DE60032145T2

DE60032145T2 - Dsp-3, eine phosphatase mit zwei spezifizitäten

Info

Publication number: DE60032145T2
Application number: DE60032145T
Authority: DE
Inventors: M. Ralf Seattle LUCHE; Bo Snohomish WEI
Original assignee: Ceptyr Inc
Current assignee: Ceptyr Inc
Priority date: 1999-07-02
Filing date: 2000-06-29
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2020-06-30
Also published as: JP2003525027A; WO2001002581A1; EP1772517A3; ES2277843T3; AU4367600A; EP1196598A1; DE60032145D1; EP1196598B1; DK1196598T3; ATE346939T1; AU5783800A; EP1772517A2; CA2377670A1; WO2001002582A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Zusammensetzungen und Verfahren, die für die Behandlung von Zuständen verwendbar sind, die mit Defekten in der Zellproliferation, Zelldifferenzierung und/oder dem Zellüberleben im Zusammenhang stehen. Die Erfindung betrifft besonders Proteinphosphatasen mit dualer Spezifität und Polypeptidvarianten davon. Die vorliegende Erfindung betrifft ganz besonders die Verwendung solcher Polypeptide zum Identifizieren von Antikörpern und anderen Mitteln, einschließlich kleiner Moleküle, die die Signaltransduktion, die zur Proliferationsreaktion, Zelldifferenzierung und/oder dem Zellüberleben führt, moduliert.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Mitogen aktivierte Proteinkinasen (MAP-Kinasen) liegen als Bestandteile von konservierten zellulären Signaltransduktionswegen vor, die eine Vielfalt von konservierten Mitgliedern aufweisen. MAP-Kinasen werden durch Phosphorylierung an einem dualen Phosphorylierungsmotiv mit der Sequenz Thr-X-Tyr (durch MAP-Kinase-Kinasen) aktiviert, in denen die Phosphorylierung an den Tyrosin- und Threonin-Resten für die Aktivität erforderlich ist. Aktivierte MAP-Kinasen phosphorylieren mehrere Transduktionsziele, einschließlich Transkriptionsfaktoren. Die Inaktivierung von MAP-Kinasen wird durch Dephosphorylierung an dieser Stelle durch Phosphatasen mit dualer Spezifität, die als MAP-Kinase-Phosphatasen bezeichnet werden, vermittelt. In höheren Eukaryoten ist die physiologische Rolle der MAP-Kinase Signalgebung mit zellulären Ereignissen, wie zum Beispiel der Proliferation, der Onkogenese, der Entwicklung und Differenzierung in Zusammenhang gebracht worden. Demgemäß könnte die Fähigkeit zur Regulation der Signaltransduktion über diese Wege zur Entwicklung von Behandlungen und präventiven Therapien für menschliche Erkrankungen führen, die mit der MAP-Kinasesignalgebung, wie zum Beispiel Krebs, in Zusammenhang stehen.
Protein-Tyrosin-Phosphatasen mit dualer Spezifität (Phosphatasen mit dualer Spezifität) sind Phosphatasen, die sowohl Phosphotyrosin- als auch Phosphothreonin/serin-Reste dephosphorylieren (Walton et al., Ann. Rev. Biochem. 62: 101-120, 1993). Verschiedene Phosphatasen dualer Spezifität, die eine MAP-Kinase inaktivieren, sind identifiziert worden, einschließlich MKP-1 (WO 97/00315; Keyse und Emslie, Nature 59: 644-647, 1992), MKP-4, MKP-5, MKP-7, Hb5 (WO 97/06245), PAC1 (Ward et al., Nature 367: 651-654, 1994), HVH2 (Guan und Butch, J. Biol. Chem. 270: 7197-7203, 1995) und PYST1 (Groom et al., EMBO J. 15: 3621-3632, 1996). Die Expression bestimmter Phosphatasen mit dualer Spezifität wird durch Stress oder Mitogene induziert, jedoch scheinen andere in spezifischen Zelltypen konstitutiv exprimiert zu werden. Die Regulation der Expression und Aktivität einer Phosphatase mit dualer Spezifität ist für die Kontrolle von MAP-Kinase vermittelten zellulären Funktionen, die die Zellproliferation, Zelldifferenzierung oder das Zellüberleben einschließen, entscheidend. Zum Beispiel können Phosphatasen mit dualer Spezifität als negative Regulatoren der Zellproliferation wirken. Es ist sehr wahrscheinlich, dass es viele solcher Phosphatasen mit dualer Spezifität mit variierender Spezifität in Bezug auf den Zelltyp oder die Aktivierung gibt. Jedoch bleibt das Verständnis der Regulation der Phosphatasen mit dualer Spezifität schlecht und nur eine relativ kleine Anzahl von Phosphatasen mit dualer Spezifität ist identifiziert worden.
Demgemäß gibt es einen Bedarf im Stand der Technik für ein besseres Verständnis der MAP-Kinase-Signalgebung und der Regulation von Phosphatasen mit dualer Spezifität innerhalb der MAP-Kinase-Signalgebungskaskaden. Ein besseres Verständnis der Regulation der Phosphatasen mit dualer Spezifität könnte die Entwicklung von Verfahren zum Modulieren der Aktivität von Proteinen, die an den MAP-Kinase-Kaskadan beteiligt sind, und für die Behandlung von Zuständen, die mit solchen Kaskaden im Zusammenhang stehen, erleichtern. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Wünsche und stellt darüber hinaus andere ähnliche Vorteile bereit. Kurz gesagt, die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zum Identifizieren von Mitteln bereit, die die zellulären Proliferationsreaktionen modulieren können.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Durchmustern für ein Mittel bereitgestellt, das eine DSP-3-Aktivität moduliert, umfassend die Schritte:

(a) In-Kontak-bringen eines Kandidaten für ein Mittel mit einem DSP-3-Polypeptid, wobei das Polypeptid entweder (1) die in SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz umfasst oder (2) die Aminosäuresequenz einer Variante des DSP-3-Polypeptids umfasst, die sich in einer oder mehreren Aminosäuredeletionen, -additionen, -insertionen oder -substitutionen an nicht mehr als 25% der Reste in SEQ ID NO: 2 unterscheidet, so dass das Polypeptid die Fähigkeit beibehält, eine aktivierte MAP-Kinase zu dephosphorylieren, unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die ausreichen, um eine Wechselwirkung zwischen dem Polypeptid und dem Kandidaten für ein Mittel zu gestatten, wobei der Kandidat für ein Mittel ein kleines Molekül ist; und
(b) anschließendes Auswerten der Fähigkeit des Polypeptids, ein DSP-3-Substrat zu dephosphorylieren, relativ zu einer vorher bestimmten Fähigkeit des Polypeptids, das DSP-3-Substrat in Abwesenheit eines Kandidaten für ein Mittel zu dephosphorylieren;

In einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Durchmustern auf ein Mittel, dass eine DSP-3-Aktivität moduliert, bereitgestellt, umfassend die Schritte:

(a) In-Kontakt-bringen eines Kandidaten für ein Mittel mit einer Zelle, die ein Polynukleotid umfasst, das fähig ist, ein DSP-3-Transkript zu exprimieren, das ein DSP-3-Polypeptid kodiert, unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die ausreichen, um eine Wechselwirkung zwischen dem Polynukleotid und dem Kandidaten für ein Mittel zu gestatten, wobei das DSP-3-Polypeptid, die in SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz umfasst oder die Aminosäuresequenz einer Variante des DSP-3-Polypeptids umfasst, die sich in einer oder mehreren Aminosäuredeletionen, -additionen, -insertionen oder -substitutionen an nicht mehr als 25% der Reste in SEQ ID NO: 2 unterscheidet, so dass das Polypeptid die Fähigkeit beibehält, eine aktivierte MAP-Kinase zu dephosphorylieren; und
(b) anschließendes Auswerten der Expression des Polynukleotids relativ zu einem vorher bestimmten Expressionsniveau in Abwesenheit des Kandidaten für ein Mittel;

In einem dritten Aspekt wird ein DSP-3-Substrat-Trapping mutantes Polypeptid bereitgestellt, das sich von der in SEQ ID NO: 2 angeführten Sequenz unterscheidet, wobei das Polypeptid eine Substitution an Position 57 oder Position 88 von SEQ ID NO: 2 enthält, wobei das für DSP-3-Substrat-Trapping mutante Polypeptid die Fähigkeit beibehält, ein DSP-3-Substrat zu binden, und wobei die Fähigkeit des Polypeptids, ein Substrat zu dephosphorylieren, relativ zu dem DSP-3-Polypeptid reduziert ist.
In einem fünften Aspekt wird ein Verfahren zum Durchmustern eines Moleküls auf die Fähigkeit bereitgestellt, mit einem DSP-3-Polypeptid in Wechselwirkung zu treten, umfassend die Schritte:

(a) In-Kontakt-bringen eines Kandidatenmoleküls mit einem DSP-3-Polypeptid unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die ausreichen, um dem Kandidatenmolekül und dem Polypeptid zu gestatten, in Wechselwirkung zu treten, wobei das Polypeptid die in SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz umfasst oder die Aminosäuresequenz einer Variante des DSP-3-Polypeptids umfasst, die sich in eine oder mehreren Aminosäuredeletionen, -additionen, -insertionen oder -substitutionen an nicht mehr als 25% der Reste in SEQ ID NO: 2 unterscheidet, so dass das Polypeptid die Fähigkeit beibehält, eine aktivierte MAP-Kinase zu dephosphorylieren; und
(b) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit des Bindens des Kandidatenmoleküls an das Polypeptid, wobei der Schritt des Nachweisens eine Durchmusterung einer Phagen-Display-Bank umfasst, und daraus Bestimmen, ob das Kandidatenmolekül mit dem DSP-3-Polypeptid in Wechselwirkung tritt.

In einem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Modulieren einer proliferativen Antwort in einer Zelle in vitro bereitgestellt, das das Modulieren einer die MAP-Kinase dephosphorylierenden Aktivität eines DSP-3-Polypeptids in der Zelle, wobei das Polypeptid (a) die in SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz umfasst oder (b) die Aminosäuresequenz einer Variante des DSP-3-Polypeptids umfasst, die sich in einer oder mehreren Aminosäuredeletionen, -additionen, -insertionen oder -substitutionen an nicht mehr als 25% der Reste in SEQ ID NO: 2 unterscheidet, so dass das Polypeptid die Fähigkeit beibehält, eine aktivierte MAP-Kinase zu dephosphorylieren, umfasst.
In einem siebten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Modulieren der Differenzierung einer Zelle in vitro bereitgestellt, das das Modulieren einer die MAP-Kinase dephosphorylierenden Aktivität eines DSP-3-Polypeptids in der Zelle, wobei das Polypeptid (a) die in SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz umfasst oder (b) die Aminosäuresequenz einer Variante des DSP-3-Polypeptids umfasst, die sich in einer oder mehreren Aminosäuredeletionen, -additionen, -insertionen oder -substitutionen an nicht mehr als 25% der Reste in SEQ ID NO: 2 unterscheidet, so dass das Polypeptid die Fähigkeit beibehält, eine aktivierte MAP-Kinase zu dephosphorylieren, umfasst.
In einem achten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Modulieren des Überlebens einer Zelle in vitro bereitgestellt, das das Modulieren einer die MAP-Kinase dephosphorylierenden Aktivität eines DSP-3-Polypeptids in der Zelle, wobei das Polypeptid (a) die in SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz umfasst oder (b) die Aminosäuresequenz einer Variante des DSP-3-Polypeptids umfasst, die sich in einer oder mehreren Aminosäuredeletionen, -additionen, -insertionen oder -Substitutionen an nicht mehr als 25% der Reste in SEQ ID NO: 2 unterscheidet, so dass das Polypeptid die Fähigkeit beibehält, eine aktivierte MAP-Kinase zu dephosphorylieren, umfasst.
In einem neunten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Durchmustern eines Moleküls auf die Fähigkeit bereitgestellt, mit einem DSP-3-Polypeptid in Wechselwirkung zu treten, umfassend die Schritte:

(a) In-Kontakt-bringen eines Kandidatenmoleküls mit einer DSP-3-Substrat-Trapping Mutante gemäß einem der Ansprüche 6-8, unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die ausreichen, um den Kandidatenmolekül und der DSP-3-Substrat-Trapping Mutante zu gestatten, in Wechselwirkung zu treten; und
(b) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit des Bindens des Kandidatenmoleküls an die DSP-3-Substrat-Trapping Mutante und daraus Bestimmen, ob das Kandidatenmolekül mit dem DSP-3-Polypeptid in Wechselwirkung tritt.

Ebenfalls offenbart werden isolierte DSP-3-Polypeptide mit der Sequenz von DSP-3, wie sie in SEQ ID NO: 2 wiedergegeben wird, oder einer Variante davon, die sich in einer oder mehreren Aminosäuredeletionen, -additionen, -insertionen oder -substitutionen an nicht mehr als 50% der Reste in SEQ ID NO: 2 unterscheidet, so dass das Polypeptid die Fähigkeit beibehält, eine aktivierte MAP-Kinase zu dephosphorylieren.
Innerhalb weiterer Aspekte stellt die vorliegende Offenbarung ein isoliertes Polynukleotid bereit, das für mindestens 10 aufeinanderfolgende Aminosäuren eines Polypeptids mit einer Sequenz entsprechend der SEQ ID NO: 2 kodiert. In bestimmten Ausführungsformen stellt die Offenbarung ein isoliertes Polynukleotid bereit, das für mindestens 15 aufeinanderfolgende Aminosäuren eines Polypeptids mit einer Sequenz entsprechend der SEQ ID NO: 2 kodiert. Bestimmte derartige Polynukleotide kodieren für ein DSP-3-Polypeptid. Noch weitere Polynukleotide können Antisense-Polynukleotide sein, die mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide umfassen, die zu einem Abschnitt eines DSP-3-Polynukleotides komplementär sind und/oder die mit dem Kompliment der Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 angeführt wird, unter Bedingungen hybridisiert, die das Waschen in 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 50°C für 15 Minuten einschließt. Es werden ebenfalls Expressionsvektoren bereitgestellt, die irgendeines der zuvor genannten Polynukleotide umfassen, und Wirtszellen, die mit solchen Expressionsvektoren transformiert oder transfiziert wurden.
Die vorliegende Offenbarung stellt in anderen Aspekten weiter Verfahren zum Herstellen eines DSP-3-Polynukleotids bereit, die die Schritte umfassen: (a) Kultivieren einer Wirtszelle, wie weiter oben beschrieben, unter Bedingungen, die eine Expression des DSP-3-Polypeptides ermöglichen; und (b) Isolieren eines DSP-3-Polypeptides aus der Wirtszellenkultur.
Durch die vorliegende Offenbarung werden ebenfalls isolierte Antikörper und Antigen bindende Fragmente davon bereitgestellt, die spezifisch mit einem DSP-3-Polypeptid binden, wie zum Beispiel einem Polypeptid mit der Sequenz der SEQ ID NO: 2.
Die vorliegende Offenbarung stellt in anderen Aspekten weiter pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die ein Polypeptid, Polynukleotid, Antikörper oder ein Fragment davon, wie weiter oben beschrieben, in Kombination mit einem physiologisch annehmbaren Träger umfassen.
Innerhalb weiterer Aspekte stellt die vorliegende Offenbarung Verfahren zum Detektieren der DSP-3-Expression in einer Probe bereit, die umfassen: (a) In-Kontak-bringen einer Probe mit einem Antikörper oder einem Antigen bindenden Fragment davon, wie weiter oben beschrieben, unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die ausreichen, um die Bildung eines Antikörper/DSP-3-Komplexes zu ermöglichen; und (b) Detektieren des Niveaus des Antikörper/DSP-3-Komplexes.
Innerhalb noch anderer Aspekte stellt die vorliegende Offenbarung Verfahren zum Detektieren der DSP-3-Expression in einer Probe bereit, die umfassen: (a) In-Kontak-bringen einer Probe mit einem Antisense-Polynukleotid, wie weiter oben beschrieben; und (b) Nachweisen einer Menge des DSP-3-Polynukleotides in der Probe, das mit dem Antisense-Polynukleotid hybridisiert. Die Menge des DSP-3-Polynukleotides, die mit dem Antisense-Polynukleotid hybridisiert, kann zum Beispiel durch Verwenden einer Polymerasekettenreaktion oder eines Hybridisierungsassays bestimmt werden.
Die Offenbarung stellt auch DSP-3-Polypeptide bereit, die in Durchmusterungsassays für Modulatoren der Enzymaktivität und/oder der Substratbindung verwendbar sind. Es werden in anderen Aspekten auch Verfahren zum Durchmustern auf ein Mittel bereitgestellt, das die DSP-3-Aktivität moduliert, das die Schritte umfasst: (a) In-Kontak-bringen eines Kandidaten für ein Mittel mit einem DSP-3-Polypeptid, wie weiter oben beschrieben, unter Bedingungen und für einen Zeitraum, der für eine Wechselwirkung zwischen dem Polypeptid und dem Kandidaten für ein Mittel ausreicht; und (b) nachfolgendes Auswerten der Fähigkeit des Polypeptids ein DSP-3-Substrat zu dephosphorylieren, relativ zu einer vorher bestimmten Fähigkeit des Polypeptids, das DSP-3-Substrat in Abwesenheit eines Kandidaten für ein Mittel zu dephosphorylieren. Solche Verfahren können in vitro oder in einer zellulären Umgebung (z.B. innerhalb einer intakten Zelle) durchgeführt werden.
In weiteren Aspekten werden Verfahren zum Durchmustern für ein Mittel offenbart, das die DSP-3-Aktivität moduliert, das die Schritte umfasst: (a) In-Kontak-bringen eines Kandidaten für ein Mittel mit einer Zelle, die einen DSP-3-Promotor umfasst, der mit einem Polynukleotid operativ verknüpft ist, das für ein nachweisbares Transkript oder Protein kodiert, unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die ausreichen, um eine Wechselwirkung zwischen dem Promotor und dem Kandidaten für ein Mittel zu gestatten; und (b) anschließendes Auswerten der Expression des Polynukleotides relativ zu einem vorher bestimmten Expressionsniveau in Abwesenheit des Kandidaten für ein Mittel.
Ebenfalls bereitgestellt werden Verfahren zum Modulieren einer proliferativen Reaktion in einer Zelle, die das in-Kontakt-bringen einer Zelle mit einem Mittel umfassen, das die DSP-3-Aktivität moduliert.
In weiteren Aspekten werden Verfahren zum Modulieren der Differenzierung einer Zelle bereitgestellt, die das in-Kontakt-bringen einer Zelle mit einem Mittel umfassen, das die DSP-3-Aktivität moduliert.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Modulieren des Überlebens der Zelle bereit, die das in-Kontakt-bringen einer Zelle mit einem Mittel umfassen, das die DSP-3-Aktivität moduliert.
