JP2003525027A - Ｄｓｐ−３二重特異性ｍａｐキナーゼホスファターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細胞増殖、細胞分化、および細胞の生存に関する状態の処置のための組成物および方法が、提供される。詳細には、二重特異性ホスファターゼＤＳＰ−３、およびＤＳＰ−３基質の脱リン酸化を刺激するＤＳＰ−３のポリペプチド改変体が、提供される。これらのポリペプチドを用いて、例えば、ＤＳＰ−３活性を阻害する抗体および他の薬剤を同定し得る。これらのポリペプチドおよび薬剤を用いて、細胞増殖、細胞分化、および細胞の生存を調節し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、一般的に、細胞増殖、細胞分化、および／または細胞生存における
欠損と関連する状態を処置するために有用な組成物および方法に関する。本発明
は、より詳細には、二重特異性プロテインホスファターゼおよびそのポリペプチ
ド改変体に関する。本発明はまた、増殖性応答、細胞分化、および／または細胞
生存をもたらすシグナル伝達を調節する抗体および他の薬剤（低分子を含む）の
同定のためのそのようなポリペプチドの使用に関する。

【０００２】 （発明の背景） マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）は、種々の保存性
のメンバーを有する保存された細胞シグナル伝達経路の構成要素として存在する
。ＭＡＰキナーゼは、配列Ｔｈｒ−Ｘ−Ｔｙｒを有する二重リン酸化モチーフに
おけるリン酸化（ＭＡＰキナーゼキナーゼによる）によって活性化される。ここ
で、チロシン残基およびスレオニン残基でのリン酸化が活性に必要である。活性
化されたＭＡＰキナーゼは、いくつかの伝達標的（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ
ｔａｒｇｅｔ）（転写因子を含む）をリン酸化する。ＭＡＰキナーゼの不活化は
、ＭＡＰキナーゼホスファターゼといわれる二重特異性ホスファターゼによる、
この部位での脱リン酸化によって媒介される。高等真核生物において、ＭＡＰキ
ナーゼシグナル伝達の生理的役割は、増殖、腫瘍形成、発生、および分化のよう
な、細胞内事象と相関している。従って、これらの経路を介してシグナル伝達を
調節する能力は、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達と関連するヒト疾患（例えば、癌
）についての処置および予防療法の開発をもたらし得る。

【０００３】 二重特異性プロテインチロシンホスファターゼ（二重特異性ホスファターゼ）
は、ホスホチロシン残基とホスホスレオニン／セリン残基との両方を脱リン酸化
するホスファターゼである（Ｗａｌｔｏｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．６２：１０１−１２０，１９９３）。ＭＡＰキナーゼを不活性化するいくつか
の二重特異性ホスファターゼが同定されており、これらには、ＭＫＰ−１（ＷＯ
９７／００３１５；ＫｅｙｓｅおよびＥｍｓｌｉｅ、Ｎａｔｕｒｅ ５９：６４
４−６４７、１９９２）、ＭＫＰ−４、ＭＫＰ−５、ＭＫＰ−７、Ｈｂ５（ＷＯ
９７／０６２４５）、ＰＡＣ１（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３６７：６５１−
６５４、１９９４）、ＨＶＨ２（ＧｕａｎおよびＢｕｔｃｈ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７０：７１９７−７２０３，１９９５）、およびＰＹＳＴ１（Ｇｒｏ
ｏｍら、ＥＭＢＯ Ｊ．１５：３６２１−３６３２，１９９６）が含まれる。特
定の二重特異性ホスファターゼの発現は、ストレスまたはマイトジェンによって
誘導されるが、他の二重特異性ホスファターゼは、特定の細胞型において構成的
に発現されるようである。二重特異性ホスファターゼの発現および活性の調節は
、細胞増殖、細胞分化、および細胞生存を含む、ＭＡＰキナーゼ媒介性の細胞機
能の制御に重要である。例えば、二重特異的ホスファターゼは、細胞増殖のネガ
ティブレギュレーターとして機能し得る。細胞の型または活性化に関して種々の
特異性を有する、多くのこのような二重特異性ホスファターゼが存在する可能性
がある。しかし、二重特異性ホスファターゼの調節は、理解が乏しいままであり
、そして比較的少ない数の二重特異性ホスファターゼのみしか同定されていない
。

【０００４】 従って、当該分野において、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達カスケードにおける
、ＭＡＰシグナル伝達、および二重特異性ホスファターゼの調節の理解の改善に
ついての必要性が存在する。二重特異性ホスファターゼ調節の理解の増加は、Ｍ
ＡＰキナーゼカスケードに関与するタンパク質の活性を調節するための方法の開
発、およびこのようなカスケードと関連する状態を処置するための方法の開発を
容易にし得る。本発明は、これらの必要性を満たし、そしてさらに、他の関連す
る利点を提供する。

【０００５】 （発明の要旨） 手短に述べれば、本発明は、細胞増殖応答を調節し得る薬剤を同定するための
組成物および方法を提供する。１つの局面において、本発明は、配列番号２に列
挙されるＤＳＰ−３の配列またはその改変体を有する単離されたＤＳＰ−３ポリ
ペプチドを提供し、この改変体は、配列番号２の残基の５０％以下において、１
以上のアミノ酸の欠失、付加、挿入、または置換にて異なり、そのポリペプチド
が活性化ＭＡＰキナーゼを脱リン酸化する能力を保持している。

【０００６】 さらなる局面において、本発明は、配列番号２に対応する配列を有するポリペ
プチドの少なくとも１０個連続するアミノ酸をコードする単離されたポリヌクレ
オチドを提供する。特定の実施形態において、本発明は、配列番号２に対応する
配列を有するポリペプチドの少なくとも１５個連続するアミノ酸をコードする単
離されたポリヌクレオチドを提供する。特定のこのようなポリヌクレオチドは、
ＤＳＰ−３ポリペプチドをコードする。なおさらに、ポリヌクレオチドは、ＤＳ
Ｐ−３ポリヌクレオチドの一部に相補的である少なくとも１５個連続するヌクレ
オチドを含み、かつ／または０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中で、５０
℃で、１５分間の洗浄を含む条件下で、配列番号１に列挙される配列の相補体に
検出可能にハイブリダイズする、アンチセンスポリヌクレオチドであり得る。前
述のポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクター、およびそのような発現ベ
クターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞もまた、提供される。

【０００７】 本発明はさらに、他の局面において、以下の工程：（ａ）ＤＳＰ−３ポリペプ
チドの発現を可能にする条件下で、上記のような宿主細胞を培養する工程；およ
び（ｂ）宿主細胞培養物からＤＳＰ−３ポリペプチドを単離する工程、を包含す
る、ＤＳＰ−３ポリペプチドを産生するための方法を提供する。

【０００８】 ＤＳＰ−３ポリペプチド（例えば、配列番号２の配列を有するポリペプチド）
に特異的に結合する、単離された抗体およびその抗原結合フラグメントもまた、
本発明によって提供される。

【０００９】 本発明はさらに、他の局面において、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体
またはそのフラグメントを、生理学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む
、薬学的組成物を提供する。

【００１０】 さらなる局面において、本発明は、サンプル中のＤＳＰ−３発現を検出するた
めの方法を提供し、この方法は、（ａ）抗体／ＤＳＰ−３複合体の形成を可能に
するのに十分な条件下かつ時間の間、サンプルを、抗体またはその抗原結合フラ
グメントと接触させる工程；および（ｂ）抗体／ＤＳＰ−３複合体のレベルを検
出する工程、を包含する。

【００１１】 なお他の局面において、本発明は、サンプル中のＤＳＰ−３発現を検出するた
めの方法を提供し、この方法は、（ａ）サンプルを、上記のようなアンチセンス
ポリヌクレオチドと接触させる工程；および（ｂ）そのアンチセンスポリヌクレ
オチドとハイブリダイズするＤＳＰ−３ポリヌクレオチドの量を、そのサンプル
中で検出する工程、を包含する。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応またはハイブリ
ダイゼーションアッセイを用いて、そのアンチセンスポリヌクレオチドとハイブ
リダイズするＤＳＰ−３ポリヌクレオチドの量が決定され得る。

【００１２】 本発明はまた、酵素活性および／または基質結合のモジュレーターについての
スクリーニングアッセイにおいて有用なＤＳＰ−３ポリペプチドを提供する。他
の局面において、ＤＳＰ−３活性を調節する薬剤についてスクリーニングするた
めの方法もまた提供され、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）候補薬剤を
上記のようなＤＳＰ−３ポリペプチドと、そのポリペプチドと候補薬剤との間の
相互作用を可能にするのに十分な条件下かつ時間の間、接触させる工程；および
（ｂ）続いて、候補薬剤の非存在下で、そのポリペプチドがＤＳＰ−３基質を脱
リン酸化する予め決定された能力と比較して、ＤＳＰ−３基質を脱リン酸化する
そのポリペプチドの能力を評価する工程。このような方法は、インビトロまたは
細胞環境中（例えば、インタクトな細胞中）で実施され得る。

【００１３】 さらなる局面において、ＤＳＰ−３活性を調節する薬剤についてスクリーニン
グするための方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）候補
薬剤を、検出可能な転写物またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作
動可能に連結されたＤＳＰ−３プロモーターを含む細胞と、そのプロモーターと
候補薬剤との間の相互作用を可能にするに十分な条件かつ時間で、接触させる工
程；ならびに（ｂ）引き続いて候補薬剤の非存在下での予め決定されたレベルの
発現と比較して、そのポリヌクレオチドの発現を評価する工程。

【００１４】 細胞における増殖性応答を調節するための方法もまた、提供され、その方法は
、ＤＳＰ−３活性を調節する薬剤と細胞を接触させる工程を包含する。

【００１５】 さらなる局面において、細胞の分化を調節するための方法が提供され、その方
法は、ＤＳＰ−３活性を調節する薬剤と細胞を接触させる工程を包含する。

【００１６】 本発明はさらに、細胞の生存を調節するための方法を提供し、その方法は、Ｄ
ＳＰ−３活性を調節する薬剤と細胞を接触させる工程を包含する。

【００１７】 関連する局面において、本発明は、ＤＳＰ−３活性と関連する（または、ＤＳ
Ｐ−３の投与により処置可能な）障害に罹患した患者を処置するための方法を提
供し、この方法は、ＤＳＰ−３活性を調節する薬剤の治療上有効な量を患者に投
与する工程を包含する。このような障害としては、デュシェーヌ筋ジストロフィ
ーならびに癌、対宿主性移植片病、自己免疫疾患、アレルギー、代謝疾患、異常
な細胞成長（ｇｒｏｗｔｈ）、異常な細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）
および細胞周期異常が、挙げられる。

【００１８】 さらなる局面において、ＤＳＰ−３基質捕捉変異体ポリペプチドが提供される
。このようなポリペプチドは、配列番号２の残基の５０％以下において、１以上
のアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換にて、配列番号２に記載される配列と
異なり、そのポリペプチドは、ＤＳＰ−３と比較して実質的には減少していない
親和性で基質に結合し、そして、そのポリペプチドが基質を脱リン酸化する能力
は、ＤＳＰ−３と比較して減少している。特定の実施形態において、基質捕捉変
異体ポリペプチドは、配列番号２の５７位または８８位の置換を含む。

【００１９】 本発明はさらに、他の局面において、ＤＳＰ−３と相互作用する能力について
分子をスクリーニングするための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含
する：（ａ）候補分子を上記のポリペプチドと、その候補分子とポリペプチドと
が相互作用するのを可能にするに十分な条件かつ時間で、接触させる工程；なら
びに（ｂ）そのポリペプチドへのその候補分子の結合の存在または非存在を検出
する工程。この検出工程は、例えば、アフィニティー精製工程、酵母ツーハイブ
リッドスクリーニング、またはファージディスプレイのスクリーニングを含み得
る。

【００２０】 １つの局面において、本発明は、配列番号２１に記載されるＤＳＰ−３代替形
態の配列またはその改変体を含む単離されたＤＳＰ−３ポリペプチドを提供し、
この改変体は、配列番号２１の残基の５０％以下において、１以上のアミノ酸欠
失、付加、挿入または置換にて異なり、その結果、このポリペプチドは、活性化
ＭＡＰ−キナーゼを脱リン酸化する能力を保持する。

【００２１】 さらなる局面において、本発明は、配列番号２１に対応する配列を有するポリ
ペプチドの少なくとも１０個の連続アミノ酸をコードする単離されたポリヌクレ
オチドを提供する。特定の実施形態において、本発明は、配列番号２１に対応す
る配列を有するポリペプチドの少なくとも１５個の連続したアミノ酸をコードす
る単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定のこのようなポリヌクレオチド
は、ＤＳＰ−３代替形態ポリペプチドをコードする。なおさらに、ポリヌクレオ
チドは、ＤＳＰ−３代替形態のポリペプチドの一部に相補的な少なくとも１５個
の連続したヌクレオチドを含み、そして／または６０℃での１５分間の０．１×
ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中での洗浄を含む条件下で、配列番号２０に記載
される配列の相補体に検出可能にハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオ
チドであり得る。前述のポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクター、およ
びこのような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞も
また、提供される。

【００２２】 他の局面において、本発明はさらに、以下の工程：（ａ）ＤＳＰ−３代替形態
ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、上記の宿主細胞を培養する工程；お
よび（ｂ）ＤＳＰ−３代替形態ポリペプチドを宿主細胞培養物から単離する工程
、を包含するＤＳＰ−３代替形態ポリペプチドを産生するための方法をさらに提
供する。

【００２３】 単離された抗体、およびその抗原結合フラグメント（これらは、配列番号２１
の配列を有するポリペプチドのようなＤＳＰ−３代替形態のポリペプチドに特異
的に結合する）もまた、本発明により提供される。

【００２４】 他の局面において、本発明は、さらに、生理学的に受容可能なキャリアと組み
合わせて、上記のようなポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体またはそのフラ
グメントを含む薬学的組成物を提供する。

【００２５】 さらなる局面において、本発明は、以下の工程を含む、サンプル中のＤＳＰ−
３代替形態発現を検出するための方法を提供する：（ａ）抗体／ＤＳＰ−３代替
形態複合体の形成を可能にするのに十分な条件でかつ時間で、上記のような抗体
またはその抗原結合フラグメントとサンプルを接触させる工程；および（ｂ）抗
体／ＤＳＰ−３代替形態複合体のレベルを検出する工程。

【００２６】 なお他の局面において、本発明は、以下の工程を含む、サンプル中のＤＳＰ−
３代替形態発現を検出するための方法を提供する：（ａ）上記のようなアンチセ
ンスポリヌクレオチドとサンプルを接触させる工程；および（ｂ）サンプル中の
アンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズするＤＳＰ−３代替形態ポリヌ
クレオチドの量を検出する工程。アンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイ
ズするＤＳＰ−３代替形態ポリヌクレオチドの量を、例えば、ポリメラーゼ連鎖
反応またはハイブリダイゼーションアッセイを用いて決定し得る。

【００２７】 本発明はまた、酵素活性および／または基質結合のモジュレーターについての
スクリーニングアッセイに有用なＤＳＰ−３代替形態のポリペプチドを提供する
。他の局面において、以下の工程を含む、ＤＳＰ−３代替形態活性を調節する薬
剤についてのスクリーニングのための方法がまた、提供される：（ａ）ポリペプ
チドと候補薬剤との間の相互作用を可能にするのに十分な条件下でかつ時間で、
上記のようなポリペプチドと候補薬剤を接触させる工程；および（ｂ）候補薬剤
の非存在でＤＳＰ−３代替形態基質を脱リン酸化するポリペプチドの予め決定さ
れた能力と比較して、ＤＳＰ−３代替形態基質を脱リン酸化するポリペプチドの
能力をその後に評価する工程。このような方法は、インビボまたは細胞環境（例
えば、インタクトな細胞内で）実施され得る。

【００２８】 さらなる局面において、以下の工程を包含する、ＤＳＰ−３代替形態活性を調
節する薬剤についてスクリーニングするための方法が、提供される：（ａ）プロ
モーターと候補薬剤との間の相互作用を可能にするのに十分な条件下でかつ時間
で、検出可能な転写物またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドに操作可
能に連結されたＤＳＰ−３代替形態プロモーターを含む細胞と候補薬剤を接触さ
せる工程；および（ｂ）候補薬剤の非存在下で予め決定された発現のレベルと比
較して、ポリヌクレオチドの発現をその後に評価する工程。

【００２９】 ＤＳＰ−３代替形態活性を調節する薬剤と細胞を接触させる工程を包含する、
細胞における増殖応答を調節するための方法がまた、提供される。

【００３０】 さらなる局面において、ＤＳＰ−３代替形態活性を調節する薬剤と細胞を接触
させる工程を包含する、細胞の分化を調節する方法が、提供される。

【００３１】 本発明は、さらに、ＤＳＰ−３代替形態活性を調節する薬剤と細胞を接触させ
る工程を包含する、細胞生存を調節するための方法を提供する。

【００３２】 関連した局面において、本発明は、ＤＳＰ−３代替形態活性に関連する障害（
またはＤＳＰ−３代替形態の投与によって処置可能な障害）に罹患する患者を処
置する方法を提供する。この方法は、ＤＳＰ−３代替形態活性を調節する治療有
効量の薬剤を患者に投与する工程を包含する。このような障害としては、癌、対
宿主性移植片病、自己免疫疾患、アレルギー、代謝疾患、異常な細胞成長（ｇｒ
ｏｗｔｈ）、異常な細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および細胞周期異
常が、挙げられる。

【００３３】 さらなる局面において、変異ポリペプチドを捕捉するＤＳＰ−３代替形態基質
が提供される。このようなポリペプチドは、配列番号２１における残基の５０％
以下において、１以上のアミノ酸欠失、付加、挿入または置換にて配列番号２１
に記載される配列と異なり、その結果、このポリペプチドは、ＤＳＰ−３代替形
態に比較して実質的に減少されない親和性で基質に結合し、かつ基質を脱リン酸
化するこのポリペプチドの能力は、ＤＳＰ−３代替形態に比較して減少される。
特定の特異的実施形態において、基質捕捉変異ポリペプチドは、配列番号２１の
５７位または８８位に置換を含む。

【００３４】 他の局面において、本発明は、さらに、以下の工程を包含する、ＤＳＰ−３代
替形態と相互作用する能力について分子をスクリーニングするための方法を提供
する：（ａ）候補分子およびポリペプチドに相互作用させるに十分な条件下かつ
時間で上記のようなＤＳＰ−３代替形態ポリペプチドまたはその改変体と候補分
子を接触させる工程；および（ｂ）候補分子のポリペプチドへの結合の存在また
は非存在を検出する工程。検出する工程は、例えば、アフィニティー精製工程、
酵母ツーハイブリッドスクリーンまたはファージディスプレイライブラリーのス
クリーンを含み得る。

【００３５】 本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面
を参照することによって、明らかになる。本明細書中に開示されるすべての参考
文献は、各々が個別に援用されたかのように、その全体が参考として本明細書中
に援用される。

【００３６】 （発明の詳細な説明） 上記のように、本発明は、一般的に、インビトロおよびインビボでの細胞増殖
性応答を調節（すなわち、刺激または阻害）するための、組成物および方法に関
する。詳細には、本発明は、二重特異性ホスファターゼＤＳＰ−３またはＤＳＰ
−３代替形態（図１〜２、５〜６；配列番号１、２、２０、２１）、ならびにそ
の改変体、ならびにＤＳＰ−３またはＤＳＰ−３代替形態に特異的に結合する抗
体を提供する。また、本明細書中に提供されるのは、スクリーニング、検出アッ
セイ、および関連する治療用途のためにこのような化合物を使用するための、方
法である。

