CN112136049A - 用于定量和修饰蛋白质粘度的系统和方法 - Google Patents

用于定量和修饰蛋白质粘度的系统和方法 Download PDF

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Abstract

提供了用于确定蛋白质中对那些蛋白质的制剂的粘度有贡献的区域的系统和方法。还提供了用于修饰浓缩蛋白质制剂的粘度的方法。

Description

用于定量和修饰蛋白质粘度的系统和方法
技术领域
本发明总体涉及用于预测高浓度治疗性抗体的粘度的方法。
背景技术
单克隆抗体是一类快速增长的生物疗法。单克隆抗体具有广泛的适应症，包括炎性疾病、癌症和传染性疾病。市售单克隆抗体的数量正在快速增长，预计到2020年将有约70种单克隆抗体产品投入市场(Ecker，D.M等人，mAbs，7：9-14(2015))。
当前，治疗性抗体最普遍使用的施用途径是静脉内(IV)输注。然而，皮下注射正越来越多地用于需要频繁给药的慢性疾病患者。即用型预填充注射器或自动注射笔允许患者自行施用治疗性抗体。用于皮下注射的抗体制剂通常比IV输注更浓缩，因为皮下注射是单次推注施用(通常是1-1.5mL)，相比之下在IV输注的情况中则是随时间推移缓慢输注抗体。
制备高度浓缩的治疗性单克隆抗体遇到的常见挑战是高粘度(Tomar，D.S.等人，mAbs，8：216-228(2016))。高粘度可导致注射时间增加和注射部位疼痛加剧。除了施用问题外，高粘度抗体还在抗体溶液的生物加工过程中带来问题。高粘度可增加加工时间，使药物产品不稳定，并且增加制造成本。短程静电和/或疏水蛋白质-蛋白质相互作用以及电粘效应可影响抗体的浓度依赖性粘度行为。
表征抗体的构象和结构动力学可能是主要的分析挑战。许多可用的结构技术要么高度复杂，从而需要非常专业的技能和大量样品(＞μM量)，要么分辨率低，从而使得难以进行详细的结构分析。因此，期望具有可用的技术，该技术可以低样品需求、良好的分辨率和相对快速的周转时间探测蛋白质结构。
因而，本发明的一个目的是提供用于鉴定蛋白质中对该蛋白质的制剂的粘度有贡献的区域的方法。
本发明的另一个目的是提供用于修饰浓缩蛋白质溶液的粘度的方法。
发明内容
提供用于确定蛋白质中对那些蛋白质的制剂的粘度有贡献的区域的系统和方法。还提供了用于修饰浓缩蛋白质制剂的粘度的方法。
一个实施方案提供一种用于鉴定蛋白质中对该蛋白质的粘度有贡献的区域的方法，该方法通过如下来实现：在微透析筒中以含有氘的缓冲液对该蛋白质的样品进行微透析，持续至少两个不同的时间段。随后淬灭该微透析。然后使用氢/氘交换质谱系统分析淬灭的样品，以确定样品中的蛋白质中相对于其他蛋白质区域具有降低的氘水平的区域。蛋白质中具有降低的氘水平的区域对蛋白质的粘度有贡献。
在某些实施方案中，蛋白质样品具有介于10mg/mL至200mg/mL的蛋白质浓度。
在一些实施方案中，在pH介于5.0至7.5之间的缓冲液中对蛋白质样品进行微透析。用于蛋白质样品的优选缓冲液是pH 6.0的10mM组氨酸。示例性的含氘缓冲液包括pH6.0的10mM组氨酸中的氘。通常，微透析在2℃至6℃，优选在4℃下进行。在一些实施方案中，微透析在20℃至25℃下进行。不同的样品可透析不同的时长，例如，一个样品可透析4小时，而另一个样品可微透析24小时。在一些实施方案中，将样品透析30分钟、4小时、24小时或过夜，即26小时。
在某些实施方案中，淬灭步骤通常在-2℃至2℃下进行1至5分钟。
在一些实施方案中，该方法包括在质谱分析之前将蛋白质消化成肽的步骤。
另一个实施方案提供一种修饰蛋白质药物的粘度的方法，该方法通过如下来实现：根据所公开的方法鉴定蛋白质药物中对该蛋白质药物的粘度有贡献的区域，以及修饰被鉴别为对该蛋白质药物的粘度有贡献的所述蛋白质药物区域以修饰蛋白质药物的粘度。可以通过在所述至少一个区域中置换一个或多个氨基酸来修饰被鉴定为对药物的粘度有贡献的所述区域，以根据需要降低或增加粘度。
蛋白质或蛋白质药物可以是抗体、融合蛋白、重组蛋白或它们的组合。在一个实施方案中，蛋白质药物是浓缩的单克隆抗体。
附图说明
图1A为显示mAb1的粘度(cP)随浓度(mg/mL)变化的线图。图1B为显示mAb2的粘度(cP)随浓度(mg/mL)变化的线图。
图2A-2F为例示性的基于微透析的HDX-MS方案的示意图。获得微透析筒(图2A)，将D2O缓冲液添加至深孔板(图2B)，将样品加载进微透析筒中(图2C)，将微透析筒加载进深孔板中(图2D)，将样品在D2O缓冲液中温育持续多个时间点(图2E)，并移出样品供MS分析(图2F)。
