MXPA06012264A - Anticuerpos de dominios que inhiben angiogenesis de cd148. - Google Patents

Abstract

Anticuerpos anti-CD148 y region de union a antigeno de los mismos, asi como tambien composiciones farmaceuticas comprendiendo tales anticuerpos y regiones de union a antigeno, se describen. Tambien se describen metodos para utilizar tales anticuerpos y regiones de union a antigeno para unir epitopos CD148 y activar la funcion de CD148, tal como inhibicion de angiogenesis. Epitopos que pueden utilizarse para activar funcion CD148 y actividad anti-angiogenesis tambien se describen, asi como tambien metodos para identificar compuestos que pueden unirlos.

Description

ANTICUERPOS DE DOMINIOS QUE INHIBEN ANGIOGENESIS DE CD148 Referencia Cruzada a Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reclama el beneficio de Solicitud Provisional de EE.UU. No. 60/564,885, presentada el 23 de Abril de 2004; Solicitud Provisional de EE.UU. No. 60/565,158, presentada el 23 de Abril de 2004; Solicitud Provisional de EE.UU. No. 60/571 ,566, presentada el 14 de Mayo de 2004; y Solicitud Provisional de EE.UU. No. 60/585,686, presentada el 6 de Julio de 2004.

Campo Técnico La presente invención se refiere a anticuerpos anti-CD 148 y a epítopos de unión de CD148 utilizados para producir tales anticuerpos. La invención también se refiere a métodos para utilizar tales anticuerpos para inhibir angiogénesis.

Antecedentes Angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos de los existentes, es esencial para muchos procesos fisiológicos y patológicos. Normalmente, la angiogénesis se regula herméticamente por factores pro- y antí-angiogénicos, pero en el caso de enfermedades tales como cáncer, enfermedades neovasculares oculares, artritis, y psoriasis, el proceso puede proseguir. Folkman , J., Nat. Med. , 1 :27-31 (1995).

La angiogénesís se cree que juega un papel importante para sostener la expansión de tejido inflamatorio (panoso) en artritis reumatoide (Walsh ef al. , Artritis Res. , 3: 147-153 (2001 ). De hecho, existe un número de enfermedades conocidas por asociarse con angiogénesis desregulada o indeseada. Ver Carmeliet et al. , Nature 407:249-257 (2000). Tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, neovascularización ocular, tal como retinopatías (incluyendo retinopatía diabética), degeneración macular relacionada con la edad, psoriasis, hemangioblastoma, hemangioma, arteriosclerosis, enfermedad inflamatoria, tal como una enfermedad inflamatoria reumatoide o reumática, especialmente artritis (incluyendo artritis reumatoide), u otros desordenes inflamatorios crónicos, tales como asma crónico, aterosclerosis arterial o después del transplante, endometriosís, y enfermedades neoplásticas, por ejemplo los así llamados tumores sólidos y líquidos (o hematopoyético) (tales como leucemias y linfomas). Otras enfermedades asociadas con angiogénesis indeseada serán aparentes para aquellos expertos en la materia. Aunque muchos sistemas de transducción de señal se han implicado en la regulación de angiogénesis, un sistema de célula endotelial recientemente caracterizado incluyen la quinasa tirosina de receptor CD148 (también referida como DEP-I (fosfata de densidad mejorada), ECRTP (fosfatasa de tirosina de receptor de célula endotelial), HPTP/7, o BYP, dependiendo de la especie y origen de cADN).

CD148 es una proteína de transmembrana de mamífero, perteneciente a una clase de receptores de superficie de célula endotelial conocidos como fosfatasas de tirosina de proteína de receptor de densidad mejorada Tipo lll (PTP). La fosforilación de tirosina de proteína es un elemento esencial en trayectorias de transducción de señal que controlan procesos celulares fundamentales incluyendo crecimiento y diferenciación, progresión del ciclo celular, y función citoesquelética. La unión de un ligando a una quinasa tirosina de proteína receptora (PTK) cataliza la autofosforilación de residuos de tirosína en los substratos objetivo de la enzima, mientras la unión de un ligando a un receptor PTP cataliza defosforilación. El nivel de fosforilación de tirosina intracelular de un substrato objetivo se determina por el equilibrio entre PTK y PTP. PTKs juegan un papel importante para promover el crecimiento celular, mientras PTPs subregulan la actividad de PTKs al inhibir el crecimiento celular. CD148 se ha mostrado que promueve la diferenciación de células progenitoras eritroides, modulan la función de linfocíto cuando se degradan con otras proteínas de señalización, e inhiben la expresión clonal de estirpes de célula de cáncer de mama sobreexpresando la proteína. Confirmando su papel como un inhibidor del crecimiento celular, CD148 también se ha mostrado recientemente que media las señales inhibidoras que bloquean la angiogénesis, una actividad biológica esencial necesaria para migración y proliferación celular, haciendo a CD148 un objetivo importante para tratamiento de cáncer al activar la inhibición mediada por CD 148 de angiogénesis asociada con el crecimiento de tumor. Como otras fosfatasas de tirosina de proteína receptora , CD 148 tiene una porción carboxil intracelular con un dominio catalítico, un dominio de transmembrana único, y un dominio terminal amino extracelular (comprendiendo cinco repeticiones de tipo l l l de fibronectina aleatorias (FN l l l), que tienen un patrón de doblado similar a aq uel de los dominios similares a Ig). Los dominios FN I I l tienen una especificidad absoluta para residuos de fosfotirosina, una alta afinidad para proteínas de substrato, y una actividad específica que es varios ordenes de magnitud mayor a aquella de PTKs. Los dominios FN I I I se cree que participan en interacciones de proteína/proteína para Activación de CD 148, activa autofosforilación de CD 148, que transduce una señal biológica resultando en inhibición de angiogénesís. Patente de EE. U U. No. 6,552, 1 69 describe secuencias de polinucleótidos relacionadas con DEP-1 de humano (CD 148) y anticuerpos policlonales generados contra polipéptidos codificados por los polinucleótidos. Patente de EE. U U. No. 6,248,327 describe el papel de CD 148 en angiogénesis y proporciona un método para modular angiogénesis en un mamífero al administrar composiciones que se unen específicamente al ectodominio de CD 148, y también describe el uso de anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a una región no específica del ectodominio de CD 148 para activar actividad anti-angiogénesís de CD148. Una terapia de activación de CD148 efectiva puede beneficiar a una vasta población de pacientes con cáncer debido a que la mayoría de los tumores sólidos requieren neovascularización para desarrollarse más allá de 1 -2 milímetros en diámetro. Tal terapia puede tener aplicación más amplia en otras enfermedades asociadas con angiogénesis también, tales como retinopatías, artritis, y psoriasis. Existe una necesidad sin desarrollar de identificar nuevos agentes que reconocen específicamente y une CD148. Tales agentes deberían ser útiles para diagnosticar la selección e intervención terapéutica en estados de enfermedad que se asocian con Actividad de CD148. De acuerdo con lo anterior, es un objeto de la presente invención proporcionar agentes de unión específicos de CD148 que activan actividad de CD148. Tales agentes de la presente invención toman la forma de anticuerpos y fragmentos de los mismos que específicamente se unen a epítopos CD148 epítopos. La descripción de todas las patentes, solicitudes de patentes, y otros documentos citados en la presente se incorporan expresamente aquí para referencia en su totalidad.

Descripción de la Invención La presente invención proporciona anticuerpos anti-CD148, o regiones de unión a antígeno de los mismos, que se unen a epítopos de CD 148 incluidos en inhibición de inflamación y/o angiogénesis, tales anticuerpos pueden utilizarse para tratamiento de enfermedades relacionadas con inflamación y angiogénesis. En modalidades particulares, los anticuerpos o regiones de unión a antígeno de los mismos se derivan de anticuerpos humanos o regiones de unión a antígeno de los mismos. En otras modalidades, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se seleccionan del grupo consistiendo de scFv, Fab, F(ab')2, Fv, y anticuerpos de cadena única, y pueden, en particular, ser fragmentos scFv, y más particularmente una fusión scFv-Fc. En otra modalidad particular, el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo es un isotipo IgG, tal como un isotipo lgG2. Un aspecto de la presente invención proporciona anticuerpos aislados o regiones de unión a antígeno de los mismos que se unen a un epítopo CD148 definido por dominios FN III 2, 3, 4 o 5 de CD148. En una modalidad particular, los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos aislados o regiones de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente un epítopo CD148 de humano definido por una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33. En todavía otra modalidad, los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos aislados o regiones de unión a antígeno de los mismos que inhiben de manera competitiva la unión de los anticuerpos monoclonales anteriores a un epítopo CD148 humano definido por una o más de las secuencias de polípéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318- 332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533- 725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33. En una modalidad más particular, los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos aislados o regiones de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a un epítopo CD148 humano definido por una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 324-338 y 321 -335 de SEQ ID NO:33, pero los cuales no se unen a la secuencia de polipéptidos de residuos de aminoácido 324-331 de SEQ ID NO:33. Ejemplos de tales anticuerpos incluyen anticuerpos Ab-1 , Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, y Ab-8. Otro aspecto de la presente invención proporciona células de hibridoma y células de transfectoma que producen el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo de la presente invención, y anticuerpos o región de unión a antígeno de los mismos producidos por tales células de transfectoma e hibridoma. Un hibridoma puede incluir una célula B obtenida de un animal no humano transgénico teniendo un genoma comprendiendo un transgen de cadena pesada de humano y un transgen de cadena ligera de humano fusionadas a una célula inmortalizada. Un transfectoma puede incluir ácidos nucleicos codificando una cadena pesada de humano y una cadena ligera de humano.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un animal no humano transgénico que expresa el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo de la presente invención , en donde el animal no humano transgénico tiene un genoma comprendiendo un transgen de cadena pesada de humano y un transgen de cadena ligera de humano. Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para producir un anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo CD148 humano definido por una o más de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33, comprendiendo: inmunizar un animal no humano transgénico teniendo un genoma comprendiendo un transgen de cadena pesada de humano y un transgen de cadena ligera de humano con un epítopo CD148 humano definido por una o más de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200- 536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33, o una célula expresando tal epítopo CD148 humano, de manera que los anticuerpos se producen por células B del animal; aislar células B del animal; y fusionar las células B con células de mielomuna para formar células de hibridoma inmortales que secretan el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo.

Otro aspecto de la presente invención proporciona una composición farmacéutica comprendiendo el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo de los anticuerpos o regiones de unión a antígeno de los mismos y un vehículo farmacéuticamente aceptable en humanos. Una modalidad particular proporciona un anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo presente en una cantidad terapéuticamente efectiva, tal como en una concentración de al menos aproximadamente 10 //g/ml. Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para inhibir angiogénesis comprendiendo administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo de la presente invención . Otro aspecto de la presente invención proporciona epítopos CD148, la unión a los cuales activa actividad biológica mediada por CD148. Epítopos CD148 de la presente invención incluyen polipéptidos aislados comprendiendo una o más de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO.33, o cualquier fragmento de las mismas que se une a un anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo de la presente invención, en donde el polipéptido no incluye aminoácidos derivados de CD148 diferentes a aquellos seleccionados del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324- 332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200- 725 de SEQ ID NO:33. En otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido aislado consistiendo de una o más de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO.33 o cualquier fragmento de las mismas que se une a un anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo de la presente invención. En todavía otra modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido aislado consistiendo esencialmente de una o más de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ I D NO:33 o cualquier fragmento de las mismas que se une a un anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo de la presente invención. Otro aspecto de la presente invención proporciona un inmunoensayo comprendiendo las etapas de: (a) contactar una muestra prueba con un anticuerpo monoclonal o región de unión a antígeno del mismo capaces de inhibirse de manera competitiva en su unión a CD148 humano por un anticuerpo monoclonal o región de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo CD148 humano definido por una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33 o cualquier fragmento de las mismas que se une a un anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo de la presente invención; y (b) determinar la presencia de CD148 humano en la muestra prueba. Otro aspecto de la invención incluye un método para identificar un compuesto que se une específicamente a un epítopo CD148 humano definido por una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33, comprendiendo: contactar un compuesto prueba con un epítopo CD148 humano definido por una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33 por un tiempo suficiente para formar un complejo y detectar la formación de un complejo al detectar el epítopo CD148 o el compuesto en el complejo, de manera que si un complejo se detecta, un compuesto que se une al epítopo CD148 se identifica. Todavía otro aspecto de la presente invención es un método para identificar un compuesto que se une específicamente a un epítopo CD 148 humano definido por una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33, comprendiendo: proporcionar coordenadas atómicas definiendo una estructura tridimensional de un epítopo CD148 definido por una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318- 332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO.33, y designar o seleccionar compuestos capaces de unir el epítopo CD148 en base a dichas coordenadas atómicas.

Descripción de las Figuras FIGURAS 1 A y IB muestran una superposición de secuencia de aminoácidos codificada y nucleótidos para cadenas, pesada variable (VH) y ligera variable (VL), para un anticuerpo de la presente invención, Anticuerpo No. 1 (Ab-1 ). Regiones sombreadas en la figura resaltan CDR1 , 2, y 3 (de término amino a carboxi, respectivamente). Designaciones de Solicitud y Estructura I indican las secuencias de nucleótidos y aminoácidos, respectivamente. FIGURAS 2A y 2B muestran una superposición de secuencia de aminoácidos codificada y nucleótidos para cadenas, pesada variable (VH) y ligera variable (VL), para Anticuerpo No. 2 (Ab-2). Regiones sombreadas en la figura resaltan CDR1 , 2, y 3 (de termino amino a carboxi, respectivamente). FIGURAS 3A y 3B muestran una superposición de secuencia de aminoácidos codificada y nucleótidos para cadenas, pesada variable (VH) y ligera variable (VL), para Anticuerpo No. 3 (Ab-3). Regiones sombreadas en la figura resaltan CDR1 , 2, y 3 (de termino amino a carboxi, respectivamente). FIGURAS 4A y 4B muestran una superposición de secuencia de aminoácidos codificada y nucleótidos para cadenas, pesada variable (VH) y ligera variable (VL), para Anticuerpo No. 4 (Ab-4). Regiones sombreadas en la figura resaltan CDR1 , 2, y 3 (de termino amino a carboxi, respectivamente). FIGURAS 5A y 5B muestran una superposición de secuencia de aminoácidos codificada y nucleótidos para cadenas, pesada variable (VH) y ligera variable (VL), para Anticuerpo No. 5 (Ab-5). Regiones sombreadas en la figura resaltan CDR1 , 2, y 3 (de termino amino a carboxi, respectivamente). FIGURAS 6A y 6B muestran una superposición de secuencia de aminoácidos codificada y nucleótidos para cadenas, pesada variable (VH) y ligera variable (VL), para Anticuerpo No. 6 (Ab-6). Regiones sombreadas en la figura resaltan CDR1 , 2, y 3 (de termino amino a carboxi, respectivamente). FIGURAS 7A y 7B muestran una superposición de secuencia de aminoácidos codificada y nucleótidos para cadenas, pesada variable (VH) y ligera variable (VL), para Anticuerpo No. 7 (Ab-7). Regiones sombreadas en la figura resaltan CDR1 , 2, y 3 (de termino amino a carboxi, respectivamente). FIGURAS 8A y 8B muestran una superposición de secuencia de aminoácidos codificada y nucleótidos para cadenas, pesada variable (VH) y ligera variable (VL), para Anticuerpo No. 8 (Ab-8). Regiones sombreadas en la figura resaltan CDR1 , 2, y 3 (de termino amino a carboxi, respectivamente).

Meior(es) Modo(s) para Llevar a Cabo la Invención Para que la presente invención puede entenderse más fácilmente, ciertos términos se defínen primero. Las definiciones adicionales se establecen por toda la descripción detallada. Definiciones Unidades, prefijos, y símbolos pueden denotarse en su forma aceptada Sl. Al menos que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3'; secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxi. Los rangos numéricos en la presente son inclusivos de los números definiendo el rango e incluyen y soportan cada número entero dentro del rango definido. Los aminoácidos pueden referirse en la presente por ya sea sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura IUPAC-lUBMB. Los nucleótidos, del mismo modo, pueden referirse por sus códigos de letra única comúnmente aceptados. Al menos que se observe de otra manera, los términos "un" o "una" son para construirse como significado "al menos uno(a) de". Los encabezados de la sección utilizados en la presente son para propósitos organizacionales solamente y no se construyen como limitantes de la materia sujeto descrita. Todos los documentos, o porciones de documentos, citados en esta solicitud, ¡ncluyendo pero no limitándose a patentes, solicitudes de patentes, artículos, libros, y tratados, se incorporan de manera expresa en la presente por referencia en su totalidad para cualquier propósito. En el caso de cualquier discrepancia de secuencia de aminoácidos o nucleicos dentro de la solicitud, las figuras controlan. Las técnicas estándar se utilizan para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótido, y cultivo de tejido y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan de acuerdo a las especificaciones del fabricante o como se realiza comúnmente en la materia o como se describe en la presente. Las técnicas anteriores y procedimientos se realizan generalmente de acuerdo a métodos convencionales bien conocidos en la materia y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y tratan por toda la presente invención. Ver, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), que se incorpora en la presente para referencia. Las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética, y química farmacéutica y medicinal, descritas en la presente son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la materia. Las técnicas estándar se utilizan para síntesis química, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y suministro, y tratamiento de pacientes. Como se utiliza de acuerdo con la presente descripción, los siguientes términos, al menos que se indique de otra manera, deben entenderse por tener los siguientes significados: El término "CD148 humano" es la proteína identificada como ECRTP/DEP humano en Ostman et al., Proc Nati Acad Sci USA 91 :9680-9684 (1994), incorporada para referencia en la presente, incluyendo variantes alélicas de la misma. Por "dominio extracelular de CD 148 humano" se entiende la porción de CD148 humano localizada entre aproximadamente residuos 36 a 973 (residuos 1 a 35 siendo la secuencia guía y no presente en la forma madura) de NCBI (National Center for Biotechnology Information) acceso AAB36687 versión AAB36687.1 Gl : 1685075, presentada el 26 de Noviembre de 1996, incorporada para referencia en la presente y disponible en la red mundial en ncbi.nlm.nih.gov. El término "anticuerpo" incluye tanto inmunoglobulinas glicosiladas como no glicosiladas de cualquier isotipo o subclase o combinación de las mismas, incluyendo humana (incluyendo anticuerpos injertados con CDR), humanizadas, quiméricas, multiespecíficas, monoclonales, políclonales, u oligómeros de las mismas, irrespectivo de si tales anticuerpos se producen, en totalidad o en parte, a través de inmunización, a través de tecnología recombinante, por medio de medios sintéticos in vitro, o de otra manera. De esta manera, el término "anticuerpo" incluye aquellos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina de humano o un hibridoma preparado de los mismos, (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transfectada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpo combinatoria, recombinante y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que incluyen división de secuencias de gen de inmunoglobulina a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de ¡nmunoglobulina de línea germinal de dos especies distintas de animales. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos pueden someterse a mutagénesis in vitro (o, cuando un animal transgénico para secuencias de inmunoglobulina de humano, se utiliza, mutagénesis somático in vivo) y de esta manera las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos son secuencias que, mientras se derivan de y relacionan con las secuencias de VH y VL de línea germinal de una especie particular (por ejemplo, humano), pueden no existir de manera natural dentro del repertorio in vivo de línea germinal de anticuerpo de las especies. Un anticuerpo completo es una glicoproteína comprendiendo al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de dísulfuro, o una región de unión a antígeno de la misma. Cada cadena pesada se comprende de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH) y una región constante de cadena pesada, comprendida de tres dominios (abreviados en la presente como CH 1 , CH2 y CH3). Cada cadena ligera se comprende de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL) y una región constante de cadena ligera, comprendida de un dominio (abreviada en la presente como CL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilídad, denominadas regiones de determinación de complementariedad (CDR), interespaciadas con regiones que son más conservadas, denominadas regiones de estructura (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDRs y cuatro FRs, instaladas de término amino a término carboxi en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la ¡nmunoglobulina a tejidos huésped o factores, ¡ncluyendo varias células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1 q) del sistema complemento clásico. Una secuencia de aminoácidos que es substancialmente la misma como una CDR de cadena pesada o ligera muestra una cantidad considerable o grado de identidad de secuencia cuando se compara con una secuencia de referencia y contribuye favorablemente a unión específica de un antígeno unido específicamente por un anticuerpo teniendo la secuencia de referencia. Tal identidad se conoce definitivamente o se reconoce como representando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo monoclonal humano particular. Substancialmente, la misma secuencia de aminoácidos CDR de cadena ligera y pesada puede tener, por ejemplo, menores modificaciones o substituciones conservadoras de aminoácidos siempre que la habilidad para unirse a un antígeno particular se mantenga. El término "anticuerpo monoclonal humano" se propone incluir un anticuerpo monoclonal con secuencias de aminoácidos CDR substancialmente de humano producidas, por ejemplo, por métodos recombinantes, por linfocitos o por células de hibridoma. El término "región de unión a antígeno" de un anticuerpo significa uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la habilidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, CD148) que se une específicamente por un anticuerpo de referencia, como se describe en la presente. Una "región de unión a antígeno" de un anticuerpo puede incluir, por ejemplo, polipéptidos comprendiendo cadenas pesadas y ligeras individuales y fragmentos de las mismas, tales como regiones VL, VH y Fd; fragmentos monovalentes, tales como regiones Fv, Fab, y Fab'; fragmentos bivalentes tal como F(ab')2; anticuerpos de cadena única, tales como regiones Fv de cadena única (scFv); fragmentos Fc; diacuerpos, Fd (consistiendo de los dominios VH y CH 1 ), maxicuerpos (scFV bivalente fusionado con el término amino de Fc (dominios CH2-CH3) de lgG1 ) y dominios de región de determinación de complementariedad (CDR). Tales términos se describen, por ejemplo, en Harlow and Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor .Laboratory, N. Y. (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensíve Desk Reference (Myers, R. A. (ed.), New York: VCH Publisher, Inc.); Huston et al., Cell Bíophysics, 22: 189-224 (1993); Pluckthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) y en Day, E. D., Advanced Imníunochemistry, Second Ed. , Wiley-Liss, Inc. , New York, N.Y. (1990), que se incorporan en la presente para referencia. El término "región de unión a antígeno" también incluye, por ejemplo, fragmentos producidos por digestión de proteasa o reducción de un anticuerpo monoclonal humano y por métodos de ADN recombinante conocidos por aquellos expertos en la materia. Un experto en la materia conoce que los límites exactos de un fragmento de un anticuerpo monoclonal humano puede ser variable, siembre que el fragmento mantenga una actividad funcional. Utilizando métodos recombinantes bien conocidos, un experto en la materia puede formar un ácido nucleico para expresar un fragmento funcional con cualquier punto final deseado para una aplicación particular. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican para genes separados, pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite hacerse como una cadena de proteína única en la cual el par de regiones VL y VH para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv); ver por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos de cadena única también se proponen para comprenderse dentro del término "región de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por aquellos con experiencia en la materia, y los fragmentos se seleccionan para utilidad en la misma manera como los anticuerpos intactos. Tales fragmentos incluyen aquellos obtenidos por eliminaciones de terminal amino y/o terminal carboxi, pero donde la secuencia de aminoácidos restante es substancialmente idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia que ocurre de manera natural deducida, por ejemplo, de una secuencia de cADN de longitud completa. Las regiones de unión a antígeno también incluyen fragmentos de un anticuerpo que retienen al menos una de las secuencias de cadena pesada (por ejemplo, 1 , 2, 3 o más) y/o al menos una de las secuencias de cadena ligera (por ejemplo, 1 , 2, 3 o más) para una región de determinación de complementariedad particular (CDR) (es decir, al menos una o más de CDR1 , CDR2, y/o CDR3 de la cadena pesada y/o ligera). Fusiones de CDR conteniendo secuencias para una región Fc (o una pesada constante 2 (CH2) o constante pesada 3 (CH3) conteniendo región de la misma) se incluyen dentro del alcance de esta definición incluyendo, por ejemplo, scFV fusionado, directa o indirectamente, a un Fc se incluyen en la presente. Una región de unión a antígeno es inclusiva de, pero no se limita a, aquellas derivadas de un anticuerpo o fragmento del mismo (por ejemplo, por digestión enzimática o reducción de enlaces de disulfuro), sintéticamente producidas utilizando métodos recombinantes (por ejemplo, transfectomas), creados a través de medios sintéticos in vitro (por ejemplo, resinas Merrifield), combinaciones de las mismas, o a través de otros métodos. Las regiones de unión a antígeno también pueden comprender fragmentos múltiples, tales como fragmentos CDR, enlazados juntos de manera sintética, química, o de otra manera, en la forma de oligómeros. De esta manera, las regiones de unión de la presente invención incluyen polipéptidos producidos por cualquier número de métodos que comprende al menos una CDR de una cadena VH o VL de la presente invención (por ejemplo, Ab-1 a Ab-8). El término "fragmento VL " significa un fragmento de la cadena ligera de un anticuerpo monoclonal humano que incluye toda o parte de la de la región variable de cadena ligera, incluyendo las CDRs. Un fragmento VL puede incluir además secuencias de región constante de cadena ligera. El término "fragmento Fd" significa un fragmento de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal humano que incluye toda o parte de la región variable de cadena pesada VH, incluyendo CDRS. Un fragmento Fd puede incluir además secuencias de región constante de cadena pesada CH 1 . El término "fragmento Fv" significa un fragmento de unión a antígeno monovalente de un anticuerpo monoclonal humano, incluyendo toda o parte de las regiones variables de las cadenas, pesada y ligera. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras incluyen, por ejemplo, CDRs. Por ejemplo, un fragmento Fv incluye toda o parte de la región variable terminal amino de aproximadamente 1 1 0 aminoácidos de ambas cadenas pesadas y ligeras. El término "fragmento Fab" significa un fragmento de unión a antígeno monovalente de un anticuerpo consistiendo de los dominios VL, VH , CL y CH 1 , que es más largo que un fragmento Fv. Por ejemplo, un fragmento Fab incluye las regiones variables, y toda o parte del primer dominio constante de las cadenas, pesada y ligera. De esta manera, un fragmento Fab incluye adicionalmente, por ejemplo, residuos de aminoácido de aproximadamente 1 1 0 a aproximadamente 220 de las cadenas, pesada y ligera. El término "fragmento Fab"' significa un fragmento de unión a antígeno monovalente de un anticuerpo monoclonal humano que es más largo que un fragmento Fab. Por ejemplo, un fragmento Fab' incluye toda la cadena ligera, toda la región variable de la cadena pesada, y toda o parte de los dominios constantes, primero y segundo, de la cadena pesada. Por ejemplo, un fragmento Fab' puede incluir adicionalmente algunos o todos de los residuos de aminoácido 220 a 330 de la cadena pesada. El término "fragmento F(ab')2" significa un fragmento de unión a antígeno bivalente de un anticuerpo monoclonal humano comprendiendo dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de articulación. Un fragmento F(ab')2 incluye, por ejemplo, todas o parte de las regiones variables de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, y puede incluir además todos o parte de los primeros dominios constantes de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. El término "fragmento dAb " significa un fragmento consistiendo del dominio VH, como se describe por Ward et al. , (1989) Nature 341 :544-546). El término "CDR" significa los sitios de combinación de antígeno no contiguo encontrados dentro de la región variable de ambos polipéptidos de cadena pesada y ligera. Esta región particular se ha descrito por Kabat et al. , U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia ef al., J. Mol. Biol. 196:901 -917 (1987) y adicionalmente por MacCallum ef al., J. Mol . Biol. 262:732-745 (1996), que se incorporan en la presente para referencia, en donde las definiciones incluyen sopreposición o subconjunto de residuos de aminoácido cuando se comparan entre sí. Sin embargo, la aplicación de cualquier definición para referirse a un CDR de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo se propone para estar dentro del alcance del término como se define y utiliza en la presente. Los números de residuo de aminoácido exacto que comprenden un CDR particular variará dependiendo de la estructura de CDR. Aquellos expertos en la materia pueden determinar de manera rutinaria que los residuos comprenden un CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de región variable del anticuerpo. Aquellos expertos en la materia pueden comparar dos o más secuencias de anticuerpos al definir regiones o posiciones de aminoácido individuales de las secuencias respectivas con la misma definición CDR. El término "injertado con CDR" se refiere a un anticuerpo o región de unión a antígeno en la cual las CDRs derivadas de una especie se insertan en la estructura de una especie diferente, tales como CDRs de murino injertadas en una estructura humana (un anticuerpo "humano"). El término "análogo" significa polipéptidos que se comprende de un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene identidad substancial a una porción de una secuencia de aminoácidos deducida y que tiene al menos una de las siguientes propiedades: (1 ) unión específica a CD148, bajo condiciones de unión adecuadas, (2) habilidad para bloquear ligandos CD 148 de unión a CD148, o (3) habilidad para inhibir angiogénesis mediada por CD148. Típicamente, los análogos de polipéptido comprenden una substitución de aminoácido conservada (o adición o eliminación) con respecto a la secuencia que ocurre de manera natural. Los análogos típicamente son al menos 20 aminoácidos de largo, preferentemente al menos 50 aminoácidos de largo o más largos, y con frecuencia son tan largos como un polipéptído que ocurre de manera natural de longitud completa. El término "aislado" significa separado de uno o más compuestos que se encuentran con el anticuerpo o polipéptido en naturaleza o en una reacción sintética utilizada para producir el anticuerpo incluyendo, por ejemplo, un reactivo, precursor u otro producto de reacción, y preferentemente substancialmente libre de cualquier otro polipéptido mamífero contaminante que interferiría con su uso terapéutico o de diagnóstico. Un agente aislado también incluye un agente substancialmente puro. El término puede incluir moléculas que ocurren de manera natural tales como productos de reacciones biosintéticas o moléculas sintéticas. Un anticuerpo también se considera "aislado", por ejemplo, cuando está substancialmente libre de otros anticuerpos teniendo diferentes especificidades antigénicas. También, una substancia se "aisla" si se une o conjuga con un polipéptido u otra substancia a la cual no se une en naturaleza. El término "substancialmente puro" significa una substancia que es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición) y comprende al menos aproximadamente 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromolares presentes. Generalmente, una composición substancialmente pura comprenderá más del 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, o alternativamente más de aproximadamente 85%, 90%, 95%, y 99%. Una substancia se purifica para homogeneidad esencial (especies contaminantes no puede detectarse en la composición por métodos de detección convencionales) en donde la composición consiste esencialmente de una especie macromolecular única. De manera similar, una substancia se "aisla" si en el curso de fabricación o formulación se "aisla" o "está substanciaimente pura" como se describe arriba, y después se combina con otros agentes en una composición bien definida, sin importar la substancia en la composición bien definida, no es la especie predominante presente. Como se utiliza en la presente, los términos "se une específicamente" y "unión específica" significan que un compuesto preferentemente o selectivamente reconoce y un epítopo CD148 madura, de longitud completa o longitud parcial, o un ortólogo del mismo, de manera que su afinidad (como se determina mediante, por ejemplo, Afinidad ELISA o ensayos BIAcore como se describe en la presente) o su capacidad de neutralización (como se determina mediante, por ejemplo, ensayos ELISA de Neutralización, descritos en la presente, o ensayos similares) es al menos 10 veces tan grande, pero opcionalmente 50 veces tan grande, 100, 250 o 500 veces tan grande, o aún al menos 1000 veces tan grande como la afinidad o capacidad de neutralización de la misma para cualquier otro polipéptido, en donde la porción de péptido del pepticuerpo se fusiona primer a una porción Fc de humano para evaluación en tal ensayo. Típicamente, el anticuerpo se une con una afinidad de al menos aproximadamente 1 x107 M"1 , y se une al antígeno predeterminado con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad para unirse a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) diferente a su antígeno predeterminado o un antígeno cercanamente relacionado. Como se utiliza en la presente, un anticuerpo "reconociendo" o "específico para" un antígeno se considera equivalente a "uniéndose específicamente" a un antígeno.

