BR112020021140A2

BR112020021140A2 - métodos para identificar regiões em uma proteína que contribuem para a viscosidade da proteína e para modificar a viscosidade de um fármaco proteico, e, fármaco proteico.

Info

Publication number: BR112020021140A2
Application number: BR112020021140-0A
Authority: BR
Inventors: Xiaobin XU; Aming Zhang; Yuan Cao
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2018-05-10
Filing date: 2019-05-09
Publication date: 2021-02-17
Also published as: AR115383A1; SG11202009372UA; EA202092694A1; TW202016125A; JP2021523349A; AU2019266275A1; WO2019217626A1; CN112136049A; KR20210007958A; CA3095190A1; MX2020012016A; US20190345196A1; EP3791189A1

Abstract

A presente invenção fornece sistemas e métodos para determinar regiões de proteínas que contribuem para a viscosidade das formulações dessas proteínas. Também são fornecidos métodos para modificar a viscosidade de formulações de proteínas concentradas.

Description

1 / 22

MÉTODOS PARA IDENTIFICAR REGIÕES EM UMA PROTEÍNA QUE CONTRIBUEM PARA A VISCOSIDADE DA PROTEÍNA E PARA MODIFICAR A VISCOSIDADE DE UM FÁRMACO PROTEICO, E, FÁRMACO PROTEICO CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[001] A invenção está, em geral, relacionada a métodos para prever a viscosidade de anticorpos terapêuticos de alta concentração.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os anticorpos monoclonais são uma classe de produtos terapêuticos biológicos que está crescendo rapidamente. Os anticorpos monoclonais têm uma ampla faixa de indicações, incluindo doenças inflamatórias, câncer e doenças infecciosas. O número de anticorpos monoclonais disponíveis comercialmente está aumentando a uma taxa rápida, com ~ 70 produtos de anticorpos monoclonais, previstos para estarem no mercado em 2020 (Ecker, DM, et al., mAbs, 7: 9-14 (2015)).

[003] Atualmente, a via de administração de anticorpos terapêuticos mais comumente utilizada é a infusão intravenosa (IV, intravenous infusion). No entanto, a injeção subcutânea está sendo cada vez mais usada para pacientes com doenças crônicas que requerem dosagem frequente. As seringas pré-cheias ou canetas autoinjetoras prontas para usar possibilitam que os pacientes se autoadministrem anticorpos terapêuticos. As formulações de anticorpos para injeção subcutânea são tipicamente mais concentradas do que a infusão IV, uma vez que a injeção subcutânea é uma administração em bolo (tipicamente 1 a 1,5 mL) ao contrário de uma infusão lenta de anticorpo com o tempo no caso de infusão IV.

[004] Um desafio comum encontrado com a produção de anticorpos monoclonais terapêuticos altamente concentrados é a alta viscosidade (Tomar, D.S., et al., mAbs, 8: 216-228 (2016)). A alta viscosidade pode causar aumento do tempo de injeção e aumento da dor no local da injeção. Além de problemas

2 / 22 com a administração, os anticorpos altamente viscosos também apresentam problemas durante o bioprocessamento da solução de anticorpos. A alta viscosidade pode aumentar o tempo de processamento, desestabilizar o medicamento e aumentar os custos de fabricação. Interações de proteína- proteína eletrostáticas e/ou hidrofóbicas de curto alcance e efeitos eletroviscosos podem influenciar o comportamento da viscosidade dependente da concentração dos anticorpos.

[005] A caracterização das dinâmicas conformativas e estruturais de um anticorpo pode ser um grande desafio analítico. Muitas técnicas estruturais disponíveis são altamente sofisticadas, exigindo habilidades muito especializadas e grandes quantidades de amostra (quantidades> μM), ou são de baixa resolução, tornando difícil a análise estrutural detalhada. Em decorrência disso, é desejável ter técnicas disponíveis que possam sondar a estrutura da proteína com requisitos de amostra baixos, boa resolução e tempo de resposta relativamente curto.

[006] Portanto, é um objetivo desta invenção fornecer métodos para identificar regiões de proteínas que contribuem para a viscosidade das formulações dessa proteína.

[007] É outro objetivo da invenção fornecer métodos para modificar a viscosidade de soluções concentradas de proteína.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[008] A presente invenção fornece sistemas e métodos para determinar regiões de proteínas que contribuem para a viscosidade das formulações dessas proteínas. Também são fornecidos métodos para modificar a viscosidade de formulações de proteínas concentradas.

[009] Uma modalidade fornece um método para identificar regiões em uma proteína que contribuem para a viscosidade da proteína por microdiálise de amostras da proteína em um cartucho de microdiálise contra um tampão contendo deutério por pelo menos dois períodos de tempo

3 / 22 diferentes. A microdiálise é posteriormente finalizada. As amostras finalizadas são então analisadas com o uso de um sistema de espectrometria de massa de troca de hidrogênio/deutério para determinar regiões da proteína na amostra que têm níveis reduzidos de deutério em relação a outras regiões da proteína. As regiões da proteína que têm níveis reduzidos de deutério contribuem para a viscosidade da proteína.

[0010] Em certas modalidades, as amostras de proteína têm uma concentração entre 10 mg/mL e 200 mg/mL da proteína.

[0011] Em algumas modalidades, as amostras de proteína são microdialisadas em um tampão com um pH entre 5,0 e 7,5. Um tampão preferido para as amostras de proteína é histidina 10 mM a pH 6,0. Um tampão contendo deutério exemplificativo inclui deutério em histidina 10 mM em pH 6,0. Normalmente, a microdiálise é realizada de 2 a 6 °C, de preferência a 4 °C. Em algumas modalidades, a microdiálise é realizada de 20 a 25 °C. Diferentes amostras podem ser dialisadas por diferentes períodos de tempo, por exemplo, uma amostra pode ser dialisada por 4 horas e outra amostra pode ser microdialisada por 24 horas. Em algumas modalidades, as amostras são dialisadas por 30 min., 4 horas, 24 horas ou durante a noite, ou seja, 26 horas.