In ähnlichen Aspekten stellt die vorliegende Offenbarung Verfahren zum Behandeln eines Patienten bereit, der an einer Erkrankung leidet, die mit der DSP-3-Aktität im Zusammenhang steht (oder durch Verabreichung von DSP-3 behandelbar ist), die das Verabreichen einer therapeutisch wirksame Menge eines Mittels, das die DSP-3-Aktivität moduliert, umfasst. Solche Erkrankungen schließen die Duchenne-Muskeldystrophy als auch Krebs, Transplantat-Wirt-Reaktion, Autoimmunerkrankungen, Allergien, metabolische Erkrankungen, abnormales Zellwachstum, abnormale Zellproliferation und Zellzyklusabnormalitäten ein.
In weiteren Aspekten werden DSP-3-Substrat-Trapping mutante Polypeptide bereitgestellt. Solche Polypeptide unterscheiden sich von der in SEQ ID NO: 2 wiedergegebenen Sequenz in einer oder mehreren Aminosäuredeletionen, -additionen, -insertionen oder -substitutionen an nicht mehr als 50% der Reste von SEQ ID NO: 2, so dass das Polypeptid an ein Substrat mit einer Affinität bindet, die relativ zum DSP-3 nicht verringert ist, und so, dass die Fähigkeit des Polypeptids ein Substrat zu dephosphorylieren relativ zu DSP-3 verringert ist. In bestimmten spezifischen Ausführungsformen enthält ein Substrat-Trapping mutantes Polypeptid eine Substitution in Position 57 oder Position 88 der SEQ ID NO: 2.
Die vorliegende Erfindung stellt in anderen Aspekten weiter Verfahren zum Durchmustern eines Moleküls auf die Fähigkeit bereit, mit einem DSP-3-Polypeptid in Wechselwirkung zu treten, das die Schritte umfasst: (a) In-Kontak-bringen eines Kandidatenmoleküls mit einem Polypeptid, wie weiter oben beschrieben, unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die ausreichen, um eine Wechselwirkung zwischen dem Polypeptid und dem Kandidatenmolekül zu gestatten; und (b) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Bindung des Kandidatenmoleküls mit dem Polypeptid. Der Schritt des Nachweisens kann zum Beispiel einen Affinitätsreinigungsschritt, einen Hefe Two-Hybrid-Screen oder das Durchmustern einer Phagen-Display-Bank umfassen.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Offenbarung isolierte DSP-3-Polypeptide bereit, die die Sequenz der DSP-3 alternativen Form, die in SEQ ID NO: 21 wiedergegeben wird, oder einer Variante davon, die sich in einer oder mehreren Aminosäuredeletionen, -additionen, -insertionen oder -substitutionen an nicht mehr als 50% der Reste in SEQ ID NO: 21 unterscheidet, so dass das Polypeptid die Fähigkeit zum dephosphorylieren einer aktivierten MAP-Kinase beibehält, umfassen.
In weiteren Aspekten stellt die vorliegende Offenbarung ein isoliertes Polynukleotid bereit, das für mindestens 10 aufeinanderfolgende Aminosäuren eines Polypeptides mit einer Sequenz entsprechend SEQ ID NO: 21 kodiert. In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung ein isoliertes Polynukleotid bereit, das für mindestens fünfzehn aufeinanderfolgende Aminosäuren eines Polypeptids mit einer Sequenz entsprechend der SEQ ID NO: 21 kodiert. Bestimmte solche Polynukleotide kodieren für eine alternative Form des DSP-3-Polypeptids. Noch weiter können Polynukleotide Antisense-Polynukleotide sein, die mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide umfassen, die zu einem Abschnitt einer alternativen Form des DSP-3-Polynukleotides komplementär sind und/oder die mit dem Komplement der in SEQ ID NO: 20 wiedergegebenen Sequenz unter Bedingungen nachweisbar hybridisieren, die das Waschen in 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 60°C für 15 Minuten einschließen. Es werden auch Expressionsvektoren bereitgestellt, die irgendeines der zuvor genannten Polynukleotide umfassen, und Wirtszellen, die mit solchen Expressionsvektoren transformiert oder transfiziert wurden.
Die vorliegende Offenbarung stellt in anderen Aspekten weiter Verfahren zum Herstellen einer alternativen Form des DSP-3-Polypeptids bereit, dass die Schritte umfasst: (a) Kultivieren einer Wirtzelle, wie weiter oben beschrieben, unter Bedingungen, die die Expression der alternativen Form des DSP-3-Polypeptids gestattet; und (b) Isolieren der alternativen Form des DSP-3-Polypeptids aus der Wirtszellenkultur.
Es werden durch die vorliegende Offenbarung auch isolierte Antikörper und Antigen bindende Fragmente davon bereitgestellt, die spezifisch mit der alternativen Form des DSP-3-Polypeptids binden, wie zum Beispiel ein Polypeptid mit der Sequenz der SEQ ID NO: 21.
Die vorliegende Offenbarung stellt in anderen Aspekten weiter pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die ein Polypeptid, Polynukleotid, Antikörper oder Fragment davon, wie weiter oben beschrieben, in Kombination mit einem physiologisch annehmbaren Träger umfassen.
In weiteren Aspekten stellt die vorliegende Offenbarung Verfahren zum Nachweisen der Expression der alternativen Form des DSP-3 in einer Probe bereit, die umfassen: (a) In-Kontakt-bringen einer Probe mit einem Antikörper oder einem Antigen bindenden Fragment davon, wie weiter oben beschrieben, unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die ausreichen, um die Bildung eines Antikörper/alternative Form des DSP-3-Komplex zu gestatten; und (b) Nachweisen des Niveaus des Antikörper/alternative Form des DSP-3-Komplexes.
In noch anderen Aspekten stellt die vorliegende Offenbarung Verfahren zum Nachweisen der Expression der alternativen Form des DSP-3 in einer Probe bereit, die umfassen: (a) In-Kontakt-bringen einer Probe mit einem Antisense-Polynukleotid, wie weiter oben beschrieben; und (b) Nachweisen einer Menge der alternativen Form des DSP-3-Polynukleotids, das mit dem Antisense-Polynukleotid hybridisiert in der Probe. Die Menge der alternativen Form des DSP-3-Polynukleotides, die mit dem Antisense-Polynukleotid hybridisiert, kann zum Beispiel durch Verwenden der Polymerasekettenreaktion oder eines Hybridisierungsassays bestimmt werden.
Die Offenbarung stellt auch alternative Formen der DSP-3-Polypeptide bereit, die in Durchmusterungsassays auf Modulatoren der Enzymaktivität und/oder der Substratbindung verwendbar sind. Es werden auch Verfahren bereitgestellt, innerhalb anderer Aspekte, zum Durchmustern auf ein Mittel, das die Aktivität der alternativen Form des DSP-3 moduliert, das die Schritte umfasst: (a) In-Kontakt-bringen eines Kandidaten für ein Mittel mit einem Polypeptid, wie weiter oben beschrieben, unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die ausreichen, um eine Wechselwirkung zwischen dem Polypeptid und dem Kandidaten für ein Mittel zu gestatten; und (b) anschließendes Auswerten der Fähigkeit des Polypeptids ein Substrat der alternativen Form des DSP-3 zu dephosphorylieren, relativ zu einer vorher bestimmten Fähigkeit des Polypeptids, das Substrat der alternativen Form des DSP-3 in Abwesenheit des Kandidaten für ein Mittel zu dephosphorylieren. Solche Verfahren können in vitro oder in einer zellulären Umgebung (z.B. innerhalb einer intakten Zelle) durchgeführt werden.
In weiteren Aspekten werden Verfahren zum Durchmustern auf ein Mittel offenbart, das die Aktivität der alternativen Form des DSP-3 moduliert, die die Schritte umfassen: (a) In-Kontakt-bringen eines Kandidaten für ein Mittel mit einer Zelle, die einen Promotor der alternativen Form des DSP-3 umfasst, der mit einem Polynukleotid operativ verknüpft ist, das für ein nachweisbares Transkript oder Protein kodiert, unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die ausreichen, um eine Wechselwirkung zwischen dem Promotor und dem Kandidaten für ein Mittel zu gestatten; und (b) anschließendes Auswerten der Expression des Polynukleotids, relativ zu einem vorher bestimmten Expressionsniveau in Abwesenheit des Kandidaten für ein Mittel.
Ebenfalls offenbart sind Verfahren zum Modulieren einer proliferativen Reaktion in einer Zelle, die das in-Kontakt-bringen einer Zelle mit einem Mittel umfassen, das die Aktivität der alternativen Form des DSP-3 moduliert.
In weiteren Aspekten werden Verfahren zum Modulieren der Differenzierung einer Zelle offenbart, die das in-Kontakt-bringen einer Zelle mit einem Mittel umfassen, das die Aktivität der alternativen Form des DSP-3 moduliert.
Die vorliegende Offenbarung stellt weiter Verfahren zum Modulieren des Zellüberlebens bereit, die das in-Kontakt-bringen einer Zelle mit einem Mittel umfassen, das die Aktivität der alternativen Form des DSP-3 moduliert.
In ähnlichen Aspekte stellt die vorliegende Offenbarung Verfahren zum Behandeln eines Patienten bereit, der unter einer Erkrankung leidet, die mit der Aktivität der alternativen Form des DSP-3 im Zusammenhang steht (oder die durch die Verabreichung einer alternativen Form des DSP-3 behandelbar ist), die das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Mittels an einen Patienten umfasst, das die Aktivität der alternativen Form des DSP-3 moduliert. Solche Erkrankungen schließen Krebs, Transplantat-Wirt-Reaktion, Autoimmunerkrankungen, Allergien, metabolische Erkrankungen, abnormales Zellwachstum, abnormale Zellproliferation und Zellzyklusabnormalitäten ein.
Innerhalb weiterer Aspekte werden alternative Formen der DSP-3-Substrat-Trapping mutanten Polypeptide bereitgestellt.
Solche Polypeptide unterscheiden sich von der Sequenz, die in SEQ ID NO: 21 wiedergegeben wird, in einer oder mehreren Aminosäuredeletionen, -additionen, -insertionen oder -substitutionen an nicht mehr als 50% der Reste in SEQ ID NO: 21, so dass das Polypeptid an einem Substrat bindet, das eine Affinität aufweist, die relativ zu einer alternativen Form des DSP-3 nicht wesentlich verringert ist, und so, dass die Fähigkeit des Polypeptids ein Substrat zu dephosphorylieren, relativ zur alternativen Form des DSP-3 verringert ist. In spezifischen, bestimmten Ausführungsformen enthält ein Substrat-Trapping mutantes Polypeptid eine Substitution in der Position 57 oder der Position 88 der SEQ ID NO: 21.
Die vorliegende Offenbarung stellt in anderen Aspekten weiter Verfahren zum Durchmustern eines Moleküls auf die Fähigkeit mit einer alternativen Form des DSP-3 in Wechselwirkung zu treten, die die Schritte umfassen: (a) In-Kontakt-bringen eines Kandidaten für ein Mittel mit einer alternativen Form des DSP-3-Polypeptids oder einer Variante davon, wie weiter oben beschrieben, unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die ausreichen, das der Kandidat für ein Mittel und ein Polypeptid wechselwirken können; und (b) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit der Bindung des Kandidaten für ein Mittel mit dem Polypeptid. Der Nachweisschritt kann zum Beispiel einen Affinitätsreinigungsschritt, ein Hefe Two-Hybrid-Screen oder die Durchmusterung einer Phagen-Display-Bank umfassen.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die beigefügten Figuren deutlich werden. Alle hierin offenbarten Dokumente werden hierin in ihrer Gänze aufgenommen, als ob jedes von ihnen individuell aufgenommen worden wäre.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 stellt eine cDNA-Sequenz des DSP-3 (SEQ ID NO: 1) dar, wobei die Start- und Stopp-Codons fettgedruckt dargestellt werden.
2 stellt die vorhergesagte Aminosäuresequenz von DSP-3 (SEQ ID NO: 2) dar.
3 ist eine Sequenzausrichtung, die die Sequenzähnlichkeit zwischen DSP-3 und anderen MAP-Kinase-Phosphatasen darstellt.
4 zeigt eine Northern-Block-Hybridisierung unter Verwendung einer mit ³²P markierten für DSP-3 kodierenden volllängen Nukleinsäuresequenz als Sonde. Der Blot enthielt humane PolyA+ RNA aus verschiedenen, folgenden Gewebetypen: Spur 1, Herz; Spur 2, Gehirn; Spur 3, Plazenta; Spur 4, Lunge; Spur 5, Leber; Spur 6, Skelettmuskel; Spur 7, Niere; Spur 8, Pankreas.
5 zeigt eine cDNA-Sequenz für eine murine Variante des DSP-3 (SEQ ID NO: 20), wobei die Start und Stopp-Codons fett gedruckt dargestellt werden.
6 stellt die vorhergesagte Aminosäuresequenz der murinen DSP-3-Variante (SEQ ID NO: 21) dar, die durch den Protein kodierenden Bereich der SEQ ID NO: 20 kodiert wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie weiter oben angemerkt, ist die vorliegende Erfindung im Allgemeinen auf Zusammensetzungen und Verfahren zum Modulieren (d.h. Stimulieren oder Inhibieren) von zellulären proliferativen Reaktionen in vitro und in vivo gerichtet. Die vorliegende Erfindung stellt besonders eine DSP-3-Phosphatase mit dualer Spezifität oder alternative Form des DSP-3 bereit (1-2, 5-6; SEQ ID NO: 1, 2, 20, 21) als auch Varianten davon und Antikörper, die besonders an DSP-3 oder alternative Formend des DSP-3 binden. Es werden hierin auch Verfahren für die Verwendung solcher Verbindungen für Durchmusterungen, Nachweisassays und ähnliche therapeutische Verwendungen bereitgestellt.
DSP-3-POLYPEPTIDE UND POLYNUKLEOTIDE
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff "DSP-3-Polypeptid" oder "alternative Form des DSP-3-Polypeptids" ein Polypeptid, das eine DSP-3-Sequenz, wie hierin bereitgestellt, oder eine Variante einer solchen Sequenz umfasst. Solche Polypeptide können sowohl Tyrosin als auch Threonin/Serin-Reste in einem DSP-3-Substrat dephosphorylieren, mit einer Aktivität, die relativ zu der eines volllängen nativen DSP-3 nicht wesentlich verringert ist. DSP-3-Substrate schließen aktivierte (d.h. phosphorylierte) MAP-Kinasen ein. Andere Substrate können unter Verwendung von Substrat-Trapping-Mutanten, wie hierin beschrieben, identifiziert werden und schließen Polypeptide mit einem oder mehreren phosphorylierten Tyrosin, Threonin und/oder Serinresten ein.
DSP-3 oder alternative Formen der DSP-3-Polypeptidvarianten innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung können eine oder mehrere Substititutionen, Deletionen, Additionen und/oder Insertionen enthalten. Für bestimmte DSP-3- oder alternative Formen der DSP-3-Varianten ist die Fähigkeit der Variante zum Dephosphorylieren von Tyrosin- und Threonin-Resten innerhalb eines DSP-3-Substrates nicht wesentlich verringert. Die Fähigkeit einer solchen DSP-3 Variante zum Dephosphorylieren von Tyrosin- und Threonin-Resten innerhalb eines DSP-3-Substrates kann relativ zu einem nativen DSP-3 oder einer alternativen Form des DSP-3 gesteigert werden oder unverändert bleiben, oder kann relativ zum nativen DSP-3 oder zur alternativen Form des DSP-3 um weniger als 50% und bevorzugt weniger als 20% verringert sein. Solche Varianten können unter Verwendung der repräsentativen Assays, die hierin bereitgestellt werden, identifiziert werden.
Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst sind modifizierte Formen von DSP-3 und/oder einer alternativen Form des DSP-3, in denen eine spezifische Funktion ausgeschaltet ist. Zum Beispiel können solche Proteine konstitutiv aktiv oder inaktiv sein oder können veränderte Bindungs- oder katalytische Eigenschaften zeigen. Solche veränderten Proteine können unter Verwendung von gut bekannten Techniken erzeugt werden und die veränderte Funktion wird unter Verwendung von Durchmusterungen, wie die hierin beschriebenen, bestätigt. Bestimmte modifizierte DSP-3- oder alternative Formen der DSP-3-Polypeptide sind als "Substrat-Trapping-Mutanten" bekannt. Solche Polypeptide behalten die Fähigkeit ein Substrat zu binden bei (d.h. K_m ist nicht wesentlich verringert), zeigen jedoch eine verringerte Fähigkeit zum Dephosphorylieren eines Substrates (d.h. k_cat ist verringert, bevorzugt auf weniger als 1 pro Minute). Darüber hinaus sollte die Stabilität des Substrat-Trapping-Mutante/Substrat-Komplexes nicht wesentlich verringert sein, relativ zur Stabilität eines DSP-3/Substrat-Komplexes, der eine alternative Form des DSP-3/Substrat-Komplexes einschließt. Die Komplex-Stabilität kann aufgrund der Assoziationskonstante (K_a) beurteilt werden. Die Bestimmung von K_m, k_cat und K_a kann durch Verwendung von im Stand der Technik bekannten Standardtechniken einfach bestimmt werden (siehe, z.B. WO 98/04712; Lehninger, Biochemistry, 1975 World Publishers, NY) und Assays, die hierin bereitgestellt werden. Substrat-Trapping-Mutanten können zum Beispiel durch Modifizieren von DSP-3 mit einer Aminosäuresubstitution in Position 57 oder Position 88 modifiziert werden (z.B. durch Ersetzen der Aminosäure Aspartat in Position 57 durch einen Alanin-Rest oder durch Ersetzen des Cysteins in Position 88 durch ein Serin). Substrat-Trapping-Mutanten können verwendet werden, um zum Beispiel DSP-3-Substrate zu identifizieren. Kurz gesagt, kann das modifizierte DSP-3 oder die alternative Form des DSP-3 mit einem Kandidaten für ein Substrat in Kontakt gebracht werden (alleine oder in einer Mischung von Proteinen, wie zum Beispiel einem Zellextrakt), um die Bildung eines Substrat/DSP-3-Komplexes zu ermöglichen. Der Komplex kann dann durch herkömmliche Techniken isoliert werden, um die Isolierung und Charakterisierung eines Substrates zu ermöglichen. Die Herstellung und Verwendung von Substrat-Trapping-Mutanten wird zum Beispiel in der PCT Veröffentlichung Nr. WO 98/04712 beschrieben.
