ES2277843T3 - Fosfatasa de especificidad dual dsp-3. - Google Patents

Abstract

Un método para seleccionar un agente que modula la actividad DSP-3, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un agente candidato con un polipéptido DSP-3, comprendiendo dicho polipéptido (1) la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:2, o (2) comprendiendo una secuencia de aminoácidos de un variante de polipéptido DSP-3 que se diferencia en una o más deleciones, adiciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos en no más de 25% de los restos de SEQ ID NO:2, de forma que el polipéptido mantiene la capacidad de desfosforilar una MAP-quinasa activada, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la interacción entre el polipéptido y el agente candidato, en el que el agente candidato es una molécula pequeña; y (b) posteriormente evaluar la capacidad del polipéptido para desfosforilar un sustrato de DSP-3, con relación a una capacidad predeterminada del polipéptido para desfosforilar el sustrato de DSP-3 en ausencia del agente candidato; y a partir de ello identificar un agente que modula la actividad DSP-3.

Description

Fosfatasa de especificidad dual DSP-3.

Campo técnico

La presente invención se refiere, en general, a composiciones y métodos útiles para tratar trastornos asociados con defectos en la proliferación celular, la diferenciación celular y/o la supervivencia celular. La invención se refiere, más en concreto, a proteína fosfatasas de especificidad dual, y a sus variantes de polipéptidos. Más en concreto, la presente invención se refiere al uso de dichos polipéptidos para identificar anticuerpos y otros agentes, incluyendo moléculas pequeñas, que modulan la transducción de señales que conducen a respuestas proliferativas, diferenciación celular y/o supervivencia celular.

Antecedentes de la invención

Las proteína quinasas activadas por mitógenos (MAP-quinasas) están presentes como componentes de las vías de transducción de señales celulares conservadas, que tienen una diversidad de miembros conservados. Las MAP-quinasas se activan mediante fosforilación en el motivo de fosforilación dual con la secuencia Thr-X-Tyr (por las MAP-quinasa quinasas), en las que se requiere la fosforilación en los restos tirosina y treonina para que se produzca actividad. Las MAP-quinasas activadas fosforilan varias dianas de transducción, incluyendo los factores de transcripción. La inactivación de las MAP-quinasas está mediada por la desfosforilación en ese sitio por fosfatasas de especificidad dual, denominadas MAP-quinasa fosfatasas. En eucariotas superiores, el papel fisiológico de la señalización de MAP-quinasas se ha correlacionado con acontecimientos celulares, tales como la proliferación, oncogénesis, desarrollo y diferenciación. Por consiguiente, la capacidad para regular la transducción de señales mediante estas vías puede conducir al desarrollo de tratamientos y terapias preventivas para enfermedades humanas asociadas con la señalización de MAP-quinasas, tales como el cáncer.

Las proteína tirosina fosfatasas de especificidad dual (fosfatasas de especificidad dual) son fosfatasas que desfosforilan los restos fosfotirosina y fosfotreonina/serina (Walton et al., Ann. Rev. Biochem., 62: 101-120, 1993). Se han identificado varias fosfatasas de especificidad dual que inactivan una MAP-quinasa, incluyendo MKP-1 (documento WO 97/00315; Keyse y Emslie, Nature, 59: 644-647, 1992), MKP-4, MKP-5, MKP-7, Hb5 (documento WO 97/06245), PACI (Ward et al., Nature, 367: 651-654, 1994), HVH2 (Guan y Butch, J. Biol. Chem., 270: 7197-7203, 1995) y PYST1 (Groom et al., EMBO J., 15: 3621-3632, 1996). La expresión de ciertas fosfatasas de especificidad dual es inducida por el estrés o por mitógenos, pero otras parecen ser expresadas de modo constitutivo en tipos celulares específicos. La regulación de la expresión y la actividad de fosfatasas de especificidad dual es crítica para el control de las funciones celulares mediadas por MAP-quinasas, incluyendo la proliferación celular, diferenciación celular y supervivencia celular. Por ejemplo, las fosfatasas de especificidad dual pueden actuar como reguladores negativos de la proliferación celular. Es probable que existan muchas fosfatasas de especificidad dual, con especificidades diversas con respecto a la activación o tipo celular. Sin embargo, aún no se comprende bien la regulación de las fosfatasas de especificidad dual, y sólo se han identificado un número relativamente pequeño de fosfatasas de especificidad
dual.

Por consiguiente, en la técnica existe la necesidad de una mejor comprensión de la señalización de MAP-quinasas, y la regulación de fosfatasas de especificidad dual dentro de las cascadas de señalización de las MAP-quinasas. Una mayor comprensión de la regulación de las fosfatasas de especificidad dual puede facilitar el desarrollo de métodos para modular la actividad de proteínas implicadas en las cascasas de MAP-quinasas, y para tratar trastornos asociados con dichas cascadas. La presente invención satisface estas necesidades y también proporciona otras ventajas relacionadas. Dicho brevemente, la presente invención proporciona composiciones y métodos para identificar agentes capaces de modular las respuestas proliferativas celulares.

En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para seleccionar un agente que modula la actividad DSP-3, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un agente candidato con un polipéptido DSP-3, comprendiendo dicho polipéptido (1) la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2, o (2) comprendiendo una secuencia de aminoácidos de un variante de polipéptido DSP-3 que se diferencia en una o más deleciones, adiciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos en no más de 25% de los restos de SEQ ID NO: 2, de forma que el polipéptido mantiene la capacidad de desfosforilar una MAP-quinasa activada, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la interacción entre el polipéptido y el agente candidato, en el que el agente candidato es una molécula pequeña; y

(b) posteriormente evaluar la capacidad del polipéptido para desfosforilar un sustrato de DSP-3, con relación a una capacidad predeterminada del polipéptido para desfosforilar el sustrato de DSP-3 en ausencia del agente candidato;

y a partir de ello identificar un agente que modula la actividad DSP-3.

En un segundo aspecto de la presente invención se proporciona un método para seleccionar un agente que modula la actividad DSP-3, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un agente candidato con una célula que comprende un polinucleótido capaz de expresar un transcripto de DSP-3 que codifica un polipéptido DSP-3, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la interacción entre el polinucleótido y el agente candidato, en el que el polipéptido DSP-3 comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2, o comprende una secuencia de aminoácidos de un variante de polipéptido DSP-3 que se diferencia en una o más deleciones, adiciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos en no más de 25% de los restos de SEQ ID NO: 2, de forma que el polipéptido mantiene la capacidad de desfosforilar una MAP-quinasa activada; y

(b) posteriormente evaluar la expresión del polinucleótido, con relación a un nivel de expresión predeterminado en ausencia del agente candidato;

y a partir de ello identificar un agente que modula la actividad DSP-3.

En un tercer aspecto, se proporciona un polipéptido mutante que atrapa un sustrato de DSP-3 que se diferencia de la secuencia indicada en SEQ ID NO: 2, en el que el polipéptido contiene una sustitución en la posición 57 o la posición 88 de SEQ ID NO: 2, en el que el polipéptido mutante que atrapa un sustrato de DSP-3 mantiene la capacidad de unirse a un sustrato de DSP-3, y en el que la capacidad del polipéptido para desfosforilar un sustrato se reduce con relación al polipéptido DSP-3.

En un quinto aspecto, se proporciona un método para seleccionar una molécula por su capacidad para interaccionar con un polipéptido DSP-3, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una molécula candidata con un polipéptido DSP-3, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que interaccionen la molécula candidata y el polipéptido, comprendiendo dicho polipéptido la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2, o comprendiendo la secuencia de aminoácidos de un variante de polipéptido DSP-3 que se diferencia en una o más deleciones, adiciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos en no más de 25% de los restos de SEQ ID NO: 2, de forma que el polipéptido mantiene la capacidad de desfosforilar una MAP-quinasa activada; y

(b) detectar la presencia o ausencia de unión de la molécula candidata al polipéptido, en el que la etapa de detección comprende una selección de un banco de presentación de fagos y, a partir de ello, determinar si la molécula candidata interacciona con el polipéptido DSP-3.

En un sexto aspecto de la presente invención, se proporciona un método para modular una respuesta proliferativa en una célula in vitro, que comprende modular en dicha célula una actividad MAP-quinasa desfosforilante de un polipéptido DSP-3, comprendiendo dicho polipéptido (a) la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2, o (b) la secuencia de aminoácidos de un variante de polipéptido DSP-3 que se diferencia en una o más deleciones, adiciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos en no más de 25% de los restos de SEQ ID NO: 2, de forma que el polipéptido mantiene la capacidad de desfosforilar una MAP-quinasa activada.

En un séptimo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para modular la diferenciación de una célula in vitro, que comprende modular en dicha célula una actividad MAP-quinasa desfosforilante de un polipéptido DSP-3, comprendiendo dicho polipéptido (a) la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2, o (b) la secuencia de aminoácidos de un variante de polipéptido DSP-3 que se diferencia en una o más deleciones, adiciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos en no más de 25% de los restos de SEQ ID NO: 2, de forma que el polipéptido mantiene la capacidad de desfosforilar una MAP-quinasa activada.

En un octavo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para modular la supervivencia de una célula in vitro, que comprende modular en dicha célula una actividad MAP-quinasa desfosforilante de un polipéptido DSP-3, comprendiendo dicho polipéptido (a) la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2, o (b) la secuencia de aminoácidos de un variante de polipéptido DSP-3 que se diferencia en una o más deleciones, adiciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos en no más de 25% de los restos de SEQ ID NO: 2, de forma que el polipéptido mantiene la capacidad de desfosforilar una MAP-quinasa activada.

En un noveno aspecto de la presente invención, se proporciona un método para seleccionar una molécula por su capacidad para interaccionar con un polipéptido DSP-3, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una molécula candidata con un mutante que atrapa un sustrato de DSP-3 según una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que la molécula candidata y el mutante que atrapa un sustrato de DSP-3 interaccionen; y (b) detectar la presencia o ausencia de unión de la molécula candidata con el mutante que atrapa un sustrato de DSP-3 y, a partir de ello, determinar si la molécula candidata interacciona con el polipéptido DSP-3.

También se describen polipéptidos DSP-3 aislados que tienen la secuencia de DSP-3 indicada en SEQ ID NO: 2, o un variante de ésta que se diferencian en una o más deleciones, adiciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos en no más de 50% de los restos de SEQ ID NO: 2, de forma que el polipéptido mantiene la capacidad de desfosforilar una AP-quinasa activada.

En otros aspectos, la presente descripción proporciona un polinucleótido aislado que codifica al menos diez aminoácidos consecutivos de un polipéptido que tiene la secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, la descripción proporciona un polinucleótido aislado que codifica al menos quince aminoácidos consecutivos de un polipéptido que tiene la secuencia correspondiente a SEQ ID NO: 2. Ciertos de estos polinucleótidos codifican un polipéptido DSP-3. Además, los polinucleótidos puede ser polinucleótidos antisentido que comprenden al menos 15 nucleóticos consecutivos complementarios con una porción de un polinucleótido DSP-3 y/o que se hibridan, de modo detectable, con el complemento de la secuencia indicada en SEQ ID NO: 1 bajo condiciones que incluyen un lavado en 0,1 x SSC y SDS al 0,1% a 50ºC durante 15 minutos. También se proporcionan vectores de expresión que comprenden cualquiera de los anteriores polinucleótidos, y células hospedantes transformadas o transfectadas con dichos vectores de expresión.

La presente descripción también proporciona, dentro de otros aspectos, métodos para producir un polipéptido DSP-3, que comprenden las etapas de (a) cultivar una célula hospedante como se describió anteriormente bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido DSP-3; y (b) aislar el polipéptido DSP-3 del cultivo de células hospedantes.

La presente descripción también proporciona anticuerpos aislados, y fragmentos de unión al antígeno de éstos, que se unen, de modo específico, con un polipéptido DSP-3, tal como un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2.

La presente descripción también proporciona, dentro de otros aspectos, composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido, polinucleótido, anticuerpo o un fragmento de éste, como se describió anteriormente, en combinación con un vehículo fisiológicamente aceptable.

Dentro de otros aspectos, la presente descripción proporciona métodos para detectar la expresión de DSP-3 en una muestra, que comprenden (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno de éste, como se describió anteriormente, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo de anticuerpo/DSP-3; y (b) detectar el nivel de complejo de anticuerpo/DSP-3.

Dentro de otros aspectos, la presente descripción proporciona métodos para detectar la expresión de DSP-3 en una muestra, que comprenden (a) poner en contacto una muestra con un polinucleótido antisentido, como se describió anteriormente; y (b) detectar en la muestra una cantidad de polinucleótido DSP-3 que se híbrida con el polinucleótido antisentido. La cantidad de polinucleótido DSP-3 que se híbrida con el polinucleótido antisentido puede determinarse, por ejemplo, utilizando una reacción en cadena de polimerasa o un ensayo de hibridación.

La descripción también proporciona polipéptidos DSP-3 útiles en ensayos de selección para moduladores de la actividad enzimática y/o la unión al sustrato. También se proporcionan métodos, dentro de otros aspectos, para seleccionar un agente que modula la actividad DSP-3, que comprenden las etapas de (a) poner en contacto un agente candidato con un polipéptido DSP-3, como se describió anteriormente, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la interacción entre el polipéptido y el agente candidato; y (b) posteriormente evaluar la capacidad del polipéptido para desfosforilar un sustrato de DSP-3, con relación a una capacidad predeterminada del polipéptido para desfosforilar el sustrato de DSP-3 en ausencia del agente candidato. Estos métodos pueden realizarse in vitro, o en un entorno celular (por ejemplo, dentro de una célula intacta).

Dentro de otros aspectos, se describen métodos para seleccionar un agente que modula la actividad DSP-3, que comprenden las etapas de (a) poner en contacto un agente candidato con una célula que comprende un promotor DSP-3 operablemente conectado con un polinucleótido que codifica una proteína o transcripto detectable, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la interacción entre el promotor y el agente candidato; y (b) posteriormente evaluar la expresión del polinucleótido, con relación a un nivel de expresión predeterminado en ausencia del agente candidato.

También se proporcionan métodos para modular una respuesta proliferativa en una célula, que comprenden poner en contacto una célula con un agente que modula la actividad DSP-3.

Dentro de otros aspectos, se proporcionan métodos para modular la diferenciación de una célula, que comprenden poner en contacto una célula con un agente que modula la actividad DSP-3.

La presente invención también proporciona métodos para modular la supervivencia celular, que comprenden poner en contacto una célula con un agente que modula la actividad DSP-3.

Dentro de aspectos relacionados, la presente descripción proporciona métodos para tratar un paciente que sufre un trastorno asociado con la actividad DSP-3 (o tratable mediante la administración de DSP-3), que comprenden administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que modula la actividad DSP-3. Estos trastornos incluyen distrofia muscular de Duchenne, así como cáncer, enfermedad del injerto frente al receptor, enfermedades autoinmunológicas, alergias, enfermedades metabólicas, crecimiento celular anómalo, proliferación celular anómala y anomalías del ciclo celular.

Dentro de otros aspectos, se proporcionan polipéptidos mutantes que atrapan un sustrato de DSP-3. Estos polipéptidos se diferencian de la secuencia indicada en SEQ ID NO: 2 en una o más deleciones, adiciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos en no más de 50% de los restos de SEQ ID NO: 2, de forma que el polipéptido se une a un sustrato con una afinidad que no está sustancialmente disminuida con respecto a DSP-3, y de forma que la capacidad del polipéptido para desfosforilar un sustrato se reduce con respecto a DSP-3. Dentro de ciertas realizaciones, un polipéptido mutante que atrapa un sustrato contiene una sustitución en la posición 57 o la posición 88 de SEQ ID NO: 2.

La presente invención proporciona también, dentro de otros aspectos, métodos para seleccionar una molécula por su capacidad para interaccionar con DSP-3, que comprenden las etapas de (a) poner en contacto una molécula candidata con un polipéptido, como se describió anteriormente, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que la molécula candidata y el polipéptido interaccionen; y (b) detectar la presencia o ausencia de unión de la molécula candidata al polipéptido. La etapa de detección puede comprender, por ejemplo, una etapa de purificación de afinidad, una selección de dos híbridos de levaduras, o una selección de un banco de presentación de
fagos.

En un aspecto, la presente descripción proporciona polipéptidos DSP-3 aislados que comprenden la secuencia de una forma alternativa de DSP-3 indicada en SEQ ID NO: 21, o un variante de ésta que se diferencia en una o más deleciones, adiciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos en no más de 50% de los restos de SEQ ID NO: 21, de forma que el polipéptido mantiene la capacidad de desfosforilar una MAP-quinasa activada.

Dentro de otros aspectos, la presente descripción proporciona un polinucleótido aislado que codifica al menos diez aminoácidos consecutivos de un polipéptido que tiene una secuencia que se corresponde con SEQ ID NO: 21. En ciertas realizaciones, la invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica al menos quince aminoácidos consecutivos de un polipéptido que tiene una secuencia que se corresponde con SEQ ID NO: 21. Ciertos de estos polinucleótidos codifican una forma alternativa de DSP-3. Además, los polinucleótidos pueden ser polinucleótidos antisentido que comprenden al menos 15 nucleótidos consecutivos complementarios con una porción de un polinucleótido de una forma alternativa de DSP-3 y/o que se hibridan, de forma detectable, con el complemento de la secuencia indicada en SEQ ID NO: 20 bajo condiciones que incluyen un lavado en 0,1 x SSC y SDS al 0,1% a 60ºC durante 15 minutos. También se proporcionan vectores de expresión que comprenden cualquiera de los anteriores polinucleótidos, y células hospedantes transformadas o transfectadas con dichos vectores de expresión.

La presente descripción también proporciona, dentro de otros aspectos, métodos para producir un polipéptido de una forma alternativa de DSP-3, que comprenden las etapas de (a) cultivar una célula hospedante como se describió anteriormente bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido de una forma alternativa de DSP-3; y (b) aislar el polipéptido de una forma alternativa de DSP-3 del cultivo de células hospedantes.

