KR20210007958A - 단백질 점도의 정량화 및 변형을 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

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Abstract

단백질의 제형의 점도에 기여하는 해당 단백질의 영역을 결정하는 시스템 및 방법이 제공된다. 농축된 단백질 제형의 점도를 변형하는 방법도 또한 제공된다.

Description

단백질 점도의 정량화 및 변형을 위한 시스템 및 방법
본 발명은 일반적으로 고농도 치료용 항체들의 점도를 예측하기 위한 방법에 관한 것이다.
단일클론 항체는 빠르게 성장하는 분류의 생물학적 치료제이다. 단일클론 항체들은 염증성 질환, 암 및 감염성 질환을 포함한 광범위한 적응증을 가지고 있다. 상업적으로 이용가능한 단일클론 항체들의 수가 빠른 속도로 증가하고 있으며, 2020년까지 약 70개의 단일클론 항체 제품들이 시장에 출시될 것으로 예상된다(Ecker, D.M, et al., mAbs, 7:9-14 (2015)).
현재 가장 일반적으로 사용되는 치료용 항체들의 투여 경로는 정맥내(IV) 주입이다. 그러나, 잦은 투여가 필요한 만성 질환이 있는 환자에게 피하 주사가 점점 더 많이 사용되고 있다. 즉시 사용가능한 사전-충전 주사기 또는 자동-주입기 펜을 사용하면 환자가 치료 항체들을 자가-투여할 수 있다. 피하 주사를 위한 항체 제형은, 일반적으로 IV 주입의 경우 시간이 지남에 따라 항체를 천천히 주입하는 것과 대조적으로 한 번의 볼루스(bolus) 투여(일반적으로 1 내지 1.5 mL)이기 때문에 IV 주입보다 더 농축된다.
고농축 치료용 단일클론 항체의 생산과 관련된 일반적인 문제는 고점도이다(Tomar, D.S., et al., mAbs, 8:216-228 (2016)). 고점도는 주사 시간을 늘리고 주사 부위의 통증을 증가시킬 수 있다. 투여 문제 외에도 고점도 항체들은 항체 용액의 바이오프로세싱 과정에서도 문제가 된다. 고점도는 가공 시간을 증가시키고, 의약품을 불안정하게 하고, 제조 비용을 증가시킬 수 있다. 단범위 정전기 및/또는 소수성 단백질-단백질 상호작용 및 전기점성 효과는 항체의 농도 의존적 점도 거동에 영향을 미칠 수 있다.
항체의 형태 및 구조 역학을 특성화하는 것은 주요 분석 과제가 될 수 있다. 사용가능한 많은 구조 기술들은 매우 정교하여 매우 전문적인 기술과 다량(μM 수량 초과)의 샘플이 필요하거나 분해능이 낮아 세부 구조 분석이 어렵다. 결과적으로 낮은 샘플 필요량, 우수한 분해능 및 상대적으로 빠른 처리 시간으로 단백질 구조를 조사할 수 있는 기술을 사용하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 목적은 단백질 제형의 점도에 기여하는 해당 단백질의 영역을 식별하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 농축된 단백질 용액의 점도를 변형하는 방법을 제공하는 것이다.
단백질 제형의 점도에 기여하는 해당 단백질의 영역을 결정하는 시스템 및 방법이 제공된다. 농축된 단백질 제형의 점도를 변형하는 방법도 또한 제공된다.
일 실시 형태는 적어도 2개의 상이한 기간 동안 중수소를 함유하는 완충액에 대해 미세투석 카트리지의 단백질의 샘플을 미세투석함으로써 단백질의 점도에 기여하는 단백질의 영역을 식별하는 방법을 제공한다. 미세투석은 이어서 냉각(quench)된다. 이어서, 냉각된 샘플은 수소/중수소 교환 질량 분석(hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry) 시스템을 사용하여 분석하여 단백질의 다른 영역에 비해 감소된 수준의 중수소를 갖는 샘플의 단백질의 영역을 결정한다. 감소된 수준의 중수소를 갖는 단백질의 영역은 단백질의 점도에 기여한다.
특정 실시 형태들에서, 단백질의 샘플은 단백질의 농도가 10 mg/mL 내지 200 mg/mL이다.
일부 실시 형태들에서, 단백질의 샘플은 5.0 내지 7.5의 pH를 갖는 완충액에서 미세투석된다. 단백질의 샘플을 위한 바람직한 완충액은 pH 6.0의 10 mM 히스티딘이다. 예시적인 중수소 함유 완충액은 pH 6.0의 10 mM 히스티딘 중의 중수소를 함유한다. 일반적으로 미세투석은 2 내지 6°C, 바람직하게는 4°C에서 수행된다. 일부 실시 형태들에서 미세투석은 20 내지 25°C에서 수행된다. 상이한 샘플이 상이한 시간 동안 투석될 수 있는데, 예를 들어 한 샘플은 4시간 동안 투석될 수 있고 다른 샘플은 24시간 동안 미세투석될 수 있다. 일부 실시 형태들에서, 샘플은 30분, 4시간, 24시간 또는 밤새, 즉 26시간 동안 투석된다.
특정 실시 형태들에서, 냉각 단계는 전형적으로 1 내지 5분 동안 -2 내지 2°C에서 수행된다.