Bevorzugt enthält eine Variante konservative Substitutionen. Eine "konservative Substitution" ist diejenige, in der die Aminosäure durch eine andere Aminosäure substituiert wird, die vergleichbare Eigenschaften aufweist, so dass der Fachmann in der Peptidchemie erwarten würde, dass die Sekundärstruktur und die hydropathische Natur des Polypeptids im Wesentlichen unverändert bleibt. Aminosäuresubstitutionen können im Allgemeinen auf der Basis der Ähnlichkeit in der Polarität, der Ladung, der Löslichkeit, der Hydrophobizität, der Hydrophilizität und/oder der amphipathischen Natur der Reste hergestellt werden. Zum Beispiel schließen negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure ein; positive geladene Aminosäuren schließen Lysin und Arginin ein; und Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen, die vergleichbare hydrophilische Werte aufweisen, schließen Leucin, Isoleucin und Valin ein; Glycin und Alanin; Asparagin und Glutamin; und Serin, Threonin, Phenylalanin und Tyrosin. Andere Gruppen von Aminosäuren, die konservative Auswechslungen darstellen können, schließen ein: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; und (5) phe, tyr, trp, his. Eine Variante kann auch oder alternativ dazu nicht konservative Auswechslungen enthalten.
Im Allgemeinen können Modifikationen einfacher in nicht kritischen Bereichen durchgeführt werden, die Bereiche der nativen Sequenz sind, die die Aktivität von DSP-3 oder der alternativen Formen des DSP-3 nicht wesentlich verändern. Nicht kritische Bereiche können durch Modifizieren der DSP-3-Sequenz in einem bestimmten Bereich und Untersuchen der Fähigkeit der sich daraus ergebenden Variante in einem Phosphataseassay, das hierin beschrieben wird, identifiziert werden. Bevorzugte Sequenzmodifikationen werden so hergestellt, um die Wirkstellen-Domäne zu bewahren (VHCLAGVSRS; SEQ ID NO: 3). In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen beeinflussen solchen Modifikationen Wechselwirkungen zwischen DSP-3 (oder der alternativen Formen des DSP-3) und anderen zelluläre Komponenten als DSP-3-Substrate. Jedoch können Substitutionen auch in kritischen Bereichen des nativen Proteins hergestellt werden, vorausgesetzt, dass die sich daraus ergebende Variante im Wesentlichen die Fähigkeit zur Stimulation der Substratdephosphorylierung beibehält. In bestimmten Ausführungsformen enthält eine Variante Substitutionen, Additionen und/oder Insertionen an nicht mehr als 50%, bevorzugt nicht mehr als 25% der Aminosäurereste.
Varianten können zum Beispiel auch (oder alternativ) durch die Deletion oder Addition von Aminosäuren, die einen minimalen Einfluss auf die Aktivität des Polypeptids haben, modifiziert werden. Insbesondere können Varianten zusätzliche Aminosäuresequenzen am Amino und/oder Carboxylende enthalten.
Solche Sequenzen können zum Beispiel verwendet werden, um die Reinigung oder die Detektion des Polypeptids zu erleichtern.
DSP-3 (oder alternative Form der DSP-3) -Polypeptide können unter Verwendung irgendeiner der verschiedenen gut bekannten Techniken hergestellt werden. Rekombinante Polypeptide, die durch DNA-Sequenzen kodiert werden, wie weiter unten beschrieben, können einfach ausgehend von den DNA-Sequenzen unter Verwendung irgendeines der verschiedenen Expressionsvektoren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, hergestellt werden. Die Expression kann in irgendeiner geeigneten Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor, der ein DNA-Molekül enthält, das für ein rekombinantes Polypeptid kodiert, transformiert oder transfiziert worden ist, ausgeführt werden. Geeigneten Wirtszellen schließen Prokaryoten, Hefe und höhere eukaryotische Zellen (einschließlich Säugetierzellen) ein, und Formen, die sich in der Glycosylierung unterscheiden, können durch Variieren der Wirtszelle oder der Post-Isolationsprozesse erzeugt werden. Überstände von geeigneten Wirt/Vektor-Systemen, die ein rekombinates Protein oder Polypeptid in das Kulturmedium sekretieren, können mittels eines kommerziell erhältlichen Filters als erstes konzentriert werden. Nach der Konzentrierung kann das Konzentrat auf eine geeignete Reinigungsmatrix, wie zum Beispiel eine Affinitätsmatrix oder ein Ionenaustauschharz, appliziert werden. Als Letztes können ein oder mehrere Umkehrphasen HPLC-Schritte verwendet werden, um ein rekombinantes Polypeptid weiter zu reinigen.
Abschnitte und andere Varianten mit weniger als etwa 100 Aminosäuren und im Allgemeinen weniger als etwa 50 Aminosäuren können ebenfalls unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind, durch synthetische Verfahren erzeugt werden. Zum Beispiel können solche Polypeptide unter Verwendung irgendeiner der kommerziell erhältlichen Festphasentechniken, wie zum Beispiel dem Merrifield-Festphasensyntheseverfahren, bei dem Aminosäuren nacheinander an eine wachsende Aminosäurekette angefügt werden, synthetisiert werden. Siehe Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963. Die Ausrüstung für die automatisierte Synthese von Polypeptiden ist kommerziell erhältlich bei den Anbietern, wie zum Beispiel bei Perkin-Elmer, Inc. Applied BioSystems Division (Foster City, CA), und können gemäß den Instruktionen des Herstellers betrieben werden.
Ein "DSP-3-Polynukleotid" ist irgendein Polynukleotid, das für mindestens einen Abschnitt eines DSP-3 oder einer alternativen Form des DSP-3-Polypeptides, oder eine Variante davon kodiert oder das komplementär zu einem solchen Polynukleotid ist. Bevorzugte Polynukleotide umfassen mindestens 15 aufeinanderfolgende Polynukleotide, bevorzugt mindestens 30 aufeinanderfolgende Polynukleotide, die für ein DSP-3 oder eine alternative Form des DSP-3-Polypeptids kodieren oder die komplementär zu einer solchen Sequenz sind. Bestimmte Polynukleotide kodieren für ein DSP-3 oder eine alternative Form des DSP-3-Polypeptids; andere können Verwendung als Sonden, Primer oder Antisense-Oligonukleotide finden, wie weiter unten beschrieben. Polynukleotide können einzelsträngig (kodierend oder Antisense) oder doppelsträngig sein und können DNA (genomisch, cDNA oder synthetisch) oder RNA-Molekül sein. Zusätzlich können kodierende oder nicht kodierende Sequenzen innerhalb eines Polynukleotids der vorliegenden Erfindung vorhanden sein, müssen es jedoch nicht, und ein Polynukleotid kann, muss jedoch nicht, mit anderen Molekülen und/oder Trägermaterialien verknüpft sein.
DSP-3-Polynukleotide können eine native Sequenz umfassen (d.h. ein endogenes DSP-3 oder eine alternativen Form des DSP-3, oder einen Abschnitt oder eine Splice-Variante davon) oder kann eine Variante einer solchen Sequenz umfassen. Polynukleotid-Varianten können eine oder mehrere Sustitutionen, Additionen, Deletionen und/oder Insertionen enthalten, so dass die Aktivität des kodierten Polypeptids nicht wesentlich verringert ist, wie weiter oben beschrieben. Die Wirkung auf die Aktivität des kodierten Polypeptids kann im Allgemeinen, wie hierin beschrieben, abgeschätzt werden. Varianten weisen bevorzugt eine mindestens 70% Identität, noch bevorzugter eine mindestens etwa 80% Identität und am meisten bevorzugt eine mindestens etwa 90% Identität zu einer Polynukleotidsequenz auf, die für ein natives DSP-3, oder eine alternativen Form des DSP-3 oder einen Abschnitt davon kodiert. Die prozentuale Identität kann durch Vergleichen der Sequenzen mittels Computeralgorithmen, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind, wie zum Beispiel Align oder der BLAST-Algorithmus (Altschul, J. Mol. Biol. 219: 555-565, 1991; Henikoff und Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919, 1992), dass auf der NCBI Webseite (http://www/ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST) verfügbar ist, bestimmt werden. Standardparameter können verwendet werden. Bestimmte Varianten sind im Wesentlichen homolog zum nativen Gen. Solche Polynukleotidvarianten können unter moderaten stringenten Bedingungen mit einer natürlich auftretenden DNA- oder RNA-Sequenz, die für ein natives DSP-3 oder eine alternativen Form des DSP-3 (oder eine komplementäre Sequenz) kodiert, hybridisieren. Geeignete moderate stringente Bedingungen schließen zum Beispiel das Vorwaschen in einer Lösung aus 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); Hybridisieren bei 50°C-70°C, 5 × SSC für 1-16 Stunden (z.B. über Nacht); gefolgt von einmaligem oder zweimaligem Waschen bei 22-65°C für 20-40 Minuten mit einem oder mehreren jeweils von 2 ×, 0,5 × und 0,2 × SSC, das 0,05-0,1% SDS enthält. Für zusätzliche Stringenz können die Bedingungen eine Waschung in 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 50-60°C für 15-40 Minuten einschließen. Wie dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, können Variationen in der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen durch Verändern der Zeit, Temperatur und/oder Konzentration der Lösungen, die für die Prähybridisierung, Hybridisierung und die Waschschritte verwendet werden, erzielt werden, und geeignete Bedingungen können auch zum Teil von den bestimmten Nukleotidsequenzen der verwendeten Sonde abhängen und von der geblotteten Probanden Nukleinsäureprobe. Daher wird geschätzt, dass geeignete Stringenzbedingungen ohne ungebührliches Experimentieren einfach ausgewählt werden können, wenn eine gewünschte Selektivität einer Sonde identifiziert worden ist, basierend auf ihrer Fähigkeit mit einer oder mehreren bestimmten Probanden-Sequenzen zu hybridisieren, während sie nicht mit bestimmten anderen Probanden-Sequenzen hybridisiert.
Es wird ebenfalls vom Fachmann anerkannt, dass es aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes viele Nukleotidsequenzen gibt, die für ein hierin beschriebenes Polypeptid kodieren. Einige dieser Polynukleotide tragen eine minimale Homologie zur Nukleotidsequenz eines nativen Gens. Trotzdem sind Polynukleotide, die aufgrund von Unterschieden bei der Codonverwendung variieren, von der vorliegenden Erfindung spezifisch umfasst.
Polynukleotide können mittels irgendeiner Vielzahl von Techniken hergestellt werden. Zum Beispiel kann ein Polynukleotid aus einer cDNA amplifiziert werden, die aus einer geeigneten Zelle oder Gewebetyp hergestellt wurde, wie zum Beispiel humanen Skelettmuskelzellen. Solche Polynukleotide können über eine Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert werden. Für diesen Ansatz können basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen sequenzspezifische Primer entworfen werden, und können gekauft oder synthetisiert werden.
Ein amplifizierter Abschnitt kann zum Isolieren eines Volllängengens aus einer geeigneten Bank (z.B. humane Skelettmuskelzellen cDNA) unter Verwendung gut bekannter Techniken isoliert werden. Bei diesen Techniken wird eine Bibliothek (cDNA oder genomisch) mittels einer oder mehrerer Polynukleotidsonden oder Primer, die für die Amplifikation geeignet sind, durchmustert. Bevorzugt wird eine Bank der Größe nach ausgewählt, um größere Moleküle einzuschließen. Zufallsgeprimte Banken können ebenfalls zum Identifizieren von 5' und Stromaufwärtsbereichen von Genen bevorzugt werden. Genomische Banken werden für das Erhalten von Introns und erweiterten 5'-Sequenzen bevorzugt.
Für Hybridisierungstechniken kann ein Sequenzabschnitt unter Verwendung gut bekannter Techniken markiert werden (z.B. durch Bruchtranslation oder Endmarkierung mit ³²P). Eine bakterielle oder Bakteriophagenbank kann dann mittels Hybridisierungsfiltern, die denaturierte bakterielle Kolonien enthalten (oder Rasen, die Phagenplaques enthalten) mit der markierten Sonde durchmustert werden (siehe, z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Hybridisierungskolonien oder Plaques werden ausgewählt und expandiert und die DNA wird für weitere Analysen isoliert. Klone können analysiert werden, um die Menge an zusätzlicher Sequenz zum Beispiel durch PCR mittels eines Primers der Teilsequenz und eines Primers vom Vektor zu bestimmen. Restriktionskarten und Sequenzabschnitte können zum Identifizieren eines oder mehrerer überlappender Klone erzeugt werden. Ein volllängen cDNA-Molekül kann durch Ligation geeigneter Fragmente mittels gut bekannter Techniken erzeugt werden.
Alternativ dazu gibt es zahlreiche Amplifikationstechniken zum Erhalten einer volllängen kodierenden Sequenz aus einem cDNA-Sequenzabschnitt. Bei diesen Techniken wird die Amplifikation im Allgemeinen über eine PCR durchgeführt. Eine solche Technik ist als "schnelle Amplifikation von cDNA-Enden" (oder RACE) bekannt. Diese Technik schließt die Verwendung eines internen Primers und eines externen Primers ein, die mit einem polyA-Bereich oder einer Vektorsequenz hybridisieren, um Sequenzen zu identifizieren, die 5' und 3' einer bekannten Sequenz liegen. Eines aus einer Vielfalt verschiedener kommerziell erhältlichen Kits kann verwendet werden, um den Amplifikationsschritt durchzuführen. Primer können unter Verwendung zum Beispiel von im Stand der Technik gut bekannter Software entworfen werden. Primer sind bevorzugt 17-32 Nukleotide lang, haben einen GC-Gehalt von mindestens 40% und verbinden sich mit der Ziel-Sequenz bei Temperaturen von etwa 54°C bis 72°C. Der amplifizierte Bereich kann wie weiter oben beschrieben sequenziert werden und überlappende Sequenzen in einer fortlaufenden Sequenz zusammengefügt werden.
Eine cDNA-Sequenz, die für die DSP-3 kodiert, wird in 1 bereitgestellt (SEQ ID NO: 1) und die vorhergesagte Aminosäuresequenz wird in 2 bereitgestellt (SEQ ID NO: 2). Eine cDNA-Sequenz, die für eine alternative Form des DSP-3 kodiert wird in 5 bereitgestellt (SEQ ID NO: 20) und die vorhergesagte Aminosäuresequenz wird in 6 bereitgestellt (SEQ ID NO: 21). Die aktive Stelle von DSP-3 VHCLAGVSRS (SEQ ID NO: 3) wird durch Nukleotidbasen kodiert, die in den Nukleotidpositionen 258 bis 285 der SEQ ID NO: 1 lokalisiert sind (1; das Startcodon beginnt in der Nukleotidposition Nr. 1). Die Sequenzinformation, die dieser Stelle unmittelbar folgt, wurde verwendet, um 5' und 3' RACE- Reaktionen mit humaner Skelettmuskel-cDNA zu entwerfen, um ein Protein von 184 Aminosäuren zu identifizieren, das durch 552 Basenpaare kodiert wird. Dieses Protein wird als Phosphatase-3 mit dualer Spezifität oder DSP-3 bezeichnet. Es wurde eine höhere Abundanz der Nachricht für DSP-3 im humanen Skelettmuskelgewebe beobachtet als in anderen Geweben. DSP-3 zeigt eine signifikante Homologie zu anderen MAP-Kinase-Phosphatasen, wie durch den in 3 präsentierten Sequenzvergleich gezeigt wird.
DSP-3 (oder alternative Formen der DSP-3) Polynukleotidvarianten können im Allgemeinen durch jedes Verfahren, das im Stand der Technik bekannt ist, einschließlich, zum Beispiel, Festphasenchemiesynthese, hergestellt werden. Modifikationen in einer Polynukleotidsequenz können ebenfalls unter Verwendung von Standardmutagensetechniken, wie zum Beispiel Oligonukleotidgerichtete ortsspezifische Mutagense eingeführt werden. Alternativ dazu können RNA-Moleküle durch in vitro oder in vivo Transkription der DNA-Sequenzen, die für DSP-3 kodieren oder einen Abschnitt davon, erzeugt werden, vorausgesetzt, dass die DNA in einen Vektor mit einem geeigneten RNA-Polymerasepromotor (wie zum Beispiel T7 oder SP6) eingebaut ist. Bestimmte Polynukleotide können verwendet werden, um ein kodiertes Polypeptid, das hierin beschrieben wird, herzustellen. Zusätzlich oder alternativ dazu kann ein Polynukleotid an einen Patienten verabreicht werden, so dass das kodierte Polypeptid in vivo erzeugt wird.
Ein Polynukleotid, das zu mindestens einem Abschnitt einer kodierenden Sequenz komplementär ist (z.B. ein Antisense-Polynukleotid oder ein Ribozym), kann auch als Sonde oder als Primer verwendet werden oder zum Modulieren der Genexpression. Die Identifikation von Oligonukleotiden und Ribozymen für die Verwendung als Antisense-Mittel und DNA kodierende Gene für die gezielte Abgabe schließen im Stand der Technik bekannte Verfahren ein. Zum Beispiel sind die erwünschten Eigenschaften, die Länge und andere Charakteristika solcher Oligonukleotide gut bekannt. Antisense-Oligonukleotide werden üblicherweise entworfen, um den Abbau durch endogene nukleolytische Enzyme zu widerstehen, durch Verwendung solcher Verknüpfungen wie: Phosphorthioat, Methylphosphonat, Sulfon, Sulfat, Ketyl, Phosphordithioat, Phosphoramidat, Phosphatester und andere derartige Verknüpfungen (siehe, z.B., Agrwal et al., Tetrahedron Lett. 28: 3539-3542 (1987); Miller et al., J. Am. Chem. Soc. 93: 6657-6665 (1971); Stec et al., Tetrahedron Lett. 26: 2191-2194 (1985); Moody et al., Nucl. Acids Res. 12: 4769-4782 (1989); Uznanski et al., Nucl. Acids Res. (1989); Letsinger et al., Tetrahedron 40: 137-143 (1984); Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 54: 367-402 (1985); Eckstein, Trends Biol. Sci. 14: 97-100 (1989); Stein In: Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, Ed, Macmillan Press, London, S. 97-117 (1989); Jager et al., Biochemistry 27: 7237-7246 (1988)).
Antisense-Polynukleotide sind Oligonukleotide, die auf sequenzspezifische Art und Weise an Nukleinsäuren, wie zum Beispiel mRNA oder DNA, binden. Wenn sie an mRNA gebunden sind, die komplementäre Sequenzen aufweist, verhindert Antisense die Translation der mRNA (siehe, z.B. U.S. Patent Nr. 5,168,053 von Altman et al.; U.S. Patent Nr. 5,190,931 von Inouye; U.S. Patent Nr. 5,135,917 von Burch; U.S. Patent 5,087,617 von Smith und Clusel et al. (1993) Nucl. Acids Res. 21: 3405-3411, dass Dumbbell Antisense-Oligonukleotide beschreibt). Triplexmoleküle betreffen einzelne DNA-Stränge, die Duplex-DNA binden, die ein kolineares Triplexmolekül bilden, wodurch die Transkription verhindert wird (siehe, z.B. U.S. Patent Nr. 5,176,996 von Hogan et al., dass Verfahren zum Herstellen von synthetischen Oligonukleotiden beschreibt, die an Ziel-Zellen in Duplex-DNA binden).