La presente descripción también proporciona anticuerpos aislados, y fragmentos de unión al antígeno de éstos, que se unen, de modo específico, con un polipéptido de una forma alternativa de DSP-3, tal como un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 21.

La presente descripción también proporciona, dentro de otros aspectos, composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido, polinucleótido, anticuerpo o un fragmento de éste, como se describió anteriormente, en combinación con un vehículo fisiológicamente aceptable.

Dentro de otros aspectos, la presente descripción proporciona métodos para detectar la expresión de una forma alternativa de DSP-3 en una muestra, que comprenden (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno de éste, como se describió anteriormente, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo de anticuerpo/forma alternativa de DSP-3; y (b) detectar el nivel de complejo de anticuerpo/forma alternativa de DSP-3.

Dentro de otros aspectos, la presente descripción proporciona métodos para detectar la expresión de una forma alternativa de DSP-3 en una muestra, que comprenden (a) poner en contacto una muestra con un polinucleótido antisentido, como se describió anteriormente; y (b) detectar en la muestra una cantidad de polinucleótido de una forma alternativa de DSP-3 que se híbrida con el polinucleótido antisentido. La cantidad de polinucleótido de la forma alternativa de DSP-3 que se híbrida con el polinucleótido antisentido puede determinarse, por ejemplo, utilizando una reacción en cadena de polimerasa o un ensayo de hibridación.

La descripción también proporciona polipéptidos de una forma alternativa de DSP-3 útiles en ensayos de selección para moduladores de la actividad enzimática y/o la unión al sustrato. También se proporcionan métodos, dentro de otros aspectos, para seleccionar un agente que modula la actividad de una forma alternativa de DSP-3, que comprenden las etapas de (a) poner en contacto un agente candidato con un polipéptido, como se describió anteriormente, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la interacción entre el polipéptido y el agente candidato; y (b) posteriormente evaluar la capacidad del polipéptido para desfosforilar un sustrato de una forma alternativa de DSP-3, con relación a una capacidad predeterminada del polipéptido para desfosforilar el sustrato de la forma alternativa de DSP-3 en ausencia del agente candidato. Estos métodos pueden realizarse in vitro, o en un entorno celular (por ejemplo, dentro de una célula intacta).

Dentro de otros aspectos, se describen métodos para seleccionar un agente que modula la actividad de una forma alternativa de DSP-3, que comprenden las etapas de (a) poner en contacto un agente candidato con una célula que comprende un promotor de una forma alternativa de DSP-3 operablemente conectado con un polinucleótido que codifica una proteína o transcripto detectable, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la interacción entre el promotor y el agente candidato; y (b) posteriormente evaluar la expresión del polinucleótido, con relación a un nivel de expresión predeterminado en ausencia del agente candidato.

También se proporcionan métodos para modular una respuesta proliferativa en una célula, que comprenden poner en contacto una célula con un agente que modula la actividad de una forma alternativa de DSP-3.

Dentro de otros aspectos, se proporcionan métodos para modular la diferenciación de una célula, que comprenden poner en contacto una célula con un agente que modula la actividad de una forma alternativa de DSP-3.

La presente descripción también proporciona métodos para modular la supervivencia celular, que comprenden poner en contacto una célula con un agente que modula la actividad de una forma alternativa de DSP-3.

Dentro de aspectos relacionados, la presente descripción proporciona métodos para tratar un paciente que sufre un trastorno asociado con la actividad de una forma alternativa de DSP-3 (o tratable mediante la administración de una forma alternativa de DSP-3), que comprenden administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que modula la actividad de una forma alternativa de DSP-3. Estos trastornos incluyen cáncer, enfermedad del injerto frente al receptor, enfermedades autoinmunológicas, alergias, enfermedades metabólicas, crecimiento celular anómalo, proliferación celular anómala y anomalías del ciclo celular.

Dentro de otros aspectos, se proporcionan polipéptidos mutantes que atrapan un sustrato de una forma alternativa de DSP-3. Estos polipéptidos se diferencian de la secuencia indicada en SEQ ID NO: 21 en una o más deleciones, adiciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos en no más de 50% de los restos de SEQ ID NO: 21, de forma que el polipéptido se une a un sustrato con una afinidad que no está sustancialmente disminuida con respecto a la forma alternativa de DSP-3, y de forma que la capacidad del polipéptido para desfosforilar un sustrato se reduce con respecto a la forma alternativa de DSP-3. Dentro de ciertas realizaciones específicas, un polipéptido mutante que atrapa un sustrato contiene una sustitución en la posición 57 o la posición 88 de SEQ ID NO: 21.

La presente invención proporciona también, dentro de otros aspectos, métodos para seleccionar una molécula por su capacidad para interaccionar con una forma alternativa de DSP-3, que comprenden las etapas de (a) poner en contacto una molécula candidata con un polipéptido de una forma alternativa de DSP-3, o un variante de éste, como se describió anteriormente, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que la molécula candidata y el polipéptido interaccionen; y (b) detectar la presencia o ausencia de unión de la molécula candidata al polipéptido. La etapa de detección puede comprender, por ejemplo, una etapa de purificación de afinidad, una selección de dos híbridos de levaduras, o una selección de un banco de presentación de fagos.

Estos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes haciendo referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos. Todas las referencias descritas en la presente se incorporan como referencia en su totalidad como si se incorporaran individualmente.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 presenta una secuencia de ADNc para DSP-3 (SEQ ID NO: 1), apareciendo en negrita los codones de inicio y fin.

La figura 2 presenta la secuencia de aminoácidos predicha de DSP-3 (SEQ ID NO: 2).

La figura 3 es un alineamiento de secuencia que muestra la similitud de secuencia entre DSP-3 y otras MAP-quinasa fosfatasas.

La figura 4 muestra una hibridación de transferencia Northern utilizando, como sonda, una secuencia de ácido nucleico que codifica DSP-3 de longitud completa marcada con ^{32}P. La transferencia contenía ARN poliA+ humano de diversos tipos de tejidos como sigue: carril 1, corazón; carril 2, cerebro; carril 3, placenta; carril 4, pulmón; carril 5, hígado; carril 6, músculo esquelético; carril 7, riñón; carril 8, páncreas.

La figura 5 muestra una secuencia de ADNc para un variante de DSP-3 murino (SEQ ID NO: 20) apareciendo en negrita los codones de inicio y fin.

La figura 6 presenta la secuencia de aminoácidos predicha del variante de DSP-3 murino (SEQ ID NO: 21) codificada por la región codificadora de proteína de SEQ ID NO: 20.

Descripción detallada de la invención

Como se indicó anteriormente, la presente invención está dirigida, en general, a composiciones y métodos para modular (es decir, estimular o inhibir) respuestas proliferativas celulares, in vitro e in vivo. En particular, la presente invención proporciona una fosfatasa de especificidad dual DSP-3 o una forma alternativa de DSP-3 (figuras 1-2, 5-6; SEQ ID NO: 1, 2, 20, 21), así como variantes de éstas, y anticuerpos que se unen específicamente a DSP-3 o a una forma alternativa de DSP-3. También se proporcionan en la presente métodos para utilizar dichas composiciones para selecciones, ensayos de detección y usos terapéuticos relacionados.

Polipéptidos y polinucleótidos DSP-3

Tal como se utiliza en la presente, la expresión "polipéptido DSP-3" o "polipéptido de una forma alternativa de DSP-3" se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de DSP-3, como se proporciona en la presente, o un variante de dicha secuencia. Estos polipéptidos son capaces de desfosforilar restos tirosina y treonina/serina en un sustrato de DSP-3, con una actividad que no está sustancialmente disminuida con respecto a la del DSP-3 nativo de longitud completa. Los sustratos de DPS-3 incluye MAP-quinasas activadas (es decir, fosforiladas). Otros sustratos pueden identificarse utilizando mutantes que atrapan un sustrato, como se describe en la presente, e incluyen polipéptidos que tienen uno o más restos tirosina, treonina y/o serina fosforilados.

El DSP-3 o los variantes de polipéptido de una forma alternativa de DSP-3 dentro del alcance de la presente invención pueden contener una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones. Para ciertos DSP-3 o variantes de forma alternativa de DSP-3, la capacidad del variante para desfosforilar restos tirosina y treonina dentro de un sustrato de DSP-3 no disminuye sustancialmente. La capacidad de dicho variante de DSP-3 para desfosforilar restos tirosina y treonina dentro de un sustrato de DSP-3 puede potenciarse o permanecer invariable, con relación al DSP-3 nativo o una forma alternativa de DSP-3, o puede disminuirse en menos de 50%, y preferiblemente en menos de 20%, con relación al DSP-3 nativo o una forma alternativa de DSP-3. Estos variantes pueden identificarse utilizando los ensayos representativos proporcionados en la presente.

La presente invención también contempla las formas modificadas de DSP-3 y/o forma alternativa de DSP-3, en las que una función específica está inutilizada. Por ejemplo, estas proteínas pueden estar constitutivamente activas o inactivas, o pueden mostrar unas propiedades de unión o catalíticas alteradas. Estas proteínas alteradas pueden generarse utilizando técnicas muy conocidas, y la función alterada puede confirmarse utilizando ensayos de selección, como los proporcionados en la presente. Ciertos polipéptidos DSP-3 o de una forma alternativa de DPS-3 modificados se conocen como "mutantes que atrapan un sustrato". Estos polipéptidos mantienen la capacidad de unirse a un sustrato (es decir, la K_{m} no disminuye sustancialmente), pero muestran una capacidad reducida para desfosforilar un sustrato (es decir, la k_{cat} se reduce, preferiblemente hasta menos de 1 por minuto). Además, la estabilidad del complejo de mutante que atrapa un sustrato/sustrato no debe disminuir sustancialmente, con relación a la estabilidad de un complejo de DSP-3/sustrato, incluyendo un complejo de forma alternativa de DSP-3/sustrato. La estabilidad del complejo puede evaluarse basándose en la constante de asociación (K_{a}). La determinación de K_{m}, k_{cat} y K_{a} puede realizarse con facilidad utilizando técnicas convencionales conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, documento WO 98/04712; Lehninger, Biochemistry, 1975, Worth Publishers, NY) y los ensayos proporcionados en la presente. Los mutante que atrapan un sustrato pueden generarse, por ejemplo, modificando DSP-3 con una sustitución de aminoácido en la posición 57 o la posición 88 (por ejemplo, sustituyendo el aminoácido aspartato en la posición 57 con un resto alanina, o sustituyendo la cisteína en el resto 88 con una serina). Los mutantes que atrapan un sustrato pueden utilizarse, por ejemplo, para identificar sustratos de DSP-3. Brevemente, el DSP-3 o forma alternativa de DSP-3 modificado puede ponerse en contacto con un sustrato candidato (sólo o dentro de una mezcla de proteínas, tal como un extracto celular) para permitir la formación de un complejo de sustrato/DSP-3. El complejo entonces puede aislarse mediante técnicas convencionales para permitir el aislamiento y caracterización del sustrato. La preparación y uso de mutantes que atrapan un sustrato se describe, por ejemplo, en la publicación PCT nº WO 98/04712.

Preferiblemente, un variante contiene sustituciones conservadoras. Una "sustitución conservadora" es aquella en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de forma que un experto en la técnica puede esperar que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permanezcan sustancialmente sin cambiar. Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse, en general, basándose en la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o naturaleza anfipática de los restos. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos con carga positiva incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polar sin carga que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservadores incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Un variante también, o como alternativa, puede contener cambios no conservadores.

En general, las modificaciones se pueden realizar, con más facilidad, en regiones no críticas, que son regiones de la secuencia nativa que no cambian sustancialmente la actividad de DSP-3 o una forma alternativa de DSP-3. Las regiones no críticas pueden identificarse modificando la secuencia de DSP-3 en una región particular y ensayando la capacidad del variante resultante en un ensayo de fosfatasa, como se describe en la presente. Las modificaciones de la secuencia preferidas se realizan de modo que se mantenga el dominio del sitio activo (VHCLAGVSRS, SEQ ID NO: 3). En ciertas realizaciones preferidas, estas modificaciones afectan a las interacciones entre DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3) y los componentes celulares diferentes a los sustratos de DSP-3. Sin embargo, también pueden realizarse sustituciones en regiones críticas de la proteína nativa, con la condición de que el variante resultante mantenga sustancialmente la capacidad para estimular la desfosforilación del sustrato. En ciertas realizaciones, un variante contiene sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones en no más de 50%, preferiblemente en no más de 25% de los restos aminoácidos.

Los variantes también (o como alternativa) pueden modificarse, por ejemplo, mediante la deleción o adición de aminoácidos que tienen una influencia mínima en la actividad del polipéptido. En particular, los variantes pueden contener otras secuencias de aminoácidos en el amino- y/o carboxi-terminal. Estas secuencias pueden utilizarse, por ejemplo, para facilitar la purificación o detección del polipéptido.

Los polipéptidos DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3) pueden prepararse usando cualquiera de una diversidad de técnicas muy conocidas. Los polipéptidos recombinantes codificados por secuencias de ADN como se describe a continuación pueden prepararse con facilidad a partir de las secuencias de ADN utilizando cualquiera de una diversidad de vectores de expresión conocidos por los expertos en la técnica. Puede lograrse la expresión en cualquier célula hospedante adecuada que se ha transformado o transfectado con un vector de expresión que contiene una molécula de ADN que codifica un polipéptido recombinante. Las células hospedantes adecuadas incluyen procariotas, levaduras y células eucariotas superiores (incluyendo células de mamífero), y pueden generarse formas que se diferencian en la glicosilación variando la célula hospedante o el procesamiento tras el aislamiento. Los sobrenadantes procedentes de sistemas de hospedante/vector apropiados que segregan el polipéptido o la proteína recombinante hacia el medio de cultivo pueden concentrarse, en primer lugar, utilizando un filtro disponible en el mercado. Después de la concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación adecuada, tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio iónico. Por último, puede emplearse una o más etapas de HPLC en fase inversa para purificar aún más un polipéptido recombinante.

Las porciones y otros variantes que tienen menos de aproximadamente 100 aminoácidos y, en general, menos de aproximadamente 50 aminoácidos, también pueden generarse mediante procedimientos sintéticos, utilizando técnicas muy conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, estos polipéptidos pueden sintetizarse utilizando cualquiera de las técnicas en fase sólida disponibles en el mercado, tales como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que los aminoácidos se añaden secuencialmente a una cadena de aminoácidos en crecimiento. Véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2146, 1963. El equipo para la síntesis automática de polipéptidos está disponible en el mercado en suministradores tales como Perkin-Elmer, Inc., Applied BioSystems División (Foster City, CA), y pueden operarse según las instrucciones del fabricante.

Un "polinucleótido DSP-3" es cualquier polinucleótido que codifica al menos una porción de un polipéptido DSP-3 o una forma alternativa de DSP-3 o un variante de éstos, o que es complementario con dicho polinucleótido. Los polinucleótidos preferidos comprenden al menos 15 nucleótidos consecutivos, preferiblemente al menos 30 nucleótidos consecutivos, que codifican un polipéptido DSP-3 o una forma alternativa de DSP-3, o que son complementarios con dicha secuencia. Ciertos polinucleótidos codifican un polipéptido DSP-3 o una forma alternativa de DSP-3; otros pueden utilizarse como sondas, cebadores u oligonucleótidos antisentido, como se describe a continuación. Los polinucleótidos pueden ser monocatenarios (codificadores o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o ARN. Pueden estar presentes, aunque no necesariamente, otras secuencias codificadoras o no codificadores dentro de un polinucleótido de la presente invención, y un polinucleótido puede estar unido, aunque no necesariamente, a otras moléculas y/o materiales de soporte.

Los polinucleótidos DSP-3 pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia de DSP-3 endógena o una forma alternativa de DSP-3, o una porción o variante de corte y empalme de éstas), o pueden comprender un variante de dicha secuencia. Los variantes de polinucleótidos pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, de forma que la actividad del polipéptido codificado no disminuye sustancialmente, como se describe a continuación. El efecto sobre la actividad del polipéptido codificado puede evaluarse, en general, como se describe en la presente. Los variantes muestran preferiblemente al menos aproximadamente 70% de coincidencia, más preferiblemente al menos aproximadamente 80% de coincidencia, y lo más preferible al menos aproximadamente 90% de coincidencia con una secuencia polinucleotídica que codifica un DSP-3 nativo o una forma alternativa de DSP-3, o una porción de ésta. El porcentaje de coincidencia puede determinarse con facilidad comparando secuencias utilizando algoritmos informáticos muy conocidos por los expertos en la técnica, tales como Align o el algoritmo BLAST (Altschul, J. Mol. Biol., 219: 555-565, 1991; Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992), que está disponible en el sitio web de NCBI (http://www/ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST). Pueden utilizarse parámetros por defecto. Ciertos variantes son sustancialmente homólogos con un gen nativo. Estos variantes de polinucleótidos son capaces de hibridarse bajo condiciones moderadamente rigurosas con una secuencia de ADN o ARN que aparece en la naturaleza que codifica un DSP-3 nativo o una forma alternativa de DSP-3 (o una secuencia complementaria). Las condiciones moderadamente rigurosas adecuadas incluyen, por ejemplo, un prelavado en una disolución de 5 x SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); hibridar a 50ºC-70ºC, 5 x SSC, durante 1-16 horas (por ejemplo, durante la noche); seguido de lavar una o dos veces a 22-65ºC durante 20-40 minutos con uno o más de cada 2 x, 0,5 x y 0,2 x SSC que contiene SDS al 0,05-0,1%. Para aumentar la rigurosidad, las condiciones pueden incluir un lavado en 0,1 x SSC y SDS al 0,1% a 50-60ºC durante 15-40 minutos. Como saben los expertos en la técnica, las variaciones en la rigurosidad de las condiciones de hibridación pueden lograrse alterando el tiempo, temperatura y/o concentración de las disoluciones utilizadas para las etapas de prehibridación, hibridación y lavado, y las condiciones adecuadas también dependerán, en parte, de las secuencias de nucleótidos particulares de la sonda utilizada, y de la muestra de ácido nucleico probando transferida. Por consiguiente, se apreciará que pueden seleccionarse con facilidad unas condiciones rigurosas adecuadas sin experimentación indebida cuando se identifica una selectividad deseada de la sonda, basándose en su capacidad para hibridarse con una o más secuencias probando determinadas, pero no se híbrida con otras secuencias probando determinadas.