【００３７】 （ＤＳＰ−３ポリペプチドおよびＤＳＰ−３ポリヌクレオチド） 本明細書中で使用される場合、用語「ＤＳＰ−３ポリペプチド」または「ＤＳ
Ｐ−３代替形態ポリペプチド」とは、本明細書中に提供されるようなＤＳＰ−３
配列またはそのような配列の改変体を含む、ポリペプチドをいう。このようなポ
リペプチドは、ＤＳＰ−３基質中のチロシン残基およびスレオニン／セリン残基
の両方を脱リン酸化し得、ネイティブの全長ＤＳＰ−３と比較して、実質的には
減少していない活性を有する。ＤＳＰ−３基質は、活性化（すなわち、リン酸化
）ＭＡＰ−キナーゼを含む。他の基質は、本明細書中で記載されるように、基質
捕捉変異体を使用して同定され得、そして１つ以上のリン酸化チロシン残基、ス
レオニン残基および／またはセリン残基を有する、ポリペプチドを含む。

【００３８】 本発明の範囲内のＤＳＰ−３またはＤＳＰ−３代替形態ポリペプチド改変体は
、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入を含み得る。特定のＤＳＰ−
３またはＤＳＰ−３代替形態改変体について、この改変体が、ＤＳＰ−３基質内
のチロシンおよびスレオニン残基を脱リン酸化する能力は、実質的には減少しな
い。このようなＤＳＰ−３改変体が、ＤＳＰ−３基質内のチロシンおよびスレオ
ニン残基を脱リン酸化する能力は、ネイティブのＤＳＰ−３またはＤＳＰ−３代
替形態と比較して、増強され得るか、または無変化であり得るか、あるいは、ネ
イティブのＤＳＰ−３またはＤＳＰ−３代替形態と比較して、５０％未満減少さ
れ得、そして好ましくは、２０％未満減少され得る。このような改変体は、本明
細書中で提供される代表的なアッセイを使用して、同定され得る。

【００３９】 本発明によって、特定の機能が無能力にされているＤＳＰ−３またはＤＳＰ−
３代替形態の改変された形態もまた意図される。例えば、このようなタンパク質
は、構成的に活性または不活性であり得るか、あるいは、変更された結合性質ま
たは触媒性質を示し得る。このような変更されたタンパク質は、周知技術を使用
して生成され得、そして変更された機能は、本明細書中で提供されるようなスク
リーニングを使用して確認され得る。特定の改変されたＤＳＰ−３またはＤＳＰ
−３代替形態ポリペプチドは、「基質捕捉変異体」として公知である。このよう
なポリペプチドは、基質を結合する能力を保持する（すなわち、Ｋ_mが実質的に
は減少していない）が、基質を脱リン酸化する能力の減少（すなわち、ｋ_catが
、好ましくは、１分当たり１未満まで減少している）を示す。さらに、基質捕捉
変異体／基質複合体の安定性は、ＤＳＰ−３／基質複合体（ＤＳＰ−３代替形態
／基質複合体を含む）の安定性と比較して、実質的に減少していないはずである
。複合体安定性は、会合定数（Ｋ_a）に基づいて評価され得る。Ｋ_m、ｋ_catおよ
びＫ_aの決定は、当該分野で公知の標準的な技術（例えば、ＷＯ ９８／０４７
１２；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７５ Ｗｏｒｔｈ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹを参照のこと）および本明細書中で提供されるア
ッセイを使用して、容易に達成され得る。基質捕捉変異体は、例えば、５７位ま
たは８８位でのアミノ酸置換によりＤＳＰ−３を改変することによって（例えば
、５７位のアミノ酸アスパラギン酸をアラニン残基で置換することによって、ま
たは残基８８のシステインをセリンで置換することによって）生成され得る。基
質捕捉変異体は、例えば、ＤＳＰ−３基質を同定するために使用され得る。手短
に言えば、改変されたＤＳＰ−３またはＤＳＰ−３代替形態が、候補基質と接触
されて（単独、または細胞抽出物のようなタンパク質の混合物内で）、基質／Ｄ
ＳＰ−３複合体の形成が可能になり得る。次いで、この複合体は、従来技術によ
って単離され得、基質の単離および特徴付けが可能になり得る。基質捕捉変異体
の調製および使用は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９８／０４７１２に記載さ
れる。

【００４０】 好ましくは、改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」は、１つのアミノ
酸が、類似の性質を有する別のアミノ酸と置換され、ペプチド化学の当業者が、
そのポリペプチドの二次構造および疎水性親水性性質（ｈｙｄｒｏｐａｔｉｃ
ｎａｔｕｒｅ）が実質的に変化しないことを予期するような置換である。アミノ
酸置換は、一般的に、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／また
は両親媒性性質の類似性に基づいてなされ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸
としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる；正に荷電したアミ
ノ酸としては、リシンおよびアルギニンが挙げられる；ならびに類似の親水性価
を有する非荷電の極性ヘッド基（ｈｅａｄ ｇｒｏｕｐ）を有するアミノ酸とし
ては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパ
ラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、スレオニン、フェニルアラニンおよ
びチロシンが挙げられる。保存的変化を代表し得るアミノ酸の他のグループとし
ては以下が挙げられる：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌ
ｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）
ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈ
ｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。改変体はまた、あるいは
代わりに、非保存的変化を含み得る。

【００４１】 一般的に、改変は、重要でない領域において、より容易になされ得、重要でな
い領域とは、ＤＳＰ−３またはＤＳＰ−３代替形態の活性を実質的には変化しな
いネイティブ配列の領域である。重要でない領域は、本明細書中に記載されるよ
うな、特定の領域におけるＤＳＰ−３配列の改変、およびホスファターゼアッセ
イにおける得られた改変体の能力の評価によって同定され得る。好ましい配列改
変は、活性部位ドメイン（ＶＨＣＬＡＧＶＳＲＳ、配列番号３）を保持するよう
になされる。特定の好ましい実施形態において、このような改変は、ＤＳＰ−３
（またはＤＳＰ−３代替形態）とＤＳＰ−３基質以外の細胞成分との間の相互作
用に影響を及ぼす。しかし、置換はまた、得られた改変体が、基質脱リン酸化を
刺激する能力を実質的に保持するならば、ネイティブタンパク質の重要な領域に
おいてなされ得る。特定の実施形態において、改変体は、５０％以下、好ましく
は、２５％以下のアミノ酸残基の、置換、欠失、付加および／または挿入を含む
。

【００４２】 改変体はまた（あるいは、代わりに）、例えば、そのポリペプチドの活性に対
して最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によって改変され得る。特に
、改変体は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端で、さらなるアミノ酸配
列を含み得る。このような配列は、例えば、そのポリペプチドの精製または検出
を容易にするために使用され得る。

【００４３】 ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）ポリペプチドは、種々の周知技術の
うちのいずれかを使用して調製され得る。以下に記載されるようなＤＮＡ配列に
よってコードされる組換えポリペプチドは、当業者に公知の種々の発現ベクター
のうちのいずれかを使用して、それらのＤＮＡ配列から容易に調製され得る。発
現は、組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転
換されたかまたはトランスフェクトされた、任意の適切な宿主細胞において達成
され得る。適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母および高等真核生物細胞（
哺乳動物細胞を含む）が挙げられ、そしてグリコシル化にて異なる形態が、宿主
細胞または単離後のプロセシングを変化させることによって生成され得る。培養
培地へ組換えタンパク質またはポリペプチドを分泌する適切な宿主／ベクター系
由来の上清は、市販のフィルターを使用して最初に濃縮され得る。濃縮後、その
濃縮物は、適切な精製マトリックス（例えば、アフィニティマトリックスまたは
イオン交換樹脂）に適用され得る。最終的に、１つ以上の逆相ＨＰＬＣ工程を利
用して、組換えポリペプチドがさらに精製され得る。

【００４４】 約１００個よりも少ないアミノ酸、そして一般的には約５０個よりも少ないア
ミノ酸を有する、部分および他の改変体はまた、当業者に周知の技術を使用して
、合成手順によって生成され得る。例えば、このようなポリペプチドは、市販の
固相技術（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法）のうちのいずれかを使用
して、合成され得、ここで、アミノ酸は、連続して、伸長するアミノ酸鎖に付加
される。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９
−２１４６，１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動合成のための装置は、
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ
Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のような供給者から市販
されており、そして製造業者の使用説明書に従って、操作され得る。

【００４５】 「ＤＳＰ−３ポリヌクレオチド」は、ＤＳＰ−３またはＤＳＰ−３代替形態ポ
リペプチドまたはその改変体の少なくとも一部分をコードする任意のポリヌクレ
オチドであるか、あるいはこのようなポリヌクレオチドに相補的である任意のポ
リヌクレオチドである。好ましいポリヌクレオチドは、ＤＳＰ−３またはＤＳＰ
−３代替形態ポリペプチドをコードするかまたはこのような配列に相補的である
、少なくとも１５個連続したヌクレオチド、好ましくは、少なくとも３０個連続
したヌクレオチドを含む。特定のポリヌクレオチドは、ＤＳＰ−３またはＤＳＰ
−３代替形態ポリペプチドをコードする；他のポリヌクレオチドは、以下に記載
されるようなプローブ、プライマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとし
ての使用を見出し得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コード鎖またはアンチセ
ンス鎖）あるいは二本鎖であり得、そしてＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまた
は合成ＤＮＡ）分子あるいはＲＮＡ分子であり得る。さらなるコード配列または
非コード配列が、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るが、必ずしもその必
要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持物質に連結
され得るが、必ずしもその必要はない。

【００４６】 ＤＳＰ−３ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、内因性ＤＳＰ−
３またはＤＳＰ−３代替形態配列あるいはその一部分またはスプライス改変体）
を含み得るか、あるいはこのような配列の改変体を含み得る。ポリヌクレオチド
改変体は、上記のように、コードされたポリペプチドの活性が、実質的には減少
しないように、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得る。コ
ードされたポリペプチドの活性に対する効果は、一般的に、本明細書中に記載さ
れるように評価され得る。改変体は、好ましくは、ネイティブのＤＳＰ−３また
はＤＳＰ−３代替形態またはその一部分をコードするポリヌクレオチド配列に、
少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは、少なくとも約８０％の同一性お
よび最も好ましくは、少なくとも約９０％の同一性を示す。パーセント同一性は
、ＡｌｉｇｎまたはＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５，１９９１；ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎ
ｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１
５−１０９１９，１９９２）のような当業者に周知のコンピュータアルゴリズム
を使用して、配列を比較することによって容易に決定され得、このアルゴリズム
は、ＮＣＢＩウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ
．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）で入手可能である。デフォルトパラメ
ータが使用され得る。特定の改変体は、ネイティブの遺伝子に実質的に相同性で
ある。このようなポリヌクレオチド改変体は、中程度にストリンジェントな条件
下で、ネイティブのＤＳＰ−３またはＤＳＰ−３代替形態（または、相補的配列
）をコードする天然に存在するＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列とハイブリダイズし
得る。適切な中程度にストリンジェントな条件は、例えば、５×ＳＳＣ、０．５
％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）の溶液中で予め洗浄する工
程；５０℃〜７０℃、５×ＳＳＣで、１〜１６時間（例えば、一晩）ハイブリダ
イズする工程；その後、２２〜６５℃にて２０〜４０分間で１回または２回、０
．０５〜０．１％ ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣおよび０．２×Ｓ
ＳＣの各々の１つ以上で、洗浄する工程を包含する。さらなるストリンジェンシ
ーのために、条件は、５０〜６０℃で１５〜４０分間の０．１×ＳＳＣおよび０
．１％ ＳＤＳでの洗浄を含み得る。当業者に公知のように、ハイブリダイゼー
ション条件のストリンジェンシーの変化は、プレハイブリダイゼーション工程、
ハイブリダイゼーション工程および洗浄工程のために使用される時間、温度およ
び／または溶液の濃度を変更することによって達成され得、そして適切な条件は
また、使用されるプローブの特定のヌクレオチド配列、およびブロットされた発
端（ｐｒｏｂａｎｄ）の核酸サンプルの特定のヌクレオチド配列に部分的に依存
し得る。従って、適切にストリンジェントな条件は、プローブの所望の選択性が
、１つ以上の特定の発端配列にハイブリダイズするが他の特定の発端配列にはハ
イブリダイズしない能力に基づいて、同定される場合、過度の実験を伴わずに容
易に選択され得ることが認識される。

【００４７】 遺伝コードの縮重の結果として、本明細書中に記載される通りのポリペプチド
をコードする多くのヌクレオチド配列が存在することもまた当業者によって認識
される。これらのポリヌクレオチドのうちのいくつかは、任意のネイティブな遺
伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を保有する。それにもかかわらず
、コドン使用法の相違に起因して変化するポリヌクレオチドが、本発明によって
特に意図される。

【００４８】 ポリヌクレオチドは、任意の種々の技術を用いて調製され得る。例えば、ポリ
ヌクレオチドは、適切な細胞または組織型（例えば、ヒトの骨格筋細胞）から調
製されたｃＤＮＡから増幅され得る。このようなポリヌクレオチドは、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して増幅され得る。このアプローチについては、配
列特異的プライマーが、本明細書中に提供される配列に基づいて設計され得、そ
して購入または合成され得る。

【００４９】 増幅された部分を用い、周知の技術を用いて全長の遺伝子が適切なライブラリ
ー（例えば、ヒト骨格筋細胞のｃＤＮＡ）から単離され得る。このような技術内
で、増幅に適切な１以上のポリヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプ
ライマーを用いてライブラリー（ｃＤＮＡまたはゲノム）がスクリーニングされ
る。好ましくは、ライブラリーは、より大きな分子を含むように大きさが選択さ
れる。ランダムプライムライブラリーもまた、遺伝子の５’領域および上流領域
を同定するために好適であり得る。ゲノムライブラリーは、イントロンを得るた
めおよび５’配列を伸長させるために好適である。

【００５０】 ハイブリダイゼーション技術について、部分配列が、周知の技術を用いて（例
えば、³²Ｐを用いるニックトランスレーションまたは末端標識によって）標識さ
れ得る。次いで、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーが、
変性した細菌コロニーを含むフィルター（またはファージプラークを含むローン
（ｌａｗｎ））を、標識したプローブを用いてハイブリダイズすることによって
スクリーニングされ得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。ハイブリダイズするコロニーま
たはプラークが選択され、そして増殖され、そしてさらなる分析のためにＤＮＡ
が単離される。クローンを分析して、例えば、部分配列由来のプライマーおよび
ベクター由来のプライマーを用いるＰＣＲによって、さらなる配列の量が決定さ
れ得る。制限地図および部分配列を生成して、オーバーラップする１以上のクロ
ーンを同定し得る。周知の技術を用いて適切なフラグメントを連結することによ
って、全長のｃＤＮＡ分子を生成し得る。

【００５１】 あるいは、部分的ｃＤＮＡ配列から全長のコード配列を得るための多数の増幅
技術が存在する。このような技術では、増幅は一般に、ＰＣＲを介して行われる
。このような技術の１つは、「ｃＤＮＡ末端の迅速増幅」、すなわち、ＲＡＣＥ
として公知である。この技術は、内部プライマーと、ポリＡ領域またはベクター
配列にハイブリダイズする外部プライマーとを使用して、既知の配列の５’側
である配列および３’側である配列を同定することを含む。任意の種々の市販の
キットを用いて、増幅工程を行い得る。例えば、当該分野で周知のソフトウェア
を使用して、プライマーを設計し得る。プライマーは好ましくは、１７〜３２ヌ
クレオチド長であり、少なくとも４０％のＧＣ含量を有し、そして約５４℃〜７
２℃の温度で標的配列にアニーリングする。増幅された領域は、上記の通りに配
列決定され得、そしてオーバーラップする配列は、連続した配列へと集合され得
る。

【００５２】 ＤＳＰ−３をコードするｃＤＮＡ配列を図１（配列番号１）に提供し、そして
推定アミノ酸配列を図２（配列番号２）に提供する。ＤＳＰ−３代替形態をコー
ドするｃＤＮＡ配列は、図５（配列番号２０）中に提供され、そして推定アミノ
酸配列が、図４６（配列番号２１）に提供される。ＤＳＰ−３の活性部位ＶＨＣ
ＬＡＧＶＳＲＳ（配列番号３）は、配列番号１（図１：開始コドンはヌクレオチ
ド位置番号１で開始する）のヌクレオチド位置２５８〜２８５に位置するヌクレ
オチド塩基によってコードされる。この部位にすぐ隣接する配列情報を用い、ヒ
トの骨格筋細胞のｃＤＮＡを用いる５’ＲＡＣＥ反応および３’ＲＡＣＥ反応を
設計して、５５２塩基対によってコードされる１８４アミノ酸のタンパク質を同
定した。このタンパク質は、二重特異性ホスファターゼ−３、すなわち、ＤＳＰ
−３と呼ばれる。ＤＳＰ−３についてのｍＲＮＡ（ｍｅｓｓａｇｅ）が、ヒト骨
格筋組織で他の組織よりも非常に豊富に観察された。図３に示す配列比較によっ
て示されるように、ＤＳＰ−３は、他のＭＡＰキナーゼホスファターゼに対して
有意な相同性を示す。

【００５３】 ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）ポリヌクレオチド改変体は一般に、
例えば、固相化学合成を含む当該分野で公知の任意の方法によって調製され得る
。ポリヌクレオチド配列の改変はまた、オリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発
（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）のような標準的な変異誘発技術を用いて導入
され得る。あるいは、ＲＮＡ分子が、ＤＳＰ−３をコードするＤＮＡ配列または
その一部分のインビトロまたはインビボでの転写によって生成され得、但し、こ
のＤＮＡは、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７またはＳＰ
６）を有するベクターに組み込まれる。特定のポリヌクレオチドを用いて、本明
細書中に記載されるように、コードされるポリペプチドを調製し得る。さらに、
あるいは、ポリヌクレオチドは、コードされるポリペプチドがインビボで生成さ
れるように、患者に投与され得る。

【００５４】 コード配列の少なくとも一部分に相補的であるポリヌクレオチド（例えば、ア
ンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイム）はまた、プローブまたはプライ
マーとして使用され得るか、または遺伝子発現を改変するために使用され得る。
アンチセンス薬剤としての使用のためのオリゴヌクレオチドおよびリボザイム、
ならびにそれらの標的化された送達のための遺伝子をコードするＤＮＡの同定は
、当該分野で周知の方法を含む。例えば、このようなオリゴヌクレオチドの所望
の特性、長さおよび他の特徴は、周知である。アンチセンスオリゴヌクレオチド
は、代表的には、以下のような結合を使用することによって、内因性ヌクレオチ
ド分解酵素による分解に耐えるように設計される：ホスホロチオエート結合、メ
チルホスホネート結合、スルホン結合、サルフェート結合、ケチル（ｋｅｔｙｌ
）結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロアミダイト結合、リン酸エステル
結合、および他のこのような結合（例えば、Ａｇｒｗａｌら，Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８：３５３９−３５４２（１９８７）；Ｍｉｌｌｅｒら，
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９３：６６５７−６６６５（１９７１）；Ｓｔｅ
ｃら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２６：２１９１−２１９４（１９８
５）；Ｍｏｏｄｙら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：４７６９−４７８
２（１９８９）；Ｕｚｎａｎｓｋｉら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９
８９）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４０：１３７−１４
３（１９８４）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４
：３６７−４０２（１９８５）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｌ．
Ｓｃｉ．１４：９７−１００（１９８９）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅｓ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃｏｈｅｎ編，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎ
ｄｏｎ，９７−１１７頁（１９８９）中のＳｔｅｉｎ；Ｊａｇｅｒら，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７２３７−７２４６（１９８８）を参照のこと）。