Un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo especificado, isoforma o variante de CD148 de humano puede, sin embargo, tener aún reactividad cruzada a otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, homólogos de especies CD148) y aún se consideran para "unir específicamente" el epítopo CD148 especificado. El término "epítopo" se refiere a esa porción de cualquier molécula capaz de reconocerse por y unirse por un agente de unión específico, por ejemplo, un anticuerpo, en una o más de las regiones de unión a antígeno del agente de unión. Los epítopos usualmente consisten de agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y usualmente tienen características estructurales tridimensionales, así como también características de carga específicas. Los epítopos conformacíonales o no conformacionales se distinguen en que la unión al anterior pero no al último se pierde en la presencia de solventes desnaturalizantes. Un anticuerpo se considera unirse específicamente a un antígeno cuando la constante de disasociación es menor a o igual a aproximadamente 1 µM, preferentemente menos de o igual a aproximadamente 100 nM y más preferentemente menos de 10 nM. Los anticuerpos y regiones de unión a antígeno de tales anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos y regiones de unión a antígeno de los mismos que se generan utilizando los determinantes eptitópícos definidos en la presente, o que se generan utilizando determinantes epitópicos teniendo identidad substancial a los determinantes epitópicos defínidos en la presente. En este contexto, el término "identidad substancial" significa que las secuencias comparten identidad suficiente que un anticuerpo que se une al determinante epítópico modificado inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo de los determinantes epitópicos descritos en la presente. La frase "inhibe competitivamente unión" significa que un anticuerpo reconoce, une a o tiene inmunoespecificidad para el mismo, o substancialmente el mismo, epítopo o fragmento del mismo como otro anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo. En el contexto de la presente invención, un anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo que inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un epítopo CD148 humano definido por la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO.33, es capaz de competir de manera medible para unirse a CD148. Típicamente, la inhibición competitiva se mide al terminar la cantidad de un anticuerpo de referencia o región de unión a antígeno que se une a la proteína objetivo (por ejemplo, CD148 humano) en la presencia del anticuerpo probado o región de unión a antígeno del mismo. Usualmente el anticuerpo probado o región de unión a antígeno probado está presente en exceso, tal como exceso de 5, 10, 25, o 50 veces. Los anticuerpos competitivamente unidos o regiones de unión a antígeno inhibirán, cuando estén presentes en exceso, la unión específica de un anticuerpo de referencia o región de unión a antígeno al dominio extracelular de CD 148 humano por un grado estadísticamente significativo, con frecuencia al menos 10%, 25%, 50%, 75%, 90% o mayor. Los ensayos de inhibición competitivos se conocen bien en la materia. Ver, por ejemplo, Harlow and Lañe (1998), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York. Como se utiliza en la presente, inhibición de unión comprende inhibición/bloqueo tanto parcial como completo. La inhibición y bloqueo también se proponen para incluir cualquier disminución medible en la afinidad de unión de un anticuerpo antí-CD148 a CD148 cuando en contacto con un anticuerpo anti-CD 148 de la presente invención, por ejemplo, el bloqueo de unión por al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%, o 100%. La identificación de uno o más anticuerpos que inhibe competitivamente la unión de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un epítopo CD148 humano definido por la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistiendo de aminoácidos 447-725, 533-725, 715-973, 324-335, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33 es una materia técnica de avance directa dada la determinación de los epítopos anteriores definidos por tales aminoácidos. En la generación de un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo CD148 humano definido por la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistiendo de aminoácidos 31 5-329, 31 8-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 71 5-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ I D NO:33, identificación de anticuerpos que inhiben competitivamente la unión de aquellos anticuerpos a CD 148 se determina fácilmente de manera simple por comparación con el anticuerpo de referencia. La identificación de los anticuerpos reactivos cruzados puede determinarse fácilmente utilizando cualquiera de una variedad de ensayos de selección inmunológicos en los cuales la competición de anticuerpo puede valorarse. Tales ensayos son rutina en la materia y se describen además en la presente en detalle. Pat. de EE. U U. No. 5,660,827, emitida el 26 de Agosto de 1 997, se incorpora específicamente en la presente para referencia para propósitos de incluir aún complementación adicional de la presente enseñanza concerniente a como hacer anticuerpos que se unen al mismo o substancialmente el mismo epítopo como un anticuerpo dado. Por ejemplo, donde los anticuerpos pruebas a examinarse se obtienen de diferentes fuentes animales, o aún son de un ¡sotipo diferente, un ensayo de competición simple puede emplearse en el cual los anticuerpos de prueba y control se mezclan (o pre-adsorben) y aplican a una composición de antígeno CD 148 que contiene un epítopo CD 148 como se describe en la presente. De esta manera, procedimientos basados en ELISAs y Western blotting son adecuados para usarse en tales estudios de competición simple. En ciertas modalidades, uno podría pre-mezclar los anticuerpos control con cantidades variables de los anticuerpos prueba (por ejemplo, 1 : 10 o 1 : 100) por un periodo de tiempo antes de aplicar a una composición de antígeno. En otras modalidades, las cantidades de control y variables de anticuerpos prueba pueden mezclarse simplemente durante la exposición a la composición de antígeno. En cualquier caso, al utilizar especies o anticuerpos secundarios de isotípo uno podría ser capaz de detectar solamente los anticuerpos control unidos, la unión de los cuales se reducirá por la presencia de un anticuerpo prueba que reconoce substancialmente el mismo epítopo. Para conducir un estudio de competición de anticuerpo entre un anticuerpo de control y cualquier anticuerpo prueba (irrespectivo de especies o isotipo), uno puede primer marcar el control con una marca detectable, tal como, por ejemplo, bíotin o una marca enzimática (o aún radioactiva) para permitir la identificación subsiguiente. En estos casos, uno podría pre-mezclar o incubar los anticuerpos control marcados con los anticuerpos prueba a examinarse en varias proporciones (por ejemplo, 1 :10 o 1 :100) y (opcíonalmente después de un periodo de tiempo adecuado), entonces ensayar la reactividad de los anticuerpos control marcados y comparar esto con un valor de control en el cual ningún anticuerpo prueba potencialmente no competente se incluye en la incubación. El ensayo puede de nuevo ser cualquiera de un rango de ensayos inmunológicos en base a la hibridación de anticuerpo, y los anticuerpos control se detectarían por medios para detectar su marca , por ejemplo , utilizando streptavidin en el caso de anticuerpos biotiniladas o al utilizar un substrato cromogénico en conexión con una marca enzimática (tal como substrato de 3,3'5,5'-tetrametilbenzidína (TMB) con enzima de peroxidasa o al detectar simplemente una marca radioactiva . Un anticuerpo que se une al mismo epítopo como los anticuerpos control será capaz de competir efectivamente para unión y de esta manera reducirá significativamente la unión de anticuerpo de control , como se evidencia por una reducción en marca unida . La reactividad de los anticuerpos control (marcados) en la ausencia de un anticuerpo completamente ¡rrelevante sería el valor alto de control. El valor bajo de control se obtendría al incubar los anticuerpos marcados con anticuerpos no marcados de exactamente el mismo tipo, cuando la competición ocurriría y reduciría la unión de los anticuerpos marcados. En un ensayo de prueba, una reducción significativa en reactividad de anticuerpo marcado en la presencia de un anticuerpo prueba es indicativa de un anticuerpo prueba que reconoce el mismo epítopo, es decir, uno que "reacciona en cruce" con el anticuerpo marcado. La frase "inhibe angiogénesis" significa una reducción estadísticamente significativa en el nivel de angiogénesis relativa a un control sin tratar. Reducciones ejemplificativas son de al menos 5 a 99% , y de esta manera incluyen al menos 1 0%, 20% , 30%, 40%, 50% , 60%, 70% , 80% , o 90% de reducción en angiogénesís relativa a un control negativo. Los ensayos funcionales ampliamente aceptados de angiogénesis tal como el ensayo de microcavidad corneal y el ensayo de migración planar de célula endotelial microvascular renal de humano (H RMEC) se conocen en la materia. Ver, por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 5,712,291 y 5,871 ,723. Brevemente, un ensayo de migración planar HRMEC es un cierre de herida, tal ensayo puede utilizarse para cuantificar la inhibición de angiogénesis por anticuerpos o regiones de unión a antígeno de la presente invención in vitro. En este ensayo, la migración celular endotelial se mide como la tasa de cierre de una herida circular en una monocapa de célula cultivada. La tasa de cierre de herida es lineal, y se regula dinámicamente por agentes que estimulan e inhiben la angiogénesis in vivo. Un ensayo de cavidad corneal de ratón también puede utilizarse para cuantificar la inhibición de angiogénesis por anticuerpos o regiones de unión a antígeno de la presente invención in vivo. En este ensayo, los agentes a probarse para actividad angiogénica o anti-angiogénica se inmovilizan en una forma de liberación lenta en una bolita de hidrón, que se implanta en microcavldades creadas en el epitelio corneal de ratones anestesiados. La vascularización se mide como la apariencia, densidad, y grado de crecimiento en vaso del limbo corneal vascularizado en la cornea normalmente avascular. Se entiende que los anticuerpos de la presente invención pueden modificarse, de manera que son substancialmente idénticos a las secuencias de polipéptidos de anticuerpo, o fragmentos de las mismas, y aún unirse a epítopos CD148 de la presente invención.

Secuencias de polipéptído son "substancíalmente idénticas" cuando, alineadas óptimamente utilizando tales programas como GAP o BESTFIT utilizando pesos de espacio de falla, comparten al menos 80 por ciento de identidad de secuencia, al menos 90 por ciento de identidad de secuencia, al menos 95 por ciento de identidad de secuencia, o al menos 99 por ciento de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de residuo que no son idénticas difieren por substituciones de aminoácido conservadoras. Las substituciones de aminoácido conservadoras se refiere a la capacidad de intercambio de residuos teniendo cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos teniendo cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina, e ¡soleucina; un grupo de aminoácidos teniendo cadenas laterales alifáticas-hidroxil es serina y treonina; un grupo de aminoácidos teniendo cadenas laterales conteniendo amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos teniendo cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina, y triptofan; un grupo de aminoácidos teniendo cadenas laterales básicas es lisina, arginina, e histidina; y un grupo de aminoácidos teniendo cadenas laterales conteniendo azufre es cisteína y metionina. Grupos de substitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valina-leucína-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutámico-aspártico, y asparagina-glutamina. Como se trata en la presente, variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de anticuerpos o moléculas de ¡nmunoglobulina se contemplan como comprendiéndose por la presente invención, proporcionado que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantienen al menos 75%, más preferentemente al menos 80%, 90%, 95%, y más preferentemente 99%. En particular, reemplazos de aminoácido conservadoras se contemplan. Los reemplazos conservadores son aquellos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que se relacionan en sus cadenas laterales. Los aminoácidos generalmente codificados son generalmente divididos en familias: (1 ) acidas (aspartato, glutamato); (2) básicas (lisina, arginina, histidina); (3) no polares (alanina, valina, leucina, ¡soieucina, prolina, fenilalanína, metionina, triptofan); y (4) polares sin cargar (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). Familias más preferidas son: serina y treonina son familia hidroxi alifática; asparagina y glutamina son una familia conteniendo amida; alanina, valina, leucína e isoleucina son una familia alifática; y fenilalanina, triptofan, y tirosina son una familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no tendrá un efecto principal en la unión o propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no incluye un aminoácido dentro de un sitio de estructura. Si un cambio de aminoácido resulta en un péptido funcional, puede fácilmente determinarse al analizar la actividad específica del derivado de polipéptido. Los ensayos se describen en detalle en la presente. Los fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina pueden prepararse fácilmente por aquellos de experiencia en la materia . Los términos amino y carboxi de fragmentos o análogos ocurren cerca de los límites de dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse por comparación de los datos de secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos a bases de datos de secuencia patentadas o públicas. Preferentemente, los métodos de comparación computarizados se utilizan para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteína predicha que ocurren en otras proteínas de estructura conocida y/o función . Métodos para identificar secuencias de proteína que se doblan en una estructura tridimensional se conocen. Bowie ef al. Science 253: 164 (1991 ). De esta manera, los ejemplos anteriores demuestran que aquellos expertos en la materia pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que pueden utilizarse para definir dominios estructurales y funcionales de acuerdo con la invención. Las substituciones de aminoácido preferidas son aquellas que: (1 ) reducen la susceptibilidad a proteolisis, (2) reducen susceptibilidad a oxidación, (3) alteran afinidad de unión par formar complejos de proteína, (4) alterar afinidades de unión , y (4) conferir o modificar otras propiedades funcionales o fisicoquímicas de tales análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia diferente a la secuencia de péptido que ocurre de manera natural. Por ejemplo, substituciones de aminoácido múltiple o única (preferentemente substituciones de aminoácido conservadoras) pueden hacerse en la secuencias de péptidos que ocurren de manera natural (preferentemente en la porción del polipéptido fuera del(los) dominio(s) formando contactos intermoleculares. Una substitución de aminoácido conservadora no debe cambiar substancialmente las características estructurales de la secuencia de origen (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe tender a romper una hélice que ocurre en la secuencia de origen, o interrumpe otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia de origen). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptido reconocidos en la materia se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J . Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991 )); y Thornton et al. Nature 354: 105 (1991 ), que se incorporan cada una en la presente para referencia. Los anticuerpos de la presente invención también pueden generarse utilizando análogos de péptido de los determinantes epitópicos descritos en la presente, tales análogos pueden consistir de compuestos no péptido teniendo propiedades análogas a aquellas del péptido templado. Estos tipos de compuesto no péptido se denominan "imitaciones de péptido" o "péptidoimitaciones", Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); y Evans et al. J . Med. Chem. 30: 1229 (1987). Tales compuestos con frecuencia se desarrollan con la ayuda de modelado molecular computerizado. Las imitaciones de péptido que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden utilizarse para producir un efecto profiláctico o terapéutico equivalente. Generalmente, péptidoimitacíones son estructuralmente similares a un polipéptido de paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica), tal como anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces de péptido opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado del grupo consistiendo de: -CH2NH-, ~CH2S--, -CH2~CH2-, -CH=CH- (cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, y CH2SO-, por métodos bien conocidos en la materia. La substitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un aminoácido D del mismo tipo (por ejemplo, D-lisína en lugar de L-lisina) puede utilizarse para generar péptidos más estables. Además, los péptidos limitados comprendiendo una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso substancialmente idéntica puede generarse por métodos conocidos en la materia (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Bíochem. 61 :387 (1992), incorporada en la presente para referencia); por ejemplo, al agregar residuos de cisteína internos capaces de formar puentes de disulfuro intramolecular que ciclizan el péptido. El término "molécula biespecífica" se propone incluir cualquier agente, por ejemplo, una proteína, péptido, complejo de péptido o proteína, que tiene al menos dos especificidades de unión diferentes.

Por ejemplo, la molécula puede unirse a, o interactuar con, (a) un antígeno de superficie celular y (b) un receptor Fc en la superficie de una célula efectora. El término "molécula multíespecífica" o "molécula heteroespecífica" se propone incluir cualquier agente, por ejemplo, una proteína, péptido, complejo de péptido o proteína, que tiene más de dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, la molécula puede unirse a, o ¡nteractuar con, (a) un antígeno de superficie celular, (b) un receptor Fc en la superficie de una célula efectora, y (c) al menos otro componente. De acuerdo con lo anterior, la invención incluye, pero no se limita a, moléculas biespecíficas, triespecíficas, tetraespecíficas y otras multiespecíficas que se dirigen a epítopos CD148, y a otros objetivos, tales como receptores Fc en células efectoras. El término "anticuerpos biespecífícos" también incluye diacuerpos. Los diacuerpos sin bivalentes, anticuerpos biespecíficos en los cuales los dominios VH y VL se expresan en una cadena de polipéptido única, pero utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir la formación de pares entre los dos dominios en la misma cadena, forzando así a los dominios a formarse en pares con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (ver por ejemplo, Hollíger, P., ef al (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., eí al. (1994) Structure 2:1 121 -1 123). Un anticuerpo biespecífico incluye dos o más anticuerpos, fragmentos de unión a anticuerpo (por ejemplo, Fab), derivados de los mismos, o regiones de unión a antígeno enlazadas juntas, al menos dos de las cuales tienen diferentes especificidades. Estas diferentes especificidades incluyen una especificidad de unión para un receptor Fc en una célula efectora, y una especificidad de unión para un antígeno o epítopo en una célula objetivo, por ejemplo, una célula de tumor. El término "anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo en el cual ambas, las regiones constantes y la estructura consisten de secuencias completa o substancialmente de humano de manera que el anticuerpo humano produce substancialmente reacción no inmunogénica contra sí mismo cuando se administra a un huésped humano y preferentemente, ninguna reacción inmunogénica detectable. Debe entenderse que un "anticuerpo h umano" no necesita consistir completamente de secuencias de humano, pero puede contener porciones de secuencias de no humano, siempre que el anticuerpo no produzca una reacción inmunogénica cuando se administra al huésped humano. Por ejemplo, un "anticuerpo humano" incluye anticuerpos en los cuales las regiones CDR de especies no humanas, tal como una de ratón , se injertan en una estructura humana. En ciertas modalidades, anticuerpos humanos se producen en mamíferos no humanos, incluyendo, pero no limitándose a , ratones, ratas, y lagomorfos. En otras modalidades, anticuerpos humanos se producen en células de hibridoma de animales transgénicos teniendo un repertorio de inmunoglobulina de humano. En otras modalidades, anticuerpos completamente humanos se producen de manera recombinante, tal como en un transfectoma. El término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo e el cual substancialmente toda la región constante se deriva de un humano, mientras toda o parte de una o más regiones variables se deriva de otras especies, por ejemplo, un ratón. Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal despliega una especificidad de unión única y afinidad para un epítopo particular. De acuerdo con lo anterior, el término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos desplegando una especificidad de unión única que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de ¡nmunoglobulina de línea germinal de humano. En una modalidad , los anticuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, teniendo un genoma comprendiendo un transgen de cadena pesada de humano y un transgen de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada. El término "recombinante", como se utiliza en la presente en referencia a anticuerpos, se propone incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de ¡nmunoglobulina de humano o un hibridoma preparado de los mismos (descritos además en Sección I , abajo), (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpo de humano de combinación, recombinante, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por otro medio que incluyen división de secuencias genéticas de inmunoglobulina de humano a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal de humano. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagénesis in vitro (o, cuando un animal transgénico para secuencias Ig de humano se utiliza, mutagénesis somática in vivo) y de esta manera las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, mientras se derivan de y relacionan con secuencias VH y VL de línea germinal de humano, pueden existir de manera no natural dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpo humano in vivo. Como se utiliza en la presente, un "anticuerpo heterólogo" se define en relación al organismo no humano transgénico produciendo tal anticuerpo. Este término se refiere a un anticuerpo teniendo una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácidos nucleicos codificante correspondiente a aquella encontrada en un organismo no consistiendo del animal no humano transgénico, y generalmente de una especie diferente a aquella del animal no humano transgénico.

Como se utiliza en la presente, un "anticuerpo heterohíbrido" se refiere a un anticuerpo teniendo cadenas ligeras y pesadas de diferentes orígenes de organismo Por ejemplo, un anticuerpo teniendo una cadena pesada de humano asociada con una cadena ligera de murino es un anticuerpo heterohíbrido. Ejemplos de anticuerpos heterohíbridos incluyen anticuerpos quiméricos o humanizados, tratados su pra. Como se utiliza en la presente, "cambio de isotipo" se refiere al fenómeno mediante el cual la clase, o isotipo, de un anticuerpo cambia de una clase Ig a una de las otras clases Ig. Como se utiliza en la presente, "isotipo no cambiado" se refiere a la clase isotópica de cadena pesada que se produce cuando ningún cambio de isotípo ha tomado lugar; el gen CH codificando el isotipo no cambiado es típicamente el primer gen CH inmediatamente aguas debajo del gen VDJ funcionalmente reinstalado. El cambio de isotípo se ha clasificado como cambio de isotipo clásico o no clásico. El cambio de isotipo clásico ocurre por eventos de recombinación que incluyen al menos una región de secuencia de cambio en el transgen . El cambio de isotipo no clásico puede ocurrir mediante, por ejemplo, recombinación homologa entre teta-mu humano y teta-mu humano (eliminación asociada con delta). Los mecanismos de cambio no clásicos alternativos, tal como recombinación ¡ntercromosómica y/o ¡ntetransgen , entre otros, pueden ocurrir y efectuar cambio de isotipo. Como se utiliza en la presente, el término "secuencia de cambio" se refiere a aquellas secuencias de ADN responsables de recombinación de cambio. Una secuencia "donadora de cambio", típicamente una región de cambio mu, será 5' (es decir, aguas arriba) de la región de construcción a eliminarse durante la recombinación de cambio. La región "aceptadora de cambio" estará entre la región de construcción a eliminarse y la región constante de reemplazo (por ejemplo, gamma, epsilon etc.). Ya que no hay sitio específico donde ocurra siempre la recombinación, la secuencia genética final típicamente no será predecible de la construcción. Como se utiliza en la presente, "patrón de glicosílación" se define como el patrón de unidades de carbohidrato que se unen covalentemente a una proteína, más específicamente a una proteína de ¡nmunoglobulina. Un patrón de glicosilación de un anticuerpo heterólogo puede caracterizarse como siendo substancialmente similar a patrones de glicosilacíón que ocurren naturalmente en anticuerpos producidos por las especies del animal transgénico no humano, cuando un experto en la materia reconocería el patrón de glícosilación del anticuerpo heterólogo como siendo más similar a dicho patrón de glicosilación en las especies del animal transgénico no humano que a las especies de las cuales los genes CH del transgen se derivan. El término "que ocurre de manera natural" como se utiliza en la presente como se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos que está presente en un organismo (¡ncluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en naturaleza y que no se ha modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio ocurre de manera natural . El término "reordenado" como se utiliza en la presente se refiere a una configuración de un lugar de ¡nmunoglobulina de cadena ligera o cadena pesada en donde un segmento V se coloca inmediatamente adyacente a un segmento D-J o J en una conformación codificando esencialmente un dominio VH o VL completo, respectivamente. Un lugar de gen de ¡nmunoglobulina reordenado puede identificarse por comparación con ADN de línea germinal; un lugar reordenado tendrá al menos un elemento de homología de heptámero/nonámero recombinado. El término "no ordenado" o "configuración de línea germinal" como se utiliza en referencia a un segmento V se refiere a la configuración en donde el segmento V no se recombina para estar inmediatamente adyacente a un segmento D o J . El término "transfectoma", como se utiliza en la presente, incluye célula huésped eucariótica recombinante expresando el anticuerpo, tales como células CHO o células NS/0. Los términos "animal no humano transgénico" se refiere a un animal no humano teniendo un genoma comprendiendo uno o más transgenes de cadena ligera y/o pesada de humano o transcromosomas (ya sea integrados o no integrados en el ADN genómico natural del animal) y que es capaz de expresar anticuerpos completamente humanos. Por ejemplo, un ratón transgénico puede tener un transgen de cadena ligera de humano y ya sea un transgen de cadena pesada de humano o transcromosoma de cadena pesada de humano, de manera que el ratón produce anticuerpos humanos anti-CD148 cuando se inmunizan con CD 148 y/o células expresando CD148. El transgen de cadena pesada de humano puede integrarse en el ADN cromosómico del ratón, como es el caso para ratones transgénicos, por ejemplo, HuMAb, o el transgen de cadena pesada de humano puede mantenerse de manera extracromosomal, como es el caso para ratones transcromosomales (por ejemplo, KM) como se describe en WO 02/43478. Tales ratones transgénicos y transcromosómicos son capaces de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para CD 148 (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgE) al experimentar recombinación V-D-J y cambio de isotipo. Varios aspectos de la invención se describen en más detalle en las siguientes subsecciones. Producción de Anticuerpos a CD148 La presente invención se ejemplifica por anticuerpos o una región de unión a antígeno de los mismos que se unen a epítopos específicos de CD148 que se han determinado para jugar un papel en activación de actividad angiogénica y/o inflamatoria mediada por CD148. Tales anticuerpos o regiones de unión a antígeno de los mismos incluyen anticuerpos anti-CD148 y regiones de unión a antígeno de los mismos cuya unión a CD148 puede inhibirse completamente por los anticuerpos o regiones de unión a antígeno de los mismos descritos en la presente. Las secuencias de polinucleótidos codificando los anticuerpos y regiones de unión a antígeno de los mismos de la presente invención, así como también la secuencia de polípéptidos expresada por tales secuencias de polinucleótidos, se describen en Solicitudes de Patente Provisionales de EE.UU. co-pendientes Nos. 60/564,885 y 60/585,686, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. La presente invención proporciona anticuerpos anti-CD148 que se unen a substancialmente el mismo epítopo como un epítopo CD148 humano definido por una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 447-725, 533-725, 715-973, 324-335, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33. En otra modalidad, la presente invención proporciona anticuerpos anti-CD 148 y regiones de unión a antígeno de los mismos que se unen a un epítopo CD148 humano, o substancialmente el mismo epítopo, definido por una o más de las secuencias de polípéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33. En otra modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo CD148 humano, o substancialmente el mismo epítopo, definido por una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 31 5-329, 31 8-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 71 5-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ I D NO:33. En otra modalidad, la presente invención proporciona a anticuerpo monoclonal o región de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo CD 148 humano, o substancíalmente el mismo epítopo, definido por una o más de las secuencias de polipéptídos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 31 5-329, 31 8-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 71 5-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33. Tales anticuerpos o regiones de unión a antígeno de los mismos pueden prepararse por cualquiera de un número de procesos descritos abajo, por ejemplo, al inmunizar un animal con al menos una primer composición antigéníca CD 148 y seleccionar del animal inmunizado un anticuerpo que substancialmente reacciona con los anticuerpos monoclonales de la presente invención . Los anticuerpos con tales combinaciones de propiedades pueden identificarse fácilmente por uno o más o una combinación de la competición de receptor, ELISA, co-precipitación , y/o ensayos funcionales y los ensayos de reactividad cruzada descritos abajo. Los anticuerpos comprendidos por la presente invención incluyen anticuerpos IgG, IgA, lgGI-4, IgE, IgM , e IgD , por ejemplo, isotipos lgG 1 ? o IgG l ?, o isotipos lgG4? o lgG4?. En una modalidad particular, el anticuerpo de la presente invención es un isotipo lgG2. En una modalidad, anticuerpos humanos se producen en un animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, capaz de producir múltiples isotipos de anticuerpos humanos para CD148 (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgE) al experimentar recombinación de V-D-J y cambio de isotipo. De acuerdo con lo anterior, aspectos de la invención incluyen no solamente anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, y composiciones farmacéuticas de los mismos, pero también anímales transgénicos no humanos, células B, transfectomas de célula huésped, e hibridomas que producen anticuerpos monoclonales. Métodos para utilizar los anticuerpos de la invención para detectar una célula expresando CD148 o un receptor del factor de crecimiento reactivo, relacionado, o para inhibir el crecimiento, diferenciación y/o motilidad de una célula expresando CD 148, ya sea in vitro o in vivo, también se comprenden por la invención. La presente invención comprende además preparaciones farmacéuticas conteniendo los anticuerpos de la presente invención, y métodos para tratar desórdenes fisiológicos al administrar los anticuerpos de la presente invención. Los anticuerpos y regiones de unión a antígeno de la presente invención pueden construirse por cualquier número de diferentes métodos, incluyendo, a través de inmunización de animales (por ejemplo, con un antígeno que produce la producción de anticuerpos que se unen específicamente a e inhiben competitivamente la unión de al menos uno de un anticuerpo de Ab-1 a Ab-8); a través de hibridomas (por ejemplo, empleando células B de animales transgénicos o no transgénícos); a través de métodos recombinantes (por ejemplo, transfectomas CHO; ver, Morríson, S. (1985) Science 229: 1202)), o, medios sintéticos in vitro (por ejemplo, síntesis de polipéptído de fase sólida). En algunas modalidades, los anticuerpos y regiones de unión a antígeno son de humano o humanizados. Métodos para humanizar anticuerpos no humanos se conocen bien en la materia. La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y cotrabajadores (Jones ef al., Nature, 321 :, 522 (1986); Riechmann ef al., Nature, 332:323 (1988); Verhoeyen ef al., Science, 239: 1534 (1988)). Brevemente, los genes de región constante se unen a genes de región variable no humana o humana apropiados. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos que representan los sitios de unión a antígeno (CDRs, o regiones de determinación de complementariedad) de un anticuerpo monoclonal de murino de origen se injertan en el nivel de ADN en secuencias de estructura de región variable de humano. Las secuencias de genes de regiones constantes de humano pueden encontrarse en Kabat ef al. (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. no. de publicación 91 -3242. Los genes de región C de humano están fácilmente disponibles de clones conocidos. La elección de isotipo de anticuerpo se guiará por las funciones efectoras deseadas, tal como fijación de complemento, o actividad en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. En ciertas modalidades, el isotipo es lgG2. Los anticuerpos humanos o humanizados o regiones de unión a antígeno también pueden generarse a través de tecnologías de tipo de despliegue, incluyendo, sin limitación, despliegue de fago, despliegue retroviral, despliegue ribosomal, y otras técnicas, utilizando técnicas bien conocidas en la materia y las moléculas resultantes pueden someterse a maduración adicional, tal como maduración de afinidad, como tales técnicas son bien conocidas en la materia. Hanes and Plucthau PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (despliegue ríbosomal), Parmley and Smith Gene 73:305-318 (1988) (despliegue de fago), Scott TIBS 17:241 -245 (1992), Cwirla eí al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel ef al. Nucí. Acids Research 21 : 1081 -1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992), y Pat. de EE.UU. No. 5,733,743. Identificación de secuencias de anticuerpo humano adecuadas puede facilitarse por modelado por computadora. El modelado se conoce bien en la materia, y se utiliza, por ejemplo, para evitar la yuxtaposición no natural de regiones de CDR no humano con regiones de estructura variables de humano, que pueden resultar en limitaciones conformacionales no naturales y pérdida concomitante de afinidad de unión. El software y hardware de computadora para producir imágenes tridimensionales de moléculas de inmunoglobulina están ampliamente disponibles. En general, los modelos moleculares se producen iniciando de estructuras resueltas para cadenas de inmunoglobulina o dominios de las mismas. Las cadenas a modelarse se comparan para similitud de secuencia de aminoácidos con cadenas o dominios de estructuras tridimensionales resueltas, y las cadenas o dominios mostrando la mayor similitud de secuencia se seleccionan como puntos iniciales para construcción del modelo molecular. Las estructuras de inicio resultas se modifican para permitir las diferencias entre los aminoácidos actuales en las cadenas de inmunoglobulina o dominios que se modelan y aquellos en la estructura inicial. Las estructuras modificadas se ensamblan entonces en una inmunoglobulina compuesta. Finalmente, el modelo se refina por minímización de energía y al verificar que todos los átomos están dentro de las distancias apropiadas uno de otro y que ambas longitudes y ángulos están dentro de límites químicamente aceptables. Ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, en la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de ¡nmunoglobulina endógena. Por ejemplo, la eliminación homocigosa de la región de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones mutantes de línea germinal y quiméricos resulta en inhibición completa de producción de anticuerpo endógeno. La transferencia del conjunto genético de inmunoglobulina de línea germinal de humano en tales ratones mutantes de línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos en el reto de antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits ef al., Proc. Nati . Acad. Sci USA, 90:2551 (1993); Jakobovits ef al., Nature, 362:255 (1993); Bruggermann ef al., Year in Immunol. , 20 7:33 (1993). Las cepas de ratones transgénicos comercialmente accesibles tales como XenoRatón se han descrito; ver, Green ef al. Nature Genetics 7: 13-21 (1994). Los métodos recombinantes para producir anticuerpos o regiones de unión a antígeno de la presente invención comienzan con el ácido nucleico aislado de regiones deseadas de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulína tales como aquellas presentes en cualquiera de Ab-1 a Ab-8. Tales regiones pueden incluir, por ejemplo, toda o parte de la región variable de las cadenas, pesada y ligera. Tales regiones pueden incluir, en particular, al menos una de las CDRs de las cadenas pesadas y/o ligeras, y con frecuencia, al menos un par CDR de Ab-1 a Ab-8. Un ácido nucleico codificando un anticuerpo o región de unión a antígeno de la invención puede sintetizarse directamente por métodos de síntesis de oligonucleótido in vitro conocidos en la materia. Alternativamente, fragmentos pequeños pueden sintetizarse y unirse para formar un fragmento más grande utilizando métodos recombinantes cocidos en la materia. Las regiones de unión a anticuerpo, tales como para Fab o F(ab')2, pueden prepararse por desdoblamiento de la proteína intacta, por ejemplo, por desdoblamiento químico o proteasa. Alternativamente, un gen truncado puede designarse. Para expresar los anticuerpos o regiones de unión a antígeno de los mismos, ADNs codificando cadenas ligeras y pesadas de longitud completa o parcial, pueden obtenerse por técnicas de biología molecular estándar (por ejemplo, amplificación PCR, mutagénesis dirigida de sitio) y pueden insertarse en vectores de expresión de manera que los genes se enlazan operativamente a secuencias reguladoras translacionales y transcripcionales. Los ácidos nucleicos codificando un anticuerpo o región de unión a antígeno de la invención pueden clonarse en un vector de expresión adecuado y expresarse en un huésped adecuado. Un vector adecuado y sistema de célula huésped puede permitir, por ejemplo, co-expresión y ensamble de las cadenas ligeras variables y pesadas variables de al menos uno de Ab-1 a Ab-8, o CDR conteniendo polipéptidos de los mismos. Los sistemas adecuados para expresión pueden determinarse por aquellos expertos en la materia. Los ácidos nucleicos comprendiendo polinucleótidos de la presente invención pueden utilizarse en transfección de una célula huésped mamífera o no mamífera adecuada. En algunas modalidades, para expresión de las cadenas ligeras y pesadas, el(los) vector(es) de expresión codificando las cadenas pesadas y ligeras se transfecta en una célula huésped por técnicas estándar. Las diversas formas del término "transfección" se proponen para comprender una amplia variedad de técnicas comúnmente utilizadas para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped eucariótica o procariótica, por ejemplo, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, transfección de dextran DEAE y lo similar. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención en ya sea células huésped eucarióticas o procarióticas, expresión de anticuerpos en células eucarióticas, y más preferentemente células huésped de mamífero, es la más típica debido a que tales células eucaríóticas, y en particular células de mamífero, son más probablemente que las células ecuarióaticas que se parezcan y secreten un anticuerpo inmunológicamente activo o apropiadamente doblado o región de unión a antígeno. Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, cósmidos, YACs, episomas derivadas de EBV, y lo similar. Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia CH (pesada constante) de humano funcionalmente completa o CL (ligera constante) de ¡nmunoglobulína, con sitios de restricción apropiados formados de manera que cualquier secuencia VH o VL puede insertarse fácilmente y expresarse. En tales vectores, la división usualmente ocurre entre el sitio donador divisor en la región J insertada y el sitio aceptador divisor precedente a la región C de humano, y también en las regiones divisoras que ocurren dentro de los exones CH de humano. La poliadenilación y terminación de transcripción ocurren en sitios cromosomales nativos aguas debajo de las regiones de codificación. El vector de expresión y secuencias de control de expresión se eligen para ser compatibles con la célula huésped de expresión utilizada. El ácido nucleico de cadena pesada variable de anticuerpo y los ácidos nucleicos de cadena ligera variable de anticuerpo de la presente invención pueden insertarse en vectores separados o, frecuentemente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión . Los ácidos nucleicos pueden insertarse en el vector de expresión por métodos estándar (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementarios en el fragmento de ácido nucleico de anticuerpo y vector, o ligación final directa si ningún sitio de restricción está presente). Las regiones variables de cadena pesada y ligera de Ab-1 a Ab-8, descritas en la presente, pueden utilizarse para crear genes de anticuerpo de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo al insértalas en los vectores de expresión ya codificando regiones constantes de cadena ligera y constantes de cadena pesada del isotipo deseado (y subclase) de manera que el segmento VH se enlaza operativamente al(los) segmento(s) CH dentro del vector y el segmento VL se enlaza operativamente al segmento CL dentro del vector. Adicional o alternativamente, el vector de expresión puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción del anticuerpo o cadena de región de unión a antígeno de una célula huésped. El anticuerpo o gen de cadena de región de unión a antígeno puede clonarse en el vector de manera que el péptido de señal se enlaza en estructura al término amino del gen de cadena de región de unión a antígeno/anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal de una proteína de no inmunoglobulina). Además de CDR comprendiendo secuencia, los vectores de expresión de la invención llevan las secuencias reguladoras que controlan la expresión de la secuencia en una célula huésped. El término "secuencia reguladora" se propone incluir promotores, aumentadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traslación de los genes de cadena de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describe, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calíf. (1990). Se apreciará por aquellos expertos en la materia que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras puede depender de tales factores como la elección de la célula huésped a transformarse, el nivel de expresión de proteína deseada, y lo similar. Las secuencias reguladoras preferidas para expresión de célula huésped de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o aumentadores derivados de citomegalovirus (CMV), Virus de Simio 40 (SV40), adenovírus, (por ejemplo, el último promotor principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Alternativamente, las secuencias reguladoras no virales pueden utilizarse, tal como el promotor de ubiquitin o promotor beta-globin. Además del anticuerpo o región de unión a antígeno, ácidos nucleicos y secuencias reguladores, los vectores de expresión de la invención pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la réplica del vector en las células huésped (por ejemplo, orígenes de réplica) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células huésped en las cuales el vector se ha introducido (ver por ejemplo, Pats. de EE.UU. Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5, 179,017, todos por Axel ef al.). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicin o metotrexato, en una célula huésped en la cual el vector se ha introducido. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de reductasa dihidrofolato (DHFR) (para utilizarse en células huésped dhfr con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para selección de G418). Las células huésped de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes o regiones de unión a antígeno de la invención incluyen Ovario de Hámster Chino (células CHO) (¡ncluyendo células dhfr-CHO, descritas en Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufinan and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601 -621 ), células de mieloma NS/0, células COS y células SP2.0. En particular para usarse con células de mieloma NS/0, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión genética GS descrita en WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338 841 . Cuando los vectores de expresión de la invención se introducen en células huésped de mamífero, los anticuerpos o regiones de unión a antígeno se producen al cultivar las células huésped por un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo o región de unión a antígeno en las células huésped o, más preferentemente, secreción del anticuerpo o región de unión a antígeno en el medio de cultivo en el cual las células huésped se desarrollan.

