JP2002542786A

JP2002542786A - Ｄｓｐ−５二重特異性ｍａｐキナーゼホスファターゼ

Info

Publication number: JP2002542786A
Application number: JP2000614403A
Authority: JP
Inventors: ラルフエム．ルーチェ，; ボウェイ，
Original assignee: セプティア，インコーポレイテッド
Priority date: 1999-04-27
Filing date: 2000-04-26
Publication date: 2002-12-17
Also published as: CA2370547A1; US20050075489A1; AU4683200A; WO2000065069A1; US6645753B1

Abstract

(57)【要約】細胞増殖、細胞分化、および細胞の生存に関する状態の処置のための組成物および方法が、提供される。詳細には、二重特異性ホスファターゼＤＳＰ−５、およびＤＳＰ−５基質の脱リン酸化を刺激するＤＳＰ−５のポリペプチド改変体が、提供される。これらのポリペプチドを用いて、例えば、ＤＳＰ−５活性を阻害する抗体および他の薬剤を同定し得る。これらのポリペプチドおよび薬剤を用いて、細胞増殖、細胞分化、および細胞の生存を調節し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、一般的に、細胞増殖、細胞分化、および／または細胞生存における
欠損と関連する状態を処置するために有用な組成物および方法に関する。本発明
は、より詳細には、二重特異性プロテインホスファターゼおよびそのポリペプチ
ド改変体に関する。本発明はまた、増殖性応答、細胞分化、および／または細胞
生存をもたらすシグナル伝達を調節する抗体および他の薬剤（低分子を含む）の
同定のためのそのようなポリペプチドの使用に関する。

【０００２】（発明の背景）マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）は、種々の保存性
のメンバーを有する保存された細胞シグナル伝達経路の構成要素として存在する
。ＭＡＰキナーゼは、配列Ｔｈｒ−Ｘ−Ｔｙｒを有する二重リン酸化モチーフに
おけるリン酸化（ＭＡＰキナーゼキナーゼによる）によって活性化される。ここ
で、チロシン残基およびスレオニン残基でのリン酸化が活性に必要である。活性
化されたＭＡＰキナーゼは、いくつかの伝達標的（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ
ｔａｒｇｅｔ）（転写薬剤を含む）をリン酸化する。ＭＡＰキナーゼの不活化は
、ＭＡＰキナーゼホスファターゼと呼ばれる二重特異性ホスファターゼによる、
この部位での脱リン酸化によって媒介される。高等真核生物において、ＭＡＰキ
ナーゼシグナル伝達の生理的役割は、増殖、腫瘍形成、発生、および分化のよう
な、細胞内事象と相関していた。従って、これらの経路を介してシグナル伝達を
調節する能力は、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達と関連するヒト疾患（例えば、癌
）についての処置および予防療法の開発をもたらし得る。

【０００３】二重特異性プロテインチロシンホスファターゼ（二重特異性ホスファターゼ）
は、ホスホチロシン残基とホスホスレオニン／セリン残基との両方を脱リン酸化
するホスファターゼである（Ｗａｌｔｏｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．６２：１０１−１２０、１９９３）。ＭＡＰキナーゼを不活性化するいくつか
の二重特異性ホスファターゼが同定されており、これらには、ＭＫＰ−１（ＷＯ
９７／００３１５；ＫｅｙｓｅおよびＥｍｓｌｉｅ、Ｎａｔｕｒｅ５９：６４
４−６４７、１９９２）、ＭＫＰ−４、ＭＫＰ−５、ＭＫＰ−７、Ｈｂ５（ＷＯ
９７／０６２４５）、ＰＡＣ１（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ３６７：６５１−
６５４、１９９４）、ＨＶＨ２（ＧｕａｎおよびＢｕｔｃｈ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７０：７１９７−７２０３、１９９５）、およびＰＹＳＴ１（Ｇｒｏ
ｏｍら、ＥＭＢＯＪ．１５：３６２１−３６３２、１９９６）が含まれる。特
定の二重特異性ホスファターゼの発現は、ストレスまたはマイトジェンによって
誘導されるが、他の二重特異性ホスファターゼは、特定の細胞型において構成的
に発現されるようである。二重特異性ホスファターゼの発現および活性の調節は
、細胞増殖、細胞分化、および細胞生存を含む、ＭＡＰキナーゼ媒介性の細胞機
能の制御に重要である。例えば、二重特異的ホスファターゼは、細胞増殖のネガ
ティブレギュレーターとして機能し得る。細胞の型または活性化に関して種々の
特異性を有する、多くのこのような二重特異性ホスファターゼが存在する可能性
がある。しかし、二重特異性ホスファターゼの調節は、理解が乏しいままであり
、そして比較的少ない数の二重特異性ホスファターゼのみしか同定されていない
。

【０００４】従って、当該分野において、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達カスケードにおける
、ＭＡＰシグナル伝達、および二重特異性ホスファターゼの調節の理解の改善に
ついての必要性が存在する。二重特異性ホスファターゼ調節の理解の増加は、Ｍ
ＡＰキナーゼカスケードに関与するタンパク質の活性を調節するための方法の開
発、およびこのようなカスケードと関連する状態を処置するための方法の開発を
容易にし得る。本発明は、これらの必要性を満足し、そしてさらに、他の関連す
る利点を提供する。

【０００５】（発明の要旨）手短に述べれば、本発明は、細胞増殖応答を調節し得る薬剤を同定するための
組成物および方法を提供する。１つの局面において、本発明は、配列番号２に列
挙されるＤＳＰ−５の配列またはその改変体を有する単離されたＤＳＰ−５ポリ
ペプチドを提供し、この改変体は、そのポリペプチドが活性化ＭＡＰキナーゼを
脱リン酸化する能力を保持しているように、配列番号２の残基の５０％以下での
１以上アミノ酸の欠失、付加、挿入、または置換にて異なる。

【０００６】さらなる局面において、本発明は、配列番号２に対応する配列を有するポリペ
プチドの少なくとも１０個連続するアミノ酸をコードする単離されたポリヌクレ
オチドを提供する。特定の実施形態において、本発明は、配列番号２に対応する
配列を有するポリペプチドの少なくとも１５個連続するアミノ酸をコードする単
離されたポリヌクレオチドを提供する。特定のこのようなポリヌクレオチドは、
ＤＳＰ−５ポリペプチドをコードする。なおさらに、ポリヌクレオチドは、ＤＳ
Ｐ−５ポリヌクレオチドの一部に相補的である少なくとも１５個連続するヌクレ
オチドを含み、かつ／または０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で、５０
℃で、少なくとも１５分間の洗浄を含む条件下で、配列番号１に列挙される配列
の相補体に検出可能にハイブリダイズする、アンチセンスポリヌクレオチドであ
り得る。前述のポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクター、およびそのよ
うな発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞もまた、提
供される。

【０００７】本発明はさらに、他の局面において、以下の工程：（ａ）ＤＳＰ−５ポリペプ
チドの発現を可能にする条件下で、上記のような宿主細胞を培養する工程；およ
び（ｂ）上記宿主細胞培養物からＤＳＰ−５ポリペプチドを単離する工程、を包
含する、ＤＳＰ−５ポリペプチドを産生するための方法を提供する。

【０００８】ＤＳＰ−５ポリペプチド（例えば、配列番号２の配列を有するポリペプチド）
に特異的に結合する、単離された抗体およびその抗原結合フラグメントもまた、
本発明によって提供される。

【０００９】本発明はさらに、他の局面において、上記のようなポリペプチド、ポリヌクレ
オチド、抗体またはそのフラグメントを、生理学的に受容可能なキャリアと合わ
せて含む、薬学的組成物を提供する。

【００１０】さらなる局面において、本発明は、サンプル中のＤＳＰ−５発現を検出するた
めの方法を提供し、この方法は、（ａ）抗体／ＤＳＰ−５複合体の形成を可能に
するのに十分な条件下かつ時間の間、サンプルを、上記のような抗体またはその
抗原結合フラグメントと接触させる工程；および（ｂ）抗体／ＤＳＰ−５複合体
のレベルを検出する工程、を包含する。

【００１１】なお他の局面において、本発明は、サンプル中のＤＳＰ−５発現を検出するた
めの方法を提供し、この方法は、（ａ）サンプルを、上記のようなアンチセンス
ポリヌクレオチドと接触させる工程；および（ｂ）そのアンチセンスポリヌクレ
オチドとハイブリダイズするＤＳＰ−５ポリヌクレオチドの量を、そのサンプル
中で検出する工程、を包含する。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応またはハイブリ
ダイゼーションアッセイを用いて、そのアンチセンスポリヌクレオチドとハイブ
リダイズするＤＳＰ−５ポリヌクレオチドの量が決定され得る。

【００１２】本発明はまた、酵素活性および／または基質結合のモジュレーターについての
スクリーニングアッセイにおいて有用なＤＳＰ−５ポリペプチドを提供する。他
の局面において、ＤＳＰ−５活性を調節する薬剤についてスクリーニングするた
めの方法もまた提供され、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）候補薬剤を
上記のようなＤＳＰ−５ポリペプチドと、そのポリペプチドと候補薬剤との間の
相互作用を可能にするのに十分な条件下かつ時間の間、接触させる工程；および
（ｂ）続いて、候補薬剤の非存在下で、そのポリペプチドがＤＳＰ−５基質を脱
リン酸化する予め決定した能力と比較して、ＤＳＰ−５基質を脱リン酸化するそ
のポリペプチドの能力を評価する工程。このような方法は、インビトロまたは細
胞環境中（例えば、インタクトな細胞中）で実施され得る。

【００１３】さらなる局面において、ＤＳＰ−５活性を調節する薬剤についてスクリーニン
グするための方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）候補
薬剤を、検出可能な転写物またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作
動可能に連結されたＤＳＰ−５プロモーターを含む細胞と、そのプロモーターと
候補薬剤との間の相互作用を可能にするに十分な条件かつ時間で、接触させる工
程；ならびに引き続いて（ｂ）候補薬剤の非存在下での予め決定したレベルの発
現と比較して、そのポリヌクレオチドの発現を評価する工程。

【００１４】また、細胞における増殖性応答を調節するための方法も提供され、その方法は
、ＤＳＰ−５活性を調節する薬剤と細胞を接触させる工程を包含する。

【００１５】さらなる局面において、細胞の分化を調節するための方法が提供され、その方
法は、ＤＳＰ−５活性を調節する薬剤と細胞を接触させる工程を包含する。

【００１６】本発明はさらに、細胞の生存を調節するための方法を提供し、その方法は、Ｄ
ＳＰ−５活性を調節する薬剤と細胞を接触させる工程を包含する。

【００１７】関連する局面において、本発明は、ＤＳＰ−５活性と関連する（かまたは、Ｄ
ＳＰ−５の投与により処置可能な）障害に罹患した患者を処置するための方法を
提供し、この方法は、ＤＳＰ−５活性を調節する薬剤の治療上有効な量を患者に
投与する工程を包含する。このような障害としては、癌、対宿主性移植片病、自
己免疫疾患、アレルギー、代謝疾患、異常な細胞成長（ｇｒｏｗｔｈ）、異常な
細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および細胞周期異常が、挙げられる。

【００１８】さらなる局面において、ＤＳＰ−５基質捕捉変異体ポリペプチドが提供される
。このようなポリペプチドは、そのポリペプチドが、ＤＳＰ−５と比較して実質
的には減少していない親和性にて基質に結合するように、かつそのポリペプチド
が基質を脱リン酸化する能力は、ＤＳＰ−５と比較して減少しているように、配
列番号２中の残基の５０％以下での１つ以上のアミノ酸の欠失、付加、挿入また
は置換にて、配列番号２に記載される配列と異なる。特定の実施形態において、
基質捕捉変異体ポリペプチドは、配列番号２の８４位または１１５位の置換を含
む。

【００１９】本発明はさらに、他の局面において、ＤＳＰ−５と相互作用する能力について
分子をスクリーニングするための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含
する：（ａ）候補分子を上記のＤＳＰ−５ポリペプチドまたはその改変体と、そ
の候補分子とポリペプチドとが相互作用するのを可能にするに十分な条件かつ時
間で、接触させる工程；ならびに（ｂ）そのポリペプチドへのその候補分子の結
合の存在または非存在を検出する工程。この検出工程は、例えば、アフィニティ
ー精製工程、酵母ツーハイブリッドスクリーニング、またはファージディスプレ
イのスクリーニングを含み得る。

【００２０】１つの局面において、本発明は、配列番号４に記載されるＤＳＰ−５代替形態
の配列またはその改変体を有する単離されたＤＳＰ−５ポリペプチドを提供し、
この改変体は、配列番号４の残基の５０％以下において、１以上のアミノ酸欠失
、付加、挿入または置換にて異なり、その結果、このポリペプチドは、活性化Ｍ
ＡＰ−キナーゼを脱リン酸化する能力を保持する。

【００２１】さらなる局面において、本発明は、配列番号４に対応する配列を有するポリペ
プチドの少なくとも１０個の連続アミノ酸をコードする単離されたポリヌクレオ
チドを提供する。特定の実施形態において、本発明は、配列番号４に対応する配
列を有するポリペプチドの少なくとも１５個の連続したアミノ酸をコードする単
離されたポリヌクレオチドを提供する。特定のこのようなポリヌクレオチドは、
ＤＳＰ−５代替形態ポリペプチドをコードする。なおさらに、ポリヌクレオチド
は、ＤＳＰ−５代替形態のポリペプチドの一部に相補的な少なくとも１５個の連
続したヌクレオチドを含み、そして／または６０℃での１５分間の０．１ＸＳ
ＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での洗浄を含む条件下で、配列番号２に記載され
る配列の相補体に検出可能にハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチド
であり得る。前述のポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクター、およびこ
のような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞がまた
、提供される。

【００２２】他の局面において、本発明はさらに、以下の工程：（ａ）ＤＳＰ−５代替形態
ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、上記の宿主細胞を培養する工程；お
よび（ｂ）ＤＳＰ−５代替形態ポリペプチドを宿主細胞培養物から単離する工程
、を包含するＤＳＰ−５代替形態ポリペプチドを産生するための方法をさらに提
供する。

【００２３】単離された抗体、およびその抗原結合フラグメント（これらは、配列番号４の
配列を有するポリペプチドのようなＤＳＰ−５代替形態のポリペプチドに特異的
に結合する）がまた、本発明により提供される。

【００２４】他の局面において、本発明は、さらに、生理学的に受容可能なキャリアと組み
合わせて、上記のようなポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体またはそのフラ
グメントを含む薬学的組成物を提供する。

【００２５】さらなる局面において、本発明は、以下の工程を含む、サンプル中のＤＳＰ−
５代替形態発現を検出するための方法を提供する：（ａ）抗体／ＤＳＰ−５代替
形態複合体の形成を可能にするのに十分な条件でかつ時間で、上記のような抗体
またはその抗原結合フラグメントとサンプルを接触させる工程；および（ｂ）抗
体／ＤＳＰ−５代替形態複合体のレベルを検出する工程。

【００２６】なお他の局面において、本発明は、以下の工程を含む、サンプル中のＤＳＰ−
５代替形態発現を検出するための方法を提供する：（ａ）上記のようなアンチセ
ンスポリヌクレオチドとサンプルを接触させる工程；および（ｂ）サンプル中の
アンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズするＤＳＰ−５代替形態ポリヌ
クレオチドの量を検出する工程。アンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイ
ズするＤＳＰ−５代替形態ポリヌクレオチドの量を、例えば、ポリメラーゼ連鎖
反応またはハイブリダイゼーションアッセイを用いて検出し得る。

【００２７】本発明はまた、酵素活性および／または基質結合のモジュレーターについての
スクリーニングアッセイに有用なＤＳＰ−５代替形態のポリペプチドを提供する
。他の局面において、以下の工程を含む、ＤＳＰ−５代替形態活性を調節する薬
剤についてのスクリーニングのための方法がまた、提供される：（ａ）ポリペプ
チドと候補薬剤との間の相互作用を可能にするに十分な条件下でかつ時間で、上
記のようなポリペプチドと候補薬剤を接触させる工程；および（ｂ）候補薬剤の
非存在でＤＳＰ−５代替形態基質を脱リン酸化するポリペプチドの予め決定され
た能力と比較して、ＤＳＰ−５代替形態基質を脱リン酸化するポリペプチドの能
力をその後に評価する工程。このような方法は、インビボまたは細胞環境（例え
ば、インタクトな細胞内で）実施され得る。

【００２８】さらなる局面において、以下の工程を包含する、ＤＳＰ−５代替形態活性を調
節する薬剤についてスクリーニングするための方法が、提供される：（ａ）プロ
モーターと候補薬剤との間の相互作用を可能にするに十分な条件下でかつ時間で
、検出可能な転写物またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドに操作可能
に連結されたＤＳＰ−５代替形態プロモーターを含む細胞と候補薬剤を接触させ
る工程；および（ｂ）候補薬剤の非存在下で発現の予め決定されたレベルと比較
して、ポリヌクレオチドの発現をその後に評価する工程。

【００２９】ＤＳＰ−５代替形態活性を調節する薬剤と細胞を接触させる工程を包含する、
細胞における増殖応答を調節するための方法がまた、提供される。

【００３０】さらなる局面において、ＤＳＰ−５代替形態活性を調節する薬剤と細胞を接触
させる工程を包含する、細胞の分化を調節する方法が、提供される。

【００３１】本発明は、さらに、ＤＳＰ−５代替形態活性を調節する薬剤と細胞を接触させ
る工程を包含する、細胞生存を調節するための方法を提供する。

【００３２】関連した局面において、本発明は、ＤＳＰ−５代替形態活性に関連する障害（
またはＤＳＰ−５代替形態の投与によって処置可能な障害）に罹患する患者を処
置する方法を提供する。この方法は、ＤＳＰ−５代替形態活性を調節する治療有
効量の薬剤を患者に投与する工程を包含する。このような障害としては、癌、対
宿主性移植片病、自己免疫疾患、アレルギー、代謝疾患、異常な細胞成長（ｇｒ
ｏｗｔｈ）、異常な細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および細胞周期異
常が、挙げられる。

【００３３】さらなる局面において、変異ポリペプチドを捕捉するＤＳＰ−５代替形態基質
が提供される。このようなポリペプチドは、配列番号４における残基の５０％以
下における１以上のアミノ酸欠失、付加、挿入または置換にて配列番号４に記載
される配列と異なり、その結果、このポリペプチドは、ＤＳＰ−５代替形態に比
較して実質的に減少されない親和性で基質に結合し、かつ基質を脱リン酸化する
このポリペプチドの能力は、ＤＳＰ−５代替形態に比較して減少される。特定の
特異的実施形態において、基質捕捉変異ポリペプチドは、配列番号４の８４位ま
たは１１５位に置換を含む。

【００３４】他の局面において、本発明は、さらに、以下の工程を包含する、ＤＳＰ−５代
替形態と相互作用する能力について分子をスクリーニングするための方法を提供
する：（ａ）候補分子およびポリペプチドに相互作用させるに十分な条件下かつ
時間で上記のようなＤＳＰ−５代替形態ポリペプチドまたはその改変体と候補分
子を接触させる工程；および（ｂ）候補分子のポリペプチドへの結合の存在また
は非存在を検出する工程。検出する工程は、例えば、アフィニティー精製工程、
酵母ツーハイブリッドスクリーンまたはファージディスプレイライブラリーのス
クリーンを含み得る。

