JPH09500794A

JPH09500794A - 密度増強タンパク質チロシンホスファターゼ

Info

Publication number: JPH09500794A
Application number: JP7528507A
Authority: JP
Inventors: トンクス，ニコラス，ケー．; エストマン，アーニー
Original assignee: コールドスプリングハーバーラボラトリー
Priority date: 1994-05-03
Filing date: 1995-05-03
Publication date: 1997-01-28
Also published as: US6552169B1; US7195762B2; US20030148491A1; JP2007312793A; EP1331265A2; DK0708831T4; ATE236983T1; EP0708831A1; EP1331265A3; EP0708831B2; DE69530261T3; WO1995030008A1; US20070190581A1; DK0708831T3; DE69530261T2; DE69530261D1; EP0708831B1; US6114140A

Abstract

(57)【要約】新規III型密度増強タンパク質チロシンホスファターゼが開示され、ヒトDEP-1酵素により例証される。huDEP-1をコードするポリヌクレオチドが、その組換え技術による製造のための方法及び材料とともに開示される。DEP-1の生物学的活性をモジュレートするために有用な、DEP-1に対して特異的な結合分子も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】密度増強タンパク質チロシンホスファターゼ発明の分野本発明は一般には、精製され単離されたタンパク質チロシンホスファターゼ酵素（PTP）及び該酵素をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のPTPは、隣接する細胞との細胞接触増大の相関結果（function）として、総細胞活性の増大へと導く、アップレギュレートされたmRNAの転写及び／もしくは翻訳、または転写後の修飾によって、その特徴が示される。このような密度増強PTPは、DEPTP と称される。例証となるヒトIII型受容体様密度増強タンパク質チロシンホスファターゼを、huDEP-1と命名している。発明の背景タンパク質チロシンリン酸化は、シグナルトランスダクション経路における必須要素であり、この経路が成長及び分化、細胞周期の進行、及び細胞骨格の機能を包含する基本的な細胞のプロセスを制御する。端的には、成長因子、または他のリガンドの、同種の受容体タンパク質チロシンキナーゼ（PTK）への結合により、受容体自身のチロシン残基の自己リン酸化及び酵素の標的基質におけるチロシン残基のリン酸化が惹起こされる。細胞内では、チロシンリン酸化は可逆的なプロセスである。すなわち、標的基質内の特定のチロシン残基のリン酸化状態は、リン酸化を触媒するPTK、及び脱リン酸化を触媒するタンパク質チロシンホスファターゼ（PTP）の双方の協調作用によって支配される。 PTPは真核生物において遍在的に見出される酵素の、大きく、且つ多様性のあるファミリーである［Charbonneau及びTonks、Ann.Rev.Cell Biol．8巻、463〜4 93頁(1993)］。PTPファミリー内での構造上の多様性は、主として１以上の高度に保存された触媒ドメインに連結した非触媒（潜在的には調節性の）配列における多様性より生じる。通常、可溶性の細胞質PTPフォームは非受容体PTPと呼ばれ、細胞膜を貫通する少なくとも１つの非触媒領域を持つものは、受容体様PTP（R PTP）と称される。非触媒配列の隣に位置する単一の触媒ドメインを特徴的に保有する種々の非受容体PTPが、同定されてきている。このような非触媒配列は、とりわけ、細胞骨格関連タンパク質［Yang及びTonks、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88巻、5949〜595 3頁(1991)］もしくは脂質結合タンパク質［Guら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 89 巻、2980〜2984頁(1992)］に相同性を有する配列、及び／または酵素と特異的な細胞内膜との会合を媒介する配列［Frangioniら、Cell 68巻、545〜560頁(1992) ］を包含することが示されており、PTP活性の調節において亜細胞での局在性が重要な役割を果たしているかもしれないことが示唆されている。 RPTPの非触媒ドメイン配列の分析によって、シグナルトランスダクション機構においてのそれら配列の関与が示唆されている。しかしながら、RPTPの細胞外セグメントへの特異的リガンドの結合は、わずかばかりの例においてしか明らかにされていない。例えば、PTPμ［Brady-Kalneyら、Ｊ.Cell.Biol. 122巻、961〜9 72頁(1993)］の分子間で同好性結合が証明されている。すなわち、細胞表面上で発現されるPTPμに対するリガンドは、近接する細胞の表面上の別のPTPμ分子である。その他には、RPTPの大半に特異的に結合し、活性をモジュレートするリガンドはほとんど知られていない。多くの受容体様PTPは、２つの触媒ドメインすなわち、１つの膜貫通ドメイン及び細胞外アミノ末端セグメントを持つ、細胞内カルボキシルセグメントを含む［Kruegerら、EMBO J. 9巻、3241〜3252頁(1990)］。RPTPのサブクラスは、細胞外ドメインの「型」の範疇に基づいて互いに区別される［Fisherら、Science 25 3巻、401〜406頁(1991)］。I型RPTPは、複数のグリコシル化部位及び保存されたシステインに富んだ領域を持つ、大きな細胞外ドメインを有する。CD45は、典型的なI型RPTPである。II型RPTPは、タンデム構造を取る複数のフィブロネクチンI II型（FNIII）様反復配列に近接して、少なくとも１つのアミノ末端イムノグロブリン（Ig）様ドメインを含む。タンパク質−タンパク質相互作用に関与すると考えられている、類似の反復したFNIIIドメインが、IL2、IL4、IL6、GM-CSF、プロラクチン、エリスロポイエチン及び成長ホルモンに対する受容体において同定されている［Patthy、Cell 61巻、13〜14頁(1992)］。LARとして知られている白血球の共通抗原関連PTPが、II型RPTP構造の例として挙げられ［Streuliら、J.Ex p.Med. 168巻、1523〜1530頁(1988)］、他のII型RPTPと同様に、細胞接着分子の NCAMクラス［Edelman及びCrossin、Ann.Rev.Bjochem. 60巻、155〜190頁(1991) ］を連想させる細胞外領域を含む。HPTPβ［Krugerら、EMBO J. 9巻、3241〜325 2頁(1990)］などのIII型RPTPは、細胞外ドメインに、タンデム構造を取る複数の FNIII反復配列のみを含む。例えばRPTPα［Krugerら、(1990)、前出］のようなI V型RPTPは、システイン残基を欠くが複数のグリコシル化部位を含む、比較的短い細胞外配列を有する。PTPγ［Barnesら、Mol.Cell.Biol. 13巻、1497〜1506頁 (1993)］及びPTPζ［Kruger及びSaito、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89巻、7417〜 7421頁(1992)］によりその例が示されるRPTPの第５番目の型は、炭酸デヒドラターゼ（CAH）に相同であるが二酸化炭素の可逆的水和に必要な必須のヒスチジン残基を欠く、280アミノ酸のセグメントを含む細胞外ドメインによりその特徴が示される。 II型及びIII型RPTPの細胞外ドメインに特徴的に見出されるFNIII配列は、Ig様ドメインについて観察されるものに類似した折りたたみパターンを持つおよそ90 のアミノ酸残基を含む［Bork及びDoolittle、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89巻、8 990〜8994頁(1992)］。50を越える、真核生物及び原核生物の相異なるタンパク質において、高く保存されたFNIII配列が同定されている［Bork及びDoolittle、 Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89巻、8990〜8994頁(1992)］が、これらのドメインについて概括された機能は確立されていない。