濃度で特徴的な分子相互作用のプロファイリングを可能にした。一実施形態は、少なくとも２つの異なる期間にわたって、重水素を含む緩衝液に対して微小透析カートリッジ中でタンパク質の試料を微小透析することによって、粘度に寄与するタンパク質の領域を同定するための方法を提供する。微小透析液は続いて反応停止される。次いで、反応停止された試料を、水素／重水素交換質量分析システムを使用して分析して、タンパク質の他の領域に比べて重水素のレベルが減少した、試料中のタンパク質の領域を決定する。重水素のレベルが減少したタンパク質の領域は、タンパク質の粘度に寄与している。
一実施形態では、高粘度挙動を有するタンパク質を最適化して、高粘度挙動を低減または除去することができる。タンパク質薬物または抗体を最適化する方法には、粘度を低下させるためにアミノ酸配列を最適化すること、製剤のｐＨまたは塩含有量を変更すること、または賦形剤を添加することが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態では、多数の治療用タンパク質または抗体製剤を試験して、産生を前進させる最も有望な候補を決定することができる。それぞれのタンパク質や抗体の高・低濃度試料が産生される。１つの実施形態において、高タンパク質または抗体濃度は＞５０ｍｇ／ｍＬである。高濃度は、１００ｍｇ／ｍＬ、１１０ｍｇ／ｍＬ、１２０ｍｇ／ｍＬ、１３０ｍｇ／ｍＬ、１４０ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１６０ｍｇ／ｍＬ、１７０ｍｇ／ｍＬ、１８０ｍｇ／ｍＬ、１９０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、または＞２００ｍｇ／ｍＬであり得る。１つの実施形態において、低抗体濃度は１５ｍｇ未満である。低濃度は、１５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、または＜０．５ｍｇ／ｍＬであり得る。
開示された方法の各工程における、より詳しい情報が以下に提供される。
１．水素／重水素交換
水素／重水素交換は、重水素イオンを含む周囲溶媒中の水素原子により、タンパク質中の不安定な位置の水素原子が自然に置換される現象である（Ｈｏｕｄｅ，Ｄ．ａｎｄ Ｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，９８８：２６９−２８９（２０１３））。ＨＤＸは、タンパク質の３種類の水素である、炭素−水素結合の水素；側鎖基の水素；およびアミド官能基の水素（バックボーン水素とも呼ばれる）を利用する。炭素−水素結合中の水素の交換速度は観察するには遅すぎる。側鎖水素（ＯＨ、ＣＯＯＨなど）の交換速度は非常に速く、Ｈ２Ｏベースの溶液で反応を停止すると、迅速に逆交換され、交換したことが記録されない。交換速度が測定可能であり、水素結合と溶媒露出度を反映しているため、バックボーン水素だけが、タンパク質の構造と動力学を報告するのに有用である。アミド水素は二次および三次構造要素の形成に重要な役割を果たしている。それらの交換速度の測定は、個々の高次構造要素の立体配座動力学ならびに全体的なタンパク質動力学および安定性の観点から解釈できる。
水素／重水素交換は、重水素イオンを含む周囲溶媒中の水素原子により、タンパク質中の不安定な位置の水素原子が自然に置換される現象である（Ｈｏｕｄｅ，Ｄ．ａｎｄ Ｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，９８８：２６９−２８９（２０１３））。ＨＤＸは、タンパク質の３種類の水素である、炭素−水素結合の水素；側鎖基の水素；およびアミド官能基の水素（バックボーン水素とも呼ばれる）を利用する。炭素−水素結合中の水素の交換速度は観察するには遅すぎる。側鎖水素（ＯＨ、ＣＯＯＨなど）の交換速度は非常に速く、Ｈ２Ｏベースの溶液で反応を停止すると、迅速に逆交換され、交換したことが記録されない。交換速度が測定可能であり、水素結合と溶媒露出度を反映しているため、バックボーン水素だけが、タンパク質の構造と動力学を報告するのに有用である。アミド水素は二次および三次構造要素の形成に重要な役割を果たしている。それらの交換速度の測定は、個々の高次構造要素の立体配座動力学ならびに全体的なタンパク質動力学および安定性の観点から解釈できる。
交換速度は、タンパク質構造の立体配座モビリティ、水素結合強度、溶媒露出度を反映している。タンパク質のコンフォメーションに関する情報、そして最も重要なことには、同じタンパク質の２つ以上の形態間のタンパク質のコンフォメーションの違いは、交換反応をモニターすることによって抽出できる。交換速度は温度に依存し、温度が２５℃から０℃に低下すると、約１０分の１に低下する。したがって、ｐＨ２〜３および０℃（一般に「反応停止条件」と呼ばれる）では、非構造化ポリペプチド中でのアミド水素同位体交換の半減期は３０〜９０分であり、これは側鎖による溶媒遮蔽効果に依存する。水素の質量は１．００８Ｄａで、重水素（水素の２番目の同位体）の質量は２．０１４Ｄａであるので、水素交換後に質量分析器でタンパク質の質量を測定することができる。