【００３５】本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面
を参照することによって、明らかになる。本明細書中に開示されるすべての参考
文献は、各々が個別に援用されたかのように、その全体が参考として本明細書中
に援用される。

【００３６】（発明の詳細な説明）上記のように、本発明は、一般的に、インビトロおよびインビボでの細胞増殖
性応答を調節（すなわち、刺激または阻害）するための、組成物および方法に関
する。詳細には、本発明は、二重特異性ホスファターゼＤＳＰ−５またはＤＳＰ
−５代替形態（図１〜４；配列番号１〜４）、ならびにその改変体、ならびにＤ
ＳＰ−５またはＤＳＰ−５代替形態に特異的に結合する抗体を提供する。また、
本明細書中に提供されるのは、スクリーニング、検出アッセイ、および関連する
治療用途のためにこのような化合物を使用するための、方法である。

【００３７】（ＤＳＰ−５ポリペプチドおよびＤＳＰ−５ポリヌクレオチド）本明細書中で使用される場合、用語「ＤＳＰ−５ポリペプチド」または「ＤＳ
Ｐ−５代替形態ポリペプチド」とは、本明細書中に提供されるようなＤＳＰ−５
配列またはそのような配列の改変体を含む、ポリペプチドをいう。このようなポ
リペプチドは、ＤＳＰ−５基質中のチロシン残基およびスレオニン／セリン残基
の両方を脱リン酸化し得、ネイティブの全長ＤＳＰ−５またはＤＳＰ−５代替形
態の活性と比較して、実質的には減少していない活性を有する。ＤＳＰ−５また
はＤＳＰ−５代替形態基質は、活性化（すなわち、リン酸化）ＭＡＰ−キナーゼ
を含む。他の基質は、本明細書中で記載されるように、基質捕捉変異体を使用し
て同定され得、そして１つ以上のリン酸化チロシン残基、スレオニン残基および
／またはセリン残基を有する、ポリペプチドを含む。

【００３８】本発明の範囲内のＤＳＰ−５またはＤＳＰ−５代替形態ポリペプチド改変体は
、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入を含み得る。特定のＤＳＰ−
５またはＤＳＰ−５代替形態改変体について、この改変体が、ＤＳＰ−５基質内
のチロシンおよびスレオニン残基を脱リン酸化する能力は、実質的には減少しな
い。このようなＤＳＰ−５改変体が、ＤＳＰ−５基質内のチロシンおよびスレオ
ニン残基を脱リン酸化する能力は、ネイティブのＤＳＰ−５またはＤＳＰ−５代
替形態と比較して、増強され得るか、または無変化であり得るか、あるいは、ネ
イティブのＤＳＰ−５またはＤＳＰ−５代替形態と比較して、５０％未満減少さ
れ得、そして好ましくは、２０％未満減少され得る。このような改変体は、本明
細書中で提供される代表的なアッセイを使用して、同定され得る。

【００３９】本発明によって、特定の機能が無能力にされているＤＳＰ−５またはＤＳＰ−
５代替形態の改変された形態もまた意図される。例えば、このようなタンパク質
は、構成的に活性または不活性であり得るか、あるいは、変更された結合性質ま
たは触媒性質を示し得る。このような変更されたタンパク質は、周知技術を使用
して生成され得、そして変更された機能は、本明細書中で提供されるようなスク
リーニングを使用して確認され得る。特定の改変されたＤＳＰ−５またはＤＳＰ
−５代替形態ポリペプチドは、「基質捕捉変異体」として公知である。このよう
なポリペプチドは、基質を結合する能力を保持する（すなわち、Ｋ_mが実質的に
は減少していない）が、基質を脱リン酸化する能力の減少（すなわち、ｋ_catが
、好ましくは、１分当たり１未満まで減少している）を示す。さらに、基質捕捉
変異体／基質複合体の安定性は、ＤＳＰ−５／基質複合体（ＤＳＰ−５代替形態
／基質複合体を含む）の安定性と比較して、実質的に減少していないはずである
。複合体安定性は、会合定数（Ｋ_a）に基づいて評価され得る。Ｋ_m、ｋ_catおよ
びＫ_aの決定は、当該分野で公知の標準的な技術（例えば、ＷＯ９８／０４７
１２；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７５Ｗｏｒｔｈ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹを参照のこと）および本明細書中で提供されるア
ッセイを使用して、容易に達成され得る。基質捕捉変異体は、例えば、８４位ま
たは１１５位でのアミノ酸置換によりＤＳＰ−５またはＤＳＰ−５代替形態を改
変することによって（例えば、８４位のアミノ酸アスパラギン酸をアラニン残基
で置換することによって、または残基１１５のシステインをセリンで置換するこ
とによって）生成され得る。基質捕捉変異体は、例えば、ＤＳＰ−５基質を同定
するために使用され得る。手短に言えば、改変されたＤＳＰ−５またはＤＳＰ−
５代替形態が、候補基質と接触されて（単独、または細胞抽出物のようなタンパ
ク質の混合物内で）、基質／ＤＳＰ−５複合体の形成が可能になり得る。次いで
、この複合体は、従来技術によって単離され得、基質の単離および特徴付けが可
能になり得る。基質捕捉変異体の調製および使用は、例えば、ＰＣＴ公開番号Ｗ
Ｏ９８／０４７１２に記載される。

【００４０】好ましくは、改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」は、ペプチド化学
の当業者が、そのポリペプチドの二次構造および親水疎水度（ｈｙｄｒｏｐａｔ
ｈｙ）が実質的に変化しないことを予期するように、１つのアミノ酸が、類似の
性質を有する別のアミノ酸に代わって置換されている、置換である。アミノ酸置
換は、一般的に、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両
親媒性性質の類似性に基づいてなされ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸とし
ては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる；正に荷電したアミノ酸
としては、リシンおよびアルギニンが挙げられる；ならびに類似の親水性価を有
する非荷電の極性ヘッド基（ｈｅａｄｇｒｏｕｐ）を有するアミノ酸としては
、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギ
ンおよびグルタミン；ならびにセリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチ
ロシンが挙げられる。保存的変化を代表し得るアミノ酸の他のグループとしては
以下が挙げられる：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、
ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａ
ｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ
；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。改変体はまた、あるいは代わ
りに、非保存的変化を含み得る。

【００４１】一般的に、改変は、重要でない領域において、より容易になされ得、重要でな
い領域とは、ＤＳＰ−５またはＤＳＰ−５代替形態の活性を実質的には変化しな
いネイティブ配列の領域である。重要でない領域は、本明細書中に記載されるよ
うな、特定の領域におけるＤＳＰ−５またはＤＳＰ−５代替形態配列の改変、お
よびホスファターゼアッセイにおける得られた改変体の能力の評価によって同定
され得る。好ましい配列改変は、活性部位ドメイン（ＶＨＣＨＡＧＶＳＲＳＶＡ
ＩＩ、配列番号５）を保持するようになされる。特定の好ましい実施形態におい
て、このような改変は、ＤＳＰ−５またはＤＳＰ−５代替形態と、ＤＳＰ−５基
質以外の細胞成分との間の相互作用に影響を及ぼす。しかし、置換はまた、得ら
れた改変体が、基質脱リン酸化を刺激する能力を実質的に保持するならば、ネイ
ティブタンパク質の重要な領域においてなされ得る。特定の実施形態において、
改変体は、５０％以下、好ましくは、２５％以下のアミノ酸残基の、置換、欠失
、付加および／または挿入を含む。

【００４２】改変体はまた（あるいは、代わりに）、例えば、そのポリペプチドの活性に対
して最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によって改変され得る。特に
、改変体は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端で、さらなるアミノ酸配
列を含み得る。このような配列は、例えば、そのポリペプチドの精製または検出
を容易にするために使用され得る。

【００４３】ＤＳＰ−５ポリペプチド（またはＤＳＰ−５代替形態ポリペプチド）は、種々
の周知技術のうちのいずれかを使用して調製され得る。以下に記載されるような
ＤＮＡ配列によってコードされる組換えポリペプチドは、当業者に公知の種々の
発現ベクターのうちのいずれかを使用して、それらのＤＮＡ配列から容易に調製
され得る。発現は、組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベク
ターで形質転換されたかまたはトランスフェクトされた、任意の適切な宿主細胞
において達成され得る。適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母および高等真
核生物細胞（哺乳動物細胞を含む）が挙げられ、そしてグリコシル化にて異なる
形態が、宿主細胞または単離後のプロセシングを変化させることによって生成さ
れ得る。培養培地へ組換えタンパク質またはポリペプチドを分泌する適切な宿主
／ベクター系由来の上清は、市販のフィルターを使用して最初に濃縮され得る。
濃縮後、その濃縮物は、適切な精製マトリックス（例えば、アフィニティマトリ
ックスまたはイオン交換樹脂）に適用され得る。最終的に、１つ以上の逆相ＨＰ
ＬＣ工程を利用して、組換えポリペプチドがさらに精製され得る。

【００４４】約１００個よりも少ないアミノ酸、そして一般的には約５０個よりも少ないア
ミノ酸を有する、部分および他の改変体はまた、当業者に周知の技術を使用して
、合成手順によって生成され得る。例えば、このようなポリペプチドは、市販の
固相技術（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法）のうちのいずれかを使用
して、合成され得、ここで、アミノ酸は、連続して、伸長するアミノ酸鎖に付加
される。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９
−２１４６，１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動合成のための装置は、
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ
Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）のような供給者から市販
されており、そして製造業者の使用説明書に従って、操作され得る。

【００４５】「ＤＳＰ−５ポリヌクレオチド」は、ＤＳＰ−５またはＤＳＰ−５代替形態ポ
リペプチドまたはその改変体の少なくとも一部分をコードする任意のポリヌクレ
オチドであるか、あるいはこのようなポリヌクレオチドに相補的である任意のポ
リヌクレオチドである。好ましいポリヌクレオチドは、ＤＳＰ−５またはＤＳＰ
−５代替形態ポリペプチドをコードするかまたはこのような配列に相補的である
、少なくとも１５個連続したヌクレオチド、好ましくは、少なくとも３０個連続
したヌクレオチドを含む。特定のポリヌクレオチドは、ＤＳＰ−５またはＤＳＰ
−５代替形態ポリペプチドをコードする；他のポリヌクレオチドは、以下に記載
されるようなプローブ、プライマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとし
ての使用を見出し得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コード鎖またはアンチセ
ンス鎖）あるいは二本鎖であり得、そしてＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまた
は合成ＤＮＡ）分子あるいはＲＮＡ分子であり得る。さらなるコード配列または
非コード配列が、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るが、必ずしもその必
要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持物質に連結
され得るが、必ずしもその必要はない。

【００４６】ＤＳＰ−５ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、内因性ＤＳＰ−
５またはＤＳＰ−５代替形態配列あるいはその一部分またはスプライス改変体）
を含み得るか、あるいはこのような配列の改変体を含み得る。ポリヌクレオチド
改変体は、上記のように、コードされたポリペプチドの活性が、実質的には減少
しないように、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得る。コ
ードされたポリペプチドの活性に対する効果は、一般的に、本明細書中に記載さ
れるように評価され得る。改変体は、好ましくは、ネイティブのＤＳＰ−５また
はＤＳＰ−５代替形態またはその一部分をコードするポリヌクレオチド配列に、
少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは、少なくとも約８０％の同一性お
よび最も好ましくは、少なくとも約９０％の同一性を示す。パーセント同一性は
、ＡｌｉｇｎまたはＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５，１９９１；ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎ
ｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１
５−１０９１９，１９９２）のような当業者に周知のコンピュータアルゴリズム
を使用して、配列を比較することによって容易に決定され得、このアルゴリズム
は、ＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ
．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）で入手可能である。デフォルトパラメ
ータが使用され得る。特定の改変体は、ネイティブの遺伝子に実質的に相同性で
ある。このようなポリヌクレオチド改変体は、中程度にストリンジェントな条件
下で、ネイティブのＤＳＰ−５またはＤＳＰ−５代替形態（または、相補的配列
）をコードする天然に存在するＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列とハイブリダイズし
得る。適切な中程度にストリンジェントな条件は、例えば、５×ＳＳＣ、０．５
％ＳＤＳ、１．０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で予め洗浄する工
程；５０℃〜６８℃、５×ＳＳＣで、１〜１６時間（例えば、一晩）ハイブリダ
イズする工程；その後、６５℃までにて２０〜４０分間で１回または２回、０．
０５〜０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣおよび０．２×ＳＳ
Ｃの各々の１つ以上で、洗浄する工程を包含する。さらなるストリンジェンシー
のために、条件は、５０〜６０℃、１５〜４０分間の０．１×ＳＳＣおよび０．
１％ＳＤＳでの洗浄を含み得る。当業者に公知のように、ハイブリダイゼーシ
ョン条件のストリンジェンシーの変化は、プレハイブリダイゼーション工程、ハ
イブリダイゼーション工程および洗浄工程のために使用される時間、温度および
／または溶液の濃度を変更することによって達成され得、そして適切な条件はま
た、使用されるプローブの特定のヌクレオチド配列、およびブロットされた発端
（ｐｒｏｂａｎｄ）の核酸サンプルの特定のヌクレオチド配列に部分的に依存し
得る。従って、適切にストリンジェントな条件は、プローブの所望の選択性が、
１つ以上の特定の発端配列にハイブリダイズするが他の特定の発端配列にはハイ
ブリダイズしない能力に基づいて、同定される場合、過度の実験を伴わずに容易
に選択され得ることが認識される。

【００４７】遺伝コードの縮重の結果として、本明細書中に記載される通りのポリペプチド
をコードする多くのヌクレオチド配列が存在することもまた当業者によって認識
される。これらのポリヌクレオチドのうちのいくつかは、任意のネイティブな遺
伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を保有する。それにもかかわらず
、コドン使用法の相違に起因して変化するポリヌクレオチドが、本発明によって
特に意図される。

【００４８】ポリヌクレオチドは、任意の種々の技術を用いて調製され得る。例えば、ポリ
ヌクレオチドは、適切な細胞または組織型（例えば、ヒトの胸、精巣または胸腺
）から調製されたｃＤＮＡから増幅され得る。このようなポリヌクレオチドは、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して増幅され得る。このアプローチについ
ては、配列特異的プライマーが、本明細書中に提供される配列に基づいて設計さ
れ得、そして購入または合成され得る。

【００４９】増幅された部分を用い、周知の技術を用いて全長の遺伝子が適切なライブラリ
ー（例えば、ヒト脳、精巣、または胸腺のｃＤＮＡ）から単離され得る。このよ
うな技術内で、増幅に適切な１以上のポリヌクレオチドプローブまたはポリヌク
レオチドプライマーを用いてライブラリー（ｃＤＮＡまたはゲノム）がスクリー
ニングされる。好ましくは、ライブラリーは、より大きな分子を含むように大き
さが選択される。ランダムプライムライブラリーもまた、遺伝子の５’領域およ
び上流領域を同定するために好適であり得る。ゲノムライブラリーは、イントロ
ンを得るためおよび５’配列を伸長させるために好適である。

【００５０】ハイブリダイゼーション技術について、部分配列が、周知の技術を用いて（例
えば、³²Ｐを用いるニックトランスレーションまたは末端標識によって）標識さ
れ得る。次いで、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーが、
変性した細菌コロニーを含むフィルター（またはファージプラークを含むローン
（ｌａｗｎ））を、標識したプローブを用いてハイブリダイズすることによって
スクリーニングされ得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。ハイブリダイズするコロニーま
たはプラークが選択され、そして増殖され、そしてさらなる分析のためにＤＮＡ
が単離される。クローンを分析して、例えば、部分配列由来のプライマーおよび
ベクター由来のプライマーを用いるＰＣＲによって、さらなる配列の量が決定さ
れ得る。制限地図および部分配列を生成して、オーバーラップする１以上のクロ
ーンを同定し得る。周知の技術を用いて適切なフラグメントを連結することによ
って、全長のｃＤＮＡ分子を生成し得る。

【００５１】あるいは、部分的ｃＤＮＡ配列から全長のコード配列を得るための多数の増幅
技術が存在する。このような技術では、増幅は一般に、ＰＣＲを介して行われる
。１つのこのような技術は、「ｃＤＮＡ末端の迅速増幅」、すなわち、ＲＡＣＥ
として公知である。この技術は、内部プライマーと、ポリＡ領域またはベクター
配列にハイブリダイズする外部プライマーとを使用して、既知の配列の５’側
である配列および３’側である配列を同定することを含む。任意の種々の市販の
キットを用いて、増幅工程を行い得る。例えば、当該分野で周知のソフトウェア
を使用して、プライマーを設計し得る。プライマーは好ましくは、１７〜３２ヌ
クレオチド長であり、少なくとも４０％のＧＣ含量を有し、そして約５４℃〜７
２℃の温度で標的配列にアニーリングする。増幅された領域は、上記の通りに配
列決定され得、そしてオーバーラップする配列は、連続した配列へと集合され得
る。

【００５２】ＤＳＰ−５をコードするｃＤＮＡ配列を図１（配列番号１）に提供し、そして
推定アミノ酸配列を図３（配列番号３）に提供する。ＤＳＰ−５代替形態をコー
ドするｃＤＮＡ配列は、図２（配列番号２）中に提供され、そして推定アミノ酸
配列が、図４（配列番号４）に提供される。ＤＳＰ−５の活性部位ＶＨＣＨＡＧ
ＶＳＲＳＶＡＩＩ（配列番号５）は、配列番号３の位置１１３〜１２６かつ配列
番号４の位置１１３〜１２６に位置する。この部位にすぐ隣接する配列情報を用
い、ヒトの脳、胸腺および精巣のｃＤＮＡを用いる５’ＲＡＣＥ反応および３’
ＲＡＣＥ反応を設計して、脳、精巣、および胸腺のＲＮＡが比較的高度に豊富で
あることを示すｍＲＮＡに対応する、１０２０塩基対ｃＤＮＡを同定した。この
ｃＤＮＡは、本明細書中で二重特異性ホスファターゼ−５、すなわち、ＤＳＰ−
５と呼ばれる、３４０アミノ酸のタンパク質をコードする。これらのＲＡＣＥ反
応はまた、脳および胸腺に存在するが、精巣に存在しないｍＲＮＡに対応する８
９７塩基対ｃＤＮＡを同定する。このｃＤＮＡは、ＤＳＰ−５代替形態として本
明細書中でいわれ、かつ３４０アミノ酸ＤＳＰ−５の５３カルボキシ末端アミノ
酸の、別個の１２アミノ酸カルボキシ末端での置換によって３４０アミノ酸ＤＳ
Ｐ−５と異なる、２９９アミノ酸のＤＳＰ−５代替形態タンパク質をコードする
。図５に示す配列比較によって示されるように、ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５
代替形態）は、他のＭＡＰキナーゼホスファターゼに対して有意な相同性を示す
。

【００５３】ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）ポリヌクレオチド改変体は一般に、
例えば、固相化学合成を含む当該分野で公知の任意の方法によって調製され得る
。ポリヌクレオチド配列の改変はまた、オリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発
（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）のような標準的な変異誘発技術を用いて導入
され得る。あるいは、ＲＮＡ分子が、ＤＳＰ−５またはＤＳＰ−５代替形態をコ
ードするＤＮＡ配列またはその部分のインビトロまたはインビボでの転写によっ
て生成され得、但し、このＤＮＡは、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター（
例えば、Ｔ７またはＳＰ６）を有するベクターに組み込まれる。特定のポリヌク
レオチドを用いて、本明細書中に記載されるように、コードされるポリペプチド
を調製し得る。さらに、あるいは、ポリヌクレオチドは、コードされるポリペプ
チドがインビボで生成されるように、患者に投与され得る。