Una vez expresados, los anticuerpos y regiones de unión a antígeno de la invención pueden purificarse de acuerdo a métodos estándar en la materia, incluyendo purificación HPLC, cromatografía de columna de fracción, electroforesis de gel y lo similar (ver, por ejemplo, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982). En ciertas modalidades, polipéptidos se purifican utilizando técnicas electroforéticas y/o cromatográficas. Métodos de purificación ejemplificativos incluyen, pero no se limitan a, precipitación con sulfato de amonio; precipitación con PEG; inmunoprecipitación, desnaturalización de calor seguida por centrifugación; cromatografía, incluyendo, pero no limitándose a, cromatografía de afinidad (por ejemplo, Proteína-A-Sepharose), cromatografía de intercambio de ¡ón, cromatografía de exclusión, y cromatografía de fase inversa; filtración de gel; cromatografía de hidroxiapatita; enfoque isoeléctrico; electroforesis de gel de poliacrilamida; y combinaciones de tales y otras técnicas. En ciertas modalidades, un polipéptido se purifica por cromatografía líquida de proteína rápida o por cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Generación de Híbridomas Produciendo Anticuerpos Monoclonales Humanos para CD148 Otro aspecto de la presente invención incluye una célula hibridoma que produce el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo de la presente invención. Una célula de hibridoma puede comprender una célula B obtenida de un animal no humano transgénico teniendo un genoma comprendiendo un transgen de cadena pesada de humano y un transgen de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada, en donde el hibridoma produce una cantidad detectable del anticuerpo monoclonal o región de unión a antígeno del mismo de la presente invención. Los esplenocitos de ratón pueden aislarse y fusionarse con PEG a una estirpe de célula de mieloma de ratón en los procedimientos estándar. Los hibridomas resultantes se seleccionan entonces para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Por ejemplo, suspensión de célula única de linfocitos esplénicos de ratones, inmunizados se fusionan a un sexto del número de células de mieloma de ratón no secretante P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con 50% PEG. Las células se colocan en placas a aproximadamente 2 x 105 en placa de microconcentración de fondo plano, seguido por una incubación de dos semanas en medio selectivo conteniendo 20% Suero de Clon fetal, 18% medio acondicionado "653", 5% origen (IGEN), 4 mM L-glutamina, 1 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sodio, 5mM HEPES, 0.055 mM 2-mercaptoetanol, 50 unidades/ml penicilina, 50 mg/ml estreptomicina, 50 mg/ml gentamicina y 1 xHAT (Sigma; HAT se agrega 24 horas después de la fusión). Después de dos semanas, las células se cultivan en medio en el cual HAT se reemplaza con HT. Las cavidades individuales se seleccionan entonces por ELISA para anticuerpos IgM e IgG monoclonales anti-CD148 de humano. Una vez que el crecimiento de hibridoma extensivo ocurre, el medio se observa usualmente después de 10-14 días. Los hibridomas secretantes de anticuerpo se vuelven a colocar en placas, seleccionan de nuevo, y si aún son positivos para anticuerpos monoclonales antí-CD 148, IgG humano, pueden subclonarse al menos dos veces al limitar la dilución. Los subclones estables se cultivan entonces in vitro para generar cantidades pequeñas de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para caracterización. Generación de Transfectomas Produciendo Anticuerpos Monoclonales de Humano para CD148 Anticuerpos humanos de la invención también pueden producirse en un transfectoma de célula huésped utilizando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección genética como se sabe bien en la materia (Morrison, S. (1985) Science 229:1202). Una célula de transfectoma puede comprender ácidos nucleicos codificando una cadena pesada de humano y una cadena ligera de humano, en donde el transfectoma produce una cantidad detectable del anticuerpo monoclonal o región de unión a antígeno del mismo de la presente invención. Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de los mismos, ADNs codificando cadenas ligeras y pesadas de longitud completa o parcial, pueden obtenerse por técnicas de biología molecular estándar (por ejemplo, amplificación PCR, mutagénesis dirigida por sitio) y pueden insertarse en vectores de expresión de manera que los genes se enlazan operativamente a secuencias control transcripcionales o translacionales. En este contexto, el término "enlazada operativamente" se propone significar que un gen de anticuerpo se liga en un vector de manera que las secuencias de control transcripcíonales y translacionales dentro del vector sirven a su función propuesta de regular la transcripción y translación del gen de anticuerpo. El vector de expresión y secuencias de control de expresión se eligen para ser compatibles con la célula huésped de expresión utilizada. El gen de cadena ligera de anticuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo pueden insertarse en vector separado o, más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión por métodos estándar (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementarios en el fragmento de gen de anticuerpo y vector, o ligación final directa si no están presentes sitios de restricción). Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos en la presente pueden utilizarse para crear genes de anticuerpo de longitud completa de un isotipo de anticuerpo al insertarlos en los vectores de expresión ya codificando las regiones constantes de cadena ligera y constantes de cadena pesada del isotipo deseado de manera que el segmento VH se enlaza operativamente al(los) segmento(s) CH dentro del vector y el segmento VL se enlaza operativamente al segmento CL dentro del vector. Adicional o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo de una célula huésped. El gen de cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de manera que el péptido de señal se enlaza en estructura al término amino del gen de cadena de anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal de una proteína de no inmunoglobulina). Además de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención llevan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula huésped. El término "secuencia reguladora" se propone incluir promotores, aumentadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o translación de los genes de cadena de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Se apreciará por aquellos expertos en la materia que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras puede depender de tales factores como la elección de la célula huésped a transformarse, el nivel de expresión de proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para expresión dé célula huésped de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o aumentadores derivados de citomegalovirus (CMV), Virus de Simio 40 (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el último promotor principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma.

Alternativamente, las secuencias reguladoras no virales pueden utilizarse, tal como promotor de ubiquítin o promotor beta-globín. Además de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombínantes de la invención pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la réplica del vector en las células huésped (por ejemplo, orígenes de réplica) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionabie facilita la selección de células huéspedes en los cuales el vector se ha introducido (ver por ejemplo, Pats. de EE.UU. Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5, 179,017, todas por Axel ef al.). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tal como G418, higromicin o metotrexato, en una célula huésped en la cual el vector se ha introducido. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de reductasa de dihidrofolato (DHFR) (para usarse en células huésped dhfr con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para selección G418). En una modalidad preferida de la presente invención, los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras se expresan en "vectores dhfr divisores" PDC323 y PDC324, como se describe por Bíanchi, A. A. and McGrew, J.T. (2003) "High-level expression of full antibodies using trans-complementing expression vectors," Bioengineering and Biotechnology, 84 (4):439-444; and McGrew, J.T. and Bianchi, AA. (2002) "Selection of cells expressing heteromeric proteins," Solicitud de Patente de EE. UU. No. 20030082735, los contenidos de la cual se incorporan de manera expresa en la presente para referencia. Para expresión de las cadenas pesadas y ligeras, el(los) vector(es) de expresión codificando las cadenas pesadas y ligeras se transfecta en una célula huésped por técnicas estándar. Las diversas formas del término "transfección" se proponen para comprender una amplia variedad de técnicas comúnmente utilizadas para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariótica o eucariótica, por ejemplo, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, transfección de dextran DEAE y lo similar. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención en ya sea células huésped procarióticas o eucarióticas, la expresión de anticuerpos en células eucarióticas, y más preferentemente células huésped de mamífero, es la más preferida debido a tales células eucarióticas, y en células de mamífero particulares, son más probables que las células procarióticas se parezcan y secreten un anticuerpo inmunológicamente activo y doblado de manera apropiada. Las células huésped de mamífero para expresar los anticuerpos recombínantes de la invención incluyen Ovario de Hámster Chino (células CHO) (¡ncluyendo células dhfr-CHO, descritas en Uriaub and Chasín, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601 -621 ), células de mieloma NS/0, células COS y células SP2.0. En particular para usarse con células de mieloma NS/0, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión de gen GS descrito en WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338 841 . Cuando los vectores de expresión recombinantes codificando genes de anticuerpo se introducen en células huésped de mamífero, los anticuerpos se producen al cultivar las células huésped por un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o, más preferentemente, secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual las células huésped se desarrollan. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteína estándar. Uso de Secuencias de Anticuerpo Parcial para Expresar Anticuerpos Intactos Los anticuerpos ¡nteractúan con antígenos objetivo predominantemente a través de residuos de aminoácido que se ubican en las seis regiones de determinación de complementariedad de cadena pesada y ligera (CDRs). Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de CDRs son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de CDRs. Debido a que las secuencias CDR son responsables de la mayoría de las interacciones de anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos que ocurren de manera natural al construir vectores de expresión que incluyen secuencias CDR del anticuerpo que ocurre de manera natural específico injertado en secuencias de estructura de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (ver, por ejemplo, Riechmann , L. ef al. , 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. eí al., 1986, Nature 321 :522-525; y Queen, C. eí al., 1989, Proc. Nati. Acad. Ver. U.S.A. 86:10029-10033). Tales secuencias de estructura pueden obtenerse de bases de datos de ADN públicas que incluyen secuencias genéticas de anticuerpo de línea germinal. Estas secuencias de línea germinal diferirán de secuencias genéticas de anticuerpo maduras debido a que no incluirán genes variables completamente ensamblados, que se forman por unión V(D)J durante la maduración de la célula B. Las secuencias genéticas de línea germinal también diferirán de las secuencias de un anticuerpo repertorio secundario de alta afinidad en individuo uniformemente a través de la región variable. Por ejemplo, las mutaciones somáticas son relativamente infrecuentes en la porción de terminal amino de región de estructura. Por ejemplo, mutaciones somáticas son relativamente infrecuentes en la porción terminal amino de región de estructura 1 y en la porción terminal carboxi de región de estructura 4. Además, muchas mutaciones somáticas no alteran de manera significativa las propiedades de unión del anticuerpo. Por esta razón, no es necesario obtener la secuencia de ADN completa de un anticuerpo particular para recrear un anticuerpo recombinante intacto teniendo propiedades de unión similares a aquellas del anticuerpo original (ver PCT/US99/05535 presentada el 12 de Marzo de 1999, que se incorpora en la presente para referencia para todos los propósitos). La secuencia de cadena ligera y pesada preferida extendiéndose sobre las regiones CDR es típicamente suficiente para este propósito. La secuencia parcial se utiliza para determinar que segmentos de gen de unión y variable de línea germinal contribuyen a los genes variables de anticuerpo recombinado. La secuencia de línea germinal se utiliza entonces para llenar las porciones faltantes de las regiones variables. Las secuencias guía de cadena pesada y ligera se desdoblan durante la maduración de proteína y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Por esta razón, es necesario utilizar la secuencia guía de línea germinal correspondiente para construcciones de expresión. Para agregar secuencias faltantes, secuencias de cADN clonadas pueden combinarse con oligonucleótidos sintéticos por ligación o amplificación PCR. Alternativamente, la región variable completa puede sintetizarse como un conjunto de oligonucleótidos cortos, de sobreposición y combinados por amplificación de PCR para crear un clon de región variable completamente sintético. Este proceso tiene ciertas ventajas tal como eliminación o inclusión o sitios de restricción particulares, u optimización de codones particulares. Las secuencias de nucleótidos de transcripciones de cadena pesada y ligera de un hibridoma se utilizan para diseñar un conjunto de sobreposición de oligonucleótidos sintéticos para crear secuencias V sintéticas con capacidades de codificación de aminoácido idénticas como las secuencias naturales. Las secuencias de cadena kappa y pesada sintéticas pueden diferir de las secuencias naturales en tres maneras: cadenas de bases nucleótidos repetidas se interrumpen para facilitar la síntesis de oligonucleótido y amplificación PCR; sitios de inicio de translación óptimos se incorporan de acuerdo a las reglas de Kozak (Kozak, 1991 , J . Biol. Chem. 266:19867-19870); y sitios Hindl ll se forman aguas arriba de los sitios de inicio de translación . Para ambas regiones variables de cadena pesada y ligera, la codificación optimizada, y secuencias de filamento, sin codificación correspondientes se interrumpen en 30-50 nucleótidos aproximadamente el punto medio del oligonucleótido no codificante correspondiente. De esta manera, para cada cadena, los olígonucleótidos pueden ensamblarse en conjuntos de doble filamento de sobreposición que expanden los segmentos de 150-400 nucleótidos. Los grupos se utilizan entonces como templados para producir productos de amplificación PCR de 150-400 nucleótidos. Típicamente, un conjunto de oligonucleótido de región variable única se romperá en dos grupos que se amplifican por separado para generar dos productos PVC de sobreposición. Estos productos de sobreposición se combinan entonces por amplificación PCT para formar la región variable completa. Puede ser deseable incluir un fragmento de sobreposición de la región constante de cadena ligera o pesada (incluyendo el sitio Bbsl de la cadena ligera kappa, o el sitio Agel si la cadena pesada gamma) en la amplificación PCR para generar fragmentos que pueden clonarse fácilmente en las construcciones del vector de expresión. Las regiones variables de cadena pesada y ligera reconstruidas se combinan entonces con promotor clonado, inicio de translación, región constante, 3' sin trasladar, poliadenilación, y terminación de transcripción, secuencias para formar construcciones de vector de expresión . Las construcciones de expresión de cadena pesada y ligera pueden combinarse en un vector único, co-transfectado, serialmente transfectado o transfectado por separado en células huésped que se fusionan entonces para formar una célula huésped expresando ambas cadenas. Los plásmidos para utilizarse en construcción de vectores de expresión para lgG? de humano se describen abajo. Los plásmidos se construyen de manera que las secuencias de cADN de cadena ligera kappa V y pesada V amplificadas por PCR podrían utilizarse para reconstruir minigenes de cadena ligera y pesada completa. Estos plásmidos pueden utilizarse para expresar anticuerpos completamente humanos, o quiméricos lgG1 ? o lgG4?. Los plásmidos similares pueden construirse para expresión de otros isotipos de cadena pesada, o para expresión de anticuerpos comprendiendo cadenas ligeras lambda. De esta manera, en otro aspecto de la invención, las características estructurales de un anticuerpo humano anti-CD148 de la invención se utilizan para crear anticuerpos humanos anti-CD148 estructuralmente relacionados que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como unión a CD148. Más específicamente, una o más regiones CDR de anticuerpos anti-CD 148 pueden combinarse de manera recombinante con regiones de estructura de humano conocidas y CDRs para crear anticuerpos anti-CD148 humanos, recombinantemente formados, adicionales de la invención. De acuerdo con lo anterior, anticuerpos anti-CD148 de la presente invención pueden utilizarse para preparar un anticuerpo anti-CD148 al preparar un anticuerpo anti-CD148 comprendiendo (1 ) regiones de estructura de cadena pesada de humano y CDRs de cadena pesada de humano; y (2) regiones de estructura de cadena ligera de humano y CDRs de cadena ligera de humano, en donde el anticuerpo retiene la habilidad de unirse a CD148. La habilidad del anticuerpo para unir CD148 puede determinarse utilizando ensayos de unión estándar (por ejemplo, ELISA). Ya que se conoce bien en la materia que los dominios CDR3 de cadena ligera y pesada de anticuerpo juegan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo para un antígeno, los anticuerpos recombinantes de la invención preparados como se establece arriba preferentemente comprenden CDR3s de cadena pesada y ligera de anticuerpos anti-CD148. Los anticuerpos además pueden comprender CDR2s de anticuerpos anti-CD148. Los anticuerpos pueden comprender además CDR1 s de anticuerpos anti-CD148. De acuerdo con lo anterior, la invención proporciona además anticuerpos anti-CD148 comprendiendo: (1 ) regiones de estructura de cadena pesada de humano, una región CDR1 de cadena pesada de humano, una región CDR2 de cadena pesada de humano, y una región CDR3 de cadena pesada de humano, en donde la región CDR3 de cadena pesada de humano es la CDR3 de anticuerpos anti-CD148; y (2) regiones de estructura de cadena ligera de humano, una región CDR1 de cadena ligera de humano, una región CDR2 de cadena ligera de humano, y una región CDR3 de cadena ligera de humano, en donde la región CDR3 de cadena ligera de humano es CDR3 de anticuerpos anti-CD148, en donde el anticuerpo une CD 148. El anticuerpo puede comprender CDR2 de cadena pesada y/o CDR2 de cadena ligera de anticuerpos anti-CD148. El anticuerpo puede comprender además CDR1 de cadena pesada y/o CDR1 de cadena ligera de anticuerpos anti-CD148. Preferentemente, CDR1 , 2, y/o 3 de los anticuerpos formados descritos arriba comprenden la(s) secuencia(s) de aminoácidos exacta(s) como aquellas de los anticuerpos anti-CD148 descritos en la presente. Sin embargo, el experto ordinario apreciará que alguna desviación de las secuencias CDR exactas puede ser posible mientras aún mantiene la habilidad del anticuerpo para unirse a CD148 efectivamente (por ejemplo, substituciones conservadoras). De acuerdo con lo anterior, en otra modalidad, el anticuerpo formado puede componerse de una o más CDRs que son, por ejemplo, 90%, 95%, 98% o 99.5% idénticas a una o más CDRs de anticuerpos anti-CD148. Caracterización de Unión de Anticuerpos Monoclonales de Humano para CD148 Para caracterizar la unión de anticuerpos monoclonales humanos anti-CD148 de humano de la invención, sueros de ratones inmunizados pueden probarse, por ejemplo, por ELISA. Brevemente, las placas de microconcentración se revisten con CD148 purificado a 0.25 g/ml en PBS, y después se bloquean con 5% albúmina de suero de bovino en PBS. Diluciones de plasma de ratones inmunizados con CD148 se agregan a cada cavidad e incuban por 1 -2 horas a 37°C. Las placas se enjuagan con PBS/Tween y después se incuban con un reactivo policlonal específico de FC IgG de humano conjugado con fosfatasa alcalina por 1 hora a 37°C. Después de enjuagar, las placas se desarrollan con substrato pNPP (1 mg/ml), y analizan a OD de 405-650. Preferentemente, los ratones que desarrollan las concentraciones más altas se utilizarán para fusiones. Un ensayo ELISA como se describe arriba también puede utilizarse para seleccionar híbridomas que muestran reactividad positiva con antígeno CD148. Hibridomas que se unen con alta afinidad a CD148 se subclonarán y caracterizan además. Un clon de cada hibridoma, que retiene la reactividad de las células de origen (por ELISA), pueden elegirse para hacer un banco celular en frasco 5-10 almacenado a -140°C, y para purificación de anticuerpo. Para purificar anticuerpos humanos anti-CD148, hibridomas seleccionados pueden desarrollarse en matraces giratorios de dos litros para purificación de anticuerpo monoclonal. Los sobrenadantes que pueden filtrarse y concentrarse antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ.). IgG eluida puede verificarse por electroforesis de gel y cromatografía líquida de alto desempeño para asegurar pureza.

La solución reguladora puede intercambiarse en PBS, y la concentración puede determinarse por OD280 utilizando coeficiente de extinción 1.43. Los anticuerpos monoclonales pueden alicuotarse y almacenarse a -80°C. Para determinar sí los anticuerpos monoclonales humanos anti- CD 148 se une a epítopos únicos, cada anticuerpo puede biotinilizarse utilizando reactivos comercialmente disponibles (Pierce, Rockford, 1 1 1 ). Los estudios de competición utilizando anticuerpos monoclonales y anticuerpos monoclonales biotinilados pueden realizarse utilizando placas ELISA revestidas con CD148 como se describe arriba. La unión MAb biotinilada puede detectarse con una sonda stre-avidin-fosfatasa alcalina, Para determinar el isotipo de anticuerpos purificados, ELISAs de isotipo pueden realizarse. Las células de placas de microconcentración pueden revestirse con 10 g/ml de Ig anti-humano durante la noche a 4° C. Después de bloquear con 5% BSA, las placas se reaccionan con 10 g/ml de anticuerpos monoclonales o controles de isotípo purificados, a temperatura ambiente por dos horas. Las cavidades pueden reaccionarse entonces con ya sea lgG1 de humano o sondas conjugadas con fosfatasa alcalina específicas de IgM de humano. Las placas se desarrollan y analizan como se describe arriba. Para demostrar la unión de anticuerpos monoclonales a células vivas expresando CD148, citometría de flujo puede utilizarse. Brevemente, las estirpes de línea expresando CD 148 (crecimiento bajo condiciones de crecimiento estándar) se mezclan con varias concentraciones de anticuerpos monoclonales en PBS conteniendo 0.1 % Tween 80 y 20% suero de ratón, e incuban a 37°C por 1 hora. Después de enjuagar, las células se reaccionan con anticuerpo IgG anti-humano marcado con Fluoresceína bajo las mismas condiciones que la coloración de anticuerpo primario. Las muestras pueden analizarse por instrumento FACScan utilizando propiedades difusoras laterales y luz para usarse sobre células únicas. Un ensayo alternativo utilizando microscopía de fluorescencia puede utilizarse (además de o en lugar de) el ensayo de citometría de flujo. Las células pueden colorearse exactamente como se describe arriba y examinan por miscroscopia de fluorescencia. Este método permite la visualización de células individuales, pero puede tener sensibilidad disminuida dependiendo de la densidad del antígeno. IgGs de humano anti-CD148 pueden probarse además para reactividad con antígeno CD148 por Western blottíng. Brevemente, los extractos celulares de células expresando CD 148 pueden prepararse y someterse a electroforesis de gel de poliacrilamida de sulfato dodecil de dosido (SDS). Después de electroforesis, los antígenos separados se transferirán a membranas de nitrocelulosa, bloquearse con 20% suero de ratón, y sondearse con los anticuerpos monoclonales a probarse. Unión de IgG de humano puede detectarse utilizando fosfatasa alcalina de IgG anti-humano y desarrollarse con tabletas de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).

Animales No Humanos Transqénicos Que Generan Anticuerpos Anti- CD148 Monoclonales de Humano Los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra polipéptidos CD148 pueden generarse utilizando ratones transgénicos llevando partes del sistema inmune humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos, referidos en la presente como ratones "HuMAb", contienen un minílugar de gen de inmunoglobulína de humano que codifica secuencias de inmunoglobulin de cadena ligera K y pesada (µ y ?) de humano sin ordenar, junto con mutaciones objetivo que inactívan el lugar de cadena µ y K (Lonberg , eí al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). De acuerdo con lo anterior, los ratones muestran expresión reducida de IgM de ratón o K, y en respuesta a inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera de humano introducidos experimentan cambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales de lgG? de humano de alta afinidad (Lonberg, N. ef al. (1994), supra; revisado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 1 13:49-101 ; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, y Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N .Y. Acad. Sci 764:536-546). La preparación de ratones HuMAb se describe en detalle abajo y en Taylor, L. ef al (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. ef al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon ef al. (1993) Proc. Nati . Acad. Sci USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 1 17-123; Chen , J. eí al. (1993) EMBO J. 12:821 - 830; Tuaillon eí al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg eí al., (1994) Nature 368(6474):856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. ef al. (1994) International Immunology 6:579-591; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, D. ef al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente en su totalidad. Ver además, Pats. de EE.UU. Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; todas para Lonberg and Kay, y GenPharm International; Pat. de EE.UU. No. 5,545,807 para Surani ef al.; Nos. de Publicación Internacional WO 98/24884, publicada el 11 de Junio de 1998; WO 94/25585, publicada el 10 de Noviembre de 1994; WO 93/1227, publicada el 24 de Junio de 1993; WO 92/22645, publicada el 23 de Diciembre de 1992; WO 92/03918, publicada el 19 de Marzo de 1992, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. Alternativamente, los ratones transgénicos pueden utilizarse para generar anticuerpos anti-CD148 humanos. Para generar anticuerpos monoclonales humanos para CD148, ratones HuMAb pueden inmunizarse con una preparación purificada o enriquecida de antígeno CD148 y/o células expresando CD148, como se describe por Lonberg, N. eí al. (1994) Nature 368(6474):856-859; Fishwild, D. ef al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851 y WO 98/24884. Preferentemente, los ratones serán de 6-16 semanas de edad en la primer infusión. Por ejemplo, una preparación purifícada o enriquecida (5-20 µg) de antígeno CD148 (por ejemplo, purificado de células LNCaP expresando CD 148) pueden utilizarse para inmunizar los ratones HuMAb intraperitonealmente. En el caso que inmunizaciones utilizando una preparación purificada o enriquecida de antígeno CD148 no resultan en anticuerpos, los ratones también pueden inmunizarse con células expresando CD148, por ejemplo, una estirpe de línea de tumor, para promover las respuestas inmunes. La experiencia acumulativa con varios antígenos ha mostrado que los ratones transgénicos HuMAb responden bien cuando se inmunizan inícialmente intraperitonealmente (IP) con antígeno en adyuvante de Freund completo, seguido por cada otra semana i.p. inmunizaciones (hasta un total de 6) con antígeno en adyuvante de Freund. La respuesta inmune puede monitorearse sobre el curso del procedimiento de inmunización con muestras de plasma obteniéndose por sangrados retroorbitales. El plasma puede seleccionarse por ELISA (como se describe abajo), y los ratones con suficientes concentraciones de ¡nmunoglobulina de humano anti-CD148 pueden utilizarse para fusiones. Los ratones pueden reforzarse intravenosamente con antígeno 3 días antes del sacrificio y retiro del bazo. Se espera que 2-3 fusiones para cada antígeno pueden necesitarse para ser realizadas. Siete ratones se inmunizaran para cada antígeno. Por ejemplo, un total de doce ratones HuMAb de las cepas HC07 y HC012 pueden inmunizarse.

En todavía otro aspecto, la invención proporciona animales no humanos transgénicos, por ejemplo, un ratón transgénico, que son capaces de expresar anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a epítopos CD 148 de la presente invención. En una modalidad preferida, los animales no humanos transgénicos, por ejemplo, los ratones transgénicos (ratones HuMAb), tienen un genoma comprendiendo un transgen de cadena pesada de humano y un transgen de cadena ligera. En una modalidad, los animales no humanos transgénícos, por ejemplo, los ratones transgénicos, se han inmunizado con una preparación purificada o enriquecida de antígeno CD148 y/o células expresando CD148. Preferentemente, los animales no humanos transgénicos, por ejemplo, los ratones transgénicos, son capaces de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para CD148 (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgE) al experimentar recombinación V-D-J y cambio de isotípo. El cambio de isotipo puede ocurrir, mediante, por ejemplo, cambio de isotipo clásico o no clásico. El diseño de un animal no humano transgénico que responde a estimulación de antígeno externo con un repertorio de anticuerpo heterólogo, requiere que los transgenes de inmunoglobulina heterólogos contienen dentro de la función de animal transgénico correctamente por la trayectoria de desarrollo de célula B. En una modalidad preferida, la función correcta de un transgen de cadena pesada heterólogo incluye cambio de isotipo. De acuerdo con lo anterior, los transgenes de la invención se construyen para producir cambio de isotipo y uno o más de los siguientes: (1 ) alto nivel y expresión específica del tipo celular, (2) reordenación del gen funcional, (3) activación de y respuesta a exclusión alélica, (4) expresión de un repertorio humano suficiente, (5) transducción de señal, (6) hipermutacíón somática, y (7) dominación del lugar de anticuerpo transgénico durante la respuesta inmune. No todos los criterios anteriores necesitan satisfacerse. Por ejemplo, en aquellas modalidades en donde el lugar de inmunoglobulina endógena del animal transgénico se interrumpen funcionalmente, el transgen no necesita activar la exclusión alélica. Además, en aquellas modalidades en donde el transgen comprende un gen de inmunoglobulina de cadena pesada y/o ligera funcionalmente reordenada, los segundos criterios de reordenación de gen funcional son innecesarios, al menos para esos transgenes que ya se reordenan. Para antecedentes en inmunología molecular, ver, Fundamental Immunology, 2nd editíon (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N.Y., que se incorpora en la presente para referencia. En ciertas modalidades, los anímales no humanos transgénicos utilizados para generar los anticuerpos monoclonales humanos de la invención contienen transgenes de cadena pesada y ligera reordenada, no reordenada o una combinación de reordenada y no reordenada de inmunoglobulina heteróloga en la línea germinal del animal transgénico. Cada uno de los transgenes de cadena pesada comprende al menos un gen CH- Además, el transgen de cadena pesada puede contener secuencias de cambio de isotipo funcional, que son capaces de soportar cambio de ¡sotipo de un transgen heterólogo codificando múltiples genes CH en las células B del animal transgénico. Tales secuencias de cambio pueden ser aquellas que ocurrirán naturalmente en el lugar de inmunoglobulína de línea germinal de las especies que sirven como la fuente de los genes CH de transgen, o tales secuencias de cambio pueden derivarse de aquellas que ocurren en las especies, es decir para recibir la construcción de transgen (el animal transgénico). Por ejemplo, una construcción de transgen humano que se utiliza para producir un ratón transgénico puede producir una frecuencia más alta de eventos de cambio de isotipo si incorpora secuencias de cambio similares a aquellas que ocurren naturalmente en el lugar de cadena pesada de ratón, como presumiblemente las secuencias de cambio de ratón se optimizan para funcionar con el sistema de enzima de recombinasa de cambio de ratón, mientras las secuencias de cambio no humano no. Las secuencias de cambio pueden aislarse y clonarse por métodos de clonación convencionales, o pueden sintetizarse de novo de oligonucleótidos sintéticos de superposición diseñados en la base de información de secuencia publicada relacionada con secuencias de región de cambio de inmunogiobulina (Mills ef al., Nucí. Acids Res. 15:7305-7316 (1991 ); Sideras ef al., Intl. Immunol. 1 :631 -642 (1989), que se incorporan en la presente para referencia). Para cada uno de los siguientes animales transgénicos, los transgenes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera, heterólogos funcionalmente reordenados se encuentran en una fracción significativa de las células B del animal transgénico (al menos 10 por ciento). Los transgenes utilizados para generar los animales transgénicos de la invención incluyen un transgen de cadena pesada comprendiendo ADN codificando al menos un segmento de gen variable, un segmento de gen de diversidad, un segmento de gen de unión y almenos un segmento de gen de región constante. El transgen de cadena ligera de inmunoglobulina comprende ADN codificando al menos un segmento de gen variable, un segmento de gen de unión y al menos un segmento de gen de región variable. Los segmentos de gen codificando los segmentos de gen de cadena ligera y pesada son heterólogos al animal no humano transgénico en que se derivan de, o corresponden a, ADN codificando segmentos de gen de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de una especie no consistiendo del animal no humano transgéníco. El transgen puede, por ejemplo, construirse de manera que los segmentos de gen individuales no se reordena, es decir, no se reordenan para codificar una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina funcional. Tales transgenes no reordenados soportan la recombinación de los segmentos de gen V, D y J (reordenación funcional) y preferentemente soportan la incorporación de toda o una porción del segmento de gen de región D en la cadena pesada de inmunoglobulina reordenada resultante dentro del animal no humano transgénico cuando se expone a antígeno CD148.