【００５５】 アンチセンスポリヌクレオチドは、配列特異的な様式で、核酸（例えば、ｍＲ
ＮＡまたはＤＮＡ）に結合するオリゴヌクレオチドである。相補的配列を有する
ｍＲＮＡに結合した場合、アンチセンスは、そのｍＲＮＡの翻訳を妨げる（例え
ば、米国特許第５，１６８，０５３号、Ａｌｔｍａｎら；同第５，１９０，９３
１号、Ｉｎｏｕｙｅ，同第５，１３５，９１７号、Ｂｕｒｃｈ；同第５，０８７
，６１７号、ＳｍｉｔｈおよびＣｌｕｓｅｌら（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．２１：３４０５−３４１１（これは、ダンベル状（ｄｕｍｂｂｅｌ
ｌ）アンチセンスオリゴヌクレオチドを記載する）を参照のこと）。３重鎖分子
とは、２重鎖ＤＮＡを結合して同一順序の（ｃｏｌｉｎｅａｒ）３重鎖分子を形
成し、それによって転写を妨げる、単一のＤＮＡ鎖をいう（例えば、米国特許第
５，１７６，９９６号、Ｈｏｇａｎら（これは、２重鎖ＤＮＡ上の標的部位に結
合する合成オリゴヌクレオチドを作製するための方法を記載する）を参照のこと
）。

【００５６】 特に有用なアンチセンスヌクレオチドおよび３重鎖分子は、ＤＳＰ−３または
ＤＳＰ−３代替形態ポリペプチドまたは内因性ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代
替形態）の発現に関する任意の他のプロセスを媒介するタンパク質をコードする
ＤＮＡまたはｍＲＮＡのセンス鎖と、そのＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形
態）ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳の阻害がもたらされるように、相
補的であるかまたは結合する分子である。アンチセンスＲＮＡへと転写され得る
ｃＤＮＡ構築物がまた、アンチセンスＲＮＡの産生を容易にするために、細胞ま
たは組織中に導入され得る。アンチセンス技術は、ポリメラーゼ、転写因子また
は他の調節分子の結合の妨害を介して、遺伝子発現を調節するために使用され得
る（Ｈｕｂｅｒ ａｎｄ Ｃａｒｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ．（Ｍｔ．Ｋｉｓｃｏ，ＮＹ；１９９４）中のＧｅｅらを参照のこと）。あ
るいは、アンチセンス分子は、ＤＳＰ−３遺伝子の制御領域（例えば、プロモー
ター、エンハンサーまたは転写開始部位）とハイブリダイズしてこの遺伝子の転
写をブロックするようにか；またはリボソームへの転写物の結合を阻害すること
により翻訳をブロックするように設計され得る。

【００５７】 本発明はまた、ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）特異的リボザイムを
意図する。リボザイムは、ＲＮＡ基質（例えば、ｍＲＮＡ）を特異的に切断する
ＲＮＡ分子であり、細胞性遺伝子発現の特異的な阻害または妨害を生じる。ＲＮ
Ａ鎖の切断および／または連結に関与する、少なくとも５つの公知のクラスのリ
ボザイムが存在する。リボザイムは、任意のＲＮＡ転写物に標的化され得、そし
てこのような転写物を触媒作用的に切断し得る（例えば、米国特許第５，２７２
，２６２号、同第５，１４４，０１９号；および同第５，１６８，０５３号、同
第５，１８０，８１８号、同第５，１１６，７４２号および同第５，０９３，２
４６号（Ｃｅｃｈら）を参照のこと）。任意のＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代
替形態） ｍＲＮＡ特異的リボザイム、またはこのようなリボザイムをコードす
る核酸が、ＤＳＰ−３遺伝子発現の阻害をもたらすために宿主細胞に送達され得
る。従って、リボザイムは、真核生物プロモーター（例えば、真核生物ウイルス
プロモーター）に連結されたリボザイムをコードするＤＮＡによって宿主細胞に
送達され得、その結果、核中への導入の際に、そのリボザイムは直接転写され得
る。

【００５８】 任意のポリヌクレオチドが、インビボでの安定性を増大するためにさらに改変
され得る。可能な改変としては、これらに限定されないが、５’末端および／ま
たは３’末端における隣接配列の付加；骨格におけるホスホジエステル結合以外
のホスホロチオエート結合または２’Ｏ−メチル結合の使用；ならびに／あるい
は非古典的（ｎｏｎｔｒａｄｉｔｏｎａｌ）塩基（例えば、イノシン、キューオ
シン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）およびワイブトシン、ならびにアセチル形態、メチル
形態、チオ形態、および他の改変された形態の、アデニン、シチジン、グアニン
、チミンおよびウリジン）を含むことが挙げられる。

【００５９】 本明細書中に記載されるようなヌクレオチド配列は、確立された組換えＤＮＡ
技術を使用して種々の他のヌクレオチド配列と結合され得る。例えば、ポリヌク
レオチドは、種々のクローニングベクターのいずれか（プラスミド、ファージミ
ド、λファージ誘導体およびコスミドを含む）中にクローン化され得る。特定の
目的のベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター
および配列決定ベクターが挙げられる。一般に、適切なベクターは、少なくとも
１つの生物にて機能的な複製起点、都合の良い制限エンドヌクレアーゼ部位およ
び１つ以上の選択可能マーカーを含む。他のエレメントは、所望される使用に依
存し、そして当業者に明らかである。

【００６０】 特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、哺乳動物の細胞中への侵入、
およびそこでの発現を可能にするように処方され得る。このような処方は、以下
の記載のような治療目的のために特に有用である。標的細胞におけるポリヌクレ
オチドの発現を達成するための多く方法が存在し、そして任意の適切な方法が利
用され得ることを、当業者は理解する。例えば、ポリヌクレオチドは、周知の技
術を使用して、ウイルスベクター中に取り込まれ得る。ウイルスベクターは、さ
らに、選択マーカーに関する遺伝子（形質導入された細胞の同定または選択を補
助するため）および／または標的化部分に関する遺伝子（例えば、特定の標的細
胞におけるレセプターに対するリガンドをコードする遺伝子）を移すかまた組み
込んで、そのベクターを標的特異的にし得る。標的化はまた、当業者に公知の方
法により、抗体を用いて達成され得る。

【００６１】 治療目的のための他の処方としては、コロイド分散系（例えば、高分子複合体
、ナノカプセル（ｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅ）、ミクロスフェア、ビーズ）、なら
びに脂質に基づく系（水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソ
ームを含む）が挙げられる。インビトロおよびインビボでの送達ビヒクルとして
の使用のための好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工膜小胞）で
ある。このような系の調製および使用は、当該分野で周知である。

【００６２】 他の局面において、ＤＳＰ−３プロモーターは、標準的技術を使用して単離さ
れ得る。本発明は、このようなプロモーター配列またはその１つ以上のシス作用
調節エレメントまたはトランス作用調節エレメントを含む、核酸分子を提供する
。このような調節エレメントは、ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）の発
現を増強し得るかまたは抑制し得る。５’隣接領域は、本明細書中に提供される
ゲノム配列に基づいて、標準的技術を使用して生成され得る。必要な場合、さら
なる５’配列が、ＰＣＲに基づく方法または他の標準的方法を使用して生成され
得る。この５’領域は、標準的な方法を使用してサブクローン化され得、そして
配列決定され得る。プライマー伸長法および／またはＲＮａｓｅプロテクション
分析が使用され、ｃＤＮＡから推定される転写開始部位が確認され得る。

【００６３】 プロモーター領域の境界を規定するために、種々の大きさの、推定上のプロモ
ーターインサートが、プロモーターもエンハンサーも含まない適切なレポーター
遺伝子を含む異種発現系にサブクローニングされ得る。適切なレポーター遺伝子
としては、ルシフェラーゼをコードする遺伝子、β−ガラクトシダーゼをコード
する遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺
伝子、分泌アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパ
ク質遺伝子が挙げられ得る。適切な発現系は周知であり、そして周知の技術を用
いて調製され得るか、または市販されている。内部欠失構築物が、唯一の内部制
限部位を用いるか、または唯一ではない制限部位の部分的な消化により、生成さ
れ得る。次いで、構築物は、高レベルのＤＳＰ−３代替形態）発現を示す細胞に
トランスフェクトされ得る。一般に、最小の５’隣接領域がレポーター遺伝子の
最も高い発現レベルを示す構築物は、プロモーターと定義される。このようなプ
ロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され得、そして薬剤を、ＤＳＰ−３
転写を調節する能力について評価するために使用され得る。

【００６４】 一旦、機能的プロモーターが同定されると、シス作用エレメントおよびトラン
ス作用エレメントが位置決定され得る。シス作用配列は、一般に、先に特徴付け
された転写モチーフに対する相同性に基づいて、同定され得る。次いで、点変異
が、同定された配列内に生成されて、このような配列の調節の役割が評価され得
る。このような変異は、部位特異的変異誘発技術またはＰＣＲに基づくストラテ
ジーを用いて、生成され得る。次いで、変更されたプロモーターが、上記のよう
に、レポーター遺伝子発現ベクターにクローニングされ、そしてレポーター遺伝
子発現に対するこの変異の影響が評価される。

【００６５】 本発明はまた、ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）の対立遺伝子改変体
ならびに他の生物由来のＤＳＰ−３配列の使用を意図する。このような配列は、
一般に、本明細書中に提供される配列に対する類似性（例えば、ハイブリダイゼ
ーション技術を用いて）に基づき、そして本明細書中に提供されるアッセイを用
いてＤＳＰ−３活性の存在に基づいて、同定され得る。

【００６６】 一般に、本明細書中に記載されるようなポリペプチドおよびポリヌクレオチド
は、単離されている。「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとは
、その元の環境から取り出された、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドである
。例えば、天然に存在するタンパク質は、天然の系において共存する物質のいく
らかまたは全てから分離されている場合に、単離されている。好ましくは、この
ようなポリペプチドは、少なくとも約９０％純粋であり、より好ましくは少なく
とも約９５％純粋であり、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である
。ポリヌクレオチドは、例えば、天然の環境の一部ではないベクターにクローニ
ングされている場合に、単離されているとみなされる。

【００６７】 （ＤＳＰ−３活性を検出するためのアッセイ） 本発明に従って、ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）の基質は、全長チ
ロシンリン酸化タンパク質およびポリペプチドを含み得、ならびにチロシン残基
においてリン酸化され得、かつ特定の好ましい実施形態においては、セリン残基
またはスレオニン残基においてもリン酸化を受け得る、そのフラグメント（例え
ば、部分）、誘導体またはアナログを含み得る。このようなフラグメント、誘導
体およびアナログとしては、例えばＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）と
複合体を形成することによって、本明細書中に提供されるようなＤＳＰ−３（ま
たはＤＳＰ−３代替形態）と相互作用する生物学的機能を少なくとも維持する、
任意の天然に存在するＤＳＰ−３基質ポリペプチドまたは人工的に操作されたＤ
ＳＰ−３基質ポリペプチドが挙げられる。ＤＳＰ−３基質ポリペプチドのフラグ
メント、誘導体またはアナログ（融合タンパク質である基質を含む）は、以下の
いずれかであり得る：（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、保存アミノ酸残基もし
くは非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換されており、そ
してこのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝コードによりコードされてもコ
ードされなくてもよいアミノ酸残基であるもの、または（ｉｉ）１つ以上のアミ
ノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）基質ポリペプチドが別の化合物
（例えば、そのポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレ
ングリコール）、またはレポーター分子のような検出可能部分）と融合されたも
の、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸（基質のポリペプチドまたはプロタンパク
質配列の精製のために使用されるアミノ酸を含む）が基質のポリペプチドに融合
したもの。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、当業者の範囲内
であるとみなされる。好ましい実施形態において、ＭＡＰキナーゼポリペプチド
は、本明細書中に提供されるような使用のための基質である。

【００６８】 ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）ポリペプチド改変体は、ＭＡＰキナ
ーゼホスファターゼ活性に適した任意のアッセイを用いて、ＤＳＰ−３活性につ
いて試験され得る。このようなアッセイは、インビトロでか、または細胞に基づ
くアッセイにおいて、実施され得る。例えば、ＭＡＰキナーゼは、本明細書中に
提供されるようなＤＳＰ−３基質として使用するために、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ；カタログ番号１４−
１９８）から不活化形態として得られ得る。ＭＡＰキナーゼのリン酸化は、周知
の技術（例えば、ＺｈｅｎｇおよびＧｕａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８
：１６１１６−１６１１９、１９９３により記載されるもの）を使用して、ＭＡ
ＰキナーゼキナーゼＭＥＫ−１（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
から入手可能；カタログ番号１４−２０６）を用いて、実施され得る。

【００６９】 例えば、［³²Ｐ］で放射線標識した基質（例えば、ＭＡＰキナーゼ）を、放射
線標識された活性化ＭＡＰキナーゼを生じるキナーゼ反応のために、使用し得る
。次いで、ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）ポリペプチドは、このＤＳ
Ｐ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）ポリペプチドをＭＡＰキナーゼと適切な条
件下（例えば、Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオト
レイトール、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、３０℃で１０分間；またはＺｈ
ｅｎｇおよびＧｕａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１６１１６−１６１
１９、１９９３により記載されるような）で接触させることにより、活性化ＭＡ
Ｐキナーゼを脱リン酸する能力について試験され得る。ＭＡＰキナーゼの脱リン
酸は、種々のアッセイ（例えば、連結キナーゼアッセイ（当該分野において一般
的に公知の任意のアッセイを用いて、ＭＡＰキナーゼ基質のリン酸化を評価する
））のいずれかを用いるか、または直接的に（（１）放射性リン酸基の損失（例
えば、ゲル電気泳動、続いてオートラジオグラフィーによる）；（２）脱リン酸
の後の電気泳動移動度のシフト；（３）ホスホチロシンまたはホスホスレオニン
に対して特異的な抗体との反応性の損失；あるいは（４）ＭＡＰキナーゼのホス
ホアミノ酸分析、に基づく）、検出され得る。特定のアッセイは、一般に、Ｗａ
ｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３６７：６５１−６５４、１９９４、またはＡｌｅｓｓ
ｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：２０１５−２０２０、１９９３により記載される
ように実施され得る。一般に、５００ｐｇ〜５０ｎｇのＤＳＰ−３ポリペプチド
と、１００ｎｇ〜１００μｇの活性ＭＡＰキナーゼとの接触は、ＭＡＰキナーゼ
の検出可能な脱リン酸を、代表的には２０〜３０分以内に生じるべきである。特
定の実施形態においては、０．０１〜１０単位／ｍＬ（好ましくは約０．１単位
／ｍＬであり、ここで単位とは、１分間あたり１ｎｍｏｌの基質を脱リン酸する
に十分な量である）のＤＳＰ−３ポリペプチドが、０．１〜１０μＭ（好ましく
は約１μＭ）の活性ＭＡＰキナーゼと接触されて、ＭＡＰキナーゼの検出可能な
脱リン酸を生じ得る。好ましくは、ＤＳＰ−３ポリペプチドは、ＭＡＰキナーゼ
の脱リン酸、または相当する量のネイティブなヒトＤＳＰ−３の存在下で観察さ
れる脱リン酸と少なくとも同程度のリン酸化基質（例えば、チロシンリン酸化ペ
プチドおよび／またはセリンリン酸化ペプチド）を生じる。本明細書中に記載の
ような変異をトラップする基質を使用して同定される他の基質が、このようなア
ッセイにおいてＭＡＰキナーゼと置換され得ることが、明らかである。

【００７０】 （抗体および抗原結合フラグメント） ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）に特異的に結合する、ペプチド、ポ
リペプチドおよび他の非ペプチド分子もまた、本発明により意図される。本明細
書中で使用される場合、ある分子が検出可能なレベルでＤＳＰ−３（またはＤＳ
Ｐ−３代替形態）と反応するが、関連しない配列または異なるホスファターゼの
配列を含むペプチドとは検出可能に反応しない場合に、この分子はＤＳＰ−３（
またはＤＳＰ−３代替形態）に「特異的に結合する」といわれる。好ましい結合
分子としては抗体が挙げられ、これは、例えば、ポリクローナル、モノクローナ
ル、単鎖、キメラ、抗イディオタイプ、ＣＤＲ移植免疫グロブリン、またはその
フラグメント（例えば、タンパク分解的に産生されたか、または組換え的に作製
された免疫グロブリンＦ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＦｄフラグメント
）であり得る。特定の好ましい抗体は、本明細書中で記載されるようなインビト
ロアッセイにおいてＤＳＰ−３の活性を阻害またはブロックする抗体である。抗
体のＤＳＰ−３への結合特性は、一般に、免疫検出法（例えば、酵素結合免疫測
定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、免疫ブロッティングなどを含む）を使用して評
価され得、これらは当業者により容易に実施され得る。

【００７１】 当該分野において周知の方法を使用して、ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替
形態）に特異的な抗体、ポリクローナル抗血清、またはモノクローナル抗体が産
生され得る。抗体はまた、所望の特性を有するように設計された、遺伝的に操作
された免疫グロブリン（Ｉｇ）またはＩｇフラグメントとして産生され得る。例
えば、例示の目的であって限定ではないが、抗体は、第１の哺乳類種からの少な
くとも１つの可変（Ｖ）領域ドメインおよび第２の異なる哺乳類種からの少なく
とも１つの定常領域ドメインを有するキメラ融合タンパク質である組換えＩｇＧ
を含み得る。最も一般的には、キメラ抗体は、マウス可変領域配列およびヒト定
常領域配列を有する。このようなマウス／ヒトキメラ免疫グロブリンは、マウス
抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植することによって「ヒト化」され得
、これは抗原への、ヒト誘導Ｖ領域フレームワーク領域およびヒト誘導定常領域
への結合特異性を与える。これらの分子のフラグメントは、タンパク分解性消化
によって、または必要に応じて、タンパク分解性消化に続く穏やかなジスルフィ
ド結合の還元およびアルキル化によって産生され得る。あるいは、このようなフ
ラグメントはまた、組換え遺伝操作技術によって産生され得る。

【００７２】 本明細書中で使用される場合、抗体が、ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形
態）に検出可能なレベルで反応する場合、好ましくは親和性定数Ｋａが約１０4
Ｍ-1以上の場合、より好ましくは約１０5Ｍ-1以上の場合、より好ましくは約１
０6Ｍ-1以上の場合、そしてさらにより好ましくは約１０7Ｍ-1以上の場合に、抗
体はＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）ポリペプチドに「免疫特異的」ま
たは「特異的に結合」といわれる。結合パートナーまたは抗体の親和性は、慣習
的な技術（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ５１：６６０（１９４９））に記載される方法または表面プラスモン
レゾナンス（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ
Ｊ）を使用して容易に決定され得る。例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．５３：２５６０−２５６５（１９９３）を参照のこと。

【００７３】 抗体は、一般に、当業者に公知の種々の任意の技術によって調製され得る。例
えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（
１９８８）を参照のこと。このような技術の１つにおいて、動物は、抗原として
ＤＳＰ−３を用いて免疫化され、ポリクローナル抗血清を産生する。適切な動物
としては、例えば、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシが挙げられ、そしてより
小さな哺乳類種（例えば、マウス、ラット、およびハムスター）または他の種も
また挙げられ得る。