【００５４】コード配列の少なくとも一部分に相補的であるポリヌクレオチド（例えば、ア
ンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイム）はまた、プローブまたはプライ
マーとして使用され得るか、または遺伝子発現を改変するために使用され得る。
アンチセンス薬剤としての使用のためのオリゴヌクレオチドおよびリボザイム、
ならびにそれらの標的化された送達のための遺伝子をコードするＤＮＡの同定は
、当該分野で周知の方法を含む。例えば、このようなオリゴヌクレオチドの所望
の特性、長さおよび他の特徴は、周知である。アンチセンスオリゴヌクレオチド
は、代表的には、以下のような結合を使用することによって、内因性ヌクレオチ
ド分解酵素による分解に耐えるように設計される：ホスホロチオエート結合、メ
チルホスホネート結合、スルホン結合、サルフェート結合、ケチル（ｋｅｔｙｌ
）結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロアミダイト結合、リン酸エステル
結合、および他のこのような結合（例えば、Ａｇｒｗａｌら，Ｔｅｔｒｅｈｅｄ
ｒｏｎＬｅｔｔ．２８：３５３９−３５４２（１９８７）；Ｍｉｌｌｅｒら，
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９３：６６５７−６６６５（１９７１）；Ｓｔｅ
ｃら，ＴｅｔｒｅｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．２６：２１９１−２１９４（１９８
５）；Ｍｏｏｄｙら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：４７６９−４７８
２（１９８９）；Ｕｚｎａｎｓｋｉら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（１９
８９）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４０：１３７−１４
３（１９８４）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４
：３６７−４０２（１９８５）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｌ．
Ｓｃｉ．１４：９７−１００（１９８９）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅｓ．ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆＧｅｎｅＥ
ｘｐｅｓｓｉｏｎ，Ｃｏｈｅｎ，編，ＭａｃｍｉｌｌａｎＰｒｅｓｓ，Ｌｏ
ｎｄｏｎ，頁９７−１１７（１９８９）中のＳｔｅｉｎ；Ｊａｇｅｒら，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７：７２３７−７２４６（１９８８）を参照のこと）。

【００５５】アンチセンスポリヌクレオチドは、配列特異的な様式で、核酸（例えば、ｍＲ
ＮＡまたはＤＮＡ）に結合するオリゴヌクレオチドである。相補的配列を有する
ｍＲＮＡに結合した場合、アンチセンスは、そのｍＲＮＡの翻訳を妨げる（例え
ば、米国特許第５，１６８，０５３号、Ａｌｔｍａｎら；同第５，１９０，９３
１号、Ｉｎｏｕｙｅ，同第５，１３５，９１７号、Ｂｕｒｃｈ；同第５，０８７
，６１７号、ＳｍｉｔｈおよびＣｌｕｓｅｌら（１９９３）Ｎｕｃａｌ．Ａｃｉ
ｄｓＲｅｓ．２１：３４０５−３４１１（これは、ダンベル状（ｄｕｍｂｂｅ
ｌｌ）アンチセンスオリゴヌクレオチドを記載する）を参照のこと）。３重鎖分
子とは、２重鎖ＤＮＡを結合して同一順序の（ｃｏｌｉｎｅａｒ）３重鎖分子を
形成し、それによって転写を妨げる、単一のＤＮＡ鎖をいう（例えば、米国特許
第５，１７６，９９６号、Ｈｏｇａｎら（これは、２重鎖ＤＮＡ上の標的部位に
結合する合成オリゴヌクレオチドを作製するための方法を記載する）を参照のこ
と）。

【００５６】特に有用なアンチセンスヌクレオチドおよび３重鎖分子は、ＤＳＰ−５または
ＤＳＰ−５代替形態ポリペプチドまたは内因性ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代
替形態）の発現に関する任意の他のプロセスを媒介するタンパク質をコードする
ＤＮＡまたはｍＲＮＡのセンス鎖と、そのＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形
態）ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳の阻害がもたらされるように、相
補的であるかまたは結合する分子である。アンチセンスＲＮＡへと転写され得る
ｃＤＮＡ構築物がまた、アンチセンスＲＮＡの産生を容易にするために、細胞ま
たは組織中に導入され得る。アンチセンス技術は、ポリメラーゼ、転写薬剤また
は他の調節分子の結合の妨害を介して、遺伝子発現を調節するために使用され得
る（ＨｕｂｅｒａｎｄＣａｒｒ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＩｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｉｃＡｐｐｒｏａｃｈｅｓ，ＦｕｔｕｒａＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ．（Ｍｔ．Ｋｉｓｃｏ，ＮＹ；１９９４）中のＧｅｅらを参照のこと）。あ
るいは、アンチセンス分子は、ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）遺伝子
の制御領域（例えば、プロモーター、エンハンサーまたは転写開始部位）とハイ
ブリダイズして、そしてこの遺伝子の転写をブロックするようにか；またはリボ
ソームへの転写物の結合を阻害することにより翻訳をブロックするように設計さ
れ得る。

【００５７】本発明はまた、ＤＳＰ−５−特異的リボザイムを意図する。リボザイムは、Ｒ
ＮＡ基質（例えば、ｍＲＮＡ）を特異的に切断するＲＮＡ分子であり、細胞性遺
伝子発現の特異的な阻害または妨害を生じる。ＲＮＡ鎖の切断および／または連
結に関与する、少なくとも５つの公知のクラスのリボザイムが存在する。リボザ
イムは、任意のＲＮＡ転写物に標的化され得、そしてこのような転写物を触媒作
用的に切断し得る（例えば、米国特許第５，２７２，２６２号、同第５，１４４
，０１９号；および同第５，１６８，０５３号、同第５，１８０，８１８号、同
第５，１１６，７４２号および同第５，０９３，２４６号（Ｃｅｃｈら）を参照
のこと）。任意のＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）ｍＲＮＡ特異的リ
ボザイム、またはこのようなリボザイムをコードする核酸が、ＤＳＰ−５（また
はＤＳＰ−５代替形態）遺伝子発現の阻害をもたらすために宿主細胞に送達され
得る。従って、リボザイムは、真核生物プロモーター（例えば、真核生物ウイル
スプロモーター）に連結されたリボザイムをコードするＤＮＡによって宿主細胞
に送達され得、その結果、核中への導入の際に、そのリボザイムは直接転写され
得る。

【００５８】任意のポリヌクレオチドが、インビボでの安定性を増大するためにさらに改変
され得る。可能な改変としては、これらに限定されないが、５’および／または
３’末端における隣接配列の付加；骨格におけるホスホジエステル結合以外のホ
スホロチオエート結合または２’Ｏ−メチル結合の使用；ならびに／あるいは非
伝統的（ｎｏｎｔｒａｄｉｔｏｎａｌ）塩基（例えば、イノシン、キューオシン
（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）およびワイブトシン、ならびにアセチル形態、メチル形態
、チオ形態、および他の改変された形態の、アデニン、シチジン、グアニン、チ
ミンおよびウリジン）を含むことが挙げられる。

【００５９】本明細書中に記載されるようなヌクレオチド配列は、確立された組換えＤＮＡ
技術を使用して種々の他のヌクレオチド配列と結合され得る。例えば、ポリヌク
レオチドは、種々のクローニングベクターのいずれか（プラスミド、ファージミ
ド、λファージ誘導体およびコスミドを含む）中にクローン化され得る。特定の
目的のベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター
および配列決定ベクターが挙げられる。一般に、適切なベクターは、少なくとも
１つの生物にて機能的な複製起点、都合の良い制限エンドヌクレアーゼ部位およ
び１つ以上の選択可能マーカーを含む。他のエレメントは、所望される使用に依
存し、そして当業者に明らかである。

【００６０】特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、哺乳動物の細胞中への侵入、
およびそこでの発現を可能にするように処方され得る。このような処方は、以下
の記載のような治療的目的のために特に有用である。標的細胞においてポリヌク
レオチドの発現を達成するための多く方法が存在し、そして任意の適切な方法が
利用され得ることを、当業者は理解する。例えば、ポリヌクレオチドは、周知の
技術を使用して、ウイルスベクター中に取り込まれ得る。ウイルスベクターは、
さらに、選択マーカーに関する遺伝子（形質導入された細胞の同定または選択を
補助するため）および／または標的化部分に関する遺伝子（例えば、特定の標的
細胞におけるレセプターに対するリガンドをコードする遺伝子）を移すかまた組
み込んで、そのベクターを標的特異的にし得る。標的化はまた、当業者に公知の
方法により、抗体を用いて達成され得る。

【００６１】治療目的のための他の処方としては、コロイド分散系（例えば、高分子複合体
、ナノカプセル（ｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅ）、ミクロスフェア、ビーズ）、なら
びに脂質に基づく系（水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソ
ームを含む）が挙げられる。インビトロおよびインビボでの送達ビヒクルとして
の使用のための好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工膜小胞）で
ある。このような系の調製および使用は、当該分野で周知である。

【００６２】他の局面において、ＤＳＰ−５プロモーターは、標準的技術を使用して単離さ
れ得る。本発明は、このようなプロモーター配列またはその１つ以上のシス作用
調節エレメントまたはトランス作用調節エレメントを含む、核酸分子を提供する
。このような調節エレメントは、ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）の発
現を増強し得るかまたは抑制し得る。５’隣接領域は、本明細書中に提供される
ゲノム配列に基づいて、標準的技術を使用して生成され得る。必要な場合、さら
なる５’配列が、ＰＣＲに基づく方法または他の標準的方法を使用して生成され
得る。この５’領域は、標準的な方法を使用してサブクローン化され得、そして
配列決定され得る。プライマー伸長法および／またはＲＮアーゼプロテクション
分析が使用され、ｃＤＮＡから推定される転写開始部位が確認され得る。

【００６３】プロモーター領域の境界を規定するために、種々の大きさの、推定上のプロモ
ーターインサートが、プロモーターもエンハンサーも含まない適切なレポーター
遺伝子を含む異種発現系にサブクローニングされ得る。適切なレポーター遺伝子
としては、ルシフェラーゼをコードする遺伝子、β−ガラクトシダーゼをコード
する遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺
伝子、分泌アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、またはグリーン蛍光タ
ンパク質遺伝子が挙げられ得る。適切な発現系は周知であり、そして周知の技術
を用いて調製され得るか、または市販されている。内部欠失構築物が、唯一の内
部制限部位を用いるか、または唯一ではない制限部位の部分的な消化により、生
成され得る。次いで、構築物は、高レベルのＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替
形態）発現を示す細胞にトランスフェクトされ得る。一般に、最小の５’隣接領
域がレポーター遺伝子の最も高い発現レベルを示す構築物は、プロモーターと定
義される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され得、そ
して薬剤を、ＤＳＰ−５転写を調節する能力について評価するために使用され得
る。

【００６４】一旦、機能的プロモーターが同定されると、シス作用エレメントおよびトラン
ス作用エレメントが位置決定され得る。シス作用配列は、一般に、先に特徴付け
された転写モチーフに対する相同性に基づいて、同定され得る。次いで、点変異
が、同定された配列内に生成されて、このような配列の調節の役割が評価され得
る。このような変異は、部位特異的変異誘発技術またはＰＣＲに基づくストラテ
ジーを用いて、生成され得る。次いで、変更されたプロモーターが、上記のよう
に、レポーター遺伝子発現ベクターにクローニングされ、そしてレポーター遺伝
子発現に対するこの変異の影響が評価される。

【００６５】本発明はまた、ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）の対立遺伝子改変体
ならびに他の生物由来のＤＳＰ−５配列の使用を意図する。このような配列は、
一般に、本明細書中に提供される配列に対する類似性（例えば、ハイブリダイゼ
ーション技術を用いて）に基づき、そして本明細書中に提供されるアッセイを用
いてＤＳＰ−５活性の存在に基づいて、同定され得る。

【００６６】一般に、本明細書中に記載されるようなポリペプチドおよびポリヌクレオチド
は、単離されている。「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとは
、その元の環境から取り出された、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドである
。例えば、天然に存在するタンパク質は、天然の系において共存する物質のいく
らかまたは全てから分離されている場合に、単離されている。好ましくは、この
ようなポリペプチドは、少なくとも約９０％純粋であり、より好ましくは少なく
とも約９５％純粋であり、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である
。ポリヌクレオチドは、例えば、天然の環境の一部ではないベクターにクローニ
ングされている場合に、単離されているとみなされる。

【００６７】（ＤＳＰ−５活性を検出するためのアッセイ）本発明に従って、ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）の基質は、全長チ
ロシンリン酸化タンパク質およびポリペプチドを含み得、ならびにチロシン残基
においてリン酸化され得、かつ特定の好ましい実施形態においては、セリン残基
またはスレオニン残基においてもリン酸化を受け得る、そのフラグメント（例え
ば、部分）、誘導体またはアナログを含み得る。このようなフラグメント、誘導
体およびアナログとしては、例えばＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）と
複合体を形成することによって、本明細書中に提供されるようなＤＳＰ−５（ま
たはＤＳＰ−５代替形態）と相互作用する生物学的機能を少なくとも維持する、
任意の天然に存在するＤＳＰ−５基質ポリペプチドまたは人工的に操作されたＤ
ＳＰ−５基質ポリペプチドが挙げられる。ＤＳＰ−５基質ポリペプチドのフラグ
メント、誘導体またはアナログ（融合タンパク質である基質を含む）は、以下の
いずれかであり得る：（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、保存アミノ酸残基もし
くは非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換されており、そ
してこのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝コードによりコードされてもコ
ードされなくてもよいアミノ酸残基であるもの、または（ｉｉ）１つ以上のアミ
ノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）基質ポリペプチドが別の化合物
（例えば、そのポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレ
ングリコール）、またはレポーター分子のような検出可能部分）と融合されたも
の、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸（基質のポリペプチドまたはプロタンパク
質配列の精製のために使用されるアミノ酸を含む）が基質のポリペプチドに融合
したもの。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、当業者の範囲内
であるとみなされる。好ましい実施形態において、ＭＡＰキナーゼポリペプチド
は、本明細書中に提供されるような使用のための基質である。

【００６８】ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）ポリペプチド改変体は、ＭＡＰキナ
ーゼホスファターゼ活性に適した任意のアッセイを用いて、ＤＳＰ−５活性につ
いて試験され得る。このようなアッセイは、インビトロでか、または細胞に基づ
くアッセイにおいて、実施され得る。例えば、ＭＡＰキナーゼは、本明細書中に
提供されるようなＤＳＰ−５基質として使用するために、ＵｐｓｔａｔｅＢｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＬａｋｅＰｌａｃｉｄ、ＮＹ；カタログ番号１４−
２０６）から不活化形態として得られ得る。ＭＡＰキナーゼのリン酸化は、周知
の技術（例えば、ＺｈｅｎｇおよびＧｕａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８
：１６１１６−１６１１９、１９９３により記載されるもの）を使用して、ＭＡ
ＰキナーゼキナーゼＭＥＫ−１（ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
；カタログ番号１４−２０６から入手可能）を用いて、実施され得る。

【００６９】例えば、［³²Ｐ］で放射線標識した基質（例えば、ＭＡＰキナーゼ）を、放射
線標識された活性化ＭＡＰキナーゼを生じるキナーゼ反応のために、使用し得る
。次いで、ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）ポリペプチドは、このＤＳ
Ｐ−５ポリペプチドをＭＡＰキナーゼと適切な条件下（例えば、Ｔｒｉｓ（ｐＨ
７．５）１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭジチオトレイトール、１ｍｇ／ｍＬウシ血
清アルブミン、３０℃で１０分間；またはＺｈｅｎｇおよびＧｕａｎ、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１６１１６−１６１１９、１９９３により記載される
ような）で接触させることにより、活性化ＭＡＰキナーゼを脱リン酸する能力に
ついて試験され得る。ＭＡＰキナーゼの脱リン酸は、種々のアッセイ（例えば、
連結キナーゼアッセイ（当該分野において一般的に公知の任意のアッセイを用い
て、ＭＡＰキナーゼ基質のリン酸化を評価する））のいずれかを用いるか、また
は直接的に（（１）放射性リン酸基の損失（例えば、ゲル電気泳動、続いてオー
トラジオグラフィーによる）；（２）脱リン酸の後の電気泳動移動度のシフト；
（３）ホスホチロシンまたはホスホスレオニンに対して特異的な抗体との反応性
の損失；あるいは（４）ＭＡＰキナーゼのホスホアミノ酸分析に基づく）、検出
され得る。特定のアッセイは、一般に、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ３６７：６
５１−６５４、１９９４、またはＡｌｅｓｓｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８：２０
１５−２０２０、１９９３により記載されるように実施され得る。一般に、５０
０ｐｇ〜５０ｎｇのＤＳＰ−５ポリペプチドと、１００ｎｇ〜１００μｇの活性
ＭＡＰキナーゼとの接触は、ＭＡＰキナーゼの検出可能な脱リン酸を、代表的に
は２０〜３０分以内に生じるべきである。特定の実施形態においては、０．０１
〜１０単位／ｍＬ（好ましくは約０．１単位／ｍＬであり、ここで単位とは、１
分間あたり１ｎｍｏｌの基質を脱リン酸するに十分な量である）のＤＳＰ−５ポ
リペプチドが、０．１〜１０μＭ（好ましくは約１μＭ）の活性ＭＡＰキナーゼ
と接触されて、ＭＡＰキナーゼの検出可能な脱リン酸を生じ得る。好ましくは、
ＤＳＰ−５ポリペプチドは、ＭＡＰキナーゼの脱リン酸、または相当する量のネ
イティブなヒトＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）の存在下で観察される
脱リン酸と少なくとも同程度のリン酸化基質（例えば、チロシンリン酸化ペプチ
ドおよび／またはセリンリン酸化ペプチド）を生じる。本明細書中に記載のよう
な変異をトラップする基質を使用して同定される他の基質が、このようなアッセ
イにおいてＭＡＰキナーゼと置換され得ることが、明らかである。

【００７０】（抗体および抗原結合フラグメント）ＤＳＰ−５に特異的に結合する、ペプチド、ポリペプチドおよび他の非ペプチ
ド分子もまた、本発明により意図される。本明細書中で使用される場合、ある分
子が検出可能なレベルでＤＳＰ−５と反応し、そして関連しない配列または異な
るホスファターゼの配列を含むペプチドとは検出可能に反応しない場合に、この
分子はＤＳＰ−５に「特異的に結合する」といわれる。好ましい結合分子として
は抗体が挙げられ、これは、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、単鎖、
キメラ、抗イディオタイプ、ＣＤＲ移植免疫グロブリン、またはそのフラグメン
ト（例えば、タンパク分解的に産生されたか、または組換え的に作製された免疫
グロブリンＦ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＦｄフラグメント）であり得
る。特定の好ましい抗体は、本明細書中で記載されるようなインビトロアッセイ
においてＤＳＰ−５の活性を阻害またはブロックする抗体である。抗体のＤＳＰ
−５への結合特性は、一般に、免疫検出法（例えば、酵素結合イムノソルベント
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、免疫ブロッティングなどを含む）を使用し
て評価され得、これらは当業者により容易に実施され得る。