フィブロネクチンそれ自体が15から 17のFNIIIドメイン配列を保有しており、第２のFNIIIドメイン（FNIII₂）はヘパリン硫酸プロテオグリカンに対する結合部位を含むこと［Schwarzbauer、Curr.O pin.Cell Biol. 3巻、786〜791頁(1991)］ならびにFNIII₁₃及びFNIII₁₄はイオン性相互作用を介したヘパリン結合に対応するものであること［Schwarzbauer、Cu rr.Opin.Cell Biol. 3巻、786〜791頁(1991)］が立証されている。おそらくは、フィブロネクチンのFNIIIドメインに対する、最も良くその特徴が明らかにされた相互作用には、細胞接着に対する主要部位であるFNIII₁₀が関与する［Edelman 及びCrossin、Ann.Rev.Biochem 60巻、155〜190頁(1991)；Leahyら、Science 25 8巻、987〜991頁(1992)；Mainら、Cell 71巻、671〜678頁(1992)］。FNIII₁₀は、タンパク質のインテグリンスーパーファミリーの特定のメンバーへの結合を介して細胞接着の促進に関与する、アミノ酸配列Arg-Gly-Asp（RGD）を含む。可溶性PTP及びRPTPの双方が共有する特徴には、ホスフォチロシン残基に対する絶対的な特異性、基質タンパク質に対する高い親和性、及びin vitroでのPTK の比活性の強さの１から３桁を越える強い比活性が包含される［Fisherら、Scie nce 253巻、401〜406頁(1991)；Tonks、Curr.Opin.Cell.Biol. 2巻、1114〜1124 頁(1990)］。この最後に記載した特徴により、in vivoでのPTKの作用に対してPT P活性が拮抗的な影響を及ぼしており、かくしてPTPとPTKと間のバランスで、細胞内チロシンリン酸化レベルが決定されるかもしれないことが示唆される。PTP 活性についての支配的な生理学上の役割は、PTP活性の強い阻害剤であるバナジン酸塩でNRK-1細胞を処理した結果、ホスフォチロシンのレベルの増大と、形質転換した細胞の形態の発生が惹起こされるという観察によって支持される［Klar lund、Cell 41巻、707〜717頁(1985)］。この観察によって、PTK活性（ひいては細胞のホスフォチロシンレベル）の間接的な修飾剤としての、PTP及び、PTP活性をモジュレートする薬剤が潜在的に有する治療学上の価値が暗示される。近年の研究で、PTP活性の生理学的重要性の局面が脚光を浴びている。例えば、非受容体造血細胞タンパク質チロシンホスファターゼであるHCPをコードする遺伝子における変異によって、マウスでmotheaten表現型を特徴とする重篤な免疫不全が惹起こされることが示されている［Schulz、Cell 73巻、1445〜1454頁( 1993)］。正常の条件下で、HCPはPTKで誘導されるシグナル伝達経路の抑制剤として作用するかもしれない［Schulz、Cell 73巻、1445〜1454頁(1993)］。いくつかのPTP酵素は、腫瘍抑制遺伝子の産物であるかもしれず、そしてそれらの変異または欠損が、ある新成物形成に関連する、細胞性ホスフォチロシンの上昇に寄与するかもしれない［Brown-Shimerら、Cancer Res. 52巻、478〜482頁(1992)；Waryら、Cancer Res. 53巻、1498〜1502頁(1993)］。ネズミL細胞のRPTPγに対する遺伝子で観察される変異は、この仮説に矛盾しないものである［Waryら、Cancer Res. 53巻、1498〜1502頁(1993)］。正常なT細胞受容体で誘導されるシグナル伝達にとって、受容体様PTP CD45が必要とされるという観察［Pingel及びThomas、Cell 58巻、1055〜1065頁(1989)］によって、細胞性のシグナル伝達応答の正のメディエータとしてのPTP活性を暗示する証拠が提供される。培養状態にある正常細胞は、成長の接触阻害を呈する。すなわち、周密な(con fluent)単層において隣合う細胞が互いに接するにつれ、それらの成長が阻害されるのである［Stoker及びRubin、Nature 215巻、171〜172頁(1967)］。PTKは細胞の成長を促進するので、PTPの作用は成長阻害の機構の基礎となるものかもしれない。Swissマウス3T3細胞において、高密度での培養より採取した周密細胞では、膜画分に会合しているホスファターゼ活性は、低密度または中程度の密度での培養より採取した細胞に比して8倍増大している［Pallen及びTong、Proc.Natl ．Acad.Sci.(USA)88巻、6996〜7000頁(1991)］。このような活性の増大は、血清を除いて休止状態とした亜周密の細胞培養では観察されなかった。増強されたホスファターゼ活性は、ゲル濾過により確認したところでは37 kDのタンパク質に帰属していたが、それ以上にその特徴は明らかにされなかった。同様に、PTPは細胞成長の密度による阻止に直接的に結びついている。すなわち、バナジウム酸塩でNRK-1細胞を処理すると、密度依存性の成長阻害を克服し、形質転換細胞または不死化細胞において独自の特徴である足場非依存性の増殖を促進することができた［Klarland、Cell 41巻、707〜717頁(1985)；Rijksenら、J. Cell Physio l. 154巻、343〜401頁(1993)］。これらの観察とは対照的に、国際出願公開第WO 94/03610号において、PTP35と称された膜貫通型PTPは、活発に成長している細胞で定常状態のmRNAレベルが最高値に達することが観察されたことが開示されている。周密細胞ではPTP35のmRN A発現は殆どもしくは全く検出されなかった。かかる調節の態様は、マウスの3T3 細胞においても観察された。このように、同じ細胞型の２つのRPTPが、見かけ上相反するプロセスに関与する。すなわち、１つ（PTP35）は細胞の成長に寄与しており、他方（Pallen及びTongsの35 kDのPTP）は細胞の休止に寄与している。興味深いことに、II型RPTP LARのメッセンジャーRNAの転写は、周密な線維芽細胞培養でアップレギュレーションを受けることが立証されている［Longo、J.B iol. Chem. 268巻、26503〜26511頁(1993)］。LARは、タンパク質分解によるプロセシングを受けて、非共有結合で会合する２つのサブユニットの複合体である成熟タンパク質として産生され、このサブユニットの１つは、細胞接着分子様細胞外ドメインの大半を含むものであり［Yuら、Oncogene 7巻、1051〜1057頁(199 2)；Streuliら、EMBO J. 11巻、897〜907頁(1992)］、細胞が周密状態に近づくにつれて放出される(shed)［Streuliら、EMBO J. 11巻、897〜907頁(1992)］。これらの観察から、細胞骨格の全体性の調整のみならず、形質転換、腫瘍の侵入、転移、細胞接着、ならびに炎症時の内皮細胞層に沿った白血球細胞の動きや内皮細胞での変化(passage)などといった、他の関連する細胞での現象におけるPTP の関与が推察されることとなる。これらの細胞における事象のいずれかまたは全てを調節することができるPTP活性のモジュレーターに対して治療的側面で暗示されることは莫大である。かくのごとく、当該技術分野において、酵素のPTPファミリーのメンバーを同定することならびにこれらタンパク質をそのアミノ酸配列及びそれらをコードするDNA配列として特徴付けることが必要とされている。このような情報によって、これらタンパク質の大容量での生産がもたらされ、天然にこれらホスファターゼを発現している細胞の同定が可能となり、そしてこれらホスファターゼとの特異的な反応性を有する抗体の製造ができるようになるであろう。さらには、これらPTPの基質、調節機構、及び亜細胞における局在性を解明することで、正常細胞の成長に関する理解に貢献し、異常及び／または悪性細胞の成長に干渉する上で有用な治療剤の開発に欠かすことのできない情報が提供されるであろう。発明の要約タンパク質チロシンホスファターゼに関して本明細書中で用いられる「密度増強(density enhanced)」とは、近隣の細胞との接触増大の相関結果として、アップレギュレーションを受けた細胞性mRNAの転写または翻訳及び／もしくは総細胞活性を示すものである。