一実施形態において、水素／重水素交換速度は、タンパク質または抗体治療薬の粘度挙動を決定するために使用される。
２．微小透析
希釈によるクラシカルな連続ＨＤＸ標識は、高度に濃縮されたタンパク質溶液の分析には適用できない。本明細書の１つの実施形態は、高度に濃縮されたタンパク質溶液での使用のためのＨＤＸ標識の代替方法を提供する。微小透析プレートでのＨＤＸ標識により、高濃度のタンパク質溶液の分析が容易になる。さらに、微小透析プレートの使用は、従来の透析装置と比較して、試料およびＤ２Ｏの使用を減少させる（Ｈｏｕｄｅ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ，J Ａｍ Ｓｏc Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，２７（４）：６６９−７６（２０１６））。微小透析プレートは、市販の微小透析プレート、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）９６ウェル微小透析プレートすることができる。
希釈によるクラシカルな連続ＨＤＸ標識は、高度に濃縮されたタンパク質溶液の分析には適用できない。本明細書の１つの実施形態は、高度に濃縮されたタンパク質溶液での使用のためのＨＤＸ標識の代替方法を提供する。微小透析プレートでのＨＤＸ標識により、高濃度のタンパク質溶液の分析が容易になる。さらに、微小透析プレートの使用は、従来の透析装置と比較して、試料およびＤ２Ｏの使用を減少させる（Ｈｏｕｄｅ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ，J Ａｍ Ｓｏc Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，２７（４）：６６９−７６（２０１６））。微小透析プレートは、市販の微小透析プレート、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）９６ウェル微小透析プレートすることができる。
１つの実施形態において、微小透析ＨＤＸ交換は、高度に濃縮されたタンパク質溶液を分析するために使用される。試料は、微小透析プレートの微小透析カートリッジにロードされる。Ｄ２Ｏ緩衝液は、ディープウェルプレートまたは他の適当な容器に加えられる。タンパク質試料を含む微小透析カートリッジを緩衝液に加え、少なくとも４時間インキュベートする。試料は、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、または２４時間超、インキュベートすることができる。この透析システムは、大量の緩衝液が必要とされる従来の連続ＨＤＸ標識において一般的であるように試料を希釈しないように、試料を含むカートリッジへの緩衝液の受動的拡散を可能にする。インキュベーション工程の間、Ｄ２Ｏ緩衝液中の重水素は、試料を含むカートリッジ中に入り、タンパク質試料のバックボーンアミド中の水素と交換される。インキュベーション工程の後、微小透析カートリッジから試料を採取する。
３．試料調製
透析された試料が微小透析カートリッジから取り出されると、試料を反応停止することによってＨＤＸ反応を終了させることができる。一実施形態では、反応停止は、反応停止緩衝液を試料に加えることによって達成される。反応停止緩衝液は、Ｈ２Ｏ中、６Ｍ ＧｌｎＨＣｌおよび０．６Ｍ ＴＣＥＰ、ｐＨ２．５を含むことができる。一実施形態では、反応停止緩衝液は、Ｈ２Ｏ中、８Ｍ 尿素、０．６Ｍ ＴＣＥＰ、ｐＨ２．５を含む。別の実施形態では、最終的な反応停止された溶液のｐＨは２．５である。
透析された試料が微小透析カートリッジから取り出されると、試料を反応停止することによってＨＤＸ反応を終了させることができる。一実施形態では、反応停止は、反応停止緩衝液を試料に加えることによって達成される。反応停止緩衝液は、Ｈ２Ｏ中、６Ｍ ＧｌｎＨＣｌおよび０．６Ｍ ＴＣＥＰ、ｐＨ２．５を含むことができる。一実施形態では、反応停止緩衝液は、Ｈ２Ｏ中、８Ｍ 尿素、０．６Ｍ ＴＣＥＰ、ｐＨ２．５を含む。別の実施形態では、最終的な反応停止された溶液のｐＨは２．５である。
一実施形態において、反応温度を低下させることは、ＨＤＸ反応を反応停止することもできる。反応は０℃で行うことができる。温度を２５℃から０℃に下げると、反応速度は１０分の１に低下する。一実施形態において、反応停止反応は、０℃以下で実施される。
反応停止後、試料は、下流側質量分析のために希釈することができる。試料は、Ｈ２Ｏ中の０．１％蟻酸（ＦＡ）または質量分析に使用するための任意の他の適当な希釈剤中で希釈することができる。その後、試料は質量分析器によって処理される。