图3A-3F为在氘温育后0小时(图3A和图3D)、4小时(图3B和图3E)或24小时(图3C和图3F)，15mg/mL浓度(图3A-图3C)和120mg/mL浓度(图3D-图3F)的非CDR mAb1样品中氘吸收随时间变化的例示性谱图。图3G-3L为在氘温育后0小时(图3G和图3J)、4小时(图3H和图3K)或24小时(图3I和图3L)，15mg/mL浓度(图3G-图3I)和120mg/mL浓度(图3J-图3L)的非CDRmAb1样品中随氘吸收随时间变化的谱图。图3M和3N是氘吸收曲线图，示出了对于mAb1HC36-47和mAb1 LC48-53，15mg/mL(◆)和120mg/mL(■)的氘吸收百分比对时间(小时)。
图4A-4B和4E-4F是蝶形图，示出了氘温育4小时或24小时后mAb1(图4A和4E)和mAb2(图4B和4F)的重链CDR区中的相对氘吸收。上图代表120mg/mL样品浓度，下图代表15mg/mL样品浓度。X轴代表肽编号，Y轴代表差异性氘吸收(％)。图4C-4D和4G-4H为残差图，示出了氘温育4小时或24小时后，mAb1(图4C和4G)和mAb2(图4D和4H)的重链CDR区中的相对氘吸收。上图代表120mg/mL样品浓度，下图代表15mg/mL样品浓度。X轴代表肽编号，Y轴代表差异性氘吸收(％)。图4G-4H为温育4小时或24小时后，mAb1轻链(图4G)和mAb2轻链(图4H)中氘吸收的残差图。X轴代表肽编号，Y轴代表差异性氘吸收(％)。
具体实施方式
I.定义
在描述当前要求权利保护的本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用术语“一个”、“一种”、“该(所述)”和类似指代应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或明确与上下文相矛盾。
除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的缩略方法，并且将每个单独的值并入本说明书中，就如同其在本文中单独引用一样。
术语“约”的使用旨在描述在大约+/-10％的范围内高于或低于所述值的值；在其它实施方案中，值的数值范围可以在大约+/-5％的范围内高于或低于所述值；在其它实施方案中，值的数值范围可以在大约+/-2％的范围内高于或低于所述值；在其它实施方案中，值的数值范围可以在大约+/-1％的范围内高于或低于所述值。前面的范围旨在通过上下文解释清楚，并且不暗示进一步的限制。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另有说明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求权利保护的要素对于本发明的实施是必不可少的。
如本文所用，“蛋白质”是指包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基的分子。蛋白质包括多肽和肽，并且可还包括修饰，诸如糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ羧化、烷基化、羟基化和ADP-核糖基化。蛋白质可以具有科学价值或商业价值，包括基于蛋白质的药物，并且蛋白质尤其包括酶、配体、受体、抗体和嵌合蛋白或融合蛋白。蛋白质是使用众所周知的细胞培养方法通过各种类型的重组细胞产生的，并且通常通过转染基因工程核苷酸载体(例如，诸如编码嵌合蛋白的序列，或者密码子优化的序列、无内含子序列等)引入细胞中，其中载体可以作为附加体存在或整合到细胞基因组中。
“抗体”是指由通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重链(H)和两条轻链(L))组成的免疫球蛋白分子。每条重链具有重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区含有三个结构域即CH1、CH2和CH3。每条轻链具有轻链可变区和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域(CL)组成。VH区和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包括指任何同种型或亚型的糖基化和非糖基化免疫球蛋白。术语“抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体分子，诸如从经转染以表达抗体的宿主细胞分离的抗体。术语抗体也包括双特异性抗体，其包括可结合至不止一个不同表位的异四聚免疫球蛋白。双特异性抗体在美国专利申请公开No.2010/0331527中进行了一般性描述，该专利申请以引用方式并入本申请中。
“CDR”或互补决定区是散布在更保守的称为“框架区”(FR)的区域内的高变区。FR可以与人种系序列相同，或者可以是天然修饰的或人工修饰的。
如本文所用，“粘度”是指液体动量的传递速率。其为表示内部摩擦大小的量，该量由抵抗流动的每单位面积的力来测量，所述流动中相隔单位距离的平行层相对于彼此具有单位速度。在液体中，粘度是指液体的“稠度”。
术语“HDX-MS”是指氢/氘交换质谱。