Los transgenes también pueden comprender un "minilugar" no reordenado. Tales transgenes típicamente comprende una porción substancial de los segmentos C, D y J así como también un subconjunto de los segmentos de gen V. En tales construcciones de transgen, las diversas secuencias reguladoras, por ejemplo, promotoras, aumentadoras, regiones de cambio de clase, secuencias donadoras divisoras y aceptadoras divisoras para procesamiento de ARN, señales de recombinación y lo similar, comprenden secuencias correspondientes derivadas del ADN heterólogo. Tales secuencias reguladoras pueden incorporarse en el transgen del mismo o una especie relacionada del animal no humano utilizado en la invención. Por ejemplo, los segmentos de gen de inmunoglobulina de humano pueden combinarse en un transgen con una secuencia aumentadora de inmunoglobulina para utilizarse en un ratón transgénico. Alternativamente, las secuencias reguladoras sintéticas pueden incorporarse en el transgen, en donde tales secuencias reguladoras sintéticas no son homologas a una secuencia de ADN funcional que se conoce que ocurre naturalmente en los genomas de mamíferos. Las secuencias reguladoras sintéticas se designan de acuerdo a reglas de consenso, tales como, por ejemplo, aquellas especificando las secuencias permisibles de un sitio aceptador divisor o un motivo promotor/aumentador. Por ejemplo, un minilugar comprende una porción del lugar de inmunoglobulina genómica teniendo al menos una eliminación interna (es decir, no en un término de la porción) de una porción de ADN no esencial (por ejemplo, secuencia de intervención; intrón o porción de la misma) en comparación con el lugar Ig de línea germinal que ocurre de manera natural. Los animales transgénicos también pueden utilizarse para generar anticuerpos humanos para CD148 conteniendo al menos una, típicamente 2-10, y algunas veces 25-50 o más copies del transgen descrito en el Ejemplo 12 de WO 98/24884 (por ejemplo, pHC1 o pHC2) criado con un animal conteniendo una copia única de y un transgen de cadena ligera descrito en los Ejemplos 5, 6, 8, o 14 de WO 98/24884, y la descendencia alimentada con el animal sin JH descrito en el Ejemplo 10 de WO 98/24884, los contenidos de los cuales se incorporan de manera expresa en la presente para referencia. Los animales se crían con homozigositis para cada uno de estos tres tratados. Tales anímales tienen el siguiente genotipo: una copia única (por conjunto haploide de cromosomas) de un mini-lugar no reordenado de cadena pesada de humano (descrito en el Ejemplo 12 de WO 98/24884), una copia única (por conjunto haploide de cromosomas) de una construcción de cadena ligera kappa de humano reordenada (descrita en el Ejemplo 14 de WO 98/24884), y una eliminación en cada lugar de cadena pesada de ratón endógeno que remueve todos de los segmentos JH funcionales (descritos en el Ejemplo 10 de WO 98/24884). Tales animales se alimentan con ratones que son homocigosos para la eliminación de los segmentos JH (Ejemplo 10 de WO 98/24884) para producir descendencia que son homocigosos para la eliminación de JH y hemicigosos para las construcciones de cadena pesada y ligera de humano. Los animales resultantes se inyectan con antígenos y utilizan para producción de anticuerpos monoclonales humanos contra estos antígenos. Las células B aisladas de tal animal son monoespecíficas con respecto a las cadenas pesadas y ligeras de humano debido a que contienen solamente una copia única de cada gen. Además, serán monoespecíficas con respecto a cadenas pesadas de ratón o humano debido a que ambas copias de gen de cadena pesada de ratón endógenas son no funcionales en virtud de la eliminación expandiendo la región JH introducida como se describe en el Ejemplo 9 y 12 de WO 98/24884. Además, una fracción substancial de las células B será monoespecífica con respecto a las cadenas ligeras de ratón o humano debido a que la expresión de la copia única del gen de cadena ligera kappa de humano reordenada excluirá alélica e isotópicamente la reordenación de los genes de cadena kappa y lambda de ratón endógeno. Los ratones transgénicos de la modalidad preferida mostrarán producción de inmunoglobulína con un repertorio significativo, idealmente de manera substancial similar a aquel de un ratón nativo. De esta manera, por ejemplo, en modalidades donde los genes Ig endógenos se han activado, los niveles de inmunoglobulina totales variarán de aproximadamente 0.1 a 10 mg/ml de suero, preferentemente 0.5 a 5 mg/ml, idealmente al menos aproximadamente 1 .0 mg/ml. Cuando un transgen capaz de efectuar un cambio a IgG de IgM se ha introducido en el ratón transgénico, la proporción de ratón adulto de suero IgG a IgM es preferentemente aproximadamente 1 0: 1 . La proporción de IgG a IgM será mucho más baja en el ratón inmaduro. En general, más de aproximadamente 1 0% , preferentemente 40 a 80% del bazo y células B de nodo linf expresan exclusivamente proteína de IgG de humano. El repertorio será idealmente aproximado a aquel mostrado en un ratón no transgénico, usualmente al menos aproximadamente 1 0% tan alto, preferentemente 25 a 50% o más. Generalmente, al menos aproximadamente un ciento de diferentes inmunoglobulinas (idealmente IgG), preferentemente 1 04 a 1 06 o más, se producirán , dependiendo principalmente del número de diferentes regiones V, J y D introducidas en el genoma de ratón . Estas inmunoglobulinas típicamente reconocerán aproximadamente una mitad o más de proteínas altamente antígénicas, por ejemplo, proteína A de estafilococos. Típicamente, las ¡nmunoglobulinas mostrarán una afinidad para antígenos preseleccionados de al menos aproximadamente 1 07 M"1 , preferentemente al menos aproximadamente 1 09 M"1 , más preferentemente al menos aproximadamente 1 01 0 M"1 , 101 1 M"1 , 1012 M"1 , o mayor, por ejemplo, hasta 1 01 3 M"1 o mayor. En algunas modalidades, puede ser preferible generar ratones con repertorios predeterminados para limitar la selección de genes V representados en la respuesta de anticuerpo a tipo de antígeno predeterminado. Un transgen de cadena pesada teniendo un repertorio predeterminado puede comprender, por ejemplo, genes VH de humano que se utilizan preferentemente en respuestas de anticuerpo al tipo de antígeno predeterminado en humanos. Alternativamente, algunos genes VH pueden excluirse de un repertorio definido por varias razones (por ejemplo, tienen una baja probabilidad de codificar regiones V de alta afinidad para el antígeno predeterminado; tienen una baja propensión a experimentar mutación somática y afilamiento de afinidad; o son inmunogénicos a ciertos humanos). De esta manera, antes de reordenación de un transgen conteniendo varios segmentos de gen de cadena pesada y ligera, tales segmentos de gen pueden identificarse fácilmente, por ejemplo, por hibridízación o secuenciación de ADN, como siendo de una especie de organismo diferente al animal transgéníco. Los ratones transgénicos de la presente invención pueden inmunizarse con una preparación purifícada y enriquecida de antígeno CD148 y/o células expresando CD148 como se describe previamente. Los ratones producirán células B que experimentan cambio de clase a través de recombinación de cambio intratransgen (cambio cis) y expresan inmunoglobulinas reactivas con CD148. Las inmunoglobulinas pueden ser anticuerpos de secuencia de humano, en donde los polipéptidos de cadena pesada y ligera se codifican por secuencias de transgen de humano, que pueden incluir secuencias derivadas por mutación somática y uniones de recombinación de región V, así como también secuencias codificadas de línea germinal; estas inmunoglobulinas de secuencia de humano pueden referirse como siendo substancialmente idénticas a una secuencia de polipéptido codificada por un segmento de gen VL o VH y un segmento JL o J de humano, aún cuando otras secuencias de línea no germinal pueden estar presentes como un resultado de mutación somática y uniones de recombinación diferenciales V-J y V-D-J. Con respecto a tales anticuerpos de secuencia de humano, las regiones variables de cada cadena son típicamente al menos 80 por ciento codificados por línea germinal de humano V, J, y, en el caso de cadenas pesadas, D, segmentos de gen; frecuentemente al menos 85 por ciento de las regiones variables se codifican por secuencias de línea germinal de humano presentes en el transgen; con frecuencia 90 o 95 por ciento o más de las secuencias de región variable se codifican por secuencias de línea germinal de humano presentes en el transgen. Sin embargo, ya que las secuencias de línea no germinal se introducen por mutación somática y unión de VJ y VDJ, los anticuerpos de secuencia de humano tendrán frecuentemente algunas secuencias de región variable (y menos frecuentemente secuencias de región constante) que no se codifican por segmentos de genes V, D, o J como se encuentra en el(los) transgen(es) humano(s) en la línea germinal de los ratones. Típicamente, tales secuencias de línea no germinal (o posiciones de nucleótido individuales) se agruparán en o cerca de CDRs, o en regiones donde mutaciones somáticas se conocen por agruparse. Los anticuerpos de secuencia de humano que se unen a antígeno predeterminado pueden resultar de cambio de isotipo, de manera que los anticuerpos humanos comprendiendo una cadena ? de secuencia de humano (tales como ?1 , ?2a, ?2B, o ?3) y una cadena ligera de secuencia de humano (tal como la cadena ligera kappa) se producen. Tales anticuerpos de secuencia de humano cambiada de isotipo con frecuencia contienen una o más mutaciones somáticas, típicamente en la región variable y con frecuencia en o dentro de aproximadamente 10 residuos de una CDR) como un resultado de maduración de afinidad y selección de células B por antígeno, particularmente subsiguiente a cambio de antígeno secundario (o subsiguiente). Una vez que la línea germinal de ratón se ha formado por contener un YAC funcional teniendo un repertorio de segmento V expandido, substancialmente no presente en el transgen Ig de humano conteniendo los segmentos de gen J y C, el tratado puede propagarse y criarse en otros antecedentes genéticos, incluyendo antecedentes donde YAC funcional teniendo un repertorio de segmento V expandido se cría en una línea germinal de ratón teniendo un transgen Ig de humano diferente. Múltiples YACs funcionales teniendo un repertorio de segmento V expandido puede criarse en una línea germinal para trabajar con un transgen de Ig de humano (o múltiples transgenes de Ig de humano). Aunque se refieren en la presente como transgenes YAC, tales transgenes cuando se integran en el genoma pueden carecer substancialmente de secuencias de levadura, tales como secuencias requeridas para réplica autónoma en levadura; tales secuencias pueden removerse opcionalmente por ingeniería genética (por ejemplo, digestión de restricción y electroforesis de gel de campo pulsado u otro método adecuado) después de que la réplica en levadura ya no es necesaria (es decir, antes de la introducción en una célula ES de ratón o procigoto de ratón). Los métodos para propagar el tratado de expresión de ¡nmunoglobulina de secuencia de humano, incluyen criar un ratón transgénico teniendo el(los) transgen(es) Ig de humano, y opcionalmente también teniendo un YAC funcional teniendo un repertorio de segmento V expandido. Ambos segmentos de gen VH y V pueden estar presentes en YAC. El ratón transgénico puede criarse en cualquier antecedente deseado por el practicante, incluyendo antecedentes alojando otros transgeries de humano, incluyendo transgenes de Ig de humano y/o transgenes codificando otras proteínas de linfocito de humano. La invención también proporciona una inmunoglobulina de secuencia de humano de alta afinidad producida por un ratón transgénico teniendo un transgen YAC de repertorio de región V expandida. Aunque lo anterior describe una modalidad preferida del animal transgénico de la invención, otras modalidades se contemplan que incluyen (1 ) animales transgénicos conteniendo un transgen de inmunoglobulina ligero reordenado y pesado reordenado; (2) animales transgénicos conteniendo un transgen de inmunoglobulina ligero no reordenado y pesado no reordenado; (3) animales transgénicos conteniendo transgen de inmunoglobulina ligero no reordenado y pesado reordenado; y (4) animales transgénicos conteniendo transgenes de inmunoglobulina ligeros reordenados y pesados reordenados. Moléculas Biespecíficas/Multiespecífícas que se Unen a CD148 En todavía otra modalidad de la invención, los anticuerpos monoclonales humanos para CD 148, o regiones de unión a antígeno de los mismos, pueden derivarse o enlazarse a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptído o proteína (por ejemplo, un fragmento Fab') para generar una molécula biespecífica o multiespecífica que se une a múltiples sitios de unión o epítopos objetivo. Por ejemplo, un anticuerpo o región de unión a anticuerpo de la invención puede enlazarse funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más moléculas de unión, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o imitación de unión. De acuerdo con lo anterior, la presente invención incluye moléculas bíespecíficas y multiespecífícas comprendiendo al menos una primer especificidad de unión para CD148 y una segunda especificidad de unión para un segundo epítopo objetivo. En una modalidad particular de la invención, el segundo epítopo objetivo es un receptor Fc, por ejemplo, Fc?RI de humano (CD64) o un receptor Fca de humano (CD89). Por lo tanto, la invención incluye moléculas biespecíficas y multiespecíficas capaces de unirse ambas a células efectoras expresando Fc?R, FcaR o FceCR (por ejemplo, monocitos, macrófagos o células polimorfonucleares (PMNs)), y a células objetivo expresando CD148. Estas células expresando CD148 objetivo de moléculas biespecíficas y multiespecíficas para célula efectora y, similar a los anticuerpos monoclonales humanos de la invención, activan las actividades de la célula efectora mediada por el receptor Fc, tal como fagocitis de una célula expresando CD148, citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC), liberación de citoquina, o generación de anión de superóxído. Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención pueden además incluir una tercer especificidad de unión, además de una especificidad de unión anti-Fc y una especificidad de unión anti- CD 148. En una modalidad, la tercer especificidad de unión es una porción de factor anti-mejora (EF), por ejemplo, una molécula que se une a una proteína de superficie incluida en actividad citotóxica e incrementa así la respuesta inmune contra la célula objetivo. La "porción de factor anti-mejora" puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo funcional o un ligando que se une a una molécula dada, por ejemplo, un antígeno o un receptor, y resulta sí en una mejora del efecto de los determinantes de unión para el receptor Fc o antígeno de célula objetivo. La "porción de factor anti-mejora" puede unir un receptor Fc o un antígeno de célula objetivo. Alternativamente, la porción de factor anti-mejora puede unirse a una entidad que es diferente de la entidad a la cual las especificidades de unión, primera y segunda, se unen. Por ejemplo, la porción de factor anti-mejora puede unir una célula T citotóxica (por ejemplo, a través de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra célula inmune que resulta en una respuesta inmune incrementada contra la célula objetivo). En una modalidad, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención comprenden como una especificidad de unión menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, ¡ncluyendo, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, o un Fv de cadena única. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena pesada o cadena ligera, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como Fv o una construcción de cadena única como se describe en Ladner et al. Pat. de EE.UU. No. 4,946,778, los contenidos de las cuales se incorporan de manera expresa para referencia. En otra modalidad, las moléculas biespecíficas y multiespecífícas de la invención comprenden una especificidad de unión para un FcaR o un Fc?R presente en ia superficie de una célula efectora, y una segunda especificidad de unión para un antígeno de célula objetivo, por ejemplo, CD148. En otra modalidad, la especificidad de unión para un receptor Fc se proporciona por un anticuerpo monoclonal humano, la unión del cual no se bloquea por inmunoglobulina humana G (IgG). Como se utiliza en la presente, el término "receptor IgG" se refiere a cualquiera de los ocho genes de cadena ? ubicados en el cromosoma 1 . Estos genes codifican un total de doce isoformas de receptor soluble o transmembrana que se agrupan en tres clases de receptor Fc?: Fc?RI (CD64), Fc?RII (CD32), y Fc?RII I (CD16). En una modalidad preferida, el receptor Fc? es un Fc?RI de alta afinidad de humano. Fc?RI de humano es una molécula de 72 kDa, que muestra alta afinidad para IgG monomérica (108-109 M"1). La producción y caracterización de estos anticuerpos monoclonales preferidos se describen por Fanger ef al. en solicitud PCT WO 88/00052 y en Pat. de EE.UU. No. 4,954,617, las enseñanzas de las cuales se incorporan completamente para referencia en la presente. Estos anticuerpos se unen a un epítopo de Fc?RI, Fc?RI I o Fc?RI II en un sitio que es distinto del sitio de unión Fc? del receptor y, de esta manera, su unión no se bloquea substancialmente por niveles fisiológicos de IgG. Anticuerpos anti- Fc?RI específicos útiles en esta invención son MAb 22, MAb 32, MAb 44, MAb 62 y MAb 197. El hibridoma produciendo MAb 32 está disponible de la Colección de Cultivo de Tipo Americano, No. de Acceso ATCC HB9469. MAb 22 anti-Fc?RI, fragmentos F(ab')2 de MAb 22, y pueden obtenerse de Medarex, Inc. (Annandale, N.J.). En otras modalidades, el anticuerpo de receptor anti-Fc? es una forma humanizada de anticuerpo monoclonal 22 (H22). La producción y caracterización del anticuerpo H22 se describe en Graziano, R. F. eí al. (1995) J. Immunol 155 (10):4996-5002 y PCT/US93/10384. El anticuerpo H22 produciendo estirpe de célula se deposita en la Colección de Cultivo de Tipo Americano el 4 de Noviembre de 1992 bajo designación HA022CL1 y tiene el no. de acceso CRL 1 1 177. En todavía otras modalidades preferidas, la especificidad de unión para un receptor Fc se proporciona por un anticuerpo que se une a un receptor IgA de humano, por ejemplo, un receptor alfa Fc (FcsRI (CD89)), la unión de la cual es preferentemente no bloqueada por ¡nmunoglobulina A de humano (IgA). El término "receptor IgA" se propone incluir el producto genético de un gen a (FcaRI) ubicado en cromosoma 19. Este gen se sabe que codifica varias isoformas de transmembrana alternativamente divididas de 55 a 1 10 kDa. FcaRI (CD89) se expresa de manera constitutiva en monocitos/macrófagos, granulocitos eosinofílicos y neutrofílicos, pero no en poblaciones de célula no efectoras. FcsRI tiene afinidad media (aproximadamente ¡gual a 5x107 M"1) para ambas lgA1 e IgA2, que se incrementa en la exposición a citoquinas tales como G-CSF o GM-CSF (Morton ef al., Critical Reviews in Immunology 16:423-440 (1996)). Cuatro anticuerpos monoclonales específicos de FcaRI , identificados como A3, A59, A62 y A77, que unen FcaRI fuera del dominio de unión de ligando IgA, se han descrito, por ejemplo, por Monteiro eí al., J. Immunol. 148:1764 (1992). En otra modalidad, los anticuerpos de la presente invención pueden tomar la forma de un fragmento scFv fusionado directamente a la porción Fc (CH2 & CH3) del isotipo lgG1 humano (referido en la presente como una construcción scFv-Fc). La construcción de fusiones scFv-Fc se describe, por ejemplo, por Fredericks ef al., Protein Engineeríng Design and Selection 17:95-106 (2003), Powers ef al., J. Imunological Methods 251 : 123-135 (2001 ), Shu ef al., PNAS 90:7995-7999 (1993), y Hayden ef al. , Therapeutic Immunology 1 :3-15 (1994). FcsRI and Fc?RI son receptores de activación preferidos para utilizarse en la invención debido a que se (1 ) expresan principalmente en células efectoras inmunes, por ejemplo, monocitos, PMNs, macrófagos y células dendrítícas; (2) expresan a altos niveles (por ejemplo, 5,000-100,000 por célula); (3) mediadores de actividades citotóxicas (por ejemplo, ADCC, fagocitis); (4) medían la presentación de antígeno mejorado de antígenos, incluyendo autoantígenos, objetivo. En otras modalidades, las moléculas biespecíficas y multiespecífícas de la invención comprenden además una especificidad de unión que se reconoce, por ejemplo, se une a, un antígeno de célula objetivo, por ejemplo, CD148. En una modalidad particular, la especificidad de unión se proporciona por un anticuerpo monoclonal de humano de la presente invención. Aunque los anticuerpos monoclonales humanos se prefieren, otros anticuerpos que pueden emplearse en las moléculas biespecíficas o multiespecíficas de la invención son anticuerpos de murino, quimérico y monoclonales humanizados. Los anticuerpos monoclonales de ratón-humano quiméricos (es decir, anticuerpos quiméricos) pueden producirse por técnicas de ADN recombinante conocidas en la materia. Por ejemplo, un gen codificando la región constante Fc de una molécula de anticuerpo monoclonal de murino (otras especies) se digiere con enzimas de restricción para remover la región codificando Fc de murino, y la porción equivalente de un gen codificando una región constante Fc de humano se substituye. (ver Robinson et al., Publicación de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira, eí al., Solicitud de Patente Europea 184, 187; Taniguchi, M., Solicitud de Patente Europea 171 ,496; Morrison ef al., Solicitud de Patente Europea 173,494; Neuberger eí al. , Solicitud Internacional WO 86/01533; Cabilly ef al. Pat. de EE. UU. No. 4,816,567; Cabilly eí al., Solicitud de Patente Europea 125,023; Better eí al. , Science 240:1041 -1043 (1988); Liu ef al. , PNAS 84:3439-3443 (1987); Liu eí al., 1987, J . Immunol. 139:3521 -3526; Sun eí al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura eí al., Cañe. Res. 47:999-1005 (1987); Wood ef al., Nature 314:446-449 (1985); y Shaw ef al., J. Nati Cáncer Inst. 80:1553-1559 (1988). El anticuerpo quimérico puede humanizarse además al reemplazar las secuencias de la región variable Fv que no se incluyen directamente en unión de antígeno con secuencias equivalentes de regiones variables Fv de humano. Las revisiones generales de anticuerpos quiméricos humanizados se proporcionan por Morrison, Science 229:1202-1207 (1985) y por Oi eí al., BioTechniques 4:214 (1986). Aquellos métodos incluyen aislar, manipular, y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican todas o parte de las regiones variables Fv de inmunoglobulin de al menos una de una cadena pesada o ligera. Fuentes de tal ácido nucleico se conocen bien por aquellos expertos en la materia y, por ejemplo, pueden obtenerse de 7E3, un anticuerpo anti-GPIIbll la produciendo híbridoma. El ADN recombinante codificando el anticuerpo quimérico, o fragmento del mismo, puede clonarse entonces en un vector de expresión apropiado. Los anticuerpos humanizados adecuados pueden producirse de manera alternativa por substitución CDR Pat. de EE.UU. No. 5,225,539; Jones ef al., Nature 321 :552-525 (1986); Verhoeyan ef al., Science 239:1534 (1988); y Beidler eí al., J . Immunol. 141 :4053-4060 (1988). CDRs de un anticuerpo humano particular pueden reemplazarse con al menos una porción de una CDR no humana o solamente algunas de las CDRs pueden reemplazarse con CDRs no humanas. Es solamente necesario reemplazar el número de CDRs requeridas para unión del anticuerpo humanizado al receptor Fc. Un anticuerpo puede humanizarse por cualquier método, que es capaz de reemplazar al menos una porción de una CDR de un anticuerpo humano con una CDR derivada de un anticuerpo no humano. Winter describe un método que puede utilizarse para preparar los anticuerpos humanizados de la presente invención (Solicitud de Patente RU GB 2188638A, presentada el 26 de Marzo de 1987), los contenidos de la cual se incorpora de manera expresa para referencia. Las CDRs de humano pueden reemplazarse con CDRs no humanas utilizando mutagénesis dirigida de sitio de oligonucleótido como se describe en la Solicitud Internacional WO 94/10332 titulada, "Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes". También dentro del alcance de la invención son anticuerpos quiméricos e humanizados en los cuales los aminoácidos específicos se han substituido, eliminado o agregado. En particular, los anticuerpos humanizados preferidos tienen substituciones de aminoácido en la región de estructura, tal como para mejorar la unión al antígeno. Por ejemplo, en un anticuerpo humanizado teniendo CDRs de ratón, aminoácidos ubicados en la región de estructura de humano pueden reemplazarse con los aminoácidos ubicados en las posiciones correspondientes en el anticuerpo de ratón . Tales substituciones se conocen por mejorar la unión de anticuerpos humanizados al antígeno en algunos casos. Los anticuerpos en los cuales los aminoácidos se han agregado, eliminado o substituido se refieren en la presente como anticuerpos modificados o anticuerpos alterados. El término anticuerpo modificado también se propone incluir anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, y anticuerpos humanizados que se han modificado al, por ejemplo, eliminar, agregar o sustituir porciones del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo puede modificarse al eliminar la región constante y reemplazarlo con una región constante significa incrementar la vida media , por ejemplo, vida media de suero, estabilidad o afinidad del anticuerpo. Cualquier modificación está dentro del alcance de la invención siempre que la molécula biespecífica y multiespecífica tenga al menos una región de unión a antígeno específica para Fc?R y activa al menos una función efectora. Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la presente invención pueden hacerse utilizando técnicas qu ímicas (ver por ejemplo, D . M . Kranz eí al. , Proc. Nati. Acad . Sci . USA 78:5807 (1 981 ), técnicas de "polidoma" (Ver Pat. de EE. UU . No. 4,474,893, para Reading), o técnicas de ADN recombinante. En particular, las moléculas bíespecíficas y multiespecífícas de la presente invención pueden prepararse al conjugar las especificidades de unión de constituyente, por ejemplo, las especificidades de unión anti-FcR y anti-CD 148, utilizando métodos conocidos en la materia y se describen en los ejemplos proporcionados en la presente. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula bíespecífica y multiespecífica puede generarse por separado y después se conjuga entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptídos, una variedad de acoplamiento o agentes de degradación pueden utilizarse para conjugación covalente. Ejemplos de agentes degradantes incluyen proteína A, carbodiimida, N-sucinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácído 2-nitrobenzóico) (DTNB), o-fenilenodímaleimida (oPDM), N-sucinímidil-3-(2-pirid¡lditío)prop¡onato (SPDP), y sulfosucinimídil 4-(N-maleimidometi I )cicloh axa no- 1 -carboxi lato (sulfo-SMCC) (ver por ejemplo, Karpovsky eí al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, M A eí al. (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:8648). Otros métodos incluyen aquellos descritos por Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 1 18-132); Brennan eí al. (Science (1985) 229:81 -83), y Glennie ef al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375). Agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, ll l). Cualquier grupo "enlazador" es opcional. Cuando está presente, su estructura química no es crítica, ya que sirve principalmente como un espaciador. El enlazador se hace preferentemente de aminoácidos enlazados juntos por enlaces de péptido. De esta manera, en modalidades preferidas, el enlazador se hace de desde 1 a 20 aminoácidos enlazados por enlaces de péptido, en donde los aminoácidos se seleccionan de los 20 aminoácidos que ocurren de manera natural. Uno o más de estos aminoácidos pueden glicosilarse, como se entiende bien por aquellos en la materia. En una modalidad más preferida, los 1 a 20 aminoácidos se seleccionan de glicina, alanina, prolína, asparagina, glutamina, y lisina. Aún más preferentemente, un enlazador se hace de una mayoría de aminoácidos que son estéricamente no ocultos, tales como glicina y alanina. De esta manera, los enlazadores preferidos son poliglicinas (particularmente (Gly). sub.5, (Gly). sub.8), poly(Gly-Ala), y polialaninas. Combinaciones de Gly y Ala también se prefieren. Los enlazadores sin péptido también son posibles. Por ejemplo, enlazadores de alquilo tales como -NH— (CH.sub.2)s-C(O)— , en donde s=2-20 puede utilizarse. Estos enlazadores de alquilo pueden substituirse además por cualquier grupo no estéricamente oculto tal como alquilo inferior (por ejemplo, C1 -C6) acilo inferior, halógeno (por ejemplo, Cl, Br), CN, NH2, fenil, etc. Un enlazador no péptido ejemplificativo es un enlazador PEG, y tiene un peso molecular de 100 a 5000 kDa, preferentemente 100 a 500 kDa. Los enlazadores de péptido pueden alterarse para formar derivados en la misma manera como se describe arriba. Cuando las especificidades de unión son anticuerpos (por ejemplo, dos anticuerpos humanizados) pueden conjugarse a través de unión de sulfhidril de las regiones de articulación de término C de las dos cadenas pesadas. En una modalidad particularmente preferida, la región de articulación se modifica para contener un número impar de residuos de sulfhidril, preferentemente, uno antes de conjugación. Alternativamente, ambas especificidades de unión pueden codificarse en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma célula huésped. Este método es particularmente útil donde las moléculas biespecíficas y multiespecíficas es una proteína de fusión MabxMAb, MabxFab, FabxF(ab')2 o lígandoxFab. Una molécula biespecífíca y multiespecífica de la invención, por ejemplo, una molécula biespecífica puede ser una molécula de cadena única, tal como un anticuerpo biespecífico de cadena única, y una molécula biespecífica de cadena única comprendiendo un anticuerpo de cadena única y un determinante de unión, o una molécula biespecífica de cadena única comprendiendo dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas también pueden ser moléculas de cadena única o pueden comprender al menos dos moléculas de cadena única. Métodos para preparar moléculas bi y multiespecíficas se describen por ejemplo en Pat. de EE.UU. No. 5,260,203; Pat. de EE.UU. No. 5,455,030; Pat. de EE.UU. No. 4,881 , 175; Pat. de EE.UU. No. 5, 132,405; Pat. de EE.UU. No. 5,091 ,513; Pat. de EE. UU. No. 5,476,786; Pat. de EE.UU. No. 5,013,653; Pat. de EE.UU. No. 5,258,498; y Pat. de EE.UU. No. 5,482,858.

La unión de las moléculas biespecíficas y multiespecíficas a sus objetivos específicos puede confirmarse por ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA), un radioinmunoensayo (RÍA), análisis FACS, un bioensayo (por ejemplo, inhibición de crecimiento) o un Ensayo Western Blot. Cada uno de estos ensayos generalmente detecta la presencia de complejos de proteína-antícuerpo de interés particular al emplear un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo , los complejos FcR-anticuerpo pueden detectarse utilizando, por ejemplo , un anticuerpo enlazado a enzima o fragmento de anticuerpo que reconoce y se une específicamente a los complejos de anticuerpo-Fcr. Alternativamente, los complejos pueden detectarse utilizando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse radioactivamente y utilizarse en un radioinmunoensayo (RÍA) (ver, por ejemplo, Weintraub, B . , Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Marzo, 1986, que se incorporada para referencia en la presente). El isótopo radioactivo puede detectarse por tales medios como el uso de un contador ? o un contador de muestreo o por autoradiografía. En los anticuerpos y regiones de unión a antígeno de los mismos también pueden combinarse con un vehículo para suministro objetivo a una ubicación específica. En una modalidad , esta invención proporciona anticuerpos, o regiones de unión a antígeno de los mismos, que se unen a al menos un vehículo (F1 , F2) a través del término N, término C o una cadena lateral de uno de los residuos aminoácidos de(los) péptido(s). Múltiples vehículos también pueden utilizarse, por ejemplo, Fc's en cada término o un Fc en un término y un grupo PEG en el otro término o una cadena lateral. Un dominio Fc es un vehículo preferido. El dominio Fc puede fusionarse a los términos N o C de los péptidos o en ambos de los términos N y C. Como se observa arriba, las variantes Fc son vehículos adecuados dentro del alcance de esta invención. Un Fc nativo puede modificarse de manera extensiva para formar una variante Fc de acuerdo con esta invención, siempre que la unión al receptor de salvamento se mantiene. Ver, por ejemplo, WO 97/34631 y WO 96/32478. En tales variantes, uno puede remover uno o más sitios de un Fe nativo que proporciona características estructurales o actividad funcional no requerida por las moléculas de fusión de esta invención. Uno puede remover estos sitios al, por ejemplo, sustituir o eliminar residuos, insertando residuos en el sitio, o truncando porciones conteniendo el sitio. Los residuos insertados o substituidos también pueden ser aminoácidos alterados, tales como peptidoimitaciones o D-aminoácidos. Variantes Fc ejemplificativas incluyen moléculas y secuencias en las cuales: 1. Sitios incluidos en formación de unión de disulfuro se remueven. Tal retiro puede evitar la reacción con otras proteínas conteniendo cisteína presentes en la célula huésped utilizada para producir las moléculas de la invención. Para este propósito, el segmento conteniendo cisteína en el término N pueden truncados o residuos de cisteína pueden eliminarse o substituirse con otros aminoácidos (por ejemplo, alanil, seril). Aún cuando los residuos de cisteína se remueven, los dominios Fc de cadena única pueden formar aún un dominio Fc dimérico que se mantienen juntos de manera no covalente. 2. Un Fc nativo se modifica para hacerlo más compatible con una célula huésped seleccionada. Por ejemplo, uno puede remover la secuencia PA cerca del término N de un Fc nativo típico, que puede reconocerse por una enzima digestiva en E. coli tal como imínopéotidos de prolina. Uno también puede agregar un residuo metionil de terminal N, especialmente cuando la molécula se expresa de manera recombinante en una célula bacterina tal como E. coli. 3. Una porción del término N de un Fc nativo se remueve para prevenir la heterogeneidad de terminal N cuando se expresa en una célula huésped seleccionada. Para este propósito, uno puede eliminar cualquiera de los primeros 20 residuos de aminoácidos en el término N, particularmente aquellos en posiciones 1 , 2, 3, 4 y 5. 4. Uno o más sitios de glicosilación se remueven. Los residuos que se glicosílan típicamente (por ejemplo, asparagina) pueden conferir respuesta citolítíca. Tales residuos pueden eliminarse o substituirse con residuos no glícosilados (por ejemplo, alanína). 5. Sitios incluidos en interacción con complemento, tal como el sitio de unión C1 q, se remueven. Por ejemplo, uno puede eliminar o sustituir la secuencia EKK de lgG 1 de humano. El reclutamiento complemento puede no ser ventajoso para las moléculas de esta invención y también pueden evitarse con tal variante Fc. 6. Los sitios se remueven, lo que afecta la unión a receptores Fc diferentes a un receptor de salvamento. Un Fc nativo puede tener sitios para interacción con ciertos glóbulos blancos que no se requieren para las moléculas de fusión de la presente invenciín y se remueven así. 7. El sitio DAC se remueve. Los sitios DAC se conocen en la materia. Ver, por ejemplo, Molec. Immunol. 29 (5):633-9 (1992) con respecto a sitios ADCC en lgG1 . Estos sitios, así también, no se requieren para las moléculas de fusión de la presente invención y así pueden removerse. 8. Cuando Fc nativo se deriva de un anticuerpo no humano, Fc nativo puede humanizarse. Típicamente, para humanizar un Fc nativo, uno substituirá residuos seleccionados en Fc nativo no humano con residuos que se encuentran normalmente en Fc nativo humano. Las técnicas para humanización de anticuerpo se conocen bien en la materia. Un vehículo alternativo sería una proteína, polipéptido, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o molécula pequeña (por ejemplo, un compuesto peptidomimético) capaz de unirse a un receptor de salvamento. Por ejemplo, uno podría utilizar como un veh ículo un polipéptido como se describe en Pat. de EE. U U . No. 5,739,277, emitida el 14 de Abril de 1 998 para Presta ef al. Los péptidos también podrían seleccionarse por despliegue de fago para unirse al receptor de salvamento FcRn . Tales compuestos de unión a receptor de salvamento también se incluyen dentro del significado "veh ículo" y están dentro del alcance de esta invención . tales vehículos deben seleccionarse para vida media incrementada (por ejemplo, al evitar secuencias reconocidas por proteasas) e ¡nmunogenicidad disminuida (por ejemplo, al favorecer secuencias no inmunogénicas, como se descubre en humanización de anticuerpo). Como se observa arriba, los veh ículos de polímero también pueden utilizarse para F1 y F2. Varios medios para unir porciones químicas útiles como vehículos están actualmente disponibles, ver, por ejemplo, Publicación Internacional del Tratado de Cooperación de Patentes ("PCT") No. WO 96/1 1 953, titulada "N-Terminally Chemically Modified Proteín Composiciones and Methods," en la presente incorporada para referencia en su totalidad. La publicación PCT describe, entre otras cosas, la unión selectiva de polímeros solubles en agua al término N de proteínas. Un vehículo de pol ímero preferido es polietilenglicol (PEG). El grupo PEG puede ser de cualquier peso molecular conveniente y puede ser lineal o ramificado. El peso molecular promedio del PEG variará preferentemente de aproximadamente 2 kiloDalton ("kDa") a aproximadamente 1 00 kDa, más preferentemente de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa, más preferentemente de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 10 kDa. Los grupos PEG se unirán generalmente a los compuestos de la invención a través de la acilación o alquilación reductiva a través de un grupo reactivo en la porción PEG (por ejemplo, un grupo aldehido, amino, tiol, o éster) a un grupo reactivo en el compuesto inventivo (por ejemplo, un grupo aldeh ido, amino o éster). Una estrategia útil para la PEGilación de péptidos sintéticos consiste de combinar, a través de la formación de un enlace conjugado en solución, un péptido y una porción PEG, cada una llevando una funcionalidad especial que es mutuamente reactiva hacia la otra. Los péptidos pueden prepararse fácilmente con síntesis de fase sólida convencional como se sabe en la materia. Los péptidos son "preactivados" con un grupo funcional en un sitio específico. Los precursores se purifican y caracterizan completamente antes de reaccionar con la porción PEG. La ligación del péptido con PEG usualmente tiene lugar en fase acuosa y puede monitorearse fácilmente por HPLC analítica de fase inversa. Los péptidos PEGilados pueden purificarse fácilmente por HPLC preparativo y caracterizarse por HPLC analítico, análisis de aminoácido y espectrometría de masa de desorción láser. Los polímeros de polisacárido son otro tipo de polímero soluble en agua que puede utilizarse para modificación de proteína. Los dextranos son polímeros de polisacárido comprendidos de subunídades individuales de glucosa predominantemente enlazadas por enlaces al-6. El dextran por sí mismo está disponible en muchos rangos de peso molecular, y está fácilmente disponible en pesos moleculares de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 70 kDa. Dextran es un polímero soluble en agua adecuado para utilizarse en la presente invención como un vehículo por sí mismo o en combinación con otro vehículo (por ejemplo, Fc). Ver, por ejemplo, WO 96/1 1953 y WO 96/05309. El uso de dextran conjugado con inmunoglobulinas terapéuticas o de diagnóstico se ha reportado; ver, por ejemplo, Solicitud de Patente Europea No. 0 315 456, que se incorpora en la presente para referencia. Dextran de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 20 kDa es preferido cuando dextran se utiliza como un vehículo de acuerdo con la presente invención. Conjugados de Anticuerpo/lnmunotoxínas En otro aspecto, la presente invención incluye un anticuerpo monoclonal anti-CD148 de humano, o un fragmento del mismo, conjugado con una porción terapéutica, tal como una citotoxina, un fármaco o un radioisótopo. Cuando se conjuga con una citotoxina, estos conjugados de anticuerpo se refieren como "inmunotoxinas". Un agente citotóxico o de citotoxina incluye cualquier agente que es dañino para las células (por ejemplo, las mata). Los ejemplos incluyen taxol, citocalasin B, gramicidín D, bromuro de etidio, emetina, mitomicin, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colcicin, doxorubicin, daunorubicin, díona antracin de dihidroxi, mitoxantrona, mitramícin, actínomicin D, 1 -dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lídocaína, propranolol, y puromicin y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolítos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabína, 5-fluorouracil decarbazina), agentes de alquílación (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCN U), ciclotosfamida, busulfan , dibromomanitol, estreptozotocin, mítomicin C, y cis-diclorodiamína platino (I I) (DDP) cisplatin), antracíclinas (por ejemplo, daunorubicin (anteriormente daunomicin) y doxorubicín), antibióticos (por ejemplo, dactinomicin (anteriormente actinomicín), bleomicin, mitramicin, y antramicin (AMC)), y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Otros ejemplos de citotoxinas terapéuticas que pueden conjugarse con un anticuerpo de la invención incluyen caliceamicin y duocarmicin. Un anticuerpo de la presente invención puede conjugarse con un radioisótopo, por ejemplo, yodo radioactivo, para generar radiofarmacéuticos citotóxícos para tratar un desorden relacionado con CD148, tal como un cáncer. Los conjugados de anticuerpo de la invención pueden utilizarse para modificar una respuesta biológica dada, y la porción de fármaco no se construye como limitada a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la porción de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o fragmento activo de la misma, tal como abrin, ricin A, exotoxina pseudomonas, o toxina de diftheria; una proteína tal como factor de necrosis de tumor o interferon gamma; o, modificadores de respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfoquinas, ¡nterleuquina-1 ("IL-1 "), interleuquina-2 ("IL-2"), interleuquina-6 ("IL- 6"), factor estimulante de colonia de macrófago de granulocito ("GM- CSF"), factor estimulante de colonia de granulocito ("G-CSF"), u otros factores de crecimiento. Las técnicas para conjugar tal porción terapéutica con anticuerpos se conocen bien, ver, por ejemplo, Arnon eí al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld eí al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., " Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson ef al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, " Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera ef al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baidwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe eí al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:1 19-58 (1982). Composiciones Farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas de anticuerpos anti-CD148 están dentro del alcance de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas comprendiendo anticuerpos se describen en detalle en, por ejemplo, Pat. de EE.UU. No. 6, 171 ,586, para Lam ef al., emitida el 9 de Enero de 2001 . Tales composiciones comprenden una cantidad terapéutica o profilácticamente activa de un anticuerpo, o un fragmento, variante, derivado o fusión de la misma como se describe en la presente, en mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o una sal farmacéuticamente aceptable. En una modalidad preferida, las composiciones farmacéuticas comprenden anticuerpos que unen epítopos CD148 que activan actividad de CD148 en mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o una sal farmacéuticamente aceptable. Típicamente, los agentes de unión específicos se purificarán lo suficiente para administración a un animal. Vehículos Farmacéuticamente Aceptables Como se utiliza en la presente, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de retraso isotónicos y de absorción, y lo similar que son fisiológicamente compatibles. En modalidades particulares, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, molécula biespecífica o multiespecífica, puede revestirse en un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto. En otra modalidad particular, las composiciones farmacéuticas se formulan con un vehículo que es farmacéuticamente aceptable en humanos. Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tal como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y lo similar), y mezclas de los mismos, aceites vegetales, tal como aceite de oliva, y esteres orgánicos inyectables, tal como etil oleato. Fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de materiales de revestimiento, tía como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y por el uso de agentes tensoactivos. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes de dispersión. Prevención de presencia de microorganismos puede asegurarse tanto por procedimientos de esterilización , supra, y por la inclusión de varios agentes antibacteríanos y antifúngicos, por ejemplo, paraben, clorobutanol, ácido sórbico de fenol, y lo similar. También puede ser deseable incluir agentes ¡sotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y lo similar en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede originarse por la inclusión de agentes que retrasan la absorción tal como monoestearato de aluminio y gelatina.

Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que mantiene la actividad biológica deseada del compuesto de origen y no imparte ningún efecto toxicológico indeseado (ver por ejemplo, Berge, S. M . , ef al. (1977) J . Pharm. Sci. 66: 1 -19). Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición acidas y sales de adición base. Las sales de adición acidas incluyen aquellos derivados de ácidos inorgánicos no tóxicos, tal como hidroclórico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, hídrobrómico, hidroyódico, fósforo y lo similar, así como también de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono o dicarboxílicos alífáticos, ácidos alcanóicos feníl-substituídos, ácidos alcanóicos de hidroxí, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos aromáticos y alifáticos y lo similar. Las sales de adición base incluyen aquellas derivadas de metales de tierra alcalina, tal como sodio, potasio, magnesio, calcio y lo similar, así como también de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N .N'-dibenziletilenodíamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamína, procaína y lo similar. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. Los materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tal como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina); antimicrobianos, antioxídantes (tal como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrogen-sulfito de sodio); reguladores ( (tal como borato, bicarbonato, Trís-HCI, citratos, fosfatos, otros ácidos orgánicos); agentes voluminosos (tal como manitol o glicina), agentes quelantes [tal como ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA)]; agentes de composición (tal como cafeína, polívinilpirrolídona, beta-ciclodextrin o hidroxipropil-beta-cilodextrin); rellenos; monosacárídos, disacáridos y otros carbohidratos (tal como glucosa, mañosa, o dextrinas); proteínas proteins (tal como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas); agentes colorantes, saborizantes y diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrofílicos (tal como polivinilpirrolidona); polipéotidos de bajo peso molecular; contraiones de formación de sal (tal como sodio); conservadores (tal como cloruro de bezalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol de fenetilo, metilparaben, propilparaben, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno); solventes (tal como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes de azúcar (tal como manitol o sorbitol); agentes de suspensión; agentes tensoactivos o agentes humectantes (tal como plurónico, PEG, esteres de sorbitan, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, trometamína, lecitin, colesterol, tiloxapal); agentes que mejoran estabilidad (sucrosa o sorbitol); agentes que mejoran tonicidad (tales como haluros de metal álcali (preferentemente cloruro de potasio o sodio, manitol, sorbitol); vehículos de suministro; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticas. (Remíngton's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990). La composición farmacéutica óptima se determinará por un experto en la materia dependiendo de, por ejemplo, la vía propuesta de administración, formato de suministro, y dosificación deseada. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Tales composiciones pueden influenciar el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y velocidad de despejo in vivo del anticuerpo específico. El vehículo o portador primario en una composición farmacéutica puede ser ya sea acuoso o no acuoso en naturaleza. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o fluido cerebroespinal artificial, posibilidad complementada con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. La salina regulada neutral o salina mezclada con albúmina de suero son vehículos ejemplificativos adicionales. Otras composiciones farmacéuticas ejemplificativas comprenden regulador Tris de aproximadamente pH 7.0-8.5, o regulador de acetato de aproximadamente pH 4.0-5.5, que pueden incluir además sorbitol o un substituyente adecuado para el mismo. En una modalidad de la presente invención, las composiciones de agente de unión pueden prepararse por almacenamiento al mezclar la composición seleccionada teniendo el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcional (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) en la forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, el producto de agente de unión puede formularse como un liofilizato utilizando excipientes apropiados tales como sucrosa. Las composiciones farmacéuticas pueden seleccionarse para suministro parenteral . Alternativamente, las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o para suministro entérico tal como oral , aural , oftálmica, rectal o vaginalmente. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la experiencia de la materia. Los componentes de formulación están presentes en concentraciones que son aceptables al sitio de administración. Por ejemplo, los reguladores se utilizan para mantener la composición a pH fisiológico o a un pH ligeramente inferior, típicamente dentro de un rango de pH de desde aproximadamente 5 a aproximadamente 8.

Cuando los compuestos de la presente invención se administran como farmacéuticos, a humanos y animales, pueden darse solos o como una composición farmacéutica conteniendo, por ejemplo, 0.01 a 99.5% (más preferentemente 0.1 a 90%) de ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. A manera de ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden contener un anticuerpo anti-CD 148 o una región de unión a antígeno del mismo en una concentración de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml, o alternativamente de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml . En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden formularse para asegurar distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera cerebral sanguínea (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Para asegurar que los compuestos terapéuticos de la invención cruzan la BBB (si se desea), pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para métodos de fabricación de liposomas, ver, por ejemplo, Pats. de EE.UU. Nos. 4,522,81 1 ; 5,374,548; y 5,399,331 . Los liposomas pueden comprender una o más porciones que se transportan selectivamente en células específicas u órganos, mejorar así suministro de fármaco objetivo (ver, por ejemplo, V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Porciones objetivo ejemplificativas incluyen folato o biotin (ver, por ejemplo, Pat. de EE.UU. No. 5,416,016 para Low ef al.); manosidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P. G. Bloeman ef al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais ef al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteína A de agente tensoactivo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol, 1233: 134), especies diferentes de las cuales pueden comprender las formulaciones de las invenciones, así como también componentes de las moléculas inventadas; p120 (Schreier ef al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); ver también K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J. J. Killion; I. J . Fidler (1994) Immunomethods 4:273. En una modalidad de la invención, los compuestos terapéuticos de la invención se formulan en liposomas; en una modalidad más preferida, los liposomas incluyen una porción objetivo. En una modalidad más preferida, los compuestos terapéuticos en los liposomas se suministran por inyección bolo a un sitio próximo al tumor o infección. Las composiciones deben fluir al grado de que existe fácil capacidad de inyección. Deben ser estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y deben conservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos.

Dosificaciones Terapéuticamente Efectivas Sin considerar la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden utilizarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales conocidos por aquellos expertos en la materia. Una "dosificación terapéuticamente efectiva" preferentemente inhibe el crecimiento de tumor por al menos aproximadamente 20%, más preferentemente por al menos aproximadamente 40%, aún más preferentemente por al menos aproximadamente 60%, y aún más preferentemente por al menos aproximadamente 80% relativo a sujetos sin tratar. La habilidad de un compuesto para inhibir cáncer puede evaluarse en un sistema de modelo animal predicho de eficacia en tumores de humano. Alternativamente, esta propiedad de una composición puede evaluarse al examinar la habilidad del compuesto para inhibir, tal inhibición in vitro por ensayos conocidos por el practicante experto. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño de tumor, o de otra manera mejorar los síntomas en un sujeto. Un experto en la materia sería capaz de terminar tales cantidades en base a tales factores tales como el tamaño del sujeto, la severidad de los síntomas del sujeto, y la composición particular o vía de administración seleccionada. Una cantidad efectiva de una composición farmacéutica a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, en el contexto terapéutico y objetivos. Un experto en la materia apreciará que los niveles de dosificación apropiados para tratamiento variarán de esta manera, en parte, de la molécula derivada, la indicación para la cual el anticuerpo o región de unión a antígeno se está utilizando, la vía de administración, y el tamaño (peso corporal, superficie de peso o tamaño de órgano) y condición (la edad y salud general) del paciente. De acuerdo con lo anterior, el médico puede concentrar la dosificación y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Un anticuerpo antí-CD148 preferido o región de unión a antígeno del mismo tiene la habilidad para unirse substancialmente a CD148 en solución en concentraciones de menos de 1 uM , preferentemente menos de 0.1 uM, y más preferentemente menos de 0.01 uM. Por "substancialmente" se entiende que al menos un 50 por ciento de reducción en proliferación de célula endotelial y migración se observa por modulación en la presencia del anticuerpo anti-CD148 o región de unión a antígeno del mismo, y un 50% de reducción se refiere en la presente como un valor IC50. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti- CD 148 o región de unión a antígeno del mismo de esta invención es típicamente una cantidad tal que cuando se administra en una composición fisiológicamente tolerable es suficiente para lograr una concentración de plasma (en base a los datos cmax después de una dosis única de anticuerpo) de, por ejemplo, de aproximadamente 0.01 ug/ml a aproximadamente 300 ug/ml. En otra modalidad, la concentración puede ser de aproximadamente 1 ug/ml a aproximadamente 300 ug/ml. En todavía otra modalidad, la concentración puede ser de aproximadamente 1 ug/ml a aproximadamente 75 ug/ml. En todavía otra modalidad, la concentración puede ser de aproximadamente 15 ug/ml a aproximadamente 50 ug/mi. Las dosificaciones pueden, por su puesto, variar de acuerdo a frecuencia y duración de administración.

Una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti- CD148 o región de unión a antígeno del mismo de esta invención en la forma de un polipéptido es típicamente una cantidad de polipéptido de manera que cuando se administra en una composición fisiológicamente tolerable es suficiente para lograr una concentración de plasma de desde aproximadamente 0.001 ug/ml a aproximadamente 10 ug/ml, o de aproximadamente 0.05 ug/ml a aproximadamente 1 .0 ug/ml. En base a un polipéptido teniendo una masa de aproximadamente 15,000 gramos por mol (es decir 15,000 Da), la concentración de plasma en molaridad puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0.0001 uM a aproximadamente 1 mM . Diferencialmente establecido, la dosificación por peso corporal puede variar de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, o de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, en una o más administraciones de dosis diarias, para uno o varios días. Una dosificación típica puede variar de aproximadamente 0.1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados arriba. En otras modalidades, la dosificación puede variar de 1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 5 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg . Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente ya sea en ensayos de cultivo celular o en modelos animales tales como ratones, ratas, conejos, perros, puercos, o monos. Un modelo animal puede también utilizarse para determinar el rango de concentración apropiado y vía de administración. Tal información puede entonces utilizarse para determinar dosis útiles y vías de administración en humanos. La dosificación exacta se determinará en vista de los factores relacionados con el sujeto requiriendo tratamiento. La dosificación y administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del compuesto activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que pueden tomarse en cuenta incluyen la severidad del estado de enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, peso, y genero del sujeto, tiempo y frecuencia de administración, combinación(es) de fármaco(s), sensibilidades de reacción y respuestas a terapia. Las composiciones farmacéuticas de larga duración pueden administrarse cada 3 a 4 días, cada semana, o dos veces a la semana dependiendo de la vida media y velocidad de despejo de la formulación particular. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la molécula de agente de unión en la formulación utilizada. Típicamente, una composición se administra hasta que una dosificación se alcanza, la cual logra el efecto deseado. La composición puede, por lo tanto administrarse como una dosis única, o como dosis múltiples (a las mismas o diferentes concentraciones/dosificaciones) con el tiempo, o como infusión continúa. Refinamiento adicional de la dosificación apropiada se hace de manera rutinaria. Las dosificaciones apropiadas pueden acertarse a través del uso de datos de respuesta de datos apropiados. Los niveles de dosificación actuales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse para obtener una cantidad del ingrediente activo que es efectivo para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición, y modo de administración, sin ser tóxido para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o el éster, sal o amida de las mismas, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular empleándose, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia médica anterior del paciente que se trata, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Un médico o veterinario teniendo experiencia ordinaria en la materia puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario debe iniciar las dosis de los compuestos de la invención empleados en la composición farmacéutica a niveles inferiores a aquellos requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y gradualmente incrementar la dosificación hasta que el efecto deseado se logre. En general, una dosis diaria adecuada de una composición de la invención será aquella cantidad del compuesto que es la dosis más baja efectiva para producir un efecto terapéutico. Tal dosis efectiva generalmente dependerá de los factores descritos arriba. Se prefiere que la administración sea intravenosa, intramuscular, ¡ntraperitoneal o subcutánea, preferentemente administrarse próxima al sitio del objetivo. Sí se desea, la dosis diaria efectiva de una composición terapéutica puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis administradas por separado a intervalos apropiados por todo el día, opcionalmente, en formas de dosificación unitaria. Aunque es posible para un compuesto de la presente invención administrarse solo, se prefiere administrar el compuesto como una formulación farmacéutica (composición). La composición puede ser estéril y fluida al grado que la composición es suminístrable por jeringa. Además de agua, el vehículo puede ser una solución salina regulada isotónica, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y lo similar), y mezclas adecuados de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por uso de revestir tal como lecitina, por mantenimiento de tamaño particular requerido en el caso de dispersión y por uso de agentes tensoactivos. En muchos casos, es preferible incluir agentes ¡sotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como mantiol o sorbitol, y cloruro de sodio en la composición. La absorción a largo plazo de las composiciones inyectables puede originarse al incluir en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina. Cuando el compuesto activo se protege de manera adecuada, como se describe arriba, el compuesto puede administrarse oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. Los métodos para administrar las composiciones (por ejemplo, anticuerpos de humano, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención se conocen en la materia. Las dosificaciones adecuadas de las moléculas utilizadas dependerán de la edad y peso del sujeto y el fármaco particular utilizado. Las moléculas pueden acoplarse a radionúclidos, tales como 131 1 , 90Y, 105Rh, indio-III, etc., como se describe en Goldenberg, D. M. et al. (1981 ) Cáncer Res. 41 :4354-4360, y en EP 0365 997. En otro aspecto la invención se refiere a un inmunoconjugado comprendiendo cualquier anticuerpo de acuerdo a la invención relacionado con un radioisótopo, agente citotóxico (por ejemplo, caliceamicin y duocarmicin), un agente citoestátíco, o un fármaco quimioterapéutico. Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos de humano, moléculas multiespecífícas o biespecíficas) de la invención pueden también acoplarse a agentes anti-infecciosos.

Vías de Administración La vía de administración de la composición farmacéutica es de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, oralmente, a través de inyección por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intra-perenquimal), intracerebroventrícular, intramuscular, intraocular, intraarterioa, intraportal, intralesional, intramedularmente, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, ¡ntraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual, uretral, vaginal, o medios rectales, por sistemas de liberación sostenida o por dispositivos de implantación. Cuando se desee, las composiciones pueden administrarse por inyección de bolo o continuamente por infusión, o por dispositivo de implantación. Alternativa o adicionalmente, la composición puede administrarse localmente a través de implantación de una membrana, esponja, u otro material apropiado en el cual la molécula deseada se ha absorbido o encapsulado. Donde un dispositivo de implantación se utiliza, el dispositivo puede implantarse en cualquier órgano o tejido adecuado, y suministro de la molécula deseada puede ser a través de difusión, bolo de liberación a tiempo, o administración continúa. En algunos casos, puede ser deseable utilizar composiciones farmacéuticas en una manera ex vivo. En tales casos, las células, tejidos, u órganos que se han removido del paciente se exponen a las composiciones farmacéuticas después de lo cual las células, tejidos y/u órganos se implantan de manera subsiguiente de regreso al paciente. En otros casos, un agente de unión de la presente invención tal como un anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo puede suministrarse al implantar ciertas células que se han formado genéticamente, utilizando métodos tales como aquellos descritos en la presente, para expresar y secretar el polipéptido. Tales células pueden ser células animales o humanas, y pueden ser autólogas, heterólogas, o xenogenéicas. Opcionalmente, las células pueden inmoritalizarse. Para reducir la elección de una respuesta inmunológica, las células pueden encapsularse para evitar infiltración de tejidos circundantes. Los materiales de encapsulación son típicamente biocompatibles, anexos poliméricos semipermeables o membranas que permiten la liberación del(los) producto(s) de proteína pero previenen la destrucción de las células por el sistema inmune del paciente o por otros factores dañinos de los tejidos circundantes. Las composiciones terapéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos conocidos en la materia. Por ejemplo, en una modalidad preferida , una composición terapéutica de la invención puede administrarse con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja , tales como los dispositivos descritos en Pats. de EE. UU. Nos. 5,399, 1 63; 5,383,851 ; 5,31 2,335; 5,064,41 3; 4,941 ,880; 4,790 ,824; o 4,596,556. Ejemplos de implantes bien conocidos y módulos útiles en la presente invención incluyen: Pat. de EE. U U . No. 4,487,603, que describe una bomba de micro-infusión implantable para distribuir medicación a una velocidad controlada; Pat. de EE. UU . No. 4,486, 1 94, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; Pat. de EE. U U . No. 4,447,233, que describe una bomba de infusión de medicación para suministrar medicación a una velocidad de infusión precisa; Pat. de EE. UU. No. 4,447,224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para suministro de fármaco continúo; Pat. de EE.UU. No. 4,439, 1 96, que describe un sistema de suministro de fármaco osmótico teniendo compartimientos de múltiples cámaras; y Pat. de EE.U U . No. 4,475, 1 96, que describe un sistema de suministro de fármaco osmótico. Estas patentes se incorporan en la presente para referencia. Muchos otros de tales implantes, sistemas de suministro y módulos se conocen por aquellos expertos en la materia. Cuando la administración parenteral se contempla, las composiciones terapéuticas para utilizarse en esta invención pueden estar en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, libre de pirogeno comprendiendo el agente de unión específico deseado en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la cual un agente de unión se formula como una solución ¡sotónica, estéril, adecuadamente conservada. Todavía otra preparación puede incluir la formulación de la molécula deseada con un agente, tales como microesferas inyectables, partículas bio-erosionables, compuestos poliméricos (ácido poliláctico, ácido poliglicólico), perlas, o liposomas, que proporciona la liberación controlada o sostenida del producto que puede entonces suministrarse a través de una inyección de depósito. El ácido hialurónico también puede utilizarse, y este puede tener el efecto de promover duración sostenida en la circulación. Otros medios adecuados para la introducción de la molécula deseada incluyen dispositivos de suministro de fármaco implantables. En otro aspecto, las formulaciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral pueden formularse en soluciones acuosas, preferentemente en reguladores fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o salina fisiológicamente regulada. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener substancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, tal como celulosa de carboximetil de sodio, sorbitol o dextran. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos pueden prepararse como suspensiones de inyección aceitosas apropiadas. Los solventes lipofílicos adecuados o vehículos incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo, o esteres de ácido graso sintéticos, tal como oleato de etilo, triglícéridos o liposomas. Los polímeros amino policatiónicos no lípidos también pueden utilizarse para suministro. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores adecuados o agentes para incrementar la solubilidad de los compuestos y permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. En otra modalidad, una composición farmacéutica puede formularse para inhalación. Por ejemplo, un agente de unión puede formularse como un polvo seco para inhalación. Las soluciones de inhalación de molécula de ácido nucleico o polipéptido también pueden formularse con un propulsor para suministro de aerosol. En todavía otra modalidad, las soluciones pueden nebulizarse. La administración pulmonar se describe además en Solicitud PCT No. PCT/US94/001875, que describe suministro pulmonar de proteínas químicamente modificadas. Las composiciones farmacéuticas para administración oral también pueden formularse utilizando vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la materia en dosificaciones adecuadas para administración oral. Tales vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y lo similar, para ingestión por el paciente. En una modalidad de la presente invención, las moléculas de agente de unión que se administran en esta manera pueden formularse con o sin aquellos vehículos utilizados comúnmente en la formación de compuestos de formas de dosificación sólidas tales como tabletas y cápsulas. Por ejemplo, una cápsula puede designarse para liberar la porción activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal cuando la biodísponibilidad se maximiza y la degradación pre-sistémica se minimiza. Los agentes adicionales pueden incluirse para facilitar la absorción de la molécula de agente de unión. Diluyentes, saborizantes, ceras de bajo punto de fusión , aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes desintegrantes de tableta, y aglutinantes también pueden emplearse.

Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse a través de la combinación de compuestos activos con excipiente sólido y procesamiento de la mezcla resultante de granulos (opcionalmente, después de trituración) para obtener tabletas y núcleos de grageas. Los auxiliares pueden agregarse, si se desea. Los excipientes adecuados incluyen carbohidrato o rellenos de proteína, tales como azúcares, incluyendo, lactosa, sucrosa, manitol, y sorbítol; almidón de maíz, trigo, arroz, papa u otras plantas; celulosa, tal como metil celulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, o sodio carboximetilcelulosa; gomas, incluyendo arábigas y tragacanto; y proteínas, tales como gelatina y colágeno. Si se desea, los agentes desintegrantes o solubilizantes pueden agregarse, tales como polivinil pirrolidona degradada, agrá, y ácido algíníco o una sal de los mismo, tal como alginato de sodio. Los núcleos de gragea pueden utilizarse junto con revestimientos adecuados, tales como soluciones de azúcar concentradas, que también pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes. Tintes o pigmentos pueden agregarse a los revestimientos de grageas o tabletas para identificación de producto o para caracterizar la cantidad de compuesto activo, es decir, dosificación. Las preparaciones farmacéuticas que pueden utilizarse oralmente también incluyen cápsulas de ajuste por empuje hechas de gelatina, así como también cápsulas suaves, selladas hechas de gelatina y un revestimiento, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste por empuje pueden contener ingredientes activos mezclados con rellenos o aglutinantes, tales como lactosa o almidones, lubricantes, tal como talco o estearato de magnesio, y opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas suaves, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, líquidos o glicol de polietileno líquido con o sin estabilizadores. Otra composición farmacéutica puede incluir una cantidad efectiva de agente de unión en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de tabletas. Al disolver las tabletas en agua estéril, u otro vehículo apropiado, soluciones pueden prepararse en forma de dosis única. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio o bicarbonato, lactosa, o fosfato de calcio; o agentes de unión , tales como almidón, gelatina, o acacia; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, o talco. Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para aquellos expertos en la materia, incluyendo formulaciones ¡ncluyendo moléculas de agente de unión en formulaciones de suministro controlado o sostenido. Las técnicas para formular una variedad de otros medios de suministro controlado o sostenido, tales como vehículos de liposoma, micropartículas bio-erosionables o perlas porosas e inyecciones de depósito, también se conocen por aquellos expertos en la materia. Ver por ejemplo, PCT/US93/00829 que describe liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para el suministro de composiciones farmacéuticas. Los ejemplos adicionales de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímero semipermeables en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, poliláctidos, (Pat. de EE.UU. No. 3,773,919, EP 58,481 ), copolímeros de ácido L-glutámico y gama etil-L-glutamato [Sidman ef al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)], poli(2-hidroxietil-metacrilato) [Langer ef al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277, (1981 )] y [Langer ef al., Chem. Tech., 12:98-105(1982)], acetato de vinil etileno (Langer ef al. , supra) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (EP 133,988). Las composiciones de liberación sostenida también incluyen liposomas, que pueden prepararse por cualquiera de los varios métodos conocidos en la materia. Ver por ejemplo, Eppstein eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 82:3688-3692 (1985); EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949. La composición farmacéutica a utilizarse para administración in vivo típicamente debe ser estéril. Esto puede realizarse por filtración a través de membranas de filtración estériles. Donde la composición se liofíliza, esterilización utilizando este método puede conducirse ya sea antes o después de la liofilízación y reconstitución. La composición para administración parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en solución. Además, las composiciones parentrales generalmente se colocan en un contenedor teniendo un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o frasco teniendo un detenedor perforable por una aguja de inyección hipodérmica. Una vez que la composición farmacéutica se ha formulado, puede almacenarse en frascos estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o un polvo liofilizado o deshidratado. Tales formulaciones pueden almacenarse ya sea en una forma lista para utilizar o en una forma (por ejemplo, liofilizada) requiriendo la reconstitución antes de la administración. En una modalidad específica, la presente invención se dirige a equipos para producir una unidad de administración de dosis única.

Los equipos pueden contener tanto un primer contenedor teniendo una proteína seca como un segundo contenedor teniendo una formulación acuosa. También se incluye dentro del alcance de esta invención los equipos conteniendo jeringas pre-llenadas de múltiples cámaras y única (por ejemplo, jeringas líquidas y lisojeringas). Terapias de combinación En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, conteniendo uno o una combinación de anticuerpos de humano, o región(es) de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención, formulados juntos con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, las composiciones incluyen una combinación de múltiples anticuerpos aislados (por ejemplo, dos o más) o regiones de unión a antígeno de los mismos de la invención. En una modalidad más particular, cada uno de los anticuerpos o regiones de unión a antígeno de los mismos de la composición se une a una epítopo pre-seleccionado, distinto de CD148. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales anti-CD148 de humano teniendo actividades complementarias se utilizan en combinación, por ejemplo, como una composición farmacéutica, comprendiendo dos o más anticuerpos monoclonales anti-CD148 de humano. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de humano que inhibe angiogéneis o el crecimiento de células expresando CD148, también puede combinarse con otro anticuerpo de humano que media muerte altamente efectiva de células objetivo en la presencia de células efectoras. En otra modalidad, la composición comprende una o una combinación de moléculas biespecíficas o multiespecíficas de la invención (por ejemplo, que contiene al menos una especificidad de unión para un receptor Fc y al menos una especificidad de unión para CD148). La invención también incluye administración de los anticuerpos o regiones de unión de antígeno de los mismos de la presente invención administrados al mismo paciente en combinación con uno o más agentes adecuados adicionalmente, cada uno administrándose de acuerdo a un régimen adecuado para ese medicamento. Esto incluye administración concurrente de un agente de unión específico de la invención y uno o más agentes adecuados. Como se utiliza en la presente, los términos "concurrentemente administrados" y "administración concurrente" comprenden administración substancialmente simultánea de uno o más anticuerpos de acuerdo a la invención y uno o más agente(s) adecuado(s) adicionalmente. Como se utiliza en la presente, el término administración "no concurrente" comprende administrar uno o más anticuerpos o regiones de unión a antígeno de los mismos de acuerdo a la invención y uno o más agentes adicionalmente adecuados, a diferentes momentos, en cualquier orden, si se recubre o no. esto incluye, pero no se limita a, tratamiento secuencial (tal como pretratamiento, post-tratamíento, o tratamiento de recubrimiento) con los componentes de la combinación, así como también regímenes en los cuales los fármacos se alterna, o en donde un componente se administra a largo plazo y el(los) otro(s) se administra(n) de manera intermitente. Los componentes pueden administrarse en las mismas o en composiciones separadas, o por las mismas o diferentes vías de administración. La terapia de combinación con factores de crecimiento pueden incluir citoquinas, linfoquinas, factores de crecimiento, u otros factores hematopoyéticos, tales como M-CSF, GM- CSF, TNF, [L-l , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IO, IL-II, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNFO, TNFI, TNF2, G-CSF, Meg- CSF, GM-CSF, trombopoyetina, factor de célula germinal, y eritropoyetina. Otros son composiciones que pueden incluir angiopoyetinas conocidas, por ejemplo, Ang-1 , -2, -4, —Y, y/o el polipéptido similar a Ang de humano, y/o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Factores de crecimiento incluyen angiogenin, proteína morfogéníca ósea- 1 , proteína morfogénica ósea-2, proteína morfogénica ósea-3, proteína morfogénica ósea-4, proteína morfogénica ósea-5, proteína morfogénica ósea-6, proteína morfogénica ósea-7, proteína morfogénica ósea-8, proteína morfogénica ósea-9, proteína morfogénica ósea-10, proteína morfogénica ósea-1 1 , proteína morfogénica ósea-12, proteína morfogénica ósea-13, proteína morfogénica ósea-14, proteína morfogénica ósea-15, receptor de proteína morfogénica ósea 1A, receptor de proteína morfogénica ósea 1 B, factor neutrofílico derivado de cerebro, factor neutrófico ciliar, receptor de factor neutrófico ciliar, factor quimiotáctico neutrofilo inducido por citoquina 1 , neutrofilo inducido de citoquina, factor quimiotáctico 2, factor quimiotáctico neutrofilo inducido por citoquina 2, factor de crecimiento celular endotelial, endotelin 1 , factor de crecimiento epidérmico, atrayente de neutrófilo derivado epitelial, factor de crecimiento de fibroblasto 4, factor de crecimiento de fibroblasto 5, factor de crecimiento de fibroblasto 6, factor de crecimiento de fibroblasto 7, factor de crecimiento de fibroblasto 8, factor de crecimiento de fibroblasto 8b, factor de crecimiento de fibroblasto 8c, factor de crecimiento de fibroblasto 9, factor de crecimiento de fibroblasto 10, factor de crecimiento de fibroblasto ácido, factor de crecimiento de fibroblasto básico, receptor-1 de factor neutrófilo derivado de estirpe de célula glial, receptor-2 de factor neutrófico de derivado de estirpe de célula glial, proteína de crecimiento relacionada, proteína de crecimiento relacionada-1 , proteína de crecimiento relacionada-2, proteína de crecimiento relacionada-3, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparin, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de hepatocito, receptor de factor de crecimiento de hepatocito, factor de crecimiento I similar a insulina, receptor de factor de crecimiento similar a insulina, factor de crecimiento similar a insulina II, proteína de unión a factor de crecimiento similar a insulina, factor de crecimiento de queratinocito, factor inhibidor de leucemia, receptor-1 de factor inhibidor de leucemia, factor de crecimiento nervioso, receptor de factor de crecimiento nervioso, neurotrofin-3, neurotrofin-4, factor de crecimiento de placenta, factor de crecimiento de placenta 2, factor de crecimiento derivado endotelial derivado de plaqueta, factor de crecimiento derivado de plaqueta, factor de crecimiento derivado de plaqueta de cadena A, factor de crecimiento derivado de plaqueta AA, factor de crecimiento derivado de plaqueta AB, factor de crecimiento derivado de plaqueta de cadena B, factor de crecimiento derivado de plaqueta BB, receptor-1 de factor de crecimiento derivado de plaqueta, receptor-2 de factor de crecimiento derivado de plaqueta, factor estimulante de crecimiento de pre-célula B, factor de célula germinal, receptor de factor de célula germinal, factor-1 de crecimiento de transformación, factor-2 de crecimiento de transformación, factor-1 de crecimiento de transformación, factor-1.2 de crecimiento de transformación, factor-2 de crecimiento de transformación, factor-3 de crecimiento de transformación, factor-5 de crecimiento de transformación, factor-1 de crecimiento de transformación latente, proteína de unión I de factor-1 de crecimiento de transformación, proteína de unión I I de factor-1 de crecimiento de transformación, proteína de unión I I de factor- de crecimiento de transformación, receptor de factor de necrosis de tumor tipo l (TNF— R1 ), receptor de factor de necrosis de tumor tipo I I (TNF-R2), receptor activador de plasminogeno tipo iroquinasa, factor de crecimiento endotelial vascular, y proteínas quiméricas y fragmentos biológica o inmunológicamente activos de los mismos. Se apreciará que los anticuerpos o regiones de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden administrarse con uno o más agentes anti-inflamatorios. Como se utiliza en la presente, el término "agente anti-inflamatorio" se refiere generalmente a cualquier agente que reduce inflamación o hinchamiento en un paciente. Un número de agentes anti- inflamatorios ejemplificativos se citan en la presente, pero se apreciará que pueden haber agentes anti-inflamatorios adecuados, adicionales no específicamente citados en la presente, pero que se comprenden por la presente invención. El agente anti-inflamatorio puede ser, por ejemplo, un compuesto que inhibe la interacción de cítoquinas inflamatorias con sus receptores. Ejemplos de inhibidores de citoquina útiles en combinación con los agentes de unión específicos de la invención incluyen, por ejemplo, antagonistas (tales como anticuerpos) de TGF-beta, así como también antagonistas (tales como anticuerpos) dirigidos contra interleuquinas incluidas en inflamación. Tales interleuquinas se describen en la presente y preferentemente incluyen, pero no se limitan a, IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-I I , IL-12, IL-13, IL- 17, e 1L-18. Ver Feghali, ef al., Frontiers in Biosci., 2:12-26 (1997). Los antagonsitas de anticuerpo ejemplficativos también incluyen anticuerpos dirigidos contra la glicoproteína de superficie celular de 21 -28 kD CD52 (tal como CamPath®, Berlex Laboratories), IL-8 (y anticuerpos anti-IL8-RB), B-FGF (y anticuerpos de receptor anti-B-FGF), anticuerpos antí-TWEAK (y anticuerpos de receptor anti-TWEAK (es decir, TWEAKR)), anticuerpos anti-Adam/Disíntegrin, receptor anti-eph, anticuerpos anti-efrin , y anticuerpos anti-PDGF-BB. Los anticuerpos específicos o regiones de unión a antígeno de los mismos de la invención también pueden administrarse en combinación con inhibidores de Proteína Quinasa A Tipo 1 para mejorar la proliferación de la célula T en pacientes infectados con VIH que reciben terapia anti-retroviral. Los factores de crecimiento nervioso (NGFs) también pueden combinarse con los anticuerpos o regiones de unión a antígeno de los mismos de la invención para tratar ciertas condiciones. Tales condiciones incluyen enfermedades neurodegenerativas, lesión de la médula espinal y esclerosis múltiple. Otras condiciones tratables con esta combinación son glaucoma y diabetes. Una terapia de combinación preferida re refiere a anticuerpos o regiones de unión a antígeno de los mismos de la invención administrados a un paciente en combinación con uno o más inhibidor 1 L-1 adecuado. Inhibidores de 1 L-1 incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de péptido de unión a receptor de IL-I , anticuerpos dirigidos contra IL-I o IL-I beta o IL-I receptor tipo I , y proteínas recombinantes comprendiendo todos o porciones de receptores para IL-I o variantes modificadas de los mismos, ¡ncluyendo muteínas genéticamente modificadas, formas multiméricas y formulaciones de liberación sostenida. Antagonistas específicos incluyen polipéptidos IL-Ira, inhibidores de enzima de conversión IL-1 beta (ICE), anticuerpos de receptor I L-1 tipo 1 antagonísticos, formas de unión 11-1 de receptor I L-1 tipo I y receptor I L-1 tipo I I, anticuerpos para IL- 1, incluyendo miembros de la familia ÍL-I alfa e IL-I beta y otras IL-I, y un terapéutico conocido como IL-I Trap (Regeneron). Polipéptidos IL-Ira incluyen las formas de IL-Ira descritas en Pat. de EE.UU. No. 5,075,222 y formas modificadas y variantes ¡ncluyendo aquellas descritas en Pat. de EE.UU. No. 5,922,573, WO 91/17184, WO 92 16221, y WO 96 09323. Inhibidores de enzima de conversión beta IL-1 (ICE) incluyen peptidil e inhibidores ICE de molécula pequeña ¡ncluyendo aquellos descritos en las solicitudes de patente PCT WO 91/15577; WO 93/05071; WO 93/09135; WO 93/14777 y WO 93/16710; y solicitud de Patente Europea 0547699. Compuestos No peptidilo incluyen aquellos descritos solicitud de patente PCT WO 95/26958, Pat. de EE.UU. No. 5,552,400, Pat. de EE.UU. No. 6,121,266, y Dolle ef al., J. Med. Chem., 39, pp. 2438-2440 (1996). Inhibidores ACE adicionales se describe en Pats. de EE.UU. Nos. 6,162,790, 6,204,261, 6,136,787, 6,103,711, 6,025,147, 6,008,217, 5,973,111, 5,874,424, 5,847,135, 5,843,904, 5,756,466, 5,656,627, 5,716,929. Formas de unión I L-1 de receptor i L-1 Tipo I y receptor IL-1 tipo II se describen en Pats. de EE.UU. Nos. 4,968,607, 4,968,607, 5,081,228, Re 35,450, 5,319,071, y 5,350,683. Otros antagonistas IL-1 adecuados incluyen, pero no se limitan a, péptidos derivados de l L-1 que son capaces de unirse competitivamente al receptor de señalización IL-1, tipo I IL-1R. La guía adicional considerando ciertos antagonistas 1 (y otra citoquina) pueden encontrarse en Pat. de EE.UU. No.6,472,179. Adicionalmente, los inhibidores TNF son adecuados, e incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de péptido de unión a receptor de TNF-alfa, oligonucleótidos antisentído o ribozimas que inhiben TNF. alfa, producción, anticuerpos dirigidos contra TNF-alfa y proteínas recombínantes comprendiendo todos o porciones de receptores para TNF-alfa o variantes modificadas de los mismos, incluyendo muteínas genéticamente modificadas, formas multiméricas y formulaciones de liberación sostenida. También son adecuados los inhibidores TACE (Enzima de Conversión de Factor-alfa de Necrosis de Tumor), tales como TAPI (Immunex Corp.) y GW-3333X (Glaxo Wellcome Inc.). También son adecuadas moléculas que inhiben la formación del complejo lgA-alfa-1 AT, tales como péptidos descritos en EP 0 614 464 B, o anticuerpos contra este complejo. Las moléculas adícíonalmente adecuadas incluyen, pero no se limitan a, disacáridos de inhibición de TNF-alfa, derivados sulfatados de glucosamína, u otros carbohidratos similares descritos en Pat. de EE.UU. No. 6,020,323. Las moléculas adecuadas adicionales incluyen inhibidores de TNF-alfa de péptido descritos en Pats. de EE.UU . Nos. 5,641 ,751 y 5,519,000, y los péptidos conteniendo aminoácido D descritos en Pat. de EE.UU. No. 5,753,628. Además, los inhibidores de enzima de conversión de TNF-alfa también se describe. WO 01/03719 describe además agentes adicionales que pueden utilizarse en combinación de acuerdo con la invención. Compuestos aún adecuados adicionales incluyen, pero no se limitan a, moléculas pequeñas tales como análogos de talidomida o talidomida, pentoxifilina, o inhibidores de metaloproteinasa de matriz (MMP) u otras moléculas pequeñas. Los inhibidores MMP adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en Pats. de EE.UU. Nos. 5,883,131, 5,863,949 y 5,861,510 así como también compuestos de petidil alquilo mercapto como se describe en Pat. de EE.UU. No. 5,872,146. Otras moléculas pequeñas capaces de reducir producción de TNF-alfa, incluyen, por ejemplo, las moléculas descritas en Pats. de EE.UU. Nos.5,508,300, 5,596,013, y 5,563,143. Las moléculas pequeñas adecuadas adicionales incluyen, pero no se limitan a, inhibidores MMP como se describe en Pats. de EE.UU. Nos. 5,747,514, y 5,691,382, así como también derivados de ácido hidroxámico tales como aquellos descritos en Pat. de EE.UU. No. 5,821,262. Las moléculas adecuadas adicionales incluyen, por ejemplo, moléculas pequeñas que inhiben producción de fosfodiesterasa IV y TNF-alfa, tal como derivado de oxima substituida (WO 96/00215), sulfonamidas de quinolina (Pat. de EE.UU. No. 5,834,485), derivados de furan de arilo (WO 99/18095) y (WO 96/01825; GB 2 291 422 A). También son útiles derivados de tiazola que suprimen TNF-alfa e IFN-gamma (WO 99/15524), así como también derivados de xantína que suprimen TNF-alfa y otras citoquinas proinflamatorias (ver, por ejemplo, Pats. de EE.UU. Nos. 5,118,500, 5,096,906 y 5,196,430). Las moléculas pequeñas adicionales útiles para tratar las condiciones descritas en la presente incluyen aquellas descritas en Pat. de EE.UU. No.5,547,979. Ejemplos adicionales de fármacos y tipos de fármacos que pueden administrarse por terapia de combinación incluyen, pero no se limitan a, antivírales, antibióticos, analgésicos (por ejemplo, acetaminofen, codeína, propoxifeno napsilato, hidrocloruro de oxicodona, bitartrato de hidrocodona, tramadol), corticosteroides, antagonistas de citoquinas inflamatorias, Fármacos Anti-Reumátícos Modificando la Enfermedad (DMARDs), fármacos Anti-lnflamatorios No Esteroidales (NSAIDs), y Fármacos Antí-Reumáticos de Baja Acción (SAARDs). Fármacos Anti-Reumáticos Modificando la Enfermedad Ejemplificativos (DMARDs) incluyen, pero no se limitan a: Rheumatrex™ (metotrexato); Enbrel® (etanercept); Remicade® (inflixímab); Humira™ (adalímumab); Segard® (afelimomab); Arava™ (leflunomida); Kineret™ (anakinra); Arava™ (leflunomida); D-penícilamina; Miocrisína; Plaquenil; Ridaura™ (auranofln); Solganal; lenercept (Hoffman-La Roche); CDP870 (Celltech); CDP571 (Celltech), así como los anticuerpos descritos en EP 0 516 785 B1 , Pat. de EE.UU. No. 5,656,272, EP 0 492 448 Al; onercept (Serono; CAS reg. no. 199685-57-9); MRA (Chugai); Imuran™ (azatioprina); inhibidores NFKB; Cytoxan™ (ciclofosfamida); ciclosporina; sulfato de hidroxicloroquina; minociclina; sulfasalazina; y compuestos de oro tales como oro oral, tiomalato de sodio de oro, y aurotioglucosa. Las moléculas adecuadas adicionales incluyen, por ejemplo, TN FRs solubles derivados de las regiones extracelulares de moléculas de receptor TNF-alfa diferente a p55 y p75 TNFRs, tales como por ejemplo, TNFR descrito en WO 99/04001 , incluyendo TNFR-lg's derivados de este TNFR. Los inhibidores TNF-alfa adecuados adicionales son adecuados para utilizarse como se describe en la presente, estos incluyen el uso no solamente de un anticuerpo contra TNF-alfa o TNFR como se describe en la presente, pero también un péptido derivado de TNF-alfa que puede actuar como un inhibidor competitivo de TNF-alfa (tales como aquellos descritos en Pat. de EE.UU. No. 5,795,859 o Pat. de EE.UU. No. 6, 107,273), proteínas de fusión TNFR-lgG, tal como una conteniendo la porción extracelular del receptor TNF-alfa p55, un TNFR soluble diferente a una proteína de fusión IgG, u otras moléculas que reducen niveles TNF-alfa endógenos, tales como inhibidores de la enzima de conversión TNF-alfa (ver por ejemplo, Pat. de EE.UU. No. 5,594, 106), o moléculas pequeñas o inhibidores alfa TNF, un número de las cuales se describen en la presente. Con respecto a anticuerpos a TNF, aunque la dosis óptimamente se determinará por un proveedor del cuidado de la salud experimentado de acuerdo con las necesidades específicas del paciente en mente, un rango de dosis preferido ejemplificativo para un anticuerpo contra TNF-alfa es 0.1 a 20 mg/kg, y más preferentemente es 1-10 mg/kg . Otro rango de dosis preferido para anticuerpo anti-TNF-alfa es 0.75 a 7.5 mg/kg de peso corporal. La presente invención también utiliza un agente de unión específico y cualquiera de uno o más Fármacos Anti-lnflamatorios No Esteroidales (NSAIDs). NSAIDs tienen su acción inflamatoria, al menos en parte, a la inhibición de síntesis de prostaglandin.

Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan 7th Edítion (1985). NSAI Ds pueden caracterizarse en nueve grupos: (1 ) derivados de ácido salicílico; (2) derivados de ácido propiónico; (3) derivados de ácido acético; (4) derivados de oxicam fenámico; (8) pirazolas y (9) pirazolonas. Ejemplos de NSAI Ds incluyen, pero no se limitan a: Anaprox™ , Anaprox DS™ (sodio de naproxen); Ansaid™ (flurbiprofen); Arthrotec™ (díclofenac sodio+misoprostíl); Cataflam.TM.?/oltaren™ (potasio de diclofenac); Clinoril™ (sulindac); Daypro™ (oxaprozín); Disalcid™ (salsalato); Dolobid™ (diflunisal); EC Naprosyn™ (sodio naproxen); Feldene™ (piroxicam); Indocin™ , Indocín SR™ (indometacin); Lodine™ , Lodine XL™ (etodolac); Motrin™ (ibuprofen); Naprelan™ (naproxen); Naprosyn™ (naproxen); Orudis™ , (ketoprofen); Oruvail™ (ketoprofen); Relaten™ (nabumetona); Tolectin™ , (sodio de tolmetin); Trílisate™ (trisalicilato de magnesio colina); inhibidores Cox-1 ; ihibidores Cox-2 tal como Vioxx™ (rofecoxib); Arcoxia™ (etoricoxib), Celebrex™ (celecoxib); Mobic™ (meloxicam); Bextra.TM . (valdecoxib), Dynastat™ sodio paracoxib; Prexige™ (lumiracoxib), y nambumetona. NSAIDs adecuados adicionales, incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: .epsilon. -pacido acetamídocapróico, S-adenosílmetionina, ácido 3-amino-4-hidroxibutírico, amixetrina, anitrazafen , antrafenina, bendazac, lisínato de bendazac, benzidamina, beprozin, broperamola, bucoloma, bufezolac, ciproquazona, cloximato, dazidamina, deboxamet, detomidína, difenpiramida, difenpiramida, difisalamina, ditazol, emorfazona, mesilato de fanetizola, fenflumizol, floctafenina, flumizol, flunixin, fluproquazona, fopirtolina, fosfosal, guaimesal, guaiazolena, isonixirn, lefetamina HCl, leflunomida, lofemizola, lotifazola, clonixinato de lisin, meseclazona, nabumetona, nictindola, nimesulida, orgotein, orpanoxin, oxaceprolm, oxapadol, paranilina, perisoxal, citrato de perisoxal, pifoxima, piproxen , pirazolac, pirfenidona, proquazona, proxazola, tíelavin B, tiflamizola, timegadina, tolectin , tolpadol, triptamid y aquellos designados por el número de código de compañía tal como 480156S, AA861 , AD1590, AFP802, AFP860, A177B, AP504, AU8001 , BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CNIOO, EB382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851 , MR714, MR897, MY309, ONO. sub.3144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131 , SCR152, SH440, SI R133, SPAS510, SQ27239, ST281 , SY6001 , TA60, TAI-901 (ácido 4-benzoil-1 -indancarboxílíco), TVX2706, U60257, UR2301 y WY41770. NSAIDs estructuralmente relacionados teniendo propiedades anti-inflamatorias y analgésicas similares a NSAIDs también se comprenden por este grupo. SAARDs o DMARDS adecuados incluyen, pero no se limitan a, sodio de alocupreido, auranofin, aurotioglucosa, aurotioglicamida, azatioprina, sodio de brequinar, bucilamina, calcio 3-aurotio-2-propanol-1 -sulfonato, clorambucil, cloroquina, clobuzarit, cuproxolina, ciclofosfamida, ciclosporin, dapsona, 15-deoxispergualin, diacerein, glucosamina, sales de oro (por ejemplo, sal de oro de cicloquina, tiomalato de sodio de oro, tiosulfato de sodio de oro), hidroxicloroquina, hidroxiurea , kebuzona, Ievamisola, lobenzarit, melitin , 6-mercaptopurina, metotrexato, mizoribina, micofenolato mofetil , mioral , mostaza de nitrógeno, D-penicilamina , imidazolas de píridinol tales como SKNF86002 y SB203580, rapamicin , tioles, timopoyetin y vincristina. SAARDs o DMARDs estructuralmente relacionados teniendo propiedades antiinflamatorias y analgésicas similares también se proponen para comprenderse por este grupo. Los inhibidores de quinasa en cascadas de señalización también son agentes adecuados para combinación con los agentes de unión específicos de la invención . Estos incluyen , pero no se limitan a, agentes que son capaces de inhibir P-38 (a.k.a., "RK" o "SAPK- 2", Lee ef al. , Nature, 372:739 (1 994). P-38 se describe como una quinasa de serina/treonina (ver Han ef al. , Biochimica Biophysica Acta, 1 265:224-227 (1 995). I nhibidores de P-38 se ha mostrado que intervienen entre los estímulos extracelulares y la secreción de I L-1 y TN F-alfa de la célula incluye la transducción de señal de bloqueo a través de la inhibición de una quinasa que yace en su trayectoria de señal. Adicionalmente adecuados son inhibidores MK2, e inhibidores tpl-2. Adicionalmente, los inhibidores de la célula T también son adecuados, incluyendo, por ejemplo, ctla-4, CsA, Fk-506, OX40, OX40R-FC, anticuerpo OX40, ligando OX40, anticuerpo de ligando OX40, Ick, y ZAP70. También son adecuados retinoides, incluyendo retinoides orales, así como también antagonistas de TG F-beta.

Los agentes adecuados adicionales para combinación con los agentes de unión específicos de la invención incluyen, por ejemplo, cualquiera de uno o más derivados de ácido salicílíco, esteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Tales derivados de ácido salicílico, esteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: acetaminosalol, aloxiprin, aspirina, benorilato, bromosaligenin, acetilsalicilato de calcio, difiusinal de trisalícilato de magnesio de colina, etersalato, fendosal, ácido gentísico, salicilato de glicol, salicilato de ¡midazol, acetilsalícílato de lisina, mesalamína, morfolina salicilato, 1 -naftil salicilato, olsalazina, parsalmida, fenil acetilsalicilato, fenil salícilato, salacetamida, salicilamide ácido O-acético, salsalato y sulfasalazina. Los derivados de ácido salicílico estructuralmente relacionados teniendo propiedades analgésicos y anti-inflamatorios similares también se proponen para comprenderse por este grupo. Los agentes adicionalmente adecuados incluyen, por ejemplo, derivados de ácido propiónico, esteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de ácido propiónico, esteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: alminoprofen, benoxaprofen, ácido bluclóxico, carprofen, dexindoprofen, fenoprofen, flunoxaprofen, fluprofen, flurbiprofen, furcloprofen, ¡buprofen, aluminio de ibuprofen, ibuproxam, indoprofen, isoprofen, ketoprofen, loxoprofen, miroprofen, naproxen, oxaprozin , piketoprofen, pimeprofen, pirprofen, pranoprofen, ácido protizínico, píridoxiprofen , suprofen , ácido tiaprofénico y tioxaprofen. Los derivados de ácido propiónico estructuralmente relacionados teniendo propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también se proponen para comprenderse por este grupo. También son adecuados para usarse los derivados de ácido acético, esteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de ácido acético, esteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden : acemetacin, alclofenac, amfenac, bufexamac, cinmetacin, clopirac, delmetacin, diclofenac sodio, etodolac, felbinac, fenclofenac, fenclorac, ácido fenclózico, fentiazac, furofenac, glucametacin, ibufenac, indometacin, isofezolac, isoxepac, lonazolac, ácido metiazíníco, oxametacin, oxpinac, pimetacin, proglumetacin, sulindac, talmetacin, tiaramida, tiopinac, tolmetín, zidometacin y zomepirac. Los derivados de ácido acético estructuralmente relacionados teniendo propiedades analgésicas y anti-ínflamatorias similares también se proponen para comprenderse por este grupo. Adecuados para usarse como se describe en la presente son los derivados de ácido fenámico, esteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de ácido fenámico, esteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: ácido enfenámico, etofenamato, ácido flufenámico, isonixin, ácido meclofenámico, sodio de meclofenamato, ácido medofenámico, ácido mefanámico, ácido niflúmico, talniflumato, terofenamato, ácido tolfenámico y ufenamato.

Los derivados de ácido fenámico estructuralmente relacionados teniendo propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también se proponen para comprenderse por este grupo. También son adecuados los derivados de ácido carboxílico, esteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que pueden utilizarse comprenden: clidanac, diflunisal, flufenisal, inoridina, ketorolac y tinoridína. Los derivados de ácido carboxílico estructuralmente relacionados teniendo propiedades analgésicas y anti-inflamatorias también se proponen para comprenderse por este grupo. Adicionalmente adecuados son los derivados de ácido butírício, esteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de ácido butírico, esteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: bumadizon, butíbufen, fenbufen y xenbucin. Los derivados de ácido butírico estructuralmente relacionados teniendo propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también se proponen para comprenderse por este grupo. Oxicams, esteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos también son adecuados. Oxicams, esteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: droxicam, enolícam, ¡soxicam, piroxicam, sudoxicam, tenoxicam y 4-hidroxil-1 ,2-benzotiazina 1 , 1 -dióxido 4-(N-feníl)-carboxamida. Los oxicams estructuralmente relacionados teniendo propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también se proponen para comprenderse por este grupo. Pirazolas, esteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de las mismas también son adecuadas. Las pirazolas, esteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que pueden utilizarse comprenden: difenamízola y epirizola. Pírazolas estructuralmente relacionadas teniendo propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también se proponen para comprenderse por este grupo. Además, las pirazolonas, esteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos son adecuados. Las pirazolonas, esteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que pueden utilizarse comprenden: apazona, azapropazona, benzpiperilon, feprazona, mofebutazona, morazona, oxifenbutazona, fenilbutazona, pipebuzona, propilfenazona, ramifenazona, suxibuzona y tiazolinobutazona. Las pirazalonas estructuralmente relacionadas teniendo propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también se proponen para comprenderse por este grupo. También adecuados son esteres de profármacos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de enfermedades mediadas por TNF. Corticoesteroides, esteres de profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyen hídrocortisona y compuestos que se derivan de hidrocortísona, tal como 21 -acetoxi-pregnenolona, alclomerasona, algestona, amcínonida, beclometasona, beta-metasona, valerato de betametasone, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, propionato de clobetasol , clobetasona , butirato de clobetasona, clocortolona, cloprednol , corticosterona, cortisona, cortivazol , deflazacon , desonida , desoximerasona , dexametasona, diflorasona, difiucortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida, flumetasona, pivalato de flumetasona, flunisolida, acetonida de flucinolona, fluocinonida , acetonida de fluorocinolona, fluocortin butíl, fluocortolona , hexanoato de fluorocortolono, valerato de diflucortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednideno, fiuprednisolona, flurandenolida, formocortal , halcinonida, halometasona, acetato de halopredona, hudrocortamato, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona acétate, butirato de hidrocortisona, fosfato de hidrocortisona, hidrocortisona 21 -succionato de sodio, tebutato de hidrocortisona, mazipredona, medrisona, meprednísona, metilprednícolona, furoato de mometasona, parametasona, prednicarbato, prednisolona, prednisolona 21 -diedriamínoacetato, prednisolona fosfato de sodio, prednisolone succionato de sodio, prednisolone sodio 21 -m-sulfobenzoato, prednisolone sodio 21 -stearoglicolato, prednisolona tebutato, prednisolona 21 -trimetilacetato, prednisona, prednival , prednilideno, prednilideno 21 -dietilaminoacetato, tixocortol, triamcinolona, triamcinolone acetonida, triamcinolone benetonida y triamcinolona hexacetonida. Los corticoesteroídes estructuralmente relacionados teniendo propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares también se proponen para comprenderse por este grupo. Los antimícrobiales (y esteres de profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos) también son adecuados para uso de combinación como se describe en la presente. Los antimícrobianos adecuados incluyen, por ejemplo, ampicilin, amoxicilín, aureomicin, bacitracín, ceftazidima, ceftriaxona, cefotaxima, cefaclor, cefalexin , cefradina, ciprofloxacin, ácido clavulánico, cloxacilin, dicloxacilan, eritromicin, flucloxacilan, gentamicin, gramícidín, meticilan, neomicin, oxacilan, penicilina y vancomicin. Los antimicrobianos estructuralmente relacionados teniendo propiedades analgésicas y anti-ínflamatorias similares también se proponen para comprenderse por este grupo. Los compuestos adecuados adicionales incluyen, pero no se limitan a: BN 50730; tenidap; E 5531 ; tiapafant PCA 4248; nimesulida; panavir; rolipram; RP 73401 ; péptido T; MDL 201 .449A; (1 R,3S)-Cis-1 -[9-(2,6-diamino-purinil)]-3-hidroxi-4-c¡clopenteno hidrocloruro; (1 R,3R)-trans-1 -[9-(2,6— diamino)purina]-3-acetoxiciclopentano; (1 R,3R)-trans-1 -[9-adenil)-3-azido-ciclopentano hidrocloruro y (1 R,3R)-trans-1 -[6-hidroxi-purin-9-il)-3-azidociclopentano. Se ha encontrado que IL-4 puede inducir un efecto inflamatorio en algunos casos, tales como en asma, en los cuales la sobre-expresión de IL-4 en los pulmones causa hipertrofia de célula epitelial y una acumulación de linfocitos, eosinófílos, y neutrófilos. Esta respuesta es representativa de las características principales de la respuesta proinflamatoria inducida por otras citoquinas Th2. Como se observa arriba, por lo tanto, los inhibidores de IL-4 también son útiles de acuerdo con la invención. Adicionalmente, se apreciará que ciertos fármacos inmunosupresores también pueden utilizarse en el tratamiento de artritis, incluyendo, pero no limitándose a, inhibidores ¡NOS e inhibidores 5-lipoxigenasa. Ginger ha mostrado tener ciertas propiedades antiinflamatorias, y por lo tanto es adecuada para usarse como un agente anti-ínflamatorio de acuerdo con la invención , como es condroitin. Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden administrarse en terapia de combinación, es decir, en combinación con otros agentes y terapias, en el tratamiento de enfermedades asociadas con activación de CD148. Los anticuerpos y regiones de unión a antígeno de la presente invención también pueden utilizarse en combinación con otros agentes y terapias para probar cánceres y tumores. Tales agentes incluyen, pero no se limitan a, composiciones químicas preparadas sintéticamente in vitro, anticuerpos, regiones de unión a antígeno, radionúclidos, y combinaciones y conjugados de los mismos. Un agente puede ser un agonista, antagonista, modulador alostérico, toxina o, más generalmente, puede actuar para inhibir o estimular su objetivo (por ejemplo, activación de enzima o receptor o inhibición), y promover así la muerte celular o detener el crecimiento celular. Otras terapias también incluyen, por ejemplo, tratamiento de radiación, quimioterapia y terapias objetivo con agentes anti-tumor, y lo similar. En una modalidad particular, los anticuerpos anti-CD148 de humano, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, pueden administrarse en combinación con uno o más agentes terapéuticos, por ejemplo, un agente anti-angiogénico, un agente anti-neoplástico, un agente quimíoterapéutico, un agente ¡nmunosupresor, un agente anti-inflamatorio, o un agente anti-psoríasis. Los anticuerpos anti-CD148 de humano, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, tales como terapias físicas, por ejemplo, terapia de radiación, hipertermia, transplante (por ejemplo, transplante de médula ósea), cirugía, luz solar, o fototerapia. Las terapias de combinación adicionales no enlistadas específicamente en la presente también están dentro del alcance de la presente invención. Los agentes anti-neoplásticos ejemplificativos incluyen, por ejemplo, doxorubicin (adriamicin), sulfato de bleomicin cisplatin, carmustina, clormabucil e hidroxiurea de ciclofosfamida, por ellos mismos, son solamente efectivos a niveles que son tóxicos o subtóxicos a un paciente. Cisplatín se administra intravenosamente como una dosis de 100 mg/m2 una vez cada cuatro semanas y adriamicin se administra intravenosamente como una dosis de 60-75 mg/m2 una vez cada 21 días. Otros agentes anti-tumor ejemplificativos incluyen HERCEPTIN™ (trastuzumab), que pueden utilizarse para tratar cáncer de mama y otras formas de cáncer, y RITUXAN™ (rituximab), ZEVALIN™ (ibritumomab tiuxetan), y LYMPHOCI DE™ (epratuzumab), que pueden utilizarse para tratar linfoma de no Hodgkiin y otras formas de cáncer, GLEEVAC™ que puede utilizarse para tratar leucemia de mieloíde crónica y tumores estromales gastrointestinales, y BEXXAR™ (yodo 131 tositumomab) que pueden utilizarse para tratamiento de línfoma de no Hodgkin. Otros agentes anti-neoplásticos que pueden emplearse en tratamiento de quimioterapia de combinación incluyen, por ejemplo, agentes de alquilación incluyendo: mostazas de nitrógeno, tales como mecloretamína, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan y clorambucil; nitrosoureas, tal como carmustina (BCN U), lomustina (CCNU), y semustina (metil-CCNU); etílenimines/metilmelamine tal como trietilenomelamina (TEM), Metileno, tiofosforamida (tiotepa), hexametilmelamina (HMM, altretamina); sulfonatos de alquilo tal como busulfan; triazinas tal como dacarbazina (DTIC); antimetabolitos incluyendo análogos de ácido fólico tales como metotrexato y trímetrexato, análogos de pirimidina tal como 5-fluorouracíl, fluorodeoxiurídina, gemcitabina, citosina arabinosida (AraC, citarabina), 5-azacitidina, 2,2'-difluorodeoxicitidina-, análogos de purina tal como 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina, 22-deoxicoformicín (pentostatin), eritrohidroxínoniladenína (EHNA), fosfato de fludarabina, y 2-clorodeoxiadenosina (cladribina, 2-CdA); productos naturales incluyendo fármacos antimitóticos tal como paclitaxel, alcaloides vinca incluyendo vinblastina (VLB), vincristina, y vinorelbine, taxotero, estramustina, y fosfato de estramustina; ppipodofilotoxinas tal como etopósido y tenipósido; antibióticos tal como actimomicín D, daunomicin (rubidomicin), doxorubícín, mitoxantrona, idarubicin, bleomicinas, plícamicin (mitramicin), mitomícin C, y actinomícin; enzimas tales como L-asparaginasa; m í<odificadores de respuesta biológica tal como interferon-alfa, IL-2, G-CSF y GM-CSF; agentes misceláneos incluyendo complejos de coordinación de platino tal como cisplatina y carboplatina, antracenedionas tal como mitoxantrona, úrea substituida tal como hidroxiurea, derivados de metilhidrazina incluyendo N-metilhidrazina (MIH) y procarbazina, supresores de adrenocortícal tal como mitotano (o,p'-DDD) y amínoglutetimida; hormonas y antagonistas incluyendo antagonistas de adrenocorticoesteroide tal como prednisona y equivalentes, dexametasona y aminoglutetimida; progestin tal como hidroxiprogesterona caproato, medroxiprogesterona acetato y megestrol acetato; estrógeno tal como dietilstilbestrol y equivalentes de etinil estradiol; antiestrógeno tal como tamoxifen; andrógenos incluyendo testosterona propionato y fluoximesterona/equívalentes; antiandrógenos tal como flutamida, análogos de hormona de liberación de gonadotropin; y antiandrógenos no esteroidales tal como flutamída. Los agentes anti-angiogénicos ejemplificativos incluyen ERBITUX™ (IMC-C225), agentes inhibidores KDR (receptor de dominio de quinasa) (por ejemplo, anticuerpos o regiones de unión a antígeno que unen específicamente VEGF, o receptores VEGF solubles o una región de unión a ligando de los mismos) tal como AVASTIN™ o VEGF-TRAP™ , y agentes receptores anti-VEGF (por ejemplo, anticuerpos o regiones de unión a antígeno que se unen específicamente a los mismos), agentes inhibidores EGFR (por ejemplo, anticuerpos o regiones de unión a antígeno que se une específicamente a los mismos) tal como ABX-EGF (panitumumab), IRESSA™ (gefitinib), TARCEVA™ (eriotinib), agentes anti-Angl y anti-Ang2 (por ejemplo, anticuerpos o regiones de unión a antígeno específicamente uniéndose a los mismos o a sus receptores, por ejemplo, Tie2/Tek), y agentes inhibidores anti-Tie-2 quinasa (por ejemplo, anticuerpos o regiones de unión a antígeno que se unen específicamente a los mismos). Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden también incluir uno o más agentes (por ejemplo, anticuerpos, regiones de unión a antígeno, o receptores solubles) que se unen específicamente e inhiben la actividad de factores de crecimiento, tales como antagonistas de factor de crecimiento de hepatocito (HGF, tamboén conocido como Factor Scatter) y anticuerpos o regiones de unión a antígeno que se une específicamente a su receptor "c-met". Otros agentes anti-angiogénicos incluyen Campath, IL-8, B- FGF, antntagonistas Tek (Ceretti ef al., Publicación de EE.UU. No. 2003/0162712; Pat. de EE. UU. No. 6,413,932), agentes anti-TWEAK (por ejemplo, anticuerpos uniéndose específicamente o regiones de unión a antígeno, o antagonistas de receptor TWEAK solubles; ver, Wiley, Pat. de EE.UU. No. 6,727,225), dominio de ADAM distintegrin para antagonizar la unión de integrina a sus ligandos (Fanslow et al., Publicación de EE.UU. No. 2002/0042368), receptor anti-eph específicamente de unión y/o anticuerpos anti-efrin o regiones de unión a antígeno (Pats. de EE.UU. Nos. 5,981 ,245; 5,728,813; 5,969, 1 10; 6,596,852; 6,232,447; 6,057, 124 y miembros de la familia de patente de las mismas), y antagonistas anti-PDGF-BB (por ejemplo, anticuerpos uniéndose específicamente o regiones de unión a antígeno) así como también anticuerpos o regiones de unión a antígeno específicamente uniéndose a ligandos PDGF-BB, y agentes inhibidores de quinasa PDGFR (por ejemplo, anticuerpos o regiones de unión a antígeno que se unen específicamente a los mismos). Otros agentes anti-angiogénicos ejemplificativos incluyen antagonistas de Ang-1 y CD148 (y sus receptores), VEGF (Avastin, VEGF-TRAP, etc.), receptores VEGF, y IL-8, B-FGF, e inhibidores de molécula pequeña de KDR y otros mediadores de angiogénesis. Agentes ati-angiogénicos/anti-tumor adicionales incluyen: SD-7784 (Pfizer, USA); cilengitida (Merck KGaA, Alemania, EPO 770622); octasodio de pegaptanib (Gilead Sciences, USA); Alphastatín (BioActa, UK); M-PGA (Celgene, USA, US 5712291 ); ilomastat, (Arriva, USA, US 5892112); emaxanib (Pfizer, USA, US 5792783); vatalanib (Novartís, Suiza); 2-metoxiestradiol (EntreMed, USA); TLC ELL-12 (Elan, Irlanda); acetato de anecortave (Alcon, USA); alfa-D148 Mab (Amgen, USA); CEP-7055 (Cephalon, USA); anti-Vn Mab (Crucell, Países Bajos) DAC:antiangiogénico (ConjuChem, Canadá); Angiocidin (InKine Pharmaceutical, USA); KM-2550 (Kyowa Hakko, Japón); SU-0879 (Pfizer, USA); CGP-79787 (Novartis, Suiza, EP 970070); tecnología ARGENT (Ariad, USA); YIGSR-Stealth (Johnson & Johnson, USA); fragmento fibrinogen-E (BioActa, UK); inhíbitor de angiogénesis (Trigen, UK); TBC-1635 (Encysive Pharmaceuticals, USA); SC-236 (Pfizer, USA); ABT-567 (Abbott, USA); Metastatin (EntreMed, USA); ¡nhibitor de angiogénesís, (Tripep, Suecia); maspin (Sosei, Japón); 2- metoxiestradiol (Oncology Sciences Corporation, USA); ER-68203-00 (IVAX, USA); Benefin (Lañe Labs, USA); Tz-93 (Tsumura, Japón); TAN-1 120 (Takeda, Japón); FR-1 1 1 142 (Fujisawa, Japón, JP 02233610); factor 4 de plaqueta (RepliGen, USA, EP 407122); antagonista de factor de crecimiento endotelial vascular (Borean, Denmark); terapia de cáncer (University of South Carolina, USA); bevacizumab (pINN) (Genentech, USA); inhibidores de angiogénesis (SUGEN, USA); XL 784 (Exelíxis, USA); XL 647 (Exelíxis, USA); MAb, alpha5beta3 integrin , segunda generación (Applied Molecular Evolution, USA and Medlmmune, USA); terapia genética, retinopatía (Oxford BioMedica, UK); hidrocloruro de enzastaurin (USAN) (Lilly, USA); CEP 7055 (Cephalon, USA y Sanofi-Synthelabo, Francia); BC 1 (Genoa Institute of Cáncer Research, Italy); inhibidor de angiogénesís (Alchemia, Australia); antagonista VEGF (Regeneron, USA); antíangiogénico derivado de rBPI 21 y BPI (XOMA, USA); Pl 88 (Progen , Australia); cilengitida (pINN) (Merck KGaA, Germán; Munich Technical Universíty, Alemania, Scripps Cliníc and Research Foundation , USA); cetuximab (INN) (Aventis, Francia); AVE 8062 (Ajinomoto, Japón); AS 1404 (Cáncer Research Laboratory, New Zealand); SG 292 (Telios, USA); Endostatin (Boston Childrens Hospital, USA); ATN 161 (Attenuon, USA); ANGIOSTATIN (Boston Childrens Hospital , USA); 2-metoxiestradiol (Boston Childrens Hospital, USA); ZD 6474 (AstraZeneca, UK); ZD 6126 (Angiogene Pharmaceuticals, UK); PPI 2458 (Praecis, USA); AZD 9935 (AstraZeneca, UK); AZD 2171 (AstraZeneca, UK); vatalanib (pINN), (Novartis, Suiza and Schering AG, Alemania); inhibidores de la trayecotira del factor de tejido (EntreMed, USA); pegaptanib (Pinn) (Gilead Sciences, USA); xantorrhizol (Yonsei Universíty, South Korea); vacuna, basada en gen, VEGF-2 (Scripps Clinic and Research Foundation, USA); SPV5.2 (Supratek, Canadá); SDX 103 (University of California at San Diego, USA); PX 478 (ProlX, USA); METASTATI N (EntreMed, USA); troponin I (Harvard Universíty, USA); SU 6668 (SUGEN, USA); OXI 4503 (OXiGENE, USA); o-guanidinas (Dimensional Pharmaceuticals, USA); motuporamina C (Britísh Columbia University, Canadá); CDP 791 (Celltech Group, UK); atiprimod (pINN) (GlaxoSmithKIine, UK); E 7820 (Eisaí, Japón); CYC 381 (Harvard University, USA); AE 941 (Aeterna, Canadá); vacuna, angíogénesis (EntreMed, USA); inhibidor de activador de plasminogen uroquinasa (Dendreon , USA); oglufanida (pINN) (Melmotte, USA); inhibidores HIF-lalfa (Xenova, UK); CEP 5214 (Cephalon, USA); BAY RES 2622 (Bayer, Alemania); Angiocidin (InKine, USA); A6 (Angstrom, USA); KR 31372 (Korea Research Institute of Chemical Technology, Corea del Sur); GW 2286 (GlaxoSmithKIine, UK); EHT 0101 (ExonHit, Francia); CP 868596 (Pfizer, USA); CP 564959 (OSl , USA); CP 547632 (Pfizer, USA); 786034 (GlaxoSmithKIíne, UK); KRN 633 (Kirin Brewery, Japón); sistema de suministro de fármaco, intraocular, 2-metoxiestradiol (EntreMed, USA); anginex (Maastricht University, Países Bajos, y Minnesota University, USA); ABT 510 (Abbott, USA); AAL 993 (Novartis, Suiza); VEGI (ProteomTech, USA); inhibidores del factor de necrosis de tumor-alfa (National Institute on Agíng, USA); SU 1 1248 (Pfizer, USA y SUGEN USA); ABT 518 (Abbott, USA); YHI 6 (Yantai Rongchang, China); S-3APG (Boston Childrens Hospital, USA y EntreMed, USA); MAb KDR, (ImClone Systems, USA); MAb alfad . betal (Protein Design, USA); inhibidor de quinasa KDR (Celltech Group, UK, and Johnson & Johnson, USA); GFB 116 (South Florida University, USA y Yale University, USA); CS 706 (Sankyo, Japón); profármaco combretastatin A4 (Arizona State University, USA); chondroitinase AC (IBEX, Canadá); BAY RES 2690 (Bayer, Alemania); AGM 1470 (Harvard University, USA, Takeda, Japón, y TAP, USA); AG 13925 (Agouron, USA); Tetrathiomolibdato (University of Michigan, USA); GCS 100 (Wayne State University, USA) CV 247 (lvy Medical, UK); CKD 732 (Chong Kun Dang, Corea del Sur); factor de crecimiento de endotelio vascular MAb (Xenova, UK); irsogladina (INN) (Nippon Shinyaku, Japón); RG 13577 (Aventis, Francia); WX 360 (Wilex, Alemania); esqualamina (pINN) (Genaera, USA); RPI 4610 (Sima, USA); terapia de cáncer (Marinova, Australia); inhibidores de heparanasa (InSight, Israel); KL 3106 (Kolon, Corea del Sur); Honokiol (Emory University, USA); ZK CDK (Schering AG, Alemania); ZK Angio (Schering AG, Alemania); ZK 229561 (Novartis, Suiza, y Schering AG, Alemania); XMP 300 (XOMA, USA); VGA 1 102 (Taísho, Japón); moduladores del receptor VEGF (Pharmacopeia, USA); antagonistas de VE-cadherin-2 (ImClone Systems, USA); Vasostatin (National Institutes of Health, USA);vacuna, Flk-I (ImCIone Systems, USA); TZ 93 (Tsumura, Japón); TumStatín (Beth Israel Hospital, USA); FLT 1 soluble truncado (receptor 1 de factor de crecimiento vascular endotelial) (Merck & Co, USA); ligandos Tie-2 (Regeneron , USA); inhibidor de trombospondin 1 (Allegheny Health, Education and Research Foundation, USA). Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden incluir uno o más inhibidores de agentes de factor de crecimiento, tales como antagonistas de factor de crecimiento de hepatocito (HGF, también conocido como factor Scatter, y su receptor "c-met"). Las células efectoras específicas de objetivo, por ejemplo, células efectoras relacionadas con composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención también pueden utilizarse como agentes terapéuticos. Las células efectoras objetivo pueden ser leucocitos humanos tales como macrófagos, neitrófilos o monocitos. Otras células incluyen eosinófilos, células asesinas naturales y otras células llevando receptor IgG- o IgA. Si se desea, las células efectoras pueden obtenerse del sujeto a tratarse. Las células efectoras específicas objetivo, pueden administrarse como una suspensión de células en una solución fisiológicamente aceptable. El número de células administradas puede ser en el orden de 108-109 pero variará dependiendo del propósito terapéutico. En general, la cantidad será suficiente para obtener la localización en la célula objetivo, por ejemplo, una célula de tumor expresando CD148, y para efectuar muerte celular por, ejemplo, fagocitosis. Las vías de administración también pueden variar. La terapia con células efectoras específicas objeto pueden realizarse junto con otras técnicas para el retiro de células objetivo. Por ejemplo, terapia anti-tumor utilizando las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecificas) de la Invención y/o células efectoras armadas con estas composiciones pueden utilizarse junto con quimioterapia. Adicionalmente, la inmunoterapia de combinación puede utilizarse para dirigir dos poblaciones efectoras citotóxicas distintas hacia el rechazo de célula de tumor. Por ejemplo, anticuerpos anti-CD148 relacionados con anti-Fc?Ri o anti-CD3 pueden utilizarse junto con agentes de unión específicos del receptor IgG o IgA. Las moléculas bíespecíficas y multiespecíficas de la invención también pueden utilizarse para modular niveles de FcaR o Fc?R en células efectoras, tales como al cubrir y eliminación de receptores en la superficie celular. Las mezclas de receptores anti-Fc también pueden utilizarse para este propósito. Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multíespecíficas y biespecífícas) de la invención que tienen sitios de unión de complemento, tales como porciones de lgG1 , lgG2, lgG3 o IgM que pueden unir complemento, también pueden utilizarse en la presencia de complemento. En una modalidad , tratamiento ex vivo de una población de células comprendiendo células objetivo con un agente de unión de la invención y células efectoras apropiadas pueden complementarse por la adición de complemento o complemento conteniendo suero. La fagocitosis de células objetivo revestidas con un agente de unión de la invención puede mejorarse al unir proteínas complemento. En otra modalidad, las células objetivo revestidas con las composiciones (por ejemplo, anticuerpos de humano, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención también pueden usarse por complemento. En todavía otra modalidad, las composiciones de la invención no activan el complemento. Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos de humano, moléculas multiespecíficas y bíespecíficas) de la invención también pueden administrarse juntas con complemento. De acuerdo con lo anterior, dentro del alcance de la invención son composiciones comprendiendo anticuerpos de humano, moléculas multiespecíficas y biespecíficas y suero o complemento. Estas composiciones son ventajosas en que el complemento se ubica en proximidad cercana a los anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas. Alternativamente, los anticuerpos de humano, moléculas multiespecíficas y biespecíficas de la invención y el complemento o suero pueden administrarse por separado. También dentro del alcance de la invención son equipos comprendiendo las composiciones (por ejemplo, anticuerpos de humano, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención e instrucciones de uso. El equipo puede contener además al menos un reactivo adicional, tal como complemento, o uno o más anticuerpos humanos adicionales de la invención (por ejemplo, un anticuerpo humano teniendo una actividad complementaria que se une a un epítopo en antígeno CD148 distinto del primer anticuerpo de humano). En otras modalidades, el sujeto puede tratarse adicionalmente con un agente que modula, por ejemplo, mejora o inhibe, la expresión o actividad de receptores Fca o Fc? al, por ejemplo, tratar el sujeto con una citoquína. Las citoquinas preferidas para administración durante tratamiento con la molécula multiespecífica incluyen de factor estimulante de colonia de granulocito (G-CSF), factor estimulante de colonia de granulocito-macrófago (GM-CSF), interferon-? (IFN-?), y factor de necrosis de tumor (TNF). En otra modalidad, el sujeto puede tratarse adicionalmente con una preparación de linfoquina. Las células cancerígenas que no expresan altamente CD148 pueden inducirse para hacer esto utilizando preparaciones de linfoquina. Las preparaciones de linfoquína pueden causar una expresión más homogénea de CD148s entre células de un tumor que pueden conducir a una terapia más efectiva. Las preparaciones de linfoquína adecuadas para administración incluyen interferón-gamma, factor de necrosis de tumor, y combinaciones de los mismos. Estas pueden administrarse intravenosamente. Las dosificaciones adecuadas de linfoquina son 10,000 a 1 ,000,000 unidades/paciente.

Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos de humano, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención también pueden utilizarse para células objetivo expresando Fc?R o CD148, por ejemplo para marcar tales células. Para tal uso, el agente de unión puede relacionarse con una molécula que puede detectarse. De esta manera, la invención proporciona métodos para localizar células ex vivo o in vitro expresando receptores Fc, tales como Fc?R o CD148. La marca detectable puede ser, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor de enzima. En una modalidad, la invención proporciona métodos para detectar la presencia de antígeno CD148 en una muestra, o medir la cantidad de antígeno CD148, comprendiendo contactar la muestra, y una muestra de control, como un anticuerpo monoclonal humano, o un una región de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD148, bajo condiciones para permitir la formación de un complejo entre el anticuerpo o porción del mismo y CD148. La formación de un complejo se detecta entonces, en donde una formación de complejo de diferencia entre la muestra en comparación con la muestra de control es indicativa de la presencia de antígeno CD 148 en la muestra. En todavía otra modalidad, la invención proporciona un método para detectar la presencia o cuantificar la cantidad de células expresando Fc in vivo o in vitro. El método comprende (i) administrar a un sujeto una composición (por ejemplo, una molécula multi o biespecífica) de la invención o un fragmento de la misma, conjugada con un marcador detectable; (ii) exponer el sujeto a un medio para detectar dicho marcador detectable para identificar áreas conteniendo células que expresan Fc. Usos y Métodos de la Invención La presente invención proporciona anticuerpos o regiones de unión a antígeno de los mismos que se unen a epítopos CD 148 que son útiles para el tratamiento de enfermedades de humano y condiciones patológicas. Los agentes que activan la actividad de CD 148, u otra actividad celular, pueden utilizarse en combinación con otros agentes terapéuticos para mejorar sus efectos terapéuticos o disminuir efectos secundarios potenciales. En un aspecto, la presente invención proporciona reactivos y métodos útiles para tratar enfermedades y condiciones caracterizadas por niveles aberrantes o indeseables de actividad de CD 148 en una célula. Estas enfermedades incluyen cánceres, y otras condiciones hiperproliferativas, tales como hiperplasia, psoriasis, dermatitis de contacto , desordenes inmunológicos, e infertilidad. Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención pueden probarse inicíalmente para actividad de unión asociada con uso terapéutico o de diagnóstico in vitro. Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden probarse utilizando ELISA y ensayos citométricos de flujo descritos en la presente. Además, la actividad de estas moléculas para accionar al menos una actividad celular efectora mediada por efector, incluyendo histolisis de células expresando CD148, puede ensayarse. Los procedimientos para ensayar fagocitosis mediada por célula efectora se describen en la presente. Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos de humano, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención tienen utilidad adicional en terapia y diagnóstico de enfermedades relacionadas con CD148. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales de humano, las moléculas multiespecífícas y biespecíficas pueden utilizarse para promover desfosforilación inducida por CD148 en una célula expresando CD148, para inhibir el crecimiento de una célula expresando CD148, o para inhibir angiogénesís de una célula expresando CD148. Los anticuerpos anti-CD148 de la presente invención pueden ser útiles para tratar cualquier enfermedad dependiente de angiogénesis, incluyendo, pero no limitándose a, neovascularización ocular, tales como retinopatias (incluyendo retinopatía diabética), degeneración macular relacionada con la edad, psoriasis, hemangioblastoma, hemangioma, arterioesclerosis, enfermedad inflamatoria, tal como una enfermedad reumatoide o inflamatoria reumática, especialmente artritis (incluyendo artritis reumatoide), u otras enfermedades inflamatorias crónicas, tal como asma crónico, ateroesclerosis post-transplante o arteria, endometriosis, y enfermedades neoplásticas, por ejemplo, los así llamados tumores sólidos y líquidos (o hematopoyéticos) tales como leucemias y linfomas). Otras enfermedades asociadas con angiogénesis indeseada serán aparentes para aquellos expertos en la materia. En una modalidad particular, los anticuerpos de humano y derivados de los mismos se utilizan in vivo para probar, prevenir o diagnosticar una variedad de enfermedades neoplásticas relacionadas con CD148. Ejemplos de enfermedades relacionadas con CD 148 incluyen una variedad de cánceres, tales como vejiga, mama, uterino/cervical, colon, pancreático, colorectal, riñon, estómago, ovárico, próstata, célula renal, célula escamosa, pulmón (célula no pequeña), esofageal, y de cabeza y cuello. La presente invención también proporciona métodos para tratar cáncer en un animal, incluyendo humanos, comprendiendo administrar al animal una cantidad efectiva de un anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo que activa la actividad de CD148. La invención se dirige además a métodos para inhibir crecimiento de célula cancerígena, incluyendo procesos de proliferación celular, invasión, y metástasis en sistemas biológicos. Los métodos incluyen uso de un compuesto de la invención como un inhibidor de crecimiento de célula cancerógena. Preferentemente, los métodos se emplean para inhibir o reducir crecimiento de célula cancerígena, invasión, metástasis, o incidencia de tumor en animales vivos, tales como mamíferos. Los métodos de la invención también son fácilmente adaptables para utilizarse en sistemas de ensayo, por ejemplo, analizar crecimiento de célula cancerígena y propiedades de la misma, así como también identificar compuestos que afectan crecimiento de célula cancerígena. Los cánceres tratables por métodos de la presente invención preferentemente ocurren en mamíferos. Los mam íferos incluyen , por ejemplo, humanos y otros primates, así como también mascotas o animales de compañía tales como perros y gatos, animales de laboratorio tales como ratas, ratones y conejos, y animales de granja tales como caballos, puercos, ovejas, y ganado. Los tumores o neoplasmas incluyen crecimientos de células de tejido en las cuales la multiplicación de las células no se controla y es progresiva . Algunos de tales crecimientos son benignos, pero otros se denominan malignos y pueden conducir a la muerte del organismo. Los neoplasmas malignos o cánceres se distinguen de crecimientos benignos en que, además de mostrar proliferación celular agresiva, pueden invadir tejidos circundantes y empezar la metástasis. Además, los neoplasmas malignos se caracterizan en que muestran una mayor pérdida de diferenciación (dediferenciación mayor), y de su organización relativa a otros y sus tejidos circundantes. Esta propiedad también se llama "anaplasia". Los neoplasmas tratables por la presente invención también incluyen tumores sólidos, es decir, carcinomas y sarcomas. Los carcinomas incluyen aquellos neoplasmas malignos derivados de células epiteliales que infiltran (invaden) los tejidos circundantes y dan origen a metástasis. Los adenocarcinomas son carcinomas derivados de tejido glandular, o que forman estructuras glandulares reconocibles. Otra amplia categoría o cánceres incluye sarcomas, que son tumores cuyas células se incrustan en una substancia homogénea o fibrilar como tejido conectivo embriónico. La invención también permite el tratamiento de cánceres de los sistemas mieloides o linfoides, incluyendo leucemias, linfomas y otros cánceres que típicamente no están presentes como una masa de tumor, pero se distribuyen en los sistemas vasculares o linforeticulares. El tipo de cáncer o células de tumor susceptibles de tratamiento de acuerdo a la invención incluyen, por ejemplo, tumor productor de ACTH , leucemia linfocítica aguda, leucemia no linfocítíca aguda, cáncer de la corteza adrenal, cáncer de vejiga, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer cervical, leucemia línfocítica crónica, leucemia míelocítica crónica, cáncer colorectal, linfoma de célula T cutáneo, cáncer endometrial, cáncer esofageal, sarcoma de Ewing, de cáncer vejiga, leucemia de célula pilosa, cáncer de cabeza y cuello, linfoma de Hodgkin, sarcoma Kaposi, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer pulmón (célula pequeña y célula no pequeña), efusión peritoneal maligna, efusión pleural maligna, meianoma, mesotelioma, mieloma múltiple, neuroblastoma, glioma, linfoma de no Hodgkin, osteosarcoma, cáncer ovárico, cáncer ovárico (célula germinar), cáncer pancreático, cáncer penil, cáncer de próstata, retinoblastoma, cáncer de piel, sarcoma de tejido suave, carcinomas de célula escamosa, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides, neoplasmas trofoblásticos, cáncer uterino, cáncer vaginal, cáncer de la vulva, tumor de Wilm. La invención se ilustra particularmente en la presente en referencia al tratamiento de ciertos tipos de cánceres experimentalmente definidos. En estos tratamientos ilustrativos, modelos in vivo e in vitro del estado de la materia estándar se han utilizado. Estos métodos pueden utilizarse para identificar agentes que puede esperarse que sean eficaces en regímenes de tratamiento in vivo. Sin embargo, se entenderá que el método de la invención no se limita al tratamiento de estos tipos de tumor, pero se extiende a cualquier tumor sólido derivado de cualquier sistema de órgano. Los cánceres cuya invasión o metástasis se asocia con actividad de CD148 son especialmente susceptibles a inhibirse o aún inducirse a regreso por medios de la invención. La invención también puede practicarse al incluir con un compuesto de la invención tal como un peptidocuerpo en combinación con otro agente quimioterapéutico antí-cáncer, tal como cualquier agente quimioterapéutico. La combinación de un agente de unión específico con tales otros agentes puede potenciar el protocolo quimíoterapéutico. Numerosos protocolos quimoterapéuticos se presentarán ellos mismos en la mente del practicante experto como siendo capaces de incorporación en el método de la invención, cualquier agente quimioterapéutico puede utilizarse, incluyendo agentes de alquílación, antimetabolitos, hormonas y antagonistas, radioisótopos, así como también productos naturales. Por ejemplo, el compuesto de la invención puede administrarse con antibióticos tal como doxorubicin y otros análogos de antraciclina, mostazas de nitrógeno tales como ciclofosfamida, análogos de pirimídina tal como 5-fluorouracil, cisplatin, hidroxiurea, taxol y sus derivados sintéticos y naturales, y lo similar. Como otro ejemplo, en el caso de tumores mezclados, tal como adenocarcinoma de la mama, donde los tumores incluyen células independientes de gonadotropin y dependientes de gonadotropin, el compuesto puede administrarse junto con leuprólido o goserelina (los análogos de péptído sintético de LH-RH). Otros protocolos antineoplásticos incluyen el uso de un compuesto de tetracílina con otra modalidad de tratamiento, por ejemplo, cirugía, radiación etc, también referidas como "modalidades antineoplásticas adjuntas". De esta manera, el método de la invención puede emplearse con tales regímenes convencionales con el beneficio de reducir los efectos secundarios y aumentar la eficacia. La presente invención de esta manera proporciona composiciones y métodos útiles para el tratamiento de una amplia variedad de cánceres, incluyendo, tumores sólidos y leucemias. Tipos de cáncer que pueden tratarse incluyen, pero no se limitan a: adenocarcinoma de mama, próstata, y colon; todas formas de carcinoma bronogéníco del pulmón; mieloide; melanoma; hepatoma; neuroblastoma; papiloma; apudoma; coristoma; branquioma; síndrome carcínoide maligno; enfermedad cardiaca de carcinoide; carcinoma (por ejemplo, Walker, célula basal, basoescamosa, Brown-Pearce, ductal, tumor Ehrlich, Krebs 2, célula merquel, mucinosa, pulmón de célula no pequeña, célula de avena, papilar, cirrosa, broquial, brocogénica, célula escamosa, y célula transicional); desórdenes histiocíticos; leucemia; histiocitosis maligna; enfermedad de Hodgkin, carcinoma de célula de pulmón pequeño inmunoproliferatívo; linfoma de no Hodgkin, plasmacitoma; reticuloendoteliosis; melanoma; condroblastoma; condroma; condrosarcoma; fibroma; fibrosarcoma; tumores de célula gigante; histíocitoma; lipoma; liposarcoma; mesotelioma; mixoma; mixosarcoma; osteoma; osteosarcoma; cordoma; craniofarinngioma; dísgerminoma; hamartoma; mesenquimoma; mesonefroma; miosarcoma; ameloblastoma; cementoma; odontoma; teratoma; timoma; tumor tofoblástico. Además los siguientes tipos de cánceres también pueden tratarse: adenoma; colangioma; colesteatoma; ciclindroma; cístadenocarcinoma; cistadenoma; tumor de célula granulosa; ginandroblastoma; hepatoma; hidradenoma; tumor de célula de isleta, tumor de célula Leydig; papiloma; tumor de célula Sertoli; tumor de célula teca; leiomioma; leiomiosarcoma; mioblastoma; mioma; miosarcoma; rabdomioma; rabdomiosarcoma; ependimoma; ganglioneuroma; glioma; meduloblastoma; meningioma; neurilemoma; neuroblastoma; neuroepítelioma; neurofibroma; neuroma; paraganglioma; paraganglioma noncromafin; angioqueratoma; angiolinfoide hiperplasia con eosinofilia; angioma esclerosis; angiomatosis; glomangioma; hemangioendotelioma; hemangioma; hemangiopericitoma; hemangíosarcoma; limfangioma; lymfangiomioma; limfangiosarcoma; pinealoma; carcinosarcoma; condrosarcoma; cistosarcoma filodos; fibrosarcoma; hemangiosarcoma; leiomiosarcoma; leucosarcoma; liposarcoma; linfangiosarcoma; miosarcoma; mixosarcoma; carcinoma ovárico; rabdomiosarcoma; sarcoma; neoplasmos; nerofibromatosis; y displasia cervical. Otro aspecto de la presente invención es utilizar los materiales y métodos de la presente invención para prevenir y/o tratar cualquier condición hiperproliferativa de la piel incluyendo soriasis y dermatitis de contacto u otras enfermedades hiperproliferativas. Preferentemente, los agentes de unión específicos para CD148 se utilizarán en combinación con otros agentes farmacéuticos para tratar humanos que expresan estos síntomas clínicos. Los agentes de unión específicos pueden suministrarse utilizando cualquiera de los diversos portadores a través de vías de administración descritas en la presente y otras que se conocen bien por aquellos expertos en la materia. Otros aspectos de la presente invención incluyen tratar varias retinopatías (¡ncluyendo retinopatía diabética y degeneración macular relacionada con la edad) en la cual la angiogénesis se incluyen, así como también desordenes/enfermedades del tracto reproductivo femenino tal como endometriosis, fibroides uterina y otras tales condiciones asociadas con proliferación vascular difuncional (¡ncluyendo crecimiento microvascular endometrial) durante el ciclo reproductivo femenino. Todavía otro aspecto de la presente invención se refiere a tratar crecimiento vascular anormal ¡ncluyendo malformaciones arterioyenosas cerebrales (AVMs), lesión y reparación mucosal gastrointesintal, ulceración de la mucosa gastroduodenal en pacientes con una historia de enfermedad de úlcera de péptido, incluyendo isquemia, resultando de apoplejía, un amplio espectro de desordenes vasculares pulmonares en enfermedad de hígado e hipertensión de portal en pacientes con hipertensión de portal no hepática. Otro aspecto de la presente invención es la prevención de cánceres utilizando las composiciones y métodos proporcionados por la presente invención. Tales reactivos incluirán agentes de unión específicos tales como anticuerpos, o regiones de unión a antígeno de los mismos, contra CD 148. Identificación de Moléculas de Unión a Epítopo de CD148 Los epítopos de CD148 y anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse para identificar agentes que activan la actividad de CD148, que pueden ser útiles para tratar ciertos desordenes fisiológicos, incluyendo, pero no limitándose a inhibir angiogénesis.

En un aspecto de la presente invención se proporciona un método para identificar un compuesto que se une específicamente a un epítopo CD148 humano definido por una o más de las secuencias de polipéptídos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 447-725, 533-725, 715-973, 324-335, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO.33, comprendiendo: contactar un compuesto prueba con un epítopo CD148 de humano definido por una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 447-725, 533-725, 715-973, 324-335, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33 por un tiempo suficiente para formar un complejo y detectar la formación de un complejo al detectar ei epítopo CD148 o el compuesto en el complejo, de manera que si un complejo se detecta, un compuesto que se une al epítopo CD148 se identifica. Por ejemplo, las células transfectadas con ADNs codificando proteínas de interés pueden tratarse con varios fármacos, y co-inmunoprecipitacíones pueden realizarse. Debido a que CD148 se incluye en la transducción de señales fisiológicas asociadas con inhibición de tales desordenes fisiológicos como angiogénesis, la identificación de agentes que son capaces de activar la actividad de CD148 proporcionará agentes que pueden utilizarse para tratar desorden fisiológico o para utilizar compuestos guía para desarrollo de agentes terapéuticos. Un agente puede activar CD148 al unirse a los epítopos de CD148 definidos en la presente en tal manera que el agente inicia la defosforilación de CD148. Los agentes que pueden utilizarse para activar CD148 incluyen péptidos, anticuerpos, ácidos nucleicos, compuestos antisentído o ribozimas. El ácido nucleico puede codificar el anticuerpo o el compuesto antisentido. El péptido puede ser al menos 4 aminoácidos de la secuencia de la proteína de unión. Alternativamente, el péptido puede ser de 4 a 30 aminoácidos (o de 8 a 20 aminoácidos) que es al menos 75% idéntico a una expansión contigua de aminoácidos de la proteína de unión. Los agentes que pueden probarse utilizando células huésped transfectadas, estirpes de célula, animales o modelos de célula, tal como se describe en las Pats. de EE.UU. Nos. 5,622,852 y 5,773,218, y solicitudes PCT publicadas Nos. WO 97/27296 y WO 99/65939, cada una de las cuales se incorporan en la presente para referencia. El efecto de modulación del agente puede probarse in vivo o in vitro. Los agentes pueden proporcionarse para probar en una biblioteca de despliegue de fago o en una biblioteca de combinación. Ejemplificativo de un método para seleccionar agentes es medir el efecto que el agente tiene en la formación del complejo de proteína. Los epítopos CD148 de la presente invención también pueden utilizarse para producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente activos de interés o de moléculas pequeñas con las cuales interactúan (por ejemplo, agonistas, antagonistas, inhibidores) para formar fármacos que son, por ejemplo, formas estables o más activas del polipéptido, o que, por ejemplo, mejoran o interfieren con la función de un polipéptido in vivo. Un aspecto de la presente invención proporciona un método para identificar un compuesto que se une específicamente a un epítopo CD148 de humano definido por una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 447-725, 533-725, 715-973, 324-335, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33 comprendiendo: proporcionar coordenadas atómicas definiendo una estructura tridimensional de un epítopo CD148 definido por una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 447-725, 533- 725, 71 5-973, 324-335, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33, y designado o seleccionado compuestos capaces de unir el epítopo CD 148 en base a dichas coordenadas atómicas. Varios planteamientos para usarse en diseño de fármaco racional incluyen análisis de estructura tridimensional , exploraciones de alanina", modelación molecular y uso de anticuerpos anti-id . Estas técnicas se conocen bien por aquellos expertos en la materia . Tales técnicas pueden incluir proporcionar coordenadas atómicas definiendo una estructura tridimensional de un complejo de proteína formado por dicho polipéptido y dicho segundo polipéptido, y designar o seleccionar compuestos capaces de interferir con la interacción entre un primer polipéptido y un segundo polipéptido en base a dichas coordenadas atómicas. Siguiendo la identificación de una substancia que modula o afecta la actividad de polipéptido, la substancia puede investigarse más. Además, puede fabricarse y/o utilizarse en preparación, es decir, fabricación o formulación , o una composición tal como un medicamento, composición farmacéutica o fármaco. Estos pueden administrarse a individuos. Una substancia identificada como un modulador de función de polipéptido puede ser péptido o no péptido en naturaleza, "moléculas pequeñas" no péptido" con frecuencia se prefieren para muchos usos farmacéuticos in vivo. De acuerdo con lo anterior, una imitación de la substancia (particularmente si un péptido) puede diseñarse para uso farmacéutico.

El diseño de la imitación a un compuesto farmacéuticamente activo es un planteamiento conocido para el desarrollo de farmacéuticos en base a un compuesto "guía". Este planteamiento debe ser deseable mientras el compuesto activo es difícil o costoso de sintetizar o es indeseable para un método particular de administración , por ejemplo, péptidos puros son agentes activos inadecuados para composiciones orales ya que tienden a degradarse rápidamente por proteasas en un canal alimenticio. El diseño de imitación , síntesis y prueba se utiliza generalmente para evitar seleccionar aleatoria de números grandes de moléculas para una propiedad objetivo. Se ha encontrado un farmacoforo, su estructura se modela de acuerdo a sus propiedades físicas, por ejemplo, estereoquímica, unión , tamaño o carga, utilizando datos de un rango de fuentes, por ejemplo, técnicas espectroscópicas, datos de difracción de rayos X y N MR. El análisis computacional, mapeo de similitud (que modela la carga y/o volumen de un farmacoforo, preferentemente la unión entre átomos) y otras técnicas pueden utilizarse en este proceso de modelado. Una molécula templada se selecciona entonces, sobre la cual los grupos químicos que imitan el farmacoforo pueden injertase. La molécula templada y los grupos químicos injertados en la misma pueden seleccionarse convenientemente de manera que la imitación es fácil de sintetizar, es probablemente que sea farmacológicamente aceptable, y no se degrada in vivo, aunque retiene la actividad biológica del compuesto guía. Alternativamente, donde la imitación es a base de péptído, la estabilidad adicional puede lograrse al ciclízar el péptido, incrementando su rigidez. La imitación encontrada por este planteamiento puede seleccionarse para ver si tienen la propiedad objetivo, o que grado se muestra. Optimización adicional o modificación puede entonces llevarse a cabo para llegar a una o más de las imitaciones finales para prueba clínica in vivo. Ensayos de Unión Los ensayos de unión inmunológícos típicamente utilizan un agente de captura para unirse específicamente a y con frecuencia inmovilizar el antígeno objetivo de analito. El agente de captura es una porción que se une específicamente al analito. En una modalidad de la presente invención, el agente de captura es un anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo que une específicamente los epítopos CD148 de la invención. Estos ensayos de unión inmunológicos se conocen bien en la materia [Asai, ed., Methods in Cell Biology, Vol. 37, Antibodys ¡n Cell Biology, Academic Press, Inc., New York (1993)]. Los ensayos de unión inmunológicos frecuentemente utilizan un agente de marcado que señalará la existencia del complejo unido formado por el agente de captura y antígeno. El agente marcador puede ser una de las moléculas comprendiendo el complejo de unión, es decir, puede ser un agente de unión específico marcado o un anticuerpo de agente de unión antí-específico marcado. Alternativamente, el agente de marcado puede ser una tercer molécula, comúnmente otro anticuerpo, que se une al complejo unido. El agente de marcado puede ser, por ejemplo, un anticuerpo de agente de unión anti-específico que lleva una marca. El segundo anticuerpo, específico para el complejo unido, puede carecer de una etiqueta, pero puede unirse por una cuarta molécula específica para las especies de anticuerpos que el segundo anticuerpo es un miembro de. Por ejemplo, el segundo anticuerpo puede modificarse con una porción detectable, tal como bíotin, que puede entonces unirse por una cuarta molécula, tal como estreptavidin marcada con enzima. Otras proteínas capaces de unir específicamente regiones constantes de inmunoglobulin, tal como proteína A o proteína G también pueden utilizarse como el agente de marcado. Estas proteínas de unión son constituyentes normales de las paredes celulares de bacteria estreptococal y muestran una fuerte reactividad no inmunogénica con regiones constantes de inmunoglobulina de una variedad de especies. Akerstrom, J. Immunol., 135:2589-2542 (1985); Chaubert, Mod. Pathol., 10:585-591 (1997). Por todos los ensayos, las etapas de enjuague y/o incubación pueden requerirse después de cada combinación de reactivos. Las etapas de incubación pueden variar de aproximadamente 5 segundos a varias horas, preferentemente de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 24 horas. Sin embargo, el tiempo de incubación dependerá del formato de ensayo, analito, volumen de solución, concentraciones, y lo similar. Usualmente, los ensayos se llevarán a cabo a temperatura ambiente, aunque pueden conducirse sobre un rango de temperaturas. A. Ensayo de Unión No Competitivo: Los ensayos de unión inmunológicos pueden ser del tipo no competitivo. Estos ensayos tienen una cantidad de analito capturado que se mide directamente. Por ejemplo, en un ensayo "sadwich" preferido, el agente de captura (anticuerpo) puede unirse directamente a un substrato sólido donde se inmoviliza. Estos agentes de captura inmovilizados capturan entonces (se unen a) antígeno presente en la muestra de prueba. La proteína así inmovilizada se une entonces a un agente de marcado, tal como un segundo anticuerpo teniendo una marca. En otro ensayo "sandwich" preferido, el segundo anticuerpo carece de una marca, pero puede unirse por un anticuerpo marcado específico para anticuerpos de las especies de las cuales se deriva el segundo anticuerpo. El segundo anticuerpo también puede modificarse con una porción detectable, tal como biotin, a la cual la tercer molécula marcada puede unirse específicamente, tal como streptavidin. Ver Harlow and Lañe, Antibodies, " A Laboratory Manual, Ch 14, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988), incorporada en la presente para referencia. B. Ensayos de Unión Competitivos: Los ensayos de unión inmunológicos pueden ser del tipo competitivo. La cantidad de analito presente en la muestra se mide indirectamente al medir la cantidad de un analito agregado desplazado, o compite, de un agente de captura (anticuerpo) por el analito presente en la muestra. En un ensayo de unión competitivo preferido, una cantidad conocida de analito, usualmente marcado, se agrega a la muestra y la muestra se contacta entonces con el agente de captura. La cantidad de analito marcado unido al anticuerpo es inversamente proporcional a la concentración de analito presente en la muestra (Ver, Harlow and Lañe, Antibodíes, A Laboratory Manual, Ch 14, pp. 579- 583, supra). En otro ensayo de unión competitivo preferido, el agente de captura se inmoviliza en un substrato sólido. La cantidad de proteína unida al agente de captura puede determinarse ya sea al medir la cantidad de proteína presente en un complejo de proteína/anticuerpo, o alternativamente al medir la cantidad de proteína no compuesta restante. La cantidad de proteína puede detectarse al proporcionar una proteína marcada. Harlow and Lañe (supra). Todavía en otro ensayo de unión competitivo preferido, se utiliza inhibición de hapten. Aquí, un analito conocido se inmoviliza en un substrato sólido. Una cantidad conocida de anticuerpo se agrega a la muestra, y la muestra se contacta con el analito inmovilizado. La cantidad de anticuerpo unido al analito inmovilizado es inversamente proporcional a la cantidad de analito presente en la muestra. La cantidad de anticuerpo inmovilizado puede detectarse al detectar ya sea la fracción de anticuerpo inmovilizada o la fracción que permanece en solución. La detección puede ser directa donde el anticuerpo se marca o indirecta por la adición subsiguiente de una porción marcada que se une específicamente al anticuerpo como se describe arriba. C. Uso de Ensayos de Unión Competitivos: Los ensayos de unión competitivos pueden utilizarse para determinaciones de reactividad cruzada para permitir que un experto determine si un complejo de proteína o enzima que se reconoce por un peptidocuerpo de la invención es la proteína deseada y no una molécula de reacción cruzada o para determinar si el peptidocuerpo es específico para el antígeno y no une antígenos no relacionados. En ensayos de este tipo, el antígeno puede inmovilizarse en un soporte sólido y una mezcla de proteína desconocida se agrega al ensayo, lo que competirá con la unión de los peptidocuerpos a la proteína inmovilizada. La molécula de competición también une uno o más antígenos sin relacionar al antígeno. La habilidad de las proteínas para competir con la unión de los peptidocuerpos al antígeno inmovilizado se compara con la unión por la misma proteína que se inmoviliza al soporte sólido para determinar la reactividad cruzada de la mezcla de proteína. D. Otros Ensayos de Unión La presente invención también proporciona métodos Western blot para detectar o cuantificar la presencia de un epítopo CD148 o fragmento de los mismos en una muestra. La técnica generalmente comprende separar proteínas de muestra por electroforesis de gel en la base de peso molecular y transferir las proteínas a un soporte sólido adecuado, tal como filtro de nitrocelulosa, un filtro de nylon, o filtro de nylon derivado. La muestra se incuba con anticuerpos o región de unión a antígeno de los mismos que une específicamente a un epitopo CD148 y el complejo resultante se detecta. Estos peptidocuerpos pueden marcarse directamente o alternativamente pueden detectarse subsiguientemente utilizando anticuerpos marcados que se unen específicamente al peptidocuerpo. E. Ensayos de Diagnóstico Los agentes de unión derivados, tales como péptidos y peptidocuerpos o fragmentos de los mismos, de la presente invención son útiles para el diagnóstico de condiciones o enfermedades caracterizadas por expresión de CD148 o subunidades, o en ensayos para monitorear los pacientes que se tratan con activadores de CD148, sus fragmentos, agonistas o inhibidores de actividad de CD148. los ensayos de diagnóstico para CD148 incluyen métodos utilizando un anticuerpo y una marca para detectar CD148 en fluidos corporales humanos o extractos de células o tejidos. Los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse con o sin modificación. En un ensayo de diagnóstico preferido, los anticuerpos se marcarán al unir, por ejemplo, una marca o una molécula reportera. Una amplia variedad de marcas y moléculas reporteras se conocen, algunas de las cuales ya se han descrito en la presente. En particular, la presente invención es útil para diagnóstico de enfermedad de humano. Una variedad de protocolos para medir proteínas CD148 utilizando anticuerpos específicos para la proteína respectiva se conocen en la materia. Ejemplos incluyen ensayo inmunosorbente relacionado con enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RÍA) y clasificación de célula activada por fluorescencia (FACS). Un inmunoensayo de base monoclonal, de dos sitios utilizando anticuerpos monoclonales reactivos para dos epítopos sin interferencia en CD 148 se prefiere, pero un ensayo de unión competitivo puede emplearse. Estos ensayos se describe, por ejemplo, en Maddox eí al., J . Exp. Med., 158: 121 1 (1983). Para proporcionar una base de diagnóstico, los valores normales o estándar para expresión de CD 148 de humano se establecen usualmente. Esta determinación puede realizarse al combinar fluidos corporales o extractos celulares de sujetos normales, preferentemente humano, con un anticuerpo a CD148, bajo condiciones adecuadas para formación de complejo que se conocen bien en la materia. La cantidad de formación de complejo estándar puede cuantificarse al comparar la unión de los anticuerpos a cantidades conocidas de proteína CD 148, con ambas muestras, de control y enfermedad. Entonces, los valores estándar obtenidos de muestras normales pueden compararse con valores obtenidos de muestras de sujetos potencialmente afectados por enfermedad. La desviación entre valores estándar y sujeto sugiere un papel para CD148 en el estado de enfermedad. Para aplicaciones de diagnóstico, en ciertas modalidades, regiones de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención típicamente se marcarán con una porción detectable. La porción detectable puede ser cualquiera que es capaz de producir, ya sea directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la porción detectable puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 4C, 32P, 35S, o 125l, un compuesto fluorescente o quimiluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, o luciferin; o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o peroxidasa de rábano picante. Bayer eí al. , Meth. Enz., 184: 138-163, (1990). La presente invención se ilustra además por los siguientes ejemplos que no deben construirse como limitantes. Los contenidos de todas las figuras y todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas por esta solicitud se incorporan de manera expresa en la presente para referencia. Ejemplo 1 — Generación de Anticuerpos Contra Epítopos CD148 Las versiones de origen de las regiones de cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos de la presente invención se identifican utilizando el siguiente procedimiento de selección. Bibliotecas de fago scFv recombinante (fragmento variable de cadena única) de Cambridge Antibody Technologies (CAT) se interrogan in vitro contra objetivos de proteína huCD148. Más de 10,000 clones se seleccionan, recuperan por despliegue fago (salidas de 2da y 3era vuelta) y más de 250 anticuerpos scFv únicos se identifican que unen específicamente huCD148. De estos reactivos, 83 se consolidan para estudio adicional, en base a su potencial terapéutico predicho. Por ejemplo, varios anticuerpos se aislan que compiten para unirse al mismo epítopo como aquel de N24 según se mide por reporte ELISA o TR competitiva (fluorescencia resuelta en tiempo). Otros anticuerpos se consolidan en base a su proporción de señal a ruido relativamente alta como se índica por ELISA o TRF (por ejemplo, unión objetivo en comparación con unión de streptavidin) o porque reaccionan con el ortólogo CD148 de murino. Todos los anticuerpos antí-CD 148 se prueban por su habilidad para reaccionar con muCD 148 (para estudios de ratón in vivo) y para unir huCD 148 expresado en célula. Ocho anticuerpos análogos N24 de humano scFv mostrando el grado relativamente más alto de competición con N24 como ya sea lgG4s , maxicuerpos (scFv-Fcs bivalente) o ambos, así como también 7 otros clones, se expresan y la actividad de unión y especificidad se confirma. El anticuerpo N24 de ratón original se clona, y los genes VH y VL se subclonan en varias "plataformas" de anticuerpo para servir como controles positivos en unión comparativa (es decir, ELISA o FACS) y ensayos funcionales in vitro e in vivo. La selección funcional primaria de los anticuerpos candidatos guía iniciales del "top 14" se completa. Ocho de estos clones agonizan huCD 148 en un ensayo de migración planar in vitro. Además, 4 de estos clones gu ía que reaccionan con muCD 148 inhiben angiogénesís inducida por FGF-2 en ensayo de cavidad corneal de ratón in vivo. Los ocho anticuerpos descritos en las Figuras 1 -8 fueron capaces de inhibir angiogénesis tanto en un ensayo de migración de célula endotelial de humano y en un ensayo de cavidad corneal, con al menos 20% de capacidad en comparación con controles in vitro a una concentración de 20 µg I ml. Los anticuerpos generados de acuerdo con el procedimiento anterior se describen en las Figuras 1 -8. Figura 1 A y 1 B muestran una superposición de secuencia de aminoácidos codificada y nucleótidos para cadenas, pesada variable (VH) and ligera variable (VL), para un anticuerpo de la presente invención, Anticuerpo No. 1 (Ab-I). Regiones sombreadas en la figura resaltan CDR1 , 2, y 3 (de termino amino a carboxi, respectivamente). Designaciones de Solicitud y Estructura 1 indican las secuencias de nucleótídos y aminoácidos, respectivamente. Figura 2A y 2B muestran una superposición de secuencia de aminoácidos codificada y nucleótidos para cadenas, pesada variable (VH) y ligera variable (VL), para Anticuerpo No. 2 (Ab-2). Regiones sombreadas en la figura resaltan CDR1 , 2, y 3 (de termino amino a carboxí, respectivamente). Figura 3A y 3B muestran una superposición de secuencia de aminoácidos codificada y nucleótidos para cadenas, pesada variable (VH) y ligera variable (VL), para Anticuerpo No. 3 (Ab-3). Regiones sombreadas en la figura resaltan CDR1 , 2, y 3 (de termino amino a carboxi, respectivamente). Figura 4A y 4B muestran una superposición de secuencia de aminoácidos codificada y nucleótidos para cadenas, pesada variable (VH) y ligera variable (VL), para Anticuerpo No. 4 (Ab-4). Regiones sombreadas en la figura resaltan CDR1 , 2, y 3 (de termino amino a carboxi, respectivamente). Figura 5A y 5B muestran una superposición de secuencia de aminoácidos codificada y nucleótidos para cadenas, pesada variable (VH) y ligera variable (VL), para Anticuerpo No. 5 (Ab-5). Regiones sombreadas en la figura resaltan CDR1 , 2, y 3 (de termino amino a carboxi , respectivamente). Figura 6A y 6B muestran una superposición de secuencia de aminoácidos codificada y nucleótidos para cadenas, pesada variable (VH) y ligera variable (VL), para Anticuerpo No. 6 (Ab-6). Regiones sombreadas en la figura resaltan CDR1 , 2, y 3 (de termino amino a carboxi, respectivamente). Figura 7A y 7B muestran una superposición de secuencia de aminoácidos codificada y nucleótidos para cadenas , pesada variable (VH) y ligera variable (VL), para Anticuerpo No. 7 (Ab-7). Regiones sombreadas en la figura resaltan CDR1 , 2, y 3 (de termino amino a carboxi , respectivamente). Figura 8A y 8B muestran una superposición de secuencia de aminoácidos codificada y nucleótidos para cadenas, pesada variable (VH ) y ligera variable (VL), para Anticuerpo No. 8 (Ab-8). Regiones sombreadas en la figura resaltan CDR1 , 2, y 3 (de termino amino a carboxi , respectivamente). Ejemplo 2 - Trazado de CD148 Uniendo Epítopos Péptido sintético 1 5-mers correspondiente al ectodominio de secuencia de proteína primaría CD41 8 de humano se sintetiza y N-enlaza covalentemente a sectores en membranas PVDF. La composición de las diversas secuencias de péptido se sobrepone por 3 aminoácidos. Las membranas conteniendo péptido se preincuban con MeOH por 10 min, enjuagan 3 veces con PBST e incuban durante la noche con 4% leche en PBST. Después de 3 enjuagues con PBST la membrana se incuba por 3 horas con 1 /M anticuerpo anti-CD148 diluido en 4% leche. La membrana se enjuaga de nuevo 3 veces y después se incuba por 1 hr con ya sea Fc-HRP anti-humano o Fc- HRP anti-ratón (Jackson). Después de 3 enjuagues con PBST la unión se detecta utilizando el equipo Super Signal de Pierce. Las membranas conteniendo péptido se regeneran por nuevos experimentos al enjuagarlas inmediatamente dos veces con agua (después de un uso) y después se incuban durante la noche con DMF. Después de 2 enjuagues con agua la membrana se enjuaga con regulador de regeneración A (1 % SDS, 0.1 % b-mercaptoetanol, 8M Urea) por varias horas, después se enjuaga 2 veces con regulador de regeneración B (50% EtOH, 10% ácido acético). La eficiencia de la etapa de regeneración se verifica al colorear la membrana utilizando anticuerpo secundario solo y desarrollándose. Después de completar el proceso de regeneración, las membranas se enjuagan con MeOH, secan y almacenan en -20°C. La unión de Ab-1 , Ab-2, Ab-3, y Ab-5, un anticuerpo anti-CD148 de murino, y anticuerpo anti-CD148 143-41 (Biosource) para el péptido conteniendo membranas se prueba de acuerdo con el procedimiento descrito arriba, con los siguientes resultados: El anticuerpo de murino unido a los péptidos 1 14-1 17 en membrana #1 y 90-93 en membrana # 2 (1 14 & 90: GPVDPS SGQQSRDTE (residuos 315-329), 1 15 & 91 : DPSSGQQSRDTEVLL (residuos 318-332), 1 16 & 92: SGQQSRDTEVLLVGL (residuos 321 - 335), 1 17 & 93: QSRDTEVLLVGLEPG (residuos 324-338)), que tienen el epítopo común QSRDTE (residuos 324-329). El anticuerpo de murino también puede unir el octapéptido QSRDTEVLL (residuos 324-332). Los péptidos unidos Ab-1 1 16 y 1 17 en membrana # 1 y péptidos 92 y 93 en membrana # 2 (1 16 & 92: SGQQSRDTEVLLVGL (residuos 321 -335), 1 17 & 93: QSRDTEVLLVGLEPG (residuos 324-338)), que tienen el epítopo común QSRDTEVLLVGL (residuos 324-335), pero no unen el octapéptido QSRDTEVL (residuos 324-331 ). Ningún otro anticuerpo anti-CD148 que se prueban mostró evidencia de unión a estas membranas conteniendo péptido. De esta manera, el anticuerpo Ab-1 se une a un péptido teniendo la secuencia de residuos de aminoácidos 324-338 y 321 -335, pero no se une a un octapéptido teniendo la secuencia de residuos de aminoácido 324-331 de CD148 de humano. En base a los resultados de trazado de péptido el epítopo requerido mínimo del anticuerpo anti-CD148 de murino se estrecha a los 6 aminoácidos QSRDTE (residuos 324-329). El epítopo requerido mínimo de Ab-1 también se determina que es de 12 aminoácidos QSRDTEVLLVGL (residuos 324-335). Debido a que ningún otro anticuerpo antí-CD 148 probado mostró la unión a las membranas conteniendo péptido, se determina que los epítopos para aquellos anticuerpos son estructuralmente dependientes. Ejemplo 3 - Construcción y Ensayo de FLAG. Poli-Histidina y Proteínas de Fusión Fc. Las siguientes construcciones se subclonan en el vector de expresión de mamífero p412 flanquedo N-terminalmente por tanto una secuencia guía IgK y fusiones Flag poly-Histidina tag; huCD148- ECTO (residuos 36-973); huCD148-NFnlll (residuos 36-210); huCD 148-Fnl ll2_3 (residuos 175-536); huCD148-Fnll l4_5 (residuos 533-725); huCD 148-Cterm: (residuos 715-973). Estos clones se transfectan de manera transitoria en células COS PKB (E5) y purifican utilizando una columna IMAC. La unión de diferentes anticuerpos anti-CD148 se prueba utilizando 2 métodos diferentes ELISA. El primer método es un ELISA directo en placas Ni-NTA. Las placas Ni-NTA (Invitrogen) se revisten con 4 diluciones (1 : 10-1 : 10.000) de las 5 proteínas en 3% BSA en PBS y se incuban durante la noche a 4°C. Las placas se enjuagan con PBST e incuban con 1 //g/ml de Ab-2-hulgG4, Ab-5-hulgG4, el anticuerpo anti-CD148 de murino, y 143-41 (Biosource) por 2 hrs a temperatura ambiente. Después de enjuagues adicionales las placas se incuban con anti-hu-lgG4-HRP (Zymed) o FC-HRP anti-ratón (Jackson) por 1 hr a temperatura ambiente. Después se enjuaga de nuevo y la señal se desarrolla al agregar 100 µ\ of 10mg of ABTS (Amersham) con 45ml 0.05M ácido cítrico pH 4.0 El segundo método es una ELISA indirecta. Las placas Maxisorp se revisten con 5 g/ml anti-huFc o anti-muFc (Jackson) durante la noche a 4°C. Las placas se enjuagan con PBST y bloquean con 3% BSA en PBS por 1 .5 hrs. Después de enjuagues adicionales las placas se incuban con 5 ug/ml de Ab-2-hulgG4, Ab-5- hulgG4, anticuerpo anti-CD148 de murino, y 143-41 (Biosource) por 2 hrs a temperatura ambiente. Las placas se enjuagan de nuevo y se incuban con 2 diluciones (1 : 10, 1 :100) de las 5 proteínas por 2 hrs a temperatura ambiente, enjuagan de nuevo e incuban con anti-FLAG M2-HRP (Sigma) por 1 hr a temperatura ambiente. Como se espera, en base al trazado del péptido, el anticuerpo anti-CD148 de murino une la proteína huCD148-Fnll l2_3 (residuos 175-536). El anticuerpo 143-41 comercial (Biosource) se une a la proteína huCD148-NFnlll (residuos 36-210). Además, Ab-5 se une tanto a la proteína huCD148-FnlH4_5 (residuos 533-725) como la proteína huCD 148-Cterm (residuos 715-973). Debido a que la producción de las proteínas utilizando este método de purificación fue muy bajo la marca FLAG poly-his tag se cambia a aquella de una marca Fc. Las construcciones se transfieren de nuevo en células CHO PBK E5, purifican utilizando columna de proteína A y la unión de anticuerpos anti-CD148 se prueba por otro método ELISA. Las placas Maxlsorp se revisten con 5 //g/ml antí-huFc (Jackson) durante la noche a 4°C, enjuagan y bloquean con 3% leche en PBS por 1 .5 hrs. Las placas se enjuagan de nuevo e incuban con 5 //g/ml de las construcciones CD148-Fc diferentes por 2 hrs a temperatura ambiente. Después de enjuagues adicionales las placas se incuban con 1 //g/ml de Ab-2-hulgG4, Ab-5-hulgG4, Ab-l-hulGg4, anticuerpo anti-CD148 de murino, y 143-41 (Biosource) por 2 hrs a temperatura ambiente. Las placas se enjuagan de nuevo e incuban con anti-hulgG4-FIRP (Zymed) o Fc- HRP anti-ratón (Jackson) por 1 hr a temperatura ambiente. Cinco construcciones CD 148 con ya sea marcas Flag, Poly-His o marca Fc se expresan transitoriamente en 293 células E5 y se purifican utilizando columna IMAC o columna de proteína A respectivamente. La unión de clones anti-CD148 a las diferentes construcciones de prueba por ELISA, como se describe en los métodos. Clon anti CD 148 de humano, Ab-5, unido tanto a la pieza Fnlll4_5 (residuos 533-725) como la pieza de término C (residuos 715-973) cuando las construcciones de marcas Flag, Poly-His se utilizan y a Fnlll4_5 (residuos 533-725) cuando las construcciones de marca Fc se utilizan. También se une la proteína de dominio ECTO de longitud completa (residuos 36-973) con ambas marcas. El clon anti-CD148 de humano, Ab-2, mostró unión a la proteína de dominio ECTO de longitud completa (residuos 36-973) con ambas marcas y un bajo nivel de unión a Fnll l4_5 (residuos 533-725) con la marca Fc tag pero no unión a todas de cualquiera de las otras 3 construcciones. El clon anti CD 148 de humano, Ab-1 se utiliza solamente en ELISA con construcciones Fc. Se une solamente la pieza Fnl l l2_3 (residuos 175-536. anti-CD148 de murino comercial 143-41 (Biosource) unido a la proteína de dominio ECTO de longitud completa (residuos 36-973) y la pieza NFnll l (residuos 36-210) en todos los ensayos pero no se une a ninguna de las otras 3 construcciones. El anticuerpo anti-CD148 de murino se utiliza como un control positivo en todos los ensayos ya que se sabe reconocer el octapéptido en residuos 324-332. El anticuerpo antí-CD148 de murino reconoció la pieza Fnlll2_3 (residuos 175-536) en todos los ensayos y la proteína de dominio ECTO de longitud completa (residuos 36-973) con la marca Fc. En base a los resultados combinados de las 3 ELISAS se concluye que el anticuerpo anti-CD148 143-41 de murino (Biosource) reconoce un epítopo estructuralmente dependiente que yace dentro de los residuos 36-210. Ab-5 reconoce tanto la pieza Fnlll4_5 (residuos 533-725) y la pieza de término C (residuos 715-973). Estas piezas tienen una sobreposición de 11 AA entre ellas. Aquí, estas 11AA pueden ser necesarias para unión Ab-5. Ejemplo 4 — Construcción y Ensayo de Proteínas de Fusión de Avídin Las siguientes construcciones se subclonan en vector pCep4-Avidin-N: huCD148-NFnlll (residuos 36-210); huCD148-Fnlll2_3 (residuos 36-536); huCD148-Fnlll4_5 (2) (residuos 36-715); huCD148-Fnlll4_5 (residuos 36-725); huCD148-ECTO (residuos 36-973); huCD148Fnlll2_3_4_5 (residuos 200-725); huCD148Fnlll3_4_5 (residuos 447-725); huCD148-Fnlll4_5 (solamente) (residuos 533-725); huCD148-Fnlll_5 (residuos 616-725); huCD148-Fnlll_5.5 (residuos 672-725). Todas las construcciones de expresión de avidin se transfectan en 293 células T utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) siguiendo el protocolo del vendedor. El medio de condición se recolecta 2 días después de la transfección y el nivel de proteína fusionada a Avidin se determina utilizando perlas de biotin (Spherotech Inc.). Para cada construcción 5//I de perlas se utilizan. Las perlas se prebloquean al incubar con 3% BSA por 30 min a temperatura ambiente, enjuagan una vez utilizando 0.2% BSA en PBS y después se agrega a 200//! de cada uno de los medios de condición para un adicional de 1 hr de incubación. Después de 2 enjuagues, 1/ g/ml de anti-Avidin-FITC (Vector) se agrega por 30 minutos de incubación, después las perlas se enjuagan de nuevo, resuspenden en 500//I regulador de enjuague y leen utilizando FACS. En base a los resultados del nivel de expresión la cantidad de medios de condición a utilizarse en el ensayo de unión se determina. El protocolo para el ensayo de unión es igual como se describe arriba solamente en lugar del anti-Avidn-FITC, 1//g/ml de anti-CD148 Ab-2 marcado con FITC y anticuerpos Ab-5 se agregan. Una variación de este ensayo incluye co-incubación de la proteína de fusión de avidin con tanto el anticuerpo marcado FITC de interés como también 50x exceso de anticuerpo sin marcar para determinar sí el anticuerpo marcado puede o no competir/prevenir efectivamente para unión del anticuerpo marcado FITC a evaluarse. Este ensayo de competición fue y puede utilizarse para determinar sí cualquier anticuerpo puede competir por unión al mismo espacio de epítopo como otro. Tanto Ab-2 como Ab-5 reconocieron huCD148-ECTO de longitud completa (residuos 36-973) y las construcciones huCD 148-Fnl ll4_5 (residuos 36-725). Sin embargo, ninguno de estos anticuerpos se une a las construcciones huCD148-NFn l l I (residuos 36-210), huCD148- Fnl l l2_3 (residuos 36-536) y huCD148-Fnlll4_5 (2) (residuos 36-715). Ab-5 también une las construcciones huCD148Fnll l2_3_4_5 (residuos 200-725); huCD148Fnl ll3_4_5 (residuos 447-725) y huCD 148-Fnl l l4_5 (solamente) (residuos 533-725) pero no las construcciones huCD148-Fnl l l_5 (residuos 616-725) y huCD148-Fnlll_5.5 (residuos 672-725). Ab-2 une las construcciones huCD148FnlH2_3_4_5 (residuos 200-725); huCD148Fnll l3_4_5 (residuos 447-725) pero no une las construcciones huCD148-Fnll l4_5 (solamente) (residuos 533-725), huCD148- Fnll l_5 (residuos 616-725) y huCD148-Fnll l_5.5 (residuos 672-725). En este ensayo de competición, Ab-2 fue capaz de inhibir completamente Ab-5 uniéndose tanto a la construcción huCD148-ECTO como la construcción Fnl ll4_5. Ab-5 fue capaz de competir completamente con la unión de Ab-2 a huCD148-ECTO pero solamente inhibe parcialmente la unión de Ab-2 a construcciones huCD148-Fnlll4_5. Debido a que tanto Ab-2 como Ab-5 se une a las construcciones de longitud completa huCD148-ECTO (residuos 36-973) y huCD148-Fnlll4_5 (residuos 36-725) pero no a la construcción huCD148-Fnlll4_5 (2) (residuos 36-715) que solamente difieren de la construcción huCD 148-Fnll l4_5 (residuos 36-725) por 1 1AA en el extremo de terminal C y debido a que ninguno de estos anticuerpos reconoce ningún péptído en nuestras membranas de unión a péptido, se concluye que 11AA en residuos 715-725 son necesarios para la unión de estos anticuerpos pero no suficiente par ala unión. En base a los resultados de unión de estos anticuerpos a construcciones huCD148Fnl l l2_3_4_5 (residuos 200-725), huCD148Fnlll3_4_5 (residuos 447-725), huCD148-Fnll l4_5 (solamente) (residuos 533- 725), huCD148-Fnlll_5 (residuos 616-725) y huCD148-Fnlll_5.5 (residuos 672-725) se determina que el área de unión mínima para Ab-5 es residuos 533-725 y para Ab-2 es residuos 447-725. Ejemplo 5 Actividad Anti-Anqiogénesis de Anticuerpos Anti-CD148 en un Ensayo de Migración Planar Un ensayo migración de célula endotelial planar (cierre de herida) se utiliza para cuantificar la inhibición de angiogénesis in vitro por todos los anticuerpos descritos en las Figuras 1 -8, substancialmente como se describe en Patente de EE.UU. No. 6,248,327, que se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. En este ensayo, la migración de célula endotelial se mide como la velocidad de cierre de una herida circular en una nanocapa de célula cultivada. La tasa de cierre de herida es lineal, y se regula dinámicamente por agentes que estimulan e inhiben la angiogénesis in vivo. Las células endoteliales microvasculares renales humanas primarias, HRMEC, se aislan, cultiva, y utilizan en el tercer paso después de descongelamiento, como se describe en Martin eí al., In Vitro Cell Dev Biol 33:261 , 1997. Las lesiones circulares de réplica, "heridas" (600-800 micron de diámetro) se generan en monocapas HRMEC confluentes utilizando una prensa de perforación de punta de silicona. En el momento de herida el medio (DMEM + 1 % BSA) se complementa con 20 ng/ml PMA (forbol-12-miristato-13-acetato), solo o en la presencia de 5 a 50 ug/ml de control o Ab-1 a Ab-8. El área de herida residual se mide como una función de tiempo (0-12 horas) utilizando un software de análisis de imagen y microscopio (Bioquant, Nashvílle, TN). La tasa de migración relativa se calcula para cada agente y combinación de agentes por regresión lineal de área de herida residual diagramada con el tiempo. Cada uno de Ab-1 , Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7 y Ab-8 inhibió la migración endotelial inducida por PMA en una manera responsiva de dosis, significativamente reduciendo la tasa de migración a niveles no estimulados variando de 15 a 50 ug/ml. Ejemplo 6 — Actividad Anti-Anqiogénesis de Anticuerpos Anti-CD148 en un Ensayo de Cavidad Corneal La habilidad de los anticuerpos de la presente invención para inhibir angiogénesis in vivo se determina en ensayo de cavidad corneal de ratón, substancialmente como se describe en Patente de EE.UU. No. 6,248,327. En este ensayo, los agentes a probarse para actividad angiogénica o anti-angiogénica se inmovilizan en una forma de liberación lenta en una pastilla de hidrón, que se implanta en microcavidades creadas en el epitelio corneal de ratones anestesiados. La vascularización se mide como la apariencia, densidad y grado de crecimiento de vaso del limbo corneal vascularizado en la córnea normalmente avascular.

Las pastillas de esponja de polivinil alcohol conteniendo FGF-2 (50 ng/pastilla), bFGF e IgG (12 ug/pastilla, control), o bFGF y Ab-1 a 8 (12 ug/pastilla). Las pastillas se implantaron quirúrgicamente en microcavidades corneal estromal por micro-disección 1 mm media al limbo corneal lateral de ratones C57BL/6 macho de 6-8 semanas de edad. Las pastillas se implantan quirúrgicamente en microcavidades corneal estromal creadas por microdisección 1 mm media al limbo corneal lateral de ratones C57BL de 6-8 semanas de edad. Después de cinco días, en el valor máximo de respuesta neovascular a FGF-2, las corneas se fotografían utilizando un estéreo microscopio MZ9.5 (Leica) a un ángulo incipiente de 35-50° del eje polar en el meridiano conteniendo la pastilla. Las imágenes se digitalizan y procesan por filtros de color substractívo (Adobe Photoshop 4.0) para delinear microenvases establecidos por contenido de hemoglobin. El software de análisis de imagen (Bioquant, Nashville, TN) se utiliza para calcular la fracción de la imagen corneal que se vasculariza, la densidad del vaso dentro del área vascularizada, y la densidad del vaso dentro de la córnea total. Ab-2, Ab-4, Ab-5, y Ab-7 inhibió la angiogénesis corneal inducida por bFGF, reduciendo significativamente la densidad vascular significativamente a menos de aquella inducida por FGF solo.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo CD 148 de humano definido por una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318- 332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533- 725, 715- 973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33. 2. El anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo inhibe angiogénesis. 3. El anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal. 4. El anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo de humano o región de unión a antígeno de los mismos. 5. El anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo consistiendo de scFv, Fab, F(ab')2, Fv, y anticuerpos de cadena única. 6. El anticuerpo aislado de humano o región de unión a antígeno de los mismos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo comprende un fragmento scFv. 7. El anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo comprende o es una fusión scFv-Fc. 8. Un anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo que inhibe completamente la unión de un anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 a un epítopo CD 148 de humano definido por una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 31 5-329, 31 8-332, 321 -335, 324- 338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 71 5-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33. 9. El anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 8, en donde el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo inhibe angiogénesis. 10. El anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 8 o 9, en donde el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal. 1 1 . El anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo de humano. 12. El anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 1 1 , en donde el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo consistiendo de scFv, Fab, F(ab')2, Fv, y anticuerpos de cadena única. 13. El anticuerpo aislado de humano o región de unión a antígeno de los mismos según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en donde el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo comprende un fragmento scFv. 14. El anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en donde el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo comprende o es una fusión scFv-Fc. 15. Una célula hibridoma que produce un anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14. 16. Una célula transfectoma que produce un anticuerpo o región de unión a antígeno dei mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14. 17. El anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, producido por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico teniendo un genoma comprendiendo un transgen de cadena pesada de humano y un transgen de cadena ligera de humano fusionado a una célula inmortalizada. 18. El anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, producido por un transfectoma comprendiendo ácidos nucleicos codificando de cadena pesada de humano y una región de cadena ligera de humano. 19. El anticuerpo monoclonal o región de unión a antígeno del mismo producidos por la célula hibridoma según la reivindicación 15 o la célula transfectoma según la reivindicación 16. 20. Un animal no humano transgénico que expresa el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el animal no humano transgénico tiene un genoma comprendiendo un transgen de cadena pesada de humano y un transgen de cadena ligera de humano. 21 . Un método para producir un anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo CD 148 de humano definido por la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33, comprendiendo: inmunizar un animal no humano transgénico teniendo un genoma comprendiendo un transgen de cadena pesada de humano y un transgen de cadena ligera de humano con un epítopo CD148 de humano definido por la secuencia de aminoácidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33, o una célula expresando tal epítopo CD148 de humano, de manera que los anticuerpos se producen por células B del animal; aislar las células B del animal; y fusionar las células B con células mieloma para formar células hibridomas inmortales que secretan el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo. 22. Una composición farmacéutica comprendiendo el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o 1 7 a 1 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable en humanos. 23. La composición según la reivindicación 22, en donde el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo está presente en una cantidad terapéuticamente efectiva . 24. La composición según la reivindicación 22 o 23, en donde el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo está presente en una concentración de al menos aproximadamente 1 0 //g/ml. 25. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en donde el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo IgG o un una región de unión a antígeno del mismo. 26. El anticuerpo o región de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o 1 7 a 1 9 para usarse en terapia. 27. El anticuerpo o región de unión a antígeno según la reivindicación 26 para el uso especificado en la presente, en donde el anticuerpo o región de unión a antígeno es para usarse para inhibir angiogénesis. 28. Uso del anticuerpo o región de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o 17 a 19 para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir angiogénesís. 29. El anticuerpo o región de unión a antígeno según la reivindicación 26 o 27 para el uso especificado en la presente, o el uso según la reivindicación 28, en donde el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo IgG o una región de unión a antígeno del mismo. 30. El anticuerpo o región de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 26, 27 o 29 para el uso especificado en la presente, o el uso según la reivindicación 28 o 29, en donde el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo comprende un scFv, Fv, Fab', Fab, diacuerpo, anticuerpo lineal o fragmento de unión a antígeno F(ab')2. 31 . Un polípéptido aislado consistiendo de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33 o cualquier fragmento de las mismas que se une a un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o 17 a 19. 32. Un polipéptido aislado consistiendo esencialmente de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33 o cualquier fragmento de las mismas que se une a un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o 17 a 19. 33. Un polipéptido aislado comprendiendo la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33, o cualquier fragmento de las mismas que se une a un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o 17 a 19, en donde el polipéptido no incluye aminoácidos derivados de CD148 diferente a aquellas seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33. 34. Un inmunoensayo comprendiendo las etapas de: (a) contactar una muestra prueba con un anticuerpo monoclonal o región de unión a antígeno del mismo capaz de inhibirse competitivamente en su unión a CD148 de humano por un anticuerpo monoclonal o región de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un epítopo CD148 de humano definido por una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33; y (b) determinar la presencia de CD148 de humano en la muestra prueba. 35. El inmunoensayo según la reivindicación 34, en donde el anticuerpo o región de unión a antígeno del mismo activa inhibición inducida por CD148 de angiogénesis. 36. Un método para identificar un compuesto que se une específicamente a un epítopo CD148 de humano definido por una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324- 329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33, comprendiendo: contactar un compuesto prueba con un epítopo CD 148 de humano definido por una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO: 33 por un tiempo suficiente para formar un complejo y detectar la formación de un complejo al detectar el epítopo CD148 o el compuesto en el complejo, de manera que si un complejo se detecta, un compuesto que se une al epítopo CD 148 se identifica. 37. Un método para identificar un compuesto que se une específicamente a un epítopo CD148 de humano definido por una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 -335, 324-338, 324- 329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33, comprendiendo: proporcionar coordenadas atómicas definiendo una estructura tridimensional de un epítopo CD 148 definido por una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas del grupo consistiendo de aminoácidos 315-329, 318-332, 321 - 335, 324-338, 324-329, 324-332, 324-335, 447-725, 533-725, 715-973, 200-536, 533-725 y 200-725 de SEQ ID NO:33, y designar o seleccionar compuestos capaces de unir el epítopo CD148 a base de dichas coordenadas atómicas.