[0012] Em certas modalidades, a etapa de finalização é tipicamente realizada de -2 a 2 °C por 1 a 5 minutos.

[0013] Em algumas modalidades, o método inclui a etapa de digerir a proteína em peptídeos antes da análise de espectrometria de massa.

[0014] Uma outra modalidade fornece um método para modificar a viscosidade de um fármaco proteico, identificar regiões do fármaco proteico que contribuem para a viscosidade do fármaco proteico de acordo com os métodos divulgados e modificar as regiões do fármaco proteico que são identificadas como contribuintes para a viscosidade do fármaco proteico para modificar a viscosidade do fármaco proteico. As regiões identificadas como contribuintes para a viscosidade do fármaco podem ser modificadas por

4 / 22 substituição de um ou mais aminoácidos em pelo menos uma região para reduzir ou aumentar a viscosidade conforme desejado.

[0015] A proteína ou fármaco proteico pode ser um anticorpo, uma proteína de fusão, uma proteína recombinante ou uma combinação das mesmas. Em uma modalidade, o fármaco proteico é um anticorpo monoclonal concentrado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0016] A Figura 1A é um gráfico de linha que mostra a viscosidade (cP) de mAb1 em função da concentração (mg/mL). A Figura 1B é um gráfico de linha que mostra a viscosidade (cP) do mAb2 em função da concentração (mg/mL).

[0017] As Figuras 2A a 2F são um esquema de um protocolo HDX-MS baseado em microdiálise exemplificativo. Os cartuchos de microdiálise (Figura 2A) são obtidos, o tampão D2O é adicionado a uma placa de poços profundos (Figura 2B), as amostras são carregadas nos cartuchos de microdiálise (Figura 2C), os cartuchos de microdiálise são carregados na placa de poços profundos (Figura 2D ), as amostras são incubadas no tampão D2O por vários pontos de tempo (Figura 2E) e as amostras são removidas para análise de MS (Figura 2F).

[0018] As Figuras 3A a 3F são espectrogramas exemplificativos de absorção de deutério com o tempo em amostras de mAb1 não CDR em concentrações de 15 mg/ mL (Figuras 3A-3C) e concentrações de 120 mg/mL (Figuras 3D-3F) 0 hora (Figuras 3A e 3D), 4 horas (Figuras 3B e 3E), ou 24 horas (Figuras 3C e 3F) após a incubação de deutério. As Figuras 3G a 3L são espectrogramas de captação de deutério com o tempo em amostras de mAb1 não CDR em concentrações de 15 mg/mL (Figuras 3G-3I) e concentrações de 120 mg/mL (Figuras 3J-3L) 0 hora (Figuras 3G e 3J), 4 horas (Figuras 3H e 3K), ou 24 horas (Figuras 3I e 3L) após a incubação de deutério. As Figuras 3M e 3N são gráficos de captação de deutério mostrando % de captação de deutério versus tempo (horas) para 15 mg/mL () e 120 mg/mL () para mAb1

5 / 22 HC36-47 e mAb1 LC48-53.

[0019] As Figuras 4A e 4B e 4E e 4F são gráficos em borboleta que mostram a absorção relativa de deutério nas regiões de CDR de cadeia pesada para mAb1 (Figuras 4A e 4E) e mAb2 (Figuras 4B e 4F) após 4 horas ou 24 horas de incubação de deutério. Os gráficos de topo representam a concentração de amostra de 120 mg/mL e os gráficos de base representam a concentração de amostra de 15 mg/mL. O eixo X representa o número do peptídeo e o eixo Y representa a absorção diferencial de deutério (%). As Figuras 4C e 4D e 4G e 4H são gráficos residuais que mostram a absorção relativa de deutério nas regiões de CDR de cadeia pesada para mAb1 (Figuras 4C e 4G) e mAb2 (Figuras 4D e 4H) após 4 horas ou 24 horas de incubação de deutério. Os gráficos de topo representam a concentração de amostra de 120 mg/mL e os gráficos de base representam a concentração de amostra de 15 mg/mL. O eixo X representa o número do peptídeo e o eixo Y representa a absorção diferencial de deutério (%). As Figuras 4G e 4H são gráficos residuais de absorção de deutério na cadeia leve de mAb1 (Figura 4G) e cadeia leve de mAb2 (Figura 4H) após 4 horas ou 24 horas de incubação. O eixo X representa o número do peptídeo e o eixo Y representa a absorção diferencial de deutério (%).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições

[0020] O uso dos termos "um", "uma", "o”, "a” e referentes semelhantes no contexto da descrição da invenção atualmente reivindicada (especialmente no contexto das reivindicações) deve ser interpretado para abranger tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contradito pelo contexto.

[0021] A repetição de faixas de valores neste documento é meramente destinada a servir como um método abreviado de referência individual a cada valor separado caindo dentro da faixa, a menos que indicado de outra forma aqui, e cada valor separado está incorporado no relatório descritivo como se

6 / 22 fosse individualmente citado neste documento.