如本文所用，“透析”是一种分离技术，其通过透过半透膜选择性和被动扩散而促进从溶液中的大分子中移除小的不需要的化合物。将样品和缓冲溶液(称为透析液，通常为样品体积的200倍至500倍)置于膜的相对两侧。大于膜孔的样品分子保留在膜的样品侧，但是小分子和缓冲盐自由透过膜，从而降低样品中那些分子的浓度。一旦液-液界面(膜一侧的样品和另一侧的透析液)起始，所有分子将试图以任一方向跨膜扩散以达到平衡。当达到平衡时，透析(扩散)将停止。透析系统也用于缓冲液交换。
术语“微透析”是指体积小于一毫升的样品的透析。
“D2O”是氘代水的缩写。其也称为重水或氧化氘。D2O含有大量的氢同位素氘，而不是构成普通水中大部分氢的常见氢同位素。氘是氢的同位素，由于所增加的中子，氘的重量是氢的两倍。
II.鉴定蛋白质中对粘度有贡献的区域的方法
本文公开了用于确定蛋白质中对那些蛋白质的制剂的粘度有贡献的区域的系统和方法。还提供了用于修饰浓缩蛋白质制剂的粘度的方法。高度浓缩的治疗性单克隆抗体的开发对于皮下递送单克隆抗体治疗剂至关重要。然而，高粘度是浓缩单克隆抗体治疗剂制备中的一个问题。需要开发计算和实验工具以在开发过程的早期快速有效地确定候选治疗剂的浓度依赖性粘度行为。
A.微透析-氢/氘交换质谱
在开发过程中，当与其他类似单克隆抗体相比时，例如在＞100mg/mL的浓度下，治疗性单克隆抗体可能会展现出异常高的粘度。这可能归因于在高浓度下单克隆抗体的特征性短程静电和/或疏水蛋白质-蛋白质相互作用。氢/氘交换质谱(HDX-MS)是研究蛋白质构象、动力学和相互作用的有用工具。然而，常规的稀释标记HDX-MS分析在分析仅在高蛋白浓度下发生的异常行为方面存在局限性。
为了用HDX-MS探测主导高蛋白浓度下单克隆抗体的高粘度的蛋白质-蛋白质相互作用，开发了一种被动的基于微透析的HDX-MS方法以在无需D2O缓冲液稀释的情况下实现HDX标记，这允许剖析不同蛋白质浓度下的特征性分子相互作用。一个实施方案提供一种用于鉴定蛋白质中对粘度有贡献的区域的方法，该方法通过如下实现：在微透析筒中以含有氘的缓冲液对该蛋白质的样品进行微透析，持续至少两个不同的时间段。随后淬灭该微透析。然后使用氢/氘交换质谱系统分析淬灭的样品，以确定样品中的蛋白质中相对于其他蛋白质区域具有降低的氘水平的区域。蛋白质中具有降低的氘水平的区域对蛋白质的粘度有贡献。
在一个实施方案中，可优化具有高粘度行为的蛋白质以减少或消除高粘度行为。优化蛋白质药物或抗体的方法包括但不限于优化氨基酸序列以降低粘度、改变制剂的pH或盐含量、或添加赋形剂。
在一个实施方案中，可以测试多种治疗性蛋白质或抗体制剂以确定最具前景的候选物以推进生产。制备每种蛋白质或抗体的高浓度样品和低浓度样品。在一个实施方案中，高蛋白质或抗体浓度是＞50mg/mL。高浓度可为100mg/mL、110mg/mL、120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、150mg/mL、160mg/mL、170mg/mL、180mg/mL、190mg/mL、200mg/mL或＞200mg/mL。在一个实施方案中，低抗体浓度为＜15mg/mL。低浓度可为15mg/mL、10mg/mL、9mg/mL、8mg/mL、7mg/mL、6mg/mL、5mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL或＜0.5mg/mL。
下文提供所公开的方法的步骤的更多细节。
1.氢/氘交换
氢/氘交换是一种现象，其中蛋白质中不稳定位置的氢原子与含有氘离子的周围溶剂中的氢原子自发地交换位置(Houde，D.和Engel，J.R.，Methods Mol Biol，988：269-289(2013))。HDX利用蛋白质中的三种类型的氢：碳-氢键中的那些氢、侧链基团中的那些氢和酰胺官能团中的那些氢(也称为主链氢)。碳-氢键中的氢的交换速率太慢而无法观察到，而侧链氢(例如OH、COOH)的交换速率非常快，以至于在基于H2O的溶液中淬灭反应时，它们快速发生反向交换，从而未被检测到交换。仅主链氢可用于报告蛋白质结构和动力学，因为它们的交换速率是可测量的，并反映氢键合和溶剂可及性。酰胺氢在二级和三级结构元件的形成中起关键作用。可以依据各个高级结构元件的构象动力学以及总体蛋白质动力学和稳定性来解释它们的交换速率的测量结果。
交换速率反映蛋白质结构中的构象活动性、氢键合强度和溶剂可及性。有关蛋白质构象以及最重要的是，同一蛋白质的两种或更多种形式之间的蛋白质构象差异的信息可以通过监测交换反应来提取。交换速率是温度依赖性的，当温度从25℃降低至0℃时，交换速率降低大约十倍。因此，在pH 2-3和0℃(通常称为“淬灭条件”)下，非结构化多肽中酰胺氢同位素交换的半衰期为30-90分钟，这取决于由侧链引起的溶剂屏蔽效应。氢的质量为1.008Da，氘(氢的第二同位素)的质量为2.014Da，可通过用质谱仪测量蛋白质的质量来跟踪氢交换。
在一个实施方案中，氢/氘交换速率用于确定蛋白质或抗体治疗剂的粘度行为。