【００７１】当該分野において周知の方法を使用して、ＤＳＰ−５に特異的な抗体、ポリク
ローナル抗血清、またはモノクローナル抗体が産生され得る。抗体はまた、所望
の特性を有するように設計された、遺伝的に操作された免疫グロブリン（Ｉｇ）
またはＩｇフラグメントとして産生され得る。例えば、例示の目的であって限定
ではないが、抗体は、第１の哺乳類種からの少なくとも１つの可変（Ｖ）領域ド
メインおよび第２の異なる哺乳類種からの少なくとも１つの定常領域ドメインを
有するキメラ融合タンパク質である抗体は組換えＩｇＧを含み得る。最も一般的
には、キメラ抗体は、マウス可変領域配列およびヒト定常領域配列を有する。こ
のようなマウス／ヒトキメラ免疫グロブリンは、マウス抗体由来の相補性決定領
域（ＣＤＲ）を移植することによって「ヒト化」され得、これは抗原への、ヒト
誘導Ｖ領域フレームワーク領域およびヒト誘導定常領域への結合特異性を与える
。これらの分子のフラグメントは、タンパク分解性消化によって、または必要に
応じて、タンパク分解性消化に続く穏やかなジスルフィド結合の還元およびアル
キル化によって産生され得る。あるいは、このようなフラグメントはまた、組換
え遺伝操作技術によって産生され得る。

【００７２】本明細書中で使用される場合、抗体が、ＤＳＰ−５に検出可能なレベルで反応
する場合、好ましくは親和性定数Ｋａが約１０⁴Ｍ^-1以上の場合、より好ましく
は約１０⁵Ｍ^-1以上の場合、より好ましくは約１０⁶Ｍ^-1以上の場合、そしてさら
により好ましくは約１０⁷Ｍ^-1以上の場合に、抗体はＤＳＰ−５ポリペプチドに
「免疫特異的」または「特異的に結合」といわれる。結合パートナーまたは抗体
の親和性は、慣習的な技術（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ５１：６６０（１９４９））に記載される方法また
は表面プラスモンレゾナンス（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃ
ａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して容易に決定され得る。例えば、Ｗｏｌｆｆら、
ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５３：２５６０−２５６５（１９９３）を参照のこと。

【００７３】抗体は、一般に、当業者に公知の種々の任意の技術によって調製され得る。例
えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ
ａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（
１９８８）を参照のこと。このような技術の１つにおいて、動物は、抗原として
ＤＳＰ−５を用いて免疫化され、ポリクローナル抗血清を産生する。適切な動物
としては、例えば、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシが挙げられ、そしてより
小さな哺乳類種（例えば、マウス、ラット、およびハムスター）または他の種も
また挙げられ得る。

【００７４】免疫原は、ＤＳＰ−５、精製されたかまたは部分的に精製されたＤＳＰ−５ポ
リペプチドまたはその改変体もしくはフラグメント（例えば、ペプチド）、ある
いはＤＳＰ−５ペプチドを発現する細胞から構成され得る。ＤＳＰ−５ペプチド
は、タンパク分解性切断によって産生され得るか、または化学的に合成され得る
。例えば、ＤＳＰ−５ポリペプチドをコードする核酸配列が本明細書中で提供さ
れ、その結果当業者は、免疫原として使用するためのこれらのポリペプチドを日
常的に調製し得る。免疫化のための有用なポリペプチドまたはペプチドはまた、
宿主動物において免疫原性応答をより作製しそうなアミノ酸配列を決定するため
に、当業者に公知の方法に従って、ＤＳＰ−５の１次、２次、および３次構造を
分析することによって選択され得る。例えば、Ｎｏｖｏｔｎｙ、１９９１Ｍｏ
ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２０１−２０７：Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、１９８５
Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：９３２−４０を参照のこと。

【００７５】動物への注射のための免疫原の調製は、ＤＳＰ−５ポリペプチド（またはその
改変体もしくはフラグメント）の、別の免疫原性タンパク質（例えば、キーホー
ルリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のよ
うなキャリアタンパク質）への共有結合を含み得る。さらに、免疫原として使用
されるＤＳＰ−５ペプチド、ポリペプチド、またはＤＳＰ−５発現細胞は、アジ
ュバント中で乳濁化され得る。例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照のこと。一般に、最初の注射
の後に、動物は、特に抗原、アジュバント（存在する場合）、および／または特
定の動物種に従って変化し得る好ましいスケジュールに従って、１つ以上のブー
スタ免疫化を受ける。免疫応答は、特異的抗体力価を決定するために、動物を定
期的に出血させ、集めた血液から血清を分離し、そしてこの血清を免疫アッセイ
（例えばＥＬＩＳＡまたはオクタロニー拡散アッセイなど）において分析するこ
とによってモニターされ得る。一旦、抗体力価が確立されると、動物は、ポリク
ローナル抗血清を集めるために、定期的に出血され得る。次いで、ＤＳＰ−５ポ
リペプチドまたはペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体は、このよう
な抗血清から精製（例えば、プロテインＡまたは適切な固体支持体に固定された
ＤＳＰ−５ポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって）
され得る。

【００７６】ＤＳＰ−５ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体に特異的に結
合するモノクローナル抗体、および所望の結合特異性を有するモノクローナル抗
体を産生する不死の真核生物細胞株のハイブリドーマもまた、例えば、Ｋｏｈｌ
ｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７；１９７
６Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６））の技術お
よびその改善方法を使用して調製され得る。動物（例えば、ラット、ハムスター
、または好ましくはマウス）は、上記のように調製されたＤＳＰ−５免疫原で免
疫化される。抗体形成細胞、代表的には脾臓細胞を含むリンパ細胞は、免疫化動
物から得られ、そして薬物感作骨髄腫（例えば、プラズマ細胞腫）細胞融合パー
トナー（好ましくは、免疫化動物と同系、そして必要に応じて他の所望の性質（
例えば、内因性Ｉｇ遺伝子産物の発現能力を有さない）を有するパートナー）と
の融合によって不死化され得る。リンパ（例えば、脾臓）細胞および骨髄腫細胞
は、膜融合促進剤（例えば、ポリエチレングリコールまたは非イオン性界面活性
剤）と数分間結合され得、次いでハイブリド−マ細胞の増殖を支持するが、骨髄
腫細胞を融合しない選択培地上で低密度でプレートされ得る。好ましい選択培地
は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）である。十分な時間
（普通約１〜２週間）の後に、細胞のコロニーのが観測される。１つのコロニー
を単離し、この細胞によって産生される抗体が、ＤＳＰ−５ポリペプチドまたは
その改変体もしくはフラグメントに対する結合活性について試験され得る。高い
親和性およびＤＳＰ−５抗原に対して特異的であるモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマが好ましい。従って、ＤＳＰ−５ポリペプチドまたはその改変
体もしくはフラグメントに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマは、本発明によって意図される。

【００７７】モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物の上清から単離され得る。マウ
スモノクローナル抗体の産生の代替方法は、同系マウス（例えば、このモノクロ
ーナル抗体を含む腹水の形成を促進するために処置された（例えば、プリスタン
刺激された）マウス）の腹腔にこのハイブリドーマ細胞を注射することである。
従来技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈澱、抽出など）によって
、引き続き（通常は１〜３週間以内）得られた腹水から、汚染物質が除去され得
る。例えば、抗体は、このモノクローナル抗体の特定の性質（例えば、重鎖また
は軽鎖イソタイプ、結合特異性など）に基づいて選択された適切なリガンドを使
用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。固体支持体に
固定される適切なリガンドの例としては、プロテインＡ、プロテインＧ、抗定常
領域（軽鎖または重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体およびＤＳＰ−５ポリペプ
チドまたはそのフラグメントもしくは改変体が挙げられる。

【００７８】ヒトモノクローナル抗体は、当業者が精通した多数の技術によって産生され得
る。このような方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ヒト
抹消血球（例えば、Ｂリンパ球を含む）のエプステイン−バーウイルス（ＥＢＶ
）形質転換、ヒトＢ細胞のインビトロ免疫化、酵母人工クロモソーム（ＹＡＣ）
によって挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する免疫化トランスジェニ
ックマウスからの脾臓細胞の融合、ヒト免疫グロブリンＶ領域ファージライブラ
リーからの単離、または本明細書中の開示に基づく当該分野で公知の他の手順。

【００７９】例えば、ヒトモノクローナル抗体を産生するための１つの方法としては、ＥＢ
Ｖ形質転換によるヒト抹消血球の不死化が挙げられる。例えば、米国特許第４，
４６４，４５６号を参照のこと。ＤＳＰ−５ポリペプチド（またはその改変体も
しくはフラグメント）に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する不死化
細胞株は、本明細書中で提供されるような免疫検出法（例えば、ＥＬＩＳＡ）に
よって同定され、次いで標準的クローニング技術によって単離され得る。ヒトモ
ノクローナル抗体を産生するための別の方法は、ヒト脾臓Ｂ細胞を抗原で刺激し
、続いて刺激されたＢ細胞の異種ハイブリッド融合パートナーとの融合を含む、
インビトロ免疫化である。例えば、Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１４７：８６−９５を参照のこと。

【００８０】本発明における使用のためのヒトＤＳＰ−５特異的モノクローナル抗体および
ポリクローナル抗血清の産生のためのさらに別の方法は、トランスジェニックマ
ウスに関連する。例えば、米国特許第５，８７７，３９７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａ
ｎｎら、１９９７Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５−
５８；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９５Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．７６４：５２５−３５を参照のこと。これらのマウスにおいて、ヒト免疫グロ
ブリン重鎖および軽鎖遺伝子は、遺伝操作によって生殖系列配列に人工的に導入
され、そして内因性マウス免疫グロブリン遺伝子は不活性化される。例えば、Ｂ
ｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９９７Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．８：４５５−５８を参照のこと。例えば、ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、
ミニ遺伝子構築物であり得るか、または酵母人工クロモソームのトランス遺伝子
座であり得、これはマウスリンパ組織におけるＢ細胞特異的ＤＮＡ転位および過
剰変異を起こす。例えば、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９９７Ｃｕｒｒ．Ｏｐ
ｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５−５８を参照のこと。ＤＳＰ−５に特
異的に結合するヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニック動物の免疫化、
脾臓細胞の骨髄腫での融合、上記のような抗体を産生する細胞の選択およびクロ
ーニングによって得られ得る。ヒト抗体を含むポリクローナル血清はまた、免疫
化動物の血液から得られる。

【００８１】ＤＳＰ−５（ヒト化抗体を含む）に特異的なキメラ抗体はまた、本発明に従っ
て産生され得る。キメラ抗体は、第１の哺乳類種由来の少なくとも１つの定常領
域ドメインおよび第２の異なる哺乳類種由来の少なくとも１つの可変領域ドメイ
ンを有する。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−５５を参照のこと。好ましい実施形
態において、キメラ抗体は、マウス、ラット、またはハムスターのモノクローナ
ル抗体由来の可変領域のような非ヒトモノクローナル抗体由来の少なくとも１つ
の可変領域ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を、少なくとも１つのヒ
ト定常領域をコードする核酸配列を含むベクターにクローニングすることによっ
て構築され得る。例えば、Ｓｈｉｎら、１９８９ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍ
ｏｌ．１７８：４５９−７６；Ｗａｌｌｓら、１９９３ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓＲｅｓ．２１：２９２１−２９を参照のこと。例示目的として、マウス
モノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列は、ヒト
κ軽鎖定常領域配列をコードする核酸配列を含むベクターに挿入され得る。別個
のベクターにおいて、モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌク
レオチド配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域をコードする配列を有するフレームにク
ローンされ得る。選択された特定のヒト定常領域は、特定の抗体に対して所望さ
れるエフェクター機能に依存し得る（例えば、相補的固定、特定のＦｃレセプタ
ーへの結合など）。キメラ抗体を産生するための、当該分野で公知の別の方法は
、相同組換え（例えば、米国特許第５，４８２，８５６号）である。好ましくは
、ベクターは、キメラ抗体の安定した発現のために、真核生物細胞にトランスフ
ェクトされる。

【００８２】非ヒト／ヒトキメラ抗体は、「ヒト化」抗体を作製するために、さらに遺伝操
作され得る。このようなヒト化抗体は、非ヒト哺乳類種の免疫グロブリン由来の
複数のＣＤＲ、少なくとも１つのヒト可変フレームワーク領域、および少なくと
も１つのヒト免疫グロブリン定常領域を含み得る。特定の実施形態におけるヒト
化は、例えば、ＤＳＰ−５結合可変領域が得られる非ヒトモノクローナル抗体、
またはこのようなＶ領域および上記のような少なくとも１つのヒトＣ領域を有す
るキメラ抗体のいずれかと比較した場合に、ＤＳＰ−５に対する減少した結合親
和性を有する抗体を提供し得る。従って、ヒト化抗体の設計について有用な計略
は、例えば、例示目的であって限定ではないが、キメラ抗体の非ヒトフレームワ
ーク領域に最も相同的なヒト可変フレームワーク領域の同定が挙げられ得る。理
論に束縛されることは望まないが、このような計略は、ヒト化抗体がＤＳＰ−５
に対する特異的結合親和性を保持している可能性を増加し得、いくつかの好まし
い実施形態において、これはＤＳＰ−５ポリペプチドまたはその改変体もしくは
フラグメントに対して実質的に同じ親和性であり得、そして他の特定の好ましい
実施形態において、これはＤＳＰ−５に対してより大きな親和性であり得る。例
えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−２５；Ｒｉｅ
ｃｈｍａｎｎら、１９８８Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−２７を参照のこと
。従って、このようなヒト化抗体の設計は、非ヒト可変領域のＣＤＲループ構造
および構造決定因子の決定（例えば、コンピュータモデリングによる）、次いで
このＣＤＲループおよび決定因子の、公知のヒトＣＤＲループ構造および決定因
子との比較を含み得る。例えば、Ｐａｄｌａｎら、１９９５ＦＡＳＥＢ９：
１３３−３９；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９Ｎａｔｕｒｅ、３４２：３７７−
３８３を参照のこと。コンピュータモデリングはまた、非ヒト可変領域での配列
相同性によって選択されたヒト構造テンプレートを比較するために使用され得る
。例えば、Ｂａｊｏｒａｔｈら、１９９５Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：９
５−１０３；ＥＰ−０５７８５１５−Ａ３を参照のこと。非ヒトＣＤＲのヒト化
が結合親和性の減少を生じる場合、コンピュータモデリングは、親和性を部分的
に、完全に、または超えて最適に（すなわち、非ヒト化抗体よりも高いレベルま
で増加）回復させるために、部位指向的または他の突然変異誘発技術によって変
化され得る特異的アミノ酸残基の同定を援助し得る。当業者はこれらの技術に精
通しており、そしてこのような設計計略についての多くの変化および改変を容易
に理解する。

【００８３】特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントの使用が好ましくあり
得る。このようなフラグメントには、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）₂
フラグメントが含まれ、これは、それぞれパパインまたはペプシンでのタンパク
分解性消化によって調製され得る。抗原結合フラグメントは、例えば、固定化プ
ロテインＡまたはプロテインＧ、あるいは固定化ＤＳＰ−５ポリペプチド、ある
いはその適切な改変体またはフラグメントを使用するアフィニティークロマトグ
ラフィーによってＦｃフラグメントから分離され得る。当業者は、日常的にかつ
過度の実験なしで、例えば、本明細書中で提供される免疫検出法を使用して、得
られた親和性精製抗体の特徴に基づく適切な改変体またはフラグメントを決定し
得る。Ｆａｂフラグメントを産生するための代替方法としては、Ｆ（ａｂ’）₂
フラグメントの穏やかな還元に続くアルキル化が挙げられる。例えば、Ｗｉｅｒ
、ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
、１９８６、ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｓｔｏｎを参照
のこと。

【００８４】特定の実施形態に従って、上記のＩｇ分子の任意の非ヒト、ヒト、またはヒト
化重鎖および軽鎖の可変領域は、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチドフラグメント
（単鎖抗体）として構築され得る。例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３を参照のこと。多機
能性ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖポリペプチドインフレームをコードするポ
リヌクレオチド配列の、種々の任意の公知のエフェクタータンパク質をコードす
る少なくとも１つのポリヌクレオチド配列への結合によって産生され得る。これ
らの方法は、当該分野で公知であり、そして例えばＥＰ−Ｂ１−０３１８５５４
、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号、および
米国特許第５，４７６，７８６号に開示される。例示の目的として、エフェクタ
ータンパク質は、免疫グロブリン定常領域配列を含み得る。例えば、Ｈｏｌｌｅ
ｎｂａｕｇｈら、１９９５Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１８８：１
−７を参照のこと。エフェクタータンパク質の他の例は酵素である。非限定的な
例として、このような酵素は、治療目的のための生物学的活性を提供し得る（例
えば、Ｓｉｍｅｒｓら、１９７７Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．８：５１０
−１９を参照のこと）か、または多くの任意の周知の基質から検出可能な産物へ
の、診断的使用のためのホースラディッシュペルオキシダーゼ触媒変換のような
、検出可能な活性を提供し得る。ｓＦｖ融合タンパク質のさらに他の例としては
、Ｉｇ−毒素融合、または免疫毒素が挙げられ、ここで、ｓＦｖポリペプチドは
毒素に結合される。適切な条件下で、細胞に対して毒性であることが同定された
広範な種々のポリペプチド配列を、当業者は理解する。本明細書中で使用される
場合、免疫グロブリン−毒素融合タンパク質に包含される毒性ポリペプチドは、
例えば、生活機能での直接干渉によってかまたはアポトーシス誘導によって、細
胞の生存を損なう様式で細胞内に導入され得る任意のポリペプチドであり得る。
従って、毒素は、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒
素Ａ、植物ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、Ｂｒｙｏｎｉａｄｉｏｉｃａからの
ブリオジン（ｂｒｙｏｄｉｎ）などのようなリボソーム不活性化タンパク質が挙
げられ得る。例えば、Ｔｈｒｕｓｈら、１９９６Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１４：４９−７１；Ｆｒａｎｋｅｌら、１９９６ＣａｎｃｅｒＲｅ
ｓ．５６：９２６−３２を参照のこと。化学治療剤、抗有糸分裂剤、抗体、アポ
トーシス誘導因子（または「アポトーゲン（ａｐｏｐｔｏｇｅｎ）」、例えばＧ
ｒｅｅｎおよびＲｅｅｄ、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８１：１３０９−１３
２１を参照のこと）などを含む多数の他の毒素は、当業者に公知であり、そして
本明細書中に提供される例は、本発明の範囲および精神を限定することのない例
示として意図される。

【００８５】特定の実施形態において、ｓＦｖは、融合タンパク質と抗原（例えば、ＤＳＰ
−５）との間の特異的結合の検出を可能にするペプチドまたはポリペプチドドメ
インに融合され得る。例えば、この融合ポリペプチドドメインは、親和性タグポ
リペプチドであり得る。従って、結合パートナー（例えば、ＤＳＰ−５）へのｓ
Ｆｖ融合タンパク質の結合は、当業者が精通する任意の種々の技術によって、ア
ビジン、ストレプトアビジンまたはＨｉｓ（例えば、ポリヒスチジン）タグのよ
うな親和性ポリペプチドまたはペプチドタグを使用して検出され得る。検出技術
はまた、例えば、アビジンまたはストレプトアビジン融合タンパク質の、ビオチ
ンまたはビオチン模倣配列への結合（例えば、Ｌｕｏら、１９９８Ｊ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ．６５：２２５およびそこに列挙される参考文献を参照のこと）
、検出可能な部分（例えば、標識部分）を有する融合タンパク質の直接共有結合
的改変、特異的標識化レポーター分子への融合タンパク質の非共有結合、酵素活
性を有する部分を含む融合タンパク質による検出可能な基質の酵素的改変、また
は融合タンパク質の固相支持体への固定（共有結合または非共有結合）を含み得
る。