本発明の１つの特徴において、III型密度増強ホスファターゼに固有な結合及び／または免疫学的特性を備えるその断片（すなわち、断片及び、欠失、付加または置換による類似体）を含んで、ヒトホスファターゼhuDEP-1及びその変異体で例示される酵素活性を有する、III型密度増強タンパク質チロシンホスファターゼをコードする、精製され単離されたポリヌクレオチド（例えば、センス及びアンチセンス鎖の双方を含む、DNA及びRNA転写物）を提供する。現在のところ好ましいDNA分子には、cDNA、ゲノムDNA及び全体的または部分的に化学合成された DNA分子が包含される。本発明で好ましいポリヌクレオチドは、配列番号：２のヒトDEP-1ポリペプチドをコードする、配列番号：１で示されるDNAである。さらに本発明で提供されるのは、III型密度増強ホスファターゼをコードする配列を含む組換えプラスミド及びウイルス性DNA構築体（発現構築体）であって、特にIII型密度増強ホスファターゼをコードする配列がホモまたはヘテロの転写調節エレメント（１以上）に作動可能に連結された構築体である。本発明の他の特徴において、III型密度増強ホスファターゼポリペプチドまたはその変異体を発現する、本発明のDNA配列で形質転換またはトランスフェクトされた原核性または真核性の宿主細胞が提供される。本発明の宿主細胞は、その宿主細胞自体もしくはその宿主細胞が生育している培地のいずれかより単離することができる、III型密度増強ホスファターゼポリペプチドの大容量製造のために、特に有用である。細胞外膜表面上のIII型密度増強ホスファターゼポリペプチドを発現する宿主細胞はまた、抗III型密度増強ホスファターゼ抗体の製造における免疫原としても有用である。本発明によりさらに提供されるのは、精製され単離されたIII型密度増強ホスファターゼポリペプチド、ならびにその断片及び変異体である。好ましいIII型密度増強ホスファターゼポリペプチドは、配列番号：２で示される。新規のIII 型密度増強ホスファターゼポリペプチド及び変異体ポリペプチドは、天然のソースからの単離物として得られるかもしれないが、好ましくは、本発明の宿主細胞が関わる組換え手法によって製造される。III型密度増強ホスファターゼポリペプチドの、完全にグリコシル化されたフォーム、部分的にグリコシル化されたフォーム及び全体にグリコシル化されていないフォームは、組換え製造用に選択される宿主細胞を変えること及び／または単離後のプロセシングによって作製することができる。本発明のIII型密度増強ホスファターゼポリペプチドの変異体は、 (1) III型密度増強ホスファターゼに特異的な１以上の生物学的活性または免疫学的特徴を喪失することなく、そして好ましくはそれらの増強を伴い、または (2) 特定のリガンド／受容体結合またはシグナル伝達機能の特異的な抑止を伴って、アミノ酸のうち１以上が欠失または置換を受けた類似体を包含する、水に可溶性及び不溶性のポリペプチドを含むことができる。本発明によりさらに企図されるのは、本発明のIII型密度増強ホスファターゼに特異的に結合する、ペプチド、ポリペプチド、及び他の非ペプチド分子である。好ましい結合分子には、抗体（例えばモノクローナル及びポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、抗イディオタイプ抗体、CDR-移植抗体など）、対向受容体（例えば、膜会合性フォーム及び可溶性フォーム）ならびに、抗III型密度増強ホスファターゼモノクローナル抗体及び／または特異的な対向受容体の存在下にIII型密度増強ホスファターゼに競合的に結合するリガンドを含めた、他のリガンド（例えば、天然に存在する分子または合成分子）が含まれる。結合分子は、本発明のIII型密度増強ホスファターゼポリペプチドの精製や、このポリペプチドを発現する細胞型の同定に有用である。結合分子はまた、III型密度増強ホスファターゼのin vivoでの結合及び／またはシグナルトランスダクション活性をモジュレートする（すなわち、阻害、阻止または刺激する）のにも有用である。 III型密度増強ホスファターゼに対して特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も、本発明により企図される。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの製造技術は、当該技術分野においてよく知られるところである。ハイブリドーマ細胞系は、精製した III型密度増強ホスファターゼもしくはその類似体、または細胞外膜表面上にIII 型密度増強ホスファターゼもしくはその変異体を発現する細胞を用いて、動物を免疫感作した後に作製することができる。免疫原の細胞系には、in vivoでIII型密度増強ホスファターゼを発現する細胞、またはin vivoで正常時にこのタンパク質を発現していない、トランスフェクトされたもしくは形質転換された原核性もしくは真核性の宿主細胞が含まれる。ヒトDEP-1のDNA及びアミノ酸配列を開示することにより与えられる情報の価値は明白である。その例の一環として、開示されたヒトDEP-1 cDNAの配列により、転写制御エレメントを含むヒトDEP-1ゲノムDNA配列を単離することが可能となる。本発明により企図される転写制御エレメントには、例えば、プロモーターエレメント、エンハンサーエレメント、のみならず、mRNA転写の抑止、またはダウンレギュレーションに寄与するエレメントも含まれる。このタイプの制御エレメントはタンパク質をコードする構造遺伝子配列に対して5'DNA配列もしくは3'DNA配列、及び／またはイントロン内に位置するDNA配列であるかもしれない。5'及び／または3'の制御エレメントは、構造遺伝子のタンパク質をコードする配列に近接し且つ／または遠位にあるかもしれない。順次、mRNA転写をモジュレートする DNA配列を同定することで、転写のモジュレーションをもたらすことができる試剤の同定が可能となる。他の特徴において、他のIII型密度増強ホスファターゼをコードするポリヌクレオチド、huDEP-1対立変異体及び異種の（例えば、ラットまたはマウス）DNAを同定することも企図される。 huDEP-1ゲノムDNA及び異種のDNAを単離することは、プローブとしてDEP-1 DNAまたはRNA配列の全てまたは一部を用い、適切な厳密さの条件下で適切なライブラリーをスクリーニングする、標準的な核酸ハイブリダイゼーション技術によって成し遂げられよう。もしくは、既知のヌクレオチド配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、他のcDNA及びゲノムDNA配列を増幅及び同定することができる。断片及び他の変異体を含めたIII型密度増強ホスフアターゼポリペプチドをコードする合成DNAは、旧来の方法によって合成できる。本発明のDNA配列情報で、相同的組換えまたは「ノックアウト」戦略［例えば、Capecchi、Science 244巻、1288〜1292頁(1989)を参照されたい］によって、機能を有するIII型密度増強ホスファターゼポリペプチドを発現しない齧歯類または変異型のIII型密度増強ホスファターゼポリペプチドを発現する齧歯類を開発することが可能となる。このような齧歯類は、in vivoでのIII型密度増強ホスファターゼの活性及びそのモジュレーターを研究するためのモデルとして有用である。本発明のDNA及びアミノ酸配列により、対向受容体の結合に活発に関与するIII 型密度増強ホスファターゼの領域や、のみならず、結合に活発に関与するというよりむしろ結合を調節することができる配列を、分析することが可能となる。膜貫通シグナルトランスダクションに関与するモチーフの同定もまた、本発明により企図される。さらに企図されるのは、未成熟及び成熟III型密度増強ホスファターゼタンパク質の亜細胞での局在性を確定するモチーフを同定することである。本発明のDNAは、III型密度増強ホスファターゼポリペプチドを発現する細胞型の検出のためにも有用である。このような細胞型の同定は、治療剤及び予防剤の開発に対して重要な効果(ramification)をもたらすかもしれない。例えばhuDEP-1 DNAを利用して対応するRNAを検出する、標準の核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて、細胞内のIII型密度増強ホスファターゼ転写の構成的レベルばかりか、内在または外来の薬剤に応答した転写レベルの変化を定量できよう。III型密度増強ホスファターゼの転写、翻訳及び／または活性を修飾する薬剤を同定することで、次には、それらに潜在する治療的または予防的価値を評価できる。