【００７４】 免疫原は、ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）、精製されたかまたは部
分的に精製されたＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）ポリペプチドまたは
その改変体もしくはフラグメント（例えば、ペプチド）、あるいはＤＳＰ−３ペ
プチドを発現する細胞から構成され得る。ＤＳＰ−３ペプチドは、タンパク分解
性切断によって産生され得るか、または化学的に合成され得る。例えば、ＤＳＰ
−３（またはＤＳＰ−３代替形態）ポリペプチドをコードする核酸配列が本明細
書中で提供され、その結果当業者は、免疫原として使用するためのこれらのポリ
ペプチドを日常的に調製し得る。免疫化のための有用なポリペプチドまたはペプ
チドはまた、宿主動物において免疫原性応答をより作製しそうなアミノ酸配列を
決定するために、当業者に公知の方法に従って、ＤＳＰ−３の１次、２次、およ
び３次構造を分析することによって選択され得る。例えば、Ｎｏｖｏｔｎｙ、１
９９１ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２０１−２０７：Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ
、１９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：９３２−４０を参照のこと。

【００７５】 動物への注射のための免疫原の調製は、ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形
態）ポリペプチド（またはその改変体もしくはフラグメント）の、別の免疫原性
タンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）またはウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなキャリアタンパク質）への共有結合を含み得
る。さらに、免疫原として使用されるＤＳＰ−３ペプチド、ポリペプチド、また
はＤＳＰ−３発現細胞は、アジュバント中で乳濁化され得る。例えば、Ｈａｒｌ
ｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参
照のこと。一般に、最初の注射の後に、動物は、特に抗原、アジュバント（存在
する場合）、および／または特定の動物種に従って変化し得る好ましいスケジュ
ールに従って、１つ以上のブースタ免疫化を受ける。免疫応答は、特異的抗体力
価を決定するために、動物を定期的に出血させ、集めた血液から血清を分離し、
そしてこの血清を免疫アッセイ（例えばＥＬＩＳＡまたはオクタロニー拡散アッ
セイなど）において分析することによってモニターされ得る。一旦、抗体力価が
確立されると、動物は、ポリクローナル抗血清を集めるために、定期的に出血さ
れ得る。次いで、ＤＳＰ−３ポリペプチドまたはペプチドに特異的に結合するポ
リクローナル抗体は、このような抗血清から精製（例えば、プロテインＡまたは
適切な固体支持体に固定されたＤＳＰ−３ポリペプチドを用いるアフィニティー
クロマトグラフィーによって）され得る。

【００７６】 ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）ポリペプチドまたはそのフラグメン
トもしくは改変体に特異的に結合するモノクローナル抗体、および所望の結合特
異性を有するモノクローナル抗体を産生する不死の真核生物細胞株のハイブリド
ーマもまた、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、２
５６：４９５−４９７；１９７６ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−
５１９（１９７６））の技術およびその改善方法を使用して調製され得る。動物
（例えば、ラット、ハムスター、または好ましくはマウス）は、上記のように調
製されたＤＳＰ−３免疫原で免疫化される。抗体形成細胞、代表的には脾臓細胞
を含むリンパ細胞は、免疫化動物から得られ、そして薬物感作骨髄腫（例えば、
プラズマ細胞腫）細胞融合パートナー（好ましくは、免疫化動物と同系、そして
必要に応じて他の所望の性質（例えば、内因性Ｉｇ遺伝子産物の発現能力を有さ
ない）を有するパートナー）との融合によって不死化され得る。リンパ（例えば
、脾臓）細胞および骨髄腫細胞は、膜融合促進剤（例えば、ポリエチレングリコ
ールまたは非イオン性界面活性剤）と数分間結合され得、次いでハイブリド−マ
細胞の増殖を支持するが、骨髄腫細胞を融合しない選択培地上で低密度でプレー
トされ得る。好ましい選択培地は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、
チミジン）である。十分な時間（普通約１〜２週間）の後に、細胞のコロニーの
が観測される。１つのコロニーを単離し、この細胞によって産生される抗体が、
ＤＳＰ−３ポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントに対する結合活
性について試験され得る。高い親和性およびＤＳＰ−３抗原に対して特異的であ
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが好ましい。従って、ＤＳＰ−
３ポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントに特異的に結合するモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマは、本発明によって意図される。

【００７７】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物の上清から単離され得る。マウ
スモノクローナル抗体の産生の代替方法は、同系マウス（例えば、このモノクロ
ーナル抗体を含む腹水の形成を促進するために処置された（例えば、プリスタン
刺激された）マウス）の腹腔にこのハイブリドーマ細胞を注射することである。
従来技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈澱、抽出など）によって
、引き続き（通常は１〜３週間以内）得られた腹水から、汚染物質が除去され得
る。例えば、抗体は、このモノクローナル抗体の特定の性質（例えば、重鎖また
は軽鎖イソタイプ、結合特異性など）に基づいて選択された適切なリガンドを使
用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。固体支持体に
固定される適切なリガンドの例としては、プロテインＡ、プロテインＧ、抗定常
領域（軽鎖または重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体およびＤＳＰ−３ポリペプ
チドまたはそのフラグメントもしくは改変体が挙げられる。

【００７８】 ヒトモノクローナル抗体は、当業者が精通した多数の技術によって産生され得
る。このような方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ヒト
抹消血球（例えば、Ｂリンパ球を含む）のエプステイン−バーウイルス（ＥＢＶ
）形質転換、ヒトＢ細胞のインビトロ免疫化、酵母人工クロモソーム（ＹＡＣ）
によって挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する免疫化トランスジェニ
ックマウスからの脾臓細胞の融合、ヒト免疫グロブリンＶ領域ファージライブラ
リーからの単離、または本明細書中の開示に基づく当該分野で公知の他の手順。

【００７９】 例えば、ヒトモノクローナル抗体を産生するための１つの方法としては、ＥＢ
Ｖ形質転換によるヒト抹消血球の不死化が挙げられる。例えば、米国特許第４，
４６４，４５６号を参照のこと。ＤＳＰ−３ポリペプチド（またはその改変体も
しくはフラグメント）に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する不死化
細胞株は、本明細書中で提供されるような免疫検出法（例えば、ＥＬＩＳＡ）に
よって同定され、次いで標準的クローニング技術によって単離され得る。ヒトモ
ノクローナル抗体を産生するための別の方法は、ヒト脾臓Ｂ細胞を抗原で刺激し
、続いて刺激されたＢ細胞の異種ハイブリッド融合パートナーとの融合を含む、
インビトロ免疫化である。例えば、Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１ Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１４７：８６−９５を参照のこと。

【００８０】 本発明における使用のためのヒトＤＳＰ−３特異的モノクローナル抗体および
ポリクローナル抗血清の産生のためのさらに別の方法は、トランスジェニックマ
ウスに関連する。例えば、米国特許第５，８７７，３９７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａ
ｎｎら、１９９７ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５−
５８；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９５ Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．７６４：５２５−３５を参照のこと。これらのマウスにおいて、ヒト免疫グロ
ブリン重鎖および軽鎖遺伝子は、遺伝操作によって生殖系列配列に人工的に導入
され、そして内因性マウス免疫グロブリン遺伝子は不活性化される。例えば、Ｂ
ｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９９７ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．８：４５５−５８を参照のこと。例えば、ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、
ミニ遺伝子構築物であり得るか、または酵母人工クロモソームのトランス遺伝子
座であり得、これはマウスリンパ組織におけるＢ細胞特異的ＤＮＡ転位および過
剰変異を起こす。例えば、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９９７ Ｃｕｒｒ．Ｏｐ
ｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５−５８を参照のこと。ＤＳＰ−３に特
異的に結合するヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニック動物の免疫化、
脾臓細胞の骨髄腫での融合、上記のような抗体を産生する細胞の選択およびクロ
ーニングによって得られ得る。ヒト抗体を含むポリクローナル血清はまた、免疫
化動物の血液から得られる。

【００８１】 ＤＳＰ−３（ヒト化抗体を含む）に特異的なキメラ抗体はまた、本発明に従っ
て産生され得る。キメラ抗体は、第１の哺乳類種由来の少なくとも１つの定常領
域ドメインおよび第２の異なる哺乳類種由来の少なくとも１つの可変領域ドメイ
ンを有する。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−５５を参照のこと。好ましい実施形
態において、キメラ抗体は、マウス、ラット、またはハムスターのモノクローナ
ル抗体由来の可変領域のような非ヒトモノクローナル抗体由来の少なくとも１つ
の可変領域ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を、少なくとも１つのヒ
ト定常領域をコードする核酸配列を含むベクターにクローニングすることによっ
て構築され得る。例えば、Ｓｈｉｎら、１９８９ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．１７８：４５９−７６；Ｗａｌｌｓら、１９９３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２９２１−２９を参照のこと。例示目的として、マウス
モノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列は、ヒト
κ軽鎖定常領域配列をコードする核酸配列を含むベクターに挿入され得る。別個
のベクターにおいて、モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌク
レオチド配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域をコードする配列を有するフレームにク
ローンされ得る。選択された特定のヒト定常領域は、特定の抗体に対して所望さ
れるエフェクター機能に依存し得る（例えば、相補的固定、特定のＦｃレセプタ
ーへの結合など）。キメラ抗体を産生するための、当該分野で公知の別の方法は
、相同組換え（例えば、米国特許第５，４８２，８５６号）である。好ましくは
、ベクターは、キメラ抗体の安定した発現のために、真核生物細胞にトランスフ
ェクトされる。

【００８２】 非ヒト／ヒトキメラ抗体は、「ヒト化」抗体を作製するために、さらに遺伝操
作され得る。このようなヒト化抗体は、非ヒト哺乳類種の免疫グロブリン由来の
複数のＣＤＲ、少なくとも１つのヒト可変フレームワーク領域、および少なくと
も１つのヒト免疫グロブリン定常領域を含み得る。特定の実施形態におけるヒト
化は、例えば、ＤＳＰ−３結合可変領域が得られる非ヒトモノクローナル抗体、
またはこのようなＶ領域および上記のような少なくとも１つのヒトＣ領域を有す
るキメラ抗体のいずれかと比較した場合に、ＤＳＰ−３に対する減少した結合親
和性を有する抗体を提供し得る。従って、ヒト化抗体の設計について有用な計略
は、例えば、例示目的であって限定ではないが、キメラ抗体の非ヒトフレームワ
ーク領域に最も相同的なヒト可変フレームワーク領域の同定が挙げられ得る。理
論に束縛されることは望まないが、このような計略は、ヒト化抗体がＤＳＰ−３
に対する特異的結合親和性を保持している可能性を増加し得、いくつかの好まし
い実施形態において、これはＤＳＰ−３ポリペプチドまたはその改変体もしくは
フラグメントに対して実質的に同じ親和性であり得、そして他の特定の好ましい
実施形態において、これはＤＳＰ−３に対してより大きな親和性であり得る。例
えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６ Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−２５；Ｒｉｅ
ｃｈｍａｎｎら、１９８８ Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−２７を参照のこと
。従って、このようなヒト化抗体の設計は、非ヒト可変領域のＣＤＲループ構造
および構造決定因子の決定（例えば、コンピュータモデリングによる）、次いで
このＣＤＲループおよび決定因子の、公知のヒトＣＤＲループ構造および決定因
子との比較を含み得る。例えば、Ｐａｄｌａｎら、１９９５ ＦＡＳＥＢ ９：
１３３−３９；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９ Ｎａｔｕｒｅ、３４２：３７７−
３８３を参照のこと。コンピュータモデリングはまた、非ヒト可変領域での配列
相同性によって選択されたヒト構造テンプレートを比較するために使用され得る
。例えば、Ｂａｊｏｒａｔｈら、１９９５ Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：９
５−１０３；ＥＰ−０５７８５１５−Ａ３を参照のこと。非ヒトＣＤＲのヒト化
が結合親和性の減少を生じる場合、コンピュータモデリングは、親和性を部分的
に、完全に、または超えて最適に（すなわち、非ヒト化抗体よりも高いレベルま
で増加）回復させるために、部位指向的または他の突然変異誘発技術によって変
化され得る特異的アミノ酸残基の同定を援助し得る。当業者はこれらの技術に精
通しており、そしてこのような設計計略についての多くの変化および改変を容易
に理解する。

【００８３】 特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントの使用が好ましくあり
得る。このようなフラグメントには、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）2
フラグメントが含まれ、これは、それぞれパパインまたはペプシンでのタンパク
分解性消化によって調製され得る。抗原結合フラグメントは、例えば、固定化プ
ロテインＡまたはプロテインＧ、あるいは固定化ＤＳＰ−３ポリペプチド、ある
いはその適切な改変体またはフラグメントを使用するアフィニティークロマトグ
ラフィーによってＦｃフラグメントから分離され得る。当業者は、日常的にかつ
過度の実験なしで、例えば、本明細書中で提供される免疫検出法を使用して、得
られた親和性精製抗体の特徴に基づく適切な改変体またはフラグメントを決定し
得る。Ｆａｂフラグメントを産生するための代替方法としては、Ｆ（ａｂ’）2
フラグメントの穏やかな還元に続くアルキル化が挙げられる。例えば、Ｗｉｅｒ
、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
、１９８６、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｓｔｏｎを参照
のこと。

【００８４】 特定の実施形態に従って、上記のＩｇ分子の任意の非ヒト、ヒト、またはヒト
化重鎖および軽鎖の可変領域は、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ポリペプチドフラグメント
（単鎖抗体）として構築され得る。例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照のこと。多機
能性ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖポリペプチドインフレームをコードするポ
リヌクレオチド配列の、種々の任意の公知のエフェクタータンパク質をコードす
る少なくとも１つのポリヌクレオチド配列への結合によって産生され得る。これ
らの方法は、当該分野で公知であり、そして例えばＥＰ−Ｂ１−０３１８５５４
、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号、および
米国特許第５，４７６，７８６号に開示される。例示の目的として、エフェクタ
ータンパク質は、免疫グロブリン定常領域配列を含み得る。例えば、Ｈｏｌｌｅ
ｎｂａｕｇｈら、１９９５ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８８：１
−７を参照のこと。エフェクタータンパク質の他の例は酵素である。非限定的な
例として、このような酵素は、治療目的のための生物学的活性を提供し得る（例
えば、Ｓｉｍｅｒｓら、１９７７ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．８：５１０
−１９を参照のこと）か、または多くの任意の周知の基質から検出可能な産物へ
の、診断的使用のためのホースラディッシュペルオキシダーゼ触媒変換のような
、検出可能な活性を提供し得る。ｓＦｖ融合タンパク質のさらに他の例としては
、Ｉｇ−毒素融合、または免疫毒素が挙げられ、ここで、ｓＦｖポリペプチドは
毒素に結合される。適切な条件下で、細胞に対して毒性であることが同定された
広範な種々のポリペプチド配列を、当業者は理解する。本明細書中で使用される
場合、免疫グロブリン−毒素融合タンパク質に包含される毒性ポリペプチドは、
例えば、生活機能での直接干渉によってかまたはアポトーシス誘導によって、細
胞の生存を損なう様式で細胞内に導入され得る任意のポリペプチドであり得る。
従って、毒素は、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒
素Ａ、植物ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、Ｂｒｙｏｎｉａ ｄｉｏｉｃａからの
ブリオジン（ｂｒｙｏｄｉｎ）などのようなリボソーム不活性化タンパク質が挙
げられ得る。例えば、Ｔｈｒｕｓｈら、１９９６ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１４：４９−７１；Ｆｒａｎｋｅｌら、１９９６ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．５６：９２６−３２を参照のこと。化学治療剤、抗有糸分裂剤、抗体、アポ
トーシス誘導因子（または「アポトーゲン（ａｐｏｐｔｏｇｅｎ）」、例えばＧ
ｒｅｅｎおよびＲｅｅｄ、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：１３０９−１３
２１を参照のこと）などを含む多数の他の毒素は、当業者に公知であり、そして
本明細書中に提供される例は、本発明の範囲および精神を限定することのない例
示として意図される。

【００８５】 特定の実施形態において、ｓＦｖは、融合タンパク質と抗原（例えば、ＤＳＰ
−３）との間の特異的結合の検出を可能にするペプチドまたはポリペプチドドメ
インに融合され得る。例えば、この融合ポリペプチドドメインは、親和性タグポ
リペプチドであり得る。従って、結合パートナー（例えば、ＤＳＰ−３）へのｓ
Ｆｖ融合タンパク質の結合は、当業者が精通する任意の種々の技術によって、ア
ビジン、ストレプトアビジンまたはＨｉｓ（例えば、ポリヒスチジン）タグのよ
うな親和性ポリペプチドまたはペプチドタグを使用して検出され得る。検出技術
はまた、例えば、アビジンまたはストレプトアビジン融合タンパク質の、ビオチ
ンまたはビオチン模倣配列への結合（例えば、Ｌｕｏら、１９９８ Ｊ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ．６５：２２５およびそこに列挙される参考文献を参照のこと）
、検出可能な部分（例えば、標識部分）を有する融合タンパク質の直接共有結合
的改変、特異的標識化レポーター分子への融合タンパク質の非共有結合、酵素活
性を有する部分を含む融合タンパク質による検出可能な基質の酵素的改変、また
は融合タンパク質の固相支持体への固定（共有結合または非共有結合）を含み得
る。

【００８６】 従って、所望の親和性特性を有するエフェクターペプチドのような別のポリペ
プチドに融合した、ＤＳＰ−３特異的免疫グロブリン誘導ポリペプチドを含む本
発明のｓＦｖタンパク質は、例えば、エフェクターペプチドがグルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼのような酵素である融合タンパク質を含み得る。別の例と
して、ｓＦｖ融合タンパク質はまた、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅ
ｕｓプロテインＡポリペプチドに融合されたＤＳＰ−３特異的Ｉｇポリペプチド
を含み得；核酸をコードするプロテインＡおよび免疫グロブリン定常領域に対し
て親和性を有する融合タンパク質の構築におけるその用途は、一般に、例えば米
国特許第５，１００，７８８号に開示される。ｓＦｖ融合タンパク質の構築に有
用な他の親和性ポリペプチドは、例えばＷＯ８９／０３４２２；米国特許第５，
４８９，５２８号；米国特許第５、６７２、６９１号；ＷＯ９３／２４６３１；
米国特許第５，１６８，０４９号；米国特許第５，２７２，２５４号およびその
他の個所に開示されるストレプトアビジン融合タンパク質、ならびにアビジン融
合タンパク質（例えば、ＥＰ ５１１，７４７を参照のこと）を含み得る。本明
細書中で提供されるように、ｓＦｖポリペプチド配列は、全長融合ポリペプチド
を含み得そして代替的にその改変体またはフラグメントを含み得るエフェクター
タンパク質配列を含む、融合ポリペプチド配列に融合され得る。

【００８７】 ＤＳＰ−３ポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントに特異的に結
合する抗体を選択するためのさらなる方法は、ファージディスプレイである。例
えば、Ｗｉｎｔｅｒら、１９９４ Ａｎｎｕｌ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２
：４３３−５５；Ｂｕｒｔｏｎら、１９９４ Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：
１９１−２８０を参照のこと。ヒトまたはマウスの免疫グロブリン可変領域遺伝
子コンビナトリアルライブラリーは、ＤＳＰ−３ポリペプチドまたはその改変体
もしくはフラグメントに特異的に結合するＩｇフラグメント（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓ
Ｆｖまたはこれらのマルチマー）を選択するためにスクリーニングされ得るファ
ージベクターにおいて作製され得る。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号
；Ｈｕｓｅら、１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−８１；Ｋａｎｇ
ら、１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４３６
３−６６；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９２ Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２
２７：３８１−３８８；Ｓｃｈｌｅｂｕｓｃｈら、１９９７ Ｈｙｂｒｉｄｏｍ
ａ １６：４７−５２およびこれらに列挙される参考文献を参照のこと。例えば
、Ｉｇ可変領域フラグメントをコードする複数のポリヌクレオチド配列を含むラ
イブラリーは、Ｍ１３またはその改変体のような糸状のバクテリオファージの遺
伝子に、Ｍ１３融合タンパク質を作製するために、例えばＭ１３の遺伝子ＩＩＩ
または遺伝子ＶＩＩＩのようなファージコートタンパク質をコードする配列を用
いて、インフレームで挿入され得る。融合タンパク質は、コートタンパク質と軽
鎖可変領域ドメインおよび／または重鎖可変領域ドメインとの融合物であり得る
。