【００８６】従って、所望の親和性特性を有するエフェクターペプチドのような別のポリペ
プチドに融合した、ＤＳＰ−５特異的免疫グロブリン誘導ポリペプチドを含む本
発明のｓＦｖタンパク質は、例えば、エフェクターペプチドがグルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼのような酵素である融合タンパク質を含み得る。別の例と
して、ｓＦｖ融合タンパク質はまた、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅ
ｕｓプロテインＡポリペプチドに融合されたＤＳＰ−５特異的Ｉｇポリペプチド
を含み得；核酸をコードするプロテインＡおよび免疫グロブリン定常領域に対し
て親和性を有する融合タンパク質の構築におけるその用途は、一般に、例えば米
国特許第５，１００，７８８号に開示される。ｓＦｖ融合タンパク質の構築に有
用な他の親和性ポリペプチドは、例えばＷＯ８９／０３４２２；米国特許第５，
４８９，５２８号；米国特許第５、６７２、６９１号；ＷＯ９３／２４６３１；
米国特許第５，１６８，０４９号；米国特許第５，２７２，２５４号およびその
他の個所に開示されるストレプトアビジン融合タンパク質、ならびにアビジン融
合タンパク質（例えば、ＥＰ５１１，７４７を参照のこと）を含み得る。本明
細書中で提供されるように、ｓＦｖポリペプチド配列は、全長融合ポリペプチド
を含み得そして代替的にその改変体またはフラグメントを含み得るエフェクター
タンパク質配列を含む、融合ポリペプチド配列に融合され得る。

【００８７】ＤＳＰ−５ポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントに特異的に結
合する抗体を選択するためのさらなる方法は、ファージディスプレイである。例
えば、Ｗｉｎｔｅｒら、１９９４Ａｎｎｕｌ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２
：４３３−５５；Ｂｕｒｔｏｎら、１９９４Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：
１９１−２８０を参照のこと。ヒトまたはマウスの免疫グロブリン可変領域遺伝
子コンビナトリアルライブラリーは、ＤＳＰ−５ポリペプチドまたはその改変体
もしくはフラグメントに特異的に結合するＩｇフラグメント（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓ
Ｆｖまたはこれらのマルチマー）を選択するためにスクリーニングされ得るファ
ージベクターにおいて作製され得る。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号
；Ｈｕｓｅら、１９８９Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−８１；Ｋａｎｇ
ら、１９９１Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：４３６
３−６６；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９２Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２
２７：３８１−３８８；Ｓｃｈｌｅｂｕｓｃｈら、１９９７Ｈｙｂｒｉｄｏｍ
ａ１６：４７−５２およびこれらに列挙される参考文献を参照のこと。例えば
、Ｉｇ可変領域フラグメントをコードする複数のポリヌクレオチド配列を含むラ
イブラリーは、Ｍ１３またはその改変体のような糸状のバクテリオファージの遺
伝子に、Ｍ１３融合タンパク質を作製するために、例えばＭ１３の遺伝子ＩＩＩ
または遺伝子ＶＩＩＩのようなファージコートタンパク質をコードする配列を用
いて、インフレームで挿入され得る。融合タンパク質は、コートタンパク質と軽
鎖可変領域ドメインおよび／または重鎖可変領域ドメインとの融合物であり得る
。

【００８８】特定の実施形態に従って、免疫グロブリンＦａｂフラグメントはまた、以下の
ようにファージ粒子上に提示され得る。Ｉｇ定常領域ドメインをコードするポリ
ヌクレオチド配列は、コートタンパク質を用いてインフレームでファージゲノム
に挿入され得る。従って、このファージコート融合タンパク質は、Ｉｇ軽鎖また
は重鎖フラグメント（Ｆｄ）と融合され得る。例えば，ヒトＩｇライブラリーか
ら、ヒトκ定常領域をコードするポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つのフ
ァージコートタンパク質をコードする配列を用いて、インフレームでベクターに
挿入され得る。さらに、または代替的に、ヒトＩｇＧ１ＣＨ１ドメインをコー
ドするポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つの他のファージコートタンパク
質をコードする配列を用いて、インフレームで挿入され得る。次いで、可変領域
ドメインをコードする複数のポリヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡライブラリ
ー由来の）は、バクテリオファージコートタンパク質に融合するＦａｂフラグメ
ントを発現するために、定常領域コートタンパク質融合物を用いて、インフレー
ムでベクターに挿入され得る。

【００８９】ＤＳＰ−５ポリペプチドに結合するＩｇフラグメント（例えば、ＩｇＶ領域
またはＦａｂ）を表示するファージは、このファージライブラリーをＤＳＰ−５
またはその改変体もしくはフラグメントと混合することによって、あるいはこの
ファージライブラリーを、結合するのに十分な条件下および時間で固体マトリッ
クス上に固定されたＤＳＰ−５ポリペプチドに接触させることによって、選択さ
れ得る。非結合ファージは、洗浄液によって除去され、この洗浄液は代表的には
低濃度の塩（例えば、ＮａＣｌ）、好ましくは１００ｍＭ未満のＮａＣｌ、より
好ましくは５０ｍＭ未満のＮａＣｌ、最も好ましくは１０ｍＭ未満のＮａＣｌを
含む緩衝液であり得るか、または塩を含まない緩衝液であり得る。次いで、特異
的に結合したファージは、ＮａＣｌ含有緩衝液で溶出される（例えば、段階的様
式で塩濃度を増加させることによって）。代表的には、高親和性でＤＳＰ−５に
結合するファージは、開放するのにより高い塩濃度を必要とする。溶出されたフ
ァージは、適切な細菌性宿主に伝播され得、そして一般に、ＤＳＰ−５特異的免
疫グロブリンを発現するファージの収量を増加させるために、ＤＳＰ−５結合お
よび溶出の連続的ラウンドが繰り返され得る。コンビナトリアルファージライブ
ラリーはまた、非ヒト可変領域のヒト化のために使用され得る。例えば、Ｒｏｓ
ｏｋら、１９９６Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−１８；Ｒａ
ｄｅｒら、１９９８Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：
８９１０−１５を参照のこと。このようにして選択されたファージ中に挿入され
た免疫グロブリン遺伝子のＤＮＡ配列は、標準的技術によって決定され得る。Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、１９８９ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰ
ｒｅｓｓを参照のこと。次いで、親和性選択されたＩｇコード配列は、Ｉｇフラ
グメントの発現のために別の適切なベクター内にクローニングされ得るか、また
は必要に応じて、免疫グロブリン全体の鎖の発現のために、Ｉｇ定常領域を含む
ベクターにクローニングされ得る。

【００９０】ファージディスプレイ技術はまた、ＤＳＰ−５に結合するポリペプチド、ペプ
チドまたは単鎖抗体を選択するために使用され得る。このようなペプチドまたは
抗体をコードする候補核酸分子（例えば、ＤＮＡ）が挿入され得るマルチクロー
ニング部位を有する適切なベクターの例として、ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙｒら、Ｇ
ｅｎｅ１２８：２９−３６、１９９３；Ｓｃｏｔｔら、１９９０Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ２４９：３８６−３９０；Ｓｍｉｔｈら、１９９３ＭｅｔｈｏｄｓＥ
ｎｚｙｍｏｌ．２１７：２２８−２５７；Ｆｉｓｃｈら、１９９６、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：７７６１−６６を参照のこと。挿
入されたＤＮＡ分子は、ランダムに産生された配列を含み得るか、または本明細
書中で提供されるようなＤＳＰ−５ポリペプチドまたはその改変体もしくはフラ
グメントに特異的に結合する公知のペプチドまたはポリペプチドドメインの改変
体をコードし得る。一般に、核酸挿入物は、６０アミノ酸までのペプチド、より
好ましくは３〜３５アミノ酸のペプチド、そしてさらにより好ましくは６〜２０
アミノ酸のペプチドをコードする。挿入された配列によってコードされるペプチ
ドは、バクテリオファージの表面に表示される。ＤＳＰ−５ポリペプチドに対す
る結合ドメインを発現するファージは、上記のような固定されたＤＳＰ−５ポリ
ペプチドへの特異的結合に基づいて選択され得る。本明細書中で提供される場合
、周知の組換え遺伝技術は、そのフラグメントを含む融合タンパク質を構築する
ために使用され得る。例えば、産生され得るポリペプチドは、得られた産物のＤ
ＳＰ−５に対する結合親和性を最大にするために、２つ以上の同様な、または異
なる親和性選択されたＤＳＰ−５結合ペプチドドメインのタンデムアレイを含む
。

【００９１】他の特定の実施形態において、本発明は、マルチマー抗体フラグメントである
ＤＳＰ−５特異的抗体を意図する。有用な方法論は、一般に、例えばＨａｙｄｅ
ｎら、１９９７、ＣｕｒｒＯｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２０１−１２；Ｃ
ｏｌｏｍａら、１９９７Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９−６３
に記載される。例えば、マルチマー抗体フラグメントは、ミニ抗体（ｍｉｎｉａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（米国特許第５，９１０，５７３号）またはディアボディ
（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９７、ＣａｎｃｅｒＩｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４５：１２８−１３０）を形成するための
ファージ技術によって作製され得る。ＤＳＰ−５特異的Ｆｖのマルチマーまたは
異なる高原特異性を有する第２のＦｖに非共有結合的に会合したＤＳＰ−５特異
的Ｆｖを含む二特異的抗体であるマルチマーフラグメントが、産生され得る。例
えば、Ｋｏｅｌｅｍｉｊら、１９９９Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２２：５１
４−２４を参照のこと。別の例として、マルチマー抗体は、２つの単鎖抗体また
はＦａｂフラグメントを有する二特異的抗体を含み得る。特定の関連した実施形
態に従って、第１のＩｇフラグメントは、ＤＳＰ−５ポリペプチド（またはその
改変体もしくはフラグメント）上の第１抗原性決定因子に特異的であり得、一方
第２Ｉｇフラグメントは、ＤＳＰ−５ポリペプチドの第２抗原性決定因子に特異
的であり得る。あるいは、他の特定の関連した実施形態において、第１免疫グロ
ブリンフラグメントは、ＤＳＰ−５ポリペプチドまたはその改変体もしくはフラ
グメント上の抗原性決定因子について特異的であり得、そして第２の免疫グロブ
リンフラグメントは、第２の異なる（すなわち、非ＤＳＰ−５）分子上の抗原性
決定因子について特異的であり得る。ＤＳＰ−５に特異的に結合する二特異的抗
体もまた意図され、ここで少なくとも１つの抗原結合ドメインは、融合タンパク
質として存在する。

【００９２】ＤＳＰ−５結合免疫グロブリン分子へのアミノ酸変異の導入は、ＤＳＰ−５に
対する特異性または親和性を増加するために、あるいはエフェクター機能を変え
るために有用であり得る。ＤＳＰ−５に対する高い親和性を有する免疫グロブリ
ンは、特定の残基の部位指向突然変異によって産生され得る。コンピュータに補
助される３次元分子モデリングは、ＤＳＰ−５ポリペプチドに対する親和性を改
善するために、変化されるべきアミノ酸残基を同定するために使用され得る。例
えば、Ｍｏｕｎｔａｉｎら、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅ
ｎｇ．１０：１−１４２を参照のこと。あるいは、ＣＤＲのコンビナトリアルラ
イブラリーは、Ｍ１３ファージにおいて産生され得、そして改善された親和性を
有する免疫グロブリンフラグメントについてスクリーニングされる。例えば、Ｇ
ｌａｓｅｒら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３９０３−３９１３；
Ｂａｒｄａｓら、１９９４Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９１：３８０９−１３；米国特許第５，７９２，４５６号を参照のこと。

【００９３】エフェクター機能はまた、部位指向突然変異によって変化され得る。例えば、
Ｄｕｎｃａｎら、１９８８Ｎａｔｕｒｅ３３２：５６３−６４；Ｍｏｒｇａ
ｎら、１９９５Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ８６：３１９−２４；Ｅｇｈｔｅｄａ
ｒｚｅｄｅｈ−Ｋｏｎｄｒｉら、１９９７Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２３
：８３０−３４を参照のこと。例えば、免疫グロブリンのＦｃタンパク質上のグ
リコシル化部位の突然変異は、免疫グロブリンが相補鎖に固定する能力を変化し
得る。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、１９９７ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．１５：２６−３２を参照のこと。定常領域ドメインにおける他の突然変異は
、免疫グロブリンが相補鎖に固定する能力を変化し得るか、または抗体依存性細
胞傷害性の効果を変化し得る。例えば、Ｄｕｎｃａｎら、１９８８Ｎａｔｕｒ
ｅ３３２：５６３−６４；Ｍｏｒｇａｎら、１９９５Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
８６：３１９−２４；Ｓｅｎｓｅｌら、１９９７Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
３４：１０１９−２９を参照のこと。

【００９４】本明細書中に記載されるＤＳＰ−５に特異的に結合する抗体またはそのフラグ
メントをコードする核酸分子は、核酸切除、連結、形質転換およびトランスフェ
クションのための任意の種々の周知の手順に従って、伝播されそして発現され得
る。従って、特定の実施形態において、抗体フラグメントの発現は、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉのような原核生物宿主において好ましくあり得る（例え
ば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎら、１９８９ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１７
８：４９７−５１５を参照のこと）。他の特定の実施形態において、抗体または
そのフラグメントの発現は、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅおよ
びＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、動物細胞（哺乳動物細胞を含む）または
植物細胞を含む真核生物宿主細胞において好ましくあり得る。適切な動物細胞の
例としては、限定ではないが、骨髄腫、ＣＯＳ，ＣＨＯ、またはハイブリドーマ
細胞が挙げられる。植物細胞の例としては、タバコ、トウモロコシ、ダイズ、お
よびイネの細胞が挙げられる。当業者に公知の手法に従って、そして本開示に基
づいて、核酸ベクターは、特定の宿主系において外来配列を発現するために設計
され得、次いでＤＳＰ−５結合抗体（またはそのフラグメント）をコードするポ
リヌクレオチド配列が挿入され得る。調節エレメントは、特定の宿主に従って変
化する。

【００９５】本明細書中に記載されるＤＳＰ−５結合免疫グロブリン（またはそのフラグメ
ント）は、酵素、細胞傷害剤、または他のレポーター分子（色素、放射性核種、
発光基、蛍光基、またはビオチンなどを含む）のような検出可能な部位または標
識を含み得る。ＤＳＰ−５特異的免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、診
断または治療の適用のために、放射標識され得る。抗体の放射標識のための技術
は、当該分野で公知である。例えば、Ａｄａｍｓ１９９８ＩｎＶｉｖｏ
１２：１１−２１；Ｈｉｌｔｕｎｅｎ１９９３ＡｃｔａＯｎｃｏｌ．３２
：８３１−９を参照のこと。治療適用は、以下に詳細に記載され、そして他の治
療剤と組合わせてＤＳＰ−５結合抗体（またはそのフラグメント）の使用を含み
得る。抗体またはフラグメントはまた、当該分野で公知のそして本明細書中で提
供される細胞傷害剤（例えば、リボソーム不活性化タンパク質のような毒素、化
学治療剤、抗縮瞳剤、抗生物質など）と組合わされ得る。

【００９６】本発明はまた、本明細書中で提供されるＤＳＰ−５またはその改変体もしくは
フラグメントに特異的に結合する抗体（またはその抗原結合フラグメント）を認
識する抗イディオタイプ抗体の産生を意図する。抗イディオタイプ抗体は、免疫
原として抗ＤＳＰ−５抗体（またはその抗原結合フラグメント）を使用し本明細
書中に記載される方法によって、ポリクローナル抗体として、またはモノクロー
ナル抗体として産生され得る。抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントは
また、上記の任意の組換え遺伝操作法によってか、またはファージディスプレイ
選択によって産生され得る。抗イディオタイプ抗体は、抗ＤＳＰ−５抗体のＤＳ
Ｐ−５ポリペプチドへの結合が競合的に阻害されるように、抗ＤＳＰ−５抗体の
抗原結合部位と反応し得る。あるいは、本明細書中で提供される抗イディオタイ
プ抗体は、抗ＤＳＰ−５抗体のＤＳＰ−５ポリペプチドへの結合を競合的に阻害
しなくてもよい。

【００９７】本明細書中で提供され、そして当該分野で周知の方法論に従って、ポリクロー
ナルおよびモノクローナル抗体は、ＤＳＰ−５ポリペプチドの親和性単離のため
に使用され得る。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら、ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＡ
ｆｆｉｎｉｔｙＬｉｇａｎｄＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｄｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．ＮｅｗＹｏｒｋ、１９９２を参照のこと。手短に言うと
、抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、固体支持体材料上に固定化され
得、次いで、この支持体材料は目的のポリペプチド（例えば、ＤＳＰ−５）を含
むサンプルと接触される。サンプルの残りからの分離に続いて、次いでこのポリ
ペプチドは、固定化された抗体から放出される。

【００９８】（ＤＳＰ−５発現を検出するための方法）本発明の特定の局面は、診断およびアッセイの目的のために、ＤＳＰ−５また
はＤＳＰ−５代替形態に対して惹起された抗体またはハイブリダイズするポリヌ
クレオチドを使用する方法を提供する。特定のアッセイは、ＤＳＰ−５またはＤ
ＳＰ−５代替形態、またはそのタンパク質分解フラグメントの存在または非存在
を検出するために抗体または他の薬剤を使用することを含む。あるいは、ＤＳＰ
−５またはＤＳＰ−５代替形態をコードする核酸は、標準的なハイブリダイゼー
ションおよび／またはＰＣＲ技術を使用して検出され得る。適切なプローブおよ
びプライマーは、本明細書に提供されるＤＳＰ−５ｃＤＮＡ配列および／また
はＤＳＰ−５代替形態ｃＤＮＡ配列に基づいて、当業者によって設計され得る。
アッセイは、一般的に、真核生物細胞、細菌、ウイルス、このような生物から調
製された抽出物および生きている生物において見出される流体のような生物学的
供給源から得られる種々のサンプルのいずれかを使用して行われ得る。患者から
得られ得る生物学的サンプルには、血液サンプル、生検検体、組織外植片、器官
培養物および他の組織または細胞調製物が挙げられる。患者または生物学的供給
源は、ヒトまたは非ヒト動物、初代細胞培養物または培養適合細胞株であり得、
これには、遺伝的に操作された細胞株（染色体的に組み込まれた組換え核酸配列
またはエピソーム組換え核酸配列を含み得る）、不死化または不死化可能細胞株
、体細胞ハイブリッド細胞株、分化した細胞株または分化可能な細胞株、形質転
換された細胞株などが挙げられるが、これらに限定されない。特定の好ましい実
施形態において、患者または生物学的供給源は、ヒトであり、特に好ましい実施
形態において、生物学的供給源は、哺乳動物である非ヒト動物（例えば、ゲッ歯
動物（例えば、マウス、ラット、ハムスターなど）、有蹄動物（例えば、ウシ）
または非ヒト霊長類）である。本発明の特定の他の好ましい実施形態において、
患者は、変化した細胞シグナル伝達と関連した疾患を有すると疑われ得るかまた
はその危険があると疑われ得るか、あるいは、疾患のような危険がないかまたは
その存在がないことが既知であり得る。