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Los expertos en la técnica también apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, existen muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido como se describe en la presente. Algunos de estos polinucleótidos presentan una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, los polinucleótidos que varían debido a diferencias en la utilización de codones se contemplan específicamente en la presente invención.

Los polinucleótidos pueden prepararse utilizando cualquiera de una diversidad de técnicas. Por ejemplo, un polinucleótido puede amplificarse a partir de ADNc preparado a partir de un tipo celular o de tejido adecuado, tal como células del músculo esquelético. Estos polinucleótidos pueden amplificarse mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR). En este enfoque, pueden diseñarse cebadores específicos de secuencia basándose en las secuencias proporcionadas en la presente, y pueden adquirirse o sintetizarse.

Una porción amplificada puede utilizarse para aislar un gen de longitud completa a partir de un banco adecuado (por ejemplo, ADNc de células del músculo esquelético humanas) utilizando técnicas muy conocidas. Dentro de estas técnicas, un banco (ADNc o genómico) se selecciona utilizando una o más sondas o cebadores de polinucleótidos adecuados para la amplificación. Preferiblemente, un banco se selecciona según el tamaño para incluir moléculas mayores. Los bancos cebados aleatoriamente también pueden preferirse para identificar regiones 5' y cadena arriba de genes. Se prefieren los bancos genómicos para obtener intrones y para extender secuencias 5'.

Para las técnicas de hibridación, puede marcarse una secuencia parcial (por ejemplo, por traducción de mellas o mediante marcaje en un extremo con ^{32}P) utilizando técnicas muy conocidas. Entonces puede seleccionarse un banco bacteriano o bacteriófago mediante filtros hibridantes que contienen colonias bacterianas desnaturalizadas (o cultivos que contiene placas de fagos) con la sonda marcada (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Las colonias o placas que se hibridan se seleccionan y expanden, y el ADN se aisla para su posterior análisis. Los clones pueden analizarse para determinar la cantidad de secuencia adicional, por ejemplo, mediante PCR utilizando un cebador procedente de la secuencia parcial y un cebador procedente del vector. Pueden generarse mapas de restricción y secuencias parciales para identificar uno o más clones solapantes. Puede generarse una molécula de ADNc de longitud completa acoplando fragmentos adecuados, utilizando técnicas muy conocidas.

Como alternativa, existen numerosas técnicas de amplificación para obtener una secuencia codificadora de longitud completa a partir de una secuencia de ADNc parcial. Dentro de estas técnicas, la amplificación se realiza, en general, mediante PCR. Una de estas técnicas se conoce como "amplificación rápida de extremos de ADNc" o RACE. Esta técnica implica el uso de un cebador interno y un cebador externo, que se híbrida con una región de poliA o una secuencia del vector, para identificar secuencias que están 5' y 3' de una secuencia conocida. Puede utilizarse cualquiera de una diversidad de kits disponibles en el mercado para realizar la etapa de amplificación. Pueden diseñarse cebadores utilizando, por ejemplo, programas informáticos muy conocidos en la técnica. Los cebadores tienen, preferiblemente, una longitud de 17-32 nucleótidos, con un contenido en GC de al menos 40%, y se reasocian con la secuencia diana a temperaturas de aproximadamente 54ºC a 72ºC. La región amplificada puede secuenciarse como se describió anteriormente, y las secuencias solapantes se ensamblan para formar una secuencia contigua.

En la figura 1 aparece una secuencia de ADNc que codifica DSP-3 (SEQ ID NO: 1), y en la figura 2 aparece la secuencia de aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 2). En la figura 5 aparece una secuencia de ADNc que codifica una forma alternativa de DSP-3 (SEQ ID NO: 20), y en la figura 6 aparece la secuencia de aminoácidos predicha (SEQ ID NO: 21). El sitio activo de DSP-3 VHCLAGVSRS (SEQ ID NO: 3) está codificado por bases de nucleótidos localizadas en las posiciones 258 a 285 de SEQ ID NO: 1 (figura 1; el codon de inicio comienza en el nucleótido de la posición número 1). Se utilizó la información de secuencia inmediatamente adyacente a este sitio para diseñar reacciones RACE 5' y 3' con ADNc de músculo esquelético humano para identificar una proteína de 184 aminoácidos codificada por 552 pares de bases. Esta proteína se denomina fosfatasa de especificidad dual-3, o DSP-3. El tejido de músculo esquelético humano fue el tejido en donde se observó la mayor abundancia de mensajeros para DSP-3. El DSP-3 muestra una homología significativa con otras MAP-quinasa fosfatasas, como se demuestra mediante la comparación de secuencia presentada en la figura 3.

Los variantes de polinucleótidos de DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3) pueden prepararse, en general, mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, síntesis química en fase sólida. También pueden introducirse modificaciones en una secuencia polinucleotídica utilizando técnicas de mutagénesis convencionales, tales como la mutagénesis específica de sitio dirigida a oligonucleótidos. Como alternativa, pueden generarse moléculas de ARN mediante transcripción in vitro o in vivo de secuencias de ADN que codifican DSP-3, o una porción de éstas, con la condición de que el ADN se incorpora a un vector con un promotor de ARN polimerasa adecuado (tal como T7 o SP6). Ciertos polinucleótidos pueden utilizarse para preparar un polipéptido codificado, como se describe en la presente. Además, o como alternativa, un polinucleótido puede administrarse a un paciente de forma que el polipéptido codificado se genera in vivo.

Un polinucleótido que es complementario con al menos una porción de una secuencia codificadora (por ejemplo, un polinucleótido antisentido o una ribozima) también puede utilizarse como sonda o cebador, o para modular la expresión génica. La identificación de oligonucleótidos y ribozimas para su uso como agentes antisentido, y ADN que codifica genes para su administración dirigida, implica métodos muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, las propiedades, longitudes y otras características deseables de estos oligonucleótidos son bien conocidas. Los oligonucleótidos antisentido se diseñan, de forma típica, para resistir a la degradación por enzimas nucleolíticas endógenas utilizando enlaces tales como: fosforotioato, metilfosfonato, sulfona, sulfato, cetilo, fosforoditioato, fosforamidato, ésteres de fosfato y otros enlaces (véase, por ejemplo, Argwal et al., Tetrahedron Lett., 28: 3539-3542 (1987); Miller et al., J. Am. Chem. Soc., 93: 6657-6665 (1971); Stec et al., Tetrahedron Lett., 26: 2191-2194 (1985); Moody et al., Nucl. Acids Res., 12: 4769-4782 (1989); Uznanski et al., Nucl. Acids Res. (1989); Letsinger et al., Tetrahedron, 40: 137-143 (1984); Eckstein, Annu. Rev. Biochem., 54: 367-402 (1985); Eckstein, Trends Biol. Sci., 14: 97-100 (1989); Stein, en: Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, Ed., Macmillan Press, Londres, pp. 97-117 (1989); Jager et al., Biochemistry, 27: 7237-7246 (1988)).

Los polinucleótidos antisentido son oligonucleótidos que se unen de una manera específica de secuencia a ácidos nucleicos, tales como ARNm o ADN. Cuando se unen a ARNm que tiene secuencias complementarias, el antisentido evita la traducción del ARNm (véase, por ejemplo, la patente de EEUU nº 5.168.053 de Altman et al.; la patente de EEUU nº 5.190.931 de Inouye; la patente de EEUU nº 5.135.917 de Burch; la patente de EEUU nº 5.087.617 de Smith; y Clusel et al. (1993), Nucl. Acids. Res., 21: 3405-3411, que describen oligonucleótidos antisentido "dumbbell" (de dos horquillas)). Las moléculas tríplex se refieren a hebras monocatenarias de ADN que se unen a ADN dúplex formando una molécula tríplex colineal evitando, con ello, la transcripción (véase, por ejemplo, la patente de EEUU nº 5.176.996 de Hogan et al., que describe métodos para fabricar oligonucleótidos sintéticos que se unen a sitios diana en DNA dúplex).

Los nucleótidos antisentido y moléculas tríplex particularmente útiles son moléculas que son complementarias o se unen con la hebra sentido de ADN o ARNm que codifica un polipéptido DSP-3 o una forma alternativa de DSP-3, o una proteína que media en cualquier otro proceso relacionado con la expresión de DSP-3 endógeno (o una forma alternativa de DSP-3), de forma que se realiza la inhibición de la traducción del ARNm que codifica el DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3). Los constructos de ADNc que pueden transcribirse en ARN antisentido también pueden introducirse en células o tejidos para facilitar la producción de ARN antisentido. Puede emplearse la tecnología antisentido para controlar la expresión génica mediante la interferencia con la unión de polimerasas, factores de transcripción u otras moléculas reguladoras (véase Gee et al., en: Huber y Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co. (Mt. Kisco, NY, 1994)). Como alternativa, una molécula antisentido puede diseñarse para hibridarse con una región control de un gen DSP-3 (por ejemplo, un sitio de promotor, potenciador o de inicio de la transcripción), y bloquear la transcripción del gen; o para bloquear la traducción mediante la inhibición de la unión de un transcripto a los ribosomas.

La presente invención también contempla ribozimas específicas de DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3). Una ribozima es una molécula de ARN que rompe, de manera específica, sustratos de ARN, tales como ARNm, dando como resultado una inhibición o interferencia específica con la expresión génica celular. Existen al menos cinco clases conocidas de ribozimas implicadas en la ruptura y/o acoplamiento de cadenas de ARN. Las ribozimas puede dirigirse a cualquier transcripto de ARN y pueden romper catalíticamente dichos transcriptos (véase, por ejemplo, la patente de EEUU nº 5.272.262; la patente de EEUU nº 5.144.019; y las patentes de EEUU nº 5.168.053, 5.180.818, 5.116.742 y 5.093.246 de Cech et al.). Cualquier ribozima específica de ARNm de DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3), o un ácido nucleico que codifica dicha ribozima, puede dirigirse a una célula hospedante para llevar a cabo la inhibición de la expresión génica de DSP-3. Por tanto, las ribozimas pueden dirigirse a las células hospedantes mediante ADN que codifica la ribozima unido a un promotor eucariota, tal como un promotor vírico eucariota, de forma que después de la introducción en el núcleo, la ribozima será transcrita directamente.

Cualquier polinucleótido puede modificarse aún más para aumentar la estabilidad in vivo. Las posibles modificaciones incluyen, pero no se limitan a la adición de secuencias flanqueantes 5' y/o 3'; el uso de enlaces fosforotioato u O-metilo 2', en lugar de enlaces fosfodiéster en el esqueleto; y/o la inclusión de bases no tradicionales, tales como inosina, queosina y wibutosina, así como formas acetil-, metil- y tiomodificadas y otras formas modificadas de adenina, citidina, guanina, timina y uridina.

Las secuencias de nucleótidos, tal como se describen en la presente, pueden unirse a una diversidad de otras secuencias de nucleótidos utilizando técnicas de ADN recombinante establecidas. Por ejemplo, un polinucleótido puede clonarse en cualquiera de una diversidad de vectores de clonación, incluyendo plásmidos, fágmidos, derivados del fago lambda y cósmidos. Los vectores de particular interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de secuenciación. En general, un vector adecuado contiene un origen de la replicación funcional en al menos un organismo, sitios de endonucleasas de restricción convenientes, y uno o más marcadores seleccionables. Otros elementos dependerán del uso deseado, y serán evidentes para los expertos en la técnica.

Dentro de ciertas realizaciones, los polinucleótidos pueden formularse para que permitan la entrada a la célula de un mamífero y la expresión en su interior. Estas formulaciones son particularmente útiles para fines terapéuticos, como se describe a continuación. Los expertos en la técnica apreciarán que existen muchas maneras de lograr la expresión de un polinucleótido en una célula diana, y puede emplearse cualquier método apropiado. Por ejemplo, un polinucleótido puede incorporarse en un vector vírico utilizando técnicas muy conocidas. Un vector vírico también puede transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable (para ayudar a la identificación o selección de células transducidas) y/o un resto de transporte dirigido, tal como un gen que codifica un ligando para un receptor sobre una célula diana específica, para obtener un vector específico de diana. El transporte dirigido también puede lograrse utilizando un anticuerpo, mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Otras formulaciones para fines terapéuticos incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, esferas y sistemas basados en lípidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal preferido para su uso como vehículo de transporte dirigido in vitro e in vivo es un liposoma (es decir, una vesícula de membrana artificial). La preparación y uso de estos sistemas es muy conocida en la técnica.

Dentro de otros aspectos, un promotor de DSP-3 puede aislarse utilizando técnicas convencionales. La presente invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos que comprenden dicha secuencia de promotor, o uno o más elementos reguladores de acción cis o trans de ésta. Estos elementos reguladores pueden potenciar o suprimir la expresión de DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3). La región flanqueante 5' puede generarse utilizando técnicas convencionales, basándose en la secuencia genómica proporcionada en la presente. Si es necesario, pueden generarse más secuencias 5' utilizando métodos basados en PCR u otros métodos convencionales. La región 5' puede subclonarse y secuenciarse utilizando métodos convencionales. Puede emplearse la extensión con cebadores y/o análisis de protección de ARNasa para verificar el sitio de inicio transcripcional deducido a partir del ADNc.

Para definir el límite de la región del promotor, pueden subclonarse insertos de promotor putativos de tamaño variable en el sistema de expresión heterólogo que contienen un gen indicador adecuado sin un promotor o potenciador. Los genes indicadores adecuados pueden incluir genes que codifican la luciferasa, beta-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, fosfatasa alcalina segregada, o el gen de la proteína fluorescente verde. Los sistemas de expresión adecuados con muy conocidos y pueden prepararse utilizando técnicas muy conocidas u obtenerse en el mercado. Pueden generarse constructos de deleción internos utilizando sitios de restricción internos exclusivos, o mediante la digestión parcial de sitios de restricción no exclusivos. Los constructos entonces pueden transfectarse a células que muestran niveles elevados de expresión de DSP-3. En general, el constructo con la mínima región flanqueante 5' que muestra el nivel más alto de expresión del gen indicador se identifica como el promotor. Estas regiones del promotor pueden unirse a un gen indicador y utilizarse para evaluar agentes por su capacidad para modular la transcripción de DSP-3.

Cuando se identifica un promotor funcional, pueden localizarse elementos de acción cis y trans. Las secuencias de acción cis pueden identificarse, en general, basándose en la homología con motivos transcripcionales previamente identificados. Entonces pueden generarse mutaciones puntuales dentro de las secuencias identificadas para evaluar el papel regulador de estas secuencias. Estas mutaciones pueden generarse utilizando técnicas de mutagénesis específica de sitio o una estrategia basada en PCR. El promotor alterado entonces puede clonarse en un vector de expresión de genes indicadores, como se describió anteriormente, y se evalúa el efecto de la mutación sobre la expresión del gen indicador.

La presente invención también contempla el uso de variantes alélicos de DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3), así como secuencias de DSP-3 de otros organismos. Estas secuencias pueden identificarse, en general, basándose en la similitud de las secuencias proporcionadas en la presente (por ejemplo, utilizando técnicas de hibridación), y basándose en la presencia de actividad DSP-3, utilizando un ensayo proporcionado en la presente.

En general, los polipéptidos y polinucleótidos como se describen en la presente están aislados. Un polipéptido o polinucleótido "aislado" es aquel que se retira de su entorno natural. Por ejemplo, una proteína que aparece en la naturaleza está aislada si se separa de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Preferiblemente, estos polipéptidos son al menos aproximadamente 90% puros, más preferiblemente al menos aproximadamente 95% puros, y lo más preferible al menos aproximadamente 99% puros. Un polinucleótido se considera que está aislado si, por ejemplo, se clona en un vector que no es parte del entorno natural.

Ensayos para detectar actividad DSP-3

Según la presente invención, los sustrados de DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3) pueden incluir polipéptidos y proteínas de tirosina fosforilada de longitud completa, así como fragmentos (por ejemplo, porciones), derivados o análogos de éstos que pueden fosforilarse en un resto tirosina y que pueden, en ciertas realizaciones preferidas, ser capaces también de sufrir una fosforilación en un resto serina o treonina. Estos fragmentos, derivados y análogos incluyen cualquier polipéptido de un sustrato de DSP-3 que aparece en la naturaleza o modificado genéticamente que mantenga al menos la función biológica de interaccionar con un DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3), como se proporciona en la presente, por ejemplo formando un complejo con un DPS-3 (o una forma alternativa de DSP-3). Un fragmento, derivado o análogo de un polipéptido de un sustrato de DSP-3, incluyendo los sustratos que son proteínas de fusión, puede ser (i) aquel en el que uno o más de los restos aminoácidos está sustituido por un resto aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un resto aminoácido conservado), y dicho resto aminoácido sustituido puede estar o no codificado por el código genético, o (ii) aquel en el que uno o más de los restos aminoácidos incluye un grupo sustituyente, o (iii) aquel en el que el polipéptido del sustrato está condensado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o un resto detectable, tal como una molécula indicadora, o (iv) aquel en el que otros aminoácidos están condensados con el polipéptido del sustrato, incluyendo aminoácidos que se emplean para la purificación del polipéptido del sustrato o una secuencia de proproteína. Se considera que estos fragmentos, derivados y análogos están dentro del alcance de los expertos en la técnica. En una realización preferida, un polipéptido de MAP-quinasa es un sustrato para su utilización como se proporciona en la presente.

Los variantes de polipéptidos de DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3) pueden ensayarse para la actividad DSP-3 utilizando cualquier ensayo adecuado para la actividad MAP-quinasa fosfatasa. Estos ensayos pueden realizarse in vitro o dentro de un ensayo basado en células. Por ejemplo, una MAP-quinasa puede obtenerse en forma inactiva en Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY; nº de catálogo 14-198), para su utilización como sustrato de DSP-3 como se proporciona en la presente. La fosforilación de la MAP-quinasa puede realizarse utilizando técnicas muy conocidas (tales como las descritas en Zheng y Guan, J. Biol. Chem., 268: 16116-16119, 1993), utilizando la MAP-quinasa MEK-1 (disponible en Upstate Biotechnology; nº de catálogo 14-206).