４．質量分析
一実施形態では、重水素による水素の交換によって誘起される質量シフトを時間の経過とともに（またはその逆）測定するために、質量分析が使用される。水素の質量は１．００８Ｄａで、重水素の質量は２．０１４Ｄａであるので、水素交換後、質量分析器でタンパク質の質量を測定することができる。重水素を取り込んだタンパク質または抗体は、Ｄ２Ｏ中でインキュベートされていない天然のタンパク質または抗体と比較して質量が増大する。一般に、交換された水素の量は、柔軟性、溶媒露出度、およびタンパク質構造中の水素結合相互作用を反映している。
一実施形態では、重水素による水素の交換によって誘起される質量シフトを時間の経過とともに（またはその逆）測定するために、質量分析が使用される。水素の質量は１．００８Ｄａで、重水素の質量は２．０１４Ｄａであるので、水素交換後、質量分析器でタンパク質の質量を測定することができる。重水素を取り込んだタンパク質または抗体は、Ｄ２Ｏ中でインキュベートされていない天然のタンパク質または抗体と比較して質量が増大する。一般に、交換された水素の量は、柔軟性、溶媒露出度、およびタンパク質構造中の水素結合相互作用を反映している。
いくつかの実施形態において、より大きなタンパク質または抗体をより小さな断片またはペプチドに切断するために、オンライン消化を使用する。オンライン消化のために一般的に使用される酵素には、ペプシン、トリプシン、トリプシン／Ｌｙｓ−Ｃ、ｒＬｙｓ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｃ、およびＡｓｐ−Ｎが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、消化されたタンパク質または抗体は、質量分析に供される。質量分析を実施する方法は、当技術分野において公知である。例えば、（Ａｅｂｅｒｓｓｏｌｄ，Ｍ．，ａｎｄ Ｍａｎｎ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ，４２２：１９８−２０７（２００３））を参照されたい。一般的に使用されるタイプの質量分析には、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、エレクトロスプレイイオン化質量分析、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）が含まれるが、これらに限定されない。
ＩＩＩ．タンパク質粘度の改変のための方法
一実施形態は、開示された方法に従って、タンパク質薬物の粘度に寄与する当該タンパク質薬物の領域を同定し、タンパク質薬物の粘度に寄与すると同定されたタンパク質薬物の領域を改変して、タンパク質薬物の粘度を改変することによって、タンパク質薬物の粘度を改変する方法を提供する。薬物の粘度に寄与すると同定された領域は、必要に応じて粘度を減少または増加させるために、少なくとも１つの領域内の１つまたは複数のアミノ酸を置換することによって改変することができる。
一実施形態は、開示された方法に従って、タンパク質薬物の粘度に寄与する当該タンパク質薬物の領域を同定し、タンパク質薬物の粘度に寄与すると同定されたタンパク質薬物の領域を改変して、タンパク質薬物の粘度を改変することによって、タンパク質薬物の粘度を改変する方法を提供する。薬物の粘度に寄与すると同定された領域は、必要に応じて粘度を減少または増加させるために、少なくとも１つの領域内の１つまたは複数のアミノ酸を置換することによって改変することができる。
例えば、抗体の濃縮製剤の粘度を低下させるように、抗体の軽鎖、重鎖、または相補性決定領域を改変することができる。例示的な濃縮製剤は、５０ｍｇ／ｍＬ超、好ましくは１００ｍｇ／ｍＬ以上の抗体濃度を有する。
タンパク質または抗体薬物の他の改変には、タンパク質または抗体薬物の粘度に寄与すると決定されたタンパク質または抗体の領域におけるアミノ酸に対する化学的改変が含まれる。
１つの実施形態において、タンパク質、抗体、または薬物産物は、原核細胞または真核細胞における発現に適した１つ以上の目的とするタンパク質であるか、またはそれを含有する。例えば、目的とするタンパク質には、抗体またはその抗原結合フラグメント、キメラ抗体またはその抗原結合フラグメント、ＳｃＦｖまたはそのフラグメント、Ｆｃ融合タンパク質またはそのフラグメント、増殖因子またはそのフラグメント、サイトカインまたはそのフラグメント、細胞表面受容体またはそのフラグメントの細胞外ドメインが含まれるが、これらに限定されない。目的とするタンパク質は、単一のサブユニットからなる単純なポリペプチド、または２つ以上のサブユニットを含む複合マルチサブユニットタンパク質であってもよい。目的とするタンパク質は、生物製剤産物、食品添加剤または保存剤、または精製および品質基準に供される任意のタンパク質産物であり得る。