Besonders nützliche Antisense-Nukleotide und Triplexmoleküle sind Moleküle, die den Sinn-Strang der DNA oder mRNA, die für ein DSP-3 oder ein alternative Form des DSP-3-Polypeptids oder ein Protein, binden oder komplementär dazu sind, wodurch irgendein anderer Prozess vermittelt wird, der der Expression von endogenem DSP-3 (oder der alternativen Form des DSP-3) ähnelt, so dass die Inhibition der Translation der mRNA, die für das DSP-3- (oder die alternative Form des DSP-3-) Polypeptid kodiert, bewirkt wird. cDNA Konstrukte, die in Antisense-RNA transkribiert werden können, können ebenfalls in Zellen oder Gewebe eingebracht werden, um die Produktion der Antisense-RNA zu erleichtern. Die Antisense-Technologie kann verwendet, um die Genexpression durch Interferenz durch das Binden von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder anderen regulatorischen Molekülen zu kontrollieren (siehe, Gee et al., In Huber und Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co. (Mt. Kisco. NY; 1994)). Alternativ dazu kann ein Antisense-Molekül entworfen werden, um mit einem Kontrollbereich eines DSP-3 Gens zu hybridisieren (z.B. Promotor, Enhancer oder Transkriptionsinitiationsstelle) und die Transkription des Gens zu blockieren; oder um die Translation durch Inhibieren der Bindung eines Transkripts an die Ribosomen zu blockieren.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch DSP-3 (oder alternative Form des DSP-3) spezifische Ribozyme. Ein Ribozym ist ein RNA-Molekül, das RNA-Substrate spezifisch schneidet, wie zum Beispiel mRNA, was zur spezifischen Inhibition oder Interferenz mit der zellulären Genexpression führt. Es gibt mindestens fünf bekannte Klassen von Ribozymen, die an der Spaltung und/oder Ligation von RNA-Ketten beteiligt sind.
Ribozyme können auf irgendein RNA-Transkript gerichtet werden und können solche Transkripte katalytisch spalten (siehe, z.B., U.S. Patent Nr. 5,272,262; U.S. Patent Nr. 5,144,019; und U.S. Patent Nr. 5,168,053, 5,180,818, 5,116,742 und 5,093,246 von Cech et al.). Jedes DSP-3 (oder alternative Form des DSP-3) mRNA-spezifische Ribozym oder eine Nukleinsäure, die für ein solches Ribozym kodiert, können an eine Wirtszelle abgegeben werden, um die Inhibition der DSP-3 Genexpression zu bewirken. Ribozyme können daher durch DNA, die für das Ribozym kodiert, das mit einem eukaryotischen Promotor, wie zum Beispiel einem eukaryotischen viralen Promotor verknüpft ist, so dass nach Einführen in den Nukleus das Ribozym direkt transkribiert wird, in die Wirtszellen befördert werden.
Jedes Polynukleotid kann weiter modifiziert werden, um die Stabilität in vivo zu erhöhen. Mögliche Modifikationen schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf das Hinzufügen von flankierenden Sequenzen an die 5' und/oder 3'-Enden; die Verwendung von Phosphorthioat oder 2' O-Methyl anstelle von Phosphodiesterverknüpfungen im Rückgrad; und/oder die Inklusion von unüblichen Basen, wie zum Beispiel Inosin, Queosin und Wybutosin als auch von Acetyl-, Methyl-, Thio- und anderen modifizierten Formen von Adenin, Cytidin, Guanin, Thymin und Uridin.
Nukleotidsequenzen, wie sie hierin beschrieben werden, können mit verschiedenen anderen Nukleotidsequenzen unter Verwendung etablierter rekombinanter DNA-Techniken verbunden werden. Zum Beispiel kann ein Polynukleotid in irgendeinen aus einer Vielzahl von Klonierungsvektoren, die Plasmide, Phagemide, Lambda-Phagenderivate und Cosmide einschließen, kloniert werden. Vektoren von besonderem Interesse schließen Expressionsvektoren, Replikationsvektoren, Sonden erzeugende Vektoren und Sequenzierungsvektoren ein. Im Allgemeinen enthält ein geeigneter Vektor einen Replikationsursprung, der in mindestens einem Organismus funktional ist, konventionelle Restriktionsendonukleasestellen und einen oder mehrere selektierbare Marker. Andere Elemente werden von der gewünschten Verwendung abhängen und werden für den Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich sein.
In bestimmten Ausführungsformen können Polynukleotide so formuliert sein, um den Eintritt in eine Zelle eines Säugetiers und die Expression darin zu ermöglichen. Solche Formulierungen sind besonders nützlich für therapeutische Zwecke, wie weiter unten beschrieben. Der Fachmann wird erkennen, dass es viele Wege gibt um die Expression eines Polynukleotids in einer Zielzelle zu erreichen und dass jedes geeignete Verfahren verwendet werden kann. Zum Beispiel kann ein Polynukleotid in einen viralen Vektor unter Verwendung gut bekannter Techniken eingebaut werden. Ein viraler Vektor kann zusätzlich ein Gen für einen selektierbaren Marker (um bei der Identifikation oder Selektion von transduzierten Zellen zu helfen) und/oder einen Rest zum Ansteuern, wie zum Beispiel ein Gen, das für einen Liganden eines Rezeptors auf einer spezifischen Ziel-Zelle kodiert, um den Vektor Ziel-spezifisch zu machen, übertragen oder einbauen. Das Ansteuern kann auch unter Verwendung eines Antikörpers durch Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren durchgeführt werden.
Andere Formulierungen für therapeutische Zwecke schließen kolloidale Dispersionssysteme, wie zum Beispiel makromolekulare Komplexe, Nanokapseln, Mikrosphären, Kügelchen und auf Lipiden basierende Systeme, einschließlich Öl-in-Wasser Emulsionen, Mizellen, gemischte Mizellen und Liposomen, ein. Ein bevorzugtes kolloidales System für die Verwendung als Vehikel zum Zuführen in vitro und in vivo ist ein Liposom (d.h. ein künstliches Membranvesikel). Die Herstellung und Verwendung solcher Systeme ist im Stand der Technik gut bekannt.
In anderen Aspekten kann ein DSP-3-Promotor unter Verwendung von Standardtechniken isoliert werden. Die vorliegende Erfindung stellt Nukleinsäuremoleküle bereit, die eine solche Promotor-Sequenz oder ein oder mehrere cis- oder trans wirkende regulatorische Elemente davon umfassen. Solche regulatorischen Elemente können die Expression von DSP-3 (oder der alternativen Form des DSP-3) verstärken oder supprimieren. Ein 5' flankierender Bereich kann unter Verwendung von Standardtechniken, basierend auf der genomischen Sequenz, die hierin bereitgestellt wird, erzeugt werden. Falls erforderlich können zusätzliche 5'-Sequenzen unter Verwendung von auf PCR basierenden oder anderer Standardverfahren erzeugt werden. Der 5'-Bereich kann subkloniert werden und mittels Standardverfahren sequenziert werden. Primerverlängerungs- und/oder RNase-Schutzanalysen können verwendet werden, um die Transkriptionsstartstelle, die aus der cDNA abgeleitet wird, zu verifizieren.
Um die Grenze des Promotor-Bereiches zu definieren, können mögliche Promotorinserts variierender Größe in ein heterologes Expressionssystem, das ein geeignetes Reportergen ohne einen Promotor oder Enhancer enthält, subkloniert werden. Geeignete Reportergene können Gene einschließen, die für Luciferase, Beta-galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase, sekretierte Alkaline Phosphatase oder das grüne Fluoreszenzproteingen kodieren. Geeignete Expressionssysteme sind gut bekannt und können unter Verwendung gut bekannter Techniken hergestellt werden oder kommerziell bezogen werden. Die internen Deletionskonstrukte können unter Verwendung einzigartiger interner Restriktionsstellen oder durch teilweisen Verdau von nicht einzigartigen Restriktionsstellen erzeugt werden. Die Konstrukte können dann in Zellen transfiziert werden, die ein hohes DSP-3-Expressionsniveau zeigen. Im Allgemeinen wird das Konstrukt mit dem kleinsten 5' flankierenden Bereich, der das höchste Expressionsniveau des Reportergens zeigt, als Promotor identifiziert. Solche Promotor-Bereiche können mit einem Reportergen verknüpft sein und verwendet werden, um Mittel auf ihre Fähigkeit zur Modulation der DSP-3-Transkription zu evaluieren.
Sobald ein funktionaler Promotor identifiziert worden ist, können cis und trans wirkende Elemente lokalisiert werden. Cis wirkende Sequenzen können im Allgemeinen auf Grundlage der Homologie zu bereits vorher charakterisierten Transkriptionsmotiven identifiziert werden. Punktmutationen können dann innerhalb der identifizierten Sequenzen erzeugt werden, um die regulatorische Rolle solcher Sequenzen zu evaluieren. Solche Mutationen können mittels ortsspezifischer Mutagensetechniken oder mittels einer auf PCR basierenden Strategie erzeugt werden. Der veränderte Promotor wird dann in einen Reportergen-Expressionsvektor kloniert, wie weiter oben beschrieben, und die Wirkung der Mutation auf die Reportergen-Expression wird evaluiert.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von allelen Varianten von DSP-3 (oder der alternativen Formen des DSP-3) als auch von DSP-3-Sequenzen aus anderen Organismen. Solche Sequenzen können im Allgemeinen basierend auf einer Ähnlichkeit zu den Sequenzen, die hierin bereitgestellt werden (z.B. mittels Hybridisierungstechniken) und basierend auf dem Vorhandensein der DSP-3-Aktivität, mittels eines hierin bereitgestellten Assays, identifiziert werden.
Im Allgemeinen werden Polypeptide und Polynukleotide, die hierin beschrieben werden, isoliert. Ein "isoliertes" Polypeptid oder Polynukleotid ist eines, das aus der natürlichen Umgebung entfernt wird. Zum Beispiel ist ein natürlich auftretendes Protein isoliert, wenn es von einem Teil oder den gesamten koexistierenden Materialien im natürlichen System abgetrennt wird. Bevorzugt sind solche Polypeptide mindestens zu etwa 90% rein, noch bevorzugter mindestens zu etwa 95% rein und am meisten bevorzugt mindestens zu etwa 99% rein. Ein Polynukleotid wird als isoliert erachtet, wenn es zum Beispiel in einen Vektor kloniert ist, der nicht Teil der natürlichen Umgebung ist.
ASSAYS ZUM DETEKTIEREN DER DSP-3 AKTIVITÄT
Gemäß der vorliegenden Erfindung können Substrate von DSP-3 (oder der alternativen Formen des DSP-3) mit Tyrosin phosphorylierte vollängen Proteine und Poylpeptide als auch Fragmente (z.B. Abschnitte), Derivate oder Analoga davon einschließen, die an einem Tyrosin-Rest phosphoryliert werden können und die, in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen, auch eine Phosphorylierung an einem Serin- oder einem Threonin-Rest durchlaufen können. Solche Fragmente, Derivate und Analoga schließen jede natürlich auftretende oder jedes künstlich bearbeitete DSP-3-Substrat-Polypeptid ein, das wenigstens die biologische Funktion des Wechselwirkens mit einem DSP-3 (oder die alternativen Formen des DSP-3), die hierin bereitgestellt werden, zum Beispiel durch Bilden eines Komplexes mit einem DSP-3 (oder der alternativen Formen des DSP-3), beibehält. Ein Fragment, Derivat oder Analoga eines DSP-3-Substrat-Polypeptids, einschließlich von Substraten, die Fusionsproteine sind, kann (i) eines sein, bei dem ein oder mehrere der Aminosäurereste mit einem konservierten oder nicht konservierten Aminosäurerest (bevorzugt einem konservierten Aminosäurerest) substituiert wird und ein solcher substituierter Aminosäurerest kann oder kann nicht einer sein, der durch den genetischen Code kodiert wird, oder (ii) eines, bei dem ein oder mehrere der Aminosäurereste eine Substitutionsgruppe einschließen, oder (iii) eines, bei dem das Substrat-Polypeptid mit einer anderen Verbindung, wie zum Beispiel einer Verbindung zum Erhöhen der Halbwertszeit des Polypeptids (z.B. Polyethylenglycol), oder einem detektierbaren Rest, wie zum Beispiel einem Reportermolekül, fusioniert ist, oder (iv) eines, bei dem zusätzliche Aminosäuren mit dem Substrat-Polypeptid fusioniert sind, einschließlich Aminosäuren, die für die Reinigung des Substratpolypeptids oder einer Protein-Sequenz verwendet werden. Solche Fragmente, Derivate und Analoga gelten als in den Anwendungsbereich des Fachmanns auf dem Gebiet fallend. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein MAP-Kinase-Polypeptid ein Substrat für die Verwendung, wie sie hierin bereitgestellt wird.
DSP-3 (oder die alternativen Formen der DSP-3) Polypeptidvarianten können auf ihre DSP-3 Aktivität mittels eines geeigneten Assays für die MAP-Kinase-Phosphatase-Aktivität getestet werden. Solche Assays könne in vitro oder innerhalb eines auf Zellen basierenden Assays untersucht werden. Zum Beispiel kann eine MAP-Kinase in inaktiver Form von Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY; Katalognummer 14-198) für die Verwendung als DSP-3-Substrat, wie hierin bereitgestellt, erhalten werden. Die Phosphorylierung der MAP-Kinase kann unter Verwendung gut bekannter Techniken (wie zum Beispiel jenen, die von Zheng und Guan, J. Biol. Chem. 268: 16116-16119, 1993) beschrieben werden, unter Verwendung der MAP-Kinase-Kinase-MEK-1 (erhältlich bei Upstate Biotechnology; Kat. Nr. 14-206) durchgeführt werden.
Zum Beispiel kann das [³²P]-radioaktiv markierte Substrat (z.B. MAP-Kinase) für die Kinasereaktion verwendet werden, was zu einer radioaktiv markierten aktivierten MAP-Kinase führt. Ein DSP-3 (oder die alternative Form des DSP-3) Polypeptid kann dann auf die Aktivität zur Dephosphorylierung einer aktivierten MAP-Kinase durch in in-Kontakt-bringen des DSP-3 (oder der alternativen Form des DSP-3) Polypeptids mit der MAP-Kinase unter geeigneten Bedingungen getestet werden (z.B. Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol, 1 mg/ml Rinderserumalbumin für 10 Minuten bei 30°C; oder wie von Zheng und Guan, J. Biol. Chem. 268: 16116-16119, 1993 beschrieben). Die Dephosphorylierung der MAP-Kinase kann unter Verwendung von irgendeinem aus einer Vielzahl von Assays, wie zum Beispiel einem gekoppelten Kinaseassay (zum Evaluieren der Phosphorylierung eines MAP-Kinase-Substrates unter Verwendung irgendeines Assays, das im Stand der Technik bekannt ist) oder direkt detektiert werden, basierend auf (1) dem Verlust der radioaktiven Phosphatgruppe (z.B. durch Gelelektrophorese gefolgt durch Autoradiographie), (2) der Verschiebung in der elektrophoretischen Mobilität nach der Dephosphorylierung; (3) dem Verlust der Reaktivität für einen Antikörper, der für Phosphotyrosin oder Phosphothreonin spezifisch ist; (4) einer Phosphoaminosäureanalyse der MAP-Kinase. Bestimmte Assays können im Allgemeinen durchgeführt werden, wie es von Ward et al., Nature 367: 651-654, 1994 oder Alessi et al., Oncogene 8: 2015-2020, 1993 beschrieben wurde. Im Allgemeinen sollte der Kontakt von 500 pg bis 50 ng DSP-3-Polypeptiden mit 100 ng bis 100 μg aktivierter MAP-Kinase, üblicherweise innerhalb von 20-30 Minuten, zu einer detektierbaren Dephosphorylierung der MAP-Kinase führen. Innerhalb bestimmter Ausführungsformen können 0,01-10 Einheiten/ml des (bevorzugt etwa 0,1 Einheiten/ml, in denen eine Einheit eine Menge ist, die für die Dephosphorylierung von 1 nmol Substrat pro Minute ausreicht) DSP-3-Polypeptids mit 0,1-10 μM (bevorzugt etwa 1 μM) aktivierter MAP-Kinase in Kontakt gebracht werden, um eine detektierbare Dephosphorylierung der MAP-Kinase zu erzeugen. Bevorzugt führt ein DSP-3-Polypeptid zu einer Dephosphorylierung einer MAP-Kinase oder eines phosphorylierten Substrates (wie zum Beispiel ein mit Tyrosin und/oder Serin phosphoryliertes Peptid), das mindestens so groß ist wie die Dephosphorylierung, die in Gegenwart einer vergleichbaren Menge des nativen humanen DSP-3 beobachtet wird. Es wird offenkundig, dass andere Substrate, die unter Verwendung einer Substrat-Trapping-Mutante, wie hierin beschrieben, identifiziert worden sind, für die MAP-Kinase in diesen Assays eingesetzt werden kann.
ANTIKÖRPER UND ANTIGENBINDENDE FRAGMENTE
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Peptide, Polypeptide und andere Nicht-Peptidmoleküle, die spezifisch mit einem DSP-3 (oder einer alternativen Form des DSP-3) binden. Wie hierin verwendet, sagt man von einem Molekül, das es an ein DSP-3 (oder eine alternative Form des DSP-3) "spezifisch bindet", wenn es in einem nachweisbaren Niveau mit DSP-3 (oder einer alternativen Form des DSP-3) reagiert, jedoch mit Peptiden nicht nachweisbar reagiert, die eine unähnliche Sequenz enthalten oder eine Sequenz einer anderen Phosphatase. Bevorzugte Bindungsmoleküle schließen Antikörper ein, die zum Beispiel polyklonal, monoklonal, einzelkettig, chimär, anti-idiotypisch oder CDR-transplantierte Immunoglobuline oder Fragmente davon, wie zum Beispiel proteolytisch erzeugte oder rekombinant erzeugte Immunoglobulin F(ab')₂-, Fab-, Fv- und Fd-Fragmente sind. Bestimmte bevorzugte Antikörper sind solche Antikörper, die die DSP-3-Aktivität innerhalb eines in vitro Assays inhibieren oder blockieren, wie es hierin beschrieben wird. Bindungseigenschaften eines Antikörpers an DSP-3 können im Allgemeinen unter Verwendung von Immunodetektionsverfahren, die zum Beispiel ein Festphasen-Enzymimmunoassay (ELISA), Immunopräzipitation, Immunoblotten und ähnliches, was von einem Fachmann auf dem Gebiet ohne weiteres durchgeführt werden kann, einschließen, ermittelt werden.
Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, können verwendet werden, um Antikörper, polyklonales Antiserum oder monoklonale Antikörper zu erzeugen, die für DSP-3 (oder der alternativen Formend des DSP-3) spezifisch sind. Antikörper können auch als genetisch erzeugte Immunoglobuline (Ig) oder Ig-Fragmente erzeugt werden, die entworfen werden, um wünschenswerte Eigenschaften aufzuweisen. Zum Beispiel können im Wege der Illustration und nicht zur Begrenzung, Antikörper ein rekombinantes IgG einschließen, das ein chimäres Fusionsprotein ist, das mindestens eine Domäne eines variablen (V) Bereichs aus einer ersten Säugetierspezies und wenigstens eine Domäne eines konstanten Bereichs aus einer zweiten anderen Säugetierspezies aufweist. Üblicherweise weist ein chimärer Antikörper murine Sequenzen variabler Bereiche und humane Sequenzen konstanter Bereiche auf. Solch ein murines/humanes chimäres Immunoglobulin kann durch Transplantation der die Komplementarität bestimmenden Bereiche (CDRs), die von einem murinen Antikörper abstammen, die eine Bindungsspezifität für ein Antigen verleihen, in vom Menschen abstammende V-Bereiche der Strukturbereiche und vom Menschen abstammende konstante Bereiche, "humanisiert" werden. Fragmente dieser Moleküle können durch proteolytischen Verdau oder wahlweise durch proteolytischen Verdau gefolgt von einer milden Reduktion der Disulfidbrücken und Alkylierung erzeugt werden. Alternativ dazu können solche Fragmente durch rekombinante Genmanipulationstechniken erzeugt werden.
Wie hierin verwendet, kann man von einem Antikörper sagen, dass er "immunospezifisch" oder "spezifisch bindet" an ein DSP-3- (oder der alternative Form des DSP-3) Polypeptid, wenn er bei einem nachweisbaren Niveau mit DSP-3 (oder der alternative Form des DSP-3), bevorzugt mit einer Affinitätskonstante, K_a, von mehr als oder gleich 10⁴ M^–1, noch bevorzugter von mehr als oder gleich etwa 10⁵ M^–1, noch bevorzugter von mehr als oder gleich etwas 10⁶ M^–1 und sogar noch bevorzugter von mehr als oder gleich etwas 10⁷ M^–1 reagiert. Die Affinitäten von Bindungspartner oder Antikörpern kann unter Verwendung von konventionellen Techniken, zum Beispiel solchen, die von Scatchard et al., beschrieben werden (Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 51: 660 (1949)) oder durch Oberflächenplasmonresonanz (BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ), bestimmt werden. Siehe, z.B. Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-2565 (1993).
Antikörper können im Allgemeinen durch irgendeine aus einer Vielzahl von Techniken, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, hergestellt werden. Siehe, z.B. Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988). In einer solchen Technik wird ein Tier mit DSP-3 als Antigen immunisiert, um polyklonales Antiserum zu generieren. Geeignete Tiere schließen zum Beispiele Hasen, Schafe, Ziegen, Schweine und Rinder ein und können auch kleinere Säugetierspezies, wie zum Beispiel Mäuse, Ratten und Hamster oder andere Spezies einschließen.
Ein Immunogen kann aus Zellen bestehen, die DSP-3 (oder die alternative Form des DSP-3) exprimieren, gereinigtes oder teilweise gereinigtes DSP-3- (oder die alternative Form des DSP-3) Polypeptide oder Varianten oder Fragmente (z.B. Peptide) davon oder DSP-3-Peptide. DSP-3-Peptide können durch proteolytische Spaltung erzeugt werden oder können chemisch synthetisiert werden. Zum Beispiel werden hierin Nukleinsäuresequenzen, die für DSP-3- (oder die alternative Form des DSP-3) Polypeptide kodieren, bereitgestellt, so dass der Fachmann auf dem Gebiet diese Polypeptide für die Verwendung als Immunogene routinemäßig herstellen kann. Polypeptide oder Peptide, die für die Immunisierung verwendbar sind, können ebenfalls durch Analysieren der Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur von DSP-3 gemäß Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, ausgewählt werden, um die Aminosäuresequenzen zu bestimmten, die höchst wahrscheinlich eine Antigenreaktion in einem Wirtstier hervorrufen. Siehe, z.B. Novotny, 1991 Mol. Immunol. 28: 201-207; Berzofsky, 1985 Science 229: 932-40.
Die Herstellung des Immunogens für die Injektion in Tiere kann eine kovalente Kopplung des DSP-3- (oder der alternativen Form des DSP-3) Polypeptids (oder Varianten oder Fragmenten davon) an andere immunogene Proteine einschließen, zum Beispiel ein Trägerprotein, wie zum Beispiel Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) oder Rinderserumalbumin (BSA). Zusätzlich kann das DSP-3-Peptid, Polypeptid oder die DSP-3 exprimierenden Zellen, die als Immunogen verwendet werden, in einem Adjuvans emulsifiziert werden. Siehe, z.B. Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988). Im Allgemeinen erhalten die Tiere nach der ersten Injektion eine oder mehrere Auffrischungsimmunisierungen nach einem bevorzugten Zeitplan, der entsprechend, inter alia, dem Antigen, dem Adjuvans (falls vorhanden) und/oder der bestimmten Tierspezies variiert werden kann. Die Immunreaktion kann durch periodischen Aderlass des Tieres, Abtrennen des Serums aus dem gesammelten Blut und Analysieren des Serums in einem Immunoassay, wie zum Beispiel einem ELISA oder Ouchterlony-Diffusionsassay oder ähnlichem zum Bestimmen des spezifischen Antikörpertiters überwacht werden. Sobald einmal ein Antikörpertiter etabliert ist, können die Tiere periodisch zu Ader gelassen werden, um das polyklonale Antiserum zu sammeln. Polyklonale Antikörper, die spezifisch an das DSP-3- Polypeptid oder Peptid binden, können dann aus einem solchen Antiserum gereinigt werden, zum Beispiel durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Protein A oder dem DSP-3-Polypeptid, das auf einem geeigneten festen Träger immobilisiert ist.
Monoklonale Antikörper, die spezifisch an DSP-3 (oder die alternativen Formen der DSP-3) Polypeptide, oder Fragment oder Varianten davon binden, und Hybridoma, die unsterbliche eukaryotische Zelllinien darstellen, die monoklonale Antikörper mit der gewünschten Bindungsspezifität herstellen, können ebenfalls, zum Beispiel unter Verwendung der Technik von Kohler und Milstein (Nature, 256: 495-497; 1976, Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1975)) und Verbesserungen dazu, hergestellt werden. Ein Tier – zum Beispiel eine Ratte, Hamster oder bevorzugt eine Maus – wird mit einem DSP-3-Immunogen, das wie weiter oben beschrieben hergestellt wird, immunisiert. Lymphoide Zellen, die antikörperbildende Zellen einschließen, für gewöhnlich Milzzellen, werden von einem immunisierten Tier erhalten und können durch Fusion mit einem arzneimittelempfindlichen Myeloma- (z.B. Plasmazytoma) Zellfusionspartner, bevorzugt einem, der isogenetisch zu dem immunisierten Tier ist und der wahlweise andere wünschenswerte Eigenschaften aufweist (z.B. die Unfähigkeit endogene Ig-Genprodukte zu exprimieren), unsterblich gemacht werden. Die lymphoiden (z.B. Milz) Zellen und die Myelomazellen können für ein paar Minuten mit einem membranfusionsfördernden Mittel, wie zum Beispiel Polyethylenglycol oder einem nicht ionischen Detergenz, kombiniert werden und dann bei geringer Dichte auf einem selektiven Medium, das das Wachstum von Hybridomazellen, jedoch nicht von unfusionierten Myelomazellen fördert, plattiert werden. Ein bevorzugtes Selektionsmedium ist HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin). Nach einem ausreichenden Zeitraum, für gewöhnlich nach etwa ein bis zwei Wochen, können Zellkolonien beobachtet werden. Einzelne Kolonien werden isoliert und die Antikörper, die durch diese Zellen erzeugt werden, können auf ihre Bindungsaktivität gegenüber dem DSP-3-Polypeptid oder Varianten oder Fragmenten davon getestet werden. Hybridoma, die monoklonale Antikörper mit hoher Affinität und Spezifität für ein DSP-3-Antigen erzeugen, werden bevorzugt. Hybridoma, die monoklonale Antikörper erzeugen, die spezifisch an ein DSP-3-Polypeptid oder einer Variante oder ein Fragment davon binden, werden daher von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Monoklonale Antikörper können aus den Überständen von Hybridomakulturen isoliert werden. Ein alternatives Verfahren zum Herstellen eines murinen monoklonalen Antikörpers ist das Injizieren der Hybridomazellen in die Peritonealhöhle einer isogenen Maus, zum Beispiel einer Maus, die so behandelt worden ist (z.B. Pristan-primed), um die Bildung von Aszitesflüssigkeit, die den monoklonalen Antikörper enthält, zu fördern. Kontaminanten können aus der nachfolgend (für gewöhnlich innerhalb von 1-3 Wochen) geernteten Aszitisflüssigkeit durch konventionelle Techniken, wie zum Beispiel Chromatographie, Gelfiltration, Präzipitation, Extraktion oder ähnlichem entfernt werden. Zum Beispiel können Antikörper durch Affinitätschromatographie mittels eines geeigneten Liganden, der basierend auf bestimmten Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers ausgewählt wird (z.B. H- oder L-Kette-Isotyp, Bindungsspezifität, etc.), gereinigt werden. Beispiele für einen geeigneten Liganden, der auf einem festen Träger immobilisiert ist, schließen Protein A, Protein G, einen anti-konstanten Bereich (L-Kette oder H-Kette) Antikörper, einen anti-idiotypischen Antikörper, ein DSP-3-Polypeptid, oder Fragment oder eine Variante davon ein.
Humane monoklonale Antikörper können durch irgendeine Technik mit der der Fachmann auf dem Gebiet vertraut ist, erzeugt werden. Solche Verfahren schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf die Epstein-Bar-Virus- (EBV) Transformation von humanen peripheralen Blutzellen (z.B., die die B-Lymphozyten enthalten), in vitro Immunisierung von humanen B-Zellen, Fusion von Milzzellen aus immunisierten transgenen Mäusen, die humane Immunoglobulingene tragen, die durch künstliche Hefe Chromosomen (YAC) eingefügt wurden, Isolation aus humanen Immunoglobulin Phagenbanken des V-Bereichs oder anderen Verfahren, wie sie im Stand der Technik bekannt sind und auf der Offenbarung hierin basieren, erzeugt werden.
Zum Beispiel schließt ein Verfahren zum Erzeugen humaner monoklonaler Antikörper, das immortalisieren von humanen peripheralen Blutzellen durch EBV-Transformation ein. Siehe, z.B. U.S. Patent Nr. 4,464,456. Eine immortalisierte Zelllinie, die einen monoklonalen Antikörper erzeugt, der spezifisch an ein DSP-3-Polypeptid (oder eine Variante oder Fragment davon) bindet, kann durch Immunodetektionsverfahren, wie hierin bereitgestellt, identifiziert werden, zum Beispiel einem ELISA, und dann durch Standardklonierungstechniken isoliert werden. Ein anderes Verfahren zum Erzeugen humaner monoklonaler Antikörper, die in vitro Immunisierung, schließt das Primen von humanen Milz-B-Zellen mit Antigen ein, gefolgt von der Fusion geprimter B-Zellen mit einem heterohybriden Fusionspartner. Siehe, z.B. Boerner et al., 1991 J. Immunol. 147: 86-95.
Ein noch anderes Verfahren zum Generieren von humanen DSP-3-spezifischen monoklonalen Antikörpern und polyklonalen Antiserum für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung betrifft transgene Mäuse. Siehe, z.B. U.S. Patent Nr. 5,877,397; Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58; Jakobovits et al., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: 525-35. Bei diesen Mäusen wurden humane Immunoglobulin H- und L-Ketten-Gene künstlich durch genetische Manipulation in die Keimbahnkonfiguration eingebracht und die endogenen murinen Immunoglobulingene inaktiviert. Siehe, z.B., Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58. Zum Beispiel können humane Immunoglobulintransgene Minigenkonstrukte oder Transloci auf künstlichen Hefechromosomen sein, die eine B-Zellen spezifische DNA Umordnung und Hypermutation im Mäuse-Lymphoidengewebe durchlaufen. Siehe, Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58. Humane monoklonale Antikörper, die spezifisch an DSP-3 binden, können durch Immunisieren der transgenen Tiere, Fusionieren der Milzzellen mit Myeolomazellen, Auswählen und dann Klonieren von Zellen, die Antikörper produzieren, wie weiter oben beschrieben, erhalten werden. Polyklonales Serum, das humane Antikörper enthält, kann auch aus dem Blut der immunisierten Tiere erhalten werden.
Chimäre Antikörper, die für DSP-3 spezifisch sind, einschließlich humanisierter Antikörper, können ebenfalls gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt werden. Ein chimärer Antikörper hat mindestens eine Domäne eines konstanten Bereiches, die von einer ersten Säugetierspezies abstammt und mindestens eine Domäne eines variablen Bereichs, die von einer zweiten, anderen Säugetierspezies abstammt. Siehe, z.B. Morrison et. al., 1984 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-55. In bevorzugten Ausführungsformen kann ein chimärer Antikörper durch Klonieren der Polynukleotidsequenz, die für mindestens eine Domäne eines variablen Bereichs kodiert, die von einem nicht humanen monoklonalen Antikörper abstammt, wie zum Beispiel der variable Bereich eines Antikörpers, der von einer Maus, einer Ratte oder einem Hamster abstammt, in einen Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz enthält, die für mindestens einen humanen konstanten Bereich kodiert, konstruiert werden. Siehe, z.B. Shin et al., 1989 Methods Enzymol. 178: 459-76; Walls et al., 1993 Nucleic Acids Res. 21: 2921-29. Als Beispiel kann die Polynukleotidsequenz, die für den variablen Bereich der L-Kette eines murinen monoklonalen Antikörpers kodiert in einen Vektor eingesetzt werden, der eine Nukleinsäuresequenz enthält, die für die Sequenz des konstanten Bereiches der L-Kette von humanem Kappa kodiert. In einem separaten Vektor kann die Polynukleotidsequenz, die für den variablen Bereich der H-Kette des monoklonalen Antikörpers kodiert in den Leserahmen mit den Sequenzen, die für den konstanten Bereich des humanen IgG1 kodieren, kloniert werden. Der jeweilige ausgewählte humane konstante Bereich kann von den Effektorfunktionen abhängen, die für den jeweiligen Antikörper gewünscht sind (z.B. Komplementfixierung, Bindung an einen bestimmten Fc-Rezeptor, etc.). Ein anderes im Stand der Technik bekannte Verfahren zum Erzeugen chimärer Antikörper ist die homologe Rekombination (z.B. U.S. Patent Nr. 5,482,856). Die Vektoren werden besonders in eukaryotische Zellen zur stabilen Expression der chimären Antikörper transfiziert.
Ein nicht-humaner/humaner chimärer Antikörper kann weiter genetisch manipuliert werden, um "humanisierte" Antikörper zu erzeugen. Ein derart humanisierter Antikörper kann eine Vielzahl von CDR's umfassen, die von einem Immunoglobulin einer nicht humanen Säugetierspezies, mindestens einem humanen variablen Strukturbereich und mindestens einem humanen konstanten Bereich des Immunoglobulin abstammen. Die Humanisierung kann in bestimmten Ausführungsformen einen Antikörper bereitstellen, der eine verringerte Bindungsaffinität für DSP-3 aufweist, wenn man ihn zum Beispiel entweder mit einem nicht humanen monoklonalen Antikörper vergleicht, von dem ein DSP-3 bindender variabler Bereich erhalten wurde oder einen chimären Antikörper mit einem derartigen V-Bereich und mindestens einen humanen C-Bereich, wie weiter oben beschrieben. Nützliche Strategien zum Entwerfen humanisierter Antikörper können daher zum Beispiel, als Illustration und nicht zur Begrenzung, die Identifikation humaner variabler Strukturbereiche, die am homologsten zu den nicht humanen Strukturbereichen des chimären Antikörpers sind, einschließen. Ohne den Wunsch durch eine Theorie gebunden zu sein, kann eine solche Strategie die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass der humanisierte Antikörper eine spezifische Bindungsaffinität für DSP-3 beibehält, die in einigen bevorzugten Ausführungsformen im Wesentlichen die gleiche Affinität für ein DSP-3-Polypeptid, oder eine Variante oder ein Fragment davon haben wird und in bestimmten anderen bevorzugten Ausführungsformen eine größere Affinität für DSP-3 haben kann. Siehe. z.B. Jones et al., 1986 Nature 321: 522-25; Riechmann et al., 1988 Nature 332: 323-27. Das Entwerfen eines solchen humanisierten Antikörpers kann daher die Bestimmung der CDR-Schleifenkonformationen und der strukturellen Determinanten der nicht humanen variablen Bereiche einschließen, zum Beispiel durch Computermodellierung, und anschließendes Vergleichen der CDR-Schleifen und Determinanten mit bekannten humanen CDR-Schleifenstrukturen und Determinanten. Siehe, z.B. Padlan et al., 1995 FASEB 9: 133-39; Chothia et al., 1989 Nature, 342: 377-383. Die Computermodellierung kann auch verwendet werden, um menschliche strukturelle Matrizen, die aufgrund der Sequenzhomologie mit nicht menschlichen variablen Bereichen ausgewählt werden, zu vergleichen. Siehe, z.B. Bajorath et al., 1995 Ther. Immunol. 2: 95-103; EP-0578515-A3.
Wenn das humanisieren der nicht menschlichen CDR's zur Verringerung bei der Bindungsaffinität führt, kann die Computermodellierung beim Identifizieren spezifischer Aminosäurereste behilflich sein, die durch ortsgerichtet oder andere Mutagenesetechniken verändert werden könnten, um die Affinität teilweise, vollständig oder supra-optimal (d.h. Erhöhen auf ein Niveau, das größer ist als das des nicht humanisierten Antikörpers) wiederherzustellen. Der Fachmann auf diesem Gebiet ist mit diesen Techniken vertraut und wird zahlreiche Veränderungen und Modifikationen derartiger Designstrategien ausführen können.