Por ejemplo, un sustrato [^{32}P]-radiomarcado (por ejemplo, MAP-quinasa) puede utilizarse para la reacción de quinasa, produciendo una MAP-quinasa activada radiomarcada. Entonces, un polipéptido DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3) puede ensayarse por su capacidad para desfosforilar una MAP-quinasa activada poniendo en contacto el polipéptido DPS-3 (o una forma alternativa de DSP-3) con la MAP-quinasa bajo condiciones adecuadas (por ejemplo, Tris, pH 7,5, EDTA 1 mM, ditiotreitol 1 mM, albúmina de suero bovina 1 mg/ml durante 10 minutos a 30ºC; o como se describe en Zheng y Guan, J. Biol. Chem., 268: 16116-16119, 1993). La desfosforilación de la MAP-quinasa puede detectarse utilizando cualquiera de una diversidad de ensayos, tales como un ensayo de quinasa acoplada (evaluando la fosforilación de un sustrato de MAP-quinasa utilizando cualquiera de los ensayos conocidos generalmente en la técnica), o directamente, basándose en (1) la pérdida de grupos fosfato radiactivos (por ejemplo, mediante electroforesis en gel, seguida de autorradiografía); (2) el desplazamiento en la movilidad electroforética después de la desfosforilación; (3) la pérdida de reactividad con un anticuerpo específico de fosfotirosina o fosfotreonina; o (4) un análisis de fosfoaminoácidos de la MAP-quinasa. Ciertos ensayos pueden realizarse, en general, como se describe en Ward et al., Nature, 367: 651-654, 1994, o Alessi et al., Oncogene, 8: 2015-2020, 1993. En general, el contacto de 500 pg-50 ng de polipéptido DSP-3 con 100 ng-100 \mug de MAP-quinasa activada debe producir una desfosforilación detectable de la MAP-quinasa, de forma típica en 20-30 minutos. En ciertas realizaciones, 0,01-10 unidades/ml (preferiblemente aproximadamente 0,1 unidades/ml, en las que una unidad es una cantidad suficiente para desfosforilar 1 nmol de sustrato por minuto) de polipéptido DSP-3 puede ponerse en contacto con 0,1-10 \muM (preferiblemente aproximadamente 1 \muM) de MAP-quinasa activada para producir una desfosforilación detectable de una MAP-quinasa. Preferiblemente, un polipéptido DSP-3 produce una desfosforilación de una MAP-quinasa o un sustrato fosforilado (tal como un péptido fosforilado en tirosina y/o serina) que es al menos tan grande como la desfosforilación observada en presencia de una cantidad comparable de DSP-3 humana nativa. Será evidente que otros sustratos identificados utilizando un mutante que atrapa un sustrato, como se describe en la presente, pueden sustituir a la MAP-quinasa en estos
ensayos.

Anticuerpos y fragmentos que se unen al antígeno

La presente invención también contempla péptidos, polipéptidos y otras moléculas no peptídicas que se unen específicamente a un DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3). Tal como se utiliza en la presente, se dice que una molécula "se une específicamente" a un DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3) si reacciona a un nivel detectable con DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3), pero no reacciona de manera detectable con péptidos que contienen una secuencia no relacionada, o una secuencia de una fosfatasa diferente. Las moléculas de unión preferidas incluyen anticuerpos, que pueden ser, por ejemplo, inmunoglobulinas policlonales, monoclonales, monocatenarias, quiméricas, antiidiotípicas, o injertadas con CDR, o sus fragmentos, tales como fragmentos de inmunoglobulinas generados proteolíticamente o producidos de modo recombinante F(ab')_{2}, Fab, Fv y Fd. Ciertos anticuerpos preferidos son aquellos anticuerpos que inhiben o bloquean la actividad DSP-3 en un ensayo in vitro, como se describe en la presente. Las propiedades de unión de un anticuerpo a DSP-3 pueden evaluarse, en general, utilizando métodos de inmunodetección, incluyendo, por ejemplo, un ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligados (ELISA), inmunoprecipitación, inmunotransferencia y similares, que los expertos en la técnica pueden realizar con facilidad.

Pueden utilizarse métodos conocidos en la técnica para generar anticuerpos, antisuero policlonal o anticuerpos monoclonales que son específicos para un DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3). También pueden producirse anticuerpos como inmunoglobulinas (Ig) modificadas genéticamente, o fragmentos de Ig diseñados para tener propiedades deseables. Por ejemplo, como ilustración y no como limitación, los anticuerpos pueden incluir una IgG recombinante que es una proteína de fusión quimérica que tiene al menos un dominio de región variable (V) procedente de una primera especie de mamífero, y al menos un dominio de región constante procedente de una segunda especie diferente de mamífero. De forma más habitual, un anticuerpo quimérico tiene secuencias de la región variable murina y secuencias de la región constante humana. Esta inmunoglobulina quimérica murina/humana puede "humanizarse" injertando las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) derivadas de un anticuerpo murino, que confieren especificidad de unión a un antígeno, en regiones de marco de la región V derivadas de humano y regiones constantes derivadas de humano. Los fragmentos de estas moléculas pueden generarse mediante digestión proteolítica u, opcionalmente, mediante digestión proteolítica seguida de una reducción suave de los enlaces disulfuro y alquilación. Como alternativa, estos fragmentos también pueden generarse mediante técnicas de modificación genética recombinantes.

Tal como se utiliza en la presente, se dice que un anticuerpo es "inmunoespecífico" o "se une específicamente" a un polipéptido DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3) si reacciona a un nivel detectable con DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3), preferiblemente con una constante de afinidad, K_{a}, mayor o igual a aproximadamente 10^{4} M^{-1}, más preferiblemente mayor o igual a aproximadamente 10^{5} M^{-1}, más preferiblemente mayor o igual a aproximadamente 10^{6} M^{-1}, y aún más preferiblemente mayor o igual a aproximadamente 10^{7} M^{-1}. Las afinidades de los compañeros de unión o anticuerpos pueden determinarse con facilidad utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, las descritas en Scatchard et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. USA, 51: 660 (1949)), o mediante resonancia de plasmón de superficie (BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ). Véase, por ejemplo, Wolff et al., Cancer Res., 53: 2560-2565 (1993).

Los anticuerpos pueden prepararse, en general, mediante cualquiera de una diversidad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988). En esta técnica, un animal se inmuniza con DSP-3 como antígeno para generar un antisuero policlonal. Los animales adecuados incluyen, por ejemplo, conejos, ovejas, cabras, cerdos, ganado vacuno, y también pueden incluir especies de mamíferos más pequeños, tales como ratones, ratas y hámsters, u otras especies.

Un inmunógeno puede estar formado por células que expresan polipéptidos DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3), polipéptidos DSP-3 purificados o parcialmente purificados (o una forma alternativa de DSP-3), o variantes o fragmentos (por ejemplo, péptidos) de éstos, o péptidos DSP-3. Los péptidos DSP-3 pueden generarse mediante ruptura proteolítica o pueden sintetizarse químicamente. Por ejemplo, en la presente se proporcionan secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3), de forma que los expertos en la técnica pueden preparar, de manera rutinaria, estos polipéptidos para su uso como inmunógenos. Los polipéptidos o péptidos útiles para la inmunización también pueden seleccionarse analizando la estructura primaria, secundaria y terciara de DSP-3 según métodos conocidos por los expertos en la técnica, para determinar las secuencias de aminoácidos que generan, con mayor probabilidad, una respuesta antigénica en un animal hospedante. Véase, por ejemplo, Novotny, 1991, Mol. Immunol., 28: 201-207; Berzofsky, 1985, Science, 229: 932-940.

La preparación del inmunógeno para inyección en animales puede incluir el acoplamiento covalente del polipéptido DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3) (o un variante o fragmento de éstos) con otra proteína inmunogénica, por ejemplo, una proteína portadora, tal como hemocianina de lapa de agujero (KLH) o albúmina de suero bovina (BSA). Además, el péptido, polipéptido DSP-3 o las células que expresan DSP-3 que se van a utilizar como inmunógeno pueden emulsionarse en un adyuvante. Véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988). En general, después de la primera inyección, los animales reciben una o más inmunizaciones de refuerzo según un programa preferido que puede variar según, entre otros, el antígeno, el adyuvante (si existe) y/o la especie animal concreta. La respuesta inmunológica puede controlarse mediante el sangrado periódico del animal, la separación del suero de la sangre recogida, y el análisis del suero en un inmunoensayo, tal como un ensayo ELISA o un ensayo de difusión Ouchterlony, o similares, para determinar la valoración del anticuerpo específico. Cuando se establece la valoración del anticuerpo, los animales pueden sangrarse periódicamente para acumular el antisuero policlonal. Los anticuerpos policlonales que se unen específicamente al polipéptido o péptido DSP-3 entonces pueden purificarse a partir de dicho antisuero, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad utilizando proteína A, o el polipéptido DSP-3, inmovilizados sobre un soporte sólido adecuado.

Los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a polipéptidos DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3), o fragmentos o variantes de éstos, e hibridomas, que son líneas celulares eucariotas inmortales, que producen anticuerpos monoclonales que tienen la especificidad de unión deseada, también pueden prepararse, por ejemplo, utilizando la técnica de Kohler y Milstein (Nature, 256: 495-497, 1976; Eur. J. Immunol., 6: 511-519 (1975)) y sus mejoras. Un animal, por ejemplo, una rata, hámster o, preferiblemente, un ratón, se inmuniza con un inmunógeno de DSP-3 preparado como se describió anteriormente. Las células linfoides que incluye células formadoras de anticuerpos, de forma típica células de bazo, se obtienen a partir de un animal inmunizado, y pueden inmortalizarse mediante fusión con un compañero de fusión celular de mieloma sensibilizado frente a un fármaco (por ejemplo, plasmacitoma), preferiblemente uno que sea singeneico con el animal inmunizado y que, opcionalmente, tenga otras propiedades deseables (por ejemplo, incapacidad para expresar productos génicos de Ig endógenos). Las células linfoides (por ejemplo, bazo) y las células de mieloma pueden combinarse durante unos pocos minutos con un agente estimulante de la fusión de membranas, tal como polietilenglicol o un detergente no iónico, y después cultivarse a baja densidad sobre un medio selectivo que apoye el crecimiento de células de hibridoma, pero no de células de mieloma no fusionadas. Un medio de selección preferido es HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, normalmente aproximadamente una a dos semanas, se observan las colonias de células. Las colonias individuales se aislan, y los anticuerpos producidos por las células pueden ensayarse para la actividad de unión con el polipéptido DSP-3, o un variante o fragmento de éste. Se prefieren los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales con alta afinidad y especificidad por un antígeno DSP-3. Por tanto, los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un polipéptido DSP-3, o un variante o fragmento de éste, son contemplados por la presente invención.

Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse a partir de los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma. Un método alternativo para la producción de un anticuerpo monoclonal murino es inyectar las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón singeneico, por ejemplo, un ratón que se ha tratado (por ejemplo, cebado con pristano) para estimular la formación de fluido de ascitis que contiene el anticuerpo monoclonal. Los contaminantes pueden retirarse del fluido de ascitis recolectado después (normalmente en 1-3 semanas) mediante técnicas convencionales, tales como cromatografía, filtración en gel, precipitación, extracción o similares. Por ejemplo, los anticuerpos pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad utilizando un ligando apropiado seleccionado basándose en las propiedades particulares del anticuerpo monoclonal (por ejemplo, isotipo de cadena pesada o ligera, especificidad de unión, etc.). Los ejemplos de un ligando adecuado, inmovilizado sobre un soporte sólido, incluyendo proteína A, proteína G, un anticuerpo de región anticonstante (cadena ligera o cadena pesada), un anticuerpo antiidiotipo, y un polipéptido DPS-3, o un fragmento o variante de éstos.

Los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse mediante cualquiera de una serie de técnicas que serán familiares para los expertos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a transformación de células de sangre periférica human (por ejemplo, que contiene linfocitos B) con virus de Epstein-Barr (EBV), inmunización in vitro de células B humanas, fusión de células de bazo procedentes de ratones transgénicos inmunizados que portan genes de inmunoglobulina insertados mediante cromosomas artificiales de levadura (YAC), aislamiento a partir de bancos de fagos de la región V de inmunoglobulinas humanas, u otros procedimientos conocidos en la técnica y basados en la descripción presente.

Por ejemplo, un método para generar anticuerpos monoclonales humanos incluye inmortalizar células de sangre periférica humana mediante transformación con EBV. Véase, por ejemplo, la patente de EEUU nº 4.464.456. Una línea celular inmortalizada que produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido DSP-3 (o un variante o fragmento de éste) puede identificarse mediante métodos de inmunodetección como se proporciona en la presente, por ejemplo, un ELISA, y después aislarse mediante técnicas de clonación convencionales. Otro método para generar anticuerpos monoclonales humanos, la inmunización in vitro, incluye cebar células B esplénicas humanas con antígeno, seguido de la fusión de las células B cebadas con un compañero de fusión heterohíbrido. Véase, por ejemplo, Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147: 86-95.

Otro método para la generación de anticuerpos monoclonales y antisuero policlonal específicos de DSP-3 para su utilización en la presente invención se refiere a ratones transgénicos. Véase, por ejemplo, la patente de EEUU nº 5.877.397; Bruggemann et al., 1997, Curr. Opin. Biotechnol., 8: 455-459; Jakobovits et al., 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci., 764: 525-535. En estos ratones, se han introducido artificialmente genes de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana mediante modificación genética en configuración de línea germinal, y se han inactivado los genes de inmunoglobulina murinos endógenos. Véase, por ejemplo, Bruggemann et al., 1997, Curr. Opin. Biotechnol., 8: 455-458. Por ejemplo, los transgenes de inmunoglobulina humana pueden ser constructos de minigenes, o transloci en cromosomas artificiales de levadura, que se someten a una redisposición de ADN específica de células B y una hipermutación en el tejido linfoide de ratón. Véase, Bruggemann et al., 1997, Curr. Opin. Biotechnol., 8: 455-458. Los anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente con DSP-3 pueden obtenerse inmunizando los animales transgénicos, fusionando las células de bazo con células de mieloma, seleccionando y después clonando las células que producen anticuerpos, como se describió anteriormente. El suero policlonal que contiene anticuerpos humanos también puede obtenerse a partir de la sangre de los animales inmunizados.

Los anticuerpos quiméricos, específicos para un DSP-3, incluyendo anticuerpos humanizados, también pueden generarse según la presente invención. Un anticuerpo quimérico tiene al menos un dominio de región constante derivado de una primera especie de mamífero, y al menos un dominio de región variable derivado de una segunda especie de mamífero diferente. Véase, por ejemplo, Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855. En realizaciones preferidas, un anticuerpo quimérico puede construirse clonando la secuencia polinucleotídica que codifica al menos un dominio de la región variable derivado de un anticuerpo monoclonal no humano, tal como la región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino, de rata, o de hámster, en un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos una región constante humana. Véase, por ejemplo, Shin et al., 1989, Methods Enzymol., 178: 459-476; Walls et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21: 2921-2929. Como ejemplo, la secuencia polinucleotídica que codifica la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo monoclonal murino puede insertarse en un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de la región constante de la cadena ligera kappa humana. En otro vector, la secuencia polinucleotídica que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal puede clonarse dentro de marco con secuencias que codifican la región constante de IgGI humana. La región constante humana particular seleccionada puede depender de las funciones efectoras deseadas para el anticuerpo concreto (por ejemplo, unión al complemento, unión a un receptor de Fc particular, etc.). Otro método conocido en la técnica para generar anticuerpos quiméricos es la recombinación homóloga (por ejemplo, la patente de EEUU nº 5.482.856). Preferiblemente, los vectores se transfectan en células eucariotas para la expresión estable del anticuerpo quimérico.

Un anticuerpo quimérico no humano/humano puede modificarse genéticamente aún más para crear un anticuerpo "humanizado". Este anticuerpo humanizado puede comprender una pluralidad de CDR derivadas de una inmunoglobulina de una especie de mamífero no humano, al menos una región de marco variable humana, y al menos una región constante de inmunoglobulina humana. La humanización, en ciertas realizaciones, puede proporcionar un anticuerpo que tiene una menor afinidad de unión por un DSP-3 cuando se compara, por ejemplo, con un anticuerpo monoclonal no humano del que se obtiene una región variable de unión a DSP-3, o un anticuerpo quimérico que tiene esta región V y al menos una región C humana, como se describió anteriormente. Las estrategias útiles para diseñar anticuerpos humanizados, por tanto, pueden incluir, por ejemplo, como ilustración y no como limitación, la identificación de regiones de marco variables humanas que son las más homólogas con las regiones de marco no humanas del anticuerpo quimérico. Sin querer limitarse por ninguna teoría, esta estrategia puede aumentar la probabilidad de que el anticuerpo humanizado mantenga la afinidad de unión específica por un DSP-3, que en algunas realizaciones preferidas puede ser sustancialmente la misma afinidad por un polipéptido DSP-3, o un variante o fragmento de éste, y en ciertas otras realizaciones preferidas puede ser una afinidad mayor por DSP-3. Véase, por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature, 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 331: 323-327. El diseño de este anticuerpo humanizado puede incluir, por tanto, determinar los determinantes estructurales y las conformaciones de bucles de las CDR de las regiones variables no humanas, por ejemplo, mediante formación de modelos por ordenador, y después comparar los determinantes y los bucles de las CDR con los determinantes y las estructuras de bucles de CDR humanas conocidas. Véase, por ejemplo, Padlan et al., 1995, FASEB, 9: 133-139; Chothia et al., 1989, Nature, 342: 377-383. La formación de modelos por ordenador también puede utilizarse para comparar moldes estructurales humanos seleccionados mediante homología de secuencia con las regiones variables no humanas. Véase, por ejemplo, Bajorath et al., 1995, Ther. Immunol., 2: 95-103; documento EP-0578515-A3. Si la humanización de las CDR no humanas produce una disminución en la afinidad de unión, la formación de modelos por ordenador puede ayudar a identificar los restos aminoácidos específicos que pueden cambiarse mediante mutagénesis dirigida específica de sitio u otras técnicas de mutagénesis para restablecer parcial, completa o supraóptimamente (es decir, aumentar hasta un nivel mayor que el del anticuerpo no humanizado) la afinidad. Los expertos en la técnica están familiarizados con estas técnicas, y apreciarán con facilidad numerosas variaciones y modificaciones de estas estrategias de diseño.