[0022] O uso do termo "cerca de" destina-se a descrever valores tanto acima quanto abaixo do valor declarado em uma faixa de aproximadamente +/- 10%; em outras modalidades, os valores podem variar em valores tanto acima quanto abaixo do valor declarado em uma faixa de aproximadamente +/- 5%; em outras modalidades, os valores podem variar em valores tanto acima quanto abaixo do valor declarado em uma faixa de aproximadamente +/- 2%; em outras modalidades, os valores podem variar em valores tanto acima quanto abaixo do valor declarado em uma faixa de aproximadamente +/- 1%. As faixas anteriores devem ser esclarecidas pelo contexto e nenhuma limitação adicional está implícita. Todos os métodos descritos neste documento podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contradito pelo contexto. O uso de todos e quaisquer exemplos, ou linguagem exemplificativos (por exemplo, "tal como") fornecidos neste documento, destina-se meramente a iluminar melhor a invenção e não representa uma limitação no escopo da invenção, a menos que reivindicado de outra forma. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicativo de qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[0023] Conforme usado nesse documento, o termo "proteína" refere-se a uma molécula que compreende dois ou mais resíduos de aminoácidos unidos uns aos outros por uma ligação peptídica. A proteína inclui polipeptídeos e peptídeos e também pode incluir modificações, como glicosilação, fixação de lipídios, sulfatação, gama-carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, alquilação, hidroxilação e ADP-ribosilação. As proteínas podem ser de interesse científico ou comercial, incluindo fármacos baseados em proteínas, e as proteínas incluem, entre outras coisas, enzimas, ligantes, receptores, anticorpos e proteínas quiméricas ou de fusão. As proteínas são produzidas por vários tipos de células recombinantes com o uso de métodos de cultura de

7 / 22 células bem conhecidos e são geralmente introduzidas na célula por transfecção de vetores de nucleotídeos geneticamente modificados (por exemplo, como uma sequência que codifica uma proteína quimérica, ou uma sequência otimizada por códons, uma sequência sem íntron etc.), onde os vetores podem residir como um epissoma ou ser integrados no genoma da célula.

[0024] O termo "anticorpo" refere-se a uma molécula de imunoglobulina que consiste em quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada possui uma região variável da cadeia pesada (HCVR ou VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada contém três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve tem uma região variável da cadeia leve e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve consiste em um domínio (CL). As regiões VH e VL podem ser subdivididas adicionalmente em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementariedade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, arranjadas do terminal amino ao terminal carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. O termo "anticorpo" inclui referência a imunoglobulinas tanto glicosiladas quanto não glicosiladas de qualquer isotipo ou subclasse. O termo "anticorpo" inclui moléculas de anticorpo preparadas, expressas, criadas ou isoladas por meios recombinantes, como anticorpos isolados de uma célula hospedeira transfectada para expressar o anticorpo. O termo anticorpo também inclui anticorpo biespecífico, que inclui uma imunoglobulina heterotetramérica que pode se ligar a mais de um epítopo diferente. Os anticorpos biespecíficos são geralmente descritos na Publicação do Pedido de Patente US Nº 2010/0331527, que está incorporada por referência neste pedido.

[0025] Uma "CDR", ou região determinante de complementaridade, é

8 / 22 uma região de hipervariabilidade intercalada dentro de regiões que são mais conservadas, denominadas "regiões de estrutura" (FR). As FRs podem ser idênticas às sequências da linha germinativa humana ou podem ser modificadas natural ou artificialmente.

[0026] Conforme usado neste documento, o termo "viscosidade" refere-se à taxa de transferência de momento do líquido. É uma quantidade que expressa a magnitude do atrito interno, conforme medido pela força por área unitária que resiste a um fluxo no qual a distância unitária das camadas paralelas separadas tem velocidade unitária uma em relação à outra. Em líquidos, a viscosidade refere-se à “espessura” de um líquido.

[0027] O termo "HDX-MS" refere-se a espectrometria de massa de troca de hidrogênio / deutério.

[0028] Como usado nesse documento, "diálise" é uma técnica de separação que facilita a remoção de compostos pequenos indesejados de macromoléculas em solução por difusão seletiva e passiva através de uma membrana semipermeável. Uma amostra e uma solução tampão (chamada dialisado, normalmente 200 a 500 vezes o volume da amostra) são colocadas em lados opostos da membrana. As moléculas da amostra que são maiores do que os poros da membrana são retidas no lado da amostra da membrana, mas pequenas moléculas e sais tampão passam livremente pela membrana, reduzindo a concentração dessas moléculas na amostra. Uma vez que a interface líquido-líquido (amostra em um lado da membrana e dialisado no outro) for iniciada, todas as moléculas tentarão se difundir em qualquer direção através da membrana para atingir o equilíbrio. A diálise (difusão) interromperá quando o equilíbrio for alcançado. Os sistemas de diálise também são usados para troca de tampão.

[0029] O termo "microdiálise" refere-se à diálise de amostras com um volume menor que um mililitro.

[0030] “D2O” é uma abreviatura de água deuterada. Também é

9 / 22 conhecido como água pesada ou óxido de deutério. D2O contém grandes quantidades do isótopo de hidrogênio deutério, em vez do isótopo de hidrogênio comum que compõe a maior parte do hidrogênio na água normal. O deutério é um isótopo do hidrogênio duas vezes mais pesado devido à adição de um nêutron. II. Métodos para Identificar Regiões de Proteínas que Contribuem para a Viscosidade

[0031] O presente documento revela sistemas e métodos para determinar regiões de proteínas que contribuem para a viscosidade de formulações dessas proteínas. Também são fornecidos métodos para modificar a viscosidade de formulações de proteínas concentradas. O desenvolvimento de anticorpos monoclonais terapêuticos altamente concentrados é fundamental para a administração subcutânea de produto terapêutico de anticorpos monoclonais. No entanto, a alta viscosidade é uma preocupação na produção de produto terapêutico de anticorpo monoclonal concentrado. Há uma necessidade de desenvolver ferramentas computacionais e experimentais para determinar de forma rápida e eficiente o comportamento da viscosidade dependente da concentração de produto terapêutico candidato no início do processo de desenvolvimento. A. Microdiálise-Espectrometria de Massa de Troca de Hidrogênio / Deutério

[0032] Durante o curso de desenvolvimento, um anticorpo monoclonal terapêutico pode exibir viscosidade excepcionalmente alta, por exemplo, em concentrações > 100 mg/mL quando comparado a outros anticorpos monoclonais semelhantes. Isso pode ser devido às interações de proteína- proteína eletrostáticas e/ou hidrofóbicas de curto alcance características do anticorpo monoclonal sob altas concentrações. A espectrometria de massa de troca de hidrogênio / deutério (HDX-MS) é uma ferramenta útil para investigar a conformação, dinâmica e interações de proteínas. No entanto, a análise de HDX-MS de marcação de diluição convencional tem uma limitação na análise

10 / 22 de comportamentos incomuns que ocorrem apenas em altas concentrações de proteína.

[0033] A fim de sondar as interações proteína-proteína que regem a alta viscosidade de anticorpos monoclonais em uma alta concentração de proteína com HDX-MS, desenvolveu-se um método HDX-MS baseado em microdiálise passivo para alcançar a marcação HDX sem diluição do tampão D2O, o que possibilita o perfil de interações moleculares características em diferentes concentrações de proteínas. Uma modalidade fornece um método para identificar regiões de proteínas que contribuem para a viscosidade por microdiálise de amostras da proteína em um cartucho de microdiálise contra um tampão contendo deutério por pelo menos dois períodos de tempo diferentes. A microdiálise é posteriormente finalizada. As amostras finalizadas são então analisadas com o uso de um sistema de espectrometria de massa de troca de hidrogênio/deutério para determinar regiões da proteína na amostra que têm níveis reduzidos de deutério em relação a outras regiões da proteína. As regiões da proteína que têm níveis reduzidos de deutério contribuem para a viscosidade da proteína.

[0034] Em uma modalidade, proteínas com comportamento de alta viscosidade podem ser otimizadas para reduzir ou eliminar o comportamento de alta viscosidade. Os métodos de otimização de fármacos ou anticorpos de proteína incluem, mas não se limitam a, otimizar a sequência de aminoácidos para reduzir a viscosidade, alterar o pH ou teor de sal da formulação ou adicionar um excipiente.

[0035] Em uma modalidade, múltiplas proteínas terapêuticas ou formulações de anticorpos podem ser testadas para determinar o candidato mais promissor para avançar na produção. Amostras de alta e baixa concentração de cada proteína ou anticorpo são produzidas. Em uma modalidade, uma alta concentração de proteína ou anticorpo é > 50 mg/mL. A alta concentração pode ser 100 mg/mL, 110 mg/mL, 120 mg/mL, 130 mg/mL, 140 mg/mL, 150

11 / 22 mg/mL, 160 mg/mL, 170 mg/mL, 180 mg/mL, 190 mg/mL, 200 mg/mL ou > 200 mg/mL. Em uma modalidade, uma baixa concentração de anticorpo é <15 mg/mL. A baixa concentração pode ser 15 mg/mL, 10 mg/mL, 9 mg/mL, 8 mg/mL, 7 mg/mL, 6 mg/mL, 5 mg/mL, 4 mg/mL, 3 mg/mL, 2 mg/mL, 1 mg/mL, 0,5 mg/mL ou <0,5 mg/mL.

[0036] A seguir, são fornecidos mais detalhes nas etapas dos métodos revelados.

1. Troca de Hidrogênio / Deutério

[0037] A troca de hidrogênio / deutério é um fenômeno em que átomos de hidrogênio em posições lábeis em proteínas mudam espontaneamente de lugar com átomos de hidrogênio no solvente circundante que contém íons de deutério (Houde, D. e Engel, J.R., Methods Mol Biol, 988: 269-289 (2013)). O HDX tira proveito dos três tipos de hidrogênio em proteínas: aqueles em ligações carbono-hidrogênio, aqueles em grupos de cadeia lateral e aqueles em grupos funcionais amida (também como seu próprio nome diz de hidrogênios da espinha dorsal). As taxas de troca dos hidrogênios nas ligações carbono- hidrogênio são muito lentas para observar, e as dos hidrogênios da cadeia lateral (por exemplo, OH, COOH) são tão rápidas que trocam rapidamente de volta quando a reação é finalizada em solução a base de H2O, e a troca não é registrada. Apenas os hidrogênios da espinha dorsal são úteis para reportar a estrutura e dinâmica da proteína, porque suas taxas de troca são mensuráveis e refletem a ligação de hidrogênio e a acessibilidade ao solvente. Os hidrogênios de amida desempenham um papel fundamental na formação de elementos de estrutura secundária e terciária. As medições de suas taxas de troca podem ser interpretadas em termos da dinâmica conformativa de elementos estruturais individuais de ordem superior, bem como da dinâmica e estabilidade geral das proteínas.

[0038] As taxas de troca refletem na mobilidade conformativa, força da ligação de hidrogênio e acessibilidade ao solvente na estrutura da proteína. As

12 / 22 informações sobre a conformação da proteína e, mais importante, as diferenças na conformação da proteína entre duas ou mais formas da mesma proteína podem ser extraídas monitorando a reação de troca. A taxa de troca depende da temperatura, diminuindo em aproximadamente um fator de dez conforme a temperatura é reduzida de 25 ° C para 0 ° C. Consequentemente, sob pH 2 a 3 e a 0 ° C (comumente referido como "condições de finalização"), a meia-vida para a troca isotópica de hidrogênio de amida em um polipeptídeo não estruturado é de 30 a 90 min, dependendo do efeito de proteção do solvente causado pelas cadeias laterais. O hidrogênio tem uma massa de 1,008 Da e o deutério (o segundo isótopo do hidrogênio) tem uma massa de 2,014 Da; a troca de hidrogênio pode ser seguida medindo a massa de uma proteína com um espectrômetro de massa.

[0039] Em uma modalidade, a taxa de troca de hidrogênio / deutério é usada para determinar o comportamento da viscosidade de proteínas ou produto terapêutico de anticorpos.

2. Microdiálise

[0040] A marcação HDX contínua clássica por diluição não é aplicável na análise de soluções de proteínas altamente concentradas. Uma modalidade nesse documento fornece um método alternativo de marcação HDX para uso com soluções de proteína de alta concentração. A marcação HDX em uma placa de microdiálise facilita a análise de soluções de proteína altamente concentradas. Além disso, o uso de uma placa de microdiálise reduz o consumo de amostras e D2O comparado com os dispositivos de diálise tradicionais (Houde, D., et al., J Am Soc Mass Spectrom, 27 (4): 669-76 (2016)). A placa de microdiálise pode ser uma placa de microdiálise disponível comercialmente, por exemplo, Pierce™ 96-well Microdialysis Plate.

[0041] Em uma modalidade, a troca de HDX de microdiálise é usada para analisar soluções de proteína altamente concentradas. As amostras são carregadas para o cartucho de microdiálise da placa de microdiálise. O tampão

13 / 22 D2O é adicionado a uma placa de poço profundo ou outro recipiente adequado. Os cartuchos de microdiálise contendo as amostras de proteína são adicionados ao tampão e deixados incubar por pelo menos 4 horas. As amostras podem incubar por 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou mais que 24 horas. O sistema de diálise possibilita a difusão passiva do tampão no cartucho que contém a amostra, de modo a não diluir a amostra como é comum na marcação HDX contínua tradicional em que grandes quantidades de tampão são necessárias. Durante a etapa de incubação, o deutério no tampão D2O entra no cartucho que contém a amostra e é trocado por hidrogênios nas amidas da espinha dorsal das amostras de proteínas. Após a etapa de incubação, as amostras são coletadas do cartucho de microdiálise.

3. Preparação de Amostra

[0042] Uma vez que as amostras dialisadas são removidas do cartucho de microdiálise, a reação HDX pode ser terminada finalizando as amostras. Em uma modalidade, a finalização é alcançada pela adição de tampão de finalização às amostras. O tampão de finalização pode conter GlnHCl 6M e TCEP 0,6M em H2O, pH 2,5. Em uma modalidade, o tampão de finalização contém ureia 8 M, TCEP 0,6 M em H20, pH 2,5. Em outra modalidade, o pH da solução final finalizada é 2,5.

[0043] Em uma modalidade, a diminuição da temperatura de reação também pode finalizar a reação de HDX. A reação pode ser realizada a 0 ° C. A taxa de troca diminui a um fator de dez a medida que a temperatura é reduzida de 25 ° C para 0 ° C. Em uma modalidade, a reação de finalização é realizada a ou abaixo de 0 ° C.

[0044] Após a finalização, as amostras podem ser diluídas para análise de espectrometria de massa à jusante. As amostras podem ser diluídas em 0,1% de ácido fórmico (FA) em H2O ou qualquer outro diluente adequado para uso em espectrometria de massa. As amostras são então processadas por um espectrômetro de massa.

14 / 22

4. Espectrometria de Massa

[0045] Em uma modalidade, a espectrometria de massa é usada para determinar as mudanças de massa induzidas pela troca de hidrogênio por deutério (ou vice-versa) com o tempo. O hidrogênio tem uma massa de 1,008 Da e o deutério tem uma massa de 2,014 Da, portanto a troca de hidrogênio pode ser seguida medindo a massa de uma proteína com um espectrômetro de massa. As proteínas ou os anticorpos que têm deutério incorporado terão uma massa aumentada comparada com a proteína ou anticorpo nativo que não foi incubado em D2O. Em geral, o nível de hidrogênio trocado reflete a flexibilidade, a acessibilidade ao solvente e as interações de ligações de hidrogênio nas estruturas das proteínas.

[0046] Em algumas modalidades, a digestão em linha é empregada para clivar proteínas ou anticorpos maiores em fragmentos ou peptídeos menores. Enzimas comumente usadas para digestão em linha incluem, mas não se limitam a pepsina, tripsina, tripsina / Lys-C, rLys-C, Lys-C e Asp-N.

[0047] Em uma modalidade, as proteínas ou anticorpos digeridos são submetidos a análise de espectrometria de massa. Os métodos de realização de espectrometria de massa são conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo (Aeberssold, M., e Mann, M., Nature, 422: 198-207 (2003)). Os tipos comumente utilizados de espectrometria de massa incluem, mas não se limitam a espectrometria de massa em tandem (MS / MS), eletropulverização espectrometria de massa de ionização, espectrometria de massa por cromatografia líquida (LC-MS) e dessorção / ionização a laser assistida por matriz (MALDI). III. Métodos para Modificar a Viscosidade da Proteína

[0048] Uma modalidade fornece um método para modificar a viscosidade de um fármaco proteico, identificando regiões do fármaco proteico que contribuem para a viscosidade do fármaco proteico de acordo com os métodos revelados e modificando as regiões do fármaco proteico que são

15 / 22 identificadas como contribuintes para a viscosidade do fármaco proteico para modificar a viscosidade do fármaco proteico. As regiões identificadas como contribuintes para a viscosidade do fármaco podem ser modificadas por substituição de um ou mais aminoácidos em pelo menos uma região para reduzir ou aumentar a viscosidade conforme desejado.

[0049] Por exemplo, a cadeia leve, cadeia pesada ou regiões determinantes de complementariedade de um anticorpo podem ser modificadas para reduzir a viscosidade de formulações concentradas do anticorpo. Uma formulação concentrada exemplificativa tem uma concentração de anticorpo que é superior a 50 mg/mL, de preferência 100 mg/mL ou superior.

[0050] Outras modificações do fármaco proteico ou anticorpo incluem modificações químicas em aminoácidos na região da proteína ou anticorpo, determinadas para contribuir para a viscosidade do fármaco proteico ou anticorpo.

[0051] Em uma modalidade, o produto de proteína, anticorpo ou fármaco é ou contém uma ou mais proteínas de interesse adequadas para expressão em células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, a proteína de interesse inclui, mas se limita a, um anticorpo ou fragmento de ligação ao seu antígeno, um anticorpo quimérico ou fragmento de ligação ao seu antígeno, um ScFv ou seu fragmento, uma proteína de fusão Fc ou seu fragmento, um fator de crescimento ou seu fragmento, uma citocina ou seu fragmento, ou um domínio extracelular de um receptor de superfície celular ou seu fragmento. As proteínas de interesse podem ser polipeptídeos simples que consistem em uma única subunidade, ou proteínas complexas com múltiplas subunidades compreendendo duas ou mais subunidades. A proteína de interesse pode ser um produto biofarmacêutico, aditivo ou conservante alimentar ou qualquer produto proteico sujeito a purificação e padrões de qualidade.

[0052] Em algumas modalidades, a proteína de interesse é um anticorpo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo

16 / 22 quimérico, um anticorpo monoclonal, um anticorpo multiespecífico, um anticorpo biespecífico, um fragmento de anticorpo de ligação ao antígeno, um anticorpo de cadeia única, um diacorpo, triacorpo ou tetracorpo, uma molécula de imunoglobulina G tetravalente específica dupla, denominada imunoglobulina de domínio variável duplo (DVD-IG), um anticorpo IgD, um anticorpo IgE, um anticorpo IgM, um anticorpo IgG, um anticorpo IgG1, um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG3 ou um anticorpo IgG4. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG1. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG2. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG4. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma região de dobradiça quimérica. Ainda em outras modalidades, o anticorpo compreende um Fc quimérico. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG2 / IgG4 quimérico. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG2 / IgG1 quimérico. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG2 / IgG1 / IgG4 quimérico.

[0053] Em algumas modalidades, o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-morte celular programada 1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD1 como descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US2015/0203579A1), um ligante de anti-morte celular programada (por exemplo, um anticorpo anti-PD-L1 como descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US2015/0203580A1), um anticorpo anti-Dll4, um anticorpo anti-Angiopoetina-2 (por exemplo, um anticorpo anti- ANG2 como descrito na Patente U.S. No. 9.402.898), um anticorpo 3 como anti-Angiopoetina (por exemplo, um anticorpo anti-AngPtl3 como descrito na Patente U.S. No. 9.018.356), um anticorpo receptor do fator de crescimento derivado de anti-plaquetas (por exemplo, um anticorpo anti-PDGFR como descrito na Patente U.S. No. 9.265.827), um anticorpo anti-Erb3, um anticorpo receptor de anti-prolactina (por exemplo, anticorpo anti-PRLR como descrito na Patente U.S. No. 9.302.015), um anticorpo anti-Complemento 5 (por

17 / 22 exemplo, um anticorpo anti-C5 como descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. Nº US2015/0313194A1), um anticorpo anti-TNF, um anticorpo receptor do fator de crescimento anti-epidérmico (por exemplo, um anticorpo anti-EGFR como descrito na Patente U.S. No. 9.132.192 ou um anticorpo anti- EGFRvIII como descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US2015/0259423A1), um anticorpo anti-Proproteína Convertase Subtilisina Kexin-9 (por exemplo, um anticorpo anti-PCSK9 como descrito na Patente U.S. No. 8.062.640 ou Patente U.S. No. 9.540.449), um anticorpo do fator de Anti-crescimento e Diferenciação 8 (por exemplo, um anticorpo anti-GDF8, também conhecido como anticorpo anti-miostatina, conforme descrito nas patentes US 8.871.209 ou 9.260.515), um receptor anti-glucagon (por exemplo anticorpo anti-GCGR conforme descrito na Publicação do Pedido de Patentes Nos. US2015/0337045A1 ou US2016/0075778A1), um anticorpo anti-VEGF, um anticorpo anti-IL1R, um anticorpo receptor de interleucina 4 (por exemplo, um anticorpo anti-IL4R como descrito na Publicação do Pedido de Patente US No. US2014/0271681A1 ou Patentes U.S. Nos. 8.735.095 ou 8.945.559), um anticorpo do receptor de anti-interleucina 6 (por exemplo, um anticorpo anti- IL6R como descrito nas Patentes U.S. Nos. 7.582.298, 8.043.617 ou

9.173.880), um anticorpo anti-IL1, um anticorpo anti-IL2, um anticorpo anti- IL3, um anticorpo anti-IL4, um anticorpo anti-IL5, um anticorpo anti-IL6, um anticorpo anti-IL7, um anti-interleucina 33 (por exemplo, anticorpo anti-IL33 como descrito nas Patentes Nos. 9.453,072 ou 9.637,535), um anticorpo do anti-vírus sincicial Respiratório (por exemplo, anticorpo anti-RSV como descrito. na Publicação do Pedido de Patente U.S No. 9.447.173), um anti- Agrupamento de diferenciação 3 (por exemplo, um anticorpo anti-CD3, conforme descrito nas Patentes U.S. Nos. 9.447.173 e 9.447.173, e no Pedido U.S. No. 62/222.605), um anti-agrupamento de diferenciação 20 (por exemplo, um anticorpo anti-CD20 como descrito nas Patentes U.S. Nos. 9.657.102 e US20150266966A1, e na Patente U.S. No. 7.879.984), um anticorpo anti-

18 / 22 CD19, um anticorpo anti-CD28, um anti-agrupamento de diferenciação-48 (por exemplo, anticorpo anti-CD48 como descrito na Patente U.S. No. 9.228.014), um anticorpo anti-Fel d1 (por exemplo, como descrito na Patente U.S. No.

9.079.948), um anti-vírus da Síndrome Respiratória do Oriente Médio (por exemplo, um anticorpo anti-MERS como descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US2015/0337029A1), um anticorpo anti-vírus Ebola (por exemplo, conforme descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US2016/0215040), um anticorpo anti-vírus da Zika, um anticorpo anti-Gene de Ativação de Linfócito 3 (por exemplo, um anticorpo anti-LAG3, ou um anticorpo anti-CD223), um anticorpo anti-Fator de Crescimento Nervoso (por exemplo, um anticorpo Anticorpo anti-NGF conforme descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. US2016/0017029 e Patente U.S. 8.309.088 e

9.353.176) e um anticorpo anti-Proteína Y. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-CD20 (conforme descrito na Publicação do Pedido de Patentes U.S. Nos. US2014/0088295A1 e US20150266966A1), um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-Mucina 16 (por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-Muc16) e um anticorpo biespecífico de antígeno de membrana específico da anti-CD3 x anti-próstata (por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-CD3 x anti-PSMA). Em algumas modalidades, a proteína de interesse é selecionada a partir do grupo que consiste em abciximabe, adalimumabe, adalimumabe-atto, ado-trastuzumabe, alemtuzumabe, alirocumabe, atezolizumabe, avelumabe, basiliximabe, belimumabe, benralizumabe, bevacizumabe, bezlotoxumabe, blinatumomabe, brentuximabe vedotina, brodalumabe, canakinumabe, capromabe pendetida, certolizumabe pegol, cemiplimabe, cetuximabe, denosumabe, dinutuximabe, dupilumabe, durvalumabe, eculizumabe, elotuzumabe, emicizumabe-kxwh, emtansinealirocumabe, evinacumabe, evolocumabe, fasinumabe, golimumabe, guselcumabe, ibritumomabe tiuxetana, idarucizumabe, infliximabe,

19 / 22 infliximabe-abda, infliximabe-dyyb, ipilimumabe, ixekizumabe, mepolizumabe, necitumumabe, nesvacumabe, nivolumabe, obiltoxaximabe, obinutuzumabe, ocrelizumabe, ofatumumabe, olaratumabe, omalizumabe, panitumumabe, pembrolizumabe, pertuzumabe, ramucirumabe, ranibizumabe, raxibacumabe, reslizumabe, rinucumabe, rituximabe, sarilumabe, secuquinumabe, siltuximabe, tocilizumabe, tocilizumabe, trastuzumabe, trevogrumabe, ustequinumabe, and vedolizumabe.

[0054] Em algumas modalidades, a proteína de interesse é uma proteína recombinante que contém uma fração Fc e um outro domínio (por exemplo, uma proteína de fusão Fc). Em algumas modalidades, uma proteína de fusão Fc é uma proteína de fusão Fc de receptor, que contém um ou mais domínio(s) extracelular(es) de um receptor acoplado a uma fração Fc. Em algumas modalidades, a fração Fc compreende uma região de dobradiça seguida por um domínio CH2 e CH3 de uma IgG. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do receptor Fc contém duas ou mais cadeias de receptor distintas que se ligam a um único ligante ou a múltiplos ligantes. Por exemplo, uma proteína de fusão Fc é uma proteína TRAP, tal como, por exemplo, uma IL-1 TRAP (por exemplo, rilonacept, que contém a região de ligação do ligante IL-1RAcP fundida à região extracelular Il-1R1 fundida a Fc de hIgG1; consultar Patente U.S. No. 6.927.004, que está incorporada nesse documento por referência em sua totalidade), ou uma TRAP de VEGF (por exemplo, aflibercept ou ziv- aflibercept, que compreende o domínio Ig 2 do receptor VEGF Flt1 fundido ao domínio Ig 3 do receptor VEGF Flk1 fundido a Fc de hIgG1; consultar Patente U.S. Nos. 7.087.411 e 7.279.159). Em outras modalidades, uma proteína de fusão Fc é uma proteína de fusão ScFv-Fc, que contém um ou mais de um ou mais domínios de ligação ao antígeno, como um fragmento de cadeia pesada variável e um fragmento de cadeia leve variável, de um anticorpo acoplado a uma fração Fc.

[0055] Em uma modalidade, o fármaco proteico é um anticorpo

20 / 22 monoclonal concentrado.

EXEMPLOS Exemplo 1. Espectrometria de Massa HDX de Microdiálise Materiais e Métodos

[0056] mAb1 e mAb2 foram diluídos em histidina 10 mM (pH 6,0) para criar amostras de alta concentração (120 mg/mL) e amostras de baixa concentração (15 mg/mL). 160 µL de cada amostra foram carregados em um cartucho de microdiálise. O cartucho foi inserido em uma placa de poço profundo contendo tampão D2O e incubado por 4 ou 24 horas a 4 ° C. Após a incubação, 5 µL de cada amostra dialisada foram finalizados pela adição de tampão de finalização à amostra, de acordo com a Tabela 1. O tampão de finalização contém GlnHCl 6M/TCEP 0,6 M em 100% D2O. A reação de finalização foi realizada a 0 °C durante 3 minutos. 10 µL de cada amostra finalizada foram diluídos com 0,1% de FA em D2O, de acordo com a Tabela 1. 70 µL de cada amostra foram carregados no sistema HDX. Tabela 1. Tampões de amostra e volumes de diluição. Volume de Tampão de Quantidade de Amostra Volume do Tampão de Diluição Finalização Injeção 120 mg/mL 5 µL295 µL (2 mg/mL) 10 µL130 µL (0,1 mg/mL) 70 µL (7 µg) 15 mg/mL 5 µL70 µL (1 mg/mL) 20 µL120 µL (0,1 mg/mL) 70 µL (7 µg) Resultados

[0057] O anticorpo monoclonal 1 (mAb1) exibiu viscosidade excepcionalmente alta em concentrações > 100 mg/mL, quando comparado a outros anticorpos monoclonais no estágio de desenvolvimento (Figuras 1A- 1B). Para sondar as interações de proteína-proteína que regem a alta viscosidade de mAb1 em uma alta concentração de proteína, um método HDX- MS baseado em microdiálise passivo foi desenvolvido para alcançar a marcação HDX sem D2O diluição do tampão, que possibilita o perfil\mento de interações moleculares em diferentes concentrações de proteína (Figura 2A- 2F).

21 / 22

[0058] Uma diminuição significante no deutério foi observada nas amostras de alta concentração (120 mg/mL) comparadas com as amostras de controle (15 mg/mL) nas três regiões determinantes complementares da cadeia pesada e CDR2 da cadeia leve para mAb1 (Figuras 3A-3N, Tabela 2 e Tabela 3). Este resultado indica que essas CDRs podem estar envolvidas em interações intermoleculares específicas que podem causar a viscosidade excepcionalmente alta observada com mAb1. Para confirmar que essas CDRs são a causa da alta viscosidade, o método revelado foi aplicado para investigar as interações proteína-proteína em alta concentração de mAb2 que tem a mesma sequência de aminoácidos que mAb1, exceto para CDRs e tem uma baixa viscosidade (Figuras 4B, 4D, 4F e 4H). Ao contrário de mAb1, nenhuma absorção diferencial de deutério foi observada entre a alta concentração de amostras de mAb2 e as amostras de baixa concentração de mAb2, confirmando ainda que as CDRs de mAb1 causaram a alta viscosidade em altas concentrações. Tabela 2. Absorção relativa de deutério no peptídeo mAb1 não CDR com o tempo. Absorção relativa de deutério não CDR de mAb1 (%) Ponto no Tempo 15 mg/ml 120 mg/ml 0 hr 0,0 % 0,0 % 4 horas 36,7 % 33,2 % 24 horas 41,7 % 38,6 % Tabela 3. Absorção relativa de deutério no peptídeo mAb1 LC-CDR com o tempo. Absorção de deutério relativa a mAb1 LC-CDR (%) Ponto no Tempo 15 mg/ml 120 mg/ml 0 hr 0,0 % 0,0 % 4 horas 49,8 % 39,1 % 24 horas 65,6 % 52,2 %

[0059] Embora, na especificação anterior, esta invenção tenha sido descrita em relação a certas modalidades da mesma, e muitos detalhes tenham sido apresentados para efeitos de ilustração, ficará evidente aos versados na técnica que a invenção é suscetível a modalidades adicionais e que alguns dos detalhes descritos neste documento podem ser variados consideravelmente sem

22 / 22 fugir dos princípios básicos da invenção.

[0060] Todas as referências citadas neste documento estão incorporadas por referência em sua totalidade. A presente invenção pode ser concretizada em outras formas específicas sem fugir do espírito ou seus atributos essenciais e, consequentemente, deve-se fazer referência às reivindicações anexas, em vez de à especificação anterior, como indicando o escopo da invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para identificar regiões em uma proteína que contribuem para a viscosidade da proteína, caracterizado por compreender: microdialisar amostras da proteína em um cartucho de microdiálise contra um tampão compreendendo deutério por pelo menos dois períodos de tempo diferentes; finalizar subsequentemente a microdiálise das amostras; analisar as amostras finalizadas em um sistema de espectrometria de massa de troca de hidrogênio/deutério para determinar as regiões da proteína na amostra que têm níveis reduzidos de deutério em relação a outras regiões da proteína, em que as regiões da proteína que têm níveis reduzidos de deutério contribuem para a viscosidade da proteína.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as amostras de proteína compreenderem entre 10 mg/mL a 200 mg/mL de proteína.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por as amostras de proteína na etapa de microdiálise estarem em um tampão com um pH entre 5,0 e 7,5.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por as amostras de proteína na etapa de microdiálise estarem em histidina 10 mM em pH 6,0.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o tampão que compreende deutério compreender Histidina 10 mM em pH 6,0.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a microdiálise ser realizada entre 2 a 6 °C.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ao menos uma amostra ser microdialisada por 4 horas e ao menos outra amostra ser microdialisada por 24 horas.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

7, caracterizado por a etapa de finalização ser realizada entre -2 a 2 °C por 1 a 5 minutos.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por compreender adicionalmente digerir a proteína em peptídeos antes da análise de espectrometria de massa.

10. Método para modificar a viscosidade de um fármaco proteico, caracterizado por compreender: identificar as regiões do fármaco proteico que contribuem para a viscosidade do fármaco proteico conforme o método definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, modificar uma ou mais das regiões identificadas como contribuintes para a viscosidade do fármaco proteico para modificar a viscosidade do fármaco proteico.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por ao menos uma das regiões identificadas como contribuintes para a viscosidade do fármaco ser modificada pela substituição de um ou mais aminoácidos em pelo menos uma região.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, caracterizado por uma ou mais regiões identificadas como contribuintes para a viscosidade do fármaco proteico serem modificadas para reduzir a viscosidade do fármaco proteico.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por a proteína ser selecionada a partir do grupo que consiste em um anticorpo, uma proteína de fusão, uma proteína recombinante ou uma de suas combinações.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado por o fármaco proteico ser um anticorpo monoclonal concentrado.

15. Fármaco proteico, caracterizado por ser produzido pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 14.