【００８８】 特定の実施形態に従って、免疫グロブリンＦａｂフラグメントはまた、以下の
ようにファージ粒子上に提示され得る。Ｉｇ定常領域ドメインをコードするポリ
ヌクレオチド配列は、コートタンパク質を用いてインフレームでファージゲノム
に挿入され得る。従って、このファージコート融合タンパク質は、Ｉｇ軽鎖また
は重鎖フラグメント（Ｆｄ）と融合され得る。例えば，ヒトＩｇライブラリーか
ら、ヒトκ定常領域をコードするポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つのフ
ァージコートタンパク質をコードする配列を用いて、インフレームでベクターに
挿入され得る。さらに、または代替的に、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインをコー
ドするポリヌクレオチド配列は、少なくとも１つの他のファージコートタンパク
質をコードする配列を用いて、インフレームで挿入され得る。次いで、可変領域
ドメインをコードする複数のポリヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡライブラリ
ー由来の）は、バクテリオファージコートタンパク質に融合するＦａｂフラグメ
ントを発現するために、定常領域コートタンパク質融合物を用いて、インフレー
ムでベクターに挿入され得る。

【００８９】 ＤＳＰ−３ポリペプチドに結合するＩｇフラグメント（例えば、Ｉｇ Ｖ領域
またはＦａｂ）を表示するファージは、このファージライブラリーをＤＳＰ−３
またはその改変体もしくはフラグメントと混合することによって、あるいはこの
ファージライブラリーを、結合するのに十分な条件下および時間で固体マトリッ
クス上に固定されたＤＳＰ−３ポリペプチドに接触させることによって、選択さ
れ得る。非結合ファージは、洗浄液によって除去され、この洗浄液は代表的には
低濃度の塩（例えば、ＮａＣｌ）、好ましくは１００ｍＭ未満のＮａＣｌ、より
好ましくは５０ｍＭ未満のＮａＣｌ、最も好ましくは１０ｍＭ未満のＮａＣｌを
含む緩衝液であり得るか、または塩を含まない緩衝液であり得る。次いで、特異
的に結合したファージは、ＮａＣｌ含有緩衝液で溶出される（例えば、段階的様
式で塩濃度を増加させることによって）。代表的には、高親和性でＤＳＰ−３に
結合するファージは、開放するのにより高い塩濃度を必要とする。溶出されたフ
ァージは、適切な細菌性宿主に伝播され得、そして一般に、ＤＳＰ−３特異的免
疫グロブリンを発現するファージの収量を増加させるために、ＤＳＰ−３結合お
よび溶出の連続的ラウンドが繰り返され得る。コンビナトリアルファージライブ
ラリーはまた、非ヒト可変領域のヒト化のために使用され得る。例えば、Ｒｏｓ
ｏｋら、１９９６ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−１８；Ｒａ
ｄｅｒら、１９９８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：
８９１０−１５を参照のこと。このようにして選択されたファージ中に挿入され
た免疫グロブリン遺伝子のＤＮＡ配列は、標準的技術によって決定され得る。Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐ
ｒｅｓｓを参照のこと。次いで、親和性選択されたＩｇコード配列は、Ｉｇフラ
グメントの発現のために別の適切なベクター内にクローニングされ得るか、また
は必要に応じて、免疫グロブリン全体の鎖の発現のために、Ｉｇ定常領域を含む
ベクターにクローニングされ得る。

【００９０】 ファージディスプレイ技術はまた、ＤＳＰ−３に結合するポリペプチド、ペプ
チドまたは単鎖抗体を選択するために使用され得る。このようなペプチドまたは
抗体をコードする候補核酸分子（例えば、ＤＮＡ）が挿入され得るマルチクロー
ニング部位を有する適切なベクターの例として、ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙｒら、Ｇ
ｅｎｅ １２８：２９−３６、１９９３；Ｓｃｏｔｔら、１９９０ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｓｍｉｔｈら、１９９３ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．２１７：２２８−２５７；Ｆｉｓｃｈら、１９９６、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７７６１−６６を参照のこと。挿
入されたＤＮＡ分子は、ランダムに産生された配列を含み得るか、または本明細
書中で提供されるようなＤＳＰ−３ポリペプチドまたはその改変体もしくはフラ
グメントに特異的に結合する公知のペプチドまたはポリペプチドドメインの改変
体をコードし得る。一般に、核酸挿入物は、６０アミノ酸までのペプチド、より
好ましくは３〜３５アミノ酸のペプチド、そしてさらにより好ましくは６〜２０
アミノ酸のペプチドをコードする。挿入された配列によってコードされるペプチ
ドは、バクテリオファージの表面に表示される。ＤＳＰ−３ポリペプチドに対す
る結合ドメインを発現するファージは、上記のような固定されたＤＳＰ−３ポリ
ペプチドへの特異的結合に基づいて選択され得る。本明細書中で提供される場合
、周知の組換え遺伝技術は、そのフラグメントを含む融合タンパク質を構築する
ために使用され得る。例えば、産生され得るポリペプチドは、得られた産物のＤ
ＳＰ−３に対する結合親和性を最大にするために、２つ以上の同様な、または異
なる親和性選択されたＤＳＰ−３結合ペプチドドメインのタンデムアレイを含む
。

【００９１】 他の特定の実施形態において、本発明は、マルチマー抗体フラグメントである
ＤＳＰ−３特異的抗体を意図する。有用な方法論は、一般に、例えばＨａｙｄｅ
ｎら、１９９７、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２０１−１２；Ｃ
ｏｌｏｍａら、１９９７ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９−６３
に記載される。例えば、マルチマー抗体フラグメントは、ミニ抗体（ｍｉｎｉａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（米国特許第５，９１０，５７３号）またはディアボディ
（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４５：１２８−１３０）を形成するための
ファージ技術によって作製され得る。ＤＳＰ−３特異的Ｆｖのマルチマーまたは
異なる高原特異性を有する第２のＦｖに非共有結合的に会合したＤＳＰ−３特異
的Ｆｖを含む二特異的抗体であるマルチマーフラグメントが、産生され得る。例
えば、Ｋｏｅｌｅｍｉｊら、１９９９ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２２：５１
４−２４を参照のこと。別の例として、マルチマー抗体は、２つの単鎖抗体また
はＦａｂフラグメントを有する二特異的抗体を含み得る。特定の関連した実施形
態に従って、第１のＩｇフラグメントは、ＤＳＰ−３ポリペプチド（またはその
改変体もしくはフラグメント）上の第１抗原性決定因子に特異的であり得、一方
第２Ｉｇフラグメントは、ＤＳＰ−３ポリペプチドの第２抗原性決定因子に特異
的であり得る。あるいは、他の特定の関連した実施形態において、第１免疫グロ
ブリンフラグメントは、ＤＳＰ−３ポリペプチドまたはその改変体もしくはフラ
グメント上の抗原性決定因子について特異的であり得、そして第２の免疫グロブ
リンフラグメントは、第２の異なる（すなわち、非ＤＳＰ−３）分子上の抗原性
決定因子について特異的であり得る。ＤＳＰ−３に特異的に結合する二特異的抗
体もまた意図され、ここで少なくとも１つの抗原結合ドメインは、融合タンパク
質として存在する。

【００９２】 ＤＳＰ−３結合免疫グロブリン分子へのアミノ酸変異の導入は、ＤＳＰ−３に
対する特異性または親和性を増加するために、あるいはエフェクター機能を変え
るために有用であり得る。ＤＳＰ−３に対する高い親和性を有する免疫グロブリ
ンは、特定の残基の部位指向突然変異によって産生され得る。コンピュータに補
助される３次元分子モデリングは、ＤＳＰ−３ポリペプチドに対する親和性を改
善するために、変化されるべきアミノ酸残基を同定するために使用され得る。例
えば、Ｍｏｕｎｔａｉｎら、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅ
ｎｇ．１０：１−１４２を参照のこと。あるいは、ＣＤＲのコンビナトリアルラ
イブラリーは、Ｍ１３ファージにおいて産生され得、そして改善された親和性を
有する免疫グロブリンフラグメントについてスクリーニングされる。例えば、Ｇ
ｌａｓｅｒら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３９０３−３９１３；
Ｂａｒｄａｓら、１９９４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９１：３８０９−１３；米国特許第５，７９２，４５６号を参照のこと。

【００９３】 エフェクター機能はまた、部位指向突然変異によって変化され得る。例えば、
Ｄｕｎｃａｎら、１９８８ Ｎａｔｕｒｅ ３３２：５６３−６４；Ｍｏｒｇａ
ｎら、１９９５ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６：３１９−２４；Ｅｇｈｔｅｄａ
ｒｚｅｄｅｈ−Ｋｏｎｄｒｉら、１９９７ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３
：８３０−３４を参照のこと。例えば、免疫グロブリンのＦｃタンパク質上のグ
リコシル化部位の突然変異は、免疫グロブリンが相補鎖に固定する能力を変化し
得る。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、１９９７ Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．１５：２６−３２を参照のこと。定常領域ドメインにおける他の突然変異は
、免疫グロブリンが相補鎖に固定する能力を変化し得るか、または抗体依存性細
胞傷害性の効果を変化し得る。例えば、Ｄｕｎｃａｎら、１９８８ Ｎａｔｕｒ
ｅ ３３２：５６３−６４；Ｍｏｒｇａｎら、１９９５ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
８６：３１９−２４；Ｓｅｎｓｅｌら、１９９７ Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
３４：１０１９−２９を参照のこと。

【００９４】 本明細書中に記載されるＤＳＰ−３に特異的に結合する抗体またはそのフラグ
メントをコードする核酸分子は、核酸切除、連結、形質転換およびトランスフェ
クションのための任意の種々の周知の手順に従って、伝播されそして発現され得
る。従って、特定の実施形態において、抗体フラグメントの発現は、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような原核生物宿主において好ましくあり得る（例え
ば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎら、１９８９ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７
８：４９７−５１５を参照のこと）。他の特定の実施形態において、抗体または
そのフラグメントの発現は、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅおよ
びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、動物細胞（哺乳動物細胞を含む）または
植物細胞を含む真核生物宿主細胞において好ましくあり得る。適切な動物細胞の
例としては、限定ではないが、骨髄腫、ＣＯＳ，ＣＨＯ、またはハイブリドーマ
細胞が挙げられる。植物細胞の例としては、タバコ、トウモロコシ、ダイズ、お
よびイネの細胞が挙げられる。当業者に公知の手法に従って、そして本開示に基
づいて、核酸ベクターは、特定の宿主系において外来配列を発現するために設計
され得、次いでＤＳＰ−３結合抗体（またはそのフラグメント）をコードするポ
リヌクレオチド配列が挿入され得る。調節エレメントは、特定の宿主に従って変
化する。

【００９５】 本明細書中に記載されるＤＳＰ−３結合免疫グロブリン（またはそのフラグメ
ント）は、酵素、細胞傷害剤、または他のレポーター分子（色素、放射性核種、
発光基、蛍光基、またはビオチンなどを含む）のような検出可能な部位または標
識を含み得る。ＤＳＰ−３特異的免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、診
断または治療の適用のために、放射標識され得る。抗体の放射標識のための技術
は、当該分野で公知である。例えば、Ａｄａｍｓ １９９８ Ｉｎ Ｖｉｖｏ
１２：１１−２１；Ｈｉｌｔｕｎｅｎ １９９３ Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ．３２
：８３１−９を参照のこと。治療適用は、以下に詳細に記載され、そして他の治
療剤と組合わせてＤＳＰ−３結合抗体（またはそのフラグメント）の使用を含み
得る。抗体またはフラグメントはまた、当該分野で公知のそして本明細書中で提
供される細胞傷害剤（例えば、リボソーム不活性化タンパク質のような毒素、化
学治療剤、抗縮瞳剤、抗生物質など）と組合わされ得る。

【００９６】 本発明はまた、本明細書中で提供されるＤＳＰ−３またはその改変体もしくは
フラグメントに特異的に結合する抗体（またはその抗原結合フラグメント）を認
識する抗イディオタイプ抗体の産生を意図する。抗イディオタイプ抗体は、免疫
原として抗ＤＳＰ−３抗体（またはその抗原結合フラグメント）を使用し本明細
書中に記載される方法によって、ポリクローナル抗体として、またはモノクロー
ナル抗体として産生され得る。抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントは
また、上記の任意の組換え遺伝操作法によってか、またはファージディスプレイ
選択によって産生され得る。抗イディオタイプ抗体は、抗ＤＳＰ−３抗体のＤＳ
Ｐ−３ポリペプチドへの結合が競合的に阻害されるように、抗ＤＳＰ−３抗体の
抗原結合部位と反応し得る。あるいは、本明細書中で提供される抗イディオタイ
プ抗体は、抗ＤＳＰ−３抗体のＤＳＰ−３ポリペプチドへの結合を競合的に阻害
しなくてもよい。

【００９７】 本明細書中で提供され、そして当該分野で周知の方法論に従って、ポリクロー
ナルおよびモノクローナル抗体は、ＤＳＰ−３ポリペプチドの親和性単離のため
に使用され得る。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａ
ｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｄｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２を参照のこと。手短に言うと
、抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、固体支持体材料上に固定化され
得、次いで、この支持体材料は目的のポリペプチド（例えば、ＤＳＰ−３）を含
むサンプルと接触される。サンプルの残りからの分離に続いて、次いでこのポリ
ペプチドは、固定化された抗体から放出される。

【００９８】 （ＤＳＰ−３発現を検出するための方法） 本発明の特定の局面は、診断およびアッセイの目的のために、ＤＳＰ−３（ま
たはＤＳＰ−３代替形態）に対して惹起された抗体またはハイブリダイズするポ
リヌクレオチドを使用する方法を提供する。特定のアッセイは、ＤＳＰ−３（ま
たはＤＳＰ−３代替形態）、またはそのタンパク質分解フラグメントの存在また
は非存在を検出するために抗体または他の薬剤を使用することを含む。あるいは
、ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）をコードする核酸は、標準的なハイ
ブリダイゼーションおよび／またはＰＣＲ技術を使用して検出され得る。適切な
プローブおよびプライマーは、本明細書に提供されるＤＳＰ−３（またはＤＳＰ
−３代替形態）ｃＤＮＡ配列に基づいて、当業者によって設計され得る。アッセ
イは、一般的に、真核生物細胞、細菌、ウイルス、このような生物から調製され
た抽出物および生きている生物において見出される流体のような生物学的供給源
から得られる種々のサンプルのいずれかを使用して行われ得る。患者から得られ
得る生物学的サンプルには、血液サンプル、生検検体、組織外植片、器官培養物
および他の組織または細胞調製物が挙げられる。患者または生物学的供給源は、
ヒトまたは非ヒト動物、初代細胞培養物または培養適合細胞株であり得、これに
は、遺伝的に操作された細胞株（染色体的に組み込まれた組換え核酸配列または
エピソーム組換え核酸配列を含み得る）、不死化または不死化可能細胞株、体細
胞ハイブリッド細胞株、分化した細胞株または分化可能な細胞株、形質転換され
た細胞株などが挙げられるが、これらに限定されない。特定の好ましい実施形態
において、患者または生物学的供給源は、ヒトであり、特に好ましい実施形態に
おいて、生物学的供給源は、哺乳動物である非ヒト動物（例えば、ゲッ歯動物（
例えば、マウス、ラット、ハムスターなど）、有蹄動物（例えば、ウシ）または
非ヒト霊長類）である。本発明の特定の他の好ましい実施形態において、患者は
、変化した細胞シグナル伝達と関連した疾患を有すると疑われ得るかまたはその
危険があると疑われ得るか、あるいは、疾患のような危険がないかまたはその存
在がないことが既知であり得る。

【００９９】 ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）タンパク質を検出するために、試薬
は代表的には抗体であり、この抗体は、本明細書中に記載されるように調製され
得る。サンプル中のポリぺプチドを検出するための抗体を使用するための、当業
者に公知の種々のアッセイ形式がある。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。
例えば、このアッセイは、ウェスタンブロット形式で実行され得、この形式にお
いて、生物学的サンプルからのタンパク質調製物を、ゲル電気泳動により分離し
、適切な膜にトランスファーし、そして抗体と反応させる。次いで、膜上の抗体
の存在は、以下に記載されるような適切な検出試薬を用いて検出され得る。

【０１００】 別の実施形態において、アッセイは、固体支持体上に固定された抗体を使用し
、標的ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）に結合させ、そしてサンプルの
残りから取り除くことを包含する。次いで結合されたＤＳＰ−３は、レポーター
基を含む第２の抗体または試薬を用いて検出され得る。あるいは、競合アッセイ
が利用され得る。この競合アッセイにおいて、ＤＳＰ−３ポリぺプチド（または
ＤＳＰ−３代替形態ポリペプチド）を、レポーター基で標識し、そしてサンプル
と共に抗体をインキュベートした後に固定化抗体に結合させる。このサンプルの
成分が標識化ポリぺプチドの抗体ヘの結合を阻害する程度は、このサンプルの固
定化抗体との反応性を示し、そして結果として、サンプル中のＤＳＰ−３（また
はＤＳＰ−３代替形態）のレベルを示す。

【０１０１】 固体支持体は、抗体が結合され得る、当業者に公知の任意の材料（例えば、マ
イクロタイタープレートにおける試験ウェル、ニトロセルロースフィルターまた
は別の適切な膜）であり得る。あるいは、支持体は、ビーズまたは円板（例えば
、ガラス）、ファイバーガラス、ラテックスまたはプラスチック（例えば、ポリ
スチレンまたはポリビニルクロリド）であり得る。当業者に公知の種々の技術（
特許および科学文献に豊富に記載される）を使用して、抗体は、固体支持体上に
固定化され得る。

【０１０２】 特定の実施形態において、サンプル中のＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形
態）の検出のためのアッセイは、２つの抗体のサンドイッチアッセイである。こ
のアッセイは、第１に固体支持体（一般的にはマイクロタイタープレートのウェ
ル）上に固定化された抗体を生物学的サンプルと接触させる工程により実行され
得、その結果、サンプル内のＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）は、固定
化抗体に結合することが可能になる（室温での３０分間のインキュベーション時
間が、一般的に充分である）。次いで、結合されないサンプルを、固定化ＤＳＰ
−３／抗体複合体から除去し、そしてＤＳＰ−３上の異なる部位に結合し得る第
２の抗体（酵素、色素、放射性核種、発光基、蛍光基、またはビオチンのような
レポーター基を含む）を添加する。次いで、固体支持体に結合したままの第２の
抗体の量を、特異的レポーター基に適切な方法を用いて決定する。放射性基につ
いては、シンチレーション計数またはオートラジオグラフィー法が、一般的に適
切である。分光法を使用して、色素、発光基、および蛍光基を検出し得る。ビオ
チンを、異なるレポーター基（一般的に放射性基もしくは蛍光基または酵素）に
結合された、アビジンを使用して検出し得る。酵素レポーター基を、一般的には
基質を（一般的に特定の期間）添加し、次いで、反応産物の分光分析または他の
分析することにより検出し得る。周知の技術を使用して、サンプル中のＤＳＰ−
３のレベルを決定するために、標準および標準添加物を使用し得る。

【０１０３】 本発明の関連する局面において、ＤＳＰ−３およびＤＳＰ−３ホスファターゼ
活性を検出するためのキットが提供される。このようなキットは、ＤＳＰ−３ま
たはＤＳＰ−３をコードする核酸のレベルを検出するために設計され得るか、ま
たは直接ホスファターゼアッセイもしくは結合ホスファターゼアッセイにおいて
、ＤＳＰ−３のホスファターゼ活性を検出し得る。一般的には、本発明のキット
は、アッセイにおいて使用される要素（例えば、試薬または緩衝液）を封入した
１つ以上の容器を含む。