En ciertas realizaciones, puede preferirse el uso de fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos. Estos fragmentos incluyen fragmentos Fab o fragmentos F(ab')_{2}, que pueden prepararse mediante digestión proteolítica con papaína o pepsina, respectivamente. Los fragmentos de unión al antígeno pueden separarse de los fragmentos Fc mediante cromatografía de afinidad, por ejemplo, utilizando proteína A o proteína G inmovilizadas, o polipéptido DSP-3 inmovilizado, o un variante o fragmento adecuado de éste. Los expertos en la técnica pueden determinar, de modo rutinario y sin experimentación indebida, qué es un variante o fragmento adecuado basándose en la caracterización de los anticuerpos purificados por afinidad obtenidos, por ejemplo, utilizando métodos de inmunodetección como se proporcionan en la presente. Un método alternativo para generar fragmentos Fab incluye una reducción suave de fragmentos F(ab')_{2}, seguido por alquilación. Véase, por ejemplo, Weir, Handbook of Experimental Immunology, 1988, Blackwell Scientific, Boston.

Según ciertas realizaciones, las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera no humanas, humanas o humanizadas de cualquiera de las moléculas de Ig descritas anteriormente pueden construirse como fragmentos polipeptídicos monocatenarios Fv (sFv) (anticuerpos monocatenarios). Véase, por ejemplo, Bird et al., 1988, Science, 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883. Pueden generarse proteínas de fusión sFv multifuncionales uniendo una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido sFv dentro de marco con al menos una secuencia polinucleotídica que codifica una cualquiera de una diversidad de proteínas efectoras conocidas. Estos métodos son conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en el documento EP-B1-0318554, la patente de EEUU nº 5.132.405, la patente de EEUU nº 5.091.513, y la patente de EEUU nº 5.476.786. Como ejemplo, las proteínas efectoras pueden incluir secuencias de la región constante de inmunoglobulinas. Véase, por ejemplo, Hollenbaugh et al., 1995, J. Immunol. Methods, 188: 1-7. Otros ejemplos de proteínas efectoras son enzimas. Como ejemplo no limitante, estas enzimas pueden proporcionar una actividad biológica para fines terapéuticos (véase, por ejemplo, Siemers et al., 1997, Bioconjug. Chem., 8: 510-519), o pueden proporcionar una actividad detectable, tal como la conversión catalizada por peroxidasa de rábano de uno cualquiera de una serie de sustratos bien conocidos, para producir un producto detectable, para usos de diagnóstico. Otros ejemplos de proteínas de fusión de sFv incluyen fusiones de Ig-toxinas, o inmunotoxinas, en las que el polipéptido sFv está unido a una toxina. Los expertos en la técnica apreciarán que se ha identificado una amplia variedad de secuencias polipeptídicas que, bajo condiciones apropiadas, son tóxicas para las células. Tal como se utiliza en la presente, un polipéptido de toxina para su inclusión en una proteína de fusión de inmunoglobulina puede ser cualquier polipéptido capaz de introducirse en una célula de una manera que compromete la supervivencia de la célula, por ejemplo, interfiriendo directamente con una función vital o induciendo la apoptosis. Por tanto, las toxinas pueden incluir, por ejemplo, proteínas inactivadoras de ribosomas, tales como la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, la gelonina vegetal, la briodina de Bryonia dioica, o similares. Véase, por ejemplo, Thrush et al., 1996, Annu. Rev. Immunol., 14: 49-71; Frankel et al., 1996, Cancer Res., 56: 926-932. Numerosas otras toxinas, incluyendo agentes quimioterapéuticos, agentes antimitóticos, antibióticos, inductores de la apoptosis (o "apoptógenos", véase, por ejemplo, Green y Reed, 1998, Science, 281: 1309-1312) o similares, son conocidos por los expertos en la técnica, y se pretende que los ejemplos proporcionados en la presente sean ilustrativos sin limitar el alcance y espíritu de la invención.

Los sFv, en ciertas realizaciones, pueden estar fusionados con dominios peptídicos o polipeptídicos que permiten la detección de la unión específica entre la proteína de fusión y el antígeno (por ejemplo, un DSP-3). Por ejemplo, el dominio del polipéptido de fusión puede ser un polipéptido de marcaje por afinidad. La unión de la proteína de fusión de sFv con un compañero de unión (por ejemplo, un DSP-3) puede detectarse, por tanto, utilizando un marcador polipeptídico o peptídico de afinidad, tal como avidina, estreptavidina o un marcador de His (por ejemplo, polihistidina), mediante una cualquiera de una diversidad de técnicas que son familiares para los expertos en la técnica. Las técnicas de detección también pueden incluir, por ejemplo, la unión de una proteína de fusión de avidina o estreptavidina con biotina o con una secuencia mimética de biotina (véase, por ejemplo, Luo et al., 1998, J. Biotechnol., 65: 225, y las referencias citadas en ello), la modificación covalente directa de una proteína de fusión con un resto detectable (por ejemplo, un resto marcador), la unión no covalente de la proteína de fusión con una molécula indicadora marcada específica, la modificación enzimática de un sustrato detectable mediante una proteína de fusión que incluye una porción que tiene actividad enzimática, o la inmovilización (covalente o no covalente) de la proteína de fusión sobre un soporte en fase sólida.

La proteína de fusión de sFv de la presente invención, que comprende un polipéptido derivado de inmunoglobulina específico de DSP-3 fusionado con otro polipéptido, tal como un péptido efector que tiene propiedades de afinidad deseables, puede incluir, por tanto, por ejemplo, una proteína de fusión en la que el péptido efector es una enzima, tal como glutatión-S-transferasa. Como otro ejemplo, las proteínas de fusión de sFv también pueden comprender un polipéptido de Ig específico de DSP-3 fusionado con un polipéptido de proteína A de Staphylococcus aureus; los ácidos nucleicos que codifican la proteína A y su uso en la construcción de proteínas de fusión que tienen afinidad por regiones constantes de inmunoglobulinas se describen, en general, por ejemplo, en la patente de EEUU nº 5.100.788. Otros polipéptidos de afinidad útiles para la construcción de proteínas de fusión de sFv pueden incluir proteínas de fusión de estreptavidina, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 89/03422; el documento US 5.489.528; el documento US 5.672.691; el documento WO 93/24631; el documento US 5.168.049; el documento US 5.272.254 y otros, y proteínas de fusión de avidina (véase, por ejemplo, el documento EP 511.747). Tal como se proporciona en la presente, las secuencias de polipéptidos de sFv pueden fusionarse con secuencias de polipéptidos de fusión, incluyendo secuencias de proteínas efectoras, que pueden incluir polipéptidos de fusión de longitud completa, y pueden contener, como alternativa, variantes o fragmentos de éstos.

Otro método para seleccionar anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido DSP-3, o un variante o fragmento de éste, es la presentación de fagos. Véase, por ejemplo, Winter et al., 1994, Annul. Rev. Immunol., 12: 433-455; Burton et al., 1994, Adv. Immunol., 57: 191-280. Pueden crearse bancos combinatorios de genes de la región variable de inmunoglobulinas humanas o murinas en vectores de fagos, que pueden seleccionarse para seleccionar fragmentos de Ig (Fab, Fv, sFv o multímeros de éstos) que se unen específicamente con un polipéptido DSP-3, o un variante o fragmento de éste. Véase, por ejemplo, la patente de EEUU nº 5.223.409; Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281; Kang et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 4363-4366; Hoogenbroom et al., 1992, J. Molec. Biol., 227: 381-388; Schlebusch et al., 1997, Hybridoma, 16: 47-52, y las referencias citadas en ellos. Por ejemplo, un banco que contiene una pluralidad de secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de la región variable de Lg puede insertarse en el genoma de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o un variante de éste, dentro de marco con la secuencia que codifica una proteína de la cubierta del fago, por ejemplo, el gen III o el gen VIII de M13, para crear una proteína de fusión de M13. Una proteína de fusión puede ser una fusión de la proteína de la cubierta con el dominio de la región variable de la cadena ligera y/o con el dominio de la región variable de la cadena
pesada.

Según ciertas realizaciones, también pueden presentarse fragmentos Fab de inmunoglobulinas sobre la partícula del fago, como sigue. Pueden insertarse secuencias polinucleotídicas que codifican dominios de la región constante de Ig en el genoma del fago dentro de marco con una proteína de la cubierta. La proteína de fusión de la cubierta del fago puede, así, fusionarse con un fragmento de cadena ligera o cadena pesada de Ig (Fd). Por ejemplo, a partir de un banco de Ig humana, la secuencia polinucleotídica que codifica la región constante kappa humana puede insertarse en un vector dentro de marco con la secuencia que codifica al menos una de las proteínas de la cubierta del fago. Además, o como alternativa, la secuencia polinucleotídica que codifica el dominio CH1 de IgGI humana puede insertarse dentro de marco con la secuencia que codifica al menos otra de las proteínas de la cubierta del fago. Una pluralidad de secuencias polinucleotídicas que codifican dominios de la región variable (por ejemplo, derivados a partir de un banco de ADN) entonces puede insertarse en el vector dentro de marco con las proteínas de fusión de la cubierta-región constante, para la expresión de fragmentos Fab fusionados con una proteína de la cubierta del bacteriófago.

El fago que presenta un fragmento de Ig (por ejemplo, una región V o Fab de Ig) que se une a un polipéptido DSP-3 puede seleccionarse mezclando el banco de fagos con DSP-3, o un variante o fragmento de éste, o poniendo en contacto el banco de fagos con un polipéptido DSP-3 inmovilizado sobre una matriz sólida bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la unión. El fago no unido se retira mediante un lavado que, de forma típica, puede ser un tampón que contiene una sal (por ejemplo, NaCl) a baja concentración, preferiblemente con menos de NaCl 100 mM, más preferiblemente con menos de NaCl 50 mM, y lo más preferible con menos de NaCl 10 mM o, como alternativa, un tampón que no contiene sal. El fago unido específicamente entonces se eluye con un tampón que contiene NaCl, por ejemplo, aumentando la concentración salina de una manera discontinua. De forma típica, el fago que se une al DSP-3 con mayor afinidad requerirá mayores concentraciones salinas para ser retirado. El fago eluido puede propagarse en un hospedante bacteriano apropiado y, en general, pueden repetirse rondas sucesivas de unión y elución de DSP-3 para aumentar el rendimiento del fago que expresa una inmunoglobulina específica de DSP-3. También pueden emplearse bancos de fagos combinatorios para la humanización de regiones variables no humanas. Véase, por ejemplo, Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem., 271: 22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 8910-8915. La secuencia de ADN del gen de inmunoglobulina insertado en el fago seleccionado de esta manera puede determinarse mediante técnicas convencionales. Véase, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. La secuencia codificadora de Ig seleccionada mediante afinidad entonces puede clonarse en otro vector adecuado para la expresión del fragmento de Ig u, opcionalmente, puede clonarse en un vector que contiene regiones constantes de Ig, para la expresión de las cadenas completas de inmunoglobulina.

Las técnicas de presentación de fagos también pueden utilizarse para seleccionar polipéptidos, péptidos o anticuerpos monocatenarios que se unen a DSP-3. Para obtener ejemplos de vectores adecuados que tienen sitios de multiclonación en los cuales pueden insertarse moléculas de ácidos nucleicos candidatas (por ejemplo, ADN) que codifican dichos péptidos o anticuerpos, véase, por ejemplo, McLafferty et al., Gene, 128: 29-36, 1993; Scott et al., 1990, Science, 249: 386-390; Smith et al., 1993, Methods Enzymol., 217: 228-257; Fisch et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 7761-7766. Las moléculas de ADN insertadas pueden comprender secuencias generadas de forma aleatoria, o pueden codificar variantes de un dominio de péptido o polipéptido conocido que se une específicamente a un polipéptido DSP-3, o un variante o fragmento de éste, como se proporciona en la presente. En general, el inserto de ácido nucleico codifica un péptido de hasta 60 aminoácidos, más preferiblemente un péptido de 3 a 35 aminoácidos, y aún más preferiblemente un péptido de 6 a 20 aminoácidos. El péptido codificado por la secuencia insertada se presenta sobre la superficie del bacteriófago. Los fagos que expresan un dominio de unión para un polipéptido DSP-3 pueden seleccionarse basándose en la unión específica a un polipéptido DSP-3 inmovilizado, como se describió anteriormente. Tal como se proporciona en la presente, pueden utilizarse técnicas genéticas recombinantes muy conocidas para construir proteínas de fusión que contienen estos fragmentos. Por ejemplo, puede generarse un polipéptido que comprende una disposición en tándem de dos o más dominios de unión al péptido DSP-3 seleccionados por afinidad similares o no similares, para maximizar la afinidad de unión por DSP-3 del producto resultante.

En ciertas realizaciones, la invención contempla anticuerpos específicos de DSP-3 que son fragmentos de anticuerpos multiméricos. Las metodologías útiles se describen, en general, por ejemplo, en Hayden et al., 1997, Curr. Opin. Immunol., 9: 201-212; Coloma et al., 1997, Nat. Biotechnol., 15: 159-163). Por ejemplo, pueden crearse fragmentos de anticuerpos multiméricos mediante técnicas de fagos para formar minianticuerpos (patente de EEUU nº 5.910.573) o diacuerpos (Holliger et al., 1997, Cancer Immunol. Immunother., 45: 128-130). Pueden generarse fragmentos multiméricos que son multímeros de un Fv específico de DSP-3, o que son anticuerpos biespecíficos que comprenden un Fv específico de DSP-3 asociado de modo no covalente con un segundo Fv que tiene una especificidad de antígeno diferente. Véase, por ejemplo, Koelemij et al., 1999, J. Immunother., 22: 514-524. Como otro ejemplo, un anticuerpo multimérico puede comprender un anticuerpo biespecífico que tiene dos anticuerpos monocatenarios o fragmentos Fab. Según ciertas realizaciones relacionadas, un primer fragmento de Ig puede ser específico para un primer determinante antigénico sobre un polipéptido DSP-3 (o un variante o fragmento de éste), mientras que un segundo fragmento de Ig puede ser específico para un segundo determinante antigénico del polipéptido DSP-3. Como alternativa, en ciertas realizaciones relacionadas, un primer fragmento de inmunoglobulina puede ser específico para un determinante antigénico sobre un polipéptido DSP-3, o un variante o fragmento de éste, y un segundo fragmento de inmunoglobulina puede ser específico para un determinante antigénico sobre una segunda molécula diferente (es decir, no es DSP-3). También se contemplan anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a DSP-3, en los que al menos un dominio de unión al antígeno está presente como una proteína de fusión.

La introducción de mutaciones de aminoácidos en las moléculas de inmunoglobulina que se unen a DSP-3 puede ser útil para aumentar la especificidad o afinidad por DSP-3, o para alterar una función efectora. La inmunoglobulinas con mayor afinidad por DSP-3 pueden generarse mediante mutagénesis dirigida específica de sitio de restos particulares. Puede emplearse la formación de modelos moleculares tridimensionales por ordenador para identificar los restos aminoácidos que se van a cambiar, para mejorar la afinidad por el polipéptido DSP-3. Véase, por ejemplo, Mountain et al., 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142. Como alternativa, pueden generarse bancos combinatorios de CDR en el fago M13 y seleccionarse para obtener fragmentos de inmunoglobulina con mayor afinidad. Véase, por ejemplo, Glaser et al., 1992, J. Immunol., 149: 3903-3913; Barbas et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813; patente de EEUU nº 5.792.456).

Las funciones efectoras también pueden alterarse mediante mutagénesis dirigida específica de sitio. Véase, por ejemplo, Duncan et al., 1988, Nature, 332: 563-564; Morgan et al., 1995, Immunology, 86: 319-324; Eghtedarzedeh-Kondri et al., 1997, Biotechniques, 23: 830-834. Por ejemplo, una mutación en el sitio de glicosilación en la porción Fc de la inmunoglobulina puede alterar la capacidad de la inmunoglobulina para unirse al complemento. Véase, por ejemplo, Wright et al., 1997, Trends Biotechnol., 15: 26-32. Otras mutaciones en los dominios de la región constante pueden alterar la capacidad de la inmunoglobulina para unirse al complemento, o para llevar a cabo la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. Véase, por ejemplo, Duncan et al., 1988, Nature, 332: 563-564; Morgan et al., 1995, Immunology, 86: 319-324; Sensel et al., 1997, Mol. Immunol., 34: 1019-1029.

Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo, o un fragmento de éste, que se une específicamente a DSP-3, como se describe en la presente, pueden propagarse y expresarse en consecuencia mediante cualquiera de una diversidad de procedimientos bien conocidos para la excisión, acoplamiento, transformación y transfección de ácidos nucleicos. Así, en ciertas realizaciones, puede preferirse la expresión de un fragmento de anticuerpo en un hospedante procariota, tal como Escherichia coli (véase, por ejemplo, Pluckthun et al., 1989, Methods Enzymol., 178: 497-515). En ciertas realizaciones, puede preferirse la expresión de un anticuerpo, o un fragmento de éste, en una célula hospedante eucariota, incluyendo levaduras (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y Pichia pastoris), células animales (incluyendo células de mamífero), o células vegetales. Los ejemplos de células animales adecuadas incluyen, pero no se limitan a células de mieloma, COS, CHO o hibridoma. Los ejemplos de células vegetales incluyen células de tabaco, maíz, soja y arroz. Mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica y basados en la presente descripción, un vector de ácido nucleico puede diseñarse para expresar secuencias extrañas en un sistema hospedante concreto, y después pueden insertarse las secuencias polinucleotídicas que codifican el anticuerpo de unión a DSP-3 (o un fragmento de éste). Los elementos reguladores variarán dependiendo del hospedante concreto.