2.微透析
经由稀释的经典连续HDX标记不适用于高度浓缩的蛋白溶液的分析。本文的一个实施方案提供可用于高浓度蛋白溶液的HDX标记的备选方法。微透析板中的HDX标记有利于分析高度浓缩的蛋白质溶液。此外，与传统的透析装置相比，微透析板的使用可减少样品和D2O的消耗(Houde，D.等人，J Am Soc Mass Spectrom，27(4)：669-76(2016))。微透析板可以是市售的微透析板，例如PierceTM 96孔微透析板。
在一个实施方案中，将微透析HDX交换用于分析高度浓缩的蛋白质溶液。将样品加载到微透析板的微透析筒中。将D2O缓冲液添加至深孔板或其他合适的容器中。将容纳有蛋白质样品的微透析筒添加至缓冲液中并温育至少4小时。样品可以温育0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个小时或超过24小时。透析系统允许缓冲液被动扩散到容纳有样品的筒中，从而不会像需要大量缓冲液的传统连续HDX标记中常见的那样稀释样品。在温育步骤期间，D2O缓冲液中的氘进入容纳有样品的筒中并与蛋白质样品的主链酰胺中的氢交换。在温育步骤后，从微透析筒收集样品。
3.样品制备
一旦从微透析筒中移出经透析的样品后，可通过淬灭样品终止HDX反应。在一个实施方案中，通过向样品添加淬灭缓冲液来实现淬灭。淬灭缓冲液可含有pH 2.5的H2O中的6MGlnHCl和0.6M TCEP。在一个实施方案中，淬灭缓冲液含有pH 2.5的H2O中的8M尿素、0.6MTCEP。在另一个实施方案中，最终淬灭溶液的pH为2.5。
在一个实施方案中，降低反应温度也可以淬灭HDX反应。该反应可以在0℃下进行。当温度从25℃降低至0℃，交换速率降低十倍。在一个实施方案中，淬灭反应在0℃或0℃以下进行。
淬灭后，可稀释样品以供下游质谱分析。可将样品稀释于0.1％甲酸(FA)水溶液或适用于质谱的任何其他稀释剂中。然后通过质谱仪处理样品。
4.质谱
在一个实施方案中，将质谱法用于确定随着时间的推移由氘交换氢引起的质量变化(反之亦然)。氢的质量为1.008Da，氘的质量为2.014Da，因此可以通过用质谱仪测量蛋白质的质量来跟踪氢交换。与未在D2O中温育的原生蛋白质或抗体相比，掺有氘的蛋白质或抗体的质量会增加。一般而言，氢交换的水平可反映蛋白质结构中的柔性、溶剂可及性和氢键合相互作用。
在一些实施方案中，采用在线消化来将较大的蛋白质或抗体切割成较小的片段或肽。用于在线消化的常用酶包括但不限于胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶/Lys-C、rLys-C、Lys-C和Asp-N。
在一个实施方案中，使经消化的蛋白质或抗体经受质谱分析。进行质谱分析的方法是本领域已知的。参见例如(Aeberssold，M.和Mann，M.，Nature，422：198-207(2003))。常用的质谱类型包括但不限于串联质谱(MS/MS)、电喷雾电离质谱、液相色谱-质谱(LC-MS)和基质辅助激光解吸/电离(MALDI)。
III.修饰蛋白质粘度的方法
一个实施方案提供一种修饰蛋白质药物的粘度的方法，该方法通过如下实现：根据所公开的方法鉴定蛋白质药物中对该蛋白质药物的粘度有贡献的区域，以及修饰被鉴别为对该蛋白质药物的粘度有贡献的所述蛋白质药物区域以修饰蛋白质药物的粘度。可以通过在所述至少一个区域中置换一个或多个氨基酸来修饰被鉴定为对药物的粘度有贡献的所述区域，以根据需要降低或增加粘度。
例如，可修饰抗体的轻链、重链或互补决定区以降低抗体的浓缩制剂的粘度。示例性浓缩制剂具有大于50mg/mL、优选100mg/mL或更高的抗体浓度。
蛋白质或抗体药物的其他修饰包括在被确定为对蛋白质或抗体药物的粘度有贡献的蛋白质或抗体区域中对氨基酸进行化学修饰。
在一个实施方案中，蛋白质、抗体或药物产品是或含有一种或多种适于在原核或真核细胞中表达的所关注的蛋白质。例如，所关注的蛋白质包括(但不限于)抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、ScFv或其片段、Fc融合蛋白或其片段、生长因子或其片段、细胞因子或其片段、或细胞表面受体的胞外结构域或其片段。所关注的蛋白质可为由单个亚基组成的简单多肽或为由两个或更多个亚基组成的复杂多亚基蛋白质。所关注的蛋白质可是生物医药产品、食品添加剂或防腐剂或任何受纯化和质量标准约束的蛋白质产品。
在一些实施方案中，所关注的蛋白质是抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双链抗体、三链抗体或四链抗体、双特异性四价免疫球蛋白G样分子(称为双可变结构域免疫球蛋白(DVD-IG))、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。在一个实施方案中，抗体是IgG1抗体。在一个实施方案中，抗体是IgG2抗体。在一个实施方案中，抗体是IgG4抗体。在另一个实施方案中，抗体包含嵌合铰链。在又其他实施方案中，抗体包含嵌合Fc。在一个实施方案中，抗体是嵌合IgG2/IgG4抗体。在一个实施方案中，抗体是嵌合IgG2/IgG1抗体。在一个实施方案中，抗体是嵌合IgG2/IgG1/IgG4抗体。