In bestimmten Ausführungsformen kann die Verwendung von antigenbindenden Fragmenten von Antikörpern bevorzugt sein. Solche Fragmente schließen Fab-Fragmente oder F(ab')₂-Fragmente ein, die man durch proteolytischen Verdau mit Papain bzw. Pepsin herstellen kann. Die antigenbindenden Fragmente können von den Fc-Fragmenten durch Affinitätschromatographie zum Beispiel unter Verwendung von immobilisiertem Protein A, oder Protein G, oder immobilisiertem DSP-3-Polypeptid, oder geeigneten Varianten oder Fragmenten davon abgetrennt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kann routinemäßig und ohne übermäßiges Experimenten basierend auf der Charakterisierung von affinitätsgereinigten Antikörpern, die zum Beispiel unter Verwendung von Immunodetektionsverfahren, wie hierin bereitgestellt, erhalten wurden, bestimmen, was eine geeignete Variante oder Fragment ist. Ein alternatives Verfahren zum Erzeugen von Fab-Fragmenten, schließt die milde Reduktion von F(ab')₂-Fragmenten, gefolgt von einer Alkylierung, ein. Siehe, z.B. Weir, Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston.
Nach bestimmten Ausführungsformen können nicht humane, humane oder humanisierte variable Bereiche der H-Kette und der L-Kette von einem der oben beschriebenen Ig-Moleküle als Einzelketten Fv(sFv)-Polypeptidfragmente (einzelkettige Antikörper) konstruiert werden. Siehe, z.B. Bird et al., 1988 Science 242: 423-426; Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883. Multifunktionale sFv-Fusionsproteine können durch Verknüpfen einer Polynukleotidsequenz, die für ein sFv-Polypeptid kodiert, im Leserahmen mit mindestens einer Polynukleotidsequenz, die für eines aus einer Vielzahl von bekannten Effektorproteinen kodiert, erzeugt werden. Diese Verfahren sind im Stand der Technik bekannt und offenbart, zum Beispiel in EP-B1-0318554, U.S. Patent Nr. 5,132,405, U.S. Patent Nr. 5,091,513 und U.S. Patent Nr. 5,476,786. Als Beispiel können Effektorproteine Sequenzen konstanter Bereiche des Immunoglobulins einschließen. Siehe, z.B. Hollenbaugh et al., 1995 J. Immunol. Methods 188: 1-7. Andere Beispiel für Effektorproteine sind Enyzme. Als nicht begrenzendes Beispiel kann ein solches Enzym eine biologische Aktivität für therapeutische Zwecke bereitstellen (siehe, z.B. Siemers et al., 1997 Bioconjug. Chem. 8: 510-19) oder kann eine nachweisbare Aktivität bereitstellen, wie zum Beispiel die durch die Meerrettichperoxidase katalysierte Umwandlung eines von vielen bekannten Substraten in ein nachweisbares Produkt für diagnostische Verwendungen. Noch andere Beispiele für sFv-Fusionsproteine schließen Ig-Toxin-Fusionen oder Immunotoxine ein, wobei das sFv-Polypeptid mit einem Toxin verknüpft ist. Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass eine große Vielzahl von Polypeptidsequenzen identifiziert worden sind, die unter geeigneten Bedingungen für Zellen toxisch sind. Wie hierin verwendet kann ein Toxin-Polypeptid für den Einbau in ein Immunoglobulin-Toxin-Fusionsprotein irgendein Polypeptid sein, das auf eine Art und Weise in eine Zelle eingebaut werden kann, die das Überleben der Zelle, zum Beispiel durch direktes Interferieren mit einer vitalen Funktion oder durch induzierte Apoptose, beeinträchtigt wird. Toxine können daher zum Beispiel Ribosomen-inaktivierende Proteine einschließen, wie zum Beispiel das Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A, Pflanzen-Gelonin, Bryodin von Bryonia dioica oder ähnliche. Siehe, z.B., Thrush et al., 1996 Annu. Rev. Immunol. 14: 49-71; Frankel et al., 1996 Cancer Res. 56: 926-32. Zahlreiche andere Toxine, einschließlich chemotherapeutischer Mittel, antimethodischer Mittel, Antibiotika, Apoptoseinduzierer (oder "Apoptogene", siehe, z.B. Green und Reed, 1998, Science 281: 1309-1312) oder ähnliches, sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und die Beispiele, die hierin bereitgestellt werden, sollen der Illustration dienen und nicht den Schutzumfang und den Geist der Erfindung begrenzen.
Das sFv kann in bestimmten Ausführungsformen mit Peptid- oder Polypeptid-Domänen fusioniert sein, die einen Nachweis einer spezifischen Bindung zwischen dem Fusionsprotein und einem Antigen ermöglichen (z.B. ein DSP-3). Zum Beispiel kann das Fusionspolypeptid ein Affinitäts-Tag-Polypeptid sein. Das Binden des sFv-Fusionsproteins an einem Bindungspartner (z.B. einem DSP-3) kann daher unter Verwendung eines Affinitätspolypeptides oder Peptid-Tags, wie zum Beispiel einem Avidin, Streptavidin oder einem His (z.B. Polyhistidin)-Tag durch eines aus einer Vielzahl von Techniken, mit denen der Fachmann auf dem Gebiet vertraut ist, nachgewiesen werden. Die Nachweistechniken können zum Beispiel auch die Bindung eines Avidin- oder Streptavidinfusionsproteins an Biotin oder an eine Biotin-mimetische Sequenz (siehe, z.B. Luo et al. 1998 J. Biotechnol. 65: 255 und die darin zitierten Dokumente), die direkte kovalente Modifikation eines Fusionsproteins mit einem nachweisbaren Rest (z.B. einem Markierungsrest), die nicht kovalente Bindung des Fusionsproteins mit einem spezifisch markierten Reportermolekül, die enzymatische Modifikation eines nachweisbaren Substrates durch ein Fusionsprotein, das einen Abschnitt mit einer Enzymaktivität einschließt, oder die Immobilisierung (kovalent oder nicht kovalent) des Fusionsproteins auf einem Festphasenträger einschließen.
Das sFv-Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung, das ein DSP-3-spezifisches vom Immunoglobulin abstammendes Polypeptid umfasst, das mit einem anderen Polypeptid fusioniert ist, wie zum Beispiel einem Effektorpeptid mit den gewünschten Affinitätseigenschaften, kann daher zum Beispiel ein Fusionsprotein einschließen, wobei das Effektorpeptid ein Enzym ist, wie zum Beispiel die Glutathion-S-Transferase. Als anderes Beispiel können sFv-Fusionsproteine auch ein DSP-3-spezifisches Ig-Polypeptid umfassen, dass mit einem Staphylococcus aureus Protein A Polypeptid fusioniert ist; für Protein A kodierende Nukleinsäuren und ihre Verwendung beim Konstruieren von Fusionsproteinen mit einer Affinität für konstante Bereiche vom Immunoglobulin werden allgemein zum Beispiel im U.S. Patent Nr. 5,100,788 offenbart. Andere verwendbare Affinitätspolypeptide zur Konstruktion von sFv-Fusionsproteinen können Streptavidinfusionsproteine einschließen, wie sie zum Beispiel offenbart werden in WO 89/03422; U.S. 5,489,528; U.S. 5,672,691; WO 93/24631; U.S. 5,168,049; U.S. 5,272,254 und anderswo, und Avidinfusionsproteine (siehe, z.B. EP 511,747 ). Wie hierin bereitgestellt, können sFv-Polypeptidsequenzen mit Fusionspolypeptidsequenzen fusioniert sein, die Effektorproteinsequenzen einschließen, die vollängen Fusionspolypeptide einschließen und die alternativ dazu Varianten oder Fragmente davon enthalten können.
Ein zusätzliches Verfahren zum Auswählen von Antikörpern, die mit einem DSP-3-Polypeptid oder einer Variante oder einem Fragment davon spezifisch binden, ist durch Phagen-Display. Siehe, z.B. Winter et al., 1994 Annul. Rev. Immunol. 12: 433-55; Burton et al., 1994 Adv. Immunol. 57: 191-280. Kombinatorische Banken für humane oder murine Gene variabler Bereiche von Immunoglobulin können in Phagenvektoren erzeugt werden, die für die Auswahl von Ig-Fragmenten (Fab, Fv, sFv oder Multimere davon), die spezifisch mit einem DSP-3-Poylpeptid oder eine Variante oder Fragmenten davon binden, durchmustert werden. Siehe, z.B., U.S. Patent Nr. 5,223,409; Huse et al., 1989 Science 246: 1275-81; Kang et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4363-66; Hoogenboom et al., 1992 J. Molec. Biol. 227: 381-388; Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16: 47-52 und darin zitierte Dokumente. Zum Beispiel kann eine Bank, die eine Vielzahl von Polynukleotidsequenzen enthält, die für Fragmente variabler Bereiche von Ig kodieren, in das Genom eines filamentösen Bakteriophagen, wie zum Beispiel M13 oder einer Variante davon, im Leserahmen mit der Sequenz, die für ein Phagenhüllprotein kodiert, zum Beispiel das Gen III oder das Gen VIII von M13, um ein M13 Fusionsprotein zu erzeugen, eingesetzt werden. Ein Fusionsprotein kann ein Fusionsprotein des Hüllenproteins mit der Domäne des variablen Bereichs der L-Kette und/oder mit der Domäne des variablen Bereichs der H-Kette sein.
Entsprechend bestimmter Ausführungsformen können Fab-Fragmente des Immunoglobulins ebenfalls auf den Phagenpartikel dargestellt werden, wie nachfolgend dargestellt wird. Polynukleotidsequenzen, die für Domänen konstanter Bereiche des Ig kodieren, können in das Phagengenom im Leserahmen mit einem Hüllprotein inseriert werden. Das Phagenhüll-Fusionsprotein kann demnach mit einem Fragment (Fd) der L-Kette oder einer H-Kette des Ig fusioniert werden. Zum Beispiel kann aus einer humanen Ig- Bank die Polynukleotidsequenz, die für den konstanten Bereich des humanen Kappa kodiert, in einen Vektor im Leserahmen mit der Sequenz inseriert werden, die für mindestens eines der Phagenhüllproteine kodiert. Zusätzlich oder alternativ dazu kann die Polynukleotidsequenz, die für die humane IgG1 CH1-Domäne kodiert im Leserahmen mit der Sequenz inseriert werden, die für mindestens ein anderes Phagenhüllprotein kodiert. Eine Vielzahl von Polynukleotidsequenzen, die für Domänen variabler Bereiche kodieren (z.B. aus einer DNA-Bank stammend) können dann in den Vektor im Leserahmen mit den konstanter Bereich-Hüllprotein-Fusionen zur Expression von Fab-Fragmente, die mit einem Bakteriophagenhüllprotein fusioniert sind, eingesetzt werden.
Phagen, die ein Ig-Fragment exhibieren (z.B. ein Ig V-Bereich oder Fab), das mit einem DSP-3-Polypeptid bindet, kann durch Mischen der Phagenbank mit DSP-3, oder einer Variante oder einem Fragment davon oder durch in-Kontakt-bringen der Phagenbank mit einem DSP-3-Polypeptid, das auf einer festen Matrix unter Bedingungen und über einen Zeitraum immobilisiert wurde, die ausreichen, um eine Bindung zu gestatten, ausgewählt werden. Ungebundene Phagen werden durch Waschen entfernt, was üblicherweise einen Puffer beinhaltet, der Salz (z.B. NaCl) bei einer niedrigen Konzentration, bevorzugt bei weniger als 100 mM NaCl, noch bevorzugter bei weniger als 50 mM NaCl, am meisten bevorzugt bei weniger als 10 mM NaCl enthält, oder, alternativ dazu, ein Puffer, der kein Salz enthält. Spezifisch gebundene Phagen werden dann mit einem NaCl-enthaltenden Puffer eluiert, zum Beispiel durch schrittweises Erhöhen der Salzkonzentration. Für gewöhnlich wird ein Phage, der das DSP-3 mit hoher Affinität bindet, für die Freisetzung eine höhere Salzkonzentration erfordern. Eluierte Phagen können in einem geeigneten bakteriellen Wirt weiter vermehrt werden und im Allgemeinen können aufeinander folgenden Runden von DSP-3-Bindung und Elution wiederholt werden, um die Ausbeute an Phagen, der DSP-3-spezifische Immunoglobuline exprimiert, zu erhöhen. Kombinatorische Phagenbanken können ebenfalls zur Humanisierung von nicht humanen variablen Bereichen verwendet werden. Siehe, z.B. Rosok et al., 1996 J. Biol. Chem. 271: 22611-18; Rader et al., 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-15. Die so ausgewählte DNA-Sequenz des inserierten Immunoglobulingens im Phagen kann durch Standardtechniken bestimmt werden. Siehe, Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. Die der Affinität nach ausgewählte Ig-kodierende Sequenz kann dann in einen anderen geeigneten Vektor zur Expression des Ig-Fragmentes kloniert werden oder kann wahlweise zur Expression von ganzen Immunoglobulinketten in einen Vektor kloniert werden, der konstante Bereiche des Ig enthält.
Phagen-Display-Techniken können ebenfalls verwendet um Polypeptide, Peptide oder einzelkettige Antikörper auszuwählen, die mit DSP-3 binden. Für Beispiel von geeigneten Vektoren, die Multiklonierungsstellen aufweisen, in die Kandidaten-Nukleinsäuremoleküle (z.B. DNA), die für solche Peptide oder Antikörper kodieren, eingesetzt werden können, siehe, z.B., McLafferty et al., Gene 128: 29-36, 1993; Scott et al., 1990 Science 249: 386-390, Smith et al., 1993 Methods Enzymol. 217: 228-257; Fisch et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7761-66. Die inserierten DNA-Moleküle können zufällig erzeugte Sequenzen aufweisen oder können für Varianten eines bekannten Peptids oder Polypeptiddomäne kodieren, die an ein DSP-3-Polypeptid, oder eine Variante oder Fragment davon, wie hierin bereitgestellt, spezifisch binden. Im Allgemeinen kodiert das Nukleinsäureinsert für ein Peptid von bis zu 60 Aminosäuren, noch bevorzugter ein Peptid von 3-35 Aminosäuren und noch bevorzugter ein Peptid von 6 bis 20 Aminsäuren. Das Peptid, das durch die eingesetzte Sequenz kodiert wird, wird auf der Oberfläche des Bakteriophagen exhibiert. Ein Phage, der eine Bindungsdomäne für ein DSP-3-Polypeptid exprimiert, kann auf Grundlage der spezifischen Bindung an ein immobilisiertes DSP-3-Polypeptid, wie weiter oben beschrieben, ausgewählt werden. Wie hierin bereitgestellt, können gut bekannte rekombinante genetische Techniken verwendet werden, um Fusionsproteine zu konstruieren, die das Fragment davon enthalten. Zum Beispiel kann ein Polypeptid erzeugt, das ein Tandemarray von zwei oder mehreren ähnlichen oder nicht ähnlichen nach der Affinität ausgewählten DSP-3-Bindungspeptiddomänen umfasst, um die Bindungsaffinität für DSP-3 des sich daraus ergebenden Produktes zu maximieren.
In bestimmten anderen Ausführungsformen umfasst die Erfindung DSP-3 spezifische Antikörper, die multimere Antikörperfragmente sind. Nützliche Methodologien werden im Allgemeinen zum Beispiel von Hayden et al., 1997, Curr Opin. Immunol. 9: 201-12; Coloma et al., 1997 Nat. Biotechnol. 15: 159-63) beschrieben. Zum Beispiel können multimere Antikörper-Fragmente durch Phagentechniken erzeugt werden, um Miniantikörper (U.S. Patent Nr. 5,910,573) oder Diakörper (Holliger et al., 1997, Cancer Immunol. Immunother. 45: 128-130) zu bilden. Es können multimere Fragmente erzeugt werden, die Multimere eines DSP-3-spezifischen Fv sind oder die bispezifische Antikörper sind, die ein DSP-3-spezifisches Fv umfassen, das nicht kovalent mit einem zweiten Fv, das eine andere Antigenspezifität aufweist, verbunden ist. Siehe, z.B. Koelemij et al., 1999 J. Immunother. 22: 514-24. In einem anderen Beispiel kann ein multimerer Antikörper einen bispezifischen Antikörper umfassen, der zwei Einzelkettenantikörper oder Fab-Fragmente aufweist. Entsprechend bestimmter ähnlicher Ausführungsformen kann ein erstes Ig-Fragment für eine erste Antigendeterminante auf einem DSP-3-Polypeptid (oder Variante oder Fragment davon) spezifisch sein, während ein zweites Ig-Fragment für eine zweite Antigendeterminante des DSP-3-Polypeptids spezifisch ist. Alternativ dazu kann in bestimmten anderen ähnlichen Ausführungsformen ein erstes Immunoglobulinfragment spezifisch sein für eine Antigendeterminante auf einem DSP-3-Poylpeptid, oder Variante oder Fragment davon und ein zweites Immunoglobulinfragment kann für eine Antigendeterminante auf einem zweiten, anderen (d.h. nicht-DSP-3) Molekül spezifisch sein. Ebenfalls umfasst sind bispezifische Antikörper, die spezifisch mit DSP-3 binden, wobei mindestens eine antigenbindende Domäne als Fusionsprotein vorhanden ist.
Das Einfügen von Aminosäuremutationen in DSP-3-bindende Immunoglobulinmoleküle kann nützlich sein, um die Spezifität oder Affinität von DSP-3 zu erhöhen oder um eine Effektorfunktion zu verändern. Immunoglobuline mit höherer Affinität für DSP-3 können durch ortsgerichtete Mutagense oder bestimmte Reste erzeugt werden. Computerunterstütze dreidimensionale molekulare Entwürfe können verwendet werden, um die Aminosäurereste, die ausgewechselt werden sollen, zu identifizieren, um die Affinität für das DSP-3-Polypeptid zu verbessern. Siehe, z.B. Mountain et al., 1992, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10: 1-142. Alternativ dazu können kombinatorische Banken von CDR's in M13-Phagen erzeugt werden und auf Immunoglobulinfragmente mit erhöhter Affinität durchmustert werden. Siehe, z.B., Glaser et al., 1992, J. Immunol. 149: 3903-3913; Barbas et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3809-13; U.S. Patent Nr. 5,792,456.
Effektorfunktionen können auch durch ortsgerichtet Mutagense verändert werden. Siehe, z.B. Duncan et al., 1988 Nature 332: 563-64; Morgan et al., 1995 Immunology 86: 319-24; Eghtedarzedeh-Kondri et al., 1997 Biotechniques 23: 830-34.