【００９９】ＤＳＰ−５またはＤＳＰ−５代替形態タンパク質を検出するために、試薬は代
表的には抗体であり、この抗体は、本明細書中に記載されるように調製され得る
。サンプル中のポリぺプチドを検出するための抗体を使用するための、当業者に
公知の種々のアッセイ形式がある。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。例え
ば、このアッセイは、ウェスタンブロット形式で実行され得、この形式において
、生物学的サンプルからのタンパク質調製物を、ゲル電気泳動により分離し、適
切な膜にトランスファーし、そして抗体と反応させる。次いで、膜上の抗体の存
在は、以下に記載されるような適切な検出試薬を用いて検出され得る。

【０１００】別の実施形態において、アッセイは、固体支持体上に固定された抗体を使用し
、標的ＤＳＰ−５またはＤＳＰ−５代替形態に結合させ、そしてサンプルの残り
から取り除くことを包含する。次いで結合されたＤＳＰ−５またはＤＳＰ−５代
替形態は、レポーター基を含む第２の抗体または試薬を用いて検出され得る。あ
るいは、競合アッセイが利用され得る。この競合アッセイにおいて、ＤＳＰ−５
ポリぺプチド（またはＤＳＰ−５代替形態ポリペプチド）を、レポーター基で標
識し、そしてサンプルと共に抗体をインキュベートした後に固定化抗体に結合さ
せる。このサンプルの成分が標識化ポリぺプチドの抗体ヘの結合を阻害する程度
は、このサンプルの固定化抗体との反応性を示し、そして結果として、サンプル
中のＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）のレベルを示す。

【０１０１】固体支持体は、抗体が結合され得る、当業者に公知の任意の材料（例えば、マ
イクロタイタープレートにおける試験ウェル、ニトロセルロースフィルターまた
は別の適切な膜）であり得る。あるいは、支持体は、ビーズまたは円板（例えば
、ガラス）、ファイバーガラス、ラテックスまたはプラスチック（例えば、ポリ
スチレンまたはポリビニルクロリド）であり得る。当業者に公知の種々の技術（
特許および科学文献に豊富に記載される）を使用して、抗体は、固体支持体上に
固定化され得る。

【０１０２】特定の実施形態において、サンプル中のＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形
態）の検出のためのアッセイは、２つの抗体のサンドイッチアッセイである。こ
のアッセイは、第１に固体支持体（一般的にはマイクロタイタープレートのウェ
ル）上に固定化された抗体を生物学的サンプルと接触させる工程により実行され
得、その結果、サンプル内のＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）は、固定
化抗体に結合することが可能になる（室温での３０分間のインキュベーション時
間が、一般的に充分である）。次いで、結合されないサンプルを、固定化ＤＳＰ
−５／抗体複合体から除去し、そしてＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）
上の異なる部位に結合し得る第２の抗体（酵素、色素、放射性核種、発光基、蛍
光基、またはビオチンのようなレポーター基を含む）を添加する。次いで、固体
支持体に結合したままの第２の抗体の量を、特異的レポーター基に適切な方法を
用いて決定する。放射性基については、シンチレーション計数またはオートラジ
オグラフィー法が、一般的に適切である。分光法を使用して、色素、発光基、お
よび蛍光基を検出し得る。ビオチンを、異なるレポーター基（一般的に放射性基
もしくは蛍光基または酵素）に結合された、アビジンを使用して検出し得る。酵
素レポーター基を、一般的には基質を（一般的に特定の期間）添加し、次いで、
反応産物の分光分析または他の分析することにより検出し得る。周知の技術を使
用して、サンプル中のＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）のレベルを決定
するために、標準および標準添加物を使用し得る。

【０１０３】本発明の関連する局面において、ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）お
よびＤＳＰ−５ホスファターゼ活性を検出するためのキットが提供される。この
ようなキットは、ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）またはＤＳＰ−５（
またはＤＳＰ−５代替形態）をコードする核酸のレベルを検出するために設計さ
れ得るか、または直接ホスファターゼアッセイもしくは結合ホスファターゼアッ
セイにおいて、ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）のホスファターゼ活性
を検出し得る。一般的には、本発明のキットは、アッセイにおいて使用される要
素（例えば、試薬または緩衝液）を封入した１つ以上の容器を含む。

【０１０４】ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）、またはＤＳＰ−５（またはＤＳＰ
−５代替形態）をコードする核酸のレベルを検出するためのキットは、代表的に
はＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）タンパク質、ＤＳＰ−５（またはＤ
ＳＰ−５代替形態）ＤＮＡあるいはＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）Ｒ
ＮＡに結合する試薬を含む。ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）をコード
する核酸を検出するために、試薬は、核酸プローブまたはＰＣＲプライマーであ
り得る。ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）タンパク質を検出するために
、試薬は、代表的には抗体である。このようなキットはまた、試薬の直接的また
は間接的検出に適したレポーター基を含む（すなわち、レポーター基は、この試
薬に共有結合で結合され得るか、または第２の分子（例えば、プロテインＡ、プ
ロテインＧ、免疫グロブリンまたはレクチン）に結合し得、この第２の分子自身
が、試薬に結合し得る）。適切なレポーター基としては、酵素（例えば、セイヨ
ウワサビペルオキシダーゼ）、基質、補因子、インヒビター、色素、放射性核種
、発光基、蛍光基およびビオチンが挙げられるが、これらに限定されない。この
ようなレポーター基は、当業者に公知の標準的な方法を使用して、サンプル成分
に対する試薬の結合を直接的または間接的に検出するために使用され得る。

【０１０５】ＤＳＰ−５活性を検出するためのキットは、代表的には適切な緩衝液と組合せ
たＤＳＰ−５基質を含む。ＤＳＰ−５活性は、上記のようなホスファターゼアッ
セイを行う前に、ＤＳＰ−５特異的（またはＤＳＰ−５代替形態特異的）抗体を
用いて免疫沈降工程を実施することにより特異的に検出され得る。基質の脱リン
酸化を検出する際の使用のための他の試薬もまた提供され得る。

【０１０６】特定の診断アッセイにおいて、変化したＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形
態）の存在または変化したレベルのＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）発
現に基づいて、増殖障害は、患者または本明細書中に提供されるような別の生物
学的供給源生物において、検出され得る。例えば、抗体は、野生型ＤＳＰ−５（
またはＤＳＰ−５代替形態）とアミノ酸配列におけるバリエーションを有する変
化したＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）とを識別し得る。このようなバ
リエーションは、増殖障害の存在、またはこのような障害の感受性を示し得る。
ハイブリダイゼーションおよび増幅技術は、同様に改変ＤＳＰ−５（またはＤＳ
Ｐ−５代替形態）配列を検出するために使用され得る。

【０１０７】（ＤＳＰ−５活性のモジュレーターを同定するための方法）本発明の１つの局面において、ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）ポリ
ペプチドは、ＤＳＰ−５活性を調節する薬剤を同定するために使用され得る。こ
のような薬剤は、ＭＡＰ−キナーゼカスケードを介するシグナル変換を阻害また
は増強し、細胞増殖を引き起こし得る。ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態
）活性を調節する薬剤は、ＤＳＰ−５の発現および／もしくは安定性、ＤＳＰ−
５タンパク質活性ならびに／または基質を脱リン酸化するＤＳＰ−５の能力を変
化させ得る。このようなアッセイにおいてスクリーニングされ得る薬剤としては
、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体およびその抗原結合フラグ
メント、例えば、触媒部位または二重リン酸化モチーフを提示する競合基質また
はペプチド、ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）の転写および／または翻
訳を妨害するアンチセンスポリヌクレオチドおよびリボザイム、ならびにＤＳＰ
−５（またはＤＳＰ−５代替形態）に結合し、そしてＤＳＰ−５（またはＤＳＰ
−５代替形態）を不活化する他の天然分子および合成分子（例えば、低分子イン
ヒビター）。

【０１０８】本発明に従うＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）のモジュレーターをス
クリーニングする方法における使用のための候補薬剤は、「ライブラリー」また
は化合物、組成物もしくは分子のコレクションとして提供され得る。このような
分子は、代表的には、当該分野において「低分子」として知られ、そして１０⁵
ダルトン未満、好ましくは１０⁴ダルトン未満、そしてなおより好ましくは、１
０³ダルトン未満の分子量を有する化合物を含む。例えば、試験化合物のライブ
ラリーのメンバーは、本明細書中に提供されるような少なくとも１つのＤＳＰ−
５ポリペプチド（またはＤＳＰ−５代替形態ポリペプチド）を各々含む、複数の
サンプルに投与され得、次いで基質のＤＳＰ−５媒介脱リン酸化または基質への
ＤＳＰ−５媒介結合を増強または阻害するそれらの能力についてアッセイされる
。ＤＳＰ−５機能（例えば、ホスホチロシンおよび／またはホスホセリン／スレ
オニン脱リン酸化）に影響を与え得るとしてこのように同定された化合物は、治
療目的および／または診断目的のために役立つ。なぜなら、これらは、ＤＳＰ−
５活性に関連する疾患の処置および／または検出を可能にするからである。この
ような化合物はまた、ＤＳＰ−５に関与する分子シグナル伝達機構に関する研究
、およびさらなる特異性を示す将来のＤＳＰ−５化合物の発見および開発におけ
る改良に関する研究において役立つ。

【０１０９】候補薬剤はさらに、コンビナトリアルライブラリーのメンバーとして提供され
得、これは、好ましくは、複数の反応容器中で行われる所定の複数の化学反応に
従って調製された合成薬剤を含む。例えば、種々の出発化合物は、１以上の固相
合成、記録されたランダム混合手順および記録された反応分割手段を利用して調
製され得、これらは、所定の構成が、複数の順列および／または組み合わせの反
応条件を帰属可能に受けることを可能にする。得られる生成物は、スクリーニン
グされ得、次いで反復の選択および合成手順をされ得るライブラリー（例えば、
ペプチド（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８６９４、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４６
６６（これらは、本明細書中でその全体を参考として援用される）を参照のこと
）または本明細書中で提供されるような低分子を含み得る他の組成物（例えば、
ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８５４２、ＥＰ０７７４４６４、米国特許第５，７９８
，０３５号、米国特許第５，７８９，１７２号、米国特許第５，７５１，６２９
号（これらは、本明細書中でその全体を参考として援用される）を参照のこと）
の合成コンビナトリアルライブラリー）を構成する。このようなライブラリーの
多様な分類は、確立された手順に従って調製され得、そして本開示に従うＤＳＰ
−５を用いて試験され得ることを、当業者は理解する。

【０１１０】特定の実施形態においては、調節薬剤は、候補薬剤を、ＤＳＰ−５（またはＤ
ＳＰ−５代替形態）ポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコードするＤ
ＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）ポリヌクレオチドと、インビトロまたは
インビボで組み合わせ、そして候補薬剤のＤＳＰ−５ホスファターゼ活性に対す
る効果を、例えば、本明細書中に記載される代表的なアッセイを用いて評価する
ことによって同定され得る。ホスファターゼ活性における増加または減少は、候
補薬剤の存在下および非存在下で、本明細書中に提供される代表的なアッセイを
行うことによって測定され得る。手短には、候補薬剤は、活性ＤＳＰ−５（また
はＤＳＰ−５代替形態）ポリペプチドと基質（例えば、リン酸化ＭＡＰ−キナー
ゼ）の混合物中に、この混合物の１以上の成分とのプレインキュベーションあり
またはなしで含まれ得る。一般的に、抗体またはこのようなアッセイにおける使
用のための他の薬剤の適切な量は、約０．０１μＭ〜約１００μＭの範囲である
。次いで、薬剤のＤＳＰ−５活性への効果は、基質からのホスフェートの損失を
定量化し、そしてその損失を、候補薬剤の添加なしでＤＳＰ−５（またはＤＳＰ
−５代替形態）を用いて達成された損失と比較することによって評価され得る。
あるいは、結合キナーゼアッセイが使用され得、このアッセイにおいてＤＳＰ−
５活性は、ＭＡＰ−キナーゼ活性に基づいて間接的に測定される。

【０１１１】あるいは、ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）コード領域またはレポー
ター遺伝子と作動可能に連結されたＤＳＰ−５プロモータを含むポリヌクレオチ
ドは、試験化合物のＤＳＰ−５転写への影響を評価するために使用され得る。こ
のようなアッセイは、ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）を内因的に発現
する細胞（例えば、ヒトもしくは他の哺乳動物の脳、精巣、卵巣、脾臓または胸
腺）またはレポーター遺伝子と連結したＤＳＰ−５プロモーターを含む発現ベク
ターでトランスフェクトされた細胞において行われ得る。次いで、試験化合物の
効果は、ＤＳＰ−５またはレポーターの転写に対する効果を、例えば、ノーザン
ブロット分析または適切なレポーター活性アッセイを用いてアッセイすることに
よって評価され得る。

【０１１２】ＤＳＰ−５活性はまた、その発現が適切な基質の活性化に依存するレポーター
遺伝子でトランスフェクトした全細胞において測定され得る。例えば、適切な細
胞（すなわち、ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）を発現する細胞）は、
レポーター遺伝子と連結された基質依存性プロモーターでトランスフェクトされ
得る。このような系において、レポーター遺伝子の発現（これは、当業者に周知
の方法を用いて容易に検出され得る）は、基質の活性化に依存する。基質の脱リ
ン酸化は、レポーター活性における減少に基づいて検出され得る。候補調節薬剤
は、上記のようにこのような系に添加され得、ＤＳＰ−５活性に対するそれらの
効果を評価する。

【０１１３】本発明はさらに、ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）と相互作用するか
、またはＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）に結合する分子を同定するた
めの方法を提供する。このような分子は、一般的に、少なくとも１０⁴、好まし
くは、少なくとも１０⁵、より好ましくは、少なくとも１０⁶、なおより好ましく
は、少なくとも１０⁷、そして最も好ましくは、少なくとも１０⁸の親和力定数（
Ｋ_a）を有してＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）と会合する。親和力定
数は、周知の技術を用いて決定され得る。相互作用分子を同定するための方法は
、例えば、調節薬剤についての最初のスクリーニングとして、またはインビボで
のＤＳＰ−５活性に関与する因子を同定するために使用され得る。基質捕捉のた
めの技術（例えば、上記のようなＤＳＰ−５改変体もしくはＤＳＰ−５代替形態
改変体または基質捕捉変異体を用いる）はまた、本明細書中で提供される特定の
実施形態に従って意図される。標準的な結合アッセイに加えて、相互作用分子を
同定するために周知である多くの他の技術（酵母ツーハイブリッドスクリーニン
グ、ファージディスプレイおよび親和力技術を含む）が存在する。このような技
術は、慣用的なプロトコルを用いて行われ得、これらのプロトコルは当業者に周
知である（例えば、Ｂａｒｔｅｌら、ＣｅｌｌｕｌａｒＩｎｔｅｒａｃｔｉｏ
ｎｓｉｎＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａ
ｃｈ、Ｄ．Ａ．Ｈａｒｌｅｙ（編）、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰ
ｒｅｓｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）、１５３〜１７９頁、１９９３を参照のこと）
。これらおよび他の技術においては、候補相互作用タンパク質（例えば、推定Ｄ
ＳＰ−５基質）は、ＤＳＰ−５結合タンパク質またはＤＳＰ−５相互作用タンパ
ク質の存在についてアッセイする前に、リン酸化され得る。

【０１１４】他の局面においては、本発明は、動物が機能的なＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−
５代替形態）の発現も、変化したＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）の発
現もしない、動物モデルを提供する。このような動物は、標準的な相同組換え戦
略を用いて産生され得る。この様式で産生された動物モデルは、ＤＳＰ−５（ま
たはＤＳＰ−５代替形態）ポリペプチドの活性およびインビボでの調節薬剤を研
究するために使用され得る。

【０１１５】（基質を脱リン酸化する方法）本発明の別の局面において、ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）ポリペ
プチドは、本明細書中で提供されるＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）の
基質を脱リン酸化するために使用され得る。１つの実施形態において、基質は、
３０℃で１０分間、適切な緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭＥ
ＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン）中
で基質とともにＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）ポリペプチドをインキ
ュベートすることで、インビボで脱リン酸化され得る。ＭＡＰキナーゼのような
、ＤＳＰ−５によって脱リン酸化され得る任意の化合物が、基質として使用され
得る。一般に、反応成分の量は、約５０ｐｇ〜約５０ｎｇのＤＳＰ−５（または
ＤＳＰ−５代替形態）ポリペプチドにわたり、そして約１０ｎｇ〜約１０μｇの
基質にわたり得る。次いで、脱リン酸化された基質は、例えば、親和性技術およ
び／またはゲル電気泳動によって精製され得る。基質の脱リン酸化の程度は、［
γ−³²Ｐ］標識化基質を試験アリコートに添加し、そして本明細書中に記載され
るように基質の脱リン酸化のレベルを評価することによって、一般にモニターさ
れ得る。

【０１１６】（細胞応答を調節する方法）調節薬剤は、インビボおよびインビトロの両方の種々の状況における、細胞の
増殖、分化および生存のような細胞応答を、調節、改変またはさもなくば変化（
例えば、増加または減少）するために使用され得る。一般に、このような応答を
調節（例えば、統計的に有意な様式で増加または減少）するために、細胞は、Ｄ
ＳＰ−５活性の調節を可能にするのに十分な時間および条件下で、ＤＳＰ−５活
性を調節する薬剤に接触される。細胞応答を調節する薬剤は、種々の方法の任意
において機能し得る。例えば、薬剤は、遺伝子発現のパターンを調節し得る（す
なわち、協調的様式で発現される遺伝子ファミリーまたは遺伝子の発現を増大ま
たは阻害し得る）。種々のハイブリダイゼーションおよび増幅の技術は、遺伝子
発現のパターンを評価するために利用可能である。あるいは、またはさらに、薬
剤は細胞のアポトーシスまたは壊死をもたらし得、そして／または細胞内の細胞
サイクルの機能を調節し得る。（例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、１９９８Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ、２８１：１３０５；Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙら、１９９８Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２８１：１３１２；Ｅｖａｎら、１９９８Ｓｃｉｅｎｃｅ２８１
：１３１７；Ａｄａｍｓら、１９９８Ｓｃｉｅｎｃｅ２８１：１３２２；お
よびそれらに列挙される参考文献を参照のこと。）上記のように処置された細胞は、変化した増殖、分化または生存特性を有する
細胞の標準的特徴を示し得る。さらに、このような細胞は、細胞増殖の接触阻害
、足場非依存性増殖または改変された細胞間接着のような、他の検出可能な特性
における変化を示し得る（しかし、必要とはされない）。このような特性は、当
業者が精通した技術を使用して容易に検出され得る。