일부 실시 형태들에서, 방법은 질량 분석법 분석 전에 단백질을 펩티드로 분해하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시 형태는, 개시된 방법에 따라 단백질 약물의 점도에 기여하는 단백질 약물의 영역을 식별하고, 단백질 약물의 점도에 기여하는 것으로 식별된 단백질 약물의 영역을 변형하여 단백질 약물의 점도를 변형함으로써 단백질 약물의 점도를 변형하는 방법을 제공한다. 약물의 점도에 기여하는 것으로 식별된 영역은 원하는 대로 점도를 감소시키거나 증가시키기 위해 적어도 하나의 영역에서 하나 이상의 아미노산을 대체함으로써 변형될 수 있다.
단백질 또는 단백질 약물은 항체, 융합 단백질, 재조합 단백질 또는 이들의 조합일 수 있다. 일 실시 형태에서, 단백질 약물은 농축된 단일클론 항체이다.
도 1a는 농도(mg/mL)의 함수로서 mAb1의 점도(cP)를 도시한 선 그래프이다. 도 1b는 농도(mg/mL)의 함수로서 mAb2의 점도(cP)를 도시한 선 그래프이다.
도 2a 내지 도 2f는 예시적인 미세투석 기반 HDX-MS 프로토콜의 개략도이다. 미세투석 카트리지를 얻고(도 2a), D2O 완충액을 딥웰(deep-well) 플레이트에 첨가하고(도 2b), 샘플을 미세투석 카트리지에 로딩하고(도 2c), 미세투석 카트리지를 딥웰 플레이트에 로딩하고(도 2d), 샘플을 다양한 시점 동안 D2O 완충액에서 배양하고(도 2e), 샘플을 MS 분석을 위해 제거한다(도 2f).
도 3a 내지 도 3f는 중수소 배양 후 0시간(도 3a 및 도 3d). 4시간(도 3b 및 도 3e), 또는 24시간(도 3c 및 도 3f)에서, 15mg/mL 농도(도 3a 내지 도 3c) 및 120mg/mL 농도(도 3d 및 도 3f)의 비-CDR mAb1 샘플 내의 시간에 따른 중수소 흡수의 예시적인 스펙트로그램들이다. 도 3g 내지 도 3l은 중수소 배양 후 0시간(도 3g 및 도 3j), 4시간(도 3h 및 도 3k), 또는 24시간(도 3i 및 도 3l)에서, 15mg/mL 농도(도 3g 내지 도 3i) 및 120mg/mL 농도(도 3j 내지 도 3l)의 비-CDR mAb1 샘플 내의 시간에 따른 중수소 흡수의 스펙트로그램들이다. 도 3m 및 도 3n은 mAb1 HC36 내지 47 및 mAb1 LC48 내지 53에 대해 15mg/mL(
Figure pct00001
) 및 120mg/mL(■)에 대해 시간(hr)에 대한 중수소 흡수(%)를 도시한 중수소 흡수 플롯들이다.
도 4a 및 도 4b 그리고 도 4e 및 도 4f는 중수소 배양 4시간 또는 24시간 이후 mAb1(도 4a 및 도 4e) 및 mAb2(도 4b 및 도 4f)에 대한 중쇄 CDR 영역 내의 상대 중수소 흡수를 도시한 나비 플롯들이다. 상단 플롯은 120mg/mL 샘플 농도를 나타내고, 하단 플롯은 15mg/mL 샘플 농도를 나타낸다. X-축은 펩티드 번호를 나타내고, Y-축은 차동 중수소 흡수(%)를 나타낸다. 도 4c 및 도 4d 그리고 도 4g 및 도 4h는 중수소 배양 4시간 또는 24시간 이후 mAb1(도 4c 및 도 4g) 및 mAb2(도 4d 및 도 4h)에 대한 중쇄 CDR 영역 내의 상대 중수소 흡수를 도시한 잔차 플롯들이다. 상단 플롯은 120mg/mL 샘플 농도를 나타내고, 하단 플롯은 15mg/mL 샘플 농도를 나타낸다. X-축은 펩티드 번호를 나타내고, Y-축은 차동 중수소 흡수(%)를 나타낸다. 도 4g 내지 도 4h는 배양 4시간 또는 24시간 이후 mAb1 경쇄(도 4g) 및 mAb2 경쇄(도 4h) 내의 중수소 흡수의 잔차 플롯들이다. X-축은 펩티드 번호를 나타내고, Y-축은 차동 중수소 흡수(%)를 나타낸다.
I. 정의
현재 청구된 발명을 설명하는 것과 관련하여(특히 청구항들과 관련하여) 용어들 “한(a), 한(an), 그(the), 그리고 유사한 지시어들(referents)의 사용은, 본 명세서에 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 둘 다를 커버하는 것으로 해석되어야 한다.
본 명세서에서의 값들의 범위들의 열거는, 본 명세서에 달리 지시되지 않는 한, 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 언급하는 약기 방법(shorthand method)으로서 역할하도록 의도되며, 각각의 별개의 값은 마치 본 명세서에 개별적으로 열거된 것처럼 본 명세서에 포함된다.
"약"이라는 용어는 언급된 값의 위 또는 아래로 대략 +/- 10% 범위에 있는 값임을 설명하기 위해 사용되며; 다른 실시 형태들에서, 값들은 언급된 값의 위 또는 아래로 대략 +/- 5 % 범위 내에서 있으며, 다른 실시 형태들에서, 값들은 언급된 값의 위 또는 아래로 대략 +/- 2 % 범위 내에서 있으며, 다른 실시 형태들에서, 값들은 언급된 값의 위 또는 아래로 대략 +/- 1 % 범위 내에서 있을 수 있다. 상기 범위들은 문맥에 의해 명확하게 되도록 의도되며, 더 이상의 제한은 암시되지 않는다. 본 명세서에 기술된 모든 방법은, 본 명세서에 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 달리 명확하게 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 예 및 모든 예들, 또는 예시 표현(language)(예를 들어, "~와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 보다 명확히 하도록 의도되며, 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범주에 대한 제한을 부과하지 않는다. 명세서에서의 어떠한 표현도 임의의 비-청구된 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, “단백질"은 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 둘 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다. 단백질은 폴리펩티드 및 펩티드를 포함하고, 또한 글리코실화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 알킬화, 히드록실화 및 ADP-리보실화와 같은 변형들을 포함할 수 있다. 단백질은 단백질-기반 약물을 포함하여 과학적 또는 상업적으로 관심을 받을 수 있고, 단백질은 특히 효소, 리간드, 수용체, 항체 및 키메라 또는 융합 단백질을 포함한다. 단백질은 공지된 세포 배양 방법을 사용하여 다양한 유형의 재조합 세포에 의해 생성되고, 일반적으로 유전자 조작 뉴클레오티드 벡터(예를 들어, 키메라 단백질을 코딩하는 서열 또는 코돈-최적화된 서열, 인트론리스 서열 등과 같음)의 형질전환에 의해 세포 내로 도입되며, 벡터는 에피솜으로 존재하거나 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.
“항체"는 이황화물 결합에 의해 상호연결된 2개의 중(H)쇄와 2개의 경(L)쇄인 4개의 폴리펩티드쇄로 구성된 면역글로불린 분자를 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH) 및 중쇄 불변 영역을 갖는다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 함유한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 갖는다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라 명명되는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라 명명되는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 용어 "항체"는 임의의 아이소타입 또는 서브클래스의 글리코실화 및 비글리코실화 면역글로불린 둘 모두에 대한 언급을 포함한다. 용어 "항체"는 항체를 발현하기 위해 형질감염된 숙주 세포로부터 단리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 항체 분자를 포함한다. 용어 항체는 또한 1개 초과의 상이한 에피토프에 결합될 수 있는 이종 사량체 면역글로불린을 포함하는 이중특이적 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 일반적으로 미국 특허 출원 공개 제2010/0331527호에 기술되어 있으며, 이 특허는 본 명세서에 참고로 포함된다.
“CDR” 또는 상보성 결정 영역은 "프레임워크 영역”(FR)이라 명명되는 더욱 보존된 영역 내에 산재되어 있는 초가변성 영역이다. FR은 인간 생식세포계열 서열과 동일하거나 자연적으로 또는 인위적으로 변형될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "점도"는 액체 운동량의 전달 속도를 지칭한다. 이는 단위 간격으로 떨어진 평행한 층들이 서로에 대해 단위 속도를 갖는 흐름에 저항하는 단위 면적당 힘으로 측정되는 내부 마찰의 크기를 나타내는 양이다. 액체에서 점도는 액체의 "두께"를 지칭한다.
용어 "HDX-MS"는 수소/중수소 교환 질량 분석법을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "투석"은 반투과성 막을 통한 선택적이고 수동적인 확산에 의해 용액의 거대 분자로부터 작고 원치 않는 화합물의 제거를 용이하게 하는 분리 기술이다. 샘플과 완충액(투석액이라고 함, 일반적으로 샘플 부피의 200 내지 500배)은 막의 반대쪽에 놓인다. 막-세공보다 큰 샘플 분자는 막의 샘플 측에 유지되지만, 작은 분자 및 완충 염은 막을 자유롭게 통과하여 샘플 내의 그러한 분자의 농도가 감소된다. 액체-액체 계면(막의 일측에 샘플 및 타측에 투석액)이 개시되면, 모든 분자들은 평형에 도달하기 위해 막을 가로질러 어느 방향으로든 확산하려고 한다. 평형에 도달하면 투석(확산)이 중지된다. 투석 시스템은 완충액 교환에도 사용된다.
용어 "미세투석"은 부피가 1밀리리터 미만인 샘플의 투석을 지칭한다.
“D2O”는 중수소화된 물(deuterated water)의 약자이다. 이는 또한 중수(heavy water) 또는 중수소 산화물이라고도 한다. D2O는 일반 물에서 대부분의 수소를 구성하는 일반적인 수소 동위원소 대신 다량의 수소 동위원소 중수소를 함유한다. 중수소는 추가된 중성자로 인해 두 배 더 무거운 수소 동위원소이다.
II. 점도에 기여하는 단백질의 영역을 식별하는 방법
이러한 단백질의 제형의 점도에 기여하는 단백질의 영역을 결정하는 시스템 및 방법이 본 명세서에 개시된다. 농축된 단백질 제형의 점도를 변형하는 방법도 또한 제공된다. 고농축 치료용 단일클론 항체의 개발은 단일클론 항체 치료제의 피하 투여에 있어서 가장 중요하다. 그러나, 고점도는 농축된 단일클론 항체 치료제의 생산에 있어 문제가 된다. 개발 프로세스의 초기에 후보 치료제들의 농도 의존적 점도 거동을 신속하고 효율적으로 결정하기 위해 계산 및 실험 도구들을 개발할 필요가 있다.
A. 미세투석-수소/중수소 교환 질량 분석법
개발 과정에서 치료용 단일클론 항체는 다른 유사한 단일클론 항체들과 비교할 때 예를 들어 100mg/mL 초과의 농도에서 비정상적으로 고점도를 나타낼 수 있다. 이것은 고농도에서 단일클론 항체의 특징적인 단범위 정전기 및/또는 소수성 단백질-단백질 상호작용 때문일 수 있다. 수소/중수소 교환 질량 분석법(HDX-MS)은 단백질 형태, 역학 및 상호작용을 조사하는 데 유용한 도구이다. 그러나, 종래의 희석 라벨링 HDX-MS 분석은 높은 단백질 농도에서만 발생하는 비정상적인 거동을 분석하는 데 한계가 있다.
HDX-MS를 사용하여 높은 단백질 농도에서 단일클론 항체의 고점도를 주관하는 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위해, D2O 완충액 희석없이 HDX 라벨링을 달성하기 위한 수동 미세투석 기반 HDX-MS 방법이 개발되었으며, 이는 상이한 단백질 농도들에서의 특징적인 분자 상호작용을 프로파일링할 수 있게 한다. 일 실시 형태는 적어도 2개의 상이한 기간들 동안 중수소를 함유하는 완충액에 대해 미세투석 카트리지 내의 단백질의 샘플을 미세투석함으로써 점도에 기여하는 단백질의 영역을 식별하기 위한 방법을 제공한다. 미세투석은 이어서 냉각된다. 이어서, 냉각된 샘플은 수소/중수소 교환 질량 분석 시스템을 사용하여 분석되어 단백질의 다른 영역에 비해 감소된 수준의 중수소를 갖는 샘플 내의 단백질의 영역을 결정한다. 감소된 수준의 중수소를 갖는 단백질의 영역은 단백질의 점도에 기여한다.
일 실시 형태에서, 고점도 거동을 갖는 단백질은 고점도 거동을 감소시키거나 제거하도록 최적화될 수 있다. 단백질 약물 또는 항체를 최적화하는 방법은 점도를 감소시키기 위해 아미노산 서열을 최적화하거나, 제형의 pH 또는 염 함량을 변경하거나, 부형제를 첨가하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일 실시 형태에서, 다수의 치료 단백질 또는 항체 제형을 시험하여 생산을 진행할 가장 유망한 후보를 결정할 수 있다. 각각의 단백질 또는 항체의 고농도 및 저농도 샘플이 생성된다. 일 실시 형태에서, 고 단백질 또는 항체 농도는 50 mg/mL 초과이다. 고농도는 100 mg/mL, 110 mg/mL, 120 mg/mL, 130 mg/mL, 140 mg/mL, 150 mg/mL, 160 mg/mL, 170 mg/mL, 180 mg/mL, 190 mg/mL, 200 mg/mL일 수 있거나, 또는 200 mg/mL 초과일 수 있다. 일 실시 형태에서, 저 항체 농도는 15 mg/mL 미만이다. 저농도는 15 mg/mL, 10 mg/mL, 9 mg/mL, 8 mg/mL, 7 mg/mL, 6 mg/mL, 5 mg/mL, 4 mg/mL, 3 mg/mL, 2 mg/mL, 1 mg/mL, 0.5 mg/mL일 수 있거나, 또는 0.5 mg/mL 미만일 수 있다.
개시된 방법의 단계들에 대한 보다 상세한 내용이 아래에 제공된다.
1. 수소/중수소 교환
수소/중수소 교환은 단백질의 불안정한 위치들에 있는 수소 원자들이 중수소 이온들을 함유하는 주변 용매에서 수소 원자들과 자발적으로 위치를 교환하는 현상이다(Houde, D. and Engel, J.R., Methods Mol Biol, 988:269-289 (2013)). HDX는 단백질에서 세 가지 유형의 수소들 즉, 탄소-수소 결합의 수소, 측쇄 그룹의 수소 및 아미드 작용기의 수소(백본 수소라고도 함)를 활용한다. 탄소-수소 결합에서 수소의 교환 속도는 관찰하기에는 너무 느리고, 측쇄 수소(예컨대, OH, COOH)의 교환 속도는 너무 빨라, 반응이 H2O 기반 용액에서 냉각될 때 빠르게 다시-교환되어 교환이 등록되지 않는다. 백본 수소 만이 단백질 구조와 역학을 보고하는 데 유용한데, 그 이유는 그 교환 속도가 측정 가능하고 수소 결합 및 용매 접근성을 반영하기 때문이다. 아미드 수소들은 2차 및 3차 구조 요소들의 형성에 중요한 역할을 한다. 이들의 교환 속도의 측정은 개별 고차 구조 요소들의 입체형태적 역학뿐만 아니라 전반적인 단백질 역학 및 안정성의 관점에서 해석될 수 있다.
교환 속도는 단백질 구조의 입체형태적 이동성, 수소 결합 강도 및 용매 접근성을 반영한다. 단백질 형태에 대한 정보와, 가장 중요하게는 동일한 단백질의 둘 이상의 형상들 간의 단백질 형태의 차이는 교환 반응을 모니터링함으로써 추출할 수 있다. 교환 속도는 온도에 따라 다르며, 온도가 25°C에서 0°C로 감소함에 따라 약 10배 감소한다. 결과적으로 pH 2 내지 3 및 0°C(일반적으로 "냉각 조건"으로 지칭함)에서, 구조화되지 않은 폴리펩티드에서의 아미드 수소 동위원소 교환에 대한 반감기는 측쇄들로 인한 용매 차폐 효과에 따라 30 내지 90분이다. 수소의 질량은 1.008 Da이고, 중수소(수소의 제2 동위원소)의 질량은 2.014 Da이고, 수소 교환 후 질량 분석기로 단백질의 질량을 측정할 수 있다.
일 실시 형태에서, 수소/중수소 교환 속도는 단백질 또는 항체 치료제의 점도 거동을 결정하는 데 사용된다.