Zum Beispiel können Mutationen der Glycosylierungsstelle auf dem Fc-Abschnitt des Immunoglobulins die Fähigkeit des Immunoglobulins zum Fixieren des Komplements verändern. Siehe, z.B. Wright et al., 1997 Trends Biotechnol. 15: 26-32. Andere Mutationen in den konstanten Bereichsdomänen können die Fähigkeit des Immunoglobulins zum Fixieren des Komplements oder zum Bewirken der Antikörper abhängigen zellulären Cytotoxizität verändern. Siehe, z.B. Duncan et al., 1988 Nature 332: 563-64; Morgan et al., 1995 Immunology 86: 319-24; Sensel et al., 1997 Mol. Immunol. 34: 1019-29.
Die Nukleinsäuremoleküle, die einen Antikörper oder ein Fragment davon kodieren, das spezifisch mit DSP-3 bindet, wie hierin beschrieben, können vermehrt werden und gemäß einer aus einer Vielzahl von gut bekannten Verfahren zur Nukleinsäureexcision, Ligation, Transformation und Transfektion exprimiert werden. Demnach kann in bestimmten Ausführungsformen die Expression eines Antikörperfragmentes in einem prokaryotischen Wirt bevorzugt sein, wie zum Beispiel Escherichia coli (siehe, z.B. Pluckthun et al., 1989 Methods Enzymol. 178: 497-515). In bestimmten anderen Ausführungsformen kann die Expression des Antikörpers oder eines Fragmentes davon in einer eukaryotischen Wirtszelle bevorzugt sein, einschließlich Hefe (z.B. Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe und Pichia pastoris), Tierzellen (einschließlich Säugetierzellen) oder Pflanzenzellen. Beispiele für geeignete Tierzellen schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Myeloma, COS, CHO oder Hybridomazellen. Beispiele für Pflanzenzellen schließen Tabak, Mais, Sojabohnen und Reiszellen ein. In Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind und basierend auf der vorliegenden Offenbarung, kann ein Nukleinsäurevektor zur Expression fremder Sequenzen in einem bestimmten Wirtsystem entworfen werden, und dann können Polynukleotidsequenzen, die für einen DSP-3-bindenden Antikörper (oder Fragment davon) kodieren, eingesetzt werden. Die regulatorischen Elemente werden gemäß dem jeweiligen Wirt variieren.
Ein an DSP-3 bindendes Immunoglobulin (oder Fragment davon), wie hierin beschrieben, kann einen nachweisbaren Rest oder Marker, wie zum Beispiel ein Enzym, ein cytotoxisches Mittel oder ein anderes Reportermolekül, einschließlich eines Farbstoffes, eines Radionuklides, einer Lumineszenzgruppe, einer Fluoreszenzgruppe, oder Biotin oder ähnliches enthalten. Das DSP-3-spezifische Immunoglobulin oder Fragment davon kann für die Diagnose oder therapeutische Anwendungen radioaktiv markiert sein. Techniken zur radioaktiven Markierung von Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt. Siehe, z.B. Adams 1998 In Vivo 12: 11-21; Hiltunen 1993 Acta Oncol. 32: 831-9. Therapeutische Anwendungen werden weiter unten im Detail beschrieben und können die Verwendung des DSP-3-bindenden Antikörpers (oder Fragment davon) in Verbindung mit anderen therapeutischen Mitteln einschließen. Der Antikörper oder das Fragment können auch mit einem cytotoxischen Mittel, wie es im Stand der Technik bekannt ist und hierin bereitgestellt wird, konjugiert werden, zum Beispiel mit einem Toxin, wie zum Beispiel einem Ribosomen inaktivierenden Protein, einem chemotherapeutischen Mittel, einem anti-mitotischen Mittel, einem Antibiotikum oder ähnlichem.
Die Erfindung umfasst auch das Erzeugen der anti-idiotypischen Antikörper, die einen Antikörper wiedererkennen (oder ein antigenbindendes Fragment davon), derr mit DSP-3, wie hierin bereitgestellt, oder eine Variante oder einem Fragment davon spezifisch bindet. Anti-idiotypische Antikörper können als polyklonale Antikörper oder als monoklonale Antikörper durch hierin beschriebene Verfahren unter Verwendung eines Anti-DSP-3-Antikörpers (oder Antigen bindendes Fragment davon) als Immunogen erzeugt werden. Anti-idiotypische Antikörper oder Fragmente davon können auch durch irgendeine, der oben beschriebenen, rekombinanten genetischen Manipulationsverfahren oder durch Auswahl mittels Phagen-Display erzeugt werden. Ein anti-idiotypischer Antikörper kann mit der Antigenbindungsstelle des Anti-DSP-3-Antikörpers reagieren, so dass das Binden des Anti-DSP-3-Antikörpers an ein DSP-3-Polypeptid kompetitiv inhibiert wird. Alternativ dazu kann ein anti-idiotypischer Antikörper, wie hierin bereitgestellt, die Bindung eines Anti-DSP-3-Antikörpers an ein DSP-3-Polypeptid nicht kompetitiv hemmen.
Wie hierin bereitgestellt und gemäß der Methodologie, die im Stand der Technik bekannt ist, können polyklonale und monoklonale Antikörper für die Affinitätsisolation von DSP-3-Polypeptiden verwendet werden. Siehe, z.B. Hermanson et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, Inc. New York, 1992. Kurz gesagt, kann ein Antikörper (oder ein antigenbindendes Fragment davon) auf einem festen Trägermaterial immobilisiert werden, das dann mit einer Probe in Kontakt gebracht wird, die das gesuchte Polypeptid (z.B. DSP-3) umfasst. Nach der Abtrennung des Restes der Probe wird das Polypeptid dann vom immobilisierten Antikörper freigesetzt.
VERFAHREN ZUM DETEKTIEREN DER DSP-3-EXPRESSION
Bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung stellen Verfahren bereit, die für die Diagnose und Assayzwecke Antikörper verwenden, die gegen DSP-3 (oder alternative Form des DSP-3) oder hybridisierende Polynukleotide gerichtet sind. Bestimmte Assays schließen das Vewenden eines Antikörpers oder eines anderen Mittels zum Nachweisen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von DSP-3 (oder die alternative Form des DSP-3) oder der proteolytische Fragmente davon ein. Alternativ dazu kann die Nukleinsäure, die für DSP-3 (oder die alternative Form des DSP-3) kodiert, unter Verwendung von Standardhybridisierungs- und/oder PCR-Techniken nachgewiesen werden. Geeignete Sonden und Primer können vom Fachmann auf dem Gebiet basierend auf der DSP-3 (oder der alternativen Form der DSP-3) cDNA-Sequenz, die hierin bereitgestellt wird, entworfen werden. Assays können im Allgemeinen unter Verwendung einer aus einer Vielzahl von Proben, die aus einer biologischen Quelle, wie zum Beispiel eukaryotischen Zellen, Bakterien, Viren, Extrakten, die aus solchen Organismen hergestellt werden und Flüssigkeiten, die in lebenden Organismen gefunden werden, durchgeführt werden. Biologische Proben, die von einem Patienten erhalten werden können, schließen Blutproben, Biopsyproben, Gewebeexplantate, Organkulturen und anderes Gewebe oder Zellpräparationen ein. Ein Patient oder eine biologische Quelle kann ein menschliches oder ein nicht menschliches Tier sein, eine primäre Zellkultur oder. eine an eine Kultur angepasste Zelllinie, die einschließt, jedoch nicht begrenzt ist auf genetisch manipulierte Zelllinien, die chromosomal integrierte oder episomal rekombinante Nukleinsäuresequenz enthalten, immortalisierte oder immortalisierbare Zelllinien, somatische Zellhybridzelllinien, differenzierte oder differenzierbare Zelllinien, transformierte Zelllinien und ähnliches. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist der Patient oder die biologische Quelle ein Mensch und in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die biologische Quelle ein nicht menschliches Tier, das ein Säugetier ist, zum Beispiel ein Nagetier (z.B. Maus, Ratte, Hamster etc.), ein Huftier (z.B. Rind) oder ein nicht-humaner Primat. In bestimmten anderen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird entweder bei einem Patienten vermutet, dass er eine Erkrankung hat oder zumindest ein Risiko dafür trägt, dass er eine Erkrankung hat, die mit einer veränderten zellulären Signaltransduktion im Zusammenhang steht, oder es kann bekannt sein, dass er frei von jedwedem Risiko oder der Anwesenheit einer solchen Erkrankung ist.
Zum Detektieren des DSP-3 (oder der alternativen Formen des DSP-3) Proteins ist das Reagenz für gewöhnlich ein Antikörper, der wie weiter unten beschrieben hergestellt werden kann. Es gibt eine Vielzahl von Assayformaten, die dem Fachmann auf dem Gebiet für die Verwendung eines Antikörpers zum Nachweisen eines Polypeptids in einer Probe gut bekannt sind. Siehe, z.B. Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Zum Beispiel kann das Assay in einem Western-Blot-Format durchgeführt werden, wobei eine Proteinpräparation aus der biologischen Probe durch Gelelektrophorese aufgetrennt wird, auf eine geeignete Membran übertragen wird und man sie dann mit dem Antikörper reagieren läßt. Die Gegenwart des Antikörpers auf der Membran kann dann mittels eines geeigneten Detektionsreagenzes, wie weiter unten beschrieben, nachgewiesen werden.
In einer anderen Ausführungsform schließt das Assay die Verwendung eines Antikörpers ein, der auf einem festen Träger immobilisiert wurde, um mit dem Ziel-DSP-3 (oder der alternativen Formen des DSP-3) zu binden, und es vom Rest der Probe zu entfernen. Das gebundene DSP-3 kann dann unter Verwendung eines zweiten Antikörpers oder Reagenzes, das eine Reportergruppe enthält, nachgewiesen werden. Alternativ dazu kann ein kompetitives Assay verwendet werden, in dem ein DSP-3 (oder eine alternative Form des DSP-3) -Polypeptid mit einer Reportergruppe markiert ist und es diesem ermöglicht wird mit dem immobilisierten Antikörper nach der Inkubation des Antikörpers mit der Probe zu binden. Das Ausmaß, mit dem die Komponenten der Probe die Bindung des markierten Polypeptids mit dem Antikörper hemmen, ist ein Zeichen für die Reaktivität der Probe mit dem immobilisierten Antikörper und als Resultat daraus ein Hinweis auf das DSP-3-Niveau (oder der alternativen Form des DSP-3) in der Probe.
Der feste Träger kann irgendein Material sein, das dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, an das der Antikörper gebunden werden kann, wie zum Beispiel eine Testkammer in einer Mikrotiterplatte, ein Nitrozellulosefilter oder eine andere geeignete Membran. Alternativ dazu kann der Träger ein Kügelchen oder eine Scheibe, wie zum Beispiel Glas, Fiberglas, Latex oder ein Kunststoff, wie zum Beispiel Polystyren oder Polyvinylchlorid sein. Der Antikörper kann auf einem festen Träger unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind und die ausführlich im Patent und in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben sind, immobilisiert werden.
In bestimmten Ausführungsformen ist das Assay zum Detektieren von DSP-3 (oder der alternativen Formen des DSP-3) in einer Probe ein Zwei-Antikörper-Sandwichassay. Dieses Assay kann durchgeführt werden indem als erstes ein Antikörper, der auf einem festen Träger immobilisiert worden ist, für gewöhnlich in der Kammer einer Mikrotiterplatte, mit der die biologischen Probe in Kontakt gebracht werden, so dass das DSP-3 (oder die alternativen Formen des DSP-3) innerhalb der Probe die Möglichkeit bekommt mit dem immobiliisierten Antikörper zu binden (eine 30 min Inkubationszeit bei Raumtemperatur ist im Allgemeinen ausreichend). Die ungebundene Probe wird dann von den immobilisierten DSP-3/Antikörper-Komplexen entfernt und ein zweiter Antikörper (der eine Reportergruppe, wie zum Beispiel ein Enzym, Farbstoff, Radionuklid, Lumineszenzgruppe, Fluoreszenzgruppe oder Biotin enthält), der an einer anderen Stelle des DSP-3 binden kann, wird zugegeben. Die Menge des zweiten Antikörpers, der am festen Träger gebunden bleibt, wird dann mittels eines Verfahrens bestimmt, das für die spezifische Reportergruppe geeignet ist. Für radioaktive Gruppen sind die Szintillationszählungen oder audioradiographische Verfahren im Allgemeinen geeignet. Spektroskopische Verfahren können verwendet werden, um Farbstoffe, Lumineszenzgruppe und Fluoreszenzgruppen zu detektieren. Biotin kann unter Verwendung von Avidin, das mit einer anderen Reportergruppe (für gewöhnlich eine radioaktive oder Fluoreszenzgruppe oder ein Enzym) gekoppelt ist, nachgewiesen werden. Enzymreportergruppen können im Allgemeinen durch die Zugabe eines Substrats nachgewiesen werden (im Allgemeinen für einen spezifischen Zeitraum), gefolgt durch Spektroskopie oder einer anderen Analyse der Reaktionsprodukte. Standards und Standardzugaben können verwendet werden, um das Niveau von DSP-3 in einer Probe unter Verwendung gut bekannter Techniken zu bestimmen.
In einem ähnlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Kits zum Nachweisen von DSP-3 und der DSP-3-Phosphataseaktivität bereitgestellt. Solche Kits können entworfen werden, um das Niveau von DSP-3 oder einer Nukleinsäure, die für DSP-3 kodiert, nachzuweisen oder können die Phosphataseaktivität von DSP-3 in einem direkten Phosphataseassay oder einem gekoppelten Phosphataseassay nachweisen. Im Allgemeinen umfassen die Kits der vorliegenden Erfindung einen oder mehrere Behälter-einschließende Elemente, wie zum Beispiel in den Assays zu verwendende Reagenzien oder Puffer.
Ein Kit zum Nachweisen des Niveaus von DSP-3 (oder der alternativen Formen des DSP-3) oder einer Nukleinsäure, die für DSP-3 (oder die alternativen Formen des DSP-3) kodiert, enthält für gewöhnlich ein Reagenz, das mit dem DSP-3- Protein, der DNA oder RNA bindet. Zum Nachweisen von Nukleinsäure, die für DSP-3 kodiert, kann das Reagenz eine Nukleinsäuresonde oder ein PCR-Primer sein. Zum Nachweisen des DSP-3-Proteins ist das Reagenz für gewöhnlich ein Antikörper. Solche Kits enthalten auch eine Reportergruppe, die für den direkten oder indirekten Nachweis des Reagenzes geeignet ist (d.h. die Reportergruppe kann kovalent mit dem Reagenz verbunden sein oder kann mit einem zweiten Molekül, wie zum Beispiel Protein A, Protein G, Immunoglobulin oder Lectin, das wiederum selbst mit dem Reagenz binden kann, verbunden sein). Geeignete Reportergruppen schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Enzyme (z.B. Meerrettichperoxidase), Substrate, Kofaktoren, Inhibitoren, Farbstoffe, Radionuklide, Lumineszenzgruppen, Fluoreszenzgruppen und Biotin. Solche Reportergruppen können verwendet werden, um das Binden des Reagenzes an eine Probenkomponente unter Verwendung von dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannten Verfahren direkt oder indirekt nachzuweisen.
Kits zum Nachweisen der DSP-3-Aktivität umfassen für gewöhnlich ein DSP-3-Substrat in Kombination mit einem geeigneten Puffer. Die DSP-3-Aktivität kann durch das Durchführen eines Immunopräzipitationsschritts mit einem DSP-3-spezifischen Antikörper vor dem Durchführen eines Phosphataseasssys, wie weiter oben beschrieben, spezifisch nachgewiesen werden. Andere Reagenzien für die Verwendung zum Nachweisen der Dephosphorylierung von Substrat können ebenfalls bereitgestellt werden.
Innerhalb bestimmter diagnostischer Assays kann eine proliferative Störung in einem Patienten oder irgendeinem anderen biologischen Quellorganismus, wie hierin bereitgestellt, basierend auf dem Vorhandensein von verändertem DSP-3 (oder der alternativen Formen des DSP-3) oder einem veränderten DSP-3-Expressionsnivau, nachgewiesen werden. Zum Beispiel kann ein Antikörper zwischen einem Wildtyp DSP-3 und einem veränderten DSP-3 mit einer Variation in der Aminosäuresequenz unterscheiden. Eine solche Abweichung kann ein Hinweis für das Vorhandensein einer proliferativen Störung oder für die Anfälligkeit für eine solche Erkrankung sein. Hybridisierungs- und Amplikationstechniken können ähnlich verwendet werden, um modifizierte DSP-3-Sequenzen nachzuweisen.
VERFAHREN ZUM IDENTIFIZIEREN VON MODULATOREN DER DSP-3-AKTIVITÄT
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können DSP-3 (oder der alternativen Formen der DSP-3) -Polypeptide zum Identifizieren von Mitteln verwendet werden, die die DSP-3-Aktivität modulieren. Solche Mittel können die Signaltransduktion über eine MAP-Kinasekaskade inhibieren oder verstärken, was zur Zellproliferation führt. Ein Mittel, das die DSP-3-Aktivität moduliert (z.B. Erhöhen oder Verringern in einer statistisch signifikanten Weise), kann die Expression und/oder Stabilität von DSP-3, die DSP-3-Proteinaktivität und/oder die Fähigkeit von DSP-3 ein Substrat zu dephosphorylieren, verändern. Mittel nach denen innerhalb eines solchen Assays gesucht werden kann, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Antikörper und antigenbindende Fragmente davon, konkurrierenden Substrate oder Peptide, die zum Beispiel eine katalytische Stelle oder ein duales Phosphorylierungsmotiv repräsentieren, Antisense-Polynukleotide und Ribozyme, die mit der Transkription und/oder Translation von DSP-3 interferieren, und andere natürliche und synthetische Moleküle, für zum Beispiel kleine Inhibitoren, die an DSP-3 binden und es inaktivieren.
Kandidatenmittel für die Verwendung in einem Verfahren zum Durchmustern auf einen Modulator von DSP-3 gemäß der vorliegenden Erfindung können als "Banken" oder Sammlungen von Verbindungen, Zusammensetzungen oder Molekülen bereitgestellt werden. Solche Moleküle schließen für gewöhnlich Verbindungen ein, die im Stand der Technik als "kleine Moleküle" bekannt sind und ein Molekulargewicht aufweisen, das geringer ist als 10⁵ Dalton, bevorzugt geringer als 10⁴ Dalton und immer noch bevorzugt geringer als 10³ Dalton. Zum Beispiel können Mitglieder einer Bank von Testverbindung zu einer Vielzahl von Proben zugegeben werden, wobei jede mindestens ein DSP-3 (oder eine alternative Form des DSP-3) -Polypeptid, wie hierin bereitgestellt, enthält, und diese können dann auf ihre Fähigkeit untersucht werden, die DSP-3 vermittelte Dephosphorylierung oder die Bindung an ein Substrat zu verstärken oder zu inhibieren. Verbindungen die so als die DSP-3-Funktion beeinflussende Verbindungen identifiziert wurden (z.B. Phosphortyrosin und/oder Phosphorserin/threonin-Dephosphorylierung), sind für therapeutische und/oder diagnostische Zwecke wertvoll, da sie die Behandlung und/oder den Nachweis von Erkrankungen, die mit der DSP-3-Aktivität in Verbindung stehen, ermöglichen. Solche Verbindung sind auch für die Forschung wertvoll, die auf die molekulare Signalgebungsmechanismen gerichtet ist, die DSP-3 einschließen, und für Verbesserungen bei der Entdeckung und Entwicklung von zukünftigen DSP-3-Verbindungen, die eine größere Spezifität zeigen.