いくつかの実施形態において、目的とする抗体は、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、抗原結合抗体フラグメント、単鎖抗体、ダイアボディ、トリボディまたはテトラボディ、二重特異性の四価免疫グロブリンＧ様分子、デュアル可変ドメイン免疫グロブリンとよばれるもの（ＤＶＤ−ＩＧ）、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、またはＩｇＧ４抗体である。１つの実施形態において、抗体はＩｇＧ１抗体である。１つの実施形態において、抗体はＩｇＧ２抗体である。１つの実施形態において、抗体はＩｇＧ４抗体である。別の実施形態では、抗体はキメラヒンジ部を含む。さらに他の実施形態において、抗体は、キメラＦｃを含む。１つの実施形態において、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ４抗体である。１つの実施形態において、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１抗体である。１つの実施形態において、抗体はキメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１／ＩｇＧ４抗体である。
いくつかの実施形態において、抗体は、抗プログラム細胞死１抗体（例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ２０１５／０２０３５７９Ａ１に記載されている抗ＰＤ１抗体）、抗プログラム細胞死リガンド−１（例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ２０１５／０２０３５８０Ａ１に記載されている抗ＰＤ−Ｌ１抗体）、抗Ｄｌｌ４抗体、抗アンジオポエチン−２抗体（例えば、米国特許第９，４０２，８９８号に記載されている抗ＡＮＧ２抗体）、抗アンジオポエチン様３抗体（例えば、米国特許第９，０１８，３５６号に記載されている抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体）、抗血小板由来成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，２６５，８２７号に記載されている抗ＰＤＧＦＲ抗体）、抗Ｅｒｂ３抗体、抗プロラクチン受容体抗体（例えば、米国特許第９，３０２，０１５号に記載されている抗ＰＲＬＲ抗体）、抗補体５抗体（例えば、米国特許出願公開番号２０１５／０３１３１９４Ａ１に記載されている抗Ｃ５抗体）、抗ＴＮＦ抗体、抗上皮成長因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，１３２，１９２号に記載されている抗ＥＧＦＲ抗体または米国特許出願公開番号２０１５／０２５９４２３Ａ１に記載されている抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体）、抗プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン−９抗体（例えば、米国特許第８，０６２，６４０号または米国特許第９，５４０，４４９号に記載されているような抗ＰＣＳＫ９抗体）、抗成長‐分化因子−８抗体（例えば、米国特許第８，８７１，２０９号または９，２６０，５１５号に記載されているように、抗ミオスタチン抗体としても知られている抗ＧＤＦ８抗体）、抗グルカゴン受容体（例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ２０１５／０３３７０４５Ａ１またはＵＳ２０１６／００７５７７８Ａ１に記載されている抗ＧＣＧＲ抗体）、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、インターロイキン４受容体抗体（例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ２０１４／０２７１６８１Ａ１または米国特許第８，７３５，０９５号または第８，９４５，５５９号に記載されている抗ＩＬ４Ｒ抗体）、抗インターロイキン６受容体抗体（例えば、米国特許第７，５８２，２９８号、８，０４３，６１７号または９，１７３，８８０号に記載されている抗ＩＬ６Ｒ抗体）、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗インターロイキン３３（例えば、米国特許第９，４５３，０７２号または９，６３７，５３５号に記載されている抗ＩＬ３３抗体）、抗呼吸器合胞体ウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開第９，４４７，１７３号に記載されている抗ＲＳＶ抗体）、抗分化クラスター３（例えば、米国特許第９，４４７，１７３号および第９，４４７１７３号、ならびに米国特許出願第６２／２２２，６０５号に記載されている抗ＣＤ３抗体）、抗分化クラスター２０（例えば、米国特許第９，６５７，１０２号およびＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１号、ならびに米国特許第７，８７９，９８４号に記載されている抗ＣＤ２０抗体）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗分化クラスター４８（例えば、米国特許第９，２２８，０１４号に記載されている抗ＣＤ４８抗体）、抗Ｆｅｌ ｄ１抗体（例えば、米国特許第９，０７９，９４８号に記載されている）、抗中東呼吸器症候群のウイルス（例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ２０１５／０３３７０２９Ａ１に記載されている抗ＭＥＲＳ抗体）、抗エボラウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ２０１６／０２１５０４０に記載されている）、抗ジカウイルス抗体、抗リンパ球活性化遺伝子３抗体（例えば、抗ＬＡＧ３抗体、または抗ＣＤ２２３抗体）、抗神経成長因子抗体（例えば、米国特許出願公開番号ＵＳ２０１６／００１７０２９号および米国特許第８，３０９，０８８号および第９，３５３，１７６号に記載されている抗ＮＧＦ抗体）および抗タンパク質Ｙ抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異性抗体（米国特許出願公開番号ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１およびＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１に記載されている）、抗ＣＤ３×抗ムチン１６二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３×抗Ｍｕｃｌ６二重特異性抗体）、および抗ＣＤ３×抗前立腺特異的膜抗原二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３×抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、目的とするタンパク質は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アダリムマブ‐ａｔｔｏ、ａｄｏ‐トラスツズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カプロマブペンデタイド、セルトリズマブペゴル、セミプリマブ、セツキシマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、エクリズマブ、エロツズマブ、エミシズマブ−ｋｘｗｈ、エンタンシネアリロクマブ、エビナクマブ、エボロクマブ、ファシヌマブ、ゴリムマブ、ギセルクマブ、イブリツモマブチウキセタン、イダルシズマブ、インフリキシマブ、インフリキシルナブ−ａｂｄａ、インフリキシマブ−ｄｙｙｂ、イピリムマブ、イキセキズマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ネスバクマブ、ニボルマブ、オビルトキサキシマブ、オビヌツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パニツムマブ、ペンブロリズマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レスリズマブ、リヌクマブ、リツキシマブ、サリルマブ、セクキヌマブ、シルツキシマブ、トシリズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、トレボグルマブ、ウステキヌマブ、およびベドリズマブからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、目的のタンパク質は、Ｆｃ部分および別のドメインを含有する組換えタンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質は、レセプターＦｃ融合タンパク質であり、それは、Ｆｃ部分にカップリングされた、レセプターの１つ以上の細胞外ドメインを含有する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分はヒンジ領域を含み、続いてＩｇＧのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態において、レセプターＦｃ融合タンパク質は、単一のリガンドまたは多数のリガンドのいずれかに結合する２つ以上の別個のレセプター鎖を含む。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、ＩＬ−１トラップなどのＴＲＡＰタンパク質（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合された、Ｉｌ−１Ｒ１細胞外領域に融合された、ＩＬ−１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含む、リロナセプト：参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第６，９２７，００４号を参照）、またはＶＥＧＦトラップ（例えば、アフリベルセプトまたはｚｉｖアフリベルセプト、これは、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合された、ＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合された、ＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含む；米国特許番号７，０８７，４１および７，２７９，１５９を参照）である。他の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ部分に結合された、抗体の可変重鎖フラグメントおよび可変軽鎖フラグメントなどの１つ以上の抗原結合ドメインの１つ以上を含有する、ＳｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質である。
１つの実施形態において、タンパク質薬物は、濃縮モノクローナル抗体である。
実施例１．微小透析ＨＤＸ質量分析
材料および方法
ｍＡｂ１とｍＡｂ２を１０ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．０）で希釈し、高濃度試料（１２０ｍｇ／ｍＬ）と低濃度試料（１５ｍｇ／ｍＬ）を作った。１６０μｌの各試料を微小透析カートリッジにロードした。カートリッジを、Ｄ２Ｏ緩衝液を含むディープウェルプレートに挿入し、４℃で４時間または２４時間インキュベートした。インキュベーション後、５μｌの各透析試料を、表１に従って、反応停止緩衝液を試料に添加することにより反応停止した。反応停止緩衝液は、１００％Ｄ２Ｏ中に６Ｍ ＧｌｎＨＣｌ／０．６Ｍ ＴＣＥＰを含有する。反応停止反応は０℃で３分間行った。１０μｌの各反応停止試料を、表１に従って、Ｄ２Ｏ中の０．１％ＦＡで希釈した。７０μｌの各試料をＨＤＸシステムにロードした。
材料および方法
ｍＡｂ１とｍＡｂ２を１０ｍＭヒスチジン（ｐＨ６．０）で希釈し、高濃度試料（１２０ｍｇ／ｍＬ）と低濃度試料（１５ｍｇ／ｍＬ）を作った。１６０μｌの各試料を微小透析カートリッジにロードした。カートリッジを、Ｄ２Ｏ緩衝液を含むディープウェルプレートに挿入し、４℃で４時間または２４時間インキュベートした。インキュベーション後、５μｌの各透析試料を、表１に従って、反応停止緩衝液を試料に添加することにより反応停止した。反応停止緩衝液は、１００％Ｄ２Ｏ中に６Ｍ ＧｌｎＨＣｌ／０．６Ｍ ＴＣＥＰを含有する。反応停止反応は０℃で３分間行った。１０μｌの各反応停止試料を、表１に従って、Ｄ２Ｏ中の０．１％ＦＡで希釈した。７０μｌの各試料をＨＤＸシステムにロードした。
（表１）試料緩衝液および希釈液量
結果
モノクローナル抗体１（ｍＡｂ１）は、開発段階での他のモノクローナル抗体と比較して、１００ｍｇ／ｍＬを超える濃度で異常に高い粘度を示した（図１Ａ〜１Ｂ）。高タンパク質濃度でｍＡｂ１の高粘性を支配するタンパク質‐タンパク質相互作用を探索するために、Ｄ２Ｏ緩衝液希釈なしでＨＤＸ標識を達成するための、受動的微小透析に基づくＨＤＸ‐ＭＳ方法を開発し、これは、異なるタンパク質濃度での分子相互作用のプロファイリングを可能にする（図２Ａ〜２Ｆ）。
モノクローナル抗体１（ｍＡｂ１）は、開発段階での他のモノクローナル抗体と比較して、１００ｍｇ／ｍＬを超える濃度で異常に高い粘度を示した（図１Ａ〜１Ｂ）。高タンパク質濃度でｍＡｂ１の高粘性を支配するタンパク質‐タンパク質相互作用を探索するために、Ｄ２Ｏ緩衝液希釈なしでＨＤＸ標識を達成するための、受動的微小透析に基づくＨＤＸ‐ＭＳ方法を開発し、これは、異なるタンパク質濃度での分子相互作用のプロファイリングを可能にする（図２Ａ〜２Ｆ）。
ｍＡｂ１について、３つの重鎖相補決定領域および軽鎖ＣＤＲ２で、対照試料（１５ｍｇ／ｍＬ）と比較して高濃度試料（１２０ｍｇ／ｍＬ）で重水素の有意な低下が観察された（図３Ａ〜３Ｎ、表２および表３）。これらの結果は、これらのＣＤＲが、ｍＡｂ１で観察される異常な高粘度を引き起こし得る特異的な分子間相互作用に関与し得ることを示している。これらのＣＤＲが高粘度の原因であることを確認するために、開示された方法を適用して、ＣＤＲを除いてｍＡｂ１と同じアミノ酸配列を有しかつ低粘度を有するｍＡｂ２の、高濃度におけるタンパク質−タンパク質相互作用を検討した（図４Ｂ、４Ｄ、４Ｆ、および４Ｈ）。ｍＡｂ１とは異なり、高濃度のｍＡｂ２試料と低濃度のｍＡｂ２試料の間には差次的な重水素取り込みは観察されず、ｍＡｂ１のＣＤＲが高濃度で高粘性を引き起こすことをさらに確認した。