本発明のDNAは、複雑な細胞集団及び組織内のI II型密度増強ホスファターゼ特異的メッセージの、細胞での局在性を調べるために、例えばhuDEP-1 DNAで細胞RNAへのin situハイブリダイゼーションを行うことを可能とする。本発明のポリヌクレオチドにより、III型密度増強ホスファターゼと相互作用する基質またはその他の分子を同定することができる方法も提供される。相互作用する分子を同定するための現在のところ好ましい方法は、以下の工程を含むものである。すなわち、a)DNA結合ドメイン及び活性化ドメインを保有する転写因子により調節されるプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むDNA構築体で、適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする；b)下記の(d) にて導入される、潜在性を有する相互作用成分及び／または基質をリン酸化するために、タンパク質チロシンキナーゼ（例えば、v-src、c-srcなど）で(a)の宿主細胞を共形質転換またはコトランスフェクトする任意の工程；c)例えばhuDEP- 1イソフォームの一部または全てと、転写因子のDNA結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとの、第１の融合体をコードする第１のハイブリッドDNA配列を、宿主細胞内で発現する；d)DEP-1イソフォーム結合性タンパク質と推定されるタンパク質の一部または全てと、第１の融合体で取り込まれていない転写因子の活性化ドメインまたはDNA結合ドメインのいずれかとの、第２の融合体をコードする第２のハイブリッドDNA配列のライブラリーを宿主細胞内で発現する；e)宿主細胞内でのレポーター遺伝子産物の生産を検出することによって、特定の宿主細胞内における、DEP-1イソフォームへのDEP-1イソフォーム結合性タンパク質の結合を検出する；及び、f)特定の宿主細胞からDEP-1 イソフォーム結合性タンパク質をコードする第２のハイブリッドDNA配列を単離する工程を含む。例えば転写因子ドメインのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、huDEP-1イソフォーム及びhuDEP-1イソフォーム結合性タンパク質として推定されるタンパク質とが該転写因子に融合される、順序を変えるというような、前記方法の変法も、企図される。好ましい方法において、プロモーターは ADHIプロモーターであり、DNA結合ドメインはlexA DNA結合ドメインであり、活性化ドメインはGAL4トランス活性化ドメインであり、レポーター遺伝子はlacZ遺伝子であって、そして宿主細胞は酵母宿主細胞である。当業者であれば、多数の他のレポーター遺伝子や宿主細胞のいずれでも、この技術に容易に導かれることをたやすく想起するであろう。同様に、別のDNA結合及び活性化ドメインを持つ数多くの転写因子のいずれでも、この手法に利用することが可能であり、DNA結合及び活性化ドメインの双方は、同じ転写因子より由来するものでも、また異なるが適合性を有する転写因子より由来するものでも用いることができる。この方法の別の変法として、触媒ドメイン内のシステイン残基をセリン残基に置換した、変異型DEP-1ポリペプチドを、この技術において用いることができる。他のホスファターゼを用いたこのタイプの変異では、基質の認識及び結合は行うが、変異の結果ホスファターゼが不活性となるので、基質の脱リン酸化は行わないことが証明されている。 III型密度増強ホスファターゼイソフォームに結合するタンパク質を検出するために、本発明により企図される前記方法に代わる同定方法は、以下の工程を含む。すなわち、a)III型密度増強ホスファターゼイソフォーム結合性タンパク質と推定されるタンパク質と、特異的な対向受容体と高い親和性をもって結合することができるリガンドとの融合体をコードするハイブリッドDNA配列で、適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする；b)適切な条件下で宿主細胞内のハイブリッドDNA配列を発現する；c)固定化された状態にある特異的な対向受容体に融合タンパク質を曝すことにより、宿主細胞によって発現される融合タンパク質を固定化する；d)III型密度増強ホスファターゼイソフォームを、固定化された融合タンパク質と接触させる；及び、e)III型密度増強ホスファターゼイソフォームに対して特異的な試薬を用いて、融合タンパク質に結合したIII型密度増強ホスファターゼイソフォームを検出する工程を含むものである。この方法を実施する上で現在のところ好ましいリガンド／対向受容体の組合せは、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ／グルタチオン、ヘマグルチニン／ヘマグルチニン特異抗体、ポリヒスチジン／ニッケル及びマルトース結合性タンパク質／アミロースである。 III型密度増強ホスファターゼと特異的に相互作用するタンパク質（すなわち、基質、リガンド、モジュレーター等）を同定するためのさらなる方法もまた、本発明により企図される。一例として、精製され単離されたIII型密度増強ホスファターゼポリペプチド（例えば、huDEP-1ポリペプチド）を、固定化された支持体（すなわち、カラム樹脂、ビーズ等）へ共有結合によりカップリングさせ、細胞溶解物とともにインキュベートして、タンパク質／タンパク質相互作用を許容することができる。その後、固定化されたDEP-1ポリペプチドと相互作用するタンパク質は、当該技術分野において標準的な、濃度勾配洗浄技術で、支持体より溶出させることができる。他の例としては、タンパク質オーバーレイ(overlay)技術を用いることができる。例えばhuDEP-1を発現している細胞か、またはhuDEP-1をモジュレートするかもしくはhuDEP-1に結合することができるポリペプチドを発現している細胞のいずれかより、DNAを単離し、標準法によってライブラリーを構築することができる。次いでこのライブラリーを異種細胞系において発現し、得られたコロニーを固定化支持体に転写することができる。その後、これらのコロニーから発現されたタンパク質をDEP-1と接触させ、適切な条件下にてインキュベートし、DEP-１／タンパク質相互作用を許容する。その結果得られた、形成されたIII型密度増強ホスファターゼ／タンパク質複合体は、特異的なIII型密度増強ホスファターゼ抗体とともにインキュベートすることにより、検出することができる。前記特異抗体と相互作用するコロニーは、III型密度増強ホスファターゼと相互作用するタンパク質をコードするDNAを含むものである。あるいは、この技術において細胞または組織溶解物を用いてもよく、ここで、正常時にDEP-1を発現する細胞もしくは組織、または予めDEP-1をコードするDNAでトランスフェクトもしくは形質転換した細胞が用いられうる。図面の簡単な説明本発明の多くの他の特徴及び利点は、添付の図面を参照しつつ、以下の発明の詳細な説明を考慮することで、明らかになるであろう。図１Aから図１Bは、ノザンブロット分析のオートラジオグラムの写真を示す。図２は、DEP-1の密度依存性の発現を示す。発明の詳細な説明本発明を、III型密度増強ホスファターゼポリペプチドをコードする遺伝子の単離及び特徴付けに関する以下の実施例によって説明する。実施例１は、ヒトDE P-1をコードするcDNAの単離に関する。実施例２において、ノザンブロット分析により調べたhuDEP-1の臓器分布を検討する。実施例３には、DEP-1及びその断片に対して特異的な抗体の作製を述べる。実施例４では、COS細胞におけるhuDEP-1 cDNAクローンの発現を示す。実施例５は、線維芽細胞におけるhuDEP-1の内在性発現の検出に関する。実施例６には、細胞培養密度の相関結果としての、huDEP- 1の発現を述べる。実施例７は、huDEP-1のリガンドの同定に関する。実施例８では、huDEP-1活性のモジュレーター及び基質の同定を検討する。実施例９では、ゲノムhuDEP-1 DNAの特徴付けを詳説する。実施例１ huDEP-1 cDNAの単離及び特徴付け細胞密度依存性の機構により調節される新規ヒトホスファターゼをコードする cDNAを単離するための最初の尽力において、以前に同定された多くのホスファターゼに共通の、保存されたアミノ酸配列に基づき、PCRプライマーを合成した。次いで、これらのプライマーを、cDNAライブラリーからポリヌクレオチドを増幅するのに用い、得られた増幅産物を配列決定し、これら配列を以前に報告された DNA配列と比較した。