在一些实施方案中，该抗体选自抗程序化细胞死亡1抗体(例如，如美国专利申请公开No.US2015/0203579A1中所述的抗PD1抗体)、抗程序化细胞死亡配体1(例如，如美国专利申请公开No.US2015/0203580A1中所述的抗PD-L1抗体)、抗D114抗体、抗血管生成素2抗体(例如，如美国专利No.9,402,898中所述的抗ANG2抗体)、抗血管生成素样3抗体(例如，如美国专利No.9,018，356中所述的抗AngPtl3抗体)、抗血小板衍生生长因子受体抗体(例如，如美国专利No.9,265,827中所述的抗PDGFR抗体)、抗Erb3抗体、抗催乳素受体抗体(例如，如美国专利No.9,302,015中所述的抗PRLR抗体)、抗补体5抗体(例如，如美国专利申请公开No.US2015/0313194A1中所述的抗C5抗体)、抗TNF抗体、抗表皮生长因子受体抗体(例如，如美国专利No.9，132,192中所述的抗EGFR抗体或如美国专利申请公开No.US2015/0259423A1中所述的抗EGFRvIII抗体)、抗前蛋白转化酶枯草溶菌素Kexin-9抗体(例如，如美国专利No.8,062,640或美国专利No.9,540,449中所述的抗PCSK9抗体)、抗生长和分化因子8抗体(例如，抗GDF8抗体，也称为抗肌生长抑制素抗体，如美国专利No.8,871,209或No.9,260,515中所述)、抗胰高血糖素受体(例如，如美国专利申请公开No.US2015/0337045A1或No.US2016/0075778A1中所述的抗GCGR抗体)、抗VEGF抗体、抗IL1R抗体、白介素4受体抗体(例如，如美国专利申请公开No.US2014/0271681A1或美国专利No.8,735,095或No.8,945,559中所述的抗IL4R抗体)、抗白介素6受体抗体(例如，如美国专利No.7,582,298、No.8,043,617或No.9,173,880中所述的抗IL6R抗体)、抗IL1抗体、抗IL2抗体、抗IL3抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、抗IL7抗体、抗白介素33(例如，如美国专利No.9,453,072或No.9,637,535中所述的抗IL33抗体)、抗呼吸道合胞病毒抗体(例如，如美国专利No.9,447,173中所述的抗RSV抗体)、抗分化簇3(例如，如在美国专利No.9,447,173和No.9,447,173以及在美国申请No.62/222,605中所述的抗CD3抗体)、抗分化簇20(例如，如美国专利No.9,657,102和No.US20150266966A1以及在美国专利No.7,879,984中所述的抗CD20抗体)、抗CD19抗体、抗CD28抗体、抗分化簇48(例如，如美国专利No.9,228,014中所述的抗CD48抗体)、抗Fel d1抗体(例如，如美国专利No.9,079,948中所述的)、抗中东呼吸综合征病毒(例如，如美国专利申请公开No.US2015/0337029A1中所述抗MERS抗体)、抗埃博拉病毒抗体(例如，如美国专利申请公开No.US2016/0215040中所述的)、抗寨卡病毒抗体、抗淋巴细胞活化基因3抗体(例如，抗LAG3抗体或抗CD223抗体)、抗神经生长因子抗体(例如，如美国专利申请公开No.US2016/0017029以及美国专利No.8,309,088和No.9,353,176中所述的抗NGF抗体)和抗蛋白Y抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体选自抗CD3×抗CD20双特异性抗体(如美国专利申请公开No.US2014/0088295A1和No.US20150266966A1中所述的)、抗CD3×抗粘蛋白16双特异性抗体(例如，抗CD3×抗Muc16双特异性抗体)和抗CD3×抗前列腺特异性膜抗原双特异性抗体(例如，抗CD3×抗PSMA双特异性抗体)。在一些实施方案中，所关注的蛋白质选自阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿达木单抗-atto(adalimumab-atto)、ado-曲妥珠单抗(ado-trastuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利库单抗(alirocumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝那利珠单抗(benralizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、贝洛托单抗(bezlotoxumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、布罗达单抗(brodalumab)、康纳单抗(canakinumab)、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、PEG化塞妥珠单抗(certolizumab pegol)、西米普利单抗(cemiplimab)、西妥昔单抗(cetuximab)、地诺单抗(denosumab)、地努妥昔单抗(dinutuximab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、得瓦鲁单抗(durvalumab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、艾米希组单抗(emicizumab-kxwh)、厄塔毒素-阿利珠单抗偶联物(emtansinealirocumab)、依维库人单抗(evinacumab)、依洛尤单抗(evolocumab)、法辛单抗(fasinumab)、戈利木单抗(golimumab)、塞库单抗(guselkumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、依达赛珠单抗(idarucizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、英夫利昔单抗-abda(infliximab-abda)、英夫利昔单抗-dyyb(infliximab-dyyb)、伊匹单抗(ipilimumab)、伊西贝单抗(ixekizumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、雷珠单抗(nesvacumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥必托昔单抗(obiltoxaximab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、瑞西巴库单抗(raxibacumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利努单抗(rinucumab)、利妥昔单抗(rituximab)、沙利鲁单抗(sarilumab)、塞库单抗(secukinumab)、西妥昔单抗(siltuximab)、塔西单抗(tocilizumab)、塔西单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、特伐单抗(trevogrumab)、乌司他单抗(ustekinumab)和维多珠单抗(vedolizumab)。
在一些实施方案中，所关注的蛋白质是含有Fc部分和另一个结构域的重组蛋白质(例如Fc融合蛋白)。在一些实施方案中，Fc融合蛋白是受体Fc融合蛋白，其含有与Fc部分偶联的受体的一个或多个胞外结构域。在一些实施方案中，Fc部分包含IgG的铰链区、随后的CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，受体Fc融合蛋白含有可结合至单种配体或多种配体的两条或更多条独特的受体链。例如，Fc融合蛋白是TRAP蛋白，诸如例如IL-1陷阱蛋白(例如，rilonacept，其含有与融合至hIgG1的Fc的Il-1R1胞外区融合的IL-1RAcP配体结合区；参见美国专利No.6,927,004，该专利全文以引用的方式并入本文)或YEGF陷阱蛋白(例如，aflibercept或ziv-aflibercept，其包含与融合至hIgG1的Fc的VEGF受体Flk1的Ig结构域3融合的VEGF受体Flt1的结构域2；参见美国专利No.7,087,411和No.7,279,159)。在其他实施方案中，Fc融合蛋白是ScFv-Fc融合蛋白，其含有与Fc部分偶联的抗体的一个或多个抗原结合结构域(诸如可变重链片段和可变轻链片段)中的一者或多者。
在一个实施方案中，蛋白质药物是浓缩的单克隆抗体。
实施例
实施例1.微透析HDX质谱
材料和方法
将mAb1和mAb2稀释于10mM组氨酸(pH 6.0)中，以生成高浓度样品(120mg/mL)和低浓度样品(15mg/mL)。将160μl的每个样品加载进微透析筒中。将该筒插入容纳有D2O缓冲液的深孔板中，并在4℃下温育4或24小时。温育后，根据表1，通过向样品添加淬灭缓冲液来淬灭5μl的每个经透析的样品。淬灭缓冲液含有100％D2O中的6M GlnHCl/0.6M TCEP。淬灭反应在0℃下进行3分钟。根据表1，用D2O中的0.1％FA稀释10μl的每个经淬灭的样品。将70μl的每个样品加载到HDX系统上。
表1.样品缓冲液和稀释液体积.
Figure BDA0002764755850000151
Figure BDA0002764755850000161
结果
在开发阶段当与其他单克隆抗体相比时，单克隆抗体1(mAb1)在＞100mg/mL的浓度下表现出异常高的粘度(图1A-1B)。为了探测主导高蛋白质浓度下mAb1的高粘度的蛋白质-蛋白质相互作用，开发了一种被动的基于微透析的HDX-MS方法以在无需D2O缓冲液稀释的情况下实现HDX标记，这允许剖析不同蛋白质浓度下的分子相互作用(图2A-2F)。
与对照样品(15mg/mL)相比，在高浓度样品(120mg/mL)中观察到mAb1的三个重链互补决定区和轻链CDR2处，氘显著降低(图3A-3N，表2和表3)。该结果表明，这些CDR可能涉及特异性的分子间相互作用，这可导致mAb1观察到异常高的粘度。为了确认这些CDR是造成高粘度的原因，应用所公开的方法来研究高浓度mAb2下的蛋白质-蛋白质相互作用，该mAb2除了CDR以外具有与mAb1相同的氨基酸序列，并且具有较低粘度(图4B、4D、4F和4H)。与mAb1不同，在高浓度mAb2样品和低浓度mAb2样品之间未观察到氘的差异吸收，进一步证实mAb1的CDR引起高浓度下的高粘度。
表2.非CDR mAb1肽随时间推移的相对氘吸收.
Figure BDA0002764755850000162
表3.LC-CDR mAb1肽随时间推移的相对氘吸收.
Figure BDA0002764755850000171
尽管在前面的说明书中已关于本发明的某些实施方案描述了本发明，并且出于说明的目的已经提出了许多细节，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可容许有额外实施方案，并且在不脱离本发明的基本原理的情况下，本文所述的某些细节可以进行相当大的改变。
本文引用的所有参考文献均以引用的方式全文并入本文。在不脱离本发明的精神或本质属性的情况下，本发明可以以其他特定形式来体现，并且因此，应参考所附权利要求，而不是前述说明书，来指示本发明的范围。

Claims (15)

1.一种鉴定蛋白质中对所述蛋白质的粘度有贡献的区域的方法，包括：
在微透析筒中以包含氘的缓冲液对所述蛋白质的样品进行微透析持续至少两个不同的时间段；
随后淬灭所述样品的所述微透析；
在氢/氘交换质谱系统中分析所述经淬灭的样品以确定所述样品中的所述蛋白质中相对于所述蛋白质的其他区域具有降低的氘水平的区域，其中所述蛋白质中具有降低的氘水平的区域对所述蛋白质的粘度有贡献。
2.根据权利要求1所述的方法，其中蛋白质的样品包含介于10mg/mL至200mg/mL之间的蛋白质。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述微透析步骤中蛋白质的样品在pH介于5.0至7.5之间的缓冲液中。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述微透析步骤中所述蛋白质的样品在pH 6.0的10mM组氨酸中。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述包含氘的缓冲液包含pH 6.0的10mM组氨酸。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述微透析在2℃至6℃下进行。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中将至少一个样品微透析4小时，并且将至少另一个样品微透析24小时。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述淬灭步骤在-2℃至2℃下进行1至5分钟。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，还包括在质谱分析之前将所述蛋白质消化成肽。
10.一种修饰蛋白质药物的粘度的方法，包括：
根据权利要求1-9中任一项所述的方法鉴定所述蛋白质药物中对所述蛋白质药物的所述粘度有贡献的区域，
修饰被鉴定为对所述蛋白质药物的所述粘度有贡献的所述区域中的一者或多者以修饰所述蛋白质药物的所述粘度。
11.根据权利要求10所述的方法，其中通过置换所述至少一个区域中的一个或多个氨基酸来修饰被鉴定为对所述药物的所述粘度有贡献的所述区域中的至少一者。
12.根据权利要求10或11中任一项所述的方法，其中对被鉴定为对所述蛋白质药物的所述粘度有贡献的所述一个或多个区域进行修饰以降低所述蛋白质药物的所述粘度。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述蛋白质选自抗体、融合蛋白、重组蛋白或它们的组合。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述蛋白质药物是浓缩的单克隆抗体。
15.一种蛋白质药物，所述蛋白质药物通过根据权利要求10-14中任一项所述的方法制备。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2024512299A (ja) * 2021-03-03 2024-03-19 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド タンパク質の粘度を定量及び変更するためのシステム及び方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106999566A (zh) * 2014-10-03 2017-08-01 麻省理工学院 结合埃博拉病毒糖蛋白的抗体及其用途
CN107208315A (zh) * 2014-12-01 2017-09-26 斯克利普斯研究院 涉及嵌入异源蛋白质支架中的功能性多肽的方法和组合物

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
AU2002213441B2 (en) * 2000-10-12 2006-10-26 Genentech, Inc. Reduced-viscosity concentrated protein formulations
KR100562195B1 (ko) 2002-03-08 2006-03-20 에이에스엠엘 네델란즈 비.브이. 리소그래피용 마스크, 마스크 제조방법, 리소그래피장치및 디바이스제조방법
US7582298B2 (en) 2006-06-02 2009-09-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity antibodies to human IL-6 receptor
US7608693B2 (en) 2006-10-02 2009-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human IL-4 receptor
PL2178916T3 (pl) 2007-07-31 2015-08-31 Regeneron Pharma Ludzkie przeciwciała przeciwko ludzkiemu CD20 i sposób ich zastosowania
US8309088B2 (en) 2007-08-10 2012-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating osteoarthritis with an antibody to NGF
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
RU2522002C2 (ru) 2009-06-26 2014-07-10 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Легковыделяемые биспецифические антитела с природным иммуноглобулиновым форматом