Una inmunoglobulina de unión a DSP-3 (o un fragmento de ésta), tal como se describe en la presente, puede contener un resto detectable o marcador, tal como una enzima, agente citotóxico u otra molécula indicadora, incluyendo un tinte, radionúclido, grupo luminiscente, grupo fluorescente, o biotina, y similares. La inmunoglobulina específica de DSP-3, o un fragmento de ésta, puede radiomarcarse para aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas. Las técnicas para el radiomarcaje de anticuerpos son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Adams, 1998, In Vivo, 12: 11-21; Hiltunen, 1993, Acta Oncol., 32: 831-839. Las aplicaciones terapéuticas se describen con más detalle a continuación y pueden incluir el uso del anticuerpo de unión a DSP-3 (o un fragmento de éste) junto con otros agentes terapéuticos. El anticuerpo o fragmento también puede conjugarse con un agente citotóxico, como se conoce en la técnica y se proporciona en la presente, por ejemplo, una toxina, tal como una proteína inactivadora de ribosomas, un agente quimioterapéutico, un agente antimitótico, un antibiótico o similares.

La invención también contempla la generación de anticuerpos antiidiotipo que reconocen un anticuerpo (o un fragmento de unión al antígeno de éste) que se une específicamente a DSP-3, como se proporciona en la presente, o un variante o fragmento de éste. Los anticuerpos antiidiotipo pueden generarse como anticuerpos policlonales o como anticuerpos monoclonales mediante los métodos descritos en la presente, utilizando un anticuerpo anti-DSP-3 (o un fragmento de unión al antígeno de éste) como inmunógeno. Los anticuerpos antiidiotipo, o fragmentos de éstos, también pueden generarse mediante cualquiera de los métodos de modificación genética recombinantes descritos anteriormente, o mediante selección de presentación de fagos. Un anticuerpo antiidiotipo puede reaccionar con el sitio de unión al antígeno del anticuerpo anti-DSP-3 de forma que la unión del anticuerpo anti-DSP-3 al polipéptido DSP-3 se inhibe competitivamente. Como alternativa, un anticuerpo antiidiotipo como se proporciona en la presente puede no inhibir competitivamente la unión de un anticuerpo anti-DSP-3 a un polipéptido DSP-3.

Tal como se proporciona en la presente y según metodologías muy conocidas en la técnica, pueden utilizarse anticuerpos policlonales y monoclonales para el aislamiento por afinidad de polipéptidos DSP-3. Véase, por ejemplo, Hermanson et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, Nueva York, 1992. Brevemente, un anticuerpo (o un fragmento de unión al antígeno de éste) puede inmovilizarse sobre un material de soporte sólido, que entonces se pone en contacto con una muestra que comprende el polipéptido de interés (por ejemplo, un DSP-3). Después de la separación del resto de la muestra, el polipéptido entonces se libera del anticuerpo inmovilizado.

Métodos para detectar la expresión de DSP-3

Ciertos aspectos de la presente invención proporcionan métodos que emplean anticuerpos producidos contra DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3), o polinucleótidos hibridantes, para objetivos de diagnóstico y ensayo. Ciertos ensayos implican el uso de un anticuerpo u otro agente para detectar la presencia o ausencia de DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3), o de fragmentos proteolíticos de éste. Como alternativa, un ácido nucleico que codifica DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3) puede detectarse utilizando técnicas de hibridación y/o PCR convencionales. Los expertos en la técnica pueden diseñarse sondas y cebadores adecuados basándose en la secuencia de ADNc de DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3) proporcionada en la presente. Los ensayos pueden realizarse, en general, utilizando cualquiera de una diversidad de muestras obtenidas a partir de una fuente biológica, tal como células eucariotas, bacterias, virus, extractos preparados a partir de estos organismos, y fluidos que se encuentran dentro de organismos vivos. Las muestras biológicas que pueden obtenerse a partir de un paciente incluyen muestras de sangre, especimenes de biopsia, explantes de tejido, cultivos de órganos y otras preparaciones de tejidos o células. Un paciente o fuente biológica puede ser un animal humano o no humano, un cultivo de células primarias, o una línea celular adaptada a un cultivo, incluyendo, pero sin limitarse a líneas células modificadas genéticamente que pueden contener secuencias de ácidos nucleicos recombinantes cromosómicamente integradas o episómicas, líneas celulares inmortalizadas o inmortalizables, líneas celulares híbridas de células somáticas, líneas celulares diferenciadas o diferenciables, líneas celulares transformadas y similares. En ciertas realizaciones preferidas, el paciente o fuente biológica es un ser humano, y en ciertas realizaciones preferidas, la fuente biológica es un animal no humano que es un mamífero, por ejemplo, un roedor (por ejemplo, ratón, rata, hámster, etc.), un ungulado (por ejemplo, un bovino) o un primate no humano. En ciertas realizaciones preferidas de la invención, puede sospecharse que un paciente tenga o presente riesgo de tener una enfermedad asociada con la transducción de señales celular alterada, o puede saberse que no presenta riesgo o no haya presencia de dicha enfermedad.

Para detectar la proteína DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3), el reactivo, de forma típica, es un anticuerpo, que puede prepararse como se describe a continuación. Existe una diversidad de formatos de ensayo conocidos por los expertos en la técnica para utilizar un anticuerpo para detectar un polipéptido en una muestra. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Por ejemplo, el ensayo puede realizarse en un formato de análisis de la transferencia Western, en el que una preparación de proteínas procedentes de la muestra biológica se resuelve mediante electroforesis en gel, se traslada a una membrana adecuada y se deja reaccionar con el anticuerpo. La presencia del anticuerpo sobre la membrana entonces puede detectarse utilizando un reactivo de detección adecuado, como se describe a continuación.

En otra realización, el ensayo implica el uso de un anticuerpo inmovilizado sobre un soporte sólido para unirse al DSP-3 diana (o una forma alternativa de DSP-3) y retirarlo del resto de la muestra. El DSP-3 unido entonces puede detectarse utilizando un segundo anticuerpo o reactivo que contiene un grupo indicador. Como alternativa, puede utilizarse un ensayo de competición, en el que un polipéptido DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3) se marca con un grupo indicador y se deja que se una al anticuerpo inmovilizado después de la incubación del anticuerpo con la muestra. El grado en el que los componentes de la muestra inhiben la unión del polipéptido marcado al anticuerpo es indicativo de la reactividad de la muestra con el anticuerpo inmovilizado y, como resultado, es indicativo del nivel de DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3) en la muestra.

El soporte sólido puede ser cualquier material conocido por los expertos en la técnica al que puede unirse el anticuerpo, tal como un pocillo de ensayo en una placa de microvaloración, un filtro de nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Como alternativa, el soporte puede ser una esfera o disco, tal como vidrio, fibra de vidrio, látex o un plástico, tal como poliestireno o poli(cloruro de vinilo). El anticuerpo puede inmovilizarse sobre el soporte sólido utilizando una diversidad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica, que se describen ampliamente en la bibliografía de patentes y científica.

En ciertas realizaciones, el ensayo para la detección de DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3) en una muestra es un ensayo de tipo sándwich de dos anticuerpos. Este ensayo puede realizarse poniendo en contacto, en primer lugar, un anticuerpo que se ha inmovilizado sobre un soporte sólido, de forma habitual el pocillo de una placa de microvaloración, con la muestra biológica, de forma que el DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3) dentro de la muestra se deja unirse al anticuerpo inmovilizado (un tiempo de incubación de 30 minutos a temperatura ambiente es suficiente, en general). La muestra no unida entonces se retira de los complejos de DSP-3/anticuerpo inmovilizados, y se añade un segundo anticuerpo (que contiene un grupo indicador, tal como una enzima, tinte, radionúclido, grupo luminiscente, grupo fluorescente o biotina) capaz de unirse a un sitio diferente sobre el DSP-3. La cantidad de segundo anticuerpo que permanece unido al soporte sólido entonces se determina utilizando un método apropiado para el grupo indicador específico. Para grupos radiactivos, en general resulta apropiado un recuento de centelleo o métodos autorradiográficos. Pueden emplearse métodos espectroscópicos para detectar tintes, grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. La biotina puede detectarse utilizando avidina, acoplada a un grupo indicador diferente (de forma habitual, un grupo radiactivo o fluorescente, o una enzima). Los grupos indicadores enzimáticos pueden detectarse, en general, mediante la adición del sustrato (en general durante un periodo específico de tiempo), seguido del análisis espectroscópico u otro análisis de los productos de reacción. Pueden utilizarse patrones y adición de patrones para determinar el nivel de DSP-3 en una muestra, utilizando técnicas muy conocidas.

En un aspecto relacionado de la presente invención, se proporcionan kits para detectar la actividad DSP-3 y DSP-3 fosfatasa. Estos kits pueden diseñarse para detectar el nivel de DSP-3 o ácido nucleico que codifica DSP-3, o pueden detectar la actividad fosfatasa de DSP-3 en un ensayo de fosfatasa directo o un ensayo de fosfatasa acoplado. En general, los kits de la presente invención comprenden uno o más recipientes que encierran elementos, tales como reactivos o tampones, para ser utilizados en el ensayo.

Un kit para detectar el nivel de DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3), o un ácido nucleico que codifica DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3), contiene, de forma típica, un reactivo que se une a la proteína, ADN o ARN de DSP-3. Para detectar el ácido nucleico que codifica DSP-3, el reactivo puede ser una sonda de ácido nucleico o un cebador de PCR. Para detectar la proteína DSP-3, el reactivo es, de forma típica, un anticuerpo. Estos kits también contienen un grupo indicador adecuado para la detección directa o indirecta del reactivo (es decir, el grupo indicador puede estar unido covalentemente con el reactivo, o puede estar unido a una segunda molécula, tal como proteína A, proteína G, inmunoglobulina o lectina, que, en sí misma, es capaz de unirse al reactivo). Los grupos indicadores adecuados incluyen, pero no se limitan a enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano), sustratos, cofactores, inhibidores, tintes, radionúclidos, grupos luminiscentes, grupos fluorescentes y biotina. Estos grupos indicadores pueden utilizarse para detectar, de forma directa o indirecta, la unión del reactivo a un componente de la muestra utilizando métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.

Los kits para detectar la actividad DSP-3 comprenden, de forma típica, un sustrato de DSP-3 en combinación con un tampón adecuado. La actividad DSP-3 puede detectarse específicamente realizando una etapa de inmunoprecipitación con un anticuerpo específico de DSP-3 antes de realizar un ensayo de fosfatasa, como se describió anteriormente. También pueden proporcionarse otros reactivos para su uso en la detección de la desfosforilación del sustrato.

Con ciertos ensayos de diagnóstico, un trastorno proliferativo puede detectarse en un paciente o cualquier otro organismo de fuente biológica como se proporciona en la presente, basándose en la presencia de un DSP-3 alterado (o una forma alternativa de DSP-3), o un nivel alterado de expresión de DSP-3. Por ejemplo, un anticuerpo puede distinguir entre un DSP-3 de tipo salvaje y un DSP-3 alterado que tiene una variación en la secuencia de aminoácidos. Esta variación puede ser indicativa de la presencia de un trastorno proliferativo, o de una susceptibilidad a dicho trastorno. Pueden utilizarse técnicas de hibridación y amplificación, de forma similar, para detectar secuencias de DSP-3 modificadas.

Métodos para identificar moduladores de la actividad DSP-3

En un aspecto de la presente invención, los polipéptidos DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3) pueden utilizarse para identificar agentes que modulan la actividad DSP-3. Estos agentes pueden inhibir o potenciar la transducción de señales a través de una cascada de MAP-quinasas, conduciendo a una proliferación celular. Un agente que modula la actividad DSP-3 puede alterar (por ejemplo, aumentar o disminuir de una manera estadísticamente significativa) la expresión y/o estabilidad de DSP-3, la actividad de la proteína DSP-3 y/o la capacidad de DSP-3 para desfosforilar un sustrato. Los agentes que pueden seleccionarse en estos ensayos incluyen, pero no se limitan a anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de éstos, sustratos competitivos o péptidos que representan, por ejemplo, un sitio catalítico o un motivo de fosforilación dual, polinucleótidos antisentido y ribozimas que interfieren con la transcripción y/o traducción de DSP-3 y otras moléculas naturales y sintéticas, por ejemplo, inhibidores de moléculas pequeñas, que se unen e inactivan el DSP-3.

Los agentes candidatos para utilizar en un método para seleccionar un modulador de DSP-3 según la presente invención pueden proporcionarse como "bancos" o colecciones de compuestos, composiciones o moléculas. Estas moléculas incluyen, de forma típica, compuestos conocidos en la técnica como "moléculas pequeñas", y que tienen un peso molecular menor que 10^{5} daltons, preferiblemente menor que 10^{4} daltons, y aún más preferiblemente menor que 10^{3} daltons. Por ejemplo, los miembros de un banco de compuestos de ensayo pueden administrarse a una pluralidad de muestras, conteniendo cada una al menos un polipéptido DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3), como se proporciona en la presente, y después ensayarse por su capacidad para potenciar o inhibir la desfosforilación mediada por DSP-3 de un sustrato, o la unión a un sustrato. Los compuestos identificados de esta manera por ser capaces de influir en la función de DSP-3 (por ejemplo, desfosforilación de fosfotirosina y/o fosfoserina/treonina) son valiosos para objetivos terapéuticos y/o de diagnóstico, puesto que permiten el tratamiento y/o detección de enfermedades asociadas con la actividad DSP-3. Estos compuestos también son valiosos en investigaciones dirigidas a mecanismos de señalización molecular que implican DSP-3, y en refinamientos en el descubrimiento y desarrollo de futuros compuestos de DSP-3 que muestren mayor especificidad.

Los agentes candidatos también pueden proporcionarse como miembros de un banco combinatorio, que incluye preferiblemente agentes sintéticos preparados según una pluralidad de reacciones químicas predeterminadas realizadas en una pluralidad de recipientes de reacción. Por ejemplo, pueden prepararse diversos compuestos de partida empleando una o más síntesis en fase sólida, metodologías mixtas aleatorias registradas y técnicas de ruptura de reacción registradas, que permiten que un constituyente concreto sufra, de forma detectable, una pluralidad de permutaciones y/o combinaciones de las condiciones de reacción. Los productos resultantes comprenden un banco que puede seleccionarse, seguido de procedimientos de selección y síntesis iterativos, tales como un banco combinatorio sintético de péptidos (véanse, por ejemplo, los documentos PCT/US91/08694, PCT/US91/04666, que se incorporan en la presente como referencia en su totalidad), u otras composiciones que pueden incluir moléculas pequeñas, como se proporciona en la presente (véanse, por ejemplo, los documentos PCT/US94/08542, EP 0774464, U.S. 5.798.035, U.S. 5.789.172, U.S. 5.751.629, que se incorporan en la presente como referencia en su totalidad). Los expertos en la técnica apreciarán que puede prepararse una variedad diversa de estos bancos según procedimientos establecidos, y ensayarse utilizando DSP-3 según la presente descripción.

En ciertas realizaciones, pueden identificarse agentes moduladores combinando un agente candidato con un polipéptido DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3), o un polinucleótido que codifica dicho polipéptido, in vitro o in vivo, y evaluando el efecto del agente candidato sobre la actividad DSP-3 fosfatasa utilizando, por ejemplo, un ensayo representativo descrito en la presente. Un aumento o disminución en la actividad fosfatasa puede medirse realizando un ensayo representativo proporcionado en la presente en presencia y ausencia de un agente candidato. Brevemente, un agente candidato puede incluirse en una mezcla de un polipéptido DSP-3 activo y sustrato (por ejemplo, una MAP-quinasa fosforilada), con o sin preincubación con uno o más componentes de la mezcla. En general, una cantidad adecuada de anticuerpo u otro agente para su uso en dicho ensayo varía de aproximadamente 0,01 \muM a aproximadamente 100 \muM. El efecto del agente sobre la actividad DSP-3 entonces puede evaluarse cuantificando la pérdida de fosfato del sustrato, y comparando la pérdida con la lograda utilizando DSP-3 sin la adición de un agente candidato. Como alternativa, puede emplearse un ensayo de quinasa acoplado, en el que la actividad DSP-3 se mide indirectamente basándose en la actividad MAP-quinasa.

Como alternativa, un polinucleótido que comprende un promotor de DSP-3 conectado operablemente a una región codificadora de DSP-3 o un gen indicador puede utilizarse para evaluar el efecto de un compuesto de ensayo sobre la transcripción de DSP-3. Estos ensayos pueden realizarse en células que expresan DSP-3 de forma endógena (por ejemplo, células del músculo esquelético, corazón, cerebro, hígado o pancreáticas humanas o de otro mamífero), o en células transfectadas con un vector de expresión que comprende un promotor de DSP-3 conectado a un gen indicador. El efecto de un compuesto de ensayo entonces puede evaluarse ensayando el efecto sobre la transcripción de DSP-3 o el indicador usando, por ejemplo, un análisis de la transferencia Northern o un ensayo de actividad del indicador adecuado.

La actividad DSP-3 también puede medirse en células completas transfectadas con un gen indicador cuya expresión depende de la activación de un sustrato apropiado. Por ejemplo, células apropiadas (es decir, células que expresan DSP-3) pueden transfectarse con un promotor dependiente de sustrato conectado con un gen indicador. En este sistema, la expresión de un gen indicador (que puede detectarse con facilidad utilizando métodos muy conocidos por los expertos en la técnica) depende de la activación del sustrato. La desfosforilación del sustrato puede detectarse basándose en la disminución en la actividad del indicador. Los agentes moduladores candidatos pueden añadirse a dicho sistema, como se describió anteriormente, para evaluar su efecto sobre la actividad DSP-3.