【０１１７】（治療方法）１つ以上のＤＳＰ−５ポリペプチドもしくはＤＳＰ−５代替形態ポリペプチド
、調節薬剤（ＤＳＰ−５と特異的に結合する任意の薬剤（例えば、本明細書中に
提供されるような抗体またはそのフラグメント））および／またはこのようなポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／または調節薬剤はまた、患者
においてＤＳＰ−５活性を調節するためにも使用され得る。本明細書中で使用さ
れる場合、「患者」は、任意の哺乳動物（ヒトを含む）であり得、そしてＤＳＰ
−５活性に関連した状態に冒され得るか、または検出可能な疾患を有さないもの
であり得る。従って、処置は、存在する疾患の処置であり得るか、または予防的
であり得る。ＤＳＰ−５活性に関連する状態としては、細胞増殖（癌、対宿主性
移植片病（ＧＶＨＤ）、自己免疫疾患、アレルギーまたは免疫抑制が関与し得る
他の状態を含む）、代謝疾患、異常な細胞増殖または異常な細胞分化、および細
胞周期異常に関連する任意の障害が挙げられる。このような特定の障害は、正常
なＭＡＰキナーゼのホスファターゼ活性の欠損に関連し、制御されていない細胞
増殖を導く。ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）ポリペプチドおよびこの
ようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、このような障害を回復さ
せるために使用され得る。

【０１１８】患者への投与のために、１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／
または調節薬剤が、薬学的組成物として一般に処方される。薬学的組成物は、滅
菌した水溶液または非水溶液、懸濁液または乳濁液であり得、これはさらに生理
学的に受容可能なキャリア（すなわち、活性成分の活性に干渉しない非毒性物質
）を含む。このような組成物は、固体、液体または気体（エアロゾル）の形態で
あり得る。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得るか、ま
たは化合物は、周知の技術を使用してリポソーム内にカプセル化され得る。本発
明の範囲内の薬学的組成物はまた、他の成分を含み得、これらは生物学的に活性
であるか、または不活性であり得る。このような成分としては、以下が挙げられ
るがこれらに限定されない：緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸
緩衝生理食塩水）、炭水化物（例えば、ブドウ糖、マンノース、ショ糖またはデ
キストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、またはグリシンのよ
うなアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンのようなキレート化剤、
安定剤、色素、矯味矯臭剤、および懸濁剤および／または保存剤。

【０１１９】当業者に公知の任意の適切なキャリアは、本発明の薬学的組成物において使用
され得る。治療的使用のためのキャリアは周知であり、そして例えば、Ｒｅｍｉ
ｎｇｔｏｎｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ
ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編１９８５）に記載
される。一般に、キャリアの型は、投与の形態に基づいて選択される。薬学的組
成物は、投与（例えば、局所的、経口、経鼻、クモ膜下内、直腸、膣、舌下、ま
たは非経口（皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）、空
洞内、道内（ｉｎｔｒａｍｅａｔａｌ）、または尿道内の注射あるいは注入が挙
げられる）投与が挙げられる）の任意の適切な様式のために処方され得る。非経
口投与について、このキャリアは、好ましくは水、生理食塩水、アルコール、脂
肪、ワックスまたは緩衝液を含む。経口投与について、上記の任意のキャリアま
たは固体キャリア（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン
酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、滑石粉、セルロース、カオリン、グリ
セリン、デンプンデキストリン、アルギニン酸ナトリウム、カルボキシメチルセ
ルロース、エチルセルロース、ブドウ糖、ショ糖、および／または炭酸マグネシ
ウム）が使用され得る。

【０１２０】薬学的組成物（例えば、経口投与または注射による送達のための）は、液体形
態（例えば、エリキシル、シロップ、溶液、乳濁液または懸濁液）であり得る。
液体の薬学的組成物としては、例えば以下の１つ以上が挙げられ得る：注射のた
めの水、食塩水、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、
溶媒または懸濁媒体として役立ち得る合成のモノグリセリドまたはジグリセリド
のような不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコ
ールまたは他の溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラ
ベン（ｐａｒａｂｅｎ）のような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナト
リウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート化剤；アセ
テート、シトレートまたはホスフェートのような緩衝液および塩化ナトリウムま
たはブドウ糖のような張度の調節のための薬剤。非経口調製物は、ガラスまたは
プラスチックで作製されたアンプル、使い捨てシリンジまたは複数の用量バイア
ルに同封され得る。生理食塩水の使用が好ましく、そして注射可能な薬学的組成
物は、好ましくは滅菌されている。

【０１２１】本明細書中に記載された組成物は、持続放出のために処方され得る（すなわち
、投与に続く化合物の緩やかな放出をもたらすカプセルまたはスポンジのような
処方物）。このような組成物は、一般的には周知の技術を用いて調製され得、そ
して例えば、経口、直腸または皮下埋め込み術によってか、または所望の標的部
位への移植によって投与され得る。持続放出処方物は、キャリアマトリックスに
おいて分散され、そして／または速度制御膜によって囲まれたリザーバ内に含ま
れる薬剤を含み得る。このような処方物内での使用のためのキャリアは、生体適
合性であり、そしてまたは生分解性であり得る；好ましくは、この処方物は、活
性成分の放出の比較的一定のレベルを提供する。持続放出処方物に含まれる活性
成分の量は、移植の部位、放出の速度および予期される持続期間ならびに処置ま
たは予防される状態の性質に依存する。

【０１２２】ＤＳＰ−５（もしくはＤＳＰ−５代替形態）ポリペプチドおよび／または調節
薬剤をコードするポリヌクレオチドを（ポリペプチドおよび／または調節薬剤が
、インサイチュで生成されるように）含有する薬学的組成物に関して、このポリ
ヌクレオチドは、核酸ならびに、細菌発現系、ウイルス発現系および哺乳動物発
現系を含む、当業者に公知の種々の送達系のいずれかに存在され得る。このよう
な発現系にＤＮＡを取り込むための技術は、当業者に周知である。このＤＮＡは
また、例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１７４５−１７４９，
１９９３に記載およびＣｏｈｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１６９１−１６９
２，１９９３によって概説されるように「裸」であり得る。裸のＤＮＡの取り込
みは、細胞に効果的に輸送される生分解性ビーズ上にＤＮＡを被覆することによ
って上昇され得る。

【０１２３】薬学的組成物内の、ＤＳＰ−５（またはＤＳＰ−５代替形態）ポリペプチド、
ポリヌクレオチドまたは調節薬剤は、種々の化合物のいずれかに連結され得る。
例えば、このような因子は、その薬剤の標的部位への送達を容易にする標的化部
分（例えば、モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体、タンパク質または
リポソーム）に連結され得る。本明細書中で使用される場合「標的化部分」は、
任意の物質（例えば、化合物または細胞）であり得、その薬剤の標的細胞または
組織への輸送を増大する薬剤と連結された場合、それによってその薬剤の局所的
な濃度を上昇する。標的化部分としては、抗体またはそのフラグメント、レセプ
ター、リガンドならびに標的組織の細胞に結合する他の分子、または標的組織の
近位の細胞に結合する他の分子が挙げられる。抗体標的化因子は、インタクト（
全て）な分子、そのフラグメント、またはその機能的な等価物であり得る。抗体
フラグメントの例としては、Ｆ（ａｂ’）₂、−Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦ［ｖ
］フラグメントであり、これらは、従来の方法によってか、または遺伝子工学も
しくはタンパク質工学によって産生され得る。結合は、一般的には、共有結合で
あり、そして例えば、直接縮合または他の反応によってか、二機能性リンカーま
たは多機能性リンカーを手段として達成され得る。標的化部分は、薬剤が治療的
利点を発揮すると予期される、細胞または組織に基づいて選択され得る。

【０１２４】薬学的組成物は、処置（または予防）される疾患に適切な様式で投与され得る
。適切な投薬量ならびに投与の適切な持続期間および頻度は、患者の状態、患者
の疾患の型および重篤性、活性成分の特定の形態および投与の方法のような因子
によって決定される。一般的には、適切な投薬量および処置レジメンは、治療的
利点および／または予防的利点（例えば、より多くの完全な寛解または部分的な
寛解、または長期の無疾患および／または全体的な生存のような臨床的な成果を
向上させる）を提供するのに十分な量で薬剤を提供する。予防的な使用に関して
、用量は、細胞増殖に関連する疾患の発症を予防、遅延、またはこれの重篤性を
減少するのに十分でなければならない。

【０１２５】最適な投薬量は、一般的には、実験的なモデルおよび／または臨床的な試みを
用いて決定され得る。一般的には、用量において存在するポリペプチドの量また
は用量において存在するＤＮＡによってインサイチュで産生されるポリペプチド
の量は、約０．０１μｇ／ｋｇ宿主〜約１００μｇ／ｋｇ宿主、代表的には約０
．１μｇ〜約１０μｇの範囲である。効果的な治療を提供するのに十分な最少投
薬量の使用は、通常好ましい。患者は、一般的には、当業者に公知である処置ま
たは予防される状態について適切なアッセイを用いて治療有効性または予防有効
性についてモニタされ得る。適切な用量サイズは、患者の大きさに伴なって変化
するが、代表的には、１０〜６０ｋｇの動物に対して約１０ｍＬ〜約５００ｍＬ
の範囲である。

【０１２６】以下の実施例は、例示の目的で提示するが、限定の目的ではない。

【０１２７】（実施例）（実施例１）（ＤＳＰ−５およびＤＳＰ−５代替形態をコードするｃＤＮＡのクローニング
および配列決定）本実施例は、ヒトＤＳＰ−５をコードするｃＤＮＡ分子のクローニングを示す
。

【０１２８】二重特異性（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）ホスファターゼの活性部位
ドメインの周囲の保存された配列モチーフを以下のように同定した：二重特異性
ホスファターゼは、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）のより大きな
ファミリーに属する。このファミリーのホスファターゼは、５つの可変アミノ酸
ストレッチのＮ末端に位置するシステイン残基、それに続くアルギニン残基を含
む保存された触媒性ドメインを共有する（Ｆａｕｍａｎら、ＴｒｅｎｄｓＩｎ
Ｂｉｏｃｈ．Ｓｃｉ．２１：４１３〜４１７、１９９６）。ＤＳＰは、代表的
に、ＰＴＰ活性部位モチーフを含むが、他の領域においてはＰＴＰに対する配列
相同性を欠いている（Ｊｉａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌ．
７５：１７〜２６，１９９７）。しかし、ＤＳＰの間で保存されているコンセン
サス配列は、報告されておらず、かつ上記に言及されたような公知のＤＳＰ配列
の試験から明白なコンセンサス領域も報告されていない。新しいＤＳＰファミリ
ーメンバーの同定に有用な、より長いコンセンサスＤＳＰアミノ酸配列モチーフ
を誘導するために、複数の公知のヒト二重特異性ホスファターゼ配列を整列させ
、比較した。ＭＡＰ−キナーゼホスファターゼ活性を有する８つのヒトＤＳＰ由
来の８つのアミノ酸配列の整列により、ＰＴＰ活性部位サインモチーフを含む２
３アミノ酸のペプチド配列から構成される保存された相同性領域を得た。従って
、以下の配列：ＧＲＶＬＶＨＣＱＡＧＩＳＲＳＧＴＮＩＬＡＹＬＭ（配列番号６）を有する候補ペプチドを用いて、発現配列タグ（ＥｘｐｒｓｓｅｄＳｅｑｕｅ
ｎｃｅＴａｇ）データベース（Ｎａｔ．ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｌ．Ｉ
ｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｂＥＳ
Ｔ）を検索した。この検索では、デフォールトパラメータ中の遺伝子コード縮重
性を可能にする反復（ｉｔｅｒａｔｉｏｎ）で候補ペプチドの逆翻訳を可能にす
るアルゴリズム（ｔｂｌａｓｔｎ）を使用した。この検索結果は、ＥＳＴＡＡ
３１４９４６を、ＭＡＰ−キナーゼホスファターゼ配列の候補として同定した。
このＥＳＴは、発現された遺伝子の完全なコード領域を含まなかった。また、セ
ンス鎖およびオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）も同定されなかった。Ｏ
ＲＦの存在を決定するために、ＥＳＴＡＡ３１４９４６配列を、２つの等しい
セグメント（第１は、推定ＯＲＦのアミノ末端領域を含み、そして第２は、カル
ボキシ末端領域を含む）に細分した。アミノ末端フラグメントの配列を、上記の
ｔｂｌａｓｔｎを用いるＥＳＴデータベースを再び検索するために使用し、そし
てＥＳＴＡＡ３１６２５３およびＡＡ０８１５１７を、ＥＳＴＡＡ３１４９
４６と有意な配列重複を有するとして同定した。ＥＳＴＡＡ３１４９４６のカ
ルボキシ末端部分を、ＥＳＴデータベースを検索するために使用する場合、さら
なるＥＳＴＡＡ４８９５６２およびＡＡ３１２９３９を、有意な配列重複を有
するとして同定した。

【０１２９】全長コード配列を得るため、供給業者の指示に従って、５’／３’ＲＡＣＥキ
ット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ
，ＩＮ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、記載
のように（Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８５：８９９８、１９８８；Ｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ８６：５６７３、１９８９；Ｌｏｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：
２１７、１９８９）、５’および３’ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄ：ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）反応において
、ヒト胸腺、脳、および精巣ｃＤＮＡをスクリーニングした。保存された配列モ
チーフにすぐ隣接する配列情報を、ヒト胸腺、脳、および精巣のｃＤＮＡでの５
’および３’ＲＡＣＥ反応において用いた。これには、以下のプライマー（配列
番号７〜１１）を用いた。

【０１３０】

【化１】生じたＲＡＣＥ５’産物のヌクレオシド配列決定は、ＡＡ３１４９４６、ＡＡ
３１６２５３およびＡＡ０８１５１７の存在を確認し、そしてＤＳＰ−５の開始
メチオニンについてコドンが存在するこれらの配列における決定を可能にした。

【０１３１】３’ＲＡＣＥ産物の配列決定は、ＥＳＴＡＡ４８９５６２との有意な重複を
示し、上記されるように、ＡＡ３１４９４６のカルボキシ末端領域との重複を示
した。ＤＳＰ−５カルボキシ末端をコードするヌクレオチド配列を同定するため
に、ＥＳＴデータベースを、プローブとしてＥＳＴＡＡ４８９５６２配列を用
いて、上記の通りに検索した。結果は、ＥＳＴＡＡ４８９５６２と別のＥＳＴ
ＡＡ０７４６６５との有意な重複を示し、後者のＥＳＴは、ＤＳＰ−５カルボキ
シ末端を含むことを示唆した。ＡＡ０７４６６５における３’配列の同一性を確
認するために、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、設計および合成した：
ＤＳＰ５−３’−ｎｏｒｍ：５’−ＴＧＡＡＴＧＡＴＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＧＧ
ＣＡＧＣ−３’（配列番号１２）（これは、ＤＳＰ−５ＯＲＦに対する３’に位置しかつこれの外にあるヌクレ
オチド配列領域について特異的である）かつＤＳＰ５−３’−ｅｎｄ：５’−ＧＴＧＧＣＡＡＣＴＧＡＡＡＴＴＡＴＡＣＣＡ
ＧＣＣ−３’（配列番号１３）（これは、以前に確認されたＯＲＦに局在する）。これらのプライマーを用いる
ＰＣＲ増幅は、残余のＤＳＰ−５Ｃ末端領域配列ならびにＤＳＰ−５のカルボ
キシ末端の決定を可能にする。６１４塩基対の推定単位複製配列を、胸腺、脳お
よび精巣ｃＤＮＡテンプレートから得た。

【０１３２】検索配列としてＡＡ４８９５６２を用いる、上記のＥＳＴデータベース検索は
また、さらなるＥＳＴ、ＡＡ９２３１５８を所与した。ＡＡ９２３１５８を、Ｂ
ＬＡＳＴアルゴリズムを用いる検索配列としてＥＳＴデータベースに再実行する
場合、類似性を、別のＥＳＴ，ＡＡ８８０７７（第２潜在性ＤＳＰ−５Ｃ末端
についてのコード配列を含む）に対して同定した。これらのさらなるＥＳＴにお
ける３’配列の同一性を確認するために、末端コドンに対する配列３’に特異的
なオリゴマープライマー：ＤＳＰ５−３’ｖａｒ：５’−ＧＴＴＡＡＡＡＴＡＧＡＧＣＴＴＡＡＡＡＴＧＣ
ＡＡＧＡＡＧＧ−３’（配列番号１４）を、脳および胸腺ｃＤＮＡから推定サイズの単位複製配列をＰＣＲ増幅するため
に、ＤＳＰ５−３’末端（配列番号１３）と対にした。

【０１３３】３４０アミノ酸のＤＳＰ−５タンパク質（図３；配列番号３）をコードするｃ
ＤＮＡ（図１；配列番号１）および２９９アミノ酸（図４：配列番号４）のＤＳ
Ｐ−５タンパク質（「ＤＳＰ−５代替形態」）の代替形態をコードする別の３’
末端を有する代替ｃＤＮＡ形態（図２、配列番号２）を同定した。第１２８７ア
ミノ酸（配列番号３および４に共通する）をコードするＤＮＡ配列は、他のＭＡ
Ｐ−キナーゼホスファターゼ（図５）に対して有意な相同性を有する。同定され
たｃＤＮＡは、１０２０（図１）塩基対のコード領域および８９７（図２）塩基
対コード領域、ならびに関連する５’および３’非翻訳配列を含む。ＤＳＰ−５
（およびＤＳＰ−５代替形態）についての活性部位ドメインを、配列番号３およ
び４の各々においてアミノ酸の１１３位で始まる領域に局在化させた。

【０１３４】半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を実行した。これらの分析は、脳、精巣、および胸
腺における、有意により高いレベルのＤＳＰ−５ｍＲＮＡを示した。

【０１３５】（実施例２）（ヒト組織におけるＤＳＰ−５発現）本実施例において、ＤＳＰ−５コード核酸配列が、種々の組織供給源由来のヒ
トポリＡ＋ＲＮＡにハイブリダイズすることを示す。核酸ハイブリダイゼーショ
ンプローブとしての使用のため、全長ＤＳＰ−５コードｃＤＮＡ（配列番号１）
を、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９８ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ
．Ｉｎｃ．＆ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ
，ＭＡ）に記載のランダムプライマー方法により³²Ｐ標識した。このプローブを
、検出可能なβアクチンｍＲＮＡの量について基準化した、複数のヒト組織に由
来するヒトポリＡ＋ＲＮＡを含むブロット（図４、カタログ番号７７５９−１；
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）にハイブリダイズし
た。ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ^TM溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中で６８℃で３０分間
、ブロットをプレハイブリダイゼーションし、次いで、標識したプローブを用い
、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ^TM溶液中で、６８℃で１時間ハイブリダイズした。次
に、このブロットを、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で、室温にて４０分間洗
浄し、次いで、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５０℃で４０分間、２回目
の洗浄をした。ブロットを風乾し、次いで、ＨｙｐｅｒｆｉｌｍＭＰ^TMオート
ラジオグラフフィルム（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒ
ｌｉｎｇｔｏｎＨｔｓ，ＩＬ）に一晩曝露した。結果を図５に示す。ここでは
、ＲＮＡのヒト組織供給源は以下のとおりであった：（図６Ａ）レーン１、心臓
；レーン２、脳；レーン３、胎盤；レーン４、肺；レーン５、肝臓；レーン６、
骨格筋；レーン７、腎臓；レーン８、脾臓；（図６Ｂ）レーン１、脾臓；レーン
２、胸腺；レーン３、前立腺；レーン４、精巣；レーン５、卵巣；レーン６、小
腸；レーン７、結腸；レーン８、末梢血白血球。