Kandidatenmittel können weiter als Mitglieder einer kombinatorischen Bank bereitgestellt werden, die bevorzugt synthetische Mittel einschließt, die gemäß einer Vielzahl von vorher bestimmten chemischen Reaktionen, die in einer Vielzahl von Reaktionsgefäßen durchgeführt werden, hergestellt worden sind. Zum Beispiel können verschiedene Starter-Verbindungen unter Verwendung einer oder mehrerer Festphasensynthesen, verzeichneten zufälligen Mischmethodologien und verzeichneten Reaktionssplittechniken, die es einem bestimmten Konstituenten ermöglicht eine Vielzahl von Permutationen und/oder Kombinationen von Reaktionsbedingungen nachweisbar zu durchlaufen, hergestellt werden. Die sich daraus ergebenden Produkte umfassen eine Bank, die durchmustert werden kann, gefolgt von einer schrittweisen Auswahl und Syntheseverfahren, wie zum Beispiel einer synthetisch, kombinatorischen Bank von Peptiden (siehe, z.B. PCT/US91/08694, PCT/US91/04666, die hiermit hierin in ihrer Gänze mit aufgenommen werden) oder andere Zusammensetzungen, die kleine Moleküle, die hierin bereitgestellt werden, einschließen können (siehe, z.B. PCT/US94/08542, EP 0774464 , U.S. 5,798,035, U.S. 5,789,172, U.S. 5,751,629, die hierin in ihrer Gänzen mit aufgenommen werden). Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass diverse Mischungen solcher Bibliotheken gemäß etablierter Verfahren hergestellt werden können und unter Verwendung von DSP-3 gemäß der vorliegenden Offenbarung getestet werden können.
In bestimmten Ausführungsformen können modulierende Mittel durch Kombinieren eines Kandidatenmittels mit einem DSP-3 (oder einer alternativen Form des DSP-3) -Polypeptid oder einem Polynukleotid, das für ein solches Polypeptid kodiert, in vitro oder in vivo identifiziert werden und der Effekt des Kandidatenmittels auf die DSP-3-Phosphataseaktivität kann zum Beispiel unter Verwendung eines repräsentativen Assays, das hierin beschrieben wird, ausgewertet werden. Eine Erhöhung oder Verringerung in der Phosphataseaktivität kann durch Durchführen eines repräsentativen Assays, das hierin bereitgestellt wird, in Gegenwart oder in Abwesenheit eines Kandidatenmittels durchgeführt werden. Kurz gesagt, kann ein Kandidatenmittel in einer Mischung aus aktivem DSP-3-Polypeptid und Substrat (z.B. eine phosphorylierte MAP-Kinase) mit oder ohne Vorinkubation mit einer oder mehreren Komponenten der Mischung eingeschlossen sein. Im Allgemeinen variiert eine geeignete Menge des Antikörpers oder eines anderen Mittels für die Verwendung in einem solchen Assay von etwa 0,01 μM bis etwa 100 μM. Die Wirkung des Mittels auf die DSP-3-Aktivität kann dann durch Quantifizieren des Verlustes an Phosphat vom Substrat und Vergleichen es Verlustes mit dem, der unter Verwendung von DSP-3 ohne die Zugabe eines Kandidatenmittels erzielt wurde, ausgewertet werden. Alternativ dazu kann ein gekoppeltes Kinaseassay verwendet werden, in dem die DSP-3-Aktivität indirekt auf Basis der MAP-Kinaseaktivität gemessen wird.
Alternativ dazu kann ein Polynukleotid, das einen DSP-3-Promotor umfasst, der operativ mit einem DSP-3 kodierenden Bereich oder einem Reportergen verknüpft ist, verwendet werden, um die Wirkung einer Testverbindung auf die DSP-3-Transkription auszuwerten. Solche Assays können in Zellen durchgeführt werden die DSP-3 endogen exprimieren (z.B. humane oder andere Säugetierskelettmuskel-, Herz-, Gehirn-, Leber- oder Pankreaszellen) oder in Zellen, die mit einem Expressionsvektor transfiziert wurden, der einen DSP-3 Promotor umfasst, der mit einem Reportergen verknüpft ist. Die Wirkung einer Testverbindung kann dann durch Untersuchen der Wirkung auf die Transkription von DSP-3 oder den Reporter unter Verwendung von, zum Beispiel, einer Northern-Blot-Analyse oder einem geeigneten Reporter-Aktivitäts-Assay, ausgewertet werden.
Die DSP-3 Aktivität kann auch in ganzen Zellen gemessen werden, die mit einem Reportergen, dessen Expression von der Aktivierung eines geeigneten Substrates abhängt, gemessen werden. Zum Beispiel können geeignete Zellen (d.h. Zellen die DSP-3 exprimieren) mit einem substratabhängigen Promotor, der mit einem Reportergen verknüpft ist, transfiziert werden. In einem solchen System hängt die Expression des Reportergens (die einfach unter Verwendung von Verfahren detektiert werden kann, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind) von der Aktivierung des Substrates ab. Die Dephosphorylierung des Systems kann basierend auf einer Verringerung in der Reporteraktivität nachgewiesen werden. Mittel, die den Kandidaten modulieren, können zu einem solchen System zugegeben werden, wie weiter oben beschrieben, um ihre Wirkung auf die DSP-3-Aktivität zu evaluieren.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Identifizieren eines Moleküls bereit, dass mit DSP-3 (oder einer alternativen Ersatzform des DSP-3) wechselwirkt oder damit bindet. Ein solches Molekül assoziiert sich mit DSP-3 für gewöhnlich mit einer Affinitätskonstante (K_a) von mindestens 10⁴, bevorzugt mindesten 10⁵, nach bevorzugter mindestens 10⁶, sogar noch bevorzugter mindestens 10⁷ und am meisten bevorzugt mindestens 10⁸. Affinitätskonstanten können unter Verwendung gut bekannter Techniken bestimmt werden. Verfahren zum Identifizieren wechselwirkender Moleküle können zum Beispiel zur anfänglichen Durchmusterung auf modulierende Mittel oder zum Identifizieren von Faktoren, die an der in vivo DSP-3 Aktivität beteiligt sind, verwendet werden. Techniken zum Substrat-Trapping, zum Beispiel unter Verwendung von DSP-3-Varianten oder Substrat-Trapping-Mutanten, wie weiter oben beschrieben, sind ebenfalls entsprechend bestimmter Ausführungsform, die hierin bereitgestellt werden, umfasst. Zusätzlich zu den Standardbindungassays gibt es viele andere Techniken, die für das Identifizieren von wechselwirkenden Molekülen gut bekannt sind, einschließlich Two-Hybrid-Screens mit Hefe, Phagen- Display- und Affinitätstechniken. Solche Techniken können unter Verwendung von Routineprotokollen durchgeführt werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind (siehe, z.B., Bartel et al., In Cellular Interactions in Development: A Practical Approach, D. A. Harley, Hrsg., Oxford University Press (Oxford, UK), S. 153-179, 1993). Bei diesen und anderen Techniken können mit dem Kandidaten wechselwirkende Proteine (z.B. mögliche DSP-3-Substrate) vor dem Untersuchen auf die Anwesenheit von DSP-3-bindenden oder -wechselwirkenden Proteinen phosphoryliert werden.
Innerhalb anderer Aspekte stellt die vorliegende Erfindung Tiermodelle bereit, in denen ein Tier entweder kein funktionales DSP-3 (oder eine alternative Form des DSP-3) exprimiert oder kein verändertes DSP-3 exprimiert. Solche Tiere können unter Verwendung von homologen, rekombinaten Standardstrategien erzeugt werden. Auf diese Art und Weise erzeugte Tiermodelle können verwendet werden, um die Aktivität von DSP-3-Polypeptiden und modulierenden Mitteln in vivo zu studieren.
VERFAHREN ZUM DEPHOSPHORYLIEREN EINES SUBSTRATES
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung kann ein DSP-3 (oder eine alternative Form des DSP-3) -Polypeptid zum Dephosphorylieren eines Substrates von DSP-3, wie hierin bereitgestellt, verwendet werden. In einer Ausführungsform kann ein Substrat in vivo durch Inkubieren eines DSP-3-Polypeptids mit einem Substrat in einem geeignet Puffer (z.B. Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol, 1 mg/ml Rinderserumalbumin) für 10 min bei 30°C dephosphoryliert werden. Jede Verbindung, die durch DSP-3 dephosphoryliert werden kann, wie z.B. eine MAP-Kinase, kann als Substrat verwendet werden. Im Allgemeinen kann die Menge der Reaktionskomponenten von etwa 50 pg bis etwa 50 ng des DSP-3- Polypeptids und von etwa 10 ng bis etwa 10 μg an Substrat variieren. Dephosphoryliertes Substrat kann dann gereinigt werden, zum Beispiel durch Affinitätstechniken und/oder Gelelektrophorese. Das Ausmaß der Substratdephosphorylierung kann im Allgemeinen durch Zugabe von [γ-³²P]markiertem Substrat zu einem Testaliquot und Auswerten des Niveaus der Substratdephosphorylierung, wie hierin beschrieben, überwacht werden.
VERFAHREN ZUM MODULIEREN DER ZELLULÄREN REAKTIONEN
Modulierende Mittel können zum Modulieren, Modifizieren oder anderweitigem Verändern (z.B. Erhöhen oder Verringern) zellulärer Reaktionen, wie zum Beispiel der Zellproliferation, der Differenzierung und dem Überleben in einer Vielzahl von Zusammenhängen, sowohl in vivo als auch in vitro verwendet werden. Um eine solche Reaktion im Allgemeinen zu modulieren (z.B. Erhöhen oder Verringern auf eine statistisch signifikante Weise) wird eine Zelle mit einem Mittel, das die DSP-3-Aktitität moduliert, unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die ausreichen, um die Modulation der DSP-3-Aktivität zu erlauben, in Kontakt gebracht. Mittel, die eine zelluläre Reaktion modulieren, können auf irgendeine einer Vielzahl von Arten funktionieren. Zum Beispiel kann ein Mittel das Muster der Genexpression modulieren (d.h. kann die Expression einer Familie von Genen oder Genen, die auf koordinierte Art und Weise exprimiert werden, verstärken oder inhibieren). Eine Vielzahl von Hybridisierungs- und Amplifikationstechniken sind zum Auswerten der Muster der Genexpression verfügbar. Alternativ dazu oder zusätzlich kann ein Mittel die Apoptose oder Nekrose der Zelle beeinflussen und/oder kann das Funktionieren des Zellcyklusses innerhalb der Zelle modulieren. (Siehe, z.B., Ashkenazi et al., 1998 Science, 281: 1305; Thornberry et al., 1998 Science 281: 1312; Evan et al., 1998 Science 281: 1317; Adams et al., 1998 Science 281: 1322; und die hierin zitierten Dokumente.)
Zellen, die so behandelt werden, wie weiter oben beschrieben, können Standardcharakteristika von Zellen, die veränderte Proliferations-, Differenzierungs- oder Überlebenseigenschaften aufweisen, exhibieren. Zusätzlich können solche Zellen, müssen jedoch nicht, Veränderungen bei anderen nachweisbaren Eigenschaften, wie zum Beispiel Kontaktinhibition des Zellwachstums, ankerunabhängiges Wachstum oder veränderte interzelluläre Adhäsion zeigen. Solche Eigenschaften können unter Verwendung von Techniken mit denen der Fachmann auf dem Gebiet vertraut ist, einfach nachgewiesen werden.
THERAPEUTISCHE VERFAHREN
Ein oder mehrere DSP-3 (oder einer alternativen Form des DSP-3) -Polypeptide, modulierende Mittel und/oder Polynukleotide, die für solche Polypeptide und/oder modulierende Mittel kodieren, können ebenfalls verwendet werden, um die DSP-3-Aktivität in einem Patienten zu modulieren. Wie hierin verwendet kann ein „Patient" irgendein Säugetier sein, einschließlich eines Menschen, und kann an einem Zustand leiden, der mit der DSP-3-Aktivität im Zusammenhang steht oder kann frei von einer nachweisbaren Erkrankung sein. Demnach kann die Behandlung, die einer vorhandenen Erkrankung sein oder kann prophylaktisch sein. Zustände, die mit der DSP-3-Aktivität im Zusammenhang stehen, schließen jede Erkrankung ein, die mit der Zellproliferation im Zusammenhang steht, einschließlich Krebs, eine Transplantat-Wirt-Reaktion (GVHD), Autoimmunerkrankungen, eine Allergie oder andere Zustände, in denen eine Immunosuppression eingeschlossen sein kann, metabolische Erkrankung, abnormales Zellwachstum, oder Proliferation und Zellzyklusabnormalitäten. Bestimmte derartige Erkrankungen schließen den Verlust der normalen MAP-Kinase-Phosphatase-Aktivität ein, was zu einem unkontrollierten Zellwachstum führt. DSP-3-Polypeptide und Polynukleotide, die für solche Polypeptide kodieren, können verwendet werden, um solche Störung zu lindern. Aktivatoren von DSP-3 können ebenfalls verwendet werden, um bestimmte Erkrankungen, einschließlich der Duchenne-Muskeldystrophy, zu behandeln.
Zum Verabreichen an einen Patienten werden ein oder mehrere Polypeptide, Polynukleotide und/oder modulierende Mittel im Allgemeinen als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert. Eine pharmazeutische Zusammensetzung kann eine sterile, wässrige oder nicht-wässrige Lösung, Suspension oder Emulsion sein, die zusätzlich eine physiologisch annehmbaren Träger (d.h. ein nicht-toxisches Material, das nicht mit der Aktivität der aktiven Bestandteile wechselwirkt) umfasst. Solche Zusammensetzungen können in Form eines Feststoffes, einer Flüssigkeit oder eines Gases (Aerosol) vorliegen. Alternativ dazu können Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung als Lyophilisat formuliert werden oder Verbindungen können in Liposomen unter Verwendung gut bekannter Technologien eingekapselt werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung können auch andere Komponenten enthalten, die biologisch aktiv oder inaktiv sein können. Solche Komponenten schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Puffer (z.B. neutral gepufferte Salzlösung oder mit Phosphat gepufferte Salzlösung), Kohlenhydrate (z.B. Glukose, Mannose, Saccharose oder Dextrane), Mannitol, Proteine, Polypeptide oder Aminosäuren, wie zum Beispiel Glycin, Antioxidantien, chelatierende Mittel, wie zum Beispiel EDTA oder Glutathion, Stabilisierungsmittel, Farbstoffe, Aromastoffe, und Suspensionsmittel und/oder Konservierungsmittel.
Irgendein geeigneter Träger, der dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, kann in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Träger für die therapeutische Verwendung sind gut bekannt und werden zum Beispiel beschrieben von Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro Hrsg. 1985). Im Allgemeinen wird die Art des Trägers auf Basis des Verabreichungsmodus ausgewählt. Pharmazeutische Zusammensetzungen können für irgendeine geeignete Art der Verabreichung formuliert werden, die zum Beispiel die topische, orale, nasale, intrathekale, rektale, vaginale, sublinguale oder parenterale Verabreichung, einschließlich der subkutanen, intravenösen, intramuskulären, intrasternalen, intrakavitären, intrameatalen oder intraurethralen Injektion oder Infusion einschließt. Für die parenterale Verabreichung umfasst der Träger bevorzugt Wasser, Salzlösung, Alkohol, ein Fett, ein Wachs oder einen Puffer. Für die orale Verabreichung kann irgendeiner der obigen Träger oder ein fester Träger, wie zum Beispiel Mannitol, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Zellulose, Kaolin, Glycerin, Stärkedextrine, Natriumalginat, Carboxymethylzellulose, Ethylzellulose, Glukose, Saccharose und/oder Magnesiumkarbonat verwendet werden.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung (z.B. für die orale Verabreichung oder die Abgabe durch Injektion) kann in Form einer Flüssigkeit vorliegen (z.B. ein Elixier, Sirup, Lösung, Emulsion oder Suspension). Eine flüssige pharmazeutische Zusammensetzung kann zum Beispiel eines oder mehrere der folgenden umfassen: sterile Verdünnungsmittel, wie zum Beispiel Wasser für die Injektion, Salzlösung, bevorzugt physiologische Salzlösung, Ringers-Lösung, isotonisches Natriumchlorid, fixierte Öle, wie zum Beispiel synthetische Mono- oder Diglyceride, die als Lösungsmittel oder Suspensionsmedium dienen können, Polyethylenglycol, Glycerin, Propylenglycol oder andere Lösungsmittel; antibakterielle Mittel, wie zum Beispiel Benzylalkohol oder Methylparaben; Antioxidationsmittel, wie zum Beispiel Askorbinsäure oder Natriumbisulfit; chelatierende Mittel, wie zum Beispiel Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer, wie zum Beispiel Acetate, Citrate, oder Phosphate und Mittel für die Einstellung der Tonizität, wie zum Beispiel Natriumchlorid oder Dextrose. Eine parenterale Zubereitung kann in Ampullen, Einwegspritzen oder Mehrfachfachdosenröhrchen, die aus Glas oder Plastik hergestellt werden, eingeschlossen sein. Die Verwendung von physiologischer Salzlösung wird bevorzugt und eine injizierbare pharmazeutische Zusammensetzung ist bevorzugt steril.
Die hierin beschriebenen Zusammensetzungen können als Depot formuliert werden (d.h. eine Formulierung, wie zum Beispiel eine Kapsel oder ein Schwamm, der eine langsame Freisetzung der Verbindung nach Verabreichung bewirkt). Solche Zusammensetzungen können im Allgemeinen unter Verwendung gut bekannter Technologien hergestellt werden und zum Beispiel durch orale, rektale, oder subkutane Implantation oder durch eine Implantation an der gewünschten Zielstelle verabreicht werden. Depotformulierungen können ein Mittel enthalten, das in einer Trägermatrix dispergiert ist und/oder innerhalb eines Reservoirs enthalten ist, dass von einer geschwindigkeitsbestimmenden Membran umgeben ist. Träger für die Verwendung innerhalb solcher Formulierungen sind biokompatibel und können auch biologisