CN114450593A - 产生抗体组合物的方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了确定抗体组合物的产品质量的方法，其中该抗体组合物的ADCC活性水平是该抗体组合物的产品质量所基于的标准。在示例性实施例中，该方法包括(i)确定抗体组合物的样品的总非岩藻糖基化(TAF)聚糖含量；以及(ii)当在(i)中确定的TAF聚糖含量在目标范围内时，确定产品质量为可接受和/或实现ADCC活性水平标准。本文进一步提供了监测产品质量的相关方法和产生抗体组合物的方法。

Description

产生抗体组合物的方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2019年9月26日提交的美国临时专利申请号62/906,709的权益；其全部披露内容通过引用并入。

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背景技术

糖基化是最常见但重要的翻译后修饰之一，因为它在多种细胞功能(包括例如蛋白折叠、质量控制、分子运输和分选以及细胞表面受体相互作用)中起作用。糖基化影响重组蛋白药物的治疗功效，因为它影响治疗性糖蛋白的生物活性、药代动力学、免疫原性、溶解性和体内清除率。特别地，Fc糖型谱是重组抗体的重要产品质量属性，因为它们直接影响抗体的临床功效和药代动力学。

与Fc-CH2结构域中的保守二天线聚糖相关的特定聚糖结构可以强烈影响与介导抗体效应子功能(例如，抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC))的FcγR的相互作用(参见Reusch D,Tejada ML.Fc glycans of therapeutic antibodies as critical qualityattributes[作为关键质量属性的治疗性抗体的Fc聚糖].Glycobiology[糖生物学]2015；25:1325-34)。例如，核心岩藻糖已展示对FcγRIIIa结合亲和力具有非常显著的影响，导致ADCC活性发生重大变化(参见Okazaki A等人Fucose depletion from human IgG1oligosaccharide enhances binding enthalpy and association rate between IgG1and FcgammaRIIIa[从人IgG1寡糖中耗减岩藻糖可以增强IgG1与FcγRIIIa的结合焓和缔合速率].Journal of molecular biology[分子生物学期刊]2004；336:1239-49；FerraraC等人Unique carbohydrate-carbohydrate interactions are required for highaffinity binding between FcgammaRIII and antibodies lacking core fucose[FcγRIII和缺乏核心岩藻糖的抗体之间的高亲和力结合需要独特的碳水化合物-碳水化合物相互作用].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America[美国国家科学院院报]2011；108:12669-74)。还表明，高甘露糖水平也在调节ADCC活性中发挥作用，尽管其程度比核心岩藻糖更加温和且更难以预测(Thomann M等人Fc-galactosylation modulates antibody-dependent cellular cytotoxicity oftherapeutic antibodies[Fc-半乳糖基化调节治疗性抗体的抗体依赖性细胞的细胞毒性].Molecular immunology[分子免疫学]2016；73:69-75)。

不同因素影响聚糖结构，从而影响蛋白(糖蛋白)的最终糖基化形式(糖型)。例如，表达抗体的细胞系、细胞培养基、进料培养基组成和细胞培养期间进料的时机可以影响蛋白的糖型的产生。尽管研究小组已经提出了许多方法来影响抗体特定糖型的水平，但生物制药行业仍然需要简单有效的方法来预测特定抗体组合物将基于该抗体组合物的给定糖型谱显示的效应子功能水平。此外，本领域需要确定将实现所需水平效应子功能的特定聚糖(例如，非岩藻糖基化聚糖、高甘露糖聚糖)的水平的方法。

发明内容

本披露提供了确定抗体组合物的产品质量的方法，其中该抗体组合物的ADCC活性水平是抗体组合物的产品质量所基于的标准。在各个方面，该方法根据ADCC活性水平标准确定产品质量。在示例性实施例中，该方法包括(i)确定抗体组合物的样品的总非岩藻糖基化(TAF)聚糖含量；以及(ii)当在(i)中确定的TAF聚糖含量在目标范围内时，确定产品质量为可接受和/或实现ADCC活性水平标准。在示例性方面，TAF聚糖含量的目标范围基于(1)参考抗体的ADCC活性水平的目标范围和(2)将抗体组合物的ADCC活性水平与抗体组合物的TAF聚糖含量相关联的第一模型。在示例性方面，由第一模型预测的ADCC为由第二模型预测的ADCC的约95％至约105％，其中第二模型将抗体组合物的ADCC活性水平与抗体组合物的HM聚糖含量和抗体组合物的AF聚糖含量相关联。如本文所用，术语“预测的”在一种或多种ADCC活性水平的上下文中是指计算的ADCC活性水平，其中该ADCC活性水平是根据模型(例如，第一模型、第二模型)计算的。有利地，由第一模型预测的ADCC在统计上显著类似于由第二模型预测的ADCC。例如，由第一模型预测的ADCC活性水平为由第二模型预测的ADCC活性水平的约95％至约105％。任选地，由第一模型预测的ADCC活性水平为由第二模型预测的ADCC活性水平的约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、约101％、约102％、约103％、约104％、或约105％。在各种情况下，由第一模型预测的ADCC活性水平为由第二模型预测的ADCC的约100％。在某些方面，由第一模型预测的ADCC与由第二模型预测的ADCC之间存在一一对应关系。在各种情况下，第一模型和/或第二模型在统计上是显著的。例如，第一模型的p值小于0.0001和/或第二模型的p值小于0.0001。任选地，第一模型和第二模型中的每一个都具有小于0.0001的p值。在示例性方面，由第一模型预测的ADCC活性水平为约12Q*％TAF，其中Q为抗体结合的抗原上的抗体结合位点的数量，并且％TAF是抗体组合物的TAF聚糖含量。在示例性情况下，TAF聚糖含量的目标范围是m至n，其中m是[ADCC_min/12Q]，其中ADCC_min是参考抗体的ADCC活性水平的目标范围的最小值，并且n是[ADCC_max]/12Q]，其中ADCC_max是参考抗体的ADCC活性水平的目标范围的最大值。在各种情况下，Q为2。在各种情况下，由第一模型预测的ADCC活性水平为约24*％TAF。在各种情况下，TAF聚糖含量的目标范围是m至n，其中m是[ADCC_min/24]，并且n是[ADCC_max]/24]。在各种情况下，由第二模型预测的ADCC活性水平为约27*％HM+约22*％AF，其中％AF是抗体组合物的AF聚糖含量，并且％HM是抗体组合物的HM聚糖含量。在各种情况下，Q为1。在各个方面，由第一模型预测的ADCC活性水平为约12*％TAF。在各种情况下，TAF聚糖含量的目标范围是m至n，其中m是[ADCC_min/12]，并且n是[ADCC_max]/12]。在各种情况下，由第二模型预测的ADCC活性水平为约14.8*％HM+约12.8*％AF。本文描述了适合的可替代第一模型和第二模型。在示例性情况下，第一模型是本文描述的将ADCC与TAF聚糖含量相关联的模型(例如，方程)中的任何一个，包括但不限于方程1、3、5和7以及方程A。在示例性情况下，第二模型是本文所述的将ADCC和HM聚糖含量与AF聚糖含量相关联的模型(例如，方程)中的任何一个，包括但不限于方程2、4、6和8以及方程B。例如，在各个方面，TAF聚糖含量的目标范围是m°至n°，其中m°定义为[[ADCC_min-y]/x]，其中ADCC_min是ADCC活性水平的目标范围的最小值,并且n°定义为[[ADCC_max-y]/x]，其中ADCC_max是ADCC活性水平的目标范围的最大值。任选地，x为约20.4至约27.7并且y为约-11.4至约16.7。可替代地，x为约9.7至约15.2并且y为约-15.6至约34.2。在各个方面，TAF聚糖含量的目标范围是m’至n’，其中m’是[ADCC_min/x’]，其中ADCC_min是ADCC活性水平的目标范围的最小值，并且n’是[ADCC_max]/x’]，其中ADCC_max是ADCC活性水平的目标范围的最大值。任选地，x’为约24.1至约25.4。可替代地，x’为约13.0至约13.95。在各种情况下，对于抗体组合物中存在的每1％TAF，抗体组合物的ADCC活性水平为约13.5％±0.5％，任选地，其中抗体组合物的抗体结合仅包含一个抗体结合位点的抗原。在各个方面，对于抗体组合物中存在的每1％TAF，抗体组合物的ADCC活性水平为约24.74％±0.625％，任选地，其中抗体组合物的抗体结合仅包含两个抗体结合位点的抗原。在示例性方面，对于抗体组合物中存在的每1％TAF，抗体组合物的ADCC活性水平为约12％±1.5％*Q，Q是抗原上存在的抗体结合位点的数量。在示例性情况下，参考抗体是英利昔单抗。在示例性方面，参考抗体是利妥昔单抗。在示例性方面，方法是质量控制(QC)测定。在示例性方面，方法是过程中QC测定。在各个方面，样品是过程中材料的样品。在各种情况下，在收获前或收获后确定TAF聚糖含量。在示例性情况下，在层析步骤之后确定TAF聚糖含量。任选地，层析步骤包括捕获层析、中间层析和/或精制层析。在一些方面，在病毒灭活和中和、病毒过滤、或缓冲液交换后确定TAF聚糖含量。在各种情况下，该方法是批次释放测定。在一些方面，样品是制造批次的样品。在各个方面，该方法进一步包括当在(i)中确定的TAF聚糖含量在目标范围内时，选择该抗体组合物进行下游处理。在各个方面，当在(i)中确定的TAF聚糖含量不在目标范围内时，对细胞培养的一种或多种条件进行改良以获得改良的细胞培养物。在一些方面，该方法进一步包括确定在改良细胞培养的一种或多种条件后获得的抗体组合物的样品的TAF聚糖含量。在各个方面，当在(i)中确定的TAF聚糖含量不在目标范围内时，该方法进一步包括(iii)改良细胞培养的一种或多种条件以获得改良的细胞培养物以及(iv)确定从改良的细胞培养物中获得的抗体组合物的样品的TAF聚糖含量。在示例性方面，当在(i)中确定的TAF聚糖含量不在目标范围内时，该方法进一步包括(iii)和(iv)，直到在(iv)中确定的TAF聚糖含量在目标范围内。在示例性情况下，仅当在(i)中确定的TAF聚糖含量不在目标范围内，例如，在目标范围外时，才对抗体组合物进行直接测量抗体组合物的ADCC活性的测定。直接测量ADCC活性的测定包括例如基于细胞的测定，该测定在通过与结合抗原表达细胞和效应细胞两者的抗体结合的效应细胞裂解包含可检测剂的抗原表达细胞时测量可检测试剂的释放。在示例性情况下，直接测量抗体组合物的ADCC活性的测定不在抗体组合物上进行。在各个方面，确定TAF聚糖含量是根据ADCC活性水平标准确定产品质量所需的唯一步骤。不受理论束缚，第一模型和第二模型的统计学显著关联允许TAF聚糖含量指示ADCC活性水平，从而不需要直接测量ADCC活性水平的测定。因此，不需要并且因此在当前披露的方法的各个方面不进行对抗体组合物的ADCC活性水平的直接测量。

本披露还提供了监测抗体组合物的产品质量的方法，其中该抗体组合物的ADCC活性水平是抗体组合物的产品质量所基于的标准。在示例性实施例中，该方法包括根据本披露的方法确定抗体组合物的产品质量，第一样品在第一时间点获得，并且第二样品在不同于第一时间点的第二时间点采集。在各种情况下，第一样品和第二样品中的每一个都是过程中材料的样品。在各个方面，第一样品是过程中材料的样品，并且第二样品是制造批次的样品。任选地，第一样品是在改良细胞培养的一种或多种条件之前获得的样品，并且第二样品是在改良细胞培养的一种或多种条件之后获得的样品。在示例性情况下，确定第一样品和第二样品中的每一个的TAF聚糖含量。抗体组合物的产品质量取决于TAF聚糖含量是否在目标范围内。在示例性方面，TAF聚糖含量的目标范围基于(1)参考抗体的ADCC活性水平的目标范围和(2)将抗体组合物的ADCC活性水平与抗体组合物的TAF聚糖含量相关联的第一模型。在示例性方面，由第一模型预测的ADCC为由第二模型预测的ADCC的约95％至约105％，其中第二模型将抗体组合物的ADCC活性水平与抗体组合物的HM聚糖含量和抗体组合物的AF聚糖含量相关联。

本披露提供了产生抗体组合物的方法。在示例性实施例中，该方法包括确定抗体组合物的产品质量，其中根据本披露的方法确定该抗体组合物的产品质量。任选地，该方法包括确定抗体组合物的样品的TAF聚糖含量并且该样品是过程中材料的样品。在各种情况下，如本文所定义，该方法包括当在(i)中确定的TAF聚糖含量在目标范围内时，确定抗体组合物的产品质量为可接受和/或实现ADCC活性水平标准。在示例性方面，TAF聚糖含量的目标范围基于(1)参考抗体的ADCC活性水平的目标范围和(2)将抗体组合物的ADCC活性水平与抗体组合物的TAF聚糖含量相关联的第一模型。在示例性方面，由第一模型预测的ADCC为由第二模型预测的ADCC的约95％至约105％，其中第二模型将抗体组合物的ADCC活性水平与抗体组合物的HM聚糖含量和抗体组合物的AF聚糖含量相关联。在各个方面，当在(i)中确定的TAF聚糖含量不在目标范围内时，该方法进一步包括(iii)改良细胞培养的一种或多种条件以获得改良的细胞培养物以及(iv)确定从改良的细胞培养物中获得的抗体组合物的样品的TAF聚糖含量，任选地，重复步骤(iii)和(iv)直到TAF聚糖含量在目标范围内。在各种情况下，样品是包含表达抗体组合物的抗体的细胞的细胞培养物样品。在各种情况下，改良细胞培养的一种或多种条件以改良TAF聚糖含量。在各个方面，抗体组合物的TAF聚糖含量是通过改良AF聚糖含量来实现的。在示例性方面，改良细胞培养的一种或多种条件以改良抗体组合物的AF聚糖含量。在示例性方面，该一种或多种条件主要改良AF聚糖含量。在各种情况下，该一种或多种条件改良AF聚糖含量并且不改良HM聚糖含量。在示例性方面，该方法包括通过改良HM聚糖含量来实现抗体组合物的TAF聚糖含量。任选地，改良细胞培养的一种或多种条件以改良抗体组合物的HM聚糖含量。在一些情况下，该一种或多种条件主要改良HM聚糖含量。在一些方面，该一种或多种条件改良HM聚糖含量并且不改良AF聚糖含量。在各种情况下，该方法包括重复改良非岩藻糖基化(AF)聚糖含量和/或重复改良高甘露糖(HM)聚糖，直到TAF聚糖含量在目标范围内。

在示例性实施例中，产生抗体组合物的方法包括(i)确定抗体组合物的样品的TAF聚糖含量；以及(ii)基于在(i)中确定的TAF聚糖含量选择该抗体组合物进行下游处理。在各个方面，样品采集自包含表达抗体组合物的抗体的细胞的细胞培养物。在各种情况下，该方法进一步包括改良抗体组合物的TAF聚糖含量并且确定改良的TAF聚糖含量。任选地，改良细胞培养的一种或多种条件以改良TAF聚糖含量。在示例性方面，该方法包括重复改良直到TAF聚糖含量在目标范围内。在示例性情况下，目标范围基于抗体的ADCC活性水平的目标范围。不受理论束缚，TAF聚糖含量与抗体组合物的ADCC活性水平相关联，从而可以基于抗体组合物的TAF聚糖含量来预测抗体组合物的ADCC活性水平。在决定是否应选择抗体组合物进行下游处理时，抗体组合物的ADCC活性水平可能是一个值得考虑的标准。因此，在各个方面，该方法包括(i)确定抗体组合物的样品的TAF聚糖含量；(ii)基于在(i)中确定的TAF聚糖含量确定抗体组合物的ADCC活性水平，并且任选地，(iii)当在(ii)中确定的抗体组合物的ADCC水平在ADCC活性水平的目标范围内时，选择该抗体组合物进行下游处理。在各个方面，对于抗体组合物的抗体，ADCC活性水平的目标范围是已知的。在各个方面，抗体组合物的抗体是参考抗体的生物类似物。在各种情况下，TAF聚糖含量的目标范围基于已知的ADCC活性水平的目标范围，或基于已知的ADCC活性水平的目标范围确定(例如，计算)。因此，在示例性方面，该方法包括(i)确定抗体组合物的样品的TAF聚糖含量；以及(ii)当在(i)中确定的TAF聚糖含量在目标范围内时，选择该抗体组合物进行下游处理。当该方法进一步包括改良抗体组合物的TAF聚糖含量时，该方法在各种情况下包括改良非岩藻糖基化(AF)聚糖含量以改良TAF聚糖含量。任选地，改良细胞培养的一种或多种条件以改良抗体组合物的AF聚糖含量，这进而改良TAF聚糖含量。可替代地或此外，当该方法进一步包括改良抗体组合物的TAF聚糖含量时，该方法在各种情况下包括改良高甘露糖(HM)聚糖含量以改良TAF聚糖含量。任选地，改良细胞培养的一种或多种条件以改良抗体组合物的HF聚糖含量，这进而改良TAF聚糖含量。在示例性方面，该一种或多种条件主要改良AF聚糖含量。在示例性情况下，该一种或多种条件主要改良HM聚糖含量。在示例性方面，该一种或多种条件改良AF聚糖含量并且不改良HM聚糖含量。在示例性情况下，该一种或多种条件改良HM聚糖含量并且不改良AF聚糖含量。该方法任选地包括重复改良非岩藻糖基化(AF)聚糖含量和/或重复改良高甘露糖(HM)聚糖，直到TAF聚糖含量在目标范围内。在示例性方面，抗体组合物的抗体是IgG，任选地，IgG₁。在各个方面，TAF聚糖含量的目标范围是m至n，其中m是[[ADCC_min-y]/x]，其中ADCC_min是ADCC活性水平的目标范围的最小值，并且n是[[ADCC_max-y]/x]，其中ADCC_max是ADCC活性水平的目标范围的最大值。任选地，x为约20.4至约27.7并且y为约-11.4至约16.7。可替代地，x为约9.7至约15.2并且y为约-15.6至约34.2。在各个方面，TAF聚糖含量的目标范围是m’至n’，其中m’是[ADCC_min/x’]，其中ADCC_min是ADCC活性水平的目标范围的最小值，并且n’是[ADCC_max]/x’]，其中ADCC_max是ADCC活性水平的目标范围的最大值。任选地，x’为约24.1至约25.4。可替代地，x’为约13.0至约13.95。在各种情况下，对于抗体组合物中存在的每1％TAF，抗体组合物的ADCC活性水平为约13.5％±0.5％，任选地，其中抗体组合物的抗体结合仅包含一个抗体结合位点的抗原。在各个方面，对于抗体组合物中存在的每1％TAF，抗体组合物的ADCC活性水平为约24.74％±0.625％，任选地，其中抗体组合物的抗体结合仅包含两个抗体结合位点的抗原。在示例性方面，对于抗体组合物中存在的每1％TAF，抗体组合物的ADCC活性水平为约12％±1.5％*Q，Q是抗原上存在的抗体结合位点的数量。在示例性情况下，Q是1并且任选地抗体是英利昔单抗或其生物类似物。任选地，Q是2并且任选地抗体是利妥昔单抗或其生物类似物。

在示例性实施例中，产生抗体组合物的方法包括(i)确定抗体组合物的％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖；(ii)使用以下方程A基于％TAF计算抗体组合物的％抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)：

Y＝2.6+24.1*X

[方程A]，

其中Y是％ADCC并且X是在步骤(i)中确定的％TAF聚糖，

以及(iii)当Y在目标％ADCC范围内时，选择抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

本披露还提供了一种产生抗体组合物的方法，其中该方法包括(i)确定抗体组合物的％高甘露糖聚糖和％非岩藻糖基化聚糖；(ii)使用以下方程B基于％高甘露糖聚糖和％非岩藻糖基化聚糖计算抗体组合物的％抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)：

Y＝(0.24+27*HM+22.1*AF)

[方程B]，

其中Y是％ADCC，HM是在步骤(i)中确定的％高甘露糖聚糖，并且AF是在步骤(i)中确定的％非岩藻糖基化聚糖，

以及(iii)当Y在目标％ADCC范围内时，选择抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

本披露此外提供了产生具有目标％ADCC的抗体组合物的方法。在示例性实施例中，该方法包括(i)针对目标％ADCC，使用以下方程A计算目标％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖：

Y＝2.6+24.1*X

[方程A]，

其中Y是目标％ADCC并且X是目标％TAF聚糖，

以及(ii)在细胞培养物中维持有糖基化能力的细胞以产生具有目标％TAF聚糖X的抗体组合物。

本披露进一步提供了产生具有目标％ADCC的抗体组合物的方法，其中该方法包括(i)针对目标％ADCC，使用以下方程B计算目标％非岩藻糖基化聚糖和目标％高甘露糖聚糖：

Y＝(0.24+27*HM+22.1*AF)

[方程B]，

其中Y是目标％ADCC，HM是目标％高甘露糖聚糖并且AF是目标％非岩藻糖基化聚糖

以及(ii)在细胞培养物中维持有糖基化能力的细胞以产生具有目标％高甘露糖聚糖和目标％非岩藻糖基化聚糖的抗体组合物。

在当前披露的方法的示例性方面，目标％ADCC在目标％ADCC范围内。任选地，目标％ADCC范围大于或约40并且小于或约170。在各个方面，目标％ADCC范围大于或约44并且小于或约165。在各种情况下，目标％ADCC范围大于或约60且小于或约130。在示例性方面，目标％ADCC范围是Y±20，例如，Y±17或Y±18。

进一步提供了产生具有任选地大于或约40且小于或约170的％ADCC(Y)的抗体组合物的方法，所述方法包括(i)确定抗体组合物的％总非岩藻糖酰化(TAF)聚糖(X)，以及(ii)当X等于(Y-2.6)/24.1时，选择抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。在示例性方面，X大于或约1.55％且小于或约6.95％。在各个方面，Y大于或约44％且小于或约165％，并且任选地，其中X为约1.72％至约6.74％。

本披露提供了产生具有％ADCC(Y)的抗体组合物的方法，所述方法包括(i)确定抗体组合物的％总岩藻糖化(TAF)聚糖(X)，以及(ii)当X等于(Y-2.6)/24.1(任选地，其中X大于或约X-0.4且小于或约X+0.4，并且其中％ADCC大于约Y-17且小于或约Y+17)时，选择抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。还提供了一种产生具有％ADCC的抗体组合物的方法，所述方法包括(i)确定抗体组合物的％非岩藻糖基化聚糖和％高甘露糖聚糖，以及(ii)当根据以下方程B将AF和HM与Y相关时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤

Y＝(0.24+27*HM+22.1*AF)

[方程B]，

其中Y是％ADCC，HM是在步骤(i)中确定的％高甘露糖聚糖，并且AF是在步骤(i)中确定的非岩藻糖基化聚糖。在示例性方面，Y大于或约40且小于或约175，任选地，约41至约171，其中AF为约1至约4并且其中HM为约40至约175。任选地，Y为约30至约185，任选地，约32至约180，其中HM为约1至约4并且其中AF为约30至约185。在示例性情况下，抗体组合物的％ADCC在由Y定义的范围内。任选地，抗体组合物的％ADCC在Y±18的范围内。在示例性方面，AF为约1至约4。任选地，％高甘露糖聚糖是在由HM定义的范围内的值，任选地，其中范围是HM±1。在各种情况下，HM为约1至约4。任选地，％非岩藻糖基化聚糖是由AF定义的范围内的值，任选地，其中该范围是AF±1。

在示例性实施例中，当前披露的产生抗体组合物的方法包括改良由细胞培养物的细胞产生的抗体组合物的总非岩藻糖基化(TAF)聚糖含量。在各种情况下，改良细胞培养的一种或多种条件以改良TAF聚糖含量。在各个方面，该方法包括确定改良的TAF聚糖含量。任选地，重复改良直到确定的TAF聚糖含量在TAF的目标范围内。不受特定理论的束缚，TAF聚糖含量可以通过改良非岩藻糖基化(AF)聚糖含量或高甘露糖(HM)含量或其组合来改良，因为每一个都会影响TAF聚糖含量。因此，这些方法有利地允许多种方式实现TAF聚糖含量的目标范围。例如，改良细胞培养的一种或多种条件以改良AF聚糖含量，以便改良TAF聚糖含量。可替代地，改良细胞培养的一种或多种条件以改良HM聚糖含量，以便改良TAF聚糖含量。在各种情况下，改良细胞培养的一种或多种条件以改良AF聚糖含量和HM聚糖含量，以便改良TAF聚糖含量。因此，本披露进一步提供了改良由细胞培养物的细胞产生的抗体组合物的总非岩藻糖基化(TAF)聚糖含量的方法。在示例性实施例中，该方法包括改良AF聚糖含量。在示例性实施例中，该方法包括改良HM聚糖含量。在各个方面，该方法包括(i)确定抗体组合物的样品的非岩藻糖基化(AF)聚糖含量和高甘露糖(HM)聚糖含量；(ii)基于抗体组合物的抗体的ADCC活性水平的目标范围确定AF聚糖含量的目标范围，假设HM聚糖含量是恒定的；以及(iii)当AF聚糖含量在AF聚糖含量的目标范围内时，选择该抗体组合物进行下游处理。在各种情况下，该方法包括(i)确定抗体组合物的样品的非岩藻糖基化(AF)聚糖含量和高甘露糖(HM)聚糖含量；(ii)基于抗体组合物的抗体的ADCC活性水平的目标范围确定HM聚糖含量的目标范围，假设AF聚糖含量是恒定的；以及(iii)当HM聚糖含量在AF聚糖含量的目标范围内时，选择该抗体组合物进行下游处理。在各种情况下，该方法包括(i)确定该抗体组合物的样品的AF聚糖含量和HM聚糖含量和(ii)基于在(i)中确定的HM聚糖含量确定AF聚糖含量的目标范围，以及(iii)改良AF聚糖含量直到它在AF聚糖含量的目标范围内，其中未改良HM聚糖含量。可替代地，该方法包括(i)确定该抗体组合物的样品的AF聚糖含量和HM聚糖含量和(ii)基于在(i)中确定的AF聚糖含量确定HM聚糖含量的目标范围，以及(iii)改良HM聚糖含量直到它在HM聚糖含量的目标范围内，其中未改良AF聚糖含量。在示例性方面，将抗体组合物的ADCC活性水平与抗体组合物的TAF聚糖含量相关联的模型预测了与由将ADCC与HM和AF聚糖含量相关联的模型预测的基本上相同的ADCC活性水平。

在当前披露的方法的各个方面，通过计算％高甘露糖聚糖和％非岩藻糖基化聚糖的总和来确定％TAF聚糖。在各种情况下，通过亲水相互作用层析确定％高甘露糖聚糖和％非岩藻糖基化聚糖。任选地，通过实例1中描述的方法确定％高甘露糖聚糖和％非岩藻糖基化聚糖。在各个方面，通过基于细胞的定量测定确定％ADCC，该测定测量抗体组合物的抗体在表达这些抗体的抗原并通过抗体的Fc结构域与效应细胞上的Fc-γRIIIA受体衔接的细胞中以剂量依赖性方式介导细胞的细胞毒性的能力。在各种情况下，通过实例2中描述的测定确定％ADCC。在示例性方面，确定步骤在收获步骤之后进行。任选地，确定步骤在层析步骤之后进行。在各个方面，层析步骤是蛋白A层析步骤。在当前披露的方法的各种情况下，一个或多个下游处理步骤包括：稀释步骤、填充步骤、过滤步骤、配制步骤、层析步骤、病毒过滤步骤、病毒灭活步骤或其组合。任选地，层析步骤是离子交换层析步骤，任选地，阳离子交换层析步骤或阴离子交换层析步骤。

在本披露的各个方面，抗体组合物的每种抗体是IgG，任选地，抗体组合物的每种抗体是IgG₁。在示例性情况下，抗体组合物的每种抗体结合肿瘤相关抗原。在示例性方面，肿瘤相关抗原包含SEQ ID NO.3的氨基酸序列。在示例性方面，抗体组合物的每种抗体是抗CD20抗体。在各种情况下，抗体组合物的每种抗体包含：(i)轻链(LC)CDR1，该LC CDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:4至少90％相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:4的变体氨基酸序列，(ii)LC CDR2，该LC CDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:5至少90％相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:5的变体氨基酸序列，(iii)LC CDR3，该LC CDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:6至少90％相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:6的变体氨基酸序列，(iv)重链(HC)CDR1，该HC CDR1包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:7至少90％相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:7的变体氨基酸序列；(v)HC CDR2，该HC CDR2包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:8至少90％相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:8的变体氨基酸序列；和/或(vi)HC CDR3，该HC CDR3包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:9至少90％相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:9的变体氨基酸序列。

在示例性方面，抗体组合物的每种抗体包含LC可变区，该LC可变区包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列、与SEQ ID NO:10至少90％相同的氨基酸序列、或具有1至10个氨基酸取代的SEQ ID NO:10的变体氨基酸序列。任选地，抗体组合物的每种抗体包含HC可变区，该HC可变区包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列、与SEQ ID NO:11至少90％相同的氨基酸序列、或具有1至10个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的变体氨基酸序列。在示例性方面，抗体组合物的每种抗体包含轻链，该轻链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列、与SEQ ID NO:12至少90％相同的氨基酸序列、或具有1至10个氨基酸取代的SEQ ID NO:12的变体氨基酸序列。在示例性情况下，抗体组合物的每种抗体包含重链，该重链包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列、与SEQ ID NO:13至少90％相同的氨基酸序列、或具有1或10个氨基酸取代的SEQ ID NO:13的变体氨基酸序列。

在示例性方面，肿瘤相关抗原包含SEQ ID NO.14的氨基酸序列。在示例性方面，抗体组合物的每种抗体是抗TNFa抗体，任选地，英利昔单抗或其生物类似物。在示例性方面，抗体组合物的每种抗体包含LC可变区，该LC可变区包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列、与SEQID NO:15至少90％相同的氨基酸序列、或具有1至10个氨基酸取代的SEQ ID NO:15的变体氨基酸序列。任选地，抗体组合物的每种抗体包含HC可变区，该HC可变区包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列、与SEQ ID NO:16至少90％相同的氨基酸序列、或具有1至10个氨基酸取代的SEQ ID NO:16的变体氨基酸序列。

本披露进一步提供了产生在目标％ADCC范围内的抗体组合物的方法，所述方法包括：(i)测量包含抗体的不同糖型的一系列样品的％ADCC，(ii)确定该系列的每个样品的％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖，(iii)确定下图的最佳拟合线的线性方程，该图为该系列的每个样品绘制作为如在步骤(ii)中确定的％TAF聚糖的函数的如在步骤(i)中测量的％ADCC，(iv)确定抗体组合物的％TAF，并且然后使用步骤(iii)的线性方程计算％ADCC，以及(v)当在步骤(iv)中计算的％ADCC在目标％ADCC范围内时，选择抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

提供了一种产生在TAF聚糖含量目标范围内的抗体组合物的方法，其中所述方法包括：(i)测量包含抗体的不同糖型的一系列样品的ADCC活性水平，(ii)确定该系列的每个样品的TAF聚糖含量，(iii)创建将ADCC活性水平与TAF聚糖含量相关联的模型，(iv)确定抗体组合物的ADCC活性水平，并且然后使用该模型计算TAF聚糖含量，或者使用该模型确定该抗体组合物的TAF聚糖含量并且计算ADCC活性水平，以及(v)当在步骤(iv)中计算的TAF聚糖含量在TAF聚糖含量的目标范围内或当在步骤(iv)中计算的ADCC活性水平在ADCC活性水平的目标范围内时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

提供了一种产生在目标％TAF范围内的抗体组合物的方法，其中所述方法包括：(i)测量包含抗体的不同糖型的一系列样品的％ADCC，(ii)确定该系列的每个样品的％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖，(iii)确定下图的最佳拟合线的线性方程，该图为该系列的每个样品绘制作为如在步骤(ii)中确定的％TAF聚糖的函数的如在步骤(i)中测量的％ADCC，(iv)确定下图的最佳拟合线的线性方程，该图为该系列的每个样品绘制作为如在步骤(ii)中确定的％TAF聚糖的函数的如在步骤(i)中测量的％ADCC，(v)确定抗体组合物的％ADCC，并且然后使用步骤(iii)的线性方程计算％TAF，以及(iv)当在步骤(iv)中计算的％TAF在目标％TAF范围内时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。还提供了一种产生在目标％TAF范围内的抗体组合物的方法，其中该方法包括以下步骤：(i)通过绘制在细胞培养条件下产生的一系列至少5种参考抗体组合物的％ADCC和％TAF聚糖生成最佳拟合图的线性方程，每种参考抗体组合物具有与抗体组合物相同的氨基酸序列，(ii)基于步骤(i)中生成的线性方程和所需的％ADCC活性选择目标％TAF聚糖范围；(iii)在细胞培养条件下培养抗体组合物；(iv)纯化抗体组合物，(v)取样抗体组合物以确定抗体组合物的％TAF以及(vi)确定抗体组合物的％TAF是否在步骤(ii)的目标％TAF范围内。在示例性方面，该方法进一步包括当在步骤(v)中计算的％TAF在目标％TAF范围内时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

还提供了一种确定抗体组合物的％抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的方法，所述方法包括：(i)确定抗体组合物的％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖；以及(ii)使用以下方程A基于％TAF计算抗体组合物的％ADCC

Y＝2.6+24.1*X

[方程A]，

其中Y是％ADCC并且X是在步骤(i)中确定的％TAF聚糖，

此外，提供了确定抗体组合物的％抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的方法，所述方法包括(i)确定抗体组合物的％高甘露糖聚糖和％非岩藻糖基化聚糖，以及(ii)使用以下方程B基于％高甘露糖聚糖和％非岩藻糖基化聚糖计算抗体组合物的％ADCC：

Y＝(0.24+27*HM+22.1*AF)

[方程B]，

其中Y是％ADCC，HM是在步骤(i)中确定的％高甘露糖聚糖，并且AF是在步骤(i)中确定的％非岩藻糖基化聚糖。

在示例性情况下，这些方法进一步包括当Y在目标％ADCC范围内时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

附图说明

图1A是三种类型的N-聚糖(寡甘露糖、复合物和杂合体)和此类糖的常用符号的说明。图1B是示例性聚糖结构的图示。

图2A是代表性聚糖谱层析图(全比例视图)。图2B是代表性聚糖谱层析图(放大比例视图)。

图3是实例2中描述的NK92 ADCC测定的示意图。

图4是NK92 ADCC测定的代表性剂量反应曲线。每个剂量点是3次重复的均值±标准偏差。检测信号＝荧光

图5A是绘制为TAF(％)的函数的实际ADCC(％)的图。显示最佳拟合线。图5B是图5A的最佳拟合线的统计参数表。图5C是绘制为使用图5B中所示的预测表达方程计算的预测ADCC(％)的函数的实际ADCC(％)(如通过实例2中描述的测定确定)的图。图5D是显示了95％置信带(灰色阴影)的图5A的图。图5E提供了方程1的y截距和斜率的95％置信区的图。

图6A是绘制为HM(％)的函数的实际ADCC(％)的图。显示最佳拟合线。图6B是绘制为AF(％)的函数的实际ADCC(％)的图。显示最佳拟合线。图6C是图6A和6B所示的一个或多个最佳拟合线的统计参数表。图6D是绘制为使用图4C中所示的预测表达方程计算的预测ADCC(％)的函数的实际ADCC(％)(如通过实例2中描述的测定确定)的图。

图7A是绘制为半乳糖基化(％)的函数的实际ADCC(％)的图。最佳拟合线显示为红色。图7B是绘制为使用将ADCC和半乳糖基化相关联的预测表达方程计算的预测ADCC(％)的函数的实际ADCC(％)(如通过实例2中描述的测定确定)的图(未显示)。

图8A是绘制为TAF(％)的函数的实际ADCC(％)的图。显示最佳拟合线。图8B是图8A的最佳拟合线的统计参数表。图8C是绘制为使用图8B中所示的预测表达方程计算的预测ADCC(％)的函数的实际ADCC(％)(如通过实例2中描述的测定确定)的图。图8D是显示了95％置信带(灰色阴影)的图8A的图。图8E提供了方程3的y截距和斜率的95％置信区的图。

图9A是绘制为HM(％)的函数的实际ADCC(％)的图。显示最佳拟合线。图9B是绘制为AF(％)的函数的实际ADCC(％)的图。显示最佳拟合线。图9C是图9A和9B所示的一个或多个最佳拟合线的统计参数表。图9D是绘制为使用图9C中所示的预测表达方程计算的预测ADCC(％)的函数的实际ADCC(％)(如通过实例2中描述的测定确定)的图。

图10A和图10B是将ADCC-HM/AF模型的无y截距预测与抗CD20抗体(图10A)和抗TNFα抗体(图10B)的ADCC-TAF模型的无y截距预测相关联的图。

具体实施方式

本文首次提供了展示抗体组合物的ADCC水平与该抗体组合物的TAF聚糖水平之间的统计学显著关联的数据。本文还首次提供了展示抗体组合物的ADCC水平与该抗体组合物的高甘露糖聚糖和非岩藻糖基化聚糖水平之间的统计学显著关联的数据。如本文进一步描述的，方程A和方程B将抗体组合物的％ADCC与％TAF聚糖(方程A)或抗体组合物的％高甘露糖聚糖和％非岩藻糖基化聚糖(方程B)关联。本披露的这些关联和方程以及其他在用于基于聚糖水平预测抗体组合物的ADCC水平的方法中是有用的。在各个方面，预测的ADCC水平用作标记物，通过该标记物，抗体组合物被鉴定为在满足治疗阈值方面是可接受的并且因此应该用于一个或多个下游制造工艺步骤，或可替代地，抗体组合物被鉴定为不可接受的并且不应在制造工艺中继续使用。当前披露的关联和方程可进一步用于鉴定所需抗体组合物的糖谱。利用本文呈现的关联和方程，并且给定目标ADCC水平，鉴定具有目标ADCC水平的抗体组合物的糖谱(例如，TAF聚糖、HM聚糖、非岩藻糖基化聚糖的谱)。利用具有目标ADCC水平的抗体组合物的TAF聚糖、HM聚糖、非岩藻糖基化聚糖的鉴定谱，可以进行制造工艺(例如，细胞培养步骤)以靶向该鉴定谱。

因此，本披露提供了确定抗体组合物的产品质量的方法，其中抗体组合物的至少一个可接受标准是ADCC活性水平。还提供了监测抗体组合物的产品质量的方法。本披露进一步提供了产生抗体组合物的方法，例如，本文提供了产生具有目标％ADCC的抗体组合物的方法，产生具有在目标％ADCC范围内的％ADCC或具有确定的％ADCC的抗体组合物的方法，和产生在目标％TAF范围内的抗体组合物的方法。

糖基化、聚糖和聚糖测量方法

许多分泌的蛋白经历翻译后糖基化，即糖部分(例如，聚糖、糖)共价附接到蛋白质的特定氨基酸的过程。在真核细胞中，发生两种类型的糖基化反应：(1)N-连接糖基化，其中聚糖附接到识别序列Asn-X-Thr/Ser的天冬酰胺，其中“X”是除脯氨酸外的任何氨基酸；以及(2)O-连接糖基化，其中聚糖附接到丝氨酸或苏氨酸。不管糖基化类型如何(N-连接还是O-连接)，由于与每个位点(O或N)相关的大范围的聚糖结构，存在蛋白质糖型的微不均一性。

所有N-聚糖均具有共同的核心糖序列：Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-Asn-X-Ser/Thr(Man₃GlcNAc₂Asn)，并且被归类为以下三种类型之一：(A)高甘露糖(HM)或寡甘露糖(OM)类型，其由两个N-乙酰葡糖胺(GalNAc)部分和大量(例如，5、6、7、8或9个)甘露糖(Man)残基组成；(B)复合类型，其包含超过两个GlcNAc部分和任何数量的其他糖类型；或(C)杂合类型，其在分支的一侧包含Man残基而在复合分支的基部包含GlcNAc。图1A(取自Stanley等人,第8章:N-Glycans[N-聚糖],Essentials of Glycobiology[糖生物学要点],第2版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；2009)显示了三种类型的N-聚糖。

N-连接聚糖通常包含半乳糖(Gal)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖胺(GalN)、葡萄糖(GLc)、N-乙酰葡糖胺(ClcNAc)、葡糖胺(GlcN)、甘露糖(Man)、N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)、甘露糖胺(ManN)、木糖(Xyl)、N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙醇酰神经氨酸(Neu5Gc)、2-酮基-3-脱氧壬酮酸(2-keto-3-doxynononic acid，Kdn)、岩藻糖(Fuc)、葡糖醛酸(GLcA)、艾杜糖醛酸(IdoA)、半乳糖醛酸(Gal A)、甘露糖醛酸(Man A)中的一种或多种单糖。此类糖的常用符号示于图1A中。示例性聚糖及其身份示于图1B中。

N连接的糖基化开始于内质网(endoplasmic reticulum，ER)中，其中一组复杂反应引起基本上由两个GlcNAc残基和三个Man残基形成的核心聚糖结构的附接。在ER中形成的聚糖复合物在高尔基器中在酶作用下修饰。若酶相对难以接近该糖，则其通常保持初始HM形式。若酶可接近该糖，则许多Man残基裂解且进一步修饰该糖，产生复合型N聚糖结构。例如，位于顺面高尔基体中的甘露糖苷酶-1可裂解或水解HM聚糖，而位于中间高尔基体中的岩藻糖基转移酶FUT-8将聚糖岩藻糖基化(Hanrue Imai-Nishiya(2007),BMCBiotechnology[BMC生物技术],7:84)。

因此，聚糖结构的糖组成和结构构型根据ER和高尔基器中的糖基化机器、机械酶对聚糖结构的可及性、每种酶的作用顺序和蛋白质从糖基化机器中释放所处的阶段以及其他因素而不同。

本领域已知多种用于评估存在于含有糖蛋白的组合物中的聚糖或用于确定、检测或测量包含糖蛋白的特定样品的糖型谱(例如，糖谱)的方法。合适的方法包括但不限于阳离子MALDI-TOF分析、阴离子MALDI-TOF分析、弱阴离子交换(WAX)层析、正相层析(NP-HPLC)、外切糖苷酶消化、Bio-Gel P-4层析、阴离子交换层析和一维核磁共振光谱及其组合。参见例如，Mattu等人,JBC 273:2260-2272(1998)；Field等人,Biochem J[生物化学杂志]299(第1部分):261-275(1994)；Yoo等人,MAbs 2(3):320-334(2010)；Wuhrer M.等人,Journal of Chromatography B[层析杂志B辑],2005,第825卷,第2期,第124-133页；Ruhaak L.R.,Anal Bioanal Chem[分析与生物分析化学],2010,第397卷:3457-3481以及Geoffrey,R.G.等人Analytical Biochemistry[分析生物化学]1996,第240卷,第210-226页。此外，本文所述的实例1描述了用于评估存在于含有糖蛋白的组合物(例如，抗体组合物)中的聚糖的适合方法。实例1的方法描述了一种测定，其中附接到组合物的糖基化蛋白(例如，抗体组合物的抗体)的聚糖是从该蛋白质(例如，抗体)酶促切割的。随后通过亲水相互作用液相层析(HILIC)分离聚糖，并产生具有若干个峰的层析图。层析图的每个峰代表不同聚糖的均值分布(量)。图2A和2B提供了包含不同聚糖峰的代表性HILIC层析图的两个视图。出于这些目的，％峰面积＝峰面积/总峰面积x 100％，并且％总峰面积＝样品总面积/标准品总面积x 100％。因此，特定聚糖(或聚糖基团)的水平以％报告。例如，如果抗体组合物被表征为具有30％的Man6水平，则意味着从该组合物的抗体切割的所有聚糖中有30％是Man6。

本披露(包括本文呈现的关联和方程)涉及抗体组合物的总非岩藻糖基化聚糖、高甘露糖聚糖和非岩藻糖基化聚糖。如本文所用，“总非岩藻糖基化聚糖”或“TAF聚糖”是指高甘露糖(HM)聚糖和非岩藻糖基化聚糖的总量。如本文所用，术语“高甘露糖聚糖”或“HM聚糖”包括包含5、6、7、8或9个甘露糖残基的糖型，分别缩写为Man5、Man6、Man7、Man8和Man9。在各个方面，HM聚糖水平是通过将％Man5、％Man6、％Man7、％Man8和％Man9相加而获得的。如本文所用，术语“非岩藻糖基化聚糖”或“AF聚糖”是指在参与与N-糖基化位点的Asn的酰胺键的GlcNAc残基上缺乏核心岩藻糖(例如，α1,6-连接的岩藻糖)的聚糖。非岩藻糖基化聚糖包括但不限于A1G0、A2G0、A2G1a、A2G1b、A2G2和A1G1M5。其他非岩藻糖基化聚糖包括例如A1G1a、G0[H3N4]、G0[H4N4]、G0[H5N4]、FO-N[H3N3]。参见例如，Reusch和Tejada,Glycobiology[糖生物学]25(12):1325-1334(2015)。在各个方面，非岩藻糖基化聚糖水平是通过将％A1G0、％A2G0、％A2G1a、％A2G1b、％A2G2、％A1G1M5、％A1G1a、％G0[H3N4]、％G0[H4N4]、％G0[H5N4]和％FO-N[H3N3]相加而获得的。

在示例性方面，通过本领域已知的用于评估存在于含糖蛋白的组合物中的聚糖或用于确定、检测或测量包含糖蛋白的特定样品的糖型谱(例如，糖谱)的各种方法中的任一种来确定(例如，测量)聚糖水平(例如，聚糖含量，任选地，表示为％，例如％TAF聚糖、％HM聚糖、％AF聚糖)。在示例性实例中，如本文所述，通过基于层析的方法(例如，HILIC)测量抗体组合物的样品中此类聚糖的水平来确定抗体组合物的聚糖水平(例如，％TAF聚糖、％HM聚糖、％AF聚糖)，并且聚糖水平以％表示。参见，例如，实例1。在示例性情况下，抗体组合物的聚糖水平表示为从组合物的抗体切割的所有聚糖的％。在各个方面，通过计算％高甘露糖聚糖和％非岩藻糖基化聚糖的总和来确定％TAF聚糖，通过亲水相互作用层析(例如，实例1中描述的方法)确定％高甘露糖聚糖和％非岩藻糖基化聚糖。在各个方面，通过测量抗体组合物的样品中此类聚糖的水平来确定(例如，测量)聚糖的水平(例如，％TAF聚糖、％HM聚糖、％AF聚糖)。在示例性情况下，采集至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个抗体组合物的样品并且确定(例如，测量)每个样品的聚糖的水平(例如，％TAF聚糖、％HM聚糖、％AF聚糖)。在各个方面，确定％TAF聚糖、％HM聚糖和/或％AF聚糖的均值或平均值。

在示例性方面，如本文进一步描述的，使用方程A或方程B计算聚糖的水平(例如，％TAF聚糖、％HM聚糖、％AF聚糖)。

ADCC

本披露(包括本文呈现的关联和方程)将抗体组合物的％总非岩藻糖基化聚糖或％高甘露糖聚糖和％非岩藻糖基化聚糖与抗体组合物的ADCC活性水平(例如，％ADCC)关联。

术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“抗体依赖性细胞的细胞毒性”是指免疫系统的效应细胞(例如，自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、中性粒细胞，嗜酸性粒细胞)主动裂解靶细胞(其膜表面抗原已被特异性抗体结合)的机制。ADCC是适应性免疫反应的一部分，当抗原特异性抗体(1)通过其抗原结合区结合靶细胞上的膜表面抗原以及(2)通过其Fc区结合效应细胞表面上的Fc受体时发生。抗体的Fc区与Fc受体的结合导致效应细胞释放导致靶细胞死亡(例如，通过细胞裂解或细胞脱粒)的细胞毒性因子。

Fc受体是B淋巴细胞、滤泡树突细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、血小板和肥大细胞表面上的结合抗体的Fc区的受体。Fc受体根据它们结合的抗体类型分为不同的类别。例如，Fc-γ受体是IgG抗体Fc区的受体，Fc-α受体是IgA抗体Fc区的受体，并且Fc-ε受体是IgE抗体Fc区的受体。

术语“FcγR”或“Fcγ受体”是属于参与诱导受调理细胞或微生物的吞噬的IgG超家族的蛋白。参见，例如，Fridman WH.Fc receptors and immunoglobulin bindingfactors[Fc受体和免疫球蛋白结合因子].FASEB杂志.5(12):2684-90(1991)。Fcγ受体家族的成员包括：FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和FcγRIIIB的序列可以在许多序列数据库中找到，例如在Uniprot数据库(www.uniprot.org)分别于登录号P12314(FCGR1_人)、P12318(FCG2A_人)、P31994(FCG2B_人)、P08637(FCG3A_人)和P08637(FCG3A_人)下找到。

术语“ADCC活性”或“ADCC水平”或“ADCC活性水平”是指ADCC被激活或刺激的程度。测量或确定抗体组合物的ADCC水平的方法，包括用于测量或确定ADCC水平的可商购测定和试剂盒，是本领域众所周知的，如以下所述：Yamashita等人,Scientific Reports[科学报告]6:文章编号19772(2016),doi:10.1038/srep19772；Kantakamalakul等人,“A novelEGFP-CEM-NKr flow cytometric method for measuring antibody dependent cellmediated-cytotoxicity(ADCC)activity in HIV-1infected individuals[用于测量HIV-1感染个体中抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性的新的EGFP-CEM-NKr流式细胞术方法]”,J Immunol Methods[免疫学方法杂志]315(第1-2期):1-10；(2006)；Gomez-Roman等人,“A simplified method for the rapid fluorometric assessment of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity[快速荧光评估抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的简化方法]”,J Immunol Methods[免疫学方法杂志]308(第1-2期):53-67(2006)；Schnueriger等人,:Development of a quantitative,cell-line based assay tomeasure ADCC activity mediated by therapeutic antibodies[开发定量的用以测量治疗性抗体介导的ADCC活性的基于细胞系的测定]”,Molec Immunology[分子免疫学]38(第12-13期):1512-1517(2011)；以及Mata等人,“Effects of cryopreservation oneffector cells for antibody dependent cell-mediated cytotoxicity(ADCC)andnatural killer(NK)cell activity in ⁵¹Cr-release and CD107a assays[在⁵¹Cr-释放和CD107a测定中低温保存对抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和自然杀伤(NK)细胞活性的效应细胞的影响]”,J Immunol Methods[免疫学方法杂志]406:1-9(2014)；出于所有目的，所有这些均通过引用并入本文。术语“ADCC测定”或“FcγR报告基因测定”是指可用于确定抗体的ADCC活性的测定、试剂盒或方法。在本文所述的方法中测量或确定抗体的ADCC活性的示例性方法包括实例2中描述的ADCC测定或可从普洛麦格(Promega)商购的ADCC报告基因测定(目录号G7010和G7018)。在一些实施例中，ADCC活性是使用包括以下一项或多项的钙黄绿素释放测定测量或确定的：表达FcγRIIa(158V)的NK92(M1)细胞作为效应细胞，HCC2218细胞或WIL2-S细胞作为用钙黄绿素-AM标记的靶细胞。

在示例性方面，通过基于细胞的定量测定确定抗体组合物的ADCC水平，该测定测量抗体组合物的抗体在表达抗体抗原并通过抗体的Fc结构域与效应细胞上的Fc-γRIIIA受体衔接的细胞中以剂量依赖性方式介导细胞的细胞毒性的能力。在各种实施例中，该方法包括使用带有可检测标记的靶细胞，当靶细胞被效应细胞裂解时，这些可检测标记被释放。从靶细胞释放的可检测标记的量是抗体组合物的ADCC活性的量度。在一些方面，将从靶细胞释放的可检测标记的量与基线进行比较。此外，ADCC水平可以报告为相对于对照％ADCC的％ADCC。在各个方面，％ADCC是相对％ADCC，其任选地是相对于对照％ADCC。在各个方面，对照％ADCC是参考抗体的％ADCC。在各个方面，参考抗体是利妥昔单抗。在示例性情况下，对照％ADCC在约60％至约130％的范围内。任选地，通过实例2中描述的测定确定％ADCC。

本披露将抗体组合物的TAF聚糖含量、HM聚糖含量、和/或AF聚糖含量与抗体组合物的ADCC活性水平相关联。如本文所展示的，抗体组合物的％TAF聚糖、％HM聚糖、和/或％AF聚糖与抗体组合物的％ADCC活性相关。在各个方面，基于将TAF聚糖含量与ADCC活性水平相关联的第一模型，(a)基于TAF聚糖含量(例如，测量TAF聚糖含量)计算ADCC活性水平或(b)基于ADCC活性水平(例如，测量ADCC活性水平)计算TAF聚糖含量。在各种情况下，目标ADCC活性水平或ADCC活性水平的目标范围是已知的，给定正产生的抗体组合物的特定抗体。例如，抗体可以是参考抗体的生物类似物，并且参考抗体的目标ADCC活性水平或其范围是已知的。在示例性方面，可以基于第一模型计算目标TAF聚糖含量或TAF聚糖含量的目标范围。在各种情况下，第一模型是线性回归模型。在各种情况下，第一模型是没有y截距的线性回归模型的简化版本。在各个方面，将ADCC与TAF聚糖含量相关联的第一模型具有统计学显著性，如其低p值所展示的。在各个方面，p值小于0.0001。

在示例性方面，对于抗体组合物中存在的每1％TAF聚糖含量，第一模型将抗体组合物的ADCC活性水平关联为约13.5％±0.5％，任选地，其中抗体组合物的抗体结合仅包含一个抗体结合位点的抗原。在各个方面，对于抗体组合物中存在的每1％TAF聚糖含量，第一模型将抗体组合物的ADCC活性水平关联为约24.74％±0.625％，任选地，其中抗体组合物的抗体结合仅包含两个抗体结合位点的抗原。在示例性方面，对于抗体组合物中存在的每1％TAF聚糖含量，第一模型将抗体组合物的ADCC活性水平关联为约12％±1.5％*Q，其中Q是抗原上存在的抗体结合位点的数量。在示例性情况下，Q是1并且任选地抗体是英利昔单抗或其生物类似物。任选地，Q是2并且任选地抗体是利妥昔单抗或其生物类似物。

在各个方面，ADCC活性水平的目标范围是已知的、预先选择的或预先确定的，并且第一模型允许基于ADCC活性水平的该目标范围计算TAF聚糖含量的目标范围。在示例性情况下，TAF聚糖含量的目标范围是m至n，其中m是[ADCC_min/12Q]，其中ADCC_min是参考抗体的ADCC活性水平的目标范围的最小值，并且n是[ADCC_max]/12Q]，其中ADCC_max是参考抗体的ADCC活性水平的目标范围的最大值。在各种情况下，Q为2。在各种情况下，由第一模型预测的ADCC活性水平为约24*％TAF。在各种情况下，TAF聚糖含量的目标范围是m至n，其中m是[ADCC_min/24]，并且n是[ADCC_max]/24]。在各种情况下，Q为1。在各个方面，由第一模型预测的ADCC活性水平为约12*％TAF。在各种情况下，TAF聚糖含量的目标范围是m至n，其中m是[ADCC_min/12]，并且n是[ADCC_max]/12]。在各个方面，TAF聚糖含量的目标范围为m°至n°，其中m°为[[ADCC_min-y]/x]，其中ADCC_min为ADCC活性水平的目标范围的最小值，并且n°为[[ADCC_max-y]/x]，其中ADCC_max为ADCC活性水平的目标范围的最大值。任选地，x为约20.4至约27.7并且y为约-11.4至约16.7。可替代地，x为约9.7至约15.2并且y为约-15.6至约34.2。在各个方面，TAF聚糖含量的目标范围是m’至n’，其中m’是[ADCC_min/x’]，其中ADCC_min是ADCC活性水平的目标范围的最小值，并且n’是[ADCC_max]/x’]，其中ADCC_max是ADCC活性水平的目标范围的最大值。任选地，x’为约24.1至约25.4。可替代地，x’为约13.0至约13.95。在各种情况下，对于抗体组合物中存在的每1％TAF，抗体组合物的ADCC活性水平为约13.5％±0.5％，任选地，其中抗体组合物的抗体结合仅包含一个抗体结合位点的抗原。在各个方面，对于抗体组合物中存在的每1％TAF，抗体组合物的ADCC活性水平为约24.74％±0.625％，任选地，其中抗体组合物的抗体结合仅包含两个抗体结合位点的抗原。在示例性方面，对于抗体组合物中存在的每1％TAF，抗体组合物的ADCC活性水平为约12％±1.5％*Q，Q是抗原上存在的抗体结合位点的数量。在示例性情况下，参考抗体是英利昔单抗。在示例性方面，参考抗体是利妥昔单抗。

可以使用将％TAF聚糖、％HM聚糖和/或％AF聚糖与给定抗体组合物的％ADCC活性相关的方程计算ADCC活性或％ADCC。在各个方面，该方程将％TAF聚糖与％ADCC相关。在示例性方面，该方程是方程A：

Y＝2.6+24.1*X

[方程A]，

其中Y是％ADCC并且X是％TAF聚糖。

在各种情况下，该方程将抗体组合物的％HM聚糖和％AF聚糖与％ADCC相关。在示例性方面，该方程是方程B：

Y＝(0.24+27*HM+22.1*AF)

[方程B]，

其中Y是％ADCC，HM是％高甘露糖聚糖，并且AF是％非岩藻糖基化聚糖。

在示例性方面，该方法包括确定(例如，测量)％TAF聚糖，并且通过使用确定的(例如，测量的)％TAF聚糖，可以使用方程A计算％ADCC。因此，在示例性情况下，该方法包括基于使用方程A确定的(例如，测量的)％TAF聚糖计算抗体组合物的％ADCC。在各个方面，以这种方式计算的抗体组合物的％ADCC对于不需要通过实验确定(例如，测量％ADCC)是有用的。

在示例性方面，该方法包括确定(例如，测量)％HM聚糖和％AF聚糖，并且通过使用确定的(例如，测量的)％HM聚糖和％AF聚糖，可以使用方程B计算％ADCC。因此，在示例性情况下，该方法包括基于使用方程B确定的(例如，测量的)％HM聚糖和％AF聚糖计算抗体组合物的％ADCC。在各个方面，以这种方式计算的抗体组合物的％ADCC对于不需要通过实验确定(例如，测量％ADCC)是有用的。

在各个方面，可以重新表示将％ADCC与％TAF聚糖、％HM聚糖和/或％AF聚糖相关的当前披露的方程，使得例如，可以使用该方程确定％TAF聚糖。例如，方程A可以重新表示如下：

X＝(Y-2.6)/24.1

其中Y是％ADCC并且X是％TAF聚糖。

可替代地，方程B可以重新表示如下：

(Y-0.24)＝27*HM+22.1*AF；或

[(Y-0.24)-22.1*AF]/27＝HM；或

[(Y-0.24)–27*HM]/22.1＝AF，

其中Y是％ADCC，HM是％高甘露糖聚糖，并且AF是％非岩藻糖基化聚糖。

在示例性情况下，确定(例如，测量)％ADCC，并且通过在重新表示方程A时使用确定的％ADCC，可以计算与确定的％ADCC相关的％TAF。使用方程A和确定的％ADCC计算的％TAF可用于鉴定目标％TAF以实现特定％ADCC。此外，在示例性方面，确定(例如，测量)％ADCC，并且通过在重新表示方程B时使用确定的％ADCC，可以计算％HM聚糖或％AF聚糖。

在各个方面，％ADCC是目标％ADCC，并且该方法使用目标ADCC水平确定目标％TAF聚糖。在各个方面，该方法包括在细胞培养物中维持有糖基化能力的细胞以产生具有目标％TAF水平的抗体组合物，如使用方程A所计算的。一旦抗体组合物实现目标％TAF水平，该方法可以包括用抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。在各个方面，该方法任选地包括确认抗体组合物的实际％TAF。

在各个方面，这些方法包括当使用以方程A确定的％TAF聚糖或以方程B确定的％HM聚糖和％AF聚糖计算的Y在目标ADCC范围内时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

确定和/或监测产品质量的方法

基于这些关联，可以确定和/或监测抗体组合物的产品质量。因此，本披露提供了确定抗体组合物的产品质量的方法，其中该抗体组合物的ADCC活性水平是抗体组合物的产品质量所基于的标准。在示例性实施例中，该方法包括(i)确定抗体组合物的样品的总非岩藻糖基化(TAF)聚糖含量；以及(ii)当在(i)中确定的TAF聚糖含量在目标范围内时，确定产品质量为可接受和/或实现ADCC活性水平标准。在示例性方面，TAF聚糖含量的目标范围基于(1)参考抗体的ADCC活性水平的目标范围和(2)将抗体组合物的ADCC活性水平与抗体组合物的TAF聚糖含量相关联的第一模型。在示例性方面，由第一模型预测的ADCC为由第二模型预测的ADCC的约95％至约105％，其中第二模型将抗体组合物的ADCC活性水平与抗体组合物的HM聚糖含量和抗体组合物的AF聚糖含量相关联。

有利地，由第一模型预测的ADCC在统计上显著类似于由第二模型预测的ADCC。例如，由第一模型预测的ADCC活性水平为由第二模型预测的ADCC活性水平的约95％至约105％。任选地，由第一模型预测的ADCC活性水平为由第二模型预测的ADCC活性水平的约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％、约101％、约102％、约103％、约104％、或约105％。在各种情况下，由第一模型预测的ADCC活性水平为由第二模型预测的ADCC的约100％。在某些方面，由第一模型预测的ADCC与由第二模型预测的ADCC之间存在一一对应关系。在各种情况下，第一模型和/或第二模型在统计上是显著的。例如，第一模型的p值小于0.0001和/或第二模型的p值小于0.0001。任选地，第一模型和第二模型中的每一个都具有小于0.0001的p值。

在示例性方面，由第一模型预测的ADCC活性水平为约12Q*％TAF，其中Q为抗体结合的抗原上的抗体结合位点的数量，并且％TAF是抗体组合物的TAF聚糖含量。在示例性情况下，TAF聚糖含量的目标范围是m至n，其中m是[ADCC_min/12Q]，其中ADCC_min是参考抗体的ADCC活性水平的目标范围的最小值，并且n是[ADCC_max]/12Q]，其中ADCC_max是参考抗体的ADCC活性水平的目标范围的最大值。在各种情况下，Q为2。在各种情况下，由第一模型预测的ADCC活性水平为约24*％TAF。在各种情况下，TAF聚糖含量的目标范围是m至n，其中m是[ADCC_min/24]，并且n是[ADCC_max]/24]。在各种情况下，由第二模型预测的ADCC活性水平为约27*％HM+约22*％AF，其中％AF是抗体组合物的AF聚糖含量，并且％HM是抗体组合物的HM聚糖含量。在各种情况下，Q为1。在各个方面，由第一模型预测的ADCC活性水平为约12*％TAF。在各种情况下，TAF聚糖含量的目标范围是m至n，其中m是[ADCC_min/12]，并且n是[ADCC_max]/12]。在各种情况下，由第二模型预测的ADCC活性水平为约14.8*％HM+约12.8*％AF。本文描述了适合的可替代第一模型和第二模型。在示例性情况下，第一模型是本文描述的将ADCC与TAF聚糖含量相关联的模型(例如，方程)中的任何一个，包括但不限于方程1、3、5和7以及方程A。在示例性情况下，第二模型是本文所述的将ADCC和HM聚糖含量与AF聚糖含量相关联的模型(例如，方程)中的任何一个，包括但不限于方程2、4、6和8以及方程B。例如，在各个方面，TAF聚糖含量的目标范围是m°至n°，其中m°定义为[[ADCC_min-y]/x]，其中ADCC_min是ADCC活性水平的目标范围的最小值,并且n°定义为[[ADCC_max-y]/x]，其中ADCC_max是ADCC活性水平的目标范围的最大值。任选地，x为约20.4至约27.7并且y为约-11.4至约16.7。可替代地，x为约9.7至约15.2并且y为约-15.6至约34.2。在各个方面，TAF聚糖含量的目标范围是m’至n’，其中m’是[ADCC_min/x’]，其中ADCC_min是ADCC活性水平的目标范围的最小值，并且n’是[ADCC_max]/x’]，其中ADCC_max是ADCC活性水平的目标范围的最大值。任选地，x’为约24.1至约25.4。可替代地，x’为约13.0至约13.95。在各种情况下，对于抗体组合物中存在的每1％TAF，抗体组合物的ADCC活性水平为约13.5％±0.5％，任选地，其中抗体组合物的抗体结合仅包含一个抗体结合位点的抗原。在各个方面，对于抗体组合物中存在的每1％TAF，抗体组合物的ADCC活性水平为约24.74％±0.625％，任选地，其中抗体组合物的抗体结合仅包含两个抗体结合位点的抗原。在示例性方面，对于抗体组合物中存在的每1％TAF，抗体组合物的ADCC活性水平为约12％±1.5％*Q，Q是抗原上存在的抗体结合位点的数量。