【０１０４】 ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）、またはＤＳＰ−３（またはＤＳＰ
−３代替形態）をコードする核酸のレベルを検出するためのキットは、代表的に
はＤＳＰ−３タンパク質、ＤＳＰ−３ＤＮＡあるいはＤＳＰ−３ＲＮＡに結合す
る試薬を含む。ＤＳＰ−３をコードする核酸を検出するために、試薬は、核酸プ
ローブまたはＰＣＲプライマーであり得る。ＤＳＰ−３タンパク質を検出するた
めに、試薬は、代表的には抗体である。このようなキットはまた、試薬の直接的
または間接的検出に適したレポーター基を含む（すなわち、レポーター基は、こ
の試薬に共有結合で結合され得るか、または第２の分子（例えば、プロテインＡ
、プロテインＧ、免疫グロブリンまたはレクチン）に結合し得、この第２の分子
自身が、試薬に結合し得る）。適切なレポーター基としては、酵素（例えば、セ
イヨウワサビペルオキシダーゼ）、基質、補因子、インヒビター、色素、放射性
核種、発光基、蛍光基およびビオチンが挙げられるが、これらに限定されない。
このようなレポーター基は、当業者に公知の標準的な方法を使用して、サンプル
成分に対する試薬の結合を直接的または間接的に検出するために使用され得る。

【０１０５】 ＤＳＰ−３活性を検出するためのキットは、代表的には適切な緩衝液と組合せ
たＤＳＰ−３基質を含む。ＤＳＰ−３活性は、上記のようなホスファターゼアッ
セイを行う前に、ＤＳＰ−３特異的抗体を用いて免疫沈降工程を実施することに
より特異的に検出され得る。基質の脱リン酸化を検出する際の使用のための他の
試薬もまた提供され得る。

【０１０６】 特定の診断アッセイにおいて、変化したＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形
態）の存在または変化したレベルのＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）発
現に基づいて、増殖障害は、患者または本明細書中に提供されるような任意の別
の生物学的供給源生物において、検出され得る。例えば、抗体は、野生型ＤＳＰ
−３とアミノ酸配列におけるバリエーションを有する変化したＤＳＰ−３とを識
別し得る。このようなバリエーションは、増殖障害の存在、またはこのような障
害の感受性を示し得る。ハイブリダイゼーションおよび増幅技術は、同様に改変
ＤＳＰ−３配列を検出するために使用され得る。

【０１０７】 （ＤＳＰ−３活性のモジュレーターを同定するための方法） 本発明の１つの局面において、ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）ポリ
ペプチドは、ＤＳＰ−３活性を調節する薬剤を同定するために使用され得る。こ
のような薬剤は、ＭＡＰ−キナーゼカスケードを介するシグナル変換を阻害また
は増強し、細胞増殖を引き起こし得る。ＤＳＰ−３活性を調節する薬剤は、ＤＳ
Ｐ−３の発現および／もしくは安定性、ＤＳＰ−３タンパク質活性ならびに／ま
たは基質を脱リン酸化するＤＳＰ−３の能力を変化（例えば、実質的に有意な様
式において上昇または減少）させ得る。このようなアッセイにおいてスクリーニ
ングされ得る薬剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体
およびその抗原結合フラグメント、例えば、触媒部位または二重リン酸化モチー
フを提示する競合基質またはペプチド、ＤＳＰ−３の転写および／または翻訳を
妨害するアンチセンスポリヌクレオチドおよびリボザイム、ならびにＤＳＰ−３
に結合し、そしてＤＳＰ−３を不活化する他の天然分子および合成分子（例えば
、低分子インヒビター）。

【０１０８】 本発明に従うＤＳＰ−３のモジュレーターをスクリーニングする方法における
使用のための候補薬剤は、「ライブラリー」または化合物、組成物もしくは分子
のコレクションとして提供され得る。このような分子は、代表的には、当該分野
において「低分子」として知られ、そして１０５ダルトン未満、好ましくは１０
４ダルトン未満、そしてなおより好ましくは、１０３ダルトン未満の分子量を有
する化合物を含む。例えば、試験化合物のライブラリーのメンバーは、本明細書
中に提供されるような少なくとも１つのＤＳＰ−３ポリペプチド（またはＤＳＰ
−３代替形態ポリペプチド）を各々含む、複数のサンプルに投与され得、次いで
基質のＤＳＰ−３媒介脱リン酸化または基質へのＤＳＰ−３媒介結合を増強また
は阻害するそれらの能力についてアッセイされる。ＤＳＰ−３機能（例えば、ホ
スホチロシンおよび／またはホスホセリン／スレオニン脱リン酸化）に影響を与
え得るとしてこのように同定された化合物は、治療目的および／または診断目的
のために役立つ。なぜなら、これらは、ＤＳＰ−３活性に関連する疾患の処置お
よび／または検出を可能にするからである。このような化合物はまた、ＤＳＰ−
３に関与する分子シグナル伝達機構に関する研究、およびさらなる特異性を示す
将来のＤＳＰ−３化合物の発見および開発における改良に関する研究において役
立つ。

【０１０９】 候補薬剤はさらに、コンビナトリアルライブラリーのメンバーとして提供され
得、これは、好ましくは、複数の反応容器中で行われる所定の複数の化学反応に
従って調製された合成薬剤を含む。例えば、種々の出発化合物は、１以上の固相
合成、記録されたランダム混合手順および記録された反応分割手段を利用して調
製され得、これらは、所定の構成が、複数の順列および／または組み合わせの反
応条件を帰属可能に受けることを可能にする。得られる生成物は、スクリーニン
グされ得、次いで反復の選択および合成手順をされ得るライブラリー（例えば、
ペプチド（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８６９４、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４６
６６（これらは、本明細書中でその全体を参考として援用される）を参照のこと
）または本明細書中で提供されるような低分子を含み得る他の組成物（例えば、
ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８５４２、ＥＰ ０７７４４６４、米国特許第５，７９８
，０３５号、米国特許第５，７８９，１７２号、米国特許第５，７５１，６２９
号（これらは、本明細書中でその全体を参考として援用される）を参照のこと）
の合成コンビナトリアルライブラリー）を構成する。このようなライブラリーの
多様な分類は、確立された手順に従って調製され得、そして本開示に従うＤＳＰ
−３を用いて試験され得ることを、当業者は理解する。

【０１１０】 特定の実施形態においては、調節薬剤は、候補薬剤を、ＤＳＰ−３（またはＤ
ＳＰ−３代替形態）ポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドと、インビトロまたはインビボで組み合わせ、そして候補薬剤の
ＤＳＰ−３ホスファターゼ活性に対する効果を、例えば、本明細書中に記載され
る代表的なアッセイを用いて評価することによって同定され得る。ホスファター
ゼ活性における増加または減少は、候補薬剤の存在下および非存在下で、本明細
書中に提供される代表的なアッセイを行うことによって測定され得る。手短には
、候補薬剤は、活性ＤＳＰ−３ポリペプチドと基質（例えば、リン酸化ＭＡＰ−
キナーゼ）の混合物中に、この混合物の１以上の成分とのプレインキュベーショ
ンありまたはなしで含まれ得る。一般的に、抗体またはこのようなアッセイにお
ける使用のための他の薬剤の適切な量は、約０．０１μＭ〜約１００μＭの範囲
である。次いで、薬剤のＤＳＰ−３活性への効果は、基質からのホスフェートの
損失を定量化し、そしてその損失を、候補薬剤の添加なしでＤＳＰ−３を用いて
達成された損失と比較することによって評価され得る。あるいは、結合キナーゼ
アッセイが使用され得、このアッセイにおいてＤＳＰ−３活性は、ＭＡＰ−キナ
ーゼ活性に基づいて間接的に測定される。

【０１１１】 あるいは、ＤＳＰ−３コード領域またはレポーター遺伝子と作動可能に連結さ
れたＤＳＰ−３プロモータを含むポリヌクレオチドは、試験化合物のＤＳＰ−３
転写への影響を評価するために使用され得る。このようなアッセイは、ＤＳＰ−
３を内因的に発現する細胞（例えば、ヒトもしくは他の哺乳動物の骨格筋、心臓
、脳、肝臓または膵臓の細胞）またはレポーター遺伝子と連結したＤＳＰ−３プ
ロモーターを含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞において行われ得
る。次いで、試験化合物の効果は、ＤＳＰ−３またはレポーターの転写に対する
効果を、例えば、ノーザンブロット分析または適切なレポーター活性アッセイを
用いてアッセイすることによって評価され得る。

【０１１２】 ＤＳＰ−３活性はまた、その発現が適切な基質の活性化に依存するレポーター
遺伝子でトランスフェクトした全細胞において測定され得る。例えば、適切な細
胞（すなわち、ＤＳＰ−３を発現する細胞）は、レポーター遺伝子と連結された
基質依存性プロモーターでトランスフェクトされ得る。このような系において、
レポーター遺伝子の発現（これは、当業者に周知の方法を用いて容易に検出され
得る）は、基質の活性化に依存する。基質の脱リン酸化は、レポーター活性にお
ける減少に基づいて検出され得る。候補調節薬剤は、上記のようにこのような系
に添加され得、ＤＳＰ−３活性に対するそれらの効果を評価する。

【０１１３】 本発明はさらに、ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）と相互作用するか
、またはＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）に結合する分子を同定するた
めの方法を提供する。このような分子は、一般的に、少なくとも１０４、好まし
くは、少なくとも１０５、より好ましくは、少なくとも１０６、なおより好まし
くは、少なくとも１０７、そして最も好ましくは、少なくとも１０８の親和力定
数（Ｋａ）を有してＤＳＰ−３と会合する。親和力定数は、周知の技術を用いて
決定され得る。相互作用分子を同定するための方法は、例えば、調節薬剤につい
ての最初のスクリーニングとして、またはインビボでのＤＳＰ−３活性に関与す
る因子を同定するために使用され得る。基質捕捉のための技術（例えば、上記の
ようなＤＳＰ−３改変体またはＤＳＰ−３基質捕捉変異体を用いる）はまた、本
明細書中で提供される特定の実施形態に従って意図される。標準的な結合アッセ
イに加えて、相互作用分子を同定するために周知である多くの他の技術（酵母ツ
ーハイブリッドスクリーニング、ファージディスプレイおよび親和力技術を含む
）が存在する。このような技術は、慣用的なプロトコルを用いて行われ得、これ
らのプロトコルは当業者に周知である（例えば、Ｂａｒｔｅｌら、Ｃｅｌｌｕｌ
ａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ａ Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｄ．Ａ．Ｈａｒｌｅｙ（編）、Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）、１５３〜１７９
頁、１９９３を参照のこと）。これらおよび他の技術においては、候補相互作用
タンパク質（例えば、推定ＤＳＰ−３基質）は、ＤＳＰ−３結合タンパク質また
はＤＳＰ−３相互作用タンパク質の存在についてアッセイする前に、リン酸化さ
れ得る。

【０１１４】 他の局面においては、本発明は、動物が機能的なＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−
３代替形態）の発現も、変化したＤＳＰ−３の発現もしない、動物モデルを提供
する。このような動物は、標準的な相同組換え戦略を用いて産生され得る。この
様式で産生された動物モデルは、ＤＳＰ−３ポリペプチドの活性およびインビボ
での調節薬剤を研究するために使用され得る。

【０１１５】 （基質を脱リン酸化する方法） 本発明の別の局面において、ＤＳＰ−３（またはＤＳＰ−３代替形態）ポリペ
プチドは、本明細書中で提供されるＤＳＰ−３の基質を脱リン酸化するために使
用され得る。１つの実施形態において、基質は、３０℃で１０分間、適切な緩衝
液（例えば、Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイ
トール、１ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン）中で基質とともにＤＳＰ−３ポリ
ペプチドをインキュベートすることで、インビボで脱リン酸化され得る。ＭＡＰ
キナーゼのような、ＤＳＰ−３によって脱リン酸化され得る任意の化合物が、基
質として使用され得る。一般に、反応成分の量は、約５０ｐｇ〜約５０ｎｇのＤ
ＳＰ−３ポリペプチドにわたり、そして約１０ｎｇ〜約１０μｇの基質にわたり
得る。次いで、脱リン酸化された基質は、例えば、親和性技術および／またはゲ
ル電気泳動によって精製され得る。基質の脱リン酸化の程度は、［γ−３２Ｐ］
標識化基質を試験アリコートに添加し、そして本明細書中に記載されるように基
質の脱リン酸化のレベルを評価することによって、一般にモニターされ得る。

【０１１６】 （細胞応答を調節する方法） 調節薬剤は、インビボおよびインビトロの両方の種々の状況における、細胞の
増殖、分化および生存のような細胞応答を、調節、改変またはさもなくば変化（
例えば、増加または減少）するために使用され得る。一般に、このような応答を
調節（例えば、統計的に有意な様式で増加または減少）するために、細胞は、Ｄ
ＳＰ−３活性の調節を可能にするのに十分な時間および条件下で、ＤＳＰ−３活
性を調節する薬剤に接触される。細胞応答を調節する薬剤は、種々の方法の任意
において機能し得る。例えば、薬剤は、遺伝子発現のパターンを調節し得る（す
なわち、協調的様式で発現される遺伝子ファミリーまたは遺伝子の発現を増大ま
たは阻害し得る）。種々のハイブリダイゼーションおよび増幅の技術は、遺伝子
発現のパターンを評価するために利用可能である。あるいは、またはさらに、薬
剤は細胞のアポトーシスまたは壊死をもたらし得、そして／または細胞内の細胞
サイクルの機能を調節し得る。（例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、１９９８ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ、２８１：１３０５；Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙら、１９９８ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２８１：１３１２；Ｅｖａｎら、１９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１
：１３１７；Ａｄａｍｓら、１９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：１３２２；お
よびそれらに列挙される参考文献を参照のこと。） 上記のように処置された細胞は、変化した増殖、分化または生存特性を有する
細胞の標準的特徴を示し得る。さらに、このような細胞は、細胞増殖の接触阻害
、足場非依存性増殖または改変された細胞間接着のような、他の検出可能な特性
における変化を示し得る（しかし、必要とはされない）。このような特性は、当
業者が精通した技術を使用して容易に検出され得る。

【０１１７】 （治療方法） １つ以上のＤＳＰ−３ポリペプチド（もしくはＤＳＰ−３代替形態ポリペプチ
ド）、調節薬剤および／またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドおよび／または調節薬剤はまた、患者においてＤＳＰ−３活性を調節する
ためにも使用され得る。本明細書中で使用される場合、「患者」は、任意の哺乳
動物（ヒトを含む）であり得、そしてＤＳＰ−３活性に関連した状態に冒され得
るか、または検出可能な疾患を有さないものであり得る。従って、処置は、存在
する疾患の処置であり得るか、または予防的であり得る。ＤＳＰ−３活性に関連
する状態としては、細胞増殖（癌、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）、自己免疫疾
患、アレルギーまたは免疫抑制が関与し得る他の状態を含む）、代謝疾患、異常
な細胞増殖または異常な細胞分化、および細胞周期異常に関連する任意の障害が
挙げられる。このような特定の障害は、正常なＭＡＰキナーゼのホスファターゼ
活性の欠損に関連し、制御されていない細胞増殖を導く。ＤＳＰ−３ポリペプチ
ドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、このような
障害を回復させるために使用され得る。ＤＳＰ−３のアクチベーターをまた使用
し、デュシェーヌ筋ジストロフィーを含む特定の障害を処置し得る。

【０１１８】 患者への投与のために、１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／
または調節薬剤が、薬学的組成物として一般に処方される。薬学的組成物は、滅
菌した水溶液または非水溶液、懸濁液または乳濁液であり得、これはさらに生理
学的に受容可能なキャリア（すなわち、活性成分の活性に干渉しない非毒性物質
）を含む。このような組成物は、固体、液体または気体（エアロゾル）の形態で
あり得る。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得るか、ま
たは化合物は、周知の技術を使用してリポソーム内にカプセル化され得る。本発
明の範囲内の薬学的組成物はまた、他の成分を含み得、これらは生物学的に活性
であるか、または不活性であり得る。このような成分としては、以下が挙げられ
るがこれらに限定されない：緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸
緩衝生理食塩水）、炭水化物（例えば、ブドウ糖、マンノース、ショ糖またはデ
キストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、またはグリシンのよ
うなアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンのようなキレート化剤、
安定剤、色素、矯味矯臭剤、および懸濁剤および／または保存剤。

【０１１９】 当業者に公知の任意の適切なキャリアは、本発明の薬学的組成物において使用
され得る。治療的使用のためのキャリアは周知であり、そして例えば、Ｒｅｍｉ
ｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編 １９８５）に記載
される。一般に、キャリアの型は、投与の形態に基づいて選択される。薬学的組
成物は、投与（例えば、局所的、経口、経鼻、クモ膜下内、直腸、膣、舌下、ま
たは非経口（皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）、空
洞内、道内（ｉｎｔｒａｍｅａｔａｌ）、または尿道内の注射あるいは注入が挙
げられる）投与が挙げられる）の任意の適切な様式のために処方され得る。非経
口投与について、このキャリアは、好ましくは水、生理食塩水、アルコール、脂
肪、ワックスまたは緩衝液を含む。経口投与について、上記の任意のキャリアま
たは固体キャリア（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン
酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、滑石粉、セルロース、カオリン、グリ
セリン、デンプンデキストリン、アルギニン酸ナトリウム、カルボキシメチルセ
ルロース、エチルセルロース、ブドウ糖、ショ糖、および／または炭酸マグネシ
ウム）が使用され得る。

【０１２０】 薬学的組成物（例えば、経口投与または注射による送達のための）は、液体形
態（例えば、エリキシル、シロップ、溶液、乳濁液または懸濁液）であり得る。
液体の薬学的組成物としては、例えば以下の１つ以上が挙げられ得る：注射のた
めの水、食塩水、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、
溶媒または懸濁媒体として役立ち得る合成のモノグリセリドまたはジグリセリド
のような不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコ
ールまたは他の溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラ
ベン（ｐａｒａｂｅｎ）のような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナト
リウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート化剤；アセ
テート、シトレートまたはホスフェートのような緩衝液および塩化ナトリウムま
たはブドウ糖のような張度の調節のための薬剤。非経口調製物は、ガラスまたは
プラスチックで作製されたアンプル、使い捨てシリンジまたは複数の用量バイア
ルに同封され得る。生理食塩水の使用が好ましく、そして注射可能な薬学的組成
物は、好ましくは滅菌されている。

【０１２１】 本明細書中に記載された組成物は、持続放出のために処方され得る（すなわち
、投与に続く化合物の緩やかな放出をもたらすカプセルまたはスポンジのような
処方物）。このような組成物は、一般的には周知の技術を用いて調製され得、そ
して例えば、経口、直腸または皮下埋め込み術によってか、または所望の標的部
位への移植によって投与され得る。持続放出処方物は、キャリアマトリックスに
おいて分散され、そして／または速度制御膜によって囲まれたリザーバ内に含ま
れる薬剤を含み得る。このような処方物内での使用のためのキャリアは、生体適
合性であり、そしてまたは生分解性であり得る；好ましくは、この処方物は、活
性成分の放出の比較的一定のレベルを提供する。持続放出処方物に含まれる活性
成分の量は、移植の部位、放出の速度および予期される持続期間ならびに処置ま
たは予防される状態の性質に依存する。

【０１２２】 ＤＳＰ−３ポリペプチドおよび／または調節薬剤をコードするポリヌクレオチ
ドを（ポリペプチドおよび／または調節薬剤が、インサイチュで生成されるよう
に）含有する薬学的組成物に関して、このポリヌクレオチドは、核酸ならびに、
細菌発現系、ウイルス発現系および哺乳動物発現系を含む、当業者に公知の種々
の送達系のいずれかに存在され得る。このような発現系にＤＮＡを取り込むため
の技術は、当業者に周知である。このＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４９，１９９３に記載およびＣｏｈｅｎ
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１６９１−１６９２，１９９３によって概説される
ように「裸」であり得る。裸のＤＮＡの取り込みは、細胞に効果的に輸送される
生分解性ビーズ上にＤＮＡを被覆することによって上昇され得る。

【０１２３】 薬学的組成物内の、ＤＳＰ−３ポリペプチド（または、ＤＳＰ−３の代替形態
）、ポリヌクレオチドまたは調節薬剤は、種々の化合物のいずれかに連結され得
る。例えば、このような因子は、その薬剤の標的部位への送達を容易にする標的
化部分（例えば、モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体、タンパク質ま
たはリポソーム）に連結され得る。本明細書中で使用される場合「標的化部分」
は、任意の物質（例えば、化合物または細胞）であり得、その薬剤の標的細胞ま
たは組織への輸送を増大する薬剤と連結された場合、それによってその薬剤の局
所的な濃度を上昇する。標的化部分としては、抗体またはそのフラグメント、レ
セプター、リガンドならびに標的組織の細胞に結合する他の分子、または標的組
織の近位の細胞に結合する他の分子が挙げられる。抗体標的化因子は、インタク
ト（全て）な分子、そのフラグメント、またはその機能的な等価物であり得る。
抗体フラグメントの例としては、Ｆ（ａｂ’）2、−Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦ
［ｖ］フラグメントであり、これらは、従来の方法によってか、または遺伝子工
学もしくはタンパク質工学によって産生され得る。結合は、一般的には、共有結
合であり、そして例えば、直接縮合または他の反応によってか、二機能性リンカ
ーまたは多機能性リンカーを手段として達成され得る。標的化部分は、薬剤が治
療的利点を発揮すると予期される、細胞または組織に基づいて選択され得る。

【０１２４】 薬学的組成物は、処置（または予防）される疾患に適切な様式で投与され得る
。適切な投薬量ならびに投与の適切な持続期間および頻度は、患者の状態、患者
の疾患の型および重篤性、活性成分の特定の形態および投与の方法のような因子
によって決定される。一般的には、適切な投薬量および処置レジメンは、治療的
利点および／または予防的利点（例えば、より多くの完全な寛解または部分的な
寛解、または長期の無疾患および／または全体的な生存のような臨床的な成果を
向上させる）を提供するのに十分な量で薬剤を提供する。予防的な使用に関して
、用量は、細胞増殖に関連する疾患の発症を予防、遅延、またはこれの重篤性を
減少するのに十分でなければならない。

【０１２５】 最適な投薬量は、一般的には、実験的なモデルおよび／または臨床的な試みを
用いて決定され得る。一般的には、用量において存在するポリペプチドの量また
は用量において存在するＤＮＡによってインサイチュで産生されるポリペプチド
の量は、約０．０１μｇ／ｋｇ宿主〜約１００μｇ／ｋｇ宿主、代表的には約０
．１μｇ〜約１０μｇの範囲である。効果的な治療を提供するのに十分な最小投
薬量の使用は、通常好ましい。患者は、一般的には、当業者に公知である処置ま
たは予防される状態について適切なアッセイを用いて治療有効性または予防有効
性についてモニターされ得る。適切な用量サイズは、患者の大きさに伴なって変
化するが、代表的には、１０〜６０ｋｇの動物に対して約１０ｍＬ〜約５００ｍ
Ｌの範囲である。

【０１２６】 以下の実施例は、例示の目的で提示するが、限定の目的ではない。

【０１２７】 （実施例） （実施例１） （ＤＳＰ−３をコードするｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定） 本実施例は、ヒトＤＳＰ−３をコードするｃＤＮＡ分子のクローニングを示す
。

【０１２８】 二重特異性（ｄｕａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）ホスファターゼの活性部位
ドメインの周囲の保存された配列モチーフを以下のように同定した：二重特異性
ホスファターゼは、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）のより大きな
ファミリーに属する。このファミリーのホスファターゼは、５つの可変アミノ酸
ストレッチのＮ末端に位置するシステイン残基、それに続くアルギニン残基を含
む保存された触媒性ドメインを共有する（Ｆａｕｍａｎら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｎ
Ｂｉｏｃｈ．Ｓｃｉ．２１：４１３〜４１７、１９９６）。ＤＳＰは、代表的
に、ＰＴＰ活性部位モチーフを含むが、他の領域においてはＰＴＰに対する配列
相同性を欠いている（Ｊｉａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
７５：１７〜２６，１９９７）。しかし、ＤＳＰの間で保存されているコンセン
サス配列は、報告されておらず、かつ上記に言及されたような公知のＤＳＰ配列
の試験から明白なコンセンサス領域も報告されていない。新しいＤＳＰファミリ
ーメンバーの同定に有用な、より長いコンセンサスＤＳＰアミノ酸配列モチーフ
を誘導するために、複数の公知のヒト二重特異性ホスファターゼ配列を整列させ
、比較した。ＭＡＰ−キナーゼホスファターゼ活性を有する８つのヒトＤＳＰ由
来の８つのアミノ酸配列の整列により、ＰＴＰ活性部位サインモチーフを含む２
３アミノ酸のペプチド配列から構成される保存された相同性領域を得た。従って
、以下の配列： ＧＲＶＬＶＨＣＱＡＧＩＳＲＳＧＴＮＩＬＡＹＬＭ（配列番号４） を有する候補ペプチドを用いて、発現配列タグ（Ｅｘｐｒｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ Ｔａｇ）データベース（Ｎａｔ．Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌ．Ｉ
ｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｂＥＳ
Ｔ）を検索した。この検索では、デフォールトパラメータ中の遺伝子コード縮重
性を可能にする繰り返し（ｉｔｅｒａｔｉｏｎ）により、候補ペプチドの逆翻訳
を可能にするアルゴリズム（ｔｂｌａｓｔｎ）を使用した。この検索結果は、Ｅ
ＳＴ ＡＡ３７４７５３、ならびにＡＡ４１１６７１およびＨ８２４４６を、候
補ＭＡＰ−キナーゼホスファターゼ配列として同定した。このＥＳＴは、ＭＡＰ
−キナーゼホスファターゼ活性を有するＤＳＰ−３をコードする遺伝子のような
、発現される遺伝子の完全なコード領域を含まなかった。また、センス鎖および
オープンリーディングフレームも同定されなかった。

【０１２９】 全長コード配列を得るために、ヒト骨格筋ｃＤＮＡを、５’／３’ＲＡＣＥキ
ット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ
，ＩＮ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を供給業者の指示に従って
用いて、記載のように（Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８５：８９９８、１９８８；Ｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５６７３、１９８９；Ｌｏｈら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２４３：２１７、１９８９）、５’および３’ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄ：ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）
反応においてスクリーニングした。保存された配列モチーフにすぐ隣接する配列
情報を、ヒト骨格筋ｃＤＮＡでのこの５’および３’ＲＡＣＥ反応において用い
た。これには、以下のプライマー（配列番号５〜８）を用いた。

【０１３０】

【化１】 開始コドンおよび終止コドンのみを欠失する全長ｃＤＮＡを、以下のプライマ
ー（配列番号９〜１０）を使用して得た。

【０１３１】

【化２】 １８４アミノ酸（図２：配列番号２）のタンパク質をコードするｃＤＮＡ（図
１：配列番号１）を、ＤＳＰ−３として同定した。この配列は、他のＭＡＰ−キ
ナーゼホスファターゼに対して有意な相同性を有する（図３）。この同定された
ｃＤＮＡは、５５２塩基対のコード領域、ならびに関連する５’および３’非翻
訳配列を含む。ＤＳＰ−３についての活性部位ドメインは、配列番号１の２５８
位で始まるヌクレオチドによってコードされる領域に局在化された。

【０１３２】 半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を実行した。これらの分析は、骨格筋組織における
、高いレベルのＤＳＰ−３ ｍＲＮＡを示した。

【０１３３】 （実施例２） （ヒト組織におけるＤＳＰ−３発現） 本実施例において、ＤＳＰ−３コード核酸配列は、種々の組織供給源由来のヒ
トポリＡ＋ＲＮＡにハイブリダイズすることが示される。核酸ハイブリダイゼー
ションプローブとしての使用のため、全長ＤＳＰ−３コードｃＤＮＡ（配列番号
１）を、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９８ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓ
ｏｃ．Ｉｎｃ．＆ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔ
ｏｎ，ＭＡ）に記載のランダムプライマー方法により³²Ｐ標識した。このプロー
ブを、検出可能なβアクチンｍＲＮＡの量について正規化した、複数のヒト組織
に由来するヒトポリＡ＋ＲＮＡを含むブロット（図４、カタログ番号７７５９−
１；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）にハイブリダイ
ズさせた。Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｈｙｂ^TM溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中で６８℃で３
０分間、ブロットをプレハイブリダイゼーションし、次いで、標識したプローブ
を、Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｈｙｂ^TM溶液中で６８℃で１時間ハイブリダイズさせた。
次に、このブロットを、２×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ中で、室温にて４０分間
洗浄し、次いで、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５０℃で４０分間、２回
目の洗浄をした。ブロットを、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＭＰ^TMオートラジオグラフ
フィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏ
ｎ Ｈｔｓ，ＩＬ）に一晩露光させた。結果を図４に示す。ここでは、ＲＮＡの
ヒト組織供給源は以下のとおりであった：レーン１、心臓；レーン２、脳；レー
ン３、胎盤；レーン４、肺；レーン５、肝臓；レーン６、骨格筋；レーン７、腎
臓；レーン８、脾臓。特に明確なＤＳＰ−３発現が、ヒト心臓、肝臓、骨格筋お
よび膵臓で検出され、他の組織においても発現が検出された。

【０１３４】 （実施例３） （マウスＤＳＰ−３改変体の同定） 本実施例は、実施例１で同定されたＤＳＰ−３配列に基づく、マウスＤＳＰ−
３改変体の同定を記載する。全長ＤＳＰ−３コードポリヌクレオチド配列（配列
番号１）を、上記のようなＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、検索配列として
マウスＥＳＴデータベースに入力し、以下の２つのＥＳＴを得た：ＡＡ１０３５
９５およびＡＷ４１３２０６。これら２つのＥＳＴ配列のアライメントは、９４
の同一ヌクレオチドの重複を示し、図５に示されるマウスＤＳＰ−３改変体コー
ド配列（配列番号２０）を生じ、そして図６に示されるような２０５アミノ酸の
マウスＤＳＰ−３改変体ポリペプチド（配列番号２１）をコードするオープンリ
ーディングフレームを決定した。活性部位配列ＶＨＣＬＡＧＶＳＲＳ（配列番号
３）は、配列番号２１のアミノ酸第８６〜９５位に存在する。

【０１３５】 このマウスＤＳＰ−３改変体を分子クローニングするために、この全長コード
配列を含むポリヌクレオチドを、標準的なＰＣＲ条件および以下のプライマーを
使用して、マウスｃＤＮＡライブラリーから増幅する：

【０１３６】

【化３】 （実施例４） （ヒトＤＳＰ−３代替形態スプライシング改変体の同定） 全長マウスＤＳＰ−３改変体コードポリヌクレオチド配列（配列番号２０）を
、上記のようにＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、検索配列としてヒトＥＳＴ
データベースに入力し、そしてＥＳＴ ＡＫ０００３８３を得た。このＥＳＴの
３つ全ての可能な読み枠での翻訳により、その第２の読み枠において、実施例３
に記載のマウスＤＳＰ−３改変体（配列番号２１）のアミノ酸第６５〜２０５位
と同一であるアミノ酸配列フラグメントを生じた。この翻訳されたＥＳＴ ＡＫ
０００３８３アミノ酸配列フラグメントの、配列番号２のヒトＤＳＰ−３アミノ
酸配列とのアライメントは、この翻訳されたＥＳＴオープンリーディングフレー
ムのアミノ末端（配列番号２のアミノ酸第６５位に対応する）から配列番号２の
第１６９位に対応するロイシン残基までの配列同一性を明らかにした。しかし、
配列番号２のＣ末端１５アミノ酸は、この翻訳されたＥＳＴ ＡＫ０００３８３
フラグメントに存在せず、このフラグメントは、代わりに、上記マウスＤＳＰ−
３改変体（配列番号２１）のＣ末端に同一な３６アミノ酸配列を含んだ。従って
、配列番号２１の１７０〜２０５位のアミノ酸は、３６アミノ酸の代替的なＤＳ
Ｐ−３カルボキシル末端を表し、これが、配列番号２のＣ末端１５アミノ酸に代
って、配列番号２１のアミノ酸６５〜２０５位を含みそして配列番号２０または
その改変体のヌクレオチド配列の全てまたは一部を含む核酸配列によってコード
される、ＤＳＰ−３の代替形態で存在しているのかもしれない。非限定的な理論
に従い、このＤＳＰ−３の代替形態は、選択的ｍＲＮＡスプライシング事象の産
物であるようである。

【０１３７】 このＤＳＰ−３の代替形態（配列番号２０）を分子クローニングするために、
全長コード配列を含むポリヌクレオチドを、標準的なＰＣＲ条件および以下のプ
ライマーを使用して、ヒトｃＤＮＡライブラリーから増幅する：

【０１３８】

【化４】 （実施例５） （ＤＳＰ−３ホスファターゼ活性） チロシンリン酸化された³²Ｐ標識したＥＧＦレセプター自己リン酸化部位ペプ
チドを基質として使用するＤＳＰ活性のアッセイを、本質的に（Ｆｌｉｎｔら、
１９９３ ＥＭＢＯ Ｊ．１２：１９３７−１９４６；Ｚｈａｎｇら、１９９４
Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：２２８５−２２９０）に記載されるように行った。配
列番号２５のＤＳＰ−３コード配列を含むポリヌクレオチドを、製造業者の説明
に従って、ｐＧＥＸ発現ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ
，ＮＪ）にクローニングし、そしてＤＳＰ−３−グルタチオン−Ｓ−トランスフ
ェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。抽出後
の固定グルタチオン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でのこのＤＳＰ−３−ＧＳＴ融合
タンパク質のアフィニティー単離もまた、製造業者に推奨されるように行った。
他に示されない限り、全ての試薬は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製であった。氷冷アッセイ緩衝液（２５ｍＭ イミダ
ゾール（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）−ｐＨ ７．２、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ，Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）
、０．２５ｍｇ／ｍｌ オボアルブミン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉ
ｏｃｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））のアリコート（２０μｌ）を、酵素ネ
ガティブコントロールとして示したウェルに添加した。この酵素量が、このアッ
セイ中の２０％未満の基質を利用するように５０％グリセロールストックから氷
冷アッセイ緩衝液に希釈したＤＳＰ−３（配列番号２）を、酵素ネガティブコン
トロールを除く全てのウェルに、２０μｌ／ウェルで添加した。プレートを２０
秒間攪拌し、各ウェルの内容物を混合し、１３分間室温でインキュベートした。
基質として、アミノ酸配列ＤＡＤＥｐＹＬ−ＮＨ₂［配列番号２６］を有するＥ
ＧＦレセプター由来の自己リン酸化部位を、本質的に（Ｚｈａｎｇら、１９９４
Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：２２８５：比活性１１μＣｉ／ｎＭｏｌ）に記載され
るような³²Ｐ標識した基質ペプチドとして調製し、アッセイ緩衝液中０．６μＭ
に希釈し、そして全てのウェルに２０μｌアリコートで添加した。プレートを再
度攪拌し、次いで、さらに１３分間インキュベートし、この時点で、１４０μｌ
の活性炭懸濁液（０．１Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄（ｐＨ５以下）中、２５ｍｇ／ｍｌ）
を各ウェルに添加し、内容物をボルテックスによって混合し、次いで、プレート
を、卓上遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｆｕ
ｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で、室温にて３分間、２４００ｒｐｍで遠心分離した。
各ウェル中の上清液のアリコート（１００μｌ）を、βシンチレーション計数プ
レート（Ｗａｌｌａｅ，Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に移し、そ
してＷａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ^TMプレートカウンターを製造業者の推奨
に従って使用して、³²Ｐβ放射を定量した。バックグラウンド計数を差し引き、
酵素ネガティブコントロールの値に対して補正し、そしてコントロールウェルに
正規化した後、ＥＧＦレセプターペプチド基質に対するＤＳＰ−３比活性は、８
８．４ｎモル／分／ｍｇであると算出され、Ｋｍ＝１．２μＭであった。

【０１３９】 前述により、本発明の特定の実施形態が例示の目的で本明細書において記載さ
れているが、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ
得ることが理解される。従って、本発明は添付の特許請求の範囲によってしか限
定されない。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＤＳＰ−３についてのｃＤＮＡ配列（配列番号１）を示し、開始コド
ンおよび終止コドンが、太字で示される。

【図２】 図２は、ＤＳＰ−３の推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。

【図３】 図３は、ＤＳＰ−３と他のＭＡＰ−キナーゼホスファターゼとの間の配列類似
性を示す、配列アラインメントである。

【図４】 図４は、³²Ｐ標識した全長ＤＳＰ−３コード核酸配列をプローブとして使用す
る、ノーザンブロットハイブリダイゼーションを示す。ブロットは、以下のよう
な種々の組織型由来のヒトポリＡ＋ＲＮＡを含んだ：レーン１、心臓；レーン２
、脳；レーン３、胎盤；レーン４、肺；レーン５、肝臓；レーン６、骨格筋；レ
ーン７、腎臓；レーン８、膵臓。

【図５】 図５は、マウスＤＳＰ−３改変体についてのｃＤＮＡ配列（配列番号２０）を
示し、開始コドンおよび終止コドンが、太字で示される。

【図６】 図６は、配列番号２０のタンパク質コード領域によってコードされるマウスＤ
ＳＰ−３改変体の推定アミノ酸配列（配列番号２１）を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 21/04 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｂ０６５ 35/00 37/02 ４Ｃ０８４ 37/02 43/00 １０５ ４Ｃ０８５ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 16/40 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 9/16 Ｂ 5/06 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/42 9/16 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/42 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 33/577 Ｂ 33/58 Ｚ 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/58 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｅ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 DA12 DA13 DA14 DA36 FB01 FB02 FB03 FB07 4B024 AA01 AA11 AA12 BA11 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 HA12 HA15 4B050 CC04 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ20 QQ33 QQ53 QR06 QR55 QR59 QR69 QR80 QS24 QS25 QS28 QS33 QS34 4B064 AG27 AG31 CA02 CA10 CA19 CA20 CC24 CE12 DA13 4B065 AA26X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA31 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA07 AA13 AA17 BA44 MA13 MA17 MA22 MA23 MA24 MA31 MA34 MA37 MA44 MA52 MA56 MA57 MA59 MA60 MA66 MA67 NA14 ZA942 ZB072 ZB132 ZB212 ZB262 ZC212 4C085 AA14 AA15 AA16 AA25 AA26 AA27 BB22 BB36 BB41 BB43 BB44 CC02 CC04 CC05 CC13 CC17 CC29 CC32 DD23 DD24 DD33 DD35 DD37 DD62 DD63 DD86 DD88 EE01 EE06 FF24 GG02 GG03 GG04 GG05 GG06 GG08 GG10 4H045 AA11 AA30 CA40 DA76 DA89 EA27 EA28 EA50 FA72 FA74 GA26