La presente invención también proporciona métodos para identificar una molécula que interacciona con, o se une a DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3). Esta molécula en general se asocia con DSP-3 con una constante de afinidad (K_{a}) de al menos 10^{4}, preferiblemente al menos 10^{5}, más preferiblemente al menos 10^{6}, aún más preferiblemente al menos 10^{7}, y lo más preferible al menos 10^{8}. Las constantes de afinidad pueden determinarse utilizando técnicas muy conocidas. Pueden emplearse métodos para identificar las moléculas de interacción, por ejemplo, como selección inicial para agentes moduladores, o para identificar factores que están implicados en la actividad DSP-3 in vivo. También se contemplan técnicas que atrapan un sustrato, por ejemplo que utilizan variantes de DSP-3 o mutantes que atrapan un sustrato, como se describió anteriormente, según ciertas realizaciones proporcionadas en la presente. Además de los ensayos de unión convencionales, existen muchas otras técnicas que son muy conocidas para identificar moléculas de interacción, incluyendo selecciones de dos híbridos de levaduras, presentación de fagos y técnicas de afinidad. Estas técnicas pueden realizarse utilizando protocolos rutinarios, que son muy conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Bartel et al., en Cellular Interactions in Development: A Practical Approach, D.A. Harley, ed., Oxford University Press (Oxford, RU), pp. 153-179, 1993). En estas y otras técnicas, las proteínas de interacción candidatas (por ejemplo, sustratos de DSP-3 putativos) pueden fosforilarse antes del ensayo para determinar la presencia de proteínas de interacción o unión a DSP-3.

Dentro de otros aspectos, la presente invención proporciona modelos animales en los que un animal no expresa un DSP-3 funcional (o una forma alternativa de DSP-3), o expresa un DSP-3 alterado. Estos animales pueden generarse utilizando estrategias de recombinación homóloga convencionales. Los modelos animales generados de esta manera pueden utilizarse para estudiar las actividades de polipéptidos DSP-3 y agentes moduladores in vivo.

Métodos para desfosforilar un sustrato

En otro aspecto de la presente invención, un polipéptido DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3) puede utilizarse para desfosforilar un sustrato de DSP-3, como se proporciona en la presente. En una realización, un sustrato puede desfosforilarse in vitro mediante la incubación de un polipéptido DSP-3 con un sustrato en un tampón adecuado (por ejemplo, Tris, pH 7,5, EDTA 1 mM, ditiotreitol 1 mM, albúmina de suero bovina 1 mg/ml) durante 10 minutos a 30ºC. Cualquier compuesto que puede ser desfosforilado por DSP-3, tal como una MAP-quinasa, puede utilizarse como sustrato. En general, las cantidades de los componentes de la reacción pueden variar de aproximadamente 50 pg a aproximadamente 50 ng de polipéptido DSP-3, y de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 10 \mug de sustrato. El sustrato desfosforilado puede entonces purificarse, por ejemplo, mediante técnicas de afinidad y/o electroforesis en gel. El grado de desfosforilación del sustrato puede controlarse, en general, añadiendo sustrato marcado con [\gamma^{32}P] a una parte alícuota de ensayo, y evaluando el nivel de desfosforilación de sustrato como se describe en la presente.

Métodos para modular las respuestas celulares

Pueden utilizarse agentes moduladores para modular, modificar o alterar de otra forma (por ejemplo, aumentar o disminuir) respuestas celulares, tales como la proliferación, diferenciación y supervivencia celular, en una diversidad de contextos, in vivo e in vitro. En general, para modular (por ejemplo, aumentar o disminuir de una manera estadísticamente significativa) esta respuesta, una célula se pone en contacto con un agente que modula la actividad DSP-3, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la modulación de la actividad DSP-3. Los agentes que modulan una respuesta celular pueden actuar mediante cualquiera de una diversidad de maneras. Por ejemplo, un agente puede modular un patrón de expresión génica (es decir, puede potenciar o inhibir la expresión de una familia de genes o genes que se expresan de una manera coordinada). Una diversidad de técnicas de hibridación y amplificación están disponibles para evaluar patrones de expresión génica. Como alternativa, o además, un agente puede efectuar la apoptosis o necrosis de la célula y/o puede modular el funcionamiento del ciclo celular dentro de la célula (véase, por ejemplo, Ashkenazi et al., 1998, Science, 281: 1305; Thornberry et al., 1998, Science, 281: 1312; Evan et al., 1998, Science, 281: 1317; Adams et al., 1998, Science, 281: 1322; y las referencias citadas en ellos).

Las células tratadas como se describió anteriormente pueden mostrar características convencionales de células que tienen alteradas las propiedades de proliferación, diferenciación o supervivencia. Además, estas células pueden mostrar (pero no necesariamente) alteraciones en otras propiedades detectables, tales como la inhibición por contacto del crecimiento celular, crecimiento independiente del anclaje o adhesión intercelular alterada. Estas propiedades pueden detectarse con facilidad utilizando técnicas que son familiares para los expertos en la técnica.

Métodos terapéuticos

Uno o más polipéptidos DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3), agentes moduladores y/o polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos y/o agentes moduladores también pueden utilizarse para modular la actividad DSP-3 en un paciente. Tal como se utiliza en la presente, un "paciente" puede ser cualquier mamífero, incluyendo un ser humano, y puede estar afectado por un trastorno asociado con la actividad DSP-3 o puede estar exento de enfermedades detectables. Por consiguiente, el tratamiento puede ser de una enfermedad existente o puede ser profiláctico. Los trastornos asociados con la actividad DSP-3 incluyen cualquier trastorno asociado con la proliferación celular, incluyendo cáncer, enfermedad del injerto frente al receptor (GVHD), enfermedades autoinmunológicas, alergias u otros trastornos en los que puede estar implicada la inmunosupresión, enfermedades metabólicas, crecimiento o proliferación celular anómalos, y anomalías del ciclo celular. Ciertos de estos trastornos implican la pérdida de la actividad MAP-quinasa fosfatasa normal, conduciendo a un crecimiento celular incontrolado. Los polipéptidos DSP-3, y los polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos, pueden utilizarse para mejorar dichos trastornos. Los activadores de DSP-3 también pueden emplearse para tratar ciertos trastornos, incluyendo la distrofia muscular de Duchenne.

Para la administración a un paciente, uno o más polipéptidos, polinucleótidos y/o agentes moduladores se formulan, en general, como una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica puede ser una disolución, suspensión o emulsión estéril acuosa o no acuosa, que comprende además un vehículo fisiológicamente aceptable (es decir, un material no tóxico que no interfiere con la actividad del ingrediente activa). Estas composiciones pueden estar en forma de un sólido, líquido o gas (aerosol). Como alternativa, las composiciones de la presente invención pueden formularse como un liofilizado, o los compuestos pueden encapsularse dentro de liposomas utilizando tecnologías muy conocidas. Las composiciones farmacéuticas dentro del alcance de la presente invención también pueden contener otros componentes, que pueden ser biológicamente activos o inactivos. Estos componentes incluyen, pero no se limitan a tampones (por ejemplo, disolución salina tamponada neutra o disolución salina tamponada con fosfato), carbohidratos (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos, tales como glicina, antioxidantes, agentes quelantes, tales como EDTA o glutatión, estabilizantes, tintes, agentes aromatizantes y agentes suspensores y/o conservantes.

Cualquier vehículo adecuado conocido por los expertos en la técnica puede emplearse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Los vehículos para uso terapéutico son muy conocidos, y se describen, por ejemplo, en Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro ed., 1985). En general, el tipo de vehículo se selecciona basándose en la vía de administración. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para cualquier manera apropiada de administración, incluyendo, por ejemplo, la administración tópica, oral, nasal, intratecal, rectal, vaginal, sublingual o parenteral, incluyendo inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal, intracavernosa, intrameatal o intrauretral. Para la administración parenteral, el vehículo comprende preferiblemente agua, disolución salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para la administración oral, puede emplearse cualquiera de los anteriores vehículos o un vehículo sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, caolín, glicerina, dextrinas de almidón, alginato de sodio, carboximetilcelulosa, etilcelulosa, glucosa, sacarosa y/o carbonato de magnesio.

Una composición farmacéutica (por ejemplo, para la administración oral, o mediante administración por inyección) puede estar en forma de un líquido (por ejemplo, un elixir, jarabe, disolución, emulsión o suspensión). Una composición farmacéutica líquida puede incluir, por ejemplo, uno o más de los siguientes: diluyentes estériles, tales como agua para inyección, disolución salina, preferiblemente disolución salina fisiológica, disolución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites no volátiles, tales como mono- o diglicéridos sintéticos que pueden actuar como disolvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos, tal como alcohol bencílico o metilparabeno; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad, tal como cloruro de sodio o dextrosa. Una preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringuillas desechables o viales de múltiples dosis fabricados con vidrio o plástico. Se prefiere el uso de disolución salina fisiológica, y una composición farmacéutica inyectable es preferiblemente estéril.

Las composiciones descritas en la presente pueden formularse para una liberación sostenida (es decir, una formulación, tal como una cápsula o esponja que lleva a cabo una liberación lenta del compuesto después de la administración). Estas composiciones pueden prepararse, en general, utilizando tecnologías muy conocidas y pueden administrarse, por ejemplo, mediante implante oral, rectal o subcutáneo, o mediante implante en el sitio diana deseado. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener un agente disperso en una matriz vehículo y/o estar contenidas en un depósito rodeado por una membrana que controla la velocidad. Los vehículos para su utilización en estas formulaciones son biocompatibles, y también pueden ser biodegradables; preferiblemente, la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación del componente activo. La cantidad de compuesto activo contenido dentro de una formulación de liberación sostenida depende del sitio de implantación, la velocidad y duración esperada de la liberación, y la naturaleza del trastorno que se va a tratar o prevenir.

Para las composiciones farmacéuticas que comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido DSP-3 y/o un agente modulador (de forma que el polipéptido y/o agente modulador se generan in situ), el polinucleótido puede estar presente dentro de uno cualquiera de una diversidad de sistemas de administración conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo sistemas de expresión bacterianos, víricos y de mamífero, y de ácidos nucleicos. Las técnicas para incorporar ADN en estos sistemas de expresión son muy conocidas por los expertos en la técnica. El ADN también puede estar "desnudo", como se describe, por ejemplo, en Ulmer et al., Science, 259: 1745-1749, 1993, y mencionado en Cohen, Science, 259: 1691-1692, 1003. La captación de ADN desnudo puede aumentar revistiendo el ADN sobre esferas biodegradables, que se transportan con eficacia hacia el interior de las células.

Dentro de una composición farmacéutica, un polipéptido DSP-3 (o una forma alternativa de DSP-3), polinucleótido o agente modulador puede estar unido a uno de una diversidad de compuestos. Por ejemplo, este agente puede estar unido a un resto de transporte dirigido (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o policlonal, una proteína o un liposoma) que facilita el transporte dirigido del agente hasta el sitio diana. Tal como se utiliza en la presente, un "resto de transporte dirigido" puede ser cualquier sustancia (tal como un compuesto o una célula) que, cuando se une a un agente, potencia el transporte del agente hasta una célula o tejido diana, aumentando, con ello, la concentración local del agente. Los restos de transporte dirigido incluyen anticuerpos o fragmentos de éstos, receptores, ligandos y otras moléculas que se unen a células del tejido diana, o a células cerca del tejido diana. Un anticuerpo agente de transporte dirigido puede ser una molécula intacta (completa), un fragmento de ésta, o un equivalente funcional de ésta. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos son fragmentos F(ab')_{2}, -Fab', Fab y F[v], que pueden producirse mediante métodos convencionales, o mediante modificación genética o proteica. La unión es, en general, covalente, y puede lograrse, por ejemplo, mediante condensación directa u otras reacciones, o mediante conectores bi- o multifuncionales. Los restos de transporte dirigido pueden seleccionarse basándose en la(s) célula(s) o tejido(s) en el(los) que cual(es) se espera que el agente ejerza un beneficio terapéutico.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de una manera apropiada a la enfermedad que se va a tratar (o prevenir). Una dosificación apropiada y una duración y frecuencia adecuada de administración vendrán determinadas por factores tales como el estado del paciente, el tipo y gravedad de la enfermedad del paciente, la forma concreta de ingrediente activo y el método de administración. En general, una dosificación y régimen de tratamiento adecuados proporciona el(los) agente(s) en una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico y/o profiláctico (por ejemplo, un mejor resultado clínico, tal como remisiones parciales o completas más frecuentes, o un periodo más largo sin enfermedad y/o supervivencia global). Para un uso profiláctico, una dosis debe ser suficiente para prevenir, retrasar la aparición o disminuir la gravedad de una enfermedad asociada con la proliferación celular.

Las dosificaciones óptimas pueden determinarse, en general, utilizando modelos experimentales y/o ensayos clínicos. En general, la cantidad de polipéptido presente en una dosis, o producida in situ por el ADN presente en una dosis, varía de aproximadamente 0,01 \mug a aproximadamente 100 \mug por kg de hospedante, de forma típica de aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 10 \mug. Se prefiere, habitualmente, el uso de la dosificación mínima que es suficiente para proporcionar una terapia eficaz. Los pacientes pueden controlarse, en general, para determinar la eficacia terapéutica o profiláctica utilizando ensayos adecuados para el trastorno que se está tratando o previniendo, que son familiares para los expertos en la técnica. El tamaño de dosis adecuado variará dependiendo del tamaño del paciente pero, de forma típica, variará de aproximadamente 10 ml a aproximadamente 500 ml por 10-60 kg de animal.

Los siguientes ejemplos se ofrecen como ilustración, y no como limitación.

Ejemplo

Ejemplo 1

Clonación y secuenciación de ADNc que codifica DSP-3

Este ejemplo ilustra la clonación de una molécula de ADNc que codifica DSP-3 humano.

Un motivo de secuencia conservada que rodea el dominio del sitio activo de fosfatasas de especificidad dual se identificó como sigue: las fosfatasas de especificidad dual pertenecen a la familia mayor de proteína tirosina fosfatasas (PTP) que comparten un dominio catalítico conservado que contiene un resto cisteína situado N-terminal con respecto a un tramo de cinco aminoácidos variables, seguido de un resto arginina (Fauman et al., Trends in Bioch. Sci., 21: 413-417, 1996). Las DSP contienen, de forma típica, un motivo de sitio activo PTP, pero carecen de homología de secuencia con PTP en otras regiones (Jia, Biochem. and Cell Biol., 75: 17-26, 1997). Sin embargo, no se han indicado secuencias consenso que se conserven entre las DSP, ni aparece ninguna secuencia consenso aparente tras el examen de secuencias DSP conocidas, tales como las indicadas anteriormente. Para derivar un motivo de secuencia de aminoácidos de DSP consenso más largo que sería útil para la identificación de nuevos miembros de la familia DSP, se alinearon y compararon múltiples secuencias de fosfatasas de especificidad dual humanas conocidas. Un alineamiento de ocho secuencias de aminoácidos derivadas de ocho DSP humanas que tienen actividad MAP-quinasa fosfatasa produjeron una región de homología conservada que consiste en una secuencia peptídica de 23 aminoácidos que contiene el motivo de firma de sitio activo PTP. Por tanto, un péptido candidato que tiene la
secuencia:

GRVLVHCQAGISRSGTNILAYLM

SEQ ID NO: 4

se utilizó para buscar en la base de datos Expressed Sequence Tag (Nat. Center for Biol. Informtion, www.ncbi.nlm.
nih.gov/dbEST). La búsqueda emplea un algoritmo (blastn) capaz de realizar de la traducción inversa del péptido candidato con iteraciones que permiten la degeneración del código genético dentro de parámetros por defecto. Los resultados de la búsqueda identificaron el EST AA374753, así como AA411671 y H82446, como secuencias candidatas de MAP-quinasa fosfatasas. Los EST no incluían una región codificadora completa de un gen expresado, tal como un gen que codifica una DSP-3 que tiene actividad MAP-quinasa fosfatasa, ni se identificaron la cadena sentido ni el marco de lectura abierto.

Para obtener una región codificadora de longitud completa, se seleccionó ADNc de músculo esquelético humano con reacciones RACE 5' y 3' (amplificación rápida de extremos de ADNc) como se describe (Forman et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 8998, 1988; Ohara et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86: 5673, 1989; Loh et al., Science, 243: 217, 1989) utilizando kits RACE 5'/3' (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN; Clontech, Palo Alto, CA; Life Technologies, Gaithersburg, MD) según las instrucciones del fabricante. Se utilizó la información de secuencia inmediatamente adyacente al motivo de secuencia conservada en las reacciones RACE 5' y 3' con ADNc de músculo esquelético humano, utilizando los siguientes cebadores (SEQ ID NO: 5 a 8):

	DSP3-SP1:	5'-GAC CTC ATG CTT CTC AAA CTC CTG-3	SEQ ID NO: 5
	DSP3-SP1.5:	5'-CGA TCA CCA GTG TCA CGC TCC-3'	SEQ ID NO: 6
	DSP3-SP3:	5'-CAG AAT ATG TGT CAC CTT GTT CTT GC-3'	SEQ ID NO: 7
	DSP3-SP5:	5'-GCA AGA ACA AGG TGA CAC ATA TTC TG-3'	SEQ ID NO: 8

Se obtuvo el ADNc de longitud completa que carece sólo de los codones de inicio y fin utilizando los siguientes cebadores (SEQ ID NO: 9-10):

	DSP3-ex5':	5'-GGG AAT GGG ATG AAC AAG ATC CTG CCC G-3'	SEQ ID NO: 9
	DSP3-ex3':	5'-CAGTCTTCTGAGAAAGGCCCAGAACTTCAGAATTCCT-3'	SEQ ID NO: 10

Un ADNc (figura 1; SEQ ID NO: 1) que codifica una proteína de 184 aminoácidos (figura 2; SEQ ID NO: 2) se identificó como DSP-3. Esta secuencia tiene una homología significativa con otras MAP-quinasas fosfatasas (figura 3). El ADNc identificado contiene la región codificadora de 552 pares de bases, así como las secuencias no traducidas 5' y 3'. El dominio del sitio activo para DSP-3 se localizó en la región codificada por los nucleótidos que empieza en la posición 258 de SEQ ID NO: 1.