在示例性方面，抗体结合仅包含一个抗体结合位点的抗原。在示例性情况下，参考抗体是英利昔单抗。在示例性方面，抗体结合仅包含两个抗体结合位点的抗原。在示例性方面，参考抗体是利妥昔单抗。

在示例性方面，方法是质量控制(QC)测定。在示例性方面，方法是过程中QC测定。在各个方面，样品是过程中材料的样品。在各种情况下，在收获前或收获后确定TAF聚糖含量。在示例性情况下，在层析步骤之后确定TAF聚糖含量。任选地，层析步骤包括捕获层析、中间层析和/或精制层析。在一些方面，在病毒灭活和中和、病毒过滤、或缓冲液交换后确定TAF聚糖含量。在各种情况下，该方法是批次释放测定。在一些方面，样品是制造批次的样品。

在各个方面，该方法进一步包括当在(i)中确定的TAF聚糖含量在目标范围内时，选择该抗体组合物进行下游处理。在各个方面，当在(i)中确定的TAF聚糖含量不在目标范围内时，对细胞培养的一种或多种条件进行改良以获得改良的细胞培养物。在一些方面，该方法进一步包括确定在改良细胞培养的一种或多种条件后获得的抗体组合物的样品的TAF聚糖含量，例如确定改良的细胞培养物的抗体组合物的样品的TAF聚糖含量。在各个方面，当在(i)中确定的TAF聚糖含量不在目标范围内时，该方法进一步包括(iii)改良细胞培养的一种或多种条件以获得改良的细胞培养物以及(iv)确定从改良的细胞培养物中获得的抗体组合物的样品的TAF聚糖含量。在示例性方面，当在(i)中确定的TAF聚糖含量不在目标范围内时，该方法进一步包括(iii)和(iv)，直到在(iv)中确定的TAF聚糖含量在目标范围内。在示例性情况下，仅当在(i)中确定的TAF聚糖含量不在目标范围内，例如，在目标范围外时，才对抗体组合物进行直接测量抗体组合物的ADCC活性的测定。直接测量ADCC活性的测定包括例如基于细胞的测定，该测定在通过与结合抗原表达细胞和效应细胞两者的抗体结合的效应细胞裂解包含可检测剂的抗原表达细胞时测量可检测试剂的释放。在示例性情况下，直接测量抗体组合物的ADCC活性的测定不在抗体组合物上进行。在各个方面，确定TAF聚糖含量是根据ADCC活性水平标准确定产品质量所需的唯一步骤。不受理论束缚，第一模型和第二模型的统计学显著关联允许TAF聚糖含量指示ADCC活性水平，从而不需要直接测量ADCC活性水平的测定。因此，不需要并且因此在当前披露的方法的各个方面不进行对抗体组合物的ADCC活性水平的直接测量。

在各个方面，该方法根据ADCC活性水平标准确定产品质量。在各个方面，ADCC活性水平标准是抗体组合物的可接受标准之一。在各个方面，当前披露的方法旨在确保药品批次符合每个适当的规范和适当的统计质量控制标准，作为根据21CFR 211.165批准和发行它们的条件。在各个方面，当前披露的确定产品质量的方法满足统计质量控制标准，其包括适当的可接受水平和/或适当的拒绝水平。包括但不限于“可接受标准”、“批次”和“过程中”的术语符合联邦法规(CFR)第21篇第210.3条中定义的含义。

本披露还提供了监测抗体组合物的产品质量的方法，其中该抗体组合物的ADCC活性水平是抗体组合物的产品质量所基于的标准。在示例性实施例中，该方法包括根据本披露的方法确定抗体组合物的产品质量，第一样品在第一时间点获得，并且第二样品在不同于第一时间点的第二时间点采集。在各种情况下，第一样品和第二样品中的每一个都是过程中材料的样品。在各个方面，第一样品是过程中材料的样品，并且第二样品是制造批次的样品。任选地，第一样品是在改良细胞培养的一种或多种条件之前获得的样品，并且第二样品是在改良细胞培养的一种或多种条件之后获得的样品。在示例性情况下，确定第一样品和第二样品中的每一个的TAF聚糖含量。为了确定抗体组合物的产品质量的目的和为了确定TAF聚糖含量，可以获得其他样品。抗体组合物的产品质量取决于TAF聚糖含量是否在目标范围内。在示例性方面，TAF聚糖含量的目标范围基于(1)参考抗体的ADCC活性水平的目标范围和(2)将抗体组合物的ADCC活性水平与抗体组合物的TAF聚糖含量相关联的第一模型。在示例性方面，由第一模型预测的ADCC为由第二模型预测的ADCC的约95％至约105％，其中第二模型将抗体组合物的ADCC活性水平与抗体组合物的HM聚糖含量和抗体组合物的AF聚糖含量相关联。

产生抗体组合物的方法

本披露提供了产生抗体组合物的方法。在示例性实施例中，该方法包括确定抗体组合物的产品质量，其中根据本披露的方法确定该抗体组合物的产品质量。任选地，该方法包括确定抗体组合物的样品的TAF聚糖含量并且该样品是过程中材料的样品。在各种情况下，如本文所定义，该方法包括当在(i)中确定的TAF聚糖含量在目标范围内时，确定抗体组合物的产品质量为可接受和/或实现ADCC活性水平标准。在示例性方面，TAF聚糖含量的目标范围基于(1)参考抗体的ADCC活性水平的目标范围和(2)将抗体组合物的ADCC活性水平与抗体组合物的TAF聚糖含量相关联的第一模型。在示例性方面，由第一模型预测的ADCC为由第二模型预测的ADCC的约95％至约105％，其中第二模型将抗体组合物的ADCC活性水平与抗体组合物的HM聚糖含量和抗体组合物的AF聚糖含量相关联。在各个方面，当在(i)中确定的TAF聚糖含量不在目标范围内时，该方法进一步包括(iii)改良细胞培养的一种或多种条件以获得改良的细胞培养物以及(iv)确定从改良的细胞培养物中获得的抗体组合物的样品的TAF聚糖含量，任选地，重复步骤(iii)和(iv)直到TAF聚糖含量在目标范围内。在各种情况下，样品是包含表达抗体组合物的抗体的细胞的细胞培养物样品。在各种情况下，改良细胞培养的一种或多种条件以改良TAF聚糖含量。在各个方面，抗体组合物的TAF聚糖含量是通过改良AF聚糖含量来实现的。在示例性方面，改良细胞培养的一种或多种条件以改良抗体组合物的AF聚糖含量。在示例性方面，该一种或多种条件主要改良AF聚糖含量。在各种情况下，该一种或多种条件改良AF聚糖含量并且不改良HM聚糖含量。在示例性方面，该方法包括通过改良HM聚糖含量来实现抗体组合物的TAF聚糖含量。任选地，改良细胞培养的一种或多种条件以改良抗体组合物的HM聚糖含量。在一些情况下，该一种或多种条件主要改良HM聚糖含量。在一些方面，该一种或多种条件改良HM聚糖含量并且不改良AF聚糖含量。在各种情况下，该方法包括重复改良非岩藻糖基化(AF)聚糖含量和/或重复改良高甘露糖(HM)聚糖，直到TAF聚糖含量在目标范围内。

在示例性实施例中，产生抗体组合物的方法包括(i)确定抗体组合物的样品的总非岩藻糖基化(TAF)聚糖含量；以及(ii)基于在(i)中确定的TAF聚糖含量选择该抗体组合物进行下游处理。在各个方面，样品采集自包含表达抗体组合物的抗体的细胞的细胞培养物。在各种情况下，该方法进一步包括改良抗体组合物的TAF聚糖含量并且确定改良的TAF聚糖含量。任选地，改良细胞培养的一种或多种条件以改良TAF聚糖含量。在示例性方面，该方法包括重复改良直到TAF聚糖含量在目标范围内。在示例性情况下，目标范围基于抗体的ADCC活性水平的目标范围。不受理论束缚，TAF聚糖含量与抗体组合物的ADCC活性水平相关联，从而可以基于抗体组合物的TAF聚糖含量来预测抗体组合物的ADCC活性水平。在决定是否应选择抗体组合物进行下游处理时，抗体组合物的ADCC活性水平可能是一个值得考虑的标准。因此，在各个方面，该方法包括(i)确定抗体组合物的样品的TAF聚糖含量；(ii)基于在(i)中确定的TAF聚糖含量确定抗体组合物的ADCC活性水平，并且任选地，(iii)当在(ii)中确定的抗体组合物的ADCC水平在ADCC活性水平的目标范围内时，选择该抗体组合物进行下游处理。在各个方面，对于抗体组合物的抗体，ADCC活性水平的目标范围是已知的。在各个方面，抗体组合物的抗体是参考抗体的生物类似物。在各种情况下，TAF聚糖含量的目标范围基于已知的ADCC活性水平的目标范围，或基于已知的ADCC活性水平的目标范围确定(例如，计算)。因此，在示例性方面，该方法包括(i)确定抗体组合物的样品的TAF聚糖含量；以及(ii)当在(i)中确定的TAF聚糖含量在目标范围内时，选择该抗体组合物进行下游处理。当该方法进一步包括改良抗体组合物的TAF聚糖含量时，该方法在各种情况下包括改良非岩藻糖基化(AF)聚糖含量以改良TAF聚糖含量。任选地，改良细胞培养的一种或多种条件以改良抗体组合物的AF聚糖含量，这进而改良TAF聚糖含量。可替代地或此外，当该方法进一步包括改良抗体组合物的TAF聚糖含量时，该方法在各种情况下包括改良高甘露糖(HM)聚糖含量以改良TAF聚糖含量。任选地，改良细胞培养的一种或多种条件以改良抗体组合物的HF聚糖含量，这进而改良TAF聚糖含量。在示例性方面，该一种或多种条件主要改良AF聚糖含量。在示例性情况下，该一种或多种条件主要改良HM聚糖含量。在示例性方面，该一种或多种条件改良AF聚糖含量并且不改良HM聚糖含量。在示例性情况下，该一种或多种条件改良HM聚糖含量并且不改良AF聚糖含量。该方法任选地包括重复改良非岩藻糖基化(AF)聚糖含量和/或重复改良高甘露糖(HM)聚糖，直到TAF聚糖含量在目标范围内。在示例性方面，抗体组合物的抗体是IgG，任选地，IgG₁。在各个方面，TAF聚糖含量的目标范围是m至n，其中m是[[ADCC_min-y]/x]，其中ADCC_min是ADCC活性水平的目标范围的最小值，并且n是[[ADCC_max-y]/x]，其中ADCC_max是ADCC活性水平的目标范围的最大值。任选地，x为约20.4至约27.7并且y为约-11.4至约16.7。可替代地，x为约9.7至约15.2并且y为约-15.6至约34.2。在各个方面，TAF聚糖含量的目标范围是m’至n’，其中m’是[ADCC_min/x’]，其中ADCC_min是ADCC活性水平的目标范围的最小值，并且n’是[ADCC_max]/x’]，其中ADCC_max是ADCC活性水平的目标范围的最大值。任选地，x’为约24.1至约25.4。可替代地，x’为约13.0至约13.95。在各种情况下，对于抗体组合物中存在的每1％TAF，抗体组合物的ADCC活性水平为约13.5％±0.5％，任选地，其中抗体组合物的抗体结合仅包含一个抗体结合位点的抗原。在各个方面，对于抗体组合物中存在的每1％TAF，抗体组合物的ADCC活性水平为约24.74％±0.625％，任选地，其中抗体组合物的抗体结合仅包含两个抗体结合位点的抗原。在示例性方面，对于抗体组合物中存在的每1％TAF，抗体组合物的ADCC活性水平为约12％±1.5％*Q，Q是抗原上存在的抗体结合位点的数量。在示例性情况下，Q是1并且任选地抗体是英利昔单抗或其生物类似物。任选地，Q是2并且任选地抗体是利妥昔单抗或其生物类似物。

当前披露的产生抗体组合物的方法包括改良由细胞培养物的细胞产生的抗体组合物的总非岩藻糖基化(TAF)聚糖含量。在各种情况下，改良细胞培养的一种或多种条件以改良TAF聚糖含量。在各个方面，该方法包括确定改良的TAF聚糖含量。任选地，重复改良直到确定的TAF聚糖含量在TAF的目标范围内。不受特定理论的束缚，TAF聚糖含量可以通过改良非岩藻糖基化(AF)聚糖含量或高甘露糖(HM)含量或其组合来改良，因为每一个都会影响TAF聚糖含量。因此，这些方法有利地允许多种方式实现TAF聚糖含量的目标范围。例如，改良细胞培养的一种或多种条件以改良AF聚糖含量，以便改良TAF聚糖含量。可替代地，改良细胞培养的一种或多种条件以改良HM聚糖含量，以便改良TAF聚糖含量。在各种情况下，改良细胞培养的一种或多种条件以改良AF聚糖含量和HM聚糖含量，以便改良TAF聚糖含量。因此，本披露进一步提供了改良由细胞培养物的细胞产生的抗体组合物的总非岩藻糖基化(TAF)聚糖含量的方法。在示例性实施例中，该方法包括改良AF聚糖含量。在示例性实施例中，该方法包括改良HM聚糖含量。在各个方面，该方法包括(i)确定抗体组合物的样品的非岩藻糖基化(AF)聚糖含量和高甘露糖(HM)聚糖含量；(ii)基于抗体组合物的抗体的ADCC活性水平的目标范围确定AF聚糖含量的目标范围，假设HM聚糖含量是恒定的；以及(iii)当AF聚糖含量在AF聚糖含量的目标范围内时，选择该抗体组合物进行下游处理。在各种情况下，该方法包括(i)确定抗体组合物的样品的非岩藻糖基化(AF)聚糖含量和高甘露糖(HM)聚糖含量；(ii)基于抗体组合物的抗体的ADCC活性水平的目标范围确定HM聚糖含量的目标范围，假设AF聚糖含量是恒定的；以及(iii)当HM聚糖含量在AF聚糖含量的目标范围内时，选择该抗体组合物进行下游处理。在各种情况下，该方法包括(i)确定该抗体组合物的样品的AF聚糖含量和HM聚糖含量和(ii)基于在(i)中确定的HM聚糖含量确定AF聚糖含量的目标范围，以及(iii)改良AF聚糖含量直到它在AF聚糖含量的目标范围内，其中未改良HM聚糖含量。可替代地，该方法包括(i)确定该抗体组合物的样品的AF聚糖含量和HM聚糖含量和(ii)基于在(i)中确定的AF聚糖含量确定HM聚糖含量的目标范围，以及(iii)改良HM聚糖含量直到它在HM聚糖含量的目标范围内，其中未改良AF聚糖含量。在示例性方面，将抗体组合物的ADCC活性水平与抗体组合物的TAF聚糖含量相关联的模型预测了与由将ADCC与HM和AF聚糖含量相关联的模型预测的基本上相同的ADCC活性水平。改良AF聚糖含量和/或HM聚糖含量的适合方法是本领域已知的。例如，国际专利公开号WO 2019/191150教导了改良抗体组合物的非岩藻糖基化聚糖水平的方法和改良抗体组合物的高甘露糖聚糖水平的方法。在此类方法中，改良细胞培养的一种或多种条件(例如，pH、岩藻糖浓度、葡萄糖浓度)以实现AF聚糖和/或HM聚糖的所需水平。此外，国际专利公开号WO 2013/114164、WO2016/089919、WO2013/114245、WO 2015/128793和WO 2013/114167，美国专利申请公开号US 2014/0356910以及Konno等人,Cytotech[细胞学技术]64:249-265(2012)中的每一个教导了获得增加的非岩藻糖基化聚糖的方法。

在示例性实施例中，产生抗体组合物的方法包括(i)确定抗体组合物的％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖；(ii)使用以下方程A基于％TAF计算抗体组合物的％抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)：

Y＝2.6+24.1*X

[方程A]，

其中Y是％ADCC并且X是在步骤(i)中确定的％TAF聚糖，以及

(iii)当Y在目标％ADCC范围内时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

在示例性实施例中，产生抗体组合物的方法包括(i)确定抗体组合物的％高甘露糖聚糖和％非岩藻糖基化聚糖，(ii)使用以下方程B基于％高甘露糖聚糖和％非岩藻糖基化聚糖计算抗体组合物的％抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)：

Y＝(0.24+27*HM+22.1*AF)

[方程B]，

其中Y是％ADCC，HM是在步骤(i)中确定的％高甘露糖聚糖，并且AF是在步骤(i)中确定的％非岩藻糖基化聚糖，以及

(iii)当Y在目标％ADCC范围内时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

在示例性实施例中，产生具有目标％ADCC的抗体组合物的方法，并且该方法包括(i)针对目标％ADCC，使用以下方程A计算目标％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖：

Y＝2.6+24.1*X

[方程A]，

其中Y是目标％ADCC并且X是目标％TAF聚糖；以及

(ii)在细胞培养物中维持有糖基化能力的细胞以产生具有目标％TAF聚糖X的抗体组合物。

在示例性实施例中，产生具有目标％ADCC的抗体组合物的方法，并且该方法包括(i)针对目标％ADCC，使用以下方程B计算目标％非岩藻糖基化聚糖和目标％高甘露糖聚糖

Y＝(0.24+27*HM+22.1*AF)

[方程B]，

其中Y是％ADCC，HM是％高甘露糖聚糖，并且AF是％非岩藻糖基化聚糖，以及

(iii)在细胞培养物中维持有糖基化能力的细胞以产生具有目标％高甘露糖聚糖和目标％非岩藻糖基化聚糖的抗体组合物。

在示例性方面，目标％ADCC在目标％ADCC范围内。任选地，目标％ADCC范围大于或约40且小于或约170或约175。例如，目标％ADCC范围为约40至约175、约50至约175、约60至约175、约70至约175、约80至约175、约90至约175、约100至约175约110至约175、约120至约175、约130至约175、约140至约175、约150至约175、约160至约175、或约170至约175、或约40至约170、约40至约160、约40至约150、约40至约140、约40至约130、约40至约120、约40至约110、约40至约100、约40至约90、约40至约80、约40至约70、约40至约60、或约40至约50。在各个方面，目标％ADCC范围大于或约44并且小于或约165(例如，约45至约165、约50至约165、约60至约165、约100至约165、约45至约100、约45至约60、约100至约150、约100至约125、约125至约150)。在示例性方面，目标％ADCC范围大于或约60并且小于或约130。

在示例性情况下，目标％ADCC范围取决于方程A或方程B的Y。例如，在一些方面，目标％ADCC范围是Y±20，任选地，Y±17或Y±18。在一些方面，目标％ADCC范围对于方程A是Y±17并且对于方程B是Y±18。

目标％ADCC范围可以是针对抗体组合物所描述的任何一个。参见，例如，组合物。

在示例性实施例中，产生具有任选地大于或约40且小于或约170的％ADCC(Y)的抗体组合物的方法包括(i)确定抗体组合物的％总非岩藻糖酰化(TAF)聚糖(X)，以及(ii)当X等于(Y-2.6)/24.1时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。在各个方面，X大于或约1.55且小于或约6.95，任选地，约1.6至约6.9、或约1.6至约6.5、约1.6至约6.0、约1.6至约5.5、约1.6至约5.0、约1.6至约4.5、约1.6至约4.0、约1.6至约3.5、约1.6至约3.0、约1.6至约2.5、约1.6至约2.0、约2.0至约6.95、约2.5至约6.95、约3.0至约6.95、约3.5至约6.95、约4.0至约6.95、约4.5至约6.95、约5.0至约6.95、约5.5至约6.95、约6.0至约6.95、或约6.5至约6.95。在各个方面，Y大于或约44且小于或约165，并且任选地，其中X为约1.72至约6.74。

在示例性实施例中，该方法是产生具有％ADCC，Y的抗体组合物的方法，所述方法包括(i)确定抗体组合物的％总岩藻糖化(TAF)聚糖，X，以及(ii)当X等于(Y-2.6)/24.1，任选地，其中X大于或约X-0.4且小于或约X+0.4，并且其中％ADCC大于约Y-17且小于或约Y+17，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。在各种情况下，X是X±0.3、X±0.2、X±0.1，和/或Y是Y±16、Y±15、Y±12、Y±9、Y±6、Y±3、Y±2、或Y±1。

在示例性实施例中，该方法是一种产生具有％ADCC的抗体组合物的方法，所述方法包括(i)确定抗体组合物的％非岩藻糖基化聚糖和％高甘露糖聚糖，以及(ii)当根据以下方程B将AF和HM与Y相关时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤

Y＝(0.24+27*HM+22.1*AF)

[方程B]，

其中Y是％ADCC，HM是在步骤(i)中确定的％高甘露糖聚糖，并且AF是在步骤(i)中确定的非岩藻糖基化聚糖。

在示例性情况下，Y大于或约40且小于或约175，或本文所述的任何子范围，任选地，约41至约171。在一些方面，AF为约1至约4、或约1至约3、或约1至约2，并且HM为约40至约175，或其任何子范围。任选地，Y为约30至约185，任选地，约32至约180，HM为约1至约4并且AF为约30至约185。在示例性方面，抗体组合物的％ADCC在由Y定义的范围内。任选地，抗体组合物的％ADCC在Y±18的范围内。在示例性方面，AF为约1至约4。在一些方面，％高甘露糖聚糖是在由HM定义的范围内的值，任选地，其中该范围是HM±1。任选地，HM为约1至约4。在一些情况下，％非岩藻糖基化聚糖是任选地由AF定义的范围内的值，其中该范围是AF±1。

提供了一种产生在TAF聚糖含量目标范围内的抗体组合物的方法，其中所述方法包括：(i)测量包含抗体的不同糖型的一系列样品的ADCC活性水平，(ii)确定该系列的每个样品的TAF聚糖含量，(iii)创建将ADCC活性水平与TAF聚糖含量相关联的模型，(iv)确定抗体组合物的ADCC活性水平，并且然后使用该模型计算TAF聚糖含量，或者使用该模型确定该抗体组合物的TAF聚糖含量并且计算ADCC活性水平，以及(v)当在步骤(iv)中计算的TAF聚糖含量在TAF聚糖含量的目标范围内或当在步骤(iv)中计算的ADCC活性水平在ADCC活性水平的目标范围内时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。在一些方面，ADCC活性水平基本上如实例2中所述进行测量。在一些方面，TAF聚糖含量基本上如实例1中所述进行测量。该模型可以通过本领域已知的任何方法来创建。在各个方面，该模型是线性回归模型并且基本上如实例3和/或实例5中所述创建。

提供了一种产生在目标％ADCC范围内的抗体组合物的方法，其中所述方法包括：

i.测量包含抗体的不同糖型的一系列样品的％ADCC，

ii.确定该系列的每个样品的％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖，

iii.确定下图的最佳拟合线的线性方程，该图为该系列的每个样品绘制作为如在步骤(ii)中确定的％TAF聚糖的函数的如在步骤(i)中测量的％ADCC，

iv.确定抗体组合物的％TAF，并且然后使用步骤(iii)的线性方程计算％ADCC，以及

v.当在步骤(iv)中计算的％ADCC在目标％ADCC范围内时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

此外，提供了产生在目标％TAF范围内的抗体组合物的方法，其中所述方法包括：

i.测量包含抗体的不同糖型的一系列样品的％ADCC，

ii.确定该系列的每个样品的％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖，

iii.确定下图的最佳拟合线的线性方程，该图为该系列的每个样品绘制作为如在步骤(ii)中确定的％TAF聚糖的函数的如在步骤(i)中测量的％ADCC，

iv.确定抗体组合物的％ADCC，并且然后使用步骤(iii)的线性方程计算％TAF，以及

v.当在步骤(iv)中计算的％TAF在目标％TAF范围内时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

在实例3中进一步详细描述了进行前三个步骤的示例性方法。

本披露进一步提供了一种产生在TAF聚糖含量的目标范围内的抗体组合物的方法，其包括确定TAF聚糖含量的目标范围以及当TAF聚糖含量在TAF聚糖含量的目标范围内时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。在各个方面，TAF聚糖含量的目标范围是m至n，其中m是[[ADCC_min-y]/x]，其中ADCC_min是ADCC活性水平的目标范围的最小值，并且n是[[ADCC_max-y]/x]，其中ADCC_max是ADCC活性水平的目标范围的最大值。任选地，x为约20.4至约27.7并且y为约-11.4至约16.7。可替代地，x为约9.7至约15.2并且y为约-15.6至约34.2。在各个方面，TAF聚糖含量的目标范围是m’至n’，其中m’是[ADCC_min/x’]，其中ADCC_min是ADCC活性水平的目标范围的最小值，并且n’是[ADCC_max]/x’]，其中ADCC_max是ADCC活性水平的目标范围的最大值。任选地，x’为约24.1至约25.4。可替代地，x’为约13.0至约13.95。

本披露进一步提供了一种产生在目标％TAF范围内的抗体组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(i)通过绘制在细胞培养条件下产生的一系列至少5种参考抗体组合物的％ADCC和％TAF聚糖生成最佳拟合图的线性方程，每种参考抗体组合物具有与抗体组合物相同的氨基酸序列，(ii)基于步骤(i)中生成的线性方程和所需的％ADCC活性选择目标％TAF聚糖范围；(iii)在细胞培养条件下培养抗体组合物；(iv)纯化抗体组合物，(v)取样抗体组合物以确定抗体组合物的％TAF以及(vi)确定抗体组合物的％TAF是否在步骤(ii)的目标％TAF范围内。在示例性方面，该方法进一步包括当在步骤(v)中计算的％TAF在目标％TAF范围内时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

本披露还提供了一种确定抗体组合物的％抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的方法。

在示例性实施例中，该方法包括：

i.确定抗体组合物的％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖；

ii.使用以下方程A基于％TAF计算该抗体组合物的％ADCC：

Y＝2.6+24.1*X

[方程A]，

其中Y是％ADCC并且X是在步骤(i)中确定的％TAF聚糖，

还提供了一种确定抗体组合物的％抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的方法。在示例性实施例中，所述方法包括

i.确定抗体组合物的％高甘露糖聚糖和％非岩藻糖基化聚糖，

ii.使用以下方程B基于％高甘露糖聚糖和％非岩藻糖基化聚糖计算抗体组合物的％ADCC：

Y＝(0.24+27*HM+22.1*AF)

[方程B]，

其中Y是％ADCC，HM是在步骤(i)中确定的％高甘露糖聚糖，并且AF是在步骤(i)中确定的％非岩藻糖基化聚糖，以及

在各个方面，该方法进一步包括当Y在目标％ADCC范围内时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

处理步骤

确定(例如，测量)％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖、％高甘露糖聚糖、和/或％非岩藻糖基化聚糖以更好地告知抗体组合物的％抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。确定步骤(例如，测量步骤)可以在制造期间的任何步骤发生。特别地，可以在收获前或收获后，在下游处理期间的任何阶段进行测量，如在任何层析单元操作之后，包括捕获层析、中间层析和/或精制层析单元操作；病毒灭活和中和、病毒过滤；和/或最终配制。在各个方面，实时、近实时和/或事后确定(例如，测量)％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖、％高甘露糖聚糖和/或％非岩藻糖基化聚糖。可以使用已知技术和可商购的设备进行监测和测量。

在本披露的各个方面，确定(例如，测量)％总无岩藻糖基化(TAF)聚糖、％高甘露糖聚糖、和/或％非岩藻糖基化聚糖的步骤在收获步骤之后进行。如本文所用，术语“收获”是指收集含有目的重组蛋白的细胞培养物并将其至少与细胞培养物的细胞分离的步骤。收获可以连续进行。在一些方面，使用离心进行收获并且可以进一步包括沉淀、过滤等。在各个方面，确定步骤在层析步骤(任选地，蛋白A层析步骤)之后进行。在各个方面，确定步骤在收获之后和层析步骤(例如，蛋白A层析步骤)之后进行。

关于当前披露的方法，在各个方面，选择或选取抗体组合物进行进一步的处理步骤(例如，进行一个或多个下游处理步骤)，并且选择基于特定参数，例如，％ADCC、％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖、％高甘露糖聚糖、和/或％非岩藻糖基化聚糖。在各种情况下，当前披露的方法包括基于特定参数(例如，基于％ADCC、％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖，％高甘露糖聚糖、和/或％非岩藻糖基化聚糖)，在进一步的处理步骤中(例如，在一个或多个下游处理步骤中)使用抗体组合物。在各种情况下，当前披露的方法包括基于特定参数(例如，基于％ADCC、％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖、％高甘露糖聚糖、和/或％非岩藻糖基化聚糖)，用抗体组合物进行进一步的处理步骤(例如一个或多个下游处理步骤)。

在示例性情况下，一个或多个下游处理步骤是在确定(例如，测量)％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖、％高甘露糖聚糖％、和/或％非岩藻糖基化聚糖的处理步骤之后(或下游)发生的任何处理步骤。例如，如果确定(例如，测量)％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖、％高甘露糖聚糖和/或％非岩藻糖基化聚糖。例如，如果在收获时确定(例如，测量)％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖、％高甘露糖聚糖、和/或％非岩藻糖基化聚糖，则一个或多个下游处理步骤是在收获步骤之后(或下游)发生的任何处理步骤，在各个方面，这些处理步骤包括：稀释步骤、填充步骤、过滤步骤、配制步骤、层析步骤、病毒过滤步骤、病毒灭活步骤或其组合。此外，例如，如果在层析步骤(例如，蛋白A层析步骤)之后确定(例如，测量)％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖、％高甘露糖聚糖、和/或％无岩藻糖基化聚糖，则一个或多个下游处理步骤是在层析步骤之后(或下游)发生的任何处理步骤，在各个方面，这些处理步骤包括：稀释步骤、填充步骤、过滤步骤、配制步骤、进一步的层析步骤、病毒过滤步骤、病毒灭活步骤或其组合。在示例性情况下，进一步的层析步骤是离子交换层析步骤(例如，阳离子交换层析步骤或阴离子交换层析步骤)。

在下游处理过程中使用的层析阶段/类型包括捕获或亲和层析，用于将重组产物与其他蛋白、聚集体、DNA、病毒和其他此类杂质分离。在示例性情况下，初始层析步骤是用蛋白A(例如，与树脂附接的蛋白A)进行的。在各个方面，中间和精制层析进一步纯化重组蛋白，去除大量污染物、外来病毒、痕量杂质、聚集体、异构体等。层析可以结合和洗脱模式进行，其中目的重组蛋白结合层析介质并且杂质流过，或处于流过模式，其中杂质结合并且重组蛋白流过。此类层析方法的实例包括离子交换层析(IEX)，如阴离子交换层析(AEX)和阳离子交换层析(CEX)；疏水相互作用层析(HIC)；混合模式或多模式层析(MM)、羟基磷灰石层析(HA)；反相层析和凝胶过滤。

在各个方面，下游步骤是病毒灭活步骤。包膜病毒具有被脂蛋白膜或“包膜”包裹的衣壳，因此容易失活。在各种情况下，病毒灭活步骤包括热灭活/巴氏消毒、pH灭活、UV和γ射线照射、使用高强度广谱白光、添加化学灭活剂、表面活性剂、和溶剂/洗涤剂处理。

在各个方面，下游步骤是病毒过滤步骤。在各个方面，病毒过滤步骤包括去除无包膜病毒。在各个方面，病毒过滤步骤包括使用微型或纳米过滤器。

在各个方面，下游处理步骤包括一个或多个配制步骤。在完成层析步骤后，在各个方面，纯化的重组蛋白被缓冲液交换成配制品缓冲液。在示例性方面，使用超滤和渗滤(UF/DF)进行缓冲液交换。在示例性方面，使用渗滤将重组蛋白缓冲液交换到所需的配制品缓冲液中，并使用超滤浓缩至所需的最终配制品浓度。在各个方面，在UF/DF配制步骤之后，添加其他增强稳定性的赋形剂。

重组糖基化蛋白质

当前披露的方法涉及包含重组糖基化蛋白的组合物。在各个方面，重组糖基化蛋白质包含含有一个或多个下式的N-糖基化共有序列的氨基酸序列：

Asn-Xaa₁-Xaa₂

其中Xaa₁是除Pro外的任何氨基酸，并且Xaa₂是Ser或Thr。

在示例性实施例中，重组糖基化蛋白质包含可结晶片段(Fc)多肽。如本文所用的术语“Fc多肽”包括衍生自抗体Fc区的天然和突变蛋白形式的多肽。还包括含有促进二聚化的铰链区的截短形式的此类多肽。包含Fc部分(和由其形成的寡聚体)的融合蛋白提供了通过蛋白A或蛋白G柱上的亲和层析进行简便纯化的优点。在示例性实施例中，重组糖基化蛋白质包含IgG(例如，人IgG)的Fc。在示例性方面中，重组糖基化蛋白质包含IgG1或IgG2的Fc。在示例性方面中，重组糖基化蛋白质是抗体、抗体蛋白质产物、肽体(peptibody)或Fc融合蛋白。

在示例性方面中，重组糖基化蛋白质是抗体。如本文所用，术语“抗体”是指具有常规免疫球蛋白形式、包含重链及轻链且包含可变区及恒定区的蛋白质。例如，抗体可以是IgG，其是两对相同多肽链的“Y形”结构，每对具有一条“轻”链(典型地具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。抗体具有可变区和恒定区。在IgG形式中，可变区通常为约100-110或更多个氨基酸，包含三个互补决定区(CDR)，主要负责抗原识别，并且与结合不同抗原的其他抗体差异很大。参见，例如Janeway等人,“Structure ofthe Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes”[抗体分子和免疫球蛋白基因的结构],Immunobiology:The Immune System in Health and Disease[免疫生物学：健康与疾病的免疫系统],第4版.爱思唯尔科学有限公司(Elsevier Science Ltd.)/加兰出版社(Garland Publishing),(1999)。

简而言之，在抗体支架中，CDR嵌埋于重链及轻链可变区中的框架内，其中其构成主要负责抗原结合及识别的区域。可变区包含至少三个重链或轻链CDR(Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫相关蛋白质序列],PublicHealth Service[公共卫生署]N.I.H.,贝塞斯达,马里兰州；还参见Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917；Chothia等人,1989,Nature[自然]342:877-883)，位于框架区内(由Kabat等人,1991指定框架区1-4、FR1、FR2、FR3、和FR4；还参见Chothia和Lesk,1987,同上)。

人类轻链分类为κ轻链及λ轻链。重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。本披露的实施例包括所有这种抗体类别或同种型。轻链恒定区可为例如κ型或λ型轻链恒定区，例如人κ型或λ型轻链恒定区。重链恒定区可为例如α型、δ型、ε型、γ型或μ型重链恒定区，例如人α型、δ型、ε型、γ型或μ型重链恒定区。因此，在示例性实施例中，该抗体为同种型IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任一种。

在各种方面中，该抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。在示例性情况下，抗体为哺乳动物抗体，例如小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、马抗体、鸡抗体、仓鼠抗体、猪抗体、人类抗体等。在某些方面中，重组糖基化蛋白质是人抗体。

在各种方面中，抗体被酶，诸如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶裂解成片段。木瓜蛋白酶切割抗体以产生两个Fab片段和单个Fc片段。胃蛋白酶使抗体裂解，以产生F(ab’)₂片段和pFc’片段。在示例性方面中，重组糖基化蛋白质是保留至少一个糖基化位点的抗体片段，例如Fab、Fc、F(ab’)₂或pFc’。关于本披露的方法，抗体可能缺乏抗体的某些部分，并且可能为抗体片段。在各个方面，抗体片段包含糖基化位点。在一些方面中，片段是“糖基化Fc片段”，其包含在真核细胞中翻译后糖基化的抗体Fc区的至少一部分。在各种情况下，重组糖基化蛋白是糖基化Fc片段。

已经开发出抗体的架构以产生越来越多可替代的抗体形式，这些抗体形式跨越至少或约12-150kDa的分子量范围和从单体(n＝1)、二聚体(n＝2)、和三聚体(n＝3)至四聚体(n＝4)以及潜在更高范围的效价(n)；此类可替代抗体形式在本文中称为“抗体蛋白质产物”或“抗体结合蛋白”。

抗体蛋白质产物可为基于保留完全抗原结合能力的抗体片段，例如scFv、Fab和VHH/VH的抗原结合形式。保留其完整抗原结合位点的最小抗原结合片段是Fv片段，后者完全由可变(V)区组成。使用可溶性柔性氨基酸肽接头将V区连接至scFv片段(可变单链片段)以使该分子稳定，或将恒定(C)结构域添加至V区以产生Fab片段[抗原结合片段]。scFv和Fab都是可以在原核宿主中容易地产生的广泛使用的片段。其他抗体蛋白产物包括经二硫键稳定的scFv(ds-scFv)、单链Fab(scFab)以及二聚及多聚抗体形式，如双抗体、三抗体和四抗体，或包含由与寡聚结构域连接的scFv组成的不同形式的迷你抗体(miniAb)。最小的片段是骆驼重链Ab的VHH/VH以及单结构域Ab(sdAb)。最常用于建造新颖抗体形式的构件为单链可变(V)结构域抗体片段(scFv)，所述包含由具有约15个氨基酸残基的肽接头连接的来自重链和轻链的V结构域(VH结构域和VL结构域)。肽体(peptibody)或肽-Fc融合物是另一种抗体蛋白产物。肽体的结构由嫁接到Fc结构域上的生物活性肽组成。本领域已充分描述了肽体。参见，例如，Shimamoto等人.,mAbs 4(5):586-591(2012)。

其他抗体蛋白产物包括单链抗体(SCA)、双抗体、三抗体；四抗体；双特异性或三特异性抗体等。双特异性抗体可分成五个主要类别：BsIgG、附加IgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白以及BsAb缀合物。参见，例如，Spiess等人,Molecular Immunology[分子免疫学]67(2)部分A:97/-106(2015)。

在示例性方面中，重组糖基化蛋白质包含这些抗体蛋白质产物(例如，scFv、FabVHH/VH、Fv片段、ds-scFv、scFab、二聚抗体、多聚抗体(例如，双抗体、三抗体、四抗体)、miniAb、肽体、骆驼重链抗体的VHH/VH、sdAb、双抗体；三抗体；四抗体；双特异性或三特异性抗体、BsIgG、附加IgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白和BsAb缀合物)中的任一个并且包含一个或多个N-糖基化共有序列，任选地，一个或多个Fc多肽。在各个方面，抗体蛋白质产物包含糖基化位点。在示例性方面中，抗体蛋白质产物可以是缀和到抗体结合片段的糖基化Fc片段(“糖基化Fc片段抗体产物”)。

重组糖基化蛋白质可以是呈单体形式或者聚合体、寡聚体或多聚体形式的抗体蛋白质产物。在抗体包含两种或更多种不同抗原结合区片段的某些实施例中，抗体被视为双特异性的、三特异性的或多特异性的，或者二价的、三价的或多价的，这取决于由抗体识别和结合的不同表位的数目。

在各个方面，重组糖基化蛋白是嵌合抗体或人源化抗体。术语“嵌合抗体”在本文中用于指含有来自一个物种的恒定结构域和来自第二物种的可变结构域，或更一般而言，含有来自至少两个物种的氨基酸序列区段的抗体。术语“人源化”在关于抗体使用时是指至少具有来自经工程化以具有比原始来源抗体更类似于真人类抗体的结构和免疫学功能的非人来源CDR区的抗体。例如，人源化可涉及将来自非人类抗体(例如小鼠抗体)的CDR接枝到人类抗体中。人源化也可涉及选择氨基酸取代以使非人类序列看起来更类似人类序列。

在示例性方面，抗体组合物的抗体结合仅包含一个抗体结合位点的抗原，并且任选地，对于抗体组合物中存在的每1％TAF，抗体组合物的ADCC活性水平为约13.5％±0.5％。在各个方面，抗体组合物的抗体结合仅包含两个抗体结合位点的抗原，并且任选地，对于抗体组合物中存在的每1％TAF，抗体组合物的ADCC活性水平为约24.74％±0.625％，在示例性方面，对于抗体组合物中存在的每1％TAF，抗体组合物的ADCC活性水平为约12％±1.5％*Q，Q是抗原上存在的抗体结合位点的数量。在示例性情况下，Q是1并且任选地抗体是英利昔单抗或其生物类似物。任选地，Q是2并且任选地抗体是利妥昔单抗或其生物类似物。在各种情况下，Q为3，因此对于抗体组合物中存在的每1％TAF聚糖含量，抗体组合物的ADCC活性水平为约36％至约40.5％。此外，在一些情况下，Q为4，因此对于抗体组合物中存在的每1％TAF聚糖含量，抗体组合物的ADCC活性水平为约48％至约54％。

有利地，这些方法不限于抗体、糖基化Fc片段、抗体蛋白产物、嵌合抗体、或人源化抗体的抗原特异性。因此，抗体、糖基化Fc片段、抗体蛋白产物、嵌合抗体、或人源化抗体对几乎任何抗原都具有任何结合特异性。在示例性方面中，抗体与激素、生长因子、细胞因子、细胞表面受体或其任何配体结合。在示例性方面中，抗体与在免疫细胞的细胞表面上表达的蛋白质结合。在示例性方面中，抗体与选自下组的分化簇分子结合，该组由以下组成：CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11A、CD11B、CD11C、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31,CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD45RA、CD45RB、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CD75、CD76、CD79α、CD79β、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CD109、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CD121a、CDw121b、CD122、CD123、CD124、CD125、CD126、CD127、CDw128、CD129、CD130、CDw131、CD132、CD134、CD135、CDw136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CD145、CD146、CD147、CD148、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、和CD182。

在示例性方面，抗体、糖基化Fc片段、抗体蛋白产物、嵌合抗体或人源化抗体是以下中描述的其中一种：美国专利号7947809和美国专利申请公开号20090041784(胰高血糖素受体)，美国专利号7939070、美国专利号7833527、美国专利号7767206和美国专利号7786284(IL-17受体A)，美国专利号7872106和美国专利号7592429(硬化蛋白)，美国专利号7871611、美国专利号7815907、美国专利号7037498、美国专利号7700742和美国专利申请公开号20100255538(IGF-1受体)，美国专利号7868140(B7RP1)，美国专利号7807159和美国专利申请公开号20110091455(肌肉生长抑制素)，美国专利号7736644、美国专利号7628986、美国专利号7524496和美国专利申请公开号20100111979(表皮生长因子受体缺失突变体)，美国专利号7728110(SARS冠状病毒)，美国专利号7718776和美国专利申请公告号20100209435(OPGL)，美国专利号7658924和美国专利号7521053(血管生成素-2)，美国专利号7601818、美国专利号7795413、美国专利申请公告号20090155274、美国专利申请公告号20110040076(NGF)，美国专利号7579186(TGF-βII型受体)，美国专利号7541438(结缔组织生长因子)，美国专利号7438910(IL1-R1)，美国专利号7423128(备解素)，美国专利号7411057、美国专利号7824679、美国专利号7109003、美国专利号6682736、美国专利号7132281和美国专利号7807797(CTLA-4)，美国专利号7084257、美国专利号7790859、美国专利号7335743、美国专利号7084257和美国专利申请公开号20110045537(干扰素γ)，美国专利号7932372(MAdCAM)，美国专利号7906625、美国专利申请公开号20080292639、以及美国专利申请公开号20110044986(淀粉样蛋白)，美国专利号7815907和美国专利号7700742(胰岛素样生长因子I)，美国专利号7566772和美国专利号7964193(白细胞介素-1β)，美国专利号7563442、美国专利号7288251、美国专利号7338660、美国专利号7626012、美国专利号7618633、以及美国专利申请公开号20100098694(CD40)，美国专利号7498420(c-Met)，美国专利号7326414、美国专利号7592430和美国专利号7728113(M-CSF)，美国专利号6924360、美国专利号7067131和美国专利号7090844(MUC18)，美国专利号6235883、美国专利号7807798、美国专利申请公开号20100305307(表皮生长因子受体)，美国专利号6716587、美国专利号7872113、美国专利号7465450、美国专利号7186809、美国专利号7317090和美国专利号7638606(白细胞介素-4受体)，美国专利申请公开号20110135657(β-KLOTHO)，美国专利号7887799和7879323(纤维母细胞生长因子样多肽)，美国专利号7867494(IgE)，美国专利申请公开号20100254975(α-4β-7)，美国专利申请公开号20100197005和美国专利号7537762(激活素受体样激酶-1)，美国专利号7585500和美国专利申请公告号20100047253(IL-13)，美国专利申请公告号20090263383和美国专利号7449555(CD148)，美国专利申请公告号20090234106(激活素A)，美国专利申请公告号20090226447(血管生成素-1和血管生成素-2)，美国专利申请公开号20090191212(血管生成素-2)，美国专利申请公开号20090155164(C-FMS)，美国专利号7537762(激活素受体样激酶-1)，美国专利号7371381(甘丙肽)，美国专利申请公开号20070196376(胰岛素样生长因子)，美国专利号7267960和美国专利号7741115(LDCAM)，US7265212(CD45RB)，美国专利号7709611、美国专利申请公开号20060127393和美国专利申请公开号20100040619(DKK1)，美国专利号7807795、美国专利申请公开号20030103978和美国专利号7923008(骨保护素)，美国专利申请公开号20090208489(OV064)，美国专利申请公开号20080286284(PSMA)，美国专利申请公开号7888482、美国专利申请公开号20110165171和美国专利申请公开号20110059063(PAR2)，美国专利申请公开号20110150888(HEPCIDIN)，美国专利号7939640(B7L-1)，美国专利号7915391(c-Kit)，美国专利号7807796、美国专利号7193058和美国专利号7427669(ULBP)，美国专利号7786271、美国专利号7304144和美国专利申请公告号20090238823(TSLP)，美国专利号7767793(SIGIRR)，美国专利号7705130(HER-3)，美国专利号7704501(共济失调蛋白-1样多肽)，美国专利号7695948和美国专利号7199224(TNF-α转化酶)，美国专利申请公开号20090234106(激活素A)，美国专利申请公开号20090214559和美国专利号7438910(IL1-R1)，美国专利号7579186(TGF-βII型受体)，美国专利号7569387(TNF受体样分子)，美国专利号7541438(结缔组织生长因子)，美国专利号7521048(TRAIL受体-2)，美国专利号6319499、美国专利号7081523和美国专利申请公开号20080182976(促红细胞生成素受体)，美国专利申请公开号20080166352、美国专利号7435796(B7RP1)，美国专利号7423128(备解素)，美国专利号7422742和美国专利号7141653(白细胞介素-5)，美国专利号6740522和美国专利号7411050(RANKL)，美国专利号7378091(碳酸酐酶IX(CA IX)肿瘤抗原)，美国专利号7318925和7288253(甲状旁腺激素)，美国专利号7285269(TNF)，美国专利号6692740和美国专利号7270817(ACPL)，美国专利号7202343(单核细胞趋化蛋白-1)，美国专利号7144731(SCF)，美国专利号6355779和美国专利号7138500(4-1BB)，美国专利号7135174(PDGFD)，美国专利号6630143和美国专利号7045128(Flt-3配体)，美国专利号6849450(金属蛋白酶抑制剂)，美国专利号6596852(LERK-5)，美国专利号6232447(LERK-6)，美国专利号6500429(脑源性神经营养因子)，美国专利号6184359(上皮源性T细胞因子)，美国专利号6143874(神经营养因子NNT-1)，美国专利申请公开号20110027287(蛋白质原转化酶枯草杆菌蛋白酶KEXIN 9型(PCSK9))，美国专利申请公开号20110014201(IL-18受体)和美国专利申请公开号20090155164(C-FMS)。出于其对可变结构域多肽、可变结构域编码核酸、宿主细胞、载体、制备编码所述可变结构域的多肽的方法、药物组合物以及治疗与含有可变结构域的抗原结合蛋白或抗体的相应靶标相关的疾病的方法的目的，将上述专利和公开的专利申请通过引用以其整体并入本文。

在示例性实施例中，抗体、糖基化Fc片段、抗体蛋白产物、嵌合抗体、或人源化抗体是以下之一：莫罗单抗-CD3(以商标名称Orthoclone

市售的产品)、阿昔单抗(以商标名称

市售的产品)、利妥昔单抗(以商标名称

市售的产品)、巴利昔单抗(以商标名称

市售的产品)、达利珠单抗(以商标名称

市售的产品)、帕利珠单抗(以商标名称

市售的产品)、英利昔单抗(以商标名称

市售的产品)、曲妥珠单抗(以商标名称

市售的产品)、阿仑单抗(以商标名称

市售的产品)、阿达木单抗(以商标名称

市售的产品)、托西莫单抗-I131(以商标名称

市售的产品)、依法利珠单抗(以商标名称

市售的产品)、西妥昔单抗(以商标名称

市售的产品)、替伊莫单抗(以商标名称

市售的产品)、奥马珠单抗(以商标名称

市售的产品)、贝伐单抗(以商标名称

市售的产品)、那他珠单抗(以商标名称

市售的产品)、兰尼单抗(以商标名称

市售的产品)、帕尼单抗(以商标名称

市售的产品)、依库珠单抗(以商标名称

市售的产品)、培舍珠单抗(以商标名称

市售的产品)、戈利木单抗(以商标名称

市售的产品)、康纳单抗(以商标名称

市售的产品)、卡妥索单抗(以商标名称

市售的产品)、优特克单抗(以商标名称

市售的产品)、托珠单抗(以商标名称

市售的产品)、奥法木单抗(以商标名称

市售的产品)、德尼单抗(以商标名称

市售的产品)、贝利木单抗(以商标名称

市售的产品)、瑞西巴库单抗、易普利姆玛(以商标名称

市售的产品)以及帕妥珠单抗(以商标名称

市售的产品)。在示例性实施例中，抗体是以下中之一：抗TNFα抗体，例如阿达木单抗、英利昔单抗、依那西普、戈利木单抗、和培舍珠单抗；抗IL1.β.抗体，如康纳单抗；抗IL12/23(p40)抗体，例如优特克单抗和布瑞吉努单抗；以及抗IL2R抗体，例如达利珠单抗。

在示例性方面中，该抗体结合肿瘤相关抗原且为抗癌抗体。合适的抗癌抗体的实例包括但不限于抗BAFF抗体，例如贝利木单抗；抗CD20抗体，例如利妥昔单抗；抗CD22抗体，例如依帕珠单抗；抗CD25抗体，例如达利珠单抗；抗CD30抗体，例如伊雷单抗；抗CD33抗体，例如吉妥珠单抗；抗CD52抗体例如阿仑单抗；抗CD152抗体，例如易普利姆玛；抗EGFR抗体，例如西妥昔单抗；抗HER2抗体，例如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗；抗IL6抗体，如司妥昔单抗(siltuximab)；以及抗VEGF抗体，如贝伐单抗；抗IL6受体抗体，如托珠单抗。

在示例性方面，肿瘤相关抗原为CD20且抗体为抗CD20抗体，例如，抗CD20单克隆抗体。在示例性方面中，肿瘤相关抗原包含SEQ ID NO:3。在示例性情况下，抗体包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列和SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在各个方面，IgG1抗体是利妥昔单抗或其生物类似物。术语利妥昔单抗是指结合CD20抗原的IgG1κ嵌合鼠/人单克隆抗体(参见CAS号：174722-31-7；DrugBank-DB00073；Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes[京都基因与基因组百科全书](KEGG)条目D02994)。在示例性方面，抗体包含含有表A中所述的CDR1、CDR2和CDR3的轻链。在示例性方面，抗体包含含有表A中所述的CDR1、CDR2和CDR3的重链。在各种情况下，抗体包含含有表A中所述的VH-IgG1和VL-IgGκ序列的VH和VL。

表A：利妥昔单抗氨基酸序列

LC，轻链；HC，重链；VL，可变轻链；VH，可变重链。

在各个方面，抗体包含：

i.轻链(LC)CDR1，该LC CDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:4至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:4的变体氨基酸序列，

ii.LC CDR2，该LC CDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:5至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:5的变体氨基酸序列，

iii.LC CDR3，该LC CDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:6至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:6的变体氨基酸序列，

iv.重链(HC)CDR1，该HC CDR1包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:7至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:7的变体氨基酸序列；

v.HC CDR2，该HC CDR2包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:8至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:8的变体氨基酸序列；

vi.HC CDR3，该HC CDR3包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:9至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:9的变体氨基酸序列。

在各种情况下，抗体包含：LC可变区，该LC可变区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列、与SEQ ID NO:10至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1至10个(例如，1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、1或2个)氨基酸取代的SEQ ID NO:10的变体氨基酸序列。

在示例性方面，该抗体包含：HC可变区，该HC可变区包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列、与SEQ ID NO:11至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1至10个(例如，1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、1或2个)氨基酸取代的SEQ ID NO:11的变体氨基酸序列。

在示例性情况下，该抗体包含轻链，该轻链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列、与SEQ ID NO:12至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1至10个(例如，1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、1或2个)氨基酸取代的SEQ ID NO:12的变体氨基酸序列。

在各个方面，该抗体包含重链，该重链包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列、与SEQ IDNO:13至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1至10个(例如，1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、1或2个)氨基酸取代的SEQ ID NO:13的变体氨基酸序列。

在示例性方面，抗体的抗原是TNFα并且抗体是抗TNFα抗体(为简洁起见，也可以简称为“抗TNF”抗体)，例如，抗TNFα单克隆抗体。在示例性方面，抗体的抗原包含SEQ ID NO:14。在各个方面，IgG1抗体是英利昔单抗或其生物类似物。术语英利昔单抗是指由人恒定区和鼠可变区组成的嵌合单克隆IgG1κ抗体并结合TNFα抗原(参见CAS号：170277-31-3，DrugBank登录号DB00065)。英利昔单抗，也称为嵌合抗体cA2，衍生自称为A2的鼠单克隆抗体(Knight等人,Molec Immunol[分子免疫学]30(16):1443-1453(1993))。cA2轻链和cA2轻链的可变区公开在国际公开号WO 2006/065975中。在示例性方面，该抗体包含含有如表B中所示的英利昔单抗轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的轻链。在示例性方面，该抗体包含含有如表B中所示的英利昔单抗重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的重链。在各种情况下，抗体包含含有英利昔单抗的VH-IgG1和VL-IgGκ序列的VH和VL。

表B：英利昔单抗氨基酸序列

LC，轻链；HC，重链；VL，可变轻链；VH，可变重链。

在各种情况下，抗体包含：LC可变区，该LC可变区包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列、与SEQ ID NO:15至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1至10个(例如，1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、1或2个)氨基酸取代的SEQ ID NO:15的变体氨基酸序列。在示例性方面，该抗体包含：HC可变区，该HC可变区包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列、与SEQ ID NO:16至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1至10个(例如，1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、1或2个)氨基酸取代的SEQ ID NO:16的变体氨基酸序列。

组合物

当前披露的方法涉及包含重组糖基化蛋白的组合物。在各个方面，该组合物仅包含一种类型的重组糖基化蛋白。在各种情况下，该组合物包含重组糖基化蛋白，其中该组合物的每种重组糖基化蛋白包含相同或基本相同的氨基酸序列。在各个方面，该组合物包含重组糖基化蛋白，其中该组合物的每种重组糖基化蛋白包含与该组合物的所有其他重组糖基化蛋白的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。在各个方面，该组合物包含重组糖基化蛋白，其中该组合物的每种重组糖基化蛋白包含与该组合物的所有其他重组糖基化蛋白的氨基酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同的氨基酸序列。在各个方面，该组合物包含重组糖基化蛋白，其中该组合物的每种重组糖基化蛋白包含相同或基本相同的氨基酸序列(例如，与组合物的所有其他重组糖基化蛋白的氨基酸序列至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同)，但该组合物的重组糖基化蛋白的糖谱可能彼此不同。

在示例性方面，重组糖基化蛋白是抗体片段，并且因此，组合物可以是抗体片段组合物。

在示例性方面，重组糖基化蛋白是抗体蛋白产物，并且因此，组合物可以是抗体蛋白产物组合物。

在示例性方面，重组糖基化蛋白是糖基化Fc片段，并且因此，组合物可以是糖基化Fc片段组合物。

在示例性方面，重组糖基化蛋白是糖基化Fc片段抗体产物，并且因此，组合物可以是糖基化Fc片段抗体产物组合物。

在示例性方面，重组糖基化蛋白是嵌合抗体，并且因此，组合物可以是嵌合抗体组合物。

在示例性方面，重组糖基化蛋白是人源化抗体，并且因此，组合物可以是人源化抗体组合物。

在示例性方面，重组糖基化蛋白是抗体，并且组合物是抗体组合物。在各个方面，该组合物仅包含一种类型的抗体。在各种情况下，该组合物包含抗体，其中该抗体组合物的每种抗体包含相同或基本相同的氨基酸序列。在各个方面，该抗体组合物包含抗体，其中该抗体组合物的每种抗体包含与该抗体组合物的所有其他抗体的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。在各个方面，该抗体组合物包含抗体，其中该抗体组合物的每种抗体包含与该抗体组合物的所有其他抗体的氨基酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同的氨基酸序列。在各个方面，抗体组合物包含抗体，其中抗体组合物的每种抗体包含相同或基本相同的氨基酸序列(例如，与抗体组合物的所有其他抗体的氨基酸序列至少90％或至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同)，但抗体组合物的抗体的糖谱可能彼此不同。在示例性方面，抗体组合物包含抗体的不同糖型的不均一混合物。在各种情况下，抗体组合物的特征可以在于其TAF聚糖含量、HM聚糖含量和/或其AF聚糖含量。在各个方面，抗体组合物根据％TAF聚糖、％HM聚糖和/或％非岩藻糖基化聚糖来描述。任选地，抗体组合物的特征可以在于其其他类型聚糖(例如，半乳糖基化糖型、岩藻糖基化糖型等)的含量。

在各个方面，抗体组合物中的每种抗体是IgG，任选地，IgG1。在各种情况下，抗体组合物的每种抗体结合肿瘤相关抗原，例如，CD20。在各个方面，CD20包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在示例性方面，抗体组合物的每种抗体是抗CD20抗体。在各个方面，抗体组合物的每种抗体包含：

i.轻链(LC)CDR1，该LC CDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:4至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:4的变体氨基酸序列，

ii.LC CDR2，该LC CDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:5至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:5的变体氨基酸序列，

iii.LC CDR3，该LC CDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:6至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:6的变体氨基酸序列，

iv.重链(HC)CDR1，该HC CDR1包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:7至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:7的变体氨基酸序列；

v.HC CDR2，该HC CDR2包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:8至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:8的变体氨基酸序列；和/或

vi.HC CDR3，该HC CDR3包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:9至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:9的变体氨基酸序列。

在各种情况下，抗体组合物的每种抗体包含：LC可变区，该LC可变区包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列、与SEQ ID NO:10至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1至10个(例如，1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、1或2个)氨基酸取代的SEQ ID NO:10的变体氨基酸序列。

在示例性方面，抗体组合物的每种抗体包含：HC可变区，该HC可变区包含SEQ IDNO:11的氨基酸序列、与SEQ ID NO:11至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1至10个(例如，1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、1或2个)氨基酸取代的SEQ ID NO:11的变体氨基酸序列。

在示例性情况下，抗体组合物的每种抗体包含轻链，该轻链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列、与SEQ ID NO:12至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1至10个(例如，1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、1或2个)氨基酸取代的SEQ ID NO:12的变体氨基酸序列。

在各个方面，抗体组合物的每种抗体包含重链，该重链包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列、与SEQ ID NO:13至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1至10个(例如，1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、1或2个)氨基酸取代的SEQ ID NO:13的变体氨基酸序列。

在各个方面，抗体组合物中的每种抗体是IgG，任选地，IgG1。在各种情况下，抗体组合物的每种抗体结合肿瘤相关抗原，例如，TNFα。在各个方面，TNFα包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在示例性方面，抗体组合物的每种抗体是抗TNFα抗体。

在各种情况下，抗体组合物的每种抗体包含：LC可变区，该LC可变区包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列、与SEQ ID NO:15至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1至10个(例如，1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、1或2个)氨基酸取代的SEQ ID NO:15的变体氨基酸序列。

在示例性方面，抗体组合物的每种抗体包含：HC可变区，该HC可变区包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列、与SEQ ID NO:16至少90％(例如，至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的氨基酸序列、或具有1至10个(例如，1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、1或2个)氨基酸取代的SEQ ID NO:16的变体氨基酸序列。

在示例性方面，抗体组合物包含抗体的不同糖型的不均一混合物。在各种情况下，抗体组合物的特征可以在于其TAF聚糖含量、HM聚糖含量和/或其AF聚糖含量。在各个方面，抗体组合物根据％TAF聚糖、％HM聚糖和/或％非岩藻糖基化聚糖来描述。任选地，抗体组合物的特征可以在于其其他类型聚糖(例如，半乳糖基化糖型、岩藻糖基化糖型等)的含量。

在示例性方面，抗体组合物具有使用方程A计算的％TAF聚糖。在示例性方面，抗体组合物具有在由方程A的X定义的范围内的％TAF聚糖。在示例性情况下，％TAF聚糖在X±0.4内。在示例性方面，抗体组合物具有如在当前披露的方法的确定步骤中确定(例如，测量)的％TAF聚糖。在示例性方面，通过亲水相互作用层析，任选地，通过实例1中描述的方法，确定％TAF聚糖。举例来说，在各种情况下，抗体组合物是小于或约50％(例如，小于或约40％、小于或约30％、小于或约25％、小于或约20％、小于或约15％)的TAF聚糖。在示例性方面，抗体组合物是小于约10％(例如，小于或约9％、小于或约8％、小于或约7％、小于或约6％、小于或约5％、小于或约4％、小于或约3％、小于或约2％)的TAF聚糖。在示例性方面，抗体组合物是约4％至约10％的TAF聚糖。在示例性方面，抗体组合物是约2％至约6％TAF聚糖。在示例性方面，抗体组合物是约2.5％至约5％的TAF聚糖。在示例性方面，抗体组合物是小于或约4％的TAF聚糖。在进一步的示例性方面，抗体组合物是小于或约4％并且大于或约2％的TAF聚糖。在各个方面，％TAF聚糖大于或约1.55％并且小于或约6.95％或者约1.72％至约6.74％。

在示例性方面，抗体组合物具有如使用方程B计算的％非岩藻糖基化聚糖。在示例性方面，抗体组合物具有在由方程B的AF定义的范围内的％非岩藻糖基化聚糖。在示例性情况下，％非岩藻糖基化聚糖在AF±1内。在示例性方面，抗体组合物具有如在当前披露的方法的确定步骤中确定(例如，测量)的％非岩藻糖基化聚糖。在示例性方面，通过亲水相互作用层析，任选地，通过实例1中描述的方法，确定％非岩藻糖基化聚糖。举例来说，在各种情况下，抗体组合物是小于或约5％的非岩藻糖基化聚糖。在示例性方面，％非岩藻糖基化聚糖为约1至约4。在示例性方面，抗体组合物是小于或约4％的非岩藻糖基化聚糖。在示例性方面，抗体组合物是小于或约3.5％的非岩藻糖基化聚糖。

在示例性方面，抗体组合物具有使用方程B计算的％高甘露糖聚糖。在示例性方面，抗体组合物具有在由方程B的HM定义的范围内的％高甘露糖聚糖。在示例性情况下，％高甘露糖聚糖在HM±1内。在示例性方面，抗体组合物具有如在当前披露的方法的确定步骤中确定(例如，测量)的％高甘露糖聚糖。在示例性方面，通过亲水相互作用层析，任选地，通过实例1中描述的方法，确定％高甘露糖聚糖。举例来说，在示例性方面，抗体组合物是小于或约5％的高甘露糖聚糖。在示例性方面，％高甘露糖聚糖为约1至约4。在示例性方面，抗体组合物是小于或约4个高甘露糖聚糖。在示例性方面，抗体组合物是小于或约3.5％的高甘露糖聚糖。

在示例性方面，抗体组合物具有使用方程A或方程B计算的％ADCC。在示例性方面，抗体组合物具有在确定步骤中确定(例如，测量)的％ADCC。在示例性方面，通过基于细胞的定量测定确定％ADCC，该测定测量抗体组合物的抗体在表达抗体抗原并通过抗体的Fc结构域与效应细胞上的Fc-γRIIIA受体衔接的细胞中以剂量依赖性方式介导细胞的细胞毒性的能力，例如，如实例2所述的方法。举例来说，在各种情况下，抗体组合物是约40％至约175％ADCC或约40％至约170％ADCC或约44％至约165％ADCC。在示例性方面，抗体组合物具有大于或约40且小于或约175或小于或约170(任选地，约41至约171)的％ADCC。在示例性方面，抗体组合物具有约30至约185(任选地，约32至约180)的％ADCC。在各个方面，％ADCC大于或约60并且小于或约130。在示例性方面，抗体组合物具有在由方程A或方程B的Y定义的范围内的％ADCC。在各个方面，％ADCC在Y±20内，例如，在Y±19、Y±18、或Y±17内。

关于方程A的％TAF聚糖(X)和％ADCC(Y)，在一些方面，Y大于或约40且小于或约170，并且X大于或约1.55％且小于或约6.95％。在各种情况下，Y大于或约44％且小于或约165％，并且任选地，其中X为约1.72％至约6.74％。

关于方程B的％非岩藻糖基化聚糖(AF)和％高甘露糖聚糖(HM)以及％ADCC(Y)，在一些方面，Y大于或约40且小于或约175，任选地，约41至约171，其中AF为约1至约4并且其中HM为约40至约175。在各种情况下，Y为约30至约185，任选地，约32至约180，其中HM为约1至约4，并且其中AF为约30至约185。

在示例性实施例中，组合物与药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合。因此，本文提供了包含本文所述的重组糖基化蛋白质组合物(例如，抗体组合物或抗体结合蛋白组合物)和药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的药物组合物。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”包括任何标准药物载剂，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂(诸如油/水或水/油乳剂)和各种类型的润湿剂。

在示例性实施例中，抗体组合物由如本文所述在细胞培养物中的有糖基化能力的细胞产生。

其他步骤

在各个方面，本文披露的方法包括其他步骤。例如，在一些方面中，这些方法包括涉及产生、纯化和配制重组糖基化蛋白(例如，抗体)的一个或多个上游步骤或下游步骤。任选地，下游步骤是本文所述或本领域已知的那些下游处理步骤中的任何一个。参见，例如，处理步骤。在示例性实施例中，该方法包括用于生成表达重组糖基化蛋白(例如，抗体)的宿主细胞的步骤。在一些方面中，宿主细胞是原核宿主细胞，例如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，或者在一些方面中宿主细胞是真核宿主细胞，例如酵母细胞、丝状真菌细胞、原生动物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)。此类宿主细胞在本领域中有描述。参见例如，Frenzel等人,Front Immunol[免疫学前沿]4:217(2013)和本文中的“细胞”。例如，在一些情况下，这些方法包括向宿主细胞中引入包含核酸的载体，该核酸包含编码重组糖基化蛋白质或其多肽链的核苷酸序列。

在示例性方面，这些方法包括在细胞培养物中维持细胞，例如，有糖基化能力的细胞。因此，这些方法可以包括进行本文在“在细胞培养物中维持细胞”中描述的任何一个或多个步骤。

在示例性实施例中，本文披露的方法包括用于从培养物中分离和/或纯化重组糖基化蛋白质(例如，重组抗体)的步骤。在示例性方面中，该方法包括一个或多个层析步骤，该一个或多个层析步骤包括但不限于例如亲和层析(例如蛋白A亲和层析)、离子交换层析、和/或疏水性相互作用层析。在示例性方面中，该方法包括用于从包含重组糖基化蛋白质的溶液中产生结晶生物分子的步骤。

在各个方面，本披露的方法包括用于制备组合物的一个或多个步骤，在一些方面中，该组合物包括包含纯化的重组糖基化蛋白质的药物组合物。本文中论述了此类组合物。

在细胞培养物中维持细胞

关于产生本披露的抗体组合物的方法，可以通过在细胞培养物中维持细胞来产生抗体组合物。可以根据适于重组糖基化蛋白质生产的任何一组条件维持细胞培养物。例如，在一些方面，将细胞培养物维持在特定pH、温度、细胞密度、培养体积、溶解氧水平、压力、渗量等下。在示例性方面，将接种前的细胞培养物在CO₂培养箱中在标准加湿条件下在5％CO₂下振荡(例如，以70rpm)。在示例性方面中，在1.5L培养基中以约10⁶个细胞/mL的接种密度接种细胞培养物。

在示例性方面中，本披露的方法包括将有糖基化能力的细胞维持在pH为约6.85至约7.05，例如在各个方面，约6.85、约6.86、约6.87、约6.88、约6.89、约6.90、约6.91、约6.92、约6.93、约6.94、约6.95、约6.96、约6.97、约6.98、约6.99、约7.00、约7.01、约7.02、约7.03、约7.04、或约7.05的细胞培养基中。

在示例性方面中，这些方法包括将细胞培养物维持在30℃和40℃之间的温度下。在示例性实施例中，温度在约32℃至约38℃之间或在约35℃至约38℃之间。

在示例性方面中，这些方法包括将渗透压维持在约200mOsm/kg至约500mOsm/kg之间。在示例性方面中，该方法包括将渗透压维持在约225mOsm/kg至约400mOsm/kg或约225mOsm/kg至约375mOsm/kg之间。在示例性方面中，该方法包括将渗透压维持在约225mOsm/kg至约350mOsm/kg之间。在各个方面，将渗透压(mOsm/kg)维持在约200、225、约250、约275、约300、约325、约350、约375、约400、约425、约450、约475、或约500。

在示例性方面中，这些方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物的溶解氧(DO)水平维持在约20％至约60％氧饱和度下。在示例性情况下，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物的DO水平维持在约30％至约50％(例如，约35％至约45％)氧饱和度下。在示例性情况下，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物的DO水平维持在约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、或约60％氧饱和度下。在示例性方面中，DO水平是约35mm Hg至约85mmHg或约40mm Hg至约80mmHg或约45mm Hg至约75mm Hg。

将细胞培养物维持在任何一种或多种培养基中。在示例性方面中，将细胞培养物维持在适于细胞生长的培养基中和/或为细胞培养物提供根据任何合适的进料方案的一种或多种进料培养基。在示例性方面中，该方法包括将细胞培养物维持在包含葡萄糖、岩藻糖、乳酸盐、氨、谷氨酰胺和/或谷氨酸盐的培养基中。在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物维持在包含浓度低于约1μM的锰的培养基中。在示例性方面中，该方法包括将细胞培养物维持在包含约0.25μM至约1μM锰的培养基中。在示例性方面中，该方法包括将细胞培养物维持在包含可忽略量的锰的培养基中。在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物维持在包含浓度低于或约50ppb的铜的培养基中。在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物维持在包含浓度低于或约40ppb的铜的培养基中。在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物维持在包含浓度低于或约30ppb的铜的培养基中。在示例性方面中，该方法包括在初始细胞培养期期间将细胞培养物维持在包含浓度低于或约20ppb的铜的培养基中。在示例性方面中，培养基包含浓度大于或约5ppb或大于或约10ppb的铜。在示例性方面中，细胞培养基包含甘露糖。在示例性方面中，细胞培养基不包含甘露糖。

在示例性实施例中，细胞培养的类型是补料分批培养或连续灌注培养。然而，本披露的方法有利地不限于任何特定类型的细胞培养。

维持在细胞培养物中的细胞可以是有糖基化能力的细胞。在示例性方面，这些有糖基化能力的细胞是真核细胞，包括但不限于酵母细胞、丝状真菌细胞、原生动物细胞、藻类细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。此类宿主细胞在本领域中有描述。参见例如，Frenzel等人,Front Immunol[免疫学前沿]4:217(2013)。在示例性方面，这些真核细胞是哺乳动物细胞。在示例性方面，这些哺乳动物细胞是非人哺乳动物细胞。在一些方面中，细胞为中国卵巢(CHO)细胞及其衍生物(例如，CHO-K1、CHO pro-3)、小鼠骨髓瘤细胞(例如，NS0、GS-NS0、Sp2/0)、经工程化而缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)活性的细胞(例如，DUKX-X11、DG44)、人胚肾293(HEK293)细胞或其衍生物(例如，HEK293T、HEK293-EBNA)、非洲绿猴肾细胞(例如，COS细胞、VERO细胞)、人子宫颈癌细胞(例如，HeLa)、人骨骼骨肉瘤上皮细胞U2-OS、腺癌人肺泡基底上皮细胞A549、人纤维肉瘤细胞HT1080、小鼠脑肿瘤细胞CAD、胚胎癌瘤细胞P19、小鼠胚胎纤维母细胞NIH 3T3、小鼠纤维母细胞L929、小鼠神经母细胞瘤细胞N2a、人乳腺癌细胞MCF-7、视网膜母细胞瘤细胞Y79、人视网膜母细胞瘤细胞SO-Rb50、人肝癌细胞Hep G2、小鼠B骨髓瘤细胞J558L或幼仓鼠肾(BHK)细胞(Gaillet等人2007；Khan,Adv Pharm Bull[高级药物通报]3(2):257-263(2013))。

没有糖基化能力的细胞也可以例如通过用编码糖基化所必需的相关酶的基因转染它们而转化为有糖基化能力的细胞。示例性酶包括但不限于寡糖基转移酶、糖苷酶、葡糖苷酶I、葡糖苷酶II、钙联蛋白/钙网蛋白、糖基转移酶、甘露糖苷酶、GlcNAc转移酶、半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶。

在示例性实施例中，有糖基化能力的细胞没有进行基因修饰以改变从头途径或补救途径的酶的活性。这两种岩藻糖代谢途径示于图2中。在示例性实施例中，有糖基化能力的细胞没有进行基因修饰以改变以下任何一种或多种的活性：岩藻糖基转移酶(FUT，例如FUT1、FUT2、FUT3、FUT4、FUT5、FUT6、FUT7、FUT8、FUT9)、岩藻糖激酶、GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶(GMD)、和GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-差向异构酶、4-还原酶(FX)。在示例性实施例中，有糖基化能力的细胞没有进行基因修饰敲除编码FX的基因。

在示例性实施例中，有糖基化能力的细胞没有进行基因修饰以改变β(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GNTIII)或GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖还原酶(RMD)的活性。在示例性方面中，有糖基化能力的细胞没有进行基因修饰过表达GNTIII或RMD。

示例性实施例

下面提供了本披露的示例性实施例。

E1一种产生抗体组合物的方法，所述方法包括：

i.确定抗体组合物的％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖；

ii.使用以下方程A基于％TAF计算该抗体组合物的％抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)：

Y＝2.6+24.1*X

[方程A]，

其中Y是％ADCC并且X是在步骤(i)中确定的％TAF聚糖，以及

iii.当Y在目标％ADCC范围内时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

E2.一种产生抗体组合物的方法，所述方法包括

i.确定抗体组合物的％高甘露糖聚糖和％非岩藻糖基化聚糖，

ii.使用以下方程B基于％高甘露糖聚糖和％非岩藻糖基化聚糖计算该抗体组合物的％抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)：

Y＝(0.24+27*HM+22.1*AF)

[方程B]，

其中Y是％ADCC，HM是在步骤(i)中确定的％高甘露糖聚糖，并且AF是在步骤(i)中确定的％非岩藻糖基化聚糖，以及

iii.当Y在目标％ADCC范围内时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

E3.一种产生具有目标％ADCC的抗体组合物的方法，所述方法包括

i.针对该目标％ADCC，使用以下方程A计算目标％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖：

Y＝2.6+24.1*X

[方程A]，

其中Y是目标％ADCC并且X是目标％TAF聚糖，以及

ii.在细胞培养物中维持有糖基化能力的细胞以产生具有目标％TAF聚糖X的抗体组合物。

E4.一种产生具有目标％ADCC的抗体组合物的方法，所述方法包括

i.针对该目标％ADCC，使用以下方程B计算目标％非岩藻糖基化聚糖和目标％高甘露糖聚糖：

Y＝(0.24+27*HM+22.1*AF)

[方程B]，

其中Y是目标％ADCC，HM是目标％高甘露糖聚糖并且AF是目标％非岩藻糖基化聚糖，以及

ii.在细胞培养物中维持有糖基化能力的细胞以产生具有目标％高甘露糖聚糖和目标％非岩藻糖基化聚糖的抗体组合物。

E5.如实施例3或4所述的方法，其中该目标％ADCC在目标％ADCC范围内。

E6.如实施例1、2和5中任一项所述的方法，其中该目标％ADCC范围大于或约40且小于或约170。

E7.如实施例6所述的方法，其中该目标％ADCC范围大于或约44且小于或约165。

E8.如实施例7所述的方法，其中该目标％ADCC范围大于或约60且小于或约130。

E9.如实施例1-4中任一项所述的方法，其中该目标％ADCC范围是Y±20。

E10.如实施例1或实施例3所述的方法，其中该目标％ADCC范围是Y±17。

E11.如实施例2或实施例4所述的方法，其中目标％ADCC范围为Y±18。

E12.一种产生具有％ADCC(Y)的抗体组合物的方法，该％ADCC任选地大于或约40且小于或约170，所述方法包括

i.确定该抗体组合物的％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖(X)，以及

ii.当X等于(Y-2.6)/24.1时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

E13.如实施例13所述的方法，其中X大于或约1.55％且小于或约6.95％。

E14.如实施例13或14所述的方法，其中Y大于或约44％且小于或约165％，并且任选地，其中X为约1.72％至约6.74％。

E15.一种产生具有％ADCC(Y)的抗体组合物的方法，所述方法包括

i.确定该抗体组合物的％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖(X)，以及

ii.选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤，当X等于(Y-2.6)/24.1时，任选地，其中X大于或约X-0.4且小于或约X+0.4，并且其中％ADCC大于约Y-17且小于或约Y+17。

E16.一种产生具有％ADCC的抗体组合物的方法，所述方法包括

i.确定该抗体组合物的％非岩藻糖基化聚糖和％高甘露糖聚糖，以及

ii.当根据以下方程B将AF和HM与Y相关时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤

Y＝(0.24+27*HM+22.1*AF)

[方程B]，

其中Y是％ADCC，HM是在步骤(i)中确定的％高甘露糖聚糖，并且AF是在步骤(i)中确定的％非岩藻糖基化聚糖。

E17.如实施例16所述的方法，其中Y大于或约40且小于或约175，任选地，约41至约171，其中AF为约1至约4并且其中HM为约40至约175。

E18.如实施例16所述的方法，其中Y为约30至约185，任选地，约32至约180，其中HM为约1至约4并且其中AF为约30至约185。

E19.如实施例16所述的方法，其中该抗体组合物的％ADCC在由Y定义的范围内。

E20.如实施例19所述的方法，其中该抗体组合物的％ADCC在Y±18的范围内。

E21.如实施例16、19和20中任一项所述的方法，其中AF为约1至约4。

E22.如实施例21所述的方法，其中该％高甘露糖聚糖是在由HM定义的范围内的值，任选地，其中该范围是HM±1。

E23.如实施例16、19和20中任一项所述的方法，其中HM为约1至约4。

E24.如实施例24所述的方法，其中该％非岩藻糖基化聚糖是由AF定义的范围内的值，任选地，其中该范围是AF±1。

E25.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该％TAF聚糖通过计算该％高甘露糖聚糖和该％非岩藻糖基化聚糖的总和来确定。

E26.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该％高甘露糖聚糖和该％非岩藻糖基化聚糖通过亲水相互作用层析来确定。

E27.如实施例26所述的方法，其中该％高甘露糖聚糖和该％非岩藻糖基化聚糖通过实例1中描述的方法来确定。

E28.如前述实施例中任一项所述的方法，其中通过基于细胞的定量测定确定％ADCC，该测定测量该抗体组合物的这些抗体在表达这些抗体的抗原并通过这些抗体的Fc结构域与效应细胞上的Fc-γRIIIA受体衔接的细胞中以剂量依赖性方式介导细胞的细胞毒性的能力。

E29.如实施例28所述的方法，其中该％ADCC通过实例2中描述的测定来确定。

E30.如实施例1、2和5-19中任一项所述的方法，其中该确定步骤在收获步骤之后进行。

E31.如实施例30所述的方法，其中该确定步骤在层析步骤之后进行。

E32.如实施例31所述的方法，其中该层析步骤是蛋白A层析步骤。

E33.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该一个或多个下游处理步骤包括：稀释步骤、填充步骤、过滤步骤、配制步骤、层析步骤、病毒过滤步骤、病毒灭活步骤或其组合。

E34.如实施例33所述的方法，其中该层析步骤是离子交换层析步骤，任选地，阳离子交换层析步骤或阴离子交换层析步骤。

E35.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该抗体组合物的每种抗体是IgG。

E36.如实施例35所述的方法，其中该抗体组合物的每种抗体是IgG₁。

E37.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该抗体组合物的每种抗体结合肿瘤相关抗原。

E38.如实施例37所述的方法，其中该肿瘤相关抗原包含SEQ ID NO.3的氨基酸序列。

E39.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该抗体组合物的每种抗体是抗CD20抗体。

E40.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该抗体组合物的每种抗体包含：

i.轻链(LC)CDR1，该LC CDR1包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:4至少90％相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:4的变体氨基酸序列，

ii.LC CDR2，该LC CDR2包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:5至少90％相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:5的变体氨基酸序列，

iii.LC CDR3，该LC CDR3包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:6至少90％相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:6的变体氨基酸序列，

iv.重链(HC)CDR1，该HC CDR1包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:7至少90％相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:7的变体氨基酸序列；

v.HC CDR2，该HC CDR2包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:8至少90％相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:8的变体氨基酸序列；以及

vi.HC CDR3，该HC CDR3包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:9至少90％相同的氨基酸序列、或具有1或2个氨基酸取代的SEQ ID NO:9的变体氨基酸序列。

E41.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该抗体组合物的每种抗体包含LC可变区，该LC可变区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列、与SEQ ID NO:10至少90％相同的氨基酸序列、或具有1或10个氨基酸取代的SEQ ID NO:10的变体氨基酸序列。

E42.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该抗体组合物的每种抗体包含HC可变区，该HC可变区包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列、与SEQ ID NO:11至少90％相同的氨基酸序列、或具有1或10个氨基酸取代的SEQ ID NO:11的变体氨基酸序列。

E43.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该抗体组合物的每种抗体包含轻链，该轻链包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列、与SEQ ID NO:12至少90％相同的氨基酸序列、或具有1或10个氨基酸取代的SEQ ID NO:12的变体氨基酸序列。

E44.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该抗体组合物的每种抗体包含重链，该重链包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列、与SEQ ID NO:13至少90％相同的氨基酸序列、或具有1或10个氨基酸取代的SEQ ID NO:13的变体氨基酸序列。

E45.一种产生在目标％ADCC范围内的抗体组合物的方法，所述方法包括:

i.测量包含抗体的不同糖型的一系列样品的％ADCC，

ii.确定该系列的每个样品的％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖，

iii.确定下图的最佳拟合线的线性方程，该图为该系列的每个样品绘制作为如在步骤(ii)中确定的％TAF聚糖的函数的如在步骤(i)中测量的％ADCC，

iv.确定抗体组合物的％TAF，并且然后使用步骤(iii)的线性方程计算％ADCC，以及

v.当在步骤(iv)中计算的％ADCC在目标％ADCC范围内时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

E46.一种产生在目标％非无岩藻糖基化(TAF)范围内的抗体组合物的方法，所述方法包括：

i.测量包含抗体的不同糖型的一系列样品的％ADCC，

ii.确定该系列的每个样品的％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖，

iii.确定下图的最佳拟合线的线性方程，该图为该系列的每个样品绘制作为如在步骤(ii)中确定的％TAF聚糖的函数的如在步骤(i)中测量的％ADCC，

iv.确定抗体组合物的％ADCC，并且然后使用步骤(iii)的线性方程计算％TAF，以及

v.当在步骤(iv)中计算的％TAF在目标％TAF范围内时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

E47.一种确定抗体组合物的％抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的方法，所述方法包括：

i.确定抗体组合物的％总非岩藻糖基化(TAF)聚糖；

ii.使用以下方程A基于％TAF计算该抗体组合物的％ADCC：

Y＝2.6+24.1*X

[方程A]，

其中Y是％ADCC并且X是在步骤(i)中确定的％TAF聚糖，E48.一种确定抗体组合物的％抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的方法，所述方法包括

i.确定抗体组合物的％高甘露糖聚糖和％非岩藻糖基化聚糖，

ii.使用以下方程B基于该％高甘露糖聚糖和该％非岩藻糖基化聚糖计算该抗体组合物的％ADCC：

Y＝(0.24+27*HM+22.1*AF)

[方程B]，

其中Y是％ADCC，HM是在步骤(i)中确定的％高甘露糖聚糖，并且AF是在步骤(i)中确定的％非岩藻糖基化聚糖，以及

E49.如实施例47或48所述的方法，其进一步包括当Y在目标％ADCC范围内时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

E50.一种产生在目标％TAF范围内的抗体组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

i.通过绘制在细胞培养条件下产生的一系列至少5种参考抗体组合物的％ADCC和％TAF聚糖生成最佳拟合图的线性方程，每种参考抗体组合物具有与抗体组合物相同的氨基酸序列；

ii.基于步骤(i)中生成的线性方程和所需的％ADCC活性选择目标％TAF聚糖范围；

iii.在细胞培养条件下培养该抗体组合物；

iv.纯化该抗体组合物；

v.对该抗体组合物进行取样以确定％TAF；以及

vi.确定该抗体组合物的％TAF是否在步骤(ii)的目标％TAF范围内。

E51.如实施例50所述的方法，其进一步包括当在步骤(v)中计算的％TAF在目标％TAF范围内时，选择该抗体组合物进行一个或多个下游处理步骤。

给出以下实例仅用于说明本发明，而不以任何方式限制其范围。

实例

实例1

该实施例描述了确定抗体的N-连接糖基化谱的示例性方法。

该分析方法的目的是通过亲水相互作用层析确定包含该抗体的样品中特定抗体的N-连接糖基化谱。该聚糖谱法是对抗体的N-连接聚糖分布的定量纯度分析。简而言之，使用N-糖苷酶F(PNG酶F)酶促释放N-连接聚糖，末端N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)用荧光团衍生化。然后使用亲水相互作用柱(HILIC)分离标记的聚糖。该分析方法由以下这些步骤组成:(1)使用PNG酶F和可以特异性衍生游离聚糖的荧光团从参考和测试样品中释放和标记N-连接聚糖，(2)将经验证线性范围内的样品负载到HILIC柱上，使用递减有机溶剂的梯度分离标记的N-连接聚糖，以及(3)使用荧光检测器监测聚糖种类的洗脱。

通过进行以下步骤制备标准样品和测试样品：(1)用水稀释样品和对照，(2)加入PNG酶F并孵育样品和对照以释放N-连接聚糖，(3)使用荧光团(如2-氨基苯甲酸)与荧光团标记溶液混合。涡旋并孵育样品和对照，(4)离心以沉淀蛋白并去除上清液，以及(5)干燥并复溶注射溶液中的标记的聚糖。

该测定中使用的试剂是流动相A(100mM甲酸铵，目标pH 3.0)和流动相B(乙腈)。用于执行该方法的步骤的设备具有以下能力：

下面提供了使用亲水相互作用分析1.7μm柱(2.1mm ID X 150mm)进行的HPLC的仪器设置：

如下提供了推荐梯度：

如下提供了系统适用性：

结果报告如下：

图2A(全比例视图)和图2B(放大比例视图)显示了代表性聚糖谱层析图。

实例2

该实例描述了使用工程化效应细胞评估抗CD20抗体的ADCC活性的示例性测定。

该分析方法的目的是确定抗体的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)水平，以％表示。该ADCC生物测定是一种基于细胞的定量测定，该测定测量抗CD20抗体通过与WIL2-S(人B淋巴细胞)上的CD20抗原结合并通过抗体Fc结构域与NK92-M1效应细胞上的FcγRIIIA(158V)受体衔接，以剂量依赖性方式介导表达CD20的B淋巴细胞的细胞毒性的能力。这通过溶细胞颗粒复合物穿孔素/颗粒酶的胞吐作用导致效应细胞的激活和肿瘤细胞的破坏。图3提供了ADCC测定的示意图，图4显示了ADCC测定的代表性剂量反应曲线。在图4中，每个剂量点是3次重复的均值±标准偏差，并且测定信号＝荧光。

该方法由以下步骤组成

标准和测试样品是通过稀释参考标准、测定对照和样品来制备的，以覆盖经验证的剂量范围。

该测定中使用的试剂包括以下，并且提供了每种试剂的组成：

该方法的某些步骤需要具有荧光能力的酶标仪。

系统适用性如下：

结果以％相对ADCC报告。

实例3

该实例描述了一项研究，该研究导致建立了将ADCC与聚糖水平相关的模型。

评估了在小型生物反应器中制备的抗CD20抗体的代表性样品(N＝41)的以下糖型水平：高甘露糖、非岩藻糖基化和半乳糖基化，使用实例1中描述的示例性方法。％总非岩藻糖基化(％TAF)是％高甘露糖和％非岩藻糖基化的总和。通过实例2中描述的测定确定抗CD20抗体的每个代表性样品的ADCC水平。结果见表1。

表1

使用用于统计分析的计算机程序JMP套件(北卡罗来纳州凯里SAS研究所)分析表1的数据。图5A中提供了数据的回归图。绘制数据的最佳拟合线显示在该图中，并且可以通过以下线性方程来描述，方程1

％ADCC＝2.6129696497+24.071940292*％TAF

[方程1]。

图5B中提供了其他统计参数。如该图所示，r²值(r²＝0.88)和p值(p<0.0001)展示了ADCC与TAF之间关联的显著性。

使用方程1和表1的TAF值，计算表1中每个样品的预测％ADCC值。在图5C中，针对预测％ADCC绘制实际ADCC％(列于表1中)。结果证实，总非岩藻糖基化与ADCC之间存在直接关联，较高水平的总非岩藻糖基化导致较高的ADCC活性。

图5D是与图5A相同的图，但用图形描述了95％置信区间(由浅蓝色区域显示)。如图5D所示，大多数数据点落在95％置信区间内。图5E提供了方程1的y截距和斜率的95％置信区的图。

也对使用表1的TAF的各个组分(非岩藻糖基化(AF)和高甘露糖(HM))的数据使用JMP套件进行分析，并且其显示出与ADCC类似的关联。图6A和6B提供了这些数据的关于高甘露糖和非岩藻糖基化的回归图。绘制数据的最佳拟合线显示在图6A和6B中，并且可以通过以下线性方程来描述，方程2：

％ADCC＝0.2358435425+27.030822634*％HM+22.12397042*％AF

[方程2]

图6C中提供了其他统计参数。如该图所示，r²值(r²＝0.88)和p值(p<0.0001)展示了ADCC与TAF之间关联的显著性。

使用方程2和表1的高甘露糖和非岩藻糖基化值，计算表1中每个样品的预测％ADCC值。在图6D中，针对预测％ADCC绘制实际ADCC％(列于表1中)。结果证实，非岩藻糖基化聚糖、高甘露糖和ADCC之间存在直接关联，较高水平的非岩藻糖基化聚糖和高甘露糖导致较高的ADCC活性。非岩藻糖基化聚糖和高甘露糖对ADCC活性有类似的贡献。

ADCC与HM和AF(或TAF)之间的关联对这些聚糖而言有特异性，因为半乳糖基化没有展示出统计学显著关联。图7A是ADCC与半乳糖基化水平之间的回归图。r²值(r²＝0.02)和p值(p<0.3715)展示了缺乏统计学显著性。图7B是绘制为预测ADCC％的函数的实际ADCC(％)(列于表1中)的图。如这些图所示，在ADCC和半乳糖基化之间仅观察到非常弱的关联。

统计分析证实TAF对ADCC活性的贡献最显著。TAF水平与ADCC活性水平的关联同％ADCC与其他聚糖之间的关系非常不同。

实例4

该实例描述了一项研究，该研究验证了将ADCC与TAF相关的模型。

使用表1中大型生物反应器样品的相同抗体的大规模制造样品验证实例3中描述的将ADCC与TAF关联的模型。通过按照实例1中描述的方法测量高甘露糖和非岩藻糖基化水平，然后将两个％相加以获得％TAF水平，来表征每个大规模样品(N＝13)的TAF水平。通过进行实例2中所述的测定来确定每个大规模样品的实验ADCC水平，重复两次以每个样品获得3个值，然后记录3个值的平均值。使用方程1计算预测ADCC。结果提供在下表2中。

表2

*三个值的平均值

如表2中的数据所示，方程1生成的预测ADCC结果与报告的实验结果高度一致。因此，建立了与ADCC和TAF关联的可靠且精确的模型。

实例5

该实例描述了一种新的聚糖模型，其揭示了预测抗CD20抗体的ADCC的基础。

正在开发作为利妥昔单抗的生物类似物的抗CD20抗体。它是一种重组嵌合小鼠/人IgG1单克隆抗体，其特异性结合B细胞上表达的CD20抗原，并且通过多种机制促进B细胞杀伤，其中ADCC是重要的作用机制之一。众所周知，缺乏核心岩藻糖导致ADCC活性增加，而半乳糖基化和高甘露糖也可起作用。通过糖工程研究对N-聚糖对抗CD20抗体ADCC活性的贡献进行了系统评估，并且证实非岩藻糖基化聚糖、高甘露糖和ADCC之间存在直接关联，较高水平的非岩藻糖基化聚糖和高甘露糖导致较高的ADCC活性。然而，通过糖工程产生的样品的聚糖谱可能不完全代表抗CD20抗体的聚糖属性范围，通过捕获抗CD20抗体制造过程中的全部范围，对抗CD20抗体的小规模生物反应器数据集进行了统计评估，以建立代表性的聚糖ADCC模型。使用该方法，它揭示了非岩藻糖基化和高甘露糖显示出相似的与ADCC的关联。将一种新的方法应用于聚糖模型，即使用总非岩藻糖基化(非岩藻糖基化和高甘露糖的总和)来预测抗CD20抗体ADCC。使用大规模制造数据建立并验证了预测表达式(ADCC＝2.6+24.1x总非岩藻糖基化)。由表达式生成的预测ADCC结果与报告的ADCC测定结果高度一致。因此，作为聚糖-ADCC模型建立总非岩藻糖基化和ADCC的关联，并且使过程能够使用聚糖测量作为正交方法来监测ADCC。

该工作的结果为抗CD20抗体和正交法(HPLC聚糖法)之间的功能测定中聚糖与ADCC结果的关联奠定了基础。该数据使安进公司(Amgen)能够继续采用以属性为中心的开发方法和确定的机制来解释结果并为市场应用提供新的属性分析。

使用的方法包括HPLC、ADCC测定和跨职能协作实例6

该实例展示了一项研究，该研究导致建立了将ADCC与二抗的聚糖水平相关的模型。

实例3描述了一项研究，该研究导致建立了将ADCC与结合CD20的IgG1的聚糖水平相关的模型。该研究评估了嵌合单克隆IgG1κ抗体的ADCC与聚糖水平之间的关系，该抗体由人恒定区和鼠可变区组成并且结合TNFα抗原。

使用实例1中描述的示例性方法，评估了在小型生物反应器中制备的二抗(抗TNFα抗体)的代表性样品的以下糖型水平：高甘露糖和非岩藻糖基化。总非岩藻糖基化百分比(％TAF)是％高甘露糖和％非岩藻糖基化的总和。通过实例2中描述的测定确定抗TNFa抗体的每个代表性样品的ADCC水平。使用用于统计分析的计算机程序JMP套件(北卡罗来纳州凯里SAS研究所)分析数据。图8A中提供了数据的回归图。绘制数据的最佳拟合线显示在该图中，并且可以通过以下线性方程来描述，方程3

％ADCC＝9.3+12.47*％TAF

[方程3]。

图8B中提供了其他统计参数。如该图所示，r²值(r²＝0.80)和p值(p<0.0001)展示了ADCC与TAF之间关联的显著性。

使用方程3和测量的TAF值，计算每个样品的预测％ADCC值。在图8C中，针对预测％ADCC绘制实际ADCC％(如实例2中所述测量)。结果证实，总非岩藻糖基化与ADCC之间存在直接关联，较高水平的总非岩藻糖基化导致较高的ADCC活性。

图8D是与图8A相同的图，但用图形描述了95％置信区间(由灰色阴影区域显示)。如图8D所示，大多数数据点落在95％置信区间内。图8E提供了方程3的y截距和斜率的95％置信区的图。

也对使用TAF的各个组分(非岩藻糖基化(AF)和高甘露糖(HM))的数据使用JMP套件进行分析，并且其显示出与ADCC类似的关联。图9A和9B分别提供了这些数据的关于高甘露糖和非岩藻糖基化的回归图。绘制数据的最佳拟合线显示在图9A和9B中，并且可以通过以下线性方程来描述，方程4：

％ADCC＝8.66+12.86*％HM+12.37*％AF

[方程4]

图9C中提供了其他统计参数。如该图所示，r²值(r²＝0.8)和p值(p<0.0001)展示了ADCC与TAF之间关联的显著性。

使用方程4和测量的高甘露糖和非岩藻糖基化值，计算每个样品的预测％ADCC值。在图9D中，针对预测％ADCC绘制实际ADCC％(如实例2中所述测量)。结果证实，非岩藻糖基化聚糖、高甘露糖和ADCC之间存在直接关联，较高水平的非岩藻糖基化聚糖和高甘露糖导致较高的ADCC活性。非岩藻糖基化聚糖和高甘露糖对ADCC活性有类似的贡献。

该实例展示，对于二抗(抗TNFα抗体)，通过统计分析证实TAF对ADCC活性具有非常显著的贡献。

实例7

该实例展示了将ADCC与TAF、HM和/或AF聚糖相关的第二组模型。

实例3和6中的每一个都建立了将两种抗体(抗CD20抗体和抗TNFα抗体)的ADCC与TAF聚糖含量或将其ADCC与HM和AF聚糖含量相关的线性回归模型。在方程1-4中对这些模型进行了数学描述。对于这些方程中的每一个，通过分析每个方程的y截距的p值来评估y截距的重要性。表3提供了方程1-4中的每一个的y截距的p值。

表3

方程	p值
		1	0.6331
2	0.9705
		3	0.3399
4	0.4426

由于每个p值都大于0.05，因此方程1-4的每个y截距都被认为接近于零，并且可以从方程中删除。

鉴于上述情况，将测量的ADCC数据和测量的聚糖数据重新拟合到“无y截距模型”，并评估这些模型的统计学显著性。表4列出了描述两种抗体的ADCC与TAF聚糖之间或ADCC与HM和AF聚糖之间关系的无y截距模型的方程。

表4

如表4所示，无y截距模型具有统计显著性，并且代表了将ADCC与TAF聚糖含量或将ADCC与HM和AF聚糖含量相关联的可替代模型。

表5提供了每个线性回归模型和无y截距模型的斜率。

表5

()中提供了标准化估计值。

如表5所示，两个模型彼此高度一致。每个线性回归模型和无y截距模型中TAF的x截距(24.07070与24.73579)的值非常接近。对于HM(27.03082与27.14941)和AF(22.12397与22.12018)聚糖中的每一个，观察到相同的情况。

实例8

该实例展示了ADCC-TAF模型和ADCC-HM/AF模型是可互换的。

表4的方程6将ADCC与HM和AF聚糖含量相关联，用于计算预测ADCC。针对根据表4的方程5计算的预测ADCC绘制预测ADCC，该方程将ADCC与TAF聚糖含量相关联。结果绘制于图10A中。对表4的方程7和8执行相同的步骤，并且绘制于图10B中。每个图下方提供了最佳拟合线的方程。如这些图和方程所示，模型彼此高度一致(p<0.0001)。斜率接近1.0(0.97或0.98)。这些数据支持可以基于一种聚糖类型(TAF聚糖)与两种聚糖类型(HM和AF)来预测抗体组合物的ADCC。此外，这些数据表明，对于具有目标ADCC的抗体组合物，可以计算目标TAF，并且可以改良HM或AF以实现目标TAF。改良抗体组合物的HM或AF的方法比改良HM和AF两者的组合方法更简单。

本文所引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请、和专利)均通过引用特此并入，引用的程度如同每个参考文献被个别地并且明确地指示通过引用并入并且以其全文在本文阐述。

除非本文中另外指示或上下文明显相矛盾，否则在描述本披露的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用术语“一个/一种(a/an)”和“该(the)”以及类似指示物将视为涵盖单数与复数两者。除非另作描述，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”将视为开放性术语(还即意指“包括(但不限于)”)。

除非本文另外指示，否则在本文引证值的范围仅旨在用作单独提及每个单独的值落在该范围内和每个端点的速记方法，并且每个单独的值和端点被并入本说明书中就像它被单独地在本文引证一样。

除非本文另外指示或上下文另外明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以按任何合适的顺序进行。除非另外要求保护，否则关于本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地描述本披露，而非对本披露的范围施加限制。本说明书中的语言不应当被解释为指示任何未要求保护的要素为实践本披露所必需。

在本文中描述了本披露的优选实施例，包括诸位发明人已知用于实施本披露的最佳模式。在阅读前述描述后，那些优选实施例的变化对于本领域普通技术人员可以变得清楚。诸位发明人预期熟练技术人员视情况采用此类变化，并且诸位发明人旨在以除本文具体描述外的方式实践本披露。因此，本披露包括所附权利要求中叙述的主题的为适用法律所允许的所有修改和等同物。此外，除非本文另外指示或上下文另外明显矛盾，否则本披露涵盖上述要素呈所有可能变化的任何组合。

Claims (36)

1.一种确定抗体组合物的产品质量的方法，其中该抗体组合物的ADCC活性水平是该抗体组合物的产品质量所基于的标准，所述方法包括

i.确定抗体组合物的样品的总非岩藻糖基化（TAF）聚糖含量；

ii. 当在 (i) 中确定的TAF聚糖含量在目标范围内时，确定该抗体组合物的产品质量为可接受和/或实现ADCC活性水平标准，

其中TAF聚糖含量的该目标范围基于 (1) 参考抗体的ADCC活性水平的目标范围和(2) 将该抗体组合物的ADCC活性水平与该抗体组合物的TAF聚糖含量相关联的第一模型，

其中由该第一模型预测的ADCC为由第二模型预测的ADCC的约95%至约105%，其中该第二模型将该抗体组合物的ADCC活性水平与该抗体组合物的高甘露糖（HM）聚糖含量和非岩藻糖基化（AF）聚糖含量相关联。

2.如权利要求1所述的方法，其中由该第一模型预测的ADCC为由该第二模型预测的ADCC的约100%。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中该第一模型的p值小于0.0001和/或该第二模型的p值小于0.0001。

4. 如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中由该第一模型预测的ADCC活性水平为约12Q* %TAF，其中Q为该抗体结合的抗原上的抗体结合位点的数量，并且%TAF是该抗体组合物的TAF聚糖含量。

5.如权利要求4所述的方法，其中Q为2。

6. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中由该第一模型预测的ADCC活性水平为约24 * %TAF。

7. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中由该第二模型预测的ADCC活性水平为约27 * %HM + 约22 * %AF，其中%AF是该抗体组合物的AF聚糖含量，并且%HM是该抗体组合物的HM聚糖含量。

8.如权利要求4所述的方法，其中Q为1。

9. 如权利要求1-4和8中任一项所述的方法，其中由该第一模型预测的ADCC活性水平为约12 * %TAF。

10. 如权利要求1-3、7和8所述的方法，其中由该第二模型预测的ADCC活性水平为约14.8 * %HM + 约12.8 * %AF。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该参考抗体是利妥昔单抗。

12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该参考抗体是英利昔单抗。

13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法是质量控制（QC）测定。

14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法是过程中QC测定。

15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该样品是过程中材料的样品。

16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在收获前或收获后确定该TAF聚糖含量。

17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在层析步骤之后确定该TAF聚糖含量。

18.如权利要求17所述的方法，其中该层析步骤包括捕获层析、中间层析和/或精制层析。

19.如权利要求17或18所述的方法，其中在病毒灭活和中和、病毒过滤、或缓冲液交换后确定该TAF聚糖含量。

20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法是批次释放测定。

21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该样品获得自制造批次。

22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括当该TAF聚糖含量在目标范围内时，选择该抗体组合物进行下游处理。

23. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中当在 (i) 中确定的该TAF聚糖含量不在该目标范围内时，对细胞培养的一种或多种条件进行改良以获得改良的细胞培养物。

24.如权利要求23所述的方法，其进一步包括确定在改良该细胞培养的一种或多种条件后获得的该抗体组合物的样品的TAF聚糖含量。

25. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中当在 (i) 中确定的该TAF聚糖含量不在该目标范围内时，该方法进一步包括 (iii) 改良该细胞培养的一种或多种条件以获得改良的细胞培养物以及 (iv) 确定从该改良的细胞培养物中获得的该抗体组合物的样品的TAF聚糖含量。

26. 如权利要求25所述的方法，其中当在 (i) 中确定的该TAF聚糖含量不在该目标范围内时，该方法进一步包括 (iii) 和 (iv)，直到在 (iv) 中确定的该TAF聚糖含量在该目标范围内。

27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中仅当该TAF聚糖含量在该目标范围外时，才对该抗体组合物进行直接测量该抗体组合物的ADCC活性的测定。

28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中当该TAF聚糖含量在该目标范围内时，不对该抗体组合物进行直接测量该抗体组合物的ADCC活性的测定。

29.如权利要求23或24所述的方法，其中该直接测量ADCC活性的测定为基于细胞的测定，该测定在通过与结合抗原表达细胞和效应细胞两者的抗体结合的效应细胞裂解包含可检测剂的抗原表达细胞时测量可检测试剂的释放。

30.一种监测抗体组合物的产品质量的方法，其包括根据前述权利要求中任一项所述的方法确定抗体组合物的产品质量，第一样品在第一时间点获得，并且第二样品在不同于该第一时间点的第二时间点采集。

31.如权利要求30所述的方法，其中该第一样品和第二样品中的每一个都是过程中材料的样品。

32.如权利要求30所述的方法，其中该第一样品是过程中材料的样品，并且该第二样品是制造批次的样品。

33.如权利要求30所述的方法，其中该第一样品是在改良细胞培养的一种或多种条件之前获得的样品，并且该第二样品是在改良该细胞培养的一种或多种条件之后获得的样品。

34. 一种产生抗体组合物的方法，其包括确定该抗体组合物的产品质量，其中根据前述权利要求中任一项所述的方法确定该抗体组合物的产品质量，其中该样品是过程中材料的样品，其中当在 (i) 中确定的TAF聚糖含量不在该目标范围内时，该方法进一步包括(iii) 改良细胞培养的一种或多种条件以获得改良的细胞培养物以及 (iv) 确定从该改良的细胞培养物中获得的该抗体组合物的样品的TAF聚糖含量，任选地，重复步骤 (ii) 和(iii) 直到该TAF聚糖含量在该目标范围内。

35.如权利要求34所述的方法，其中改良该细胞培养的一种或多种条件以主要改变HM聚糖含量，以实现TAF聚糖含量的该目标范围。

36.如权利要求34所述的方法，其中改良该细胞培养的一种或多种条件以主要改变AF聚糖含量，以实现TAF聚糖含量的该目标范围。

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