JO3417B1 (ar) 2010-01-08 2019-10-20 Regeneron Pharma الصيغ المستقرة التي تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد مستقبل( interleukin-6 (il-6r
JO3340B1 (ar) 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
JOP20190250A1 (ar) 2010-07-14 2017-06-16 Regeneron Pharma صيغ مستقرة تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد عامل نمو الأعصاب
AR083044A1 (es) 2010-09-27 2013-01-30 Regeneron Pharma Anticuerpos anti-cd48 y usos de los mismos
US8945559B2 (en) 2010-10-06 2015-02-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stabilized formulations containing anti-interleukin-4 receptor (IL-4R) antibodies
JO3756B1 (ar) 2010-11-23 2021-01-31 Regeneron Pharma اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون
AR087329A1 (es) 2011-06-17 2014-03-19 Regeneron Pharma Anticuerpos humanos contra proteina 3 de tipo angiopoietina humana
PL2780368T3 (pl) 2011-11-14 2018-06-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Kompozycje i sposoby do zwiększania masy mięśni i siły mięśni poprzez swoiste antaganizowanie GDF8 i/lub aktywiny A
CN104169299B (zh) 2012-01-23 2018-06-05 瑞泽恩制药公司 含抗Ang-2 抗体的稳定化制剂
JO3820B1 (ar) 2012-05-03 2021-01-31 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية لـ fel d1وطرق لاستخدامها
TW201843172A (zh) 2012-06-25 2018-12-16 美商再生元醫藥公司 抗－ｅｇｆｒ抗體及其用途
CA2881679C (en) 2012-08-13 2021-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-pcsk9 antibodies with ph-dependent binding characteristics
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
JO3405B1 (ar) 2013-01-09 2019-10-20 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - بيتا واستخداماتها
JO3532B1 (ar) 2013-03-13 2020-07-05 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد انترلوكين-33 واستعمالاتها
TWI659968B (zh) 2013-03-14 2019-05-21 再生元醫藥公司 針對呼吸道融合病毒ｆ蛋白質的人類抗體及其使用方法
JP6404314B2 (ja) 2013-03-15 2018-10-10 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｉｌ−３３拮抗薬とその使用法
TWI641620B (zh) 2013-08-21 2018-11-21 再生元醫藥公司 抗－ｐｒｌｒ抗體及其用途
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
CA2940685C (en) 2014-03-11 2023-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-egfrviii antibodies and uses thereof
TWI754319B (zh) 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
WO2015171523A1 (en) 2014-05-05 2015-11-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized c5 and c3 animals
JO3701B1 (ar) 2014-05-23 2021-01-31 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية - بروتين كورونا فيروس الشوكي
SG11201701711VA (en) 2014-09-16 2017-04-27 Regeneron Pharma Anti-glucagon antibodies and uses thereof
TWI710573B (zh) 2015-01-26 2020-11-21 美商再生元醫藥公司 抗伊波拉病毒醣蛋白之人類抗體

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106999566A (zh) * 2014-10-03 2017-08-01 麻省理工学院 结合埃博拉病毒糖蛋白的抗体及其用途
CN107208315A (zh) * 2014-12-01 2017-09-26 斯克利普斯研究院 涉及嵌入异源蛋白质支架中的功能性多肽的方法和组合物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAMIAN HOUDE等: "Conformational Analysis of Proteins in Highly Concentrated Solutions by Dialysis-Coupled Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry", 《AMERICAN SOCIETY FOR MASS SPECTROMETRY》, pages 671 *
JAMES C. GEOGHEGAN等: "Mitigation of reversible self-association and viscosity in a human IgG1 monoclonal antibody by rational, structure-guided Fv engineering", 《MABS》, pages 2 - 3 *
JAYANT ARORA等: "Hydrogen exchange mass spectrometry reveals protein interfaces and distant dynamic coupling effects during the reversible self-association of an IgG1 monoclonal antibody", 《MABS》, pages 525 - 539 *

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