Se realizaron análisis RT-PCR semicuantitavos. Estos análisis muestran unos niveles mayores de ARNm de DSP-3 en tejido de músculo esquelético.

Ejemplo 2

Expresión de DSP-3 en tejidos humanos

En este ejemplo, se demuestra que una secuencia de ácido nucleico que codifica DSP-3 se híbrida con ARN poliA+ humano procedente de diversas fuentes de tejido. El ADNc que codifica DSP-3 de longitud completa (SEQ ID NO: 1) se marcó con ^{32}P mediante el método de cebadores aleatorios como se describe en Ausubel et al. (1998, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA) para su uso como sonda de hibridación de ácido nucleico. La sonda se híbrido con transferencias que contienen ARN poliA+ humano derivados de múltiples tejidos humanos, se normalizó para la cantidad de ARNm de \beta-actina detectable (figura 4, nº de catálogo 7759-1; Clontech, Inc., Palo Alto, CA). Las transferencias se sometieron a una prehibridación durante 30 minutos a 68ºC en disolución Express Hyb^{TM} (Clontech), y después se hibridaron con la sonda marcada durante 1 hora a 68ºC en disolución Express Hyb^{TM}. Después las transferencias se lavaron durante 40 minutos a temperatura ambiente en 2 x SSC, SDS al 0,05%, seguido de un segundo lavado durante 40 minutos a 50ºC en 0,1 x SSC, SDS al 0,1%. Las transferencias se expusieron a película autorradiográfica Hyperfilm MP^{TM} (Amersham Life Sciences, Arlington Hts, IL) durante la noche. Los resultados aparecen en la figura 4, en la que las fuentes de tejido humano para los ARN son las siguientes: carril 1, corazón; carril 2, cerebro; carril 3, placenta; carril 4, pulmón; carril 5, hígado; carril 6, músculo esquelético; carril 7, riñón; carril 8, páncreas. Se detectó una expresión de DSP-3 particularmente pronunciada en corazón, hígado, músculo esquelético y páncreas humanos, detectándose expresión también en otros
tejidos.

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Ejemplo 3

Identificación de un variante de DSP-3 murino

Este ejemplo describe la identificación de un variante de DSP-3 murino, basado en la secuencia de DSP-3 identificada en el ejemplo 1. La secuencia polinucleotídica que codifica DSP-3 de longitud completa (SEQ ID NO: 1) se sometió a una base de datos de EST murinos como secuencia de búsqueda, utlizando el algoritmo BLAST como se describió anteriormente, y se obtuvieron los siguientes dos EST: AA103595 y AW413206. El alineamiento de estas dos secuencias EST, que muestran un solapamiento de 94 nucleótidos idénticos, produce una secuencia que codifica el variante de DSP-3 murino (SEQ ID NO: 20) que aparece en la figura 5, y permite la determinación de un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de variante de DSP-3 murino de 205 aminoácidos (SEQ ID NO: 21) como se muestra en la figura 6. La secuencia del sitio activo VHCLAGVSRS (SEQ ID NO: 3) está presente en las posiciones de aminoácidos numeradas de 86 a 95 de SEQ ID NO: 21.

Para clonar molecularmente este variante de DSP-3 murino, se amplificó un polinucleótido que contiene la secuencia codificadora de longitud completa a partir de un banco de ADNc murino utilizando condiciones de PCR convencionales y los siguientes cebadores:

	N-muDSP3:	5'-ATGGGGAGTGGGATGAG-3'	SEQ ID NO: 22
	C-muDSP3:	5'-GATGTTATTGATGTGTTGTCTCTGGATT-3'	SEQ ID NO: 23

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Ejemplo 4

Identificación de un variante de corte y empalme de una forma alternativa de DSP-3 humano

La secuencia polinucleotídica que codifica un variante de DSP-3 murino de longitud completa (SEQ ID NO: 20) se volvió a someter a una base de datos de EST humanos como secuencia de búsqueda utilizando el algoritmo BLAST como se describió anteriormente, y se obtuvo EST AK000383. La traducción de este EST en los tres posibles marcos de lectura produjo, en el segundo marco de lectura, un fragmento de secuencia de aminoácidos que era idéntica a los aminoácidos numerados de 65 a 205 en el variante de DSP-3 murino descrito en el ejemplo 3 (SEQ ID NO: 21). El alineamiento de este fragmento de secuencia de aminoácidos de EST AK000383 humana traducida con la secuencia de aminoácidos de DSP-3 humana de SEQ ID NO: 2 reveló una coincidencia de secuencia desde el amino-terminal del marco de lectura abierto de EST traducido, que se corresponde con el número de aminoácido 65 de SEQ ID NO: 2, hasta el resto leucina que se corresponde con el número de posición 169 de SEQ ID NO: 2. Sin embargo, los 15 aminoácidos C-terminales de SEQ ID NO: 2 no estaban presentes en el fragmento EST AK000383 traducido, que, en su lugar, comprendía una secuencia de 36 aminoácidos que era idéntica al C-terminal del variante de DSP-3 murino descrito anteriormente (SEQ ID NO: 21). Por tanto, los aminoácidos en las posiciones 107 a 205 de SEQ ID NO: 21 representan un carboxilo-terminal alternativo de DSP-3 de 36 aminoácidos que puede estar presente, en lugar de los 15 aminoácidos C-terminales de SEQ ID NO: 2, en una forma alternativa de DSP-3 que comprende los aminoácidos 65 a 205 de SEQ ID NO: 21 y que está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende toda o una porción de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 20 o un variante de ésta. Esta forma alternativa de DSP-3 parece ser, según una teoría no limitante, el producto de un acontecimiento de corte y empalme de ARNm
alternativo.

Para clonar molecularmente esta forma alternativa de DSP-3 (SEQ ID NO: 29), un polinucleótido que contiene la secuencia codificadora de longitud completa se amplifica a partir de un banco de ADNc humano utilizando condiciones de PCR convencionales y los siguientes cebadores:

	N-muDSP3:	5'-ATGGGGAGTGGGATGAG-3'	SEQ ID NO: 7
	C-hualtDSP3:	5'-CTATTAATATGCTGCCTCTGGATT-3'	SEQ ID NO: 10

Ejemplo 5

Actividad DSP-3 fosfatasa

Se realizaron ensayos de actividad DSP-3 utilizando un péptido de sitio de autofosforilación del receptor de EGF marcado con ^{32}P fosforilado en tirosina como sustrato, esencialmente como se describe (Flint et al., 1993, EMBO J., 12: 1937-1946; Zhang et al., 1994, Biochem., 33: 2285-2290). Un polinucleótido que comprende la secuencia codificadora de DSP-3 de SEQ ID NO: 25 se clonó en el vector de expresión pGEX (Pharmacia, Piscataway, NJ) y se expresó en E. coli como una proteína de fusión de DSP-3-glutatión-S-transferasa (GST) según las instrucciones del fabricante. También se realizó un aislamiento por afinidad de la proteína de fusión de DSP-3-GST sobre glutatión inmovilizado (Pharmacia) después de una extracción, como recomienda el fabricante. Todos los reactivos eran de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) a menos que se indique lo contrario. Una parte alícuota (20 \mul) de tampón de ensayo enfriado en hielo (imidazol 25 mM (EM Science, Gibbstown, NJ), pH 7,2, EDTA 1 mM, ditiotreitol 2 mM (DTT, Roche Molecular Biochemicals, Indianápolis, IN), ovoalbúmina 0,25 mg/ml (Calbiochem-Novabiochem, La Jolla, CA)) se añadió a pocillos indicados como controles negativos de enzima. Se añadió DSP-3 (SEQ ID NO: 2) diluido en tampón de ensayo enfriado en hielo a partir de una disolución madre de glicerol al 50%, de forma que esta cantidad de enzima utiliza menos de 20% del sustrato en el ensayo, a 20 \mul por pocillo a todos los pocillos excepto a los pocillos de control negativo de enzima. La placa se agitó durante 20 segundos para mezclar los contenidos de cada pocillo y se incubó durante 13 minutos a temperatura ambiente. Para el sustrato, se preparó el sitio de autofosforilación del receptor de EGF que tiene la secuencia de aminoácidos DADE_{P}YL-NH_{2} (SEQ ID NO: 26) como un péptido sustrato marcado con ^{32}P esencialmente como se describe (Zhang et al., 1994, Biochem., 33: 2285; actividad específica, 11 \muCi/nMol), diluido hasta 0,6 \muM de tampón de ensayo, y se añadió a todos los pocillos en partes alícuotas de 20 \mul. La placa de nuevo se agitó y después se incubó durante 13 minutos más, tras lo cual se añadieron 140 \mul de una suspensión de carbón activado (25 mg/ml en NaH_{2}PO_{4} 0,1 M, pH \leq 5) a cada pocillo, los contenidos se mezclaron en vórtice, y la placa entonces se centrífugo a 2400 rpm durante 3 minutos a temperatura ambiente en una centrífuga de mesa (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA). Se trasladaron partes alícuotas (100 \mul) del fluido sobrenadante en cada pocillo a una placa de recuento de beta-centelleo (Wallac, Inc., Gaithersburg, MD) y se cuantificaron las emisiones beta-^{32}P utilizando un contador de placas Wallac Microbeta^{TM} según las instrucciones del fabricante. Después de restar las cuentas de fondo, corregir los valores de control negativo de enzima y normalizar para los pocillos control, se calculó que la actividad específica de DSP-3 para el sustrato de péptido de receptor de EGF era 88,4 nmol/min/mg, con una Km = 1,2 \muM.

A partir de lo anterior, se apreciará que, aunque en la presente se han descrito realizaciones específicas con fines ilustrativos, pueden realizarse diversas modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. Por consiguiente, la presente invención no está limitada excepto por las reivindicaciones adjuntas.

<110> Ceptyr, Inc.

\hskip1cm

Luche, Ralf M.

\hskip1cm

Wei, Bo

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<120> FOSFATASA DE ESPECIFICIDAD DUAL DSP-3

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<130> 200125.40802PC

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<140> PCT

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<141> 2000-06-29

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<160> 26

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 926

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 184

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 2

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2

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<210> 3

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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\sa{Val His Cys Leu Ala Gly Val Ser Arg Ser}

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<210> 4

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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\sa{Gly Arg Val Leu Val His Cys Gln Ala Gly Ile Ser Arg Ser Gly Thr}

\sac{Asn Ile Leu Ala Tyr Leu Met}

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<210> 5

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador utilizado para obtener un ADNc de longitud completa que codifica DSP-3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacctcatgc ttctcaaact cctg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador utilizado para obtener un ADNc de longitud completa que codifica DSP-3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatcaccag tgtcacgctc c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador utilizado para obtener un ADNc de longitud completa que codifica DSP-3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagaatatgt gtcaccttgt tcttgc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador utilizado para obtener un ADNc de longitud completa que codifica DSP-3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaagaacaa ggtgacacat attctg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador utilizado para obtener un ADNc de longitud completa que codifica DSP-3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggaatggga tgaacaagat cctgcccg

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador utilizado para obtener un ADNc de longitud completa que codifica DSP-3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagtcttctg agaaaggccc agaacttcag aattcct

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 687

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 205

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggggagtg ggatgag

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgttattg atgtgttgtc tctggatt

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctattaatat gctgcctctg gatt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 555

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido fosforilado en tirosina derivado del receptor de EGF que se utiliza como sustrato para la actividad fosfatasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> FOSFORILACIÓN

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<222> (5)...(5)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ala Asp Glu Tyr Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (21)

1. Un método para seleccionar un agente que modula la actividad DSP-3, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un agente candidato con un polipéptido DSP-3, comprendiendo dicho polipéptido (1) la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2, o (2) comprendiendo una secuencia de aminoácidos de un variante de polipéptido DSP-3 que se diferencia en una o más deleciones, adiciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos en no más de 25% de los restos de SEQ ID NO: 2, de forma que el polipéptido mantiene la capacidad de desfosforilar una MAP-quinasa activada, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la interacción entre el polipéptido y el agente candidato, en el que el agente candidato es una molécula pequeña;
y

(b) posteriormente evaluar la capacidad del polipéptido para desfosforilar un sustrato de DSP-3, con relación a una capacidad predeterminada del polipéptido para desfosforilar el sustrato de DSP-3 en ausencia del agente candidato;

y a partir de ello identificar un agente que modula la actividad DSP-3.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que el sustrato de DSP-3 es una MAP-quinasa.

3. Un método según la reivindicación 1, en el que el agente candidato está presente en un banco combinatorio.

4. Un método para seleccionar un agente que modula la actividad DSP-3, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un agente candidato con una célula que comprende un polinucleótido capaz de expresar un transcripto de DSP-3 que codifica un polipéptido DSP-3, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la interacción entre el polinucleótido y el agente candidato, en el que el polipéptido DSP-3 comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2, o comprende una secuencia de aminoácidos de un variante de polipéptido DSP-3 que se diferencia en una o más deleciones, adiciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos en no más de 25% de los restos de SEQ ID NO: 2, de forma que el polipéptido mantiene la capacidad de desfosforilar una MAP-quinasa activada; y

(b) posteriormente evaluar la expresión del polinucleótido, con relación a un nivel de expresión predeterminado en ausencia del agente candidato;

y a partir de ello identificar un agente que modula la actividad DSP-3.

5. Un método según la reivindicación 4, en el que la célula comprende además un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína indicadora.

6. Un polipéptido mutante que atrapa un sustrato de DSP-3 que se diferencia de la secuencia indicada en SEQ ID NO: 2, en el que el polipéptido contiene una sustitución en la posición 57 o la posición 88 de SEQ ID NO: 2, en el que el polipéptido mutante que atrapa un sustrato de DSP-3 mantiene la capacidad de unirse a un sustrato de DSP-3, y en el que la capacidad del polipéptido para desfosforilar un sustrato se reduce con relación al polipéptido DSP-3.

7. El polipéptido mutante que atrapa un sustrato según la reivindicación 6, en el que la posición 57 está sustituida con un resto alanina.

8. El polipéptido mutante que atrapa un sustrato según la reivindicación 6, en el que la posición 88 está sustituida con un resto serina.

9. Un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido mutante que atrapa un sustrato según una cualquiera de las reivindicaciones 6-8.

10. Un método para seleccionar una molécula por su capacidad para interaccionar con un polipéptido DSP-3, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una molécula candidata con un polipéptido DSP-3, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que interaccionen la molécula candidata y el polipéptido, comprendiendo dicho polipéptido la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2, o comprendiendo la secuencia de aminoácidos de un variante de polipéptido DSP-3 que se diferencia en una o más deleciones, adiciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos en no más de 25% de los restos de SEQ ID NO: 2, de forma que el polipéptido mantiene la capacidad de desfosforilar una MAP-quinasa activada; y

(b) detectar la presencia o ausencia de unión de la molécula candidata al polipéptido, en el que la etapa de detección comprende una selección de un banco de presentación de fagos y, a partir de ello, determinar si la molécula candidata interacciona con el polipéptido DSP-3.

11. Un método para modular una respuesta proliferativa en una célula in vitro, que comprende modular en dicha célula una actividad MAP-quinasa desfosforilante de un polipéptido DSP-3, comprendiendo dicho polipéptido (a) la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2, o (b) la secuencia de aminoácidos de un variante de polipéptido DSP-3 que se diferencia en una o más deleciones, adiciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos en no más de 25% de los restos de SEQ ID NO: 2, de forma que el polipéptido mantiene la capacidad de desfosforilar una MAP-quinasa activada.

12. Un método para modular la diferenciación celular de una célula in vitro, que comprende modular en dicha célula una actividad MAP-quinasa desfosforilante de un polipéptido DSP-3, comprendiendo dicho polipéptido (a) la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2, o (b) la secuencia de aminoácidos de un variante de polipéptido DSP-3 que se diferencia en una o más deleciones, adiciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos en no más de 25% de los restos de SEQ ID NO: 2, de forma que el polipéptido mantiene la capacidad de desfosforilar una MAP-quinasa activada.

13. Un método para modular la supervivencia de una célula in vitro, que comprende modular en dicha célula una actividad MAP-quinasa desfosforilante de un polipéptido DSP-3, comprendiendo dicho polipéptido (a) la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2, o (b) la secuencia de aminoácidos de un variante de polipéptido DSP-3 que se diferencia en una o más deleciones, adiciones, inserciones o sustituciones de aminoácidos en no más de 25% de los restos de SEQ ID NO: 2, de forma que el polipéptido mantiene la capacidad de desfosforilar una MAP-quinasa activada.

14. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que la etapa de modulación modula un patrón de expresión génica.

15. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que la célula muestra inhibición por contacto del crecimiento celular.

16. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que la célula muestra un crecimiento independiente del anclaje.

17. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que la célula muestra una propiedad de adhesión intercelular alterada.

18. Un método según la reivindicación 13, en el que se modula la apoptosis.

19. Un método según la reivindicación 13, en el que se modula un ciclo celular de la célula.

20. Un método para seleccionar una molécula por su capacidad para interaccionar con un polipéptido DSP-3, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una molécula candidata con un mutante que atrapa un sustrato de DSP-3 según una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que la molécula candidata y el mutante que atrapa un sustrato de DSP-3 interaccionen; y

(b) detectar la presencia o ausencia de unión de la molécula candidata con el mutante que atrapa un sustrato de DSP-3 y, a partir de ello, determinar si la molécula candidata interacciona con el polipéptido DSP-3.

21. Un método para seleccionar una molécula por su capacidad para interaccionar con un polipéptido DSP-3, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una molécula candidata con un mutante que atrapa un sustrato de DSP-3 según la reivindicación 30, bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que la molécula candidata y el mutante que atrapa un sustrato de DSP-3 interaccionen; y

(b) detectar la presencia o ausencia de unión de la molécula candidata con el mutante que atrapa un sustrato de DSP-3 y, a partir de ello, determinar si la molécula candidata interacciona con el polipéptido DSP-3.