Claims (98)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２に記載されるＤＳＰ−３の配列あるいはその改変
   体を有する単離されたポリペプチドであって、該改変体は、該ポリペプチドが活
   性化ＭＡＰキナーゼを脱リン酸化する能力を保持するように、配列番号２におけ
   る残基の５０％以下での１つ以上のアミノ酸の欠失、付加、挿入、または置換に
   て異なる、単離されたポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列番号２に対応する配列を有するポリペプチドの少なくと
   も１０個連続するアミノ酸をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 配列番号２に対応する配列を有するポリペプチドの少なくと
   も１５個連続するアミノ酸をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項２または請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む、
   発現ベクター。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の発現ベクターを用いて形質転換されたかま
   たはトランスフェクトされた、宿主細胞。
6. 【請求項６】 請求項１に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポ
   リヌクレオチド。
7. 【請求項７】 配列番号１に記載された配列を含む、請求項６に記載のポリ
   ヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の発現ベクターを用いて形質転換されたかま
   たはトランスフェクトされた、宿主細胞。
10. 【請求項１０】 請求項６に記載のポリヌクレオチドに相補的な少なくとも
    １５個連続するヌクレオチドを含む、アンチセンスポリヌクレオチド。
11. 【請求項１１】 配列番号１に記載される配列の相補体に、５０℃にて１５
    分間の０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での洗浄を含む条件下で、検出可
    能にハイブリダイズする、単離されたポリヌクレオチド。
12. 【請求項１２】 請求項１０または請求項１１に記載のポリヌクレオチドを
    含む、発現ベクター。
13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の発現ベクターを用いて形質転換された
    かまたはトランスフェクトされた、宿主細胞。
14. 【請求項１４】 ＤＳＰ−３ポリペプチドを産生する方法であって、以下の
    工程： （ａ）請求項９に記載の宿主細胞を、ＤＳＰ−３ポリペプチドの発現を可能にす
    る条件下で培養する工程；および （ｂ）該宿主細胞培養物から該ＤＳＰ−３ポリペプチドを単離する工程、 を包含する、方法。
15. 【請求項１５】 配列番号２の配列を有するＤＳＰ−３ポリペプチドに特異
    的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
16. 【請求項１６】 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５に記載
    の抗体またはそのフラグメント。
17. 【請求項１７】 薬学的組成物であって、生理学的に受容可能なキャリアと
    組み合わせて請求項１５に記載の抗体またはそのフラグメントを含む、薬学的組
    成物。
18. 【請求項１８】 サンプル中のＤＳＰ−３発現を検出するための方法であっ
    て、以下： （ａ）サンプルを、請求項１５に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと
    、抗体／ＤＳＰ−３複合体を形成させるに十分な条件かつ時間で接触させる工程
    ；および （ｂ）抗体／ＤＳＰ−３複合体のレベルを検出し、そしてそこからサンプル中の
    ＤＳＰ−３の存在を検出する工程、 を包含する、方法。
19. 【請求項１９】 前記抗体が支持物質に連結される、請求項１８に記載の方
    法。
20. 【請求項２０】 前記抗体が検出可能なマーカーに連結される、請求項１８
    に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記サンプルが患者から得られた生物学的サンプルである
    、請求項１８に記載の方法。
22. 【請求項２２】 サンプル中のＤＳＰ−３発現を検出するための方法であっ
    て、以下： （ａ）サンプルを、請求項１０または請求項１１に記載のアンチセンスポリヌク
    レオチドと接触させる工程；および （ｂ）該サンプルにおいて該アンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズす
    るＤＳＰ−３ポリヌクレオチドの量を検出し、そしてそこから該サンプル中のＤ
    ＳＰ−３発現を検出する工程、 を包含する、方法。
23. 【請求項２３】 前記アンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする
    ＤＳＰ−３ポリヌクレオチドの量がポリメラーゼ連鎖反応を用いて決定される、
    請求項２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記アンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする
    ＤＳＰ−３ポリヌクレオチドの量がハイブリダイゼーションアッセイを用いて決
    定される、請求項２２に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記サンプルがＲＮＡ調製物またはｃＤＮＡ調製物を含む
    、請求項２２に記載の方法。
26. 【請求項２６】 ＤＳＰ−３活性を調節する薬剤についてスクリーニングす
    るための方法であって、以下の工程： （ａ）候補薬剤を、請求項１に記載のポリペプチドと、該ポリペプチドと候補薬
    剤との間での相互作用を可能にするに十分な条件かつ時間で接触させる工程；な
    らびに （ｂ）引き続いて、該ポリペプチドがＤＳＰ−３基質を脱リン化する能力を、候
    補薬剤の非存在下で該ポリペプチドが該ＤＳＰ−３基質を脱リン酸化する予め決
    定された能力と比較して評価し；そしてそれからＤＳＰ−３活性を調節する薬剤
    を同定する工程、 を包含する、方法。
27. 【請求項２７】 前記ＤＳＰ−３基質がＭＡＰキナーゼである、請求項２６
    に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記候補薬剤が低分子である、請求項２６に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記低分子がコンビナトリアルライブラリー内に存在する
    、請求項２６に記載の方法。
30. 【請求項３０】 ＤＳＰ−３活性を調節する薬剤についてスクリーニングす
    るための方法であって、以下の工程： （ａ）候補薬剤を、検出可能な転写物またはタンパク質をコードするポリヌクレ
    オチドに作動可能に連結されたＤＳＰ−３プロモーターを含む細胞と、該プロモ
    ーターと候補薬剤との間での相互作用を可能にするに十分な条件かつ時間で接触
    させる工程；ならびに （ｂ）引き続いて、該ポリヌクレオチドの発現を、候補薬剤の非存在下での発現
    の予め決定されたレベルと比較して評価し；そしてそれからＤＳＰ−３活性を調
    節する薬剤を同定する工程、 を包含する、方法。
31. 【請求項３１】 前記ポリヌクレオチドがＤＳＰ−３ポリペプチドをコード
    する、請求項３０に記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記ポリヌクレオチドがレポータータンパク質をコードす
    る、請求項３０に記載の方法。
33. 【請求項３３】 細胞における増殖応答を調節するための方法であって、 細胞を、ＤＳＰ−３活性を調節する薬剤と接触させる工程 を包含する、方法。
34. 【請求項３４】 細胞の分化を調節するための方法であって、 細胞を、ＤＳＰ−３活性を調節する薬剤と接触させる工程 を包含する、方法。
35. 【請求項３５】 細胞の生存を調節するための方法であって、 細胞を、ＤＳＰ−３活性を調節する薬剤と接触させる工程 を包含する、方法。
36. 【請求項３６】 前記薬剤が遺伝子発現のパターンを調節する、請求項３３
    〜３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 【請求項３７】 前記細胞が細胞成長の接触阻害を示す、請求項３３〜３５
    のいずれか１項に記載の方法。
38. 【請求項３８】 前記細胞が足場非依存性増殖を示す、請求項３３〜３５の
    いずれか１項に記載の方法。
39. 【請求項３９】 前記細胞が変化した細胞間接着特性を示す、請求項３３〜
    ３５のいずれか１項に記載の方法。
40. 【請求項４０】 前記薬剤がアポトーシスを調節する、請求項３５に記載の
    方法。
41. 【請求項４１】 前記薬剤が細胞周期を調節する、請求項３５に記載の方法
    。
42. 【請求項４２】 前記細胞が患者の中に存在する、請求項３２に記載の方法
    。
43. 【請求項４３】 ＤＳＰ−３活性に関連する障害に罹患した患者を処置する
    ための方法であって、 患者に、ＤＳＰ−３活性を調節する薬剤の治療有効量を投与する工程 を包含する、方法。
44. 【請求項４４】 前記障害が、デュシェーヌ筋ジストロフィー、癌、対宿主
    性移植片病、自己免疫疾患、アレルギー、代謝疾患、異常な細胞成長、異常な細
    胞増殖、および細胞周期の異常からなる群から選択される、請求項４３に記載の
    方法。
45. 【請求項４５】 ＤＳＰ−３基質捕捉変異体ポリペプチドであって、該ポリ
    ペプチドが、ＤＳＰ−３と比較して実質的には減少していない親和性で基質に結
    合するように、かつ該ポリペプチドが、基質を脱リン酸化する能力がＤＳＰ−３
    と比較して低下しているように、配列番号２に記載される配列と、配列番号２に
    おける残基の５０％以下での１つ以上のアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換
    にて異なっている、ＤＳＰ−３基質捕捉変異体ポリペプチド。
46. 【請求項４６】 前記ポリペプチドが、配列番号２の５７位または８８位で
    の置換を含む、請求項４５に記載の基質捕捉変異体ポリペプチド。
47. 【請求項４７】 ＤＳＰ−３と相互作用する能力について分子をスクリーニ
    ングする方法であって、以下の工程： （ａ）候補分子を請求項１に記載のポリペプチドと、該候補分子とポリペプチド
    とを相互作用させるに十分な条件かつ時間で接触させる工程；および （ｂ）該ポリペプチドへの該候補分子の結合の存在または非存在を検出し、そし
    てそこから該候補分子がＤＳＰ−３と相互作用するか否かを決定する工程、 を包含する、方法。
48. 【請求項４８】 前記検出する工程が、アフィニティー精製工程を包含する
    、請求項４７に記載の方法。
49. 【請求項４９】 前記検出する工程が、酵母ツーハイブリットスクリーニン
    グまたはファージディスプレーライブラリーのスクリーニングを包含する、請求
    項４７に記載の方法。
50. 【請求項５０】 配列番号２１に記載されるＤＳＰ−３代替形態の配列ある
    いはその改変体を含む単離されたポリペプチドであって、該改変体は、該ポリペ
    プチドが活性化ＭＡＰキナーゼを脱リン酸化する能力を保持するように、配列番
    号２１における残基の５０％以下での１以上のアミノ酸欠失、付加、挿入または
    置換にて異なる、単離されたポリペプチド。
51. 【請求項５１】 配列番号２１に対応する配列を有するポリペプチドの少な
    くとも１０個の連続アミノ酸をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
52. 【請求項５２】 配列番号２１に対応する配列を有するポリペプチドの少な
    くとも１５個の連続するアミノ酸をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
53. 【請求項５３】 請求項５１または請求項５２に記載のポリヌクレオチドを
    含む、発現ベクター。
54. 【請求項５４】 請求項５３に記載の発現ベクターを用いて形質転換された
    かまたはトランスフェクトされた、宿主細胞。
55. 【請求項５５】 請求項５０に記載のポリペプチドをコードする、単離され
    たポリヌクレオチド。
56. 【請求項５６】 配列番号２０に記載された配列を含む、請求項５５に記載
    のポリヌクレオチド。
57. 【請求項５７】 請求項５５に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクタ
    ー。
58. 【請求項５８】 請求項５７に記載の発現ベクターを用いて形質転換された
    かまたはトランスフェクトされた、宿主細胞。
59. 【請求項５９】 請求項５５に記載のポリヌクレオチドに相補的な少なくと
    も１５個連続するヌクレオチドを含む、アンチセンスポリヌクレオチド。
60. 【請求項６０】 配列番号２０に記載される配列の相補体に、６０℃にて１
    ５分間の０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での洗浄を含む条件下で、検出
    可能にハイブリダイズする、単離されたポリヌクレオチド。
61. 【請求項６１】 請求項５９または請求項６０に記載のポリヌクレオチドを
    含む、発現ベクター。
62. 【請求項６２】 請求項６１に記載の発現ベクターを用いて形質転換された
    かまたはトランスフェクトされた、宿主細胞。
63. 【請求項６３】 ＤＳＰ−３代替形態ポリペプチドを産生する方法であって
    、以下の工程： （ａ）請求項５８に記載の宿主細胞を、ＤＳＰ−３代替形態ポリペプチドの発現
    を可能にする条件下で培養する工程；および （ｂ）該宿主細胞培養物から該ＤＳＰ−３代替形態ポリペプチドを単離する工程
    、 を包含する、方法。
64. 【請求項６４】 配列番号２１の配列を有するＤＳＰ−３代替形態ポリペプ
    チドに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
65. 【請求項６５】 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項６４に記載
    の抗体またはそのフラグメント。
66. 【請求項６６】 薬学的組成物であって、生理学的に受容可能なキャリアと
    組み合わせて請求項６４に記載の抗体またはそのフラグメントを含む、薬学的組
    成物。
67. 【請求項６７】 サンプル中のＤＳＰ−３代替形態発現を検出するための方
    法であって、以下： （ａ）サンプルを、請求項６４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと
    、抗体／ＤＳＰ−３代替形態複合体を形成させるに十分な条件かつ時間で接触さ
    せる工程；および （ｂ）抗体／ＤＳＰ−３代替形態複合体のレベルを検出し、そしてそこからサン
    プル中のＤＳＰ−３代替形態の存在を検出する工程、 を包含する、方法。
68. 【請求項６８】 前記抗体が支持物質に連結される、請求項６７に記載の方
    法。
69. 【請求項６９】 前記抗体が検出可能なマーカーに連結される、請求項６７
    に記載の方法。
70. 【請求項７０】 前記サンプルが患者から得られた生物学的サンプルである
    、請求項６７に記載の方法。
71. 【請求項７１】 サンプル中のＤＳＰ−３代替形態発現を検出するための方
    法であって、以下： （ａ）サンプルを、請求項５９または請求項６０に記載のアンチセンスポリヌク
    レオチドと接触させる工程；および （ｂ）該サンプルにおいて該アンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズす
    るＤＳＰ−３代替形態ポリヌクレオチドの量を検出し、そしてそこから該サンプ
    ル中のＤＳＰ−３代替形態発現を検出する工程、 を包含する、方法。
72. 【請求項７２】 前記アンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする
    ＤＳＰ−３代替形態ポリヌクレオチドの量がポリメラーゼ連鎖反応を用いて決定
    される、請求項７１に記載の方法。
73. 【請求項７３】 前記アンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする
    ＤＳＰ−３代替形態ポリヌクレオチドの量がハイブリダイゼーションアッセイを
    用いて決定される、請求項７１に記載の方法。
74. 【請求項７４】 前記サンプルがＲＮＡ調製物またはｃＤＮＡ調製物を含む
    、請求項７１に記載の方法。
75. 【請求項７５】 ＤＳＰ−３代替形態活性を調節する薬剤についてスクリー
    ニングするための方法であって、以下の工程： （ａ）候補薬剤を、請求項５０に記載のポリペプチドと、該ポリペプチドと候補
    薬剤との間での相互作用を可能にするに十分な条件かつ時間で接触させる工程；
    ならびに （ｂ）引き続いて、該ポリペプチドがＤＳＰ−３代替形態基質を脱リン化する能
    力を、候補薬剤の非存在下で該ポリペプチドが該ＤＳＰ−３代替形態基質を脱リ
    ン酸化する予め決定された能力と比較して評価し；そしてそれからＤＳＰ−３代
    替形態活性を調節する薬剤を同定する工程、 を包含する、方法。
76. 【請求項７６】 前記ＤＳＰ−３代替形態基質がＭＡＰキナーゼである、請
    求項７５に記載の方法。
77. 【請求項７７】 前記候補薬剤が低分子である、請求項７５に記載の方法。
78. 【請求項７８】 前記低分子がコンビナトリアルライブラリー内に存在する
    、請求項７５に記載の方法。
79. 【請求項７９】 ＤＳＰ−３代替形態活性を調節する薬剤についてスクリー
    ニングするための方法であって、以下の工程： （ａ）候補薬剤を、検出可能な転写物またはタンパク質をコードするポリヌクレ
    オチドに作動可能に連結されたＤＳＰ−３代替形態プロモーターを含む細胞と、
    該プロモーターと候補薬剤との間での相互作用を可能にするに十分な条件かつ時
    間で接触させる工程；ならびに （ｂ）引き続いて、該ポリヌクレオチドの発現を、候補薬剤の非存在下での発現
    の予め決定されたレベルと比較して評価し；そしてそれからＤＳＰ−３代替形態
    活性を調節する薬剤を同定する工程、 を包含する、方法。
80. 【請求項８０】 前記ポリヌクレオチドがＤＳＰ−３代替形態ポリペプチド
    をコードする、請求項７９に記載の方法。
81. 【請求項８１】 前記ポリヌクレオチドがレポータータンパク質をコードす
    る、請求項７９に記載の方法。
82. 【請求項８２】 細胞における増殖応答を調節するための方法であって、 細胞を、ＤＳＰ−３代替形態活性を調節する薬剤と接触させる工程 を包含する、方法。
83. 【請求項８３】 細胞の分化を調節するための方法であって、 細胞を、ＤＳＰ−３代替形態活性を調節する薬剤と接触させる工程 を包含する、方法。
84. 【請求項８４】 細胞の生存を調節するための方法であって、 細胞を、ＤＳＰ−３代替形態活性を調節する薬剤と接触させる工程 を包含する、方法。
85. 【請求項８５】 前記薬剤が遺伝子発現のパターンを調節する、請求項８２
    〜８４のいずれか１項に記載の方法。
86. 【請求項８６】 前記細胞が細胞成長の接触阻害を示す、請求項８２〜８４
    のいずれか１項に記載の方法。
87. 【請求項８７】 前記細胞が足場非依存性増殖を示す、請求項８２〜８４の
    いずれか１項に記載の方法。
88. 【請求項８８】 前記細胞が変化した細胞間接着特性を示す、請求項８２〜
    ８４のいずれか１項に記載の方法。
89. 【請求項８９】 前記薬剤がアポトーシスを調節する、請求項８４に記載の
    方法。
90. 【請求項９０】 前記薬剤が細胞周期を調節する、請求項８４に記載の方法
    。
91. 【請求項９１】 前記細胞が患者の中に存在する、請求項８１に記載の方法
    。
92. 【請求項９２】 ＤＳＰ−３代替形態活性に関連する障害に罹患した患者を
    処置するための方法であって、 患者に、ＤＳＰ−３代替形態活性を調節する薬剤の治療有効量を投与する工程
    を包含する、方法。
93. 【請求項９３】 前記障害が、癌、対宿主性移植片病、自己免疫疾患、アレ
    ルギー、代謝疾患、異常な細胞成長、異常な細胞増殖、および細胞周期の異常か
    らなる群から選択される、請求項９２に記載の方法。
94. 【請求項９４】 ＤＳＰ−３代替形態基質捕捉変異体ポリペプチドであって
    、該ポリペプチドが、ＤＳＰ−３代替形態と比較して実質的には減少していない
    親和性で基質に結合するように、かつ該ポリペプチドが、基質を脱リン酸化する
    能力がＤＳＰ−３代替形態と比較して低下しているように、配列番号２１に記載
    される配列と、配列番号２１における残基の５０％以下での１つ以上のアミノ酸
    の欠失、付加、挿入または置換にて異なっている、ＤＳＰ−３代替形態基質捕捉
    変異体ポリペプチド。
95. 【請求項９５】 前記ポリペプチドが、配列番号２１の５７位または８８位
    での置換を含む、請求項９４に記載の基質捕捉変異体ポリペプチド。
96. 【請求項９６】 ＤＳＰ−３代替形態と相互作用する能力について分子をス
    クリーニングする方法であって、以下の工程： （ａ）候補分子を請求項５０に記載のポリペプチドと、該候補分子とポリペプチ
    ドとを相互作用させるに十分な条件かつ時間で接触させる工程；および （ｂ）該ポリペプチドへの該候補分子の結合の存在または非存在を検出し、そし
    てそこから該候補分子がＤＳＰ−３代替形態と相互作用するか否かを決定する工
    程、 を包含する、方法。
97. 【請求項９７】 前記検出する工程が、アフィニティー精製工程を包含する
    、請求項９６に記載の方法。
98. 【請求項９８】 前記検出する工程が、酵母ツーハイブリットスクリーニン
    グまたはファージディスプレーライブラリーのスクリーニングを包含する、請求
    項９６に記載の方法。