配列番号：３及び配列番号：４で示される、保存されたPTPアミノ酸配列に対応する縮重プライマーを合成して、HeLa細胞のcDNAライブラリーを用いたPCRの鋳型として、プライムするのに用いた。 KCAQYWP （配列番号：３） HCSAGIG （配列番号：４） PCR反応で用いた対応するプライマーは、それぞれ配列番号：５及び配列番号：６に示す。ここで用いたヌクレオチドの標記は米国特許法施行規則§1.882に従う。 5'-AARTGYGCNCARTAYTGGCC-3' （配列番号：５） 3'-GTRACRTCRCGNCCITADCC-5' （配列番号：６） 77の別個のサブクローンを配列決定し、７の異なる配列が明らかになり、そのうちの６つがそれ以前にDNA配列が公表されていたPTPに対応するものであって、それらには、PTPIB［Tonksら、J.Biol.Chem. 263巻、6722〜6730頁(1988)］、TCPT P［Coolら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)86巻、5257〜5261頁(1989)］、RPTPα［K ruegerら、EMBO J. 9巻、3241〜3252頁(1990)］、LAR［Streuliら、J.Exp.Med. 168巻、1523〜1530頁(1988)］、PTPH1［Yang及びTonks、Proc.Natl.Acad.Sci.(U SA)88巻、5949〜5953頁(1991)］、及びPTPμ［Gebbinkら、FEBS Lett．290巻、1 23〜130頁(1991)］が含まれていた。第７のクローンは、独特な300 bpのPCR断片を含んでなることが判明し、このクローンに対応する全長のcDNAを単離する試みで、オリゴ-dTでプライムしたHeLa細胞のcDNAライブラリー（Stratagene,，La J olla、カリホルニア州）をスクリーニングするのに用いた。以前に報告したとおり［Yang及びTonks、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88巻、5949〜5953頁(1991)］、およそ1.8×10⁶のファージプラークをスクリーニングし、24の陽性プラークを同定した。5.1 kbの最大インサートをpUC119にクローニングし、ジデオキシチェーンターミネーター法により配列決定して、1337アミノ酸の新規受容体様PTPをコードする、401 1ヌクレオチドの読取り枠を含むことが見出された。この5.1 kbのインサートのD NA配列を配列番号：１で示し、その予測されるアミノ酸配列を配列番号：２で示す。この、ヒト密度増強(human density-enhanced)PTPを、huDEP-1と命名した。 huDEP-1遺伝子の、想定された開始ATGコドンは、-3位でプリン（G）に隣接しており、従って、開始についてのコザック則［Kozak、J.Cell Biol. 108巻、229 〜241頁(1989)］に符合するものである。予測された開始部位のおよそ290 bp上流に、枠内停止コドンがあり、開始のATGの次に、シグナル配列として働くかもしれない疎水性領域が続く。シグナルペプチダーゼについての既知の切断部位の統計的分析［von Heijne、Nuc.Acids Res. 14巻、4683〜4690頁(1986)］に基づくと、成熟huDEP-1ポリペプチドのアミノ末端はGly³⁷に特定される。第２の疎水性領域は、第977位から第996位のアミノ酸の間に見出され、その次に停止トランスファー配列に特徴的な、顕著に塩基性である残基の連なりが続く。従って、成熟huDEP-１タンパク質について、940アミノ酸の細胞外領域及び341アミノ酸の細胞内部分が予測される。細胞外ドメインは８つのFNIIIドメインを含み、そして3 3のN-結合グリコシル化の可能性を有する部位が予測される。このように、huDEP -1はFisherら（前出）の体系に従ったIII型RPTPのトポグラフィーに一致する。触媒ドメインのタンデム構造の反復配列を有するほとんどのRPTPとは異なり、細胞質領域には第1060位から第1296位のアミノ酸残基にわたる単一の触媒ドメインが含まれる。従って、ヒトDEP-1は、単一の触媒ドメインを有するRPTPの拡大群( expanding group)の典型であり、この群には、PTPβ［Kruegerら、EMBO J. 9巻、3241〜3252頁(1990)］、ドロソフィアのDPTP10D［Tianら、Cell 76巻、675〜685頁(1991)；Yangら、Cell 67巻、661 〜673頁（1991月、ドロソフィアのDPTP4E［Oonら、J.Biol.Chem. 268巻、23964 〜23971頁(1993)］、及び最近報告されたSAP-1酵素［Matozakiら、J.Biol.Chem. 269巻、2075〜2081頁(1994)］が含まれる。他のPTPドメインとhuDEP-1の触媒ドメインのアミノ酸配列の比較によって、huDEP-1はPTPβ及びSAP-1と最も密接に関連することが明らかになった。この配列は、いくつかのSer-Proモチーフのみならず、カゼインキナーゼIIによるリン酸化が可能な部位をも包含するものである。実施例２ huDEP-1組織分布のノザン分析 PTPの発現は真核生物において遍在的であることがこれまでに立証されているので、huDEP-1のmRNA発現の相対的な程度を調べるために種々のヒト組織を分析した。 Megaprime DNAラベリングキット（Amersham、Arlington Heights、イリノイ州）を用いて予め1.5×10⁶ cpm/ngの比活性に放射性ラベルしたhuDEP-1 cDNAの1.6 kbのHindIII/EcoRI断片を、種々のヒト組織由来の固定化されたRNAを含むRNAMu lti Tissue Nothern ブロットフィルター（Clontech、Palo Alto、カリホルニア州）に対してプローブとして用いた。このプローブは単離されたhuDEP-1 cDNAの全長に相当するものであった。0.5 M Na₂HPO₄、7％ SDS、１ mM EDTA、及びラベルしたプローブを10⁶ cpm/mlの濃度で含有するハイブリダイゼーション用緩衝液中で65℃にて16時間、ハイブリダイゼーションを実施した。次いで、40 mM Na₂H PO₄、1％ SDS、及び１ mM EDTA中で65℃にて5分間、フィルターを洗浄した。次いで膜をオートラジオグラフィーに供した。その結果を図１A及び１Bに示すが、図中、固定化されたRNAのヒト組織のソースは以下の通りである。図１Aにおいて、レーン２のRNAは心臓由来、レーン３は脳由来、レーン４は胎盤由来、レーン５は肺由来、レーン６は肝臓由来、レーン７は骨格筋由来、レーン８は腎臓由来、そしてレーン９は膵臓由来である。図１Bにおいて、レーン２のRNAは脾臓由来、レーン３は胸腺由来、レーン４は前立腺由来、レーン５は精巣由来、レーン６は卵巣由来、レーン７は小腸由来、レーン８は結腸由来、そしてレーン９は末梢血白血球由来である。ノザン分析により、分析した殆どの組織でhuDEP-１が発現しており、特に胎盤、腎臓、脾臓及び末梢血白血球において高いmRNAレベルが検出されることが示された。実施例３ huDEP-1ポリクローナル抗体の作製 huDEP-1に独特であり、配列番号：２の第1297位から第1315位までのアミノ酸残基及び第1321位から第1334位までのアミノ酸残基（触媒領域から下流）に対応する２つのペプチドを、追加のアミノ末端システイン残基を加えて合成し、m-マレイミド安息香酸 N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（MBS）（Pierce、Roc kford、イリノイ州）を用いてウサギ血清アルブミン（RSA）と接合させた。これらのペプチドを用いた免疫感作のプロトコルは、Cocalico Biologicals（Reamst own、ペンシルベニア州）によって行った。まず、免疫感作に先立って、ウサギの予備採血を行った。第１回目の免疫感作には、フロインド完全アジュバントと 500μgの接合したペプチドまたは100μgの精製したペプチドを用いた。その後の免疫感作は全て、前回の注射から４週間後に行い、同量のタンパク質を含むフロインド不完全アジュバントを用いた。免疫感作後7〜10日で採血をした。抗体のアフィニティー精製のために、MBSを用いてRSAに接合したhuDEP-1ペプチドを、CNBrで活性化したセファロース（Pharmacia、Uppsala、スウェーデン）にカップリングさせた。10 mMトリス塩酸、pH 7.5で抗血清を10倍に希釈し、アフィニティーマトリックスとともに一晩インキュベートした。洗浄後、100 mMグリシン、pH 2.5で、結合した抗体を樹脂から溶出した。第1297位から第1315位の、接合したアミノ酸残基に対して作製された抗体を抗 -CSH-241と命名し、第1321位から第1334位のアミノ酸残基に対応する接合したペプチドに対して作った抗体を抗-CSH-243と命名した。実施例４トランスフェクトした宿主細胞によるhuDEP-1の発現 huDEP-1 cDNAのタンパク質産物を調べるために、5.1 kbEcoRIインサートを、発現ベクターpMT2へとクローニングし［Sambrookら、Molecular Cloning: A Lab oratory Manual 、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)16.17〜16.22頁］、10％ FCSを補ったDMEM中で生育したCOS細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションは、リン酸カルシウム法［Sambrookら(1989)、前出、16.32〜1 6.40頁］を用いて行い、トランスフェクトしたCOS細胞及びトランスフェクトしなかったCOS細胞の双方から、トランスフェクション後48時間目に、細胞溶解物を調製した。溶解物は、下記の通りに、抗-CHS-243抗体を用いたイムノブロッティングによる分析、及び免疫複合体のPTPアッセイに供した。イムノブロッティング実験において、細胞溶解物の調製及び電気泳動を実施した。タンパク質濃度は、BioRadタンパク質アッセイ溶液を用いて定量した。ニトロセルロースに対して、セミドライの電気泳動転写を行った後、5％ドライミルクを含む500 mM NaCl 20 mM トリス、pH 7.5、0.05％ Tween-20 （TTBS）の中で、膜をブロッキングした。TTBS中で洗浄し、２次抗体（Amersham ）とインキュベートした後、エンハンス化学発光（ECL）プロトコル（Amersham ）を製造業者の記載に従って行って、検出を可能ならしめた。免疫複合体PTPアッセイのために、25μlのProtein-A Sepharose（Pharmacia）に結合した、20μlの抗-CSH-243抗血清または免疫前のウサギ血清を用いて、60 μgの細胞溶解物を免疫沈降した。4℃にて一晩インキュベートした後、洗浄用緩衝液（1％ Triton X-100、150 mM NaCl、20 mM Hepes、pH 7.5、5μg/ml アプロチニン、5μg/ml ロイペプチン、1 mM ベンズアミジン、及び1 mM DTT）中で３度、そしてアッセイ用緩衝液（25 mM イミダゾール、pH 7.2、0.5 mg/ml BSA、及び1 mMDTT）中で１度、免疫複合体を洗浄した。次いで、Protein-A Sepharose 免疫複合体は、150μlのアッセイ用緩衝液中に再懸濁し、３重試験にてPTP活性をアッセイした。基質として3 μMの［³²P-Tyr］-還元型カルボキシメチル化（R CM）ライソゾームを用い、総容量60μl中で30℃にて6分間アッセイを行った［Fl intら、EMBO J. 12巻、1937〜1946頁(1993)］。トランスフェクトされた細胞からの溶解物において、アフィニティー精製した抗-CSH-243抗体で180 kDの分子量のタンパク質が特異的に検出された。さらに、免疫複合体をPTP活性について分析すると、トランスフェクトしなかった細胞に比してトランスフェクトした細胞からの抗-CSH-243複合体において、ほぼ10倍の高さの活性が検出された。このPTP活性は、ブロックした抗血清または免疫前の血清を用いた免疫沈降物由来の免疫複合体ではほとんど認められなかった。huDEP-1 cDNAは、本来の（intrinsic）PTP活性を有する180 kD のタンパク質をコードすることが結論付けられた。実施例５ huDEP-1の内在性発現内在性に発現されるhuDEP-1の特徴を明らかにするために、実施例４に記載のごとく、抗-CSH-243抗体を用いたイムノブロッティングにより、CEM（ATCC CCL 119）、HeLa（ATCC CCL 2）、293（ATCC CRL 1573）、Jurkat（ATCC TIB 152）、K562（ATCC CCL243）、HL60（ATCC CCL 240）、WI38（ATCC CCL 75）及びAG 1 518（Coriell Cell Repositories、Camden、ニュージャージー州）を含む、異なる細胞系からの溶解物を分析した。寿命が限られている２倍体の胎児肺線維芽様細胞系であるWI38細胞が、最も高い発現量を示した。AG 1518包皮線維芽細胞においても、同様の発現レベルが検出された。 huDEP-1の発現をさらに精査するために、免疫沈降及びSDS-ゲル電気泳動によって、代謝的にラベルした細胞からの溶解物を分析した。WI38及びAG 158細胞からの周密な培養物を、1 mg/ml ウシ血清アルブミン（BSA）及び0.15 mCi/ml Tra nslabel（ICN、Costa Mesa、カリホルニア州）を補ったメチオニン不含のDMEM中で、4時間、代謝的にラベルした。細胞は0.5％ DOC、0.5％ Triton X-100、150 mM NaCl、20 mM Hepes、pH 7.5、5μg/ml アプロチニン、5μg/ml ロイペプチン、1 mMベンズアミジン、1 mM DTT（溶解用緩衝液）中で溶解し、その溶解物を15 ,000 × gにて15分間遠心した。次いで、およそ2 × 10⁶個の細胞に相当する溶解物を、20μlの抗-CSH-243または抗-CSH-243とともにインキュベートした。4℃にて4時間インキュベートした後、50μlの１：１ Protein-A-Sepharoseスラリーを添加してタンパク質／抗体複合体を結合させ、60分間インキュベーションを続けた。Protein-A-Sepharoseに吸着した免疫複合体を遠心によって集め、1％ Triton X-100、150 mM NaCl、20 mM Hepes、pH 7.5、5μg/ml アプロチニン、5μg/ml ロイペプチン、1 mM ベンズアミジン、1 mM DTT（洗浄用緩衝液）中で３度、そして20 mMトリス、pH 7.5 中で１度洗浄した。還元SDS-試料用緩衝液中で95℃にて3分間インキュベートすることにより、樹脂から試料を溶出させ、7％ゲルでのSDS-ゲル電気泳動とそれに続くフルオログラフィーにより分析した。 WI38及びAG 1518細胞の双方において、ブロックしていない抗血清により180 k Dのタンパク質が特異的に認識された。WI38細胞溶解物を用いた抗-CSH-243抗血清沈降物でもまた、予め200μg/mlのペプチド接合体とインキュベートしておいた免疫前の血清または抗血清を用いた沈降物よりも有意に高い（およそ10〜20倍高い）活性量が得られた。［³²P］-無機リン酸塩で代謝的にラベルしておいたWI38細胞の細胞溶解物からの、［³²P］でラベルされた180 kDタンパク質を、抗-CSH-243抗体が免疫沈降させることができるという事実のゆえに、huDEP-1はin vivoにおいてホスフォタンパク質であると考えられる。実施例６ huDEP-1の細胞密度依存性の発現及び活性散在（sparse）（7,000 細胞／cm²未満）培養または集密（dense）（25,000 細胞／cm²を越える）培養に由来するWI38細胞溶解物を、実施例４に記載のごとく抗-CSH-243抗体を用いたイムノブロッティングにより、発現されたhuDEP-1タンパク質のレベルについて比較した。図２に示すように、劇的な、10から20倍ものhuDEP-1発現の増大が、集密培養で検出された。より周密な培養に由来する総細胞溶解物3 μgで比較的強いシグナルが与えられ、散在培養に由来する溶解物15 μgでは検出限界を下回っていたので、集密培養に由来する細胞で少なくとも10倍高い量のhuDEP-1が存在すると見積もられた。抗-CSH-241を用いても同様の結果が得られた。散在細胞と集密細胞からの細胞溶解物中のPTP1Bの量を抗-PTP1Bモノクローナル抗体FG6（On cogene Science、Uniondale、ニューヨーク）を用いて比較すると、差異は観察されなかった。AG 1518細胞でも同様の結果が得られたので、huDEP-1発現に対して観察された効果は、WI38細胞に限定されるものではない。酵素活性もまた密度依存性の機構によって調節されるのか否かを調べるために、huDEP-1及びPTP1B免疫複合体ならびに散在及び集密の双方のWI38及びAG 1518 細胞培養由来の総細胞溶解物の、PTPアッセイを用いたホスファターゼ活性についての分析も行った。免疫複合体のPTPアッセイには、25μlのProtein-A-Sephar oseに結合させた、20μlの抗-CSH-243抗血清（抗原による前処置をしたものとしなかったもの）または免疫前の血清を用いて、60μgの細胞溶解物の免疫沈降を行った。4℃にて一晩インキュベートした後、免疫複合体は洗浄用緩衝液中で３度洗浄し、25 mM イミダゾール、pH 7.2、0.5 mg/ml BSA、1 mMDTT（アッセイ用緩衝液）中で１度洗浄した。次いで、Protein-A-Sepharose免疫複合体は、150μ lのアッセイ用緩衝液に懸濁し、３重試験でPTP活性についてアッセイした。アッセイは基質として3 μMの［³²P-Tyr］RCMライソゾームを用い、総容量60μlで、 30℃にて6分間実施した［Flintら、前出］。イムノブロッティング実験で実証されたhuDEP-1タンパク質発現の増大に一致して、huDEP-1酵素活性もまた集密細胞培養において増大していた。集密培養由来のhuDEP-1/CSH-243免疫沈降物において観察された活性の増大（およそ2〜3倍）は、集密培養において観察されるタンパク質発現の増大ほどには大きくなく、これは概ね、抗-CSH-243抗血清を用いた全PTPの沈降が不完全であったことによるのであろうと考えられる。PTP1B/FG6免疫沈降物または散在細胞及び集密細胞培養由来の総細胞溶解物の活性においては、差異は観察されなかった。最後に、huDEP-1発現の密度依存性アップレギュレーションの動力学を探るために、中等度の細胞密度にあるWI38細胞及びAG 1518細胞の溶解物を、イムノブロッティング分析に加えた。飽和密度にある細胞において最も高い発現が認められたが、散在細胞培養に対して中等度の細胞密度でも発現の増大が観察された。このように、huDEP-1発現のアップレギュレーションは飽和密度に至るに先んじて開始されており、生育阻止の結果ではないであろうと考えられる。 huDEP-1発現が誘導される機構は未だ不明のままであるが、２つの別個の細胞系において、細胞が周密状態に近づくにつれて発現が誘導されるという実証がなされたことにより、huDEP-1が、生育を促進するPTK活性の効果とは反対に、タンパク質の正味の(net)脱リン酸化の促進に関与することが示唆される。huDEP-1発現の広範な分布と合わせて、前記の可能性により、huDEP-1が細胞生育の接触阻害についての一般的な機構に関与するかもしれないことが示唆される。実施例７ DEP-1リガンドの同定接着分子としてDEP-1が機能するという可能性は、Sf9細胞システム［Brady-Ka lnayら、J.Cell Biol. 122巻、961〜972頁(1993)］を用い、続いてDEP-1 cDNAでトランスフェクトして、調べられよう。一過性発現による研究に加えて、DEP-1 を過剰発現する安定な細胞系を作製できよう。 DEP-1が接着分子として機能するのであれば、細胞外対向受容体が同定されよう。１つの可能性としては、PTPμのようにDEP-1結合は同好性であり、１つのDE P-1分子が近接する細胞上の他のDEP-1分子に結合するものである。さもなくば、 DEP-1は異好性結合機構において、非DEP-1分子を特異的に認識するものである。加えて、結合特異性を与えるタンパク質内の重要なセグメントを同定するために、当該技術分野においてよく知られている、多くの欠失及び部位特異的突然変異の戦略が適用されよう。同好性結合相互作用または抗体結合のいずれかにおけるPTP細胞外セグメントの係合の、活性に対する効果についての研究を開始するために、例えばモノクローナル抗体4G10（UBI、Lake Placid、ニューヨーク）といった、抗ホスフォチロシン抗体と反応するタンパク質の２Ｄゲルの分析が用いられよう。 DEP-1と相互作用するペプチド配列を同定するために、「エピトープ」ライブラリー技術［Scott及びSmith、Science 249巻、386〜390頁(1990)］の使用が採用されよう。このアプローチは、複数のFNIII反復配列を含む細胞外セグメントが低分子の因子と結合するかもしれないDEP-1に対するリガンドを探索する上で、特に有用であることがわかるであろう。 FNIII配列と特異的結合タンパク質について、タンパク質／タンパク質相互作用が以前に報告されており、DEP-1の細胞外ドメインと特異的に相互作用するタンパク質を同定するための種々のアプローチにおいて、この情報が利用されよう。特に、細胞「パンニング」実験［Seed及びAruffo、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)84巻、3365〜3369頁(1987)］、ゲルオーバーレイアッセイ［Hirschら、J.Biol.Chem. 267巻、2131〜2134頁(199 2)；Carr及びScott、Trends in Biochemical Sci. 17巻、246〜249頁(1992)］、バンドシフトアッセイ［Carrら、J.Biol.Chem 267巻、13376〜13382頁(1992)］、アフィニティークロマトグラフィー、発現ライブラリーのスクリーニング［Yo ung及びDavis、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)80巻、1194〜1195頁(1983)］等で、タンパク質／タンパク質相互作用が研究されるであろう。実施例８ DEP-1のモジュレーター／基質の同定生理学的関連性が予見される、潜在性を有する基質は、in vitroでの触媒ドメインに対する活性について調べられよう。加えて、特に、DEP-1活性の調節能を有するタンパク質を単離するために、例えばv-srcまたはc-srcなどといったタンパク質チロシンキナーゼでの共発現に関し、酵母スクリーニングシステム［Fields及びSong、Nature 340巻、245〜246頁 (1989)；Yangら、Science 257巻、6810682(1992)；Vojtekら、Cell 74巻、205〜 214頁(1993)］が利用されよう。 DEP-1に対する基質を同定するためのさらなる試みでは、活性中心のシステイン残基がセリンで置換された変異体フォームの発現がなされよう。近年の実験により、基質は不活性ホスファヤーゼに結合して複合体としてとどまることが示唆されている。変異体PTPは、基質分子に結合することができるが、標準の免疫沈降技術によって単離することができる「ゆきどまり」複合体内にそれら分子を閉じ込めてしまう［Sunら、Cell 75巻、487〜 493頁(1993)］。潜在性を有する基質は、³⁵S-でラベルした細胞から、変異体のP TPで共免疫沈降されるかもしれない。もしくは、野生型または天然型のDEP-1酵素を、この技術において利用しうる。この方向性で端緒となる研究では、細胞外成長因子結合ドメインセグメントへの抗体が市販されているキメラ分子を利用しえ、一方で、真正のDEP-1配列に対して抗体が作製される。実施例９ゲノムDEP-1遺伝子の特徴付け DEP-1に対するcDNA配列を単離すると、DEP-1につき対応するゲノム配列の単離及び精製が可能となるであろう。予備実験で、huDEP-1はヒトクロモソーム11p、バンド11.2、または11.2と11.3との境界にマッピングされることが証明されている。これらゲノムDEP-1配列の単離により、DEP-1転写調節配列と推定される配列の同定、及びおそらくはDEP-1発現のトランス作用転写モジュレーターの同定が可能となるであろう。加えて、ヒトゲノムクローンの単離及び精製により、相同な相対物が他の種に存在するか否かを調べるために、他の種においてライブラリーのスクリーニングを行うことが可能となるであろう。ノックアウト系を作製できる可能性があるので、マウスで相同な相対物を同定することが特に重要視されよう。特定のタンパク質を発現しないマウスの系は、動物生体内でそのタンパク質が存在しないことに関わる兆候を調べることを可能ならしめるという点で、極めて重要である。本発明を特定の方法及び組成物により記載してきたが、当業者にあってはこれらに対しての変更や修飾が想起されるであろうことは理解される。従って、本発明に対しては、請求の範囲における限定のみしかなされるべきではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 9/16 9358−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 15/02 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/08 9162−4Ｂ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．精製され単離された密度増強タンパク質チロシンホスファターゼポリペプチド。２．請求の範囲第１項記載の受容体様タンパク質チロシンホスファターゼポリペプチド。３．請求の範囲第１項記載のIII型受容体様タンパク質チロシンホスファターゼポリペプチド。４．本質的に、配列番号：２で示されるhuDEP-1アミノ酸配列またはその変異型からなる、請求の範囲第３項記載のIII型受容体様タンパク質チロシンホスファターゼポリペプチド。５．請求の範囲第１項記載のタンパク質チロシンホスファターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。６．DNAである、請求の範囲第５項記載のポリヌクレオチド。７．ゲノムDNA、cDNA、部分的に化学合成されたDNA、及び全体的に化学合成されたDNAからなる群より選択される、請求の範囲第６項記載のDNA。８．DNAの転写を導く調節DNA配列をさらに含む、請求の範囲第６項記載のDNA 。９．請求の範囲第８項記載のDNAを含むDNA発現構築体。１０．請求の範囲第６項記載のDNAで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。１１．好適な培地中で請求の範囲第１０項記載の宿主細胞を生育すること、及び該宿主細胞またはその生育培地からホスファターゼポリペプチドを単離することを含む、密度増強タンパク質チロシンホスファターゼポリペプチドの製造方法。１２．密度増強III型受容体様タンパク質チロシンホスファターゼポリペプチドをコードする、精製され単離されたポリヌクレオチド。１３．DNAである、請求の範囲第１２項記載のポリヌクレオチド。１４．cDNA、ゲノムDNA、部分的に化学合成されたDNA、及び全体的に化学合成されたDNAからなる群より選択される、請求の範囲第１３項記載のDNA。１５．配列番号：１で示されるhuDEP-1タンパク質をコードする配列またはその変異型を含む、請求の範囲第１３項記載のDNA。１６．DNAの転写を導く調節DNA配列をさらに含む、請求の範囲第１３項記載のDN A。１７．a)配列番号：１で示されるDNA配列、及び b)厳密な条件下で(a)のDNAのタンパク質をコードする部分とハイブリダイズするDNA分子からなる群より選択される、精製され単離されたポリヌクレオチド。１８．配列番号：２で示されるhuDEP-1アミノ酸配列またはその変異体をコードするDNA。１９．請求の範囲第１６項記載のDNAを含むDNA発現構築体。２０．請求の範囲第１３項記載のDNAで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。２１．好適な培地中で請求の範囲第２０項記載の宿主細胞を生育する工程、及び該宿主細胞またはその生育培地からポリペプチドを単離する工程を含む、密度増強III型受容体様タンパク質チロシンホスファターゼポリペプチドの製造方法。２２．密度増強III型受容体様タンパク質チロシンホスファターゼが、huDEP-1、またはその変異体である、請求の範囲第２１項記載の方法。２３．密度増強タンパク質チロシンホスファターゼポリペプチドに特異的に結合することができる、ポリペプチドまたはペプチド。２４．密度増強III型受容体様タンパク質チロシンホスファターゼポリペプチドに特異的に結合することができる、ポリペプチドまたはペプチド。２５．抗体である、請求の範囲第２４項記載のポリペプチド。２６．モノクローナル抗体である、請求の範囲第２５項記載の抗体。２７．請求の範囲第２６項記載のモノクローナル抗体に対して特異的な抗イディオタイプ抗体。２８．請求の範囲第２６または２７項の抗体を生産するハイブリドーマ細胞系。２９．密度増強III型受容体様タンパク質チロシンホスファターゼポリペプチドがhuDEP-1、またはその変異体である、請求の範囲第２４、２５、２６、または２７項記載のポリペプチドまたはペプチド。３０．密度増強III型受容体様タンパク質チロシンホスファターゼポリペプチドに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する方法であって、以下の工程、すなわち、 a)DNA結合ドメイン及び活性化ドメインを保有する転写因子により調節されるプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むDNA構築体で、宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし、 b)密度増強III型受容体様タンパク質チロシンホスファターゼポリペプチドの一部または全てと、転写因子のDNA結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかとの、第１の融合体をコードする第１のハイブリッドDNA配列を宿主細胞内で発現し、 c)密度増強III型受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ結合性ポリペプチドと推定されるポリペプチドの一部または全てと、第１の融合体で取り込まれていない転写因子の活性化ドメインまたはDNA結合ドメインのいずれかとの、第２の融合体をコードする第２のハイブリッドDNA配列のライブラリーを宿主細胞内で発現し、 d)タンパク質チロシンキナーゼ遺伝子を含むDNA構築体で宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし、 e)宿主細胞（１種以上）内でのレポーター遺伝子産物の生産を検出することによって、宿主細胞内における、密度増強III型受容体様タンパク質チロシンホスファターゼ結合性ポリペプチド（１種以上）のホスファターゼポリペプチドへの結合を検出し、及び f)宿主細胞（１種以上）からホスファターゼ結合性ポリペプチドをコードする第２のハイブリッドDNA配列を単離する工程を含む方法。３１．プロモーターがベーターガラクトシダーゼプロモーターであり、DNA結合ドメインがlexA DNA結合ドメインであり、活性化ドメインがGAL4トランス活性化ドメインであり、レポーター遺伝子がlacZ遺伝子であって、そして宿主細胞が酵母宿主細胞である、請求の範囲第３０項記載の方法。３２．密度増強III型受容体様タンパク質チロシンホスファターゼが、huDEP-1、またはその変異体である、請求の範囲第３０項記載の方法。３３．密度増強III型受容体様タンパク質チロシンホスファターゼが、huDEP-1基質に結合することができる、触媒としては不活性なhuDEP-１の変異体である、請求の範囲第３０項記載の方法。３４．密度増強III型受容体様タンパク質チロシンホスファターゼポリペプチドイソフォームに結合するタンパク質を検出する方法であって、以下の工程、すなわち、 a)ホスファターゼ結合性タンパク質と推定されるタンパク質と、特異的な対向受容体と高い親和性をもって結合することができるリガンドとの、融合体をコードするハイブリッドDNA配列で宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし、 b)適切な条件下で宿主細胞内のハイブリッドDNA配列を発現し、 c)固定化された状態にある特異的な対向受容体に、融合タンパク質を曝すことにより、宿主細胞から融合タンパク質を固定化し、 d)密度増強III型受容体様タンパク質チロシンホスファターゼポリペプチドを、固定化された融合タンパク質と接触させ、及び e)ホスファターゼポリペプチドに対して特異的な試薬を用いて、融合タンパク質に結合したホスファターゼポリペプチドを検出する工程を含む方法。３５．リガンドがグルタチオン-S-トランスフェラーゼであり、対向受容体がグルタチオンである、請求の範囲第３４項記載の方法。３６．リガンドがヘマグルチニンであり、対向受容体がヘマグルチニン特異性抗体である、請求の範囲第３４項記載の方法。３７．リガンドがポリヒスチジンであり、対向受容体がニッケルである、請求の範囲第３４項記載の方法。３８．リガンドがマルトース結合性タンパク質であり、対向受容体がアミロースである、請求の範囲第３４項記載の方法。３９．密度増強III型受容体様タンパク質チロシンホスファターゼポリペプチドがhuDEP-1、またはその変異体である、請求の範囲第３３項記載の方法。