（表２）非CDR mAb1ペプチドにおける経時的な相対的重水素取り込み量
（表３）LC-CDR mAb1ペプチドにおける経時的な相対的重水素取り込み量
以上の明細書では、本発明をその特定の実施形態に関連して説明し、説明のために多くの詳細を記載してきたが、本発明は追加の実施形態の余地があり、本発明の基本原理から逸脱することなく、本明細書に記載された詳細の一部をかなり変更することができることは、当業者には明らかであろう。
本明細書に引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により援用される。本発明は、その趣旨またはその本質的な属性から逸脱することなく、他の特定の形態で実施することができ、したがって、本発明の範囲を示すものとして、前述の明細書ではなく、添付の特許請求の範囲を参照すべきである。
Claims (15)
- タンパク質の粘度に寄与する当該タンパク質中の領域を同定するための方法であって、
少なくとも２つの異なる期間にわたって、重水素を含む緩衝液に対して微小透析カートリッジ中のタンパク質の試料を微小透析する工程と、
その後、前記微小透析の試料を反応停止する工程と、
前記タンパク質の他の領域に比べて重水素のレベルが減少した、試料中の前記タンパク質の領域を決定するために、水素／重水素交換質量分析システムで前記反応停止された試料を分析する工程であって、重水素のレベルが減少した前記タンパク質の領域が、前記タンパク質の粘度に寄与する、工程と
を含む、方法。 - タンパク質の試料が、１０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記微小透析する工程におけるタンパク質の試料が、５．０〜７．５のｐＨを有する緩衝液中にある、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微小透析する工程における前記タンパク質の試料が、ｐＨ６．０の１０ｍＭヒスチジン中にある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 重水素を含む前記緩衝液が、ｐＨ６．０の１０ｍＭヒスチジンを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微小透析が２〜６℃で行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも１つの試料を４時間微量透析し、少なくとももう１つの試料を２４時間微量透析する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記反応停止する工程が、−２〜２℃で１〜５分間行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
- 質量分析の前に、前記タンパク質をペプチドに消化する工程をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質薬物の粘度を改変する方法であって、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法によって、前記タンパク質薬物の前記粘度に寄与する当該タンパク質薬物の領域を同定する工程と、
前記タンパク質薬物の粘度を改変するために、前記タンパク質薬物の前記粘度に寄与すると同定された１つまたは複数の前記領域を改変する工程と、
を含む、方法。 - 前記薬物の前記粘度に寄与すると同定された前記領域のうちの少なくとも１つが、前記少なくとも１つの領域中の１つまたは複数のアミノ酸を置換することによって改変される、請求項１０に記載の方法。
- 前記タンパク質薬物の前記粘度に寄与すると同定された前記１つまたは複数の領域が、前記タンパク質薬物の前記粘度を低下させるように改変される、請求項１０または１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質が、抗体、融合タンパク質、組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質薬物が濃縮モノクローナル抗体である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法によって製造される、タンパク質薬物。
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