【０１３６】前述により、本発明の特定の実施形態が例示の目的で本明細書において記載さ
れているが、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ
得ることが理解される。従って、本発明は添付の特許請求の範囲によってしか限
定されない。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＤＳＰ−５についてのｃＤＮＡ配列（配列番号１）を示し、開始コド
ンおよび終止コドンが、太字で示される。

【図２】図２は、ＤＳＰ−５代替形態のｃＤＮＡ配列（配列番号２）を示し、開始コド
ンおよび停止コドンは、太字で示される。

【図３】図３は、ＤＳＰ−５の推定アミノ酸配列（配列番号３）を示す。

【図４】図４は、ＤＳＰ−５代替形態の推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。

【図５】図５は、ＤＳＰ−５と他のＭＡＰ−キナーゼホスファターゼとの間の配列類似
性を示す、配列アラインメントである。

【図６】図６は、³²Ｐ標識した全長ＤＳＰ−５コード核酸配列をプローブとして使用す
る、ノーザンブロットハイブリダイゼーションを示す。ブロットは、以下のよう
な種々の組織型由来のヒトポリＡ＋ＲＮＡを含んだ：（図６Ａ）レーン１、心臓
；レーン２、脳；レーン３、胎盤；レーン４、肺；レーン５、肝臓；レーン６、
骨格筋；レーン７、腎臓；レーン８、膵臓；（図６Ｂ）レーン１、脾臓；レーン
２、胸腺；レーン３、前立腺；レーン４、精巣；レーン５、卵巣；レーン６、小
腸；レーン７、結腸；レーン８、末梢血白血球。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 37/06 ４Ｂ０６５ 37/06 37/08 ４Ｃ０８４ 37/08 43/00 １０５４Ｃ０８５ 43/00 １０５Ｃ０７Ｋ 16/40 ４Ｈ０４５Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 9/16 Ｂ 5/06 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 9/16 33/50 ＺＣ１２Ｑ 1/68 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 33/577 Ｂ 33/58 Ｚ 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/58 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｅ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2G045 AA25 AA40 BB20 CA25 CB01 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA77 FB01 FB02 FB03 FB07 4B024 AA01 AA11 BA11 BA44 CA01 DA03 GA11 GA18 HA12 4B050 CC01 CC03 DD11 EE10 LL01 4B063 QA18 QQ02 QQ27 QQ42 QQ79 QQ96 QR08 QR32 QR42 QR48 QR55 QR62 QS25 QS33 QS34 QX01 4B064 AG27 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 BB19 BB34 CA25 CA31 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13 AA17 CA53 NA14 ZB082 ZB132 ZB212 ZB262 4C085 AA13 AA14 DD62 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA76 DA89 EA20 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号３に記載されるＤＳＰ−５の配列あるいはその改変
体を有する単離されたポリペプチドであって、該改変体は、該ポリペプチドが活
性化ＭＡＰキナーゼを脱リン酸化する能力を保持するように、配列番号３におけ
る残基の５０％以下での１つ以上のアミノ酸の欠失、付加、挿入、または置換に
て異なる、単離されたポリペプチド。
【請求項２】配列番号３に対応する配列を有するポリペプチドの少なくと
も１０個連続するアミノ酸をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】配列番号３に対応する配列を有するポリペプチドの少なくと
も１５個連続するアミノ酸をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】請求項２または請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む、
発現ベクター。
【請求項５】請求項４に記載の発現ベクターを用いて形質転換されたかま
たはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項６】請求項１に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポ
リヌクレオチド。
【請求項７】配列番号１に記載された配列を含む、請求項６に記載のポリ
ヌクレオチド。
【請求項８】請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項９】請求項８に記載の発現ベクターを用いて形質転換されたかま
たはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項１０】請求項６に記載のポリヌクレオチドに相補的な少なくとも
１５個連続するヌクレオチドを含む、アンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項１１】配列番号１に記載される配列の相補体に、５０℃にて１５
分間の０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での洗浄を含む条件下で、検出可
能にハイブリダイズする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】請求項１０または請求項１１に記載のポリヌクレオチドを
含む、発現ベクター。
【請求項１３】請求項１２に記載の発現ベクターを用いて形質転換された
かまたはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項１４】ＤＳＰ−５ポリペプチドを産生する方法であって、以下の
工程：（ａ）請求項９に記載の宿主細胞を、ＤＳＰ−５ポリペプチドの発現を可能にす
る条件下で培養する工程；および（ｂ）該宿主細胞培養物から該ＤＳＰ−５ポリペプチドを単離する工程、を包含する、方法。
【請求項１５】配列番号３の配列を有するＤＳＰ−５ポリペプチドに特異
的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５に記載
の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１７】薬学的組成物であって、生理学的に受容可能なキャリアと
組み合わせて請求項１５に記載の抗体またはそのフラグメントを含む、薬学的組
成物。
【請求項１８】サンプル中のＤＳＰ−５発現を検出するための方法であっ
て、以下：（ａ）サンプルを、請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと
、抗体／ＤＳＰ−５複合体を形成させるに十分な条件かつ時間で接触させる工程
；および（ｂ）抗体／ＤＳＰ−５複合体のレベルを検出し、そしてそこからサンプル中の
ＤＳＰ−５の存在を検出する工程、を包含する、方法。
【請求項１９】前記抗体が支持物質に連結される、請求項１８に記載の方
法。
【請求項２０】前記抗体が検出可能なマーカーに連結される、請求項１８
に記載の方法。
【請求項２１】前記サンプルが患者から得られた生物学的サンプルである
、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】サンプル中のＤＳＰ−５発現を検出するための方法であっ
て、以下：（ａ）サンプルを、請求項１０または請求項１１に記載のアンチセンスポリヌク
レオチドと接触させる工程；および（ｂ）該サンプルにおいて該アンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズす
るＤＳＰ−５ポリヌクレオチドの量を検出し、そしてそこから該サンプル中のＤ
ＳＰ−５発現を検出する工程、を包含する、方法。
【請求項２３】前記アンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする
ＤＳＰ−５ポリヌクレオチドの量がポリメラーゼ連鎖反応を用いて決定される、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】前記アンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする
ＤＳＰ−５ポリヌクレオチドの量がハイブリダイゼーションアッセイを用いて決
定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】前記サンプルがＲＮＡ調製物またはｃＤＮＡ調製物を含む
、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】ＤＳＰ−５活性を調節する薬剤についてスクリーニングす
るための方法であって、以下の工程：（ａ）候補薬剤を、請求項１に記載のポリペプチドと、該ポリペプチドと候補薬
剤との間での相互作用を可能にするに十分な条件かつ時間で接触させる工程；な
らびに（ｂ）引き続いて、該ポリペプチドがＤＳＰ−５基質を脱リン化する能力を、候
補薬剤の非存在下で該ポリペプチドが該ＤＳＰ−５基質を脱リン酸化する予め決
定された能力と比較して評価し；そしてそれからＤＳＰ−５活性を調節する薬剤
を同定する工程、を包含する、方法。
【請求項２７】前記ＤＳＰ−５基質がＭＡＰキナーゼである、請求項２６
に記載の方法。
【請求項２８】前記候補薬剤が低分子である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】前記低分子がコンビナトリアルライブラリー内に存在する
、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】ＤＳＰ−５活性を調節する薬剤についてスクリーニングす
るための方法であって、以下の工程：（ａ）候補薬剤を、検出可能な転写物またはタンパク質をコードするポリヌクレ
オチドに作動可能に連結されたＤＳＰ−５プロモーターを含む細胞と、該プロモ
ーターと候補薬剤との間での相互作用を可能にするに十分な条件かつ時間で接触
させる工程；ならびに（ｂ）引き続いて、該ポリヌクレオチドの発現を、候補薬剤の非存在下での発現
の予め決定されたレベルと比較して評価し；そしてそれからＤＳＰ−５活性を調
節する薬剤を同定する工程、を包含する、方法。
【請求項３１】前記ポリヌクレオチドがＤＳＰ−５ポリペプチドをコード
する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】前記ポリヌクレオチドがレポータータンパク質をコードす
る、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】細胞における増殖応答を調節するための方法であって、細胞を、ＤＳＰ−５活性を調節する薬剤と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項３４】細胞の分化を調節するための方法であって、細胞を、ＤＳＰ−５活性を調節する薬剤と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項３５】細胞の生存を調節するための方法であって、細胞を、ＤＳＰ−５活性を調節する薬剤と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項３６】前記薬剤が遺伝子発現のパターンを調節する、請求項３３
〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】前記細胞が細胞成長の接触阻害を示す、請求項３３〜３５
のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】前記細胞が足場非依存性増殖を示す、請求項３３〜３５の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】前記細胞が変化した細胞間接着特性を示す、請求項３３〜
３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】前記薬剤がアポトーシスを調節する、請求項３５に記載の
方法。
【請求項４１】前記薬剤が細胞周期を調節する、請求項３５に記載の方法
。
【請求項４２】前記細胞が患者の中に存在する、請求項３２に記載の方法
。
【請求項４３】ＤＳＰ−５活性に関連する障害に罹患した患者を処置する
ための方法であって、患者に、ＤＳＰ−５活性を調節する薬剤の治療有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項４４】前記障害が、癌、対宿主性移植片病、自己免疫疾患、アレ
ルギー、代謝疾患、異常な細胞成長、異常な細胞増殖、および細胞周期の異常か
らなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】ＤＳＰ−５基質捕捉変異体ポリペプチドであって、該ポリ
ペプチドが、ＤＳＰ−５と比較して実質的には減少していない親和性で基質に結
合するように、かつ該ポリペプチドが、基質を脱リン酸化する能力がＤＳＰ−５
と比較して低下しているように、配列番号３に記載される配列と、配列番号３に
おける残基の５０％以下での１つ以上のアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換
にて異なっている、ＤＳＰ−５基質捕捉変異体ポリペプチド。
【請求項４６】前記ポリペプチドが、配列番号３の８４位または１１５位
での置換を含む、請求項４５に記載の基質捕捉変異体ポリペプチド。
【請求項４７】ＤＳＰ−５と相互作用する能力について分子をスクリーニ
ングする方法であって、以下の工程：（ａ）候補分子を請求項１に記載のポリペプチドと、該候補分子とポリペプチド
とを相互作用させるに十分な条件かつ時間で接触させる工程；および（ｂ）該ポリペプチドへの該候補分子の結合の存在または非存在を検出し、そし
てそこから該候補分子がＤＳＰ−５と相互作用するか否かを決定する工程、を包含する、方法。
【請求項４８】前記検出する工程が、アフィニティー精製工程を包含する
、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】前記検出する工程が、酵母ツーハイブリットスクリーニン
グまたはファージディスプレーライブラリーのスクリーニングを包含する、請求
項４７に記載の方法。
【請求項５０】配列番号４に記載されるＤＳＰ−５代替形態の配列あるい
はその改変体有する単離されたポリペプチドであって、該改変体は、該ポリペプ
チドが活性化ＭＡＰキナーゼを脱リン酸化する能力を保持するように、配列番号
４における残基の５０％以下での１以上のアミノ酸欠失、付加、挿入または置換
にて異なる、単離されたポリペプチド。
【請求項５１】配列番号４に対応する配列を有するポリペプチドの少なく
とも１０個の連続アミノ酸をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５２】配列番号４に対応する配列を有するポリペプチドの少なく
とも１５個の連続するアミノ酸をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５３】請求項５１または請求項５２に記載のポリヌクレオチドを
含む、発現ベクター。
【請求項５４】請求項５３に記載の発現ベクターを用いて形質転換された
かまたはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項５５】請求項５０に記載のポリペプチドをコードする、単離され
たポリヌクレオチド。
【請求項５６】配列番号２に記載された配列を含む、請求項５５に記載の
ポリヌクレオチド。
【請求項５７】請求項５５に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクタ
ー。
【請求項５８】請求項５７に記載の発現ベクターを用いて形質転換された
かまたはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項５９】請求項５５に記載のポリヌクレオチドに相補的な少なくと
も１５個連続するヌクレオチドを含む、アンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項６０】配列番号２に記載される配列の相補体に、６０℃にて１５
分間の０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での洗浄を含む条件下で、検出可
能にハイブリダイズする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６１】請求項５９または請求項６０に記載のポリヌクレオチドを
含む、発現ベクター。
【請求項６２】請求項６１に記載の発現ベクターを用いて形質転換された
かまたはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項６３】ＤＳＰ−５代替形態ポリペプチドを産生する方法であって
、以下の工程：（ａ）請求項５８に記載の宿主細胞を、ＤＳＰ−５代替形態ポリペプチドの発現
を可能にする条件下で培養する工程；および（ｂ）該宿主細胞培養物から該ＤＳＰ−５代替形態ポリペプチドを単離する工程
、を包含する、方法。
【請求項６４】配列番号４の配列を有するＤＳＰ−５代替形態ポリペプチ
ドに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６５】前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項６４に記載
の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６６】薬学的組成物であって、生理学的に受容可能なキャリアと
組み合わせて請求項６４に記載の抗体またはそのフラグメントを含む、薬学的組
成物。
【請求項６７】サンプル中のＤＳＰ−５代替形態発現を検出するための方
法であって、以下：（ａ）サンプルを、請求項６４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと
、抗体／ＤＳＰ−５代替形態複合体を形成させるに十分な条件かつ時間で接触さ
せる工程；および（ｂ）抗体／ＤＳＰ−５代替形態複合体のレベルを検出し、そしてそこからサン
プル中のＤＳＰ−５代替形態の存在を検出する工程、を包含する、方法。
【請求項６８】前記抗体が支持物質に連結される、請求項６７に記載の方
法。
【請求項６９】前記抗体が検出可能なマーカーに連結される、請求項６７
に記載の方法。
【請求項７０】前記サンプルが患者から得られた生物学的サンプルである
、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】サンプル中のＤＳＰ−５代替形態発現を検出するための方
法であって、以下：（ａ）サンプルを、請求項５９または請求項６０に記載のアンチセンスポリヌク
レオチドと接触させる工程；および（ｂ）該サンプルにおいて該アンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズす
るＤＳＰ−５代替形態ポリヌクレオチドの量を検出し、そしてそこから該サンプ
ル中のＤＳＰ−５代替形態発現を検出する工程、を包含する、方法。
【請求項７２】前記アンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする
ＤＳＰ−５代替形態ポリヌクレオチドの量がポリメラーゼ連鎖反応を用いて決定
される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】前記アンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする
ＤＳＰ−５代替形態ポリヌクレオチドの量がハイブリダイゼーションアッセイを
用いて決定される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】前記サンプルがＲＮＡ調製物またはｃＤＮＡ調製物を含む
、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】ＤＳＰ−５代替形態活性を調節する薬剤についてスクリー
ニングするための方法であって、以下の工程：（ａ）候補薬剤を、請求項５０に記載のポリペプチドと、該ポリペプチドと候補
薬剤との間での相互作用を可能にするに十分な条件かつ時間で接触させる工程；
ならびに（ｂ）引き続いて、該ポリペプチドがＤＳＰ−５代替形態基質を脱リン化する能
力を、候補薬剤の非存在下で該ポリペプチドが該ＤＳＰ−５代替形態基質を脱リ
ン酸化する予め決定された能力と比較して評価し；そしてそれからＤＳＰ−５代
替形態活性を調節する薬剤を同定する工程、を包含する、方法。
【請求項７６】前記ＤＳＰ−５代替形態基質がＭＡＰキナーゼである、請
求項７５に記載の方法。
【請求項７７】前記候補薬剤が低分子である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】前記低分子がコンビナトリアルライブラリー内に存在する
、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】ＤＳＰ−５代替形態活性を調節する薬剤についてスクリー
ニングするための方法であって、以下の工程：（ａ）候補薬剤を、検出可能な転写物またはタンパク質をコードするポリヌクレ
オチドに作動可能に連結されたＤＳＰ−５代替形態プロモーターを含む細胞と、
該プロモーターと候補薬剤との間での相互作用を可能にするに十分な条件かつ時
間で接触させる工程；ならびに（ｂ）引き続いて、該ポリヌクレオチドの発現を、候補薬剤の非存在下での発現
の予め決定されたレベルと比較して評価し；そしてそれからＤＳＰ−５代替形態
活性を調節する薬剤を同定する工程、を包含する、方法。
【請求項８０】前記ポリヌクレオチドがＤＳＰ−５代替形態ポリペプチド
をコードする、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】前記ポリヌクレオチドがレポータータンパク質をコードす
る、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】細胞における増殖応答を調節するための方法であって、細胞を、ＤＳＰ−５代替形態活性を調節する薬剤と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項８３】細胞の分化を調節するための方法であって、細胞を、ＤＳＰ−５代替形態活性を調節する薬剤と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項８４】細胞の生存を調節するための方法であって、細胞を、ＤＳＰ−５代替形態活性を調節する薬剤と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項８５】前記薬剤が遺伝子発現のパターンを調節する、請求項８２
〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】前記細胞が細胞成長の接触阻害を示す、請求項８２〜８４
のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】前記細胞が足場非依存性増殖を示す、請求項８２〜８４の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】前記細胞が変化した細胞間接着特性を示す、請求項８２〜
８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】前記薬剤がアポトーシスを調節する、請求項８４に記載の
方法。
【請求項９０】前記薬剤が細胞周期を調節する、請求項８４に記載の方法
。
【請求項９１】前記細胞が患者の中に存在する、請求項８１に記載の方法
。
【請求項９２】ＤＳＰ−５代替形態活性に関連する障害に罹患した患者を
処置するための方法であって、患者に、ＤＳＰ−５代替形態活性を調節する薬剤の治療有効量を投与する工程
を包含する、方法。
【請求項９３】前記障害が、癌、対宿主性移植片病、自己免疫疾患、アレ
ルギー、代謝疾患、異常な細胞成長、異常な細胞増殖、および細胞周期の異常か
らなる群から選択される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】ＤＳＰ−５代替形態基質捕捉変異体ポリペプチドであって
、該ポリペプチドが、ＤＳＰ−５代替形態と比較して実質的には減少していない
親和性で基質に結合するように、かつ該ポリペプチドが、基質を脱リン酸化する
能力がＤＳＰ−５代替形態と比較して低下しているように、配列番号４に記載さ
れる配列と、配列番号４における残基の５０％以下での１つ以上のアミノ酸の欠
失、付加、挿入または置換にて異なっている、ＤＳＰ−５代替形態基質捕捉変異
体ポリペプチド。
【請求項９５】前記ポリペプチドが、配列番号４の８４位または１１５位
での置換を含む、請求項９４に記載の基質捕捉変異体ポリペプチド。
【請求項９６】ＤＳＰ−５代替形態と相互作用する能力について分子をス
クリーニングする方法であって、以下の工程：（ａ）候補分子を請求項５０に記載のポリペプチドと、該候補分子とポリペプチ
ドとを相互作用させるに十分な条件かつ時間で接触させる工程；および（ｂ）該ポリペプチドへの該候補分子の結合の存在または非存在を検出し、そし
てそこから該候補分子がＤＳＰ−５代替形態と相互作用するか否かを決定する工
程、を包含する、方法。
【請求項９７】前記検出する工程が、アフィニティー精製工程を包含する
、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】前記検出する工程が、酵母ツーハイブリットスクリーニン
グまたはファージディスプレーライブラリーのスクリーニングを包含する、請求
項９６に記載の方法。