2. 미세투석
희석을 통한 고전적인 연속 HDX 라벨링은 고농축 단백질 용액의 분석에 적용할 수 없다. 본 명세서의 일 실시 형태는 고농도 단백질 용액과 함께 사용하기 위한 HDX 라벨링의 대체 방법을 제공한다. 미세투석 플레이트의 HDX 라벨링은 고농축 단백질 용액의 분석을 용이하게 한다. 또한 미세투석 플레이트를 사용하면 전통적인 투석 장치들에 비해 샘플 및 D2O의 소비가 감소된다(Houde, D., et al., J Am Soc Mass Spectrom, 27(4):669-76 (2016)). 미세투석 플레이트는 상업적으로 이용가능한 미세투석 플레이트, 예를 들어, Pierce™ 96-웰 미세투석 플레이트(Pierce™ 96-well Microdialysis Plate)일 수 있다.
일 실시 형태에서, 미세투석 HDX 교환은 고농축 단백질 용액을 분석하는 데 사용된다. 샘플을 미세투석 플레이트의 미세투석 카트리지 내로 로딩한다. D2O 완충액을 딥웰 플레이트 또는 기타 적합한 용기에 넣는다. 단백질의 샘플을 함유하는 미세투석 카트리지를 완충액에 넣고 최소 4시간 동안 배양한다. 샘플은 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24시간 또는 24시간 초과 동안 배양할 수 있다. 투석 시스템은 대량의 완충액이 필요한 전통적인 연속 HDX 라벨링에서 흔히 볼 수 있는 바와 같이 샘플이 희석되지 않도록, 샘플을 함유하는 카트리지 내로 완충액의 수동 확산을 허용한다. 배양 단계 동안 D2O 완충액 중의 중수소는 샘플을 함유하는 카트리지 내로 진입하여 단백질 샘플의 백본 아미드의 수소와 교환된다. 배양 단계 후, 샘플을 미세투석 카트리지로부터 수집한다.
3. 샘플 제조
투석된 샘플을 미세투석 카트리지로부터 제거하면 샘플을 냉각시켜 HDX 반응을 종료할 수 있다. 일 실시 형태에서, 냉각은 냉각 완충액을 샘플에 첨가함으로써 달성된다. 냉각 완충액은 H2O 중 6M GlnHCl 및 0.6M TCEP, pH 2.5를 함유할 수 있다. 일 실시 형태에서, 냉각 완충액은 H2O, pH 2.5 중 8M 우레아, 0.6M TCEP를 함유한다. 다른 실시 형태에서, 최종 냉각된 용액의 pH는 2.5이다.
일 실시 형태에서, 반응 온도를 감소시키는 것도 HDX 반응을 냉각시킬 수 있다. 반응은 0°C에서 수행될 수 있다. 온도가 25°C에서 0°C로 감소함에 따라 교환 속도는 10배 감소한다. 일 실시 형태에서, 냉각 반응은 0°C 이하에서 수행된다.
냉각 후 샘플은 다운스트림 질량 분석을 위해 희석될 수 있다. 샘플은 H2O 중 0.1% 포름산(FA) 또는 질량 분석에 사용하기 위한 다른 적합한 희석제로 희석할 수 있다. 이어서, 샘플을 질량 분석기로 처리한다.
4. 질량 분석
일 실시 형태에서, 질량 분석법은 시간에 따른 중수소에 의한 수소 교환(또는 그 반대)에 의해 유도된 질량 이동을 결정하는 데 사용된다. 수소의 질량은 1.008 Da이고 중수소의 질량은 2.014 Da이므로 수소 교환 후 질량 분석기로 단백질의 질량을 측정할 수 있다. 중수소가 포함된 단백질 또는 항체는 D2O에서 배양되지 않은 천연 단백질 또는 항체에 비해 질량이 증가한다. 일반적으로, 교환된 수소의 수준은 단백질 구조들의 유연성, 용매 접근성 및 수소 결합 상호작용을 반영한다.
일부 실시 형태들에서 온라인(on-line) 분해는 더 큰 단백질 또는 항체를 더 작은 단편 또는 펩티드로 절단하기 위해 사용된다. 온라인 분해에 일반적으로 사용되는 효소들에는 펩신, 트립신, 트립신/Lys-C, rLys-C, Lys-C 및 Asp-N이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
일 실시 형태에서, 분해된 단백질 또는 항체는 질량 분석법 분석을 받는다. 질량 분석법을 수행하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Aeberssold, M., and Mann, M., Nature, 422:198-207 (2003)]을 참조한다. 일반적으로 사용되는 유형의 질량 분석법에는 탠덤 질량 분석법(MS/MS), 전기분무 이온화 질량 분석법, 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC-MS) 및 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화(MALDI)가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
III. 단백질 점도를 변형하기 위한 방법
일 실시 형태는, 개시된 방법에 따라 단백질 약물의 점도에 기여하는 단백질 약물의 영역을 식별하고, 단백질 약물의 점도에 기여하는 것으로 식별된 단백질 약물의 영역을 변형하여 단백질 약물의 점도를 변형함으로써 단백질 약물의 점도를 변형하는 방법을 제공한다. 약물의 점도에 기여하는 것으로 식별된 영역은 원하는 대로 점도를 감소시키거나 증가시키기 위해 적어도 하나의 영역에서 하나 이상의 아미노산을 대체함으로써 변형될 수 있다.
예를 들어, 항체의 경쇄, 중쇄 또는 상보성 결정 영역은 항체의 농축된 제형의 점도를 감소시키기 위해 변형될 수 있다. 예시적인 농축된 제형은 50 mg/mL 초과, 바람직하게는 100 mg/mL 이상의 항체의 농도를 갖는다.
단백질 또는 항체 약물의 다른 변형들은 단백질 또는 항체 약물의 점도에 기여하는 것으로 결정된 단백질 또는 항체의 영역의 아미노산에 대한 화학적 변형을 포함한다.
일 실시 형태에서, 단백질, 항체 또는 약물 제품은 원핵 또는 진핵 세포들에서의 발현에 적합한 하나 이상의 관심 단백질이거나 이를 함유한다. 예를 들어, 관심 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편, ScFv 또는 이의 단편, Fc-융합 단백질 또는 이의 단편, 성장 인자 또는 이의 단편, 사이토카인 또는 이의 단편, 또는 세포 표면 수용체의 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 관심 단백질은 단일 서브 유닛으로 구성된 단순한 폴리펩티드, 또는 2개 이상의 서브 유닛을 포함하는 복합 다중 서브 유닛 단백질일 수 있다. 관심 단백질은 생물약학적 제품, 식품 첨가물 또는 보존제, 또는 정제 및 품질 표준에 따른 임의의 단백질 제품일 수 있다.
일부 실시 형태들에서, 관심 단백질은 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일클론 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 항원 결합 항체 단편, 단일쇄 항체, 다이아바디, 트라이아바디 또는 테트라바디, 이중 가변 도메인 면역글로불린(DVD-IG)이라 명명되는 이중특이적 4가 면역글로불린 G-유사 분자, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체 또는 IgG4 항체이다. 일 실시 형태에서, 항체는 IgG1 항체이다. 일 실시 형태에서, 항체는 IgG2 항체이다. 일 실시 형태에서, 항체는 IgG4 항체이다. 다른 실시 형태에서, 항체는 키메라 힌지를 포함한다. 또 다른 실시 형태들에서, 항체는 키메라 Fc를 포함한다. 일 실시 형태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG4 항체이다. 일 실시 형태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1 항체이다. 일 실시 형태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1/IgG4 항체이다.
일부 실시 형태들에서, 항체는 항-프로그래밍된 세포 사멸 1 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2015/0203579A1호에 기재된 항-PD1 항체), 항-프로그래밍된 세포 사멸 리간드-1(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2015/0203580A1호에 기재된 항-PD-L1 항체), 항-Dll4 항체, 항-안지오포이에틴-2 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,402,898호에 기재된 항-ANG2 항체), 항-안지오포이에틴-유사 3 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,018,356호에 기재된 항-AngPtl3 항체), 항-혈소판 유래 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,265,827호에 기재된 항-PDGFR 항체), 항-Erb3 항체, 항-프로락틴 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,302,015호에 기재된 항-PRLR 항체), 항-보체 5 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2015/0313194A1호에 기재된 항-C5 항체), 항-TNF 항체, 항-표피 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,132,192호에 기재된 항-EGFR 항체 또는 미국 특허 출원 공개 제2015/0259423A1호에 기재된 항-EGFRvIII 항체), 항-프로단백질 컨버타제 서브틸리신 켁신(Subtilisin Kexin)-9 항체(예를 들어, 미국 특허 제8,062,640호 또는 미국 특허 제9,540,449호에 기재된 항-PCSK9 항체), 항-성장 및 분화 인자-8 항체(예를 들어, 미국 특허 제8,871,209호 또는 제9,260,515호에 기재된 항-미오스타틴 항체로도 알려진 항-GDF8 항체), 항-글루카곤 수용체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2015/0337045A1호 또는 제2016/0075778A1호에 기재된 항-GCGR 항체), 항-VEGF 항체, 항-IL1R 항체, 인터류킨 4 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2014/0271681A1 또는 미국 특허 제8,735,095 또는 제8,945,559호에 기재된 항-IL4R 항체), 항-인터류킨 6 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 제7,582,298호, 제8,043,617호 또는 제9,173,880호에 기재된 항-IL6R 항체), 항-IL1 항체, 항-IL2 항체, 항-IL3 항체, 항-IL4 항체, 항-IL5 항체, 항-IL6 항체, 항-IL7 항체, 항-인터류킨 33(예를 들어, 미국 특허 제9,453,072호 또는 제9,637,535호에 기재된 항-IL33 항체), 항 호흡기 세포융합 바이러스 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제9,447,173호에 기술된 항-RSV 항체), 항-분화 클러스터 3(예를 들어, 미국 특허 제9,447,173호 및 제9,447,173호 및 미국 출원 제62/222,605호에 기재된 항-CD3 항체), 항-분화 클러스터 20(예를 들어, 미국 특허 제9,657,102호 및 제20150266966A1호 및 미국 특허 제7,879,984호에 기재된 항-CD20 항체), 항-CD19 항체, 항-CD28 항체, 항-분화 클러스터 48(예를 들어, 미국 특허 제9,228,014호에 기재된 항-CD48 항체), 항-Fel d1 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,079,948호에 기재된 바와 같음), 항-중동 호흡기 증후군 바이러스(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2015/0337029A1호에 기재된 항-MERS 항체), 항-에볼라 바이러스 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2016/0215040호에 기재된 바와 같음), 항-지카 바이러스 항체, 항-림프구 활성화 유전자 3 항체(예를 들어, 항-LAG3 항체 또는 항-CD223 항체), 항-신경 성장 인자 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2016/0017029호 및 미국 특허 제8,309,088호 및 제9,353,176호에 기재된 항-NGF 항체) 및 항-단백질 Y 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태들에서, 이중특이적 항체는 항-CD3 x 항-CD20 이중특이적 항체(미국 특허 출원 공개 제2014/0088295A1호 및 제US20150266966A1호에 기술된 바와 같음), 항-CD3 x 항-뮤신 16 이중특이적 항체(예를 들어, 항-CD3 x 항-Muc16 이중특이적 항체), 및 항-CD3 x 항-전립선-특이적 막 항원 이중특이적 항체(예를 들어, 항-CD3 x 항-PSMA 이중특이적 항체)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태들에서, 관심 단백질은 압식시맙(abciximab), 아달리무맙(adalimumab), 아달리무맙-아토(adalimumab-atto), 아도-트라스투주맙(ado-trastuzumab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 알리로쿠맙(alirocumab), 아테졸리주맙(atezolizumab), 아벨루맙(avelumab), 바실리시맙(basiliximab), 벨리무맙(belimumab), 벤랄리주맙(benralizumab), 베바시주맙(bevacizumab), 베즐로톡수맙(bezlotoxumab), 블리나투모맙(blinatumomab), 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), 브로달루맙(brodalumab), 카나키누맙(canakinumab), 카프로맙 펜데티드(capromab pendetide), 세르톨리주맙 페골(certolizumab pegol), 세미플리맙(cemiplimab), 세툭시맙(cetuximab), 데노수맙(denosumab), 디누툭시맙(dinutuximab), 두필루맙(dupilumab), 두르발루맙(durvalumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 엘로투주맙(elotuzumab), 에미시주맙-kxwh(emicizumab-kxwh), 엠탄신알리로쿠맙(emtansinealirocumab), 에비나쿠맙(evinacumab), 에볼로쿠맙(evolocumab), 파시누맙(fasinumab), 골리무맙(golimumab), 구셀쿠맙(guselkumab), 이브리투모맙 티우세탄(ibritumomab tiuxetan), 이다루시주맙(idarucizumab), 인플릭시맙(infliximab), 인플릭시맙-abda, 인플릭시맙-dyyb, 이필리무맙(ipilimumab), 익세키주맙(ixekizumab), 메폴리주맙(mepolizumab), 네시투무맙(necitumumab), 네스바쿠맙(nesvacumab), 니볼루맙(nivolumab), 오빌톡사시맙(obiltoxaximab), 오비누투주맙(obinutuzumab), 오크렐리주맙(ocrelizumab), 오파투무맙(ofatumumab), 올라라투맙(olaratumab), 오말리주맙(omalizumab), 파니투무맙(panitumumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 페르투주맙(pertuzumab), 라무시루맙(ramucirumab), 라니비주맙(ranibizumab), 락시바쿠맙(raxibacumab), 레즐리주맙(reslizumab), 리누쿠맙(rinucumab), 리툭시맙(rituximab), 사릴루맙(sarilumab), 세쿠키누맙(secukinumab), 실툭시맙(siltuximab), 토실리주맙(tocilizumab), 토실리주맙, 트라스투주맙(trastuzumab), 트레보그루맙(trevogrumab), 우스테키누맙(ustekinumab), 베돌리주맙(vedolizumab)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시 형태들에서, 관심 단백질은 Fc 모이어티 및 다른 도메인을 함유하는 재조합 단백질이다(예를 들어 Fc-융합 단백질). 일부 실시 형태들에서, Fc-융합 단백질은 Fc 모이어티에 결합된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들)을 함유하는 수용체 Fc-융합 단백질이다. 일부 실시 형태들에서, Fc 모이어티는 힌지 영역, 이어서 IgG의 CH2 및 CH3 도메인을 함유한다. 일부 실시 형태들에서, 수용체 Fc-융합 단백질은 단일 리간드 또는 다중 리간드에 결합하는 둘 이상의 별개의 수용체 쇄를 함유한다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은 TRAP 단백질, 예컨대, 예를 들어 IL-1 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 Il-1R1 세포외 영역에 융합된 IL-1RAcP 리간드 결합 영역을 함유하는 릴로나셉트; 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제6,927,004호를 참조), 또는 VEGF 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 VEGF 수용체 Flk1의 Ig 도메인 3에 융합된 VEGF 수용체 Flt1의 Ig 도메인 2를 함유하는 아플리베르셉트 또는 ziv-아플리베르셉트; 미국 특허 제7,087,411호 및 제7,279,159호 참조)이다. 다른 실시 형태들에서, Fc-융합 단백질은 Fc 모이어티에 결합된 항체의 하나 이상의 항원-결합 도메인(들), 예컨대 가변 중쇄 단편 및 가변 경쇄 단편 중 하나 이상을 함유하는 ScFv-Fc-융합 단백질이다.
일 실시 형태에서, 단백질 약물은 농축된 단일클론 항체이다.
실시예
실시예 1. 미세투석 HDX 질량 분석법
재료 및 방법
mAb1 및 mAb2를 10 mM 히스티딘(pH 6.0)으로 희석하여 고농도 샘플(120 mg/mL) 및 저농도 샘플(15 mg/mL)을 생성했다. 160 μl의 각각의 샘플을 미세투석 카트리지에 로딩하였다. 카트리지를 D2O 완충액을 함유하는 딥웰 플레이트에 삽입하고 4°C에서 4시간 또는 24시간 동안 배양했다. 배양 후, 표 1에 따라 샘플에 냉각 완충액을 첨가하여 각각의 투석된 샘플 5 μl를 냉각시켰다. 냉각 완충액은 100% D2O에 6M GlnHCl/0.6M TCEP를 함유한다. 냉각 반응은 0°C에서 3분 동안 수행되었다. 표 1에 따라 D2O에서 각각의 냉각된 샘플 10μl를 0.1% FA로 희석하였다. 70 μl의 각각의 샘플을 HDX 시스템에 로딩하였다.
Figure pct00002
결과
단일클론 항체 1(mAb1)은 개발 단계에서 다른 단일클론 항체들과 비교할 때, 100mg/mL 초과의 농도에서 비정상적으로 고점도를 나타냈다(도 1a 및 도 1b). 고 단백질 농도에서 mAb1의 고점도를 주관하는 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위해, 수동 미세투석 기반 HDX-MS 방법이 개발되어 D2O 완충액 희석없이 HDX 라벨링을 달성하였으며, 이는 상이한 단백질 농도들에서의 분자 상호작용을 프로파일링할 수 있게 한다(도 2a 내지 도 2f).
mAb1에 대한 3개의 중쇄 상보성 결정 영역 및 경쇄 CDR2에서 대조군 샘플(15mg/mL)에 비해 고농도 샘플(120mg/mL)에서 중수소의 현저한 감소가 관찰되었다(도 3a 내지 도 3n, 표 2 및 표 3). 이 결과는 이러한 CDR들이 mAb1에서 관찰되는 비정상적인 고점도를 유발할 수 있는 특정 분자간 상호작용에 관여할 수 있음을 나타낸다. 이러한 CDR들이 고점도의 원인임을 확인하기 위해, 개시된 방법을 적용하여 CDR을 제외하고 mAb1과 아미노산 서열이 동일하고 점도가 낮은 고농도의 mAb2에서 단백질-단백질 상호작용을 조사했다(도 4b, 도 4d, 도 4f 및 도 4h). mAb1과 달리, 고농도 mAb2 샘플과 저농도 mAb2 샘플 간에 차별적인 중수소 흡수가 관찰되지 않아 mAb1의 CDR들이 고농도들에서 고점도를 유발했음을 추가로 확인하였다.
시간 경과에 따른 비-CDR mAb1 펩티드의 상대 중수소 흡수
시점 mAb1 비-CDR 상대 중수소 흡수(%)
15 mg/ml 120 mg/ml
0 시간 0.0 % 0.0 %
4 시간 36.7 % 33.2 %
24 시간 41.7 % 38.6 %
시간 경과에 따른 LC-CDR mAb1 펩티드의 상대 중수소 흡수

시점 		mAb1 LC-CDR 상대 중수소 흡수(%)
15 mg/ml 120 mg/ml
0 시간 0.0 % 0.0 %
4 시간 49.8 % 39.1 %
24 시간 65.6 % 52.2 %
전술한 명세서에서 본 발명은 그의 특정 실시 형태들과 관련하여 설명되고, 예시의 목적으로 많은 세부 사항이 제시되었지만, 본 발명은 추가의 실시 형태들이 가능하고, 본 명세서에 기술된 특정 세부 사항들은 본 발명의 기본 원리를 벗어나지 않으면서 상당히 변경될 수 있음이 명백할 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 본 발명은 이들의 사상 또는 본질적인 특징으로부터 벗어남이 없이 다른 구체적인 실시 형태로 구현될 수 있으므로, 본 발명의 범주를 나타내면서, 전술한 상세한 설명보다는 첨부된 청구항을 참조해야 할 것이다.

Claims (15)

  1. 단백질의 점도에 기여하는 상기 단백질 내의 영역을 식별하는 방법으로서,
    적어도 2개의 상이한 기간 동안, 중수소를 포함하는 완충액에 대해 미세투석 카트리지에서 상기 단백질의 샘플을 미세투석하는 단계;
    후속적으로 상기 샘플의 미세투석을 냉각하는(quench) 단계;
    상기 냉각된 샘플을 수소/중수소 교환 질량 분석(hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry) 시스템에서 분석하여 상기 단백질의 다른 영역에 비해 중수소의 수준을 감소시킨 상기 샘플 내의 단백질의 영역을 결정하는 단계를 포함하며, 중수소의 수준을 감소시킨 상기 단백질의 영역은 단백질의 점도에 기여하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단백질의 샘플이 10 mg/mL 내지 200 mg/mL의 단백질을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미세투석 단계에서 단백질의 샘플이 5.0 내지 7.5의 pH를 갖는 완충액에 있는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세투석 단계에서 단백질의 샘플이 pH 6.0의 10 mM 히스티딘에 있는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 중수소를 포함하는 완충액이 pH 6.0의 10 mM 히스티딘을 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세투석은 2 내지 6°C에서 수행되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 샘플이 4시간 동안 미세투석되고 적어도 다른 샘플이 24시간 동안 미세투석되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 냉각 단계가 -2 내지 2°C에서 1 내지 5분 동안 수행되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 질량 분석법 분석 전에 상기 단백질을 펩티드로 분해하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  10. 단백질 약물의 점도를 변형하는 방법으로서,
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 따라 상기 단백질 약물의 점도에 기여하는 상기 단백질 약물의 영역을 식별하는 단계; 및
    상기 단백질 약물의 점도를 변형하기 위해 상기 단백질 약물의 점도에 기여하는 것으로 식별된 하나 이상의 영역을 변형하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 약물의 점도에 기여하는 것으로 식별된 영역 중 적어도 하나는 상기 적어도 하나의 영역 내의 하나 이상의 아미노산을 치환함으로써 변형되는, 방법.
  12. 제10항 또는 제11 항에 있어서, 상기 단백질 약물의 점도에 기여하는 것으로 식별된 하나 이상의 영역이 상기 단백질 약물의 점도를 감소시키기 위해 변형되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 항체, 융합 단백질, 재조합 단백질 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 약물은 농축된 단일클론 항체인, 방법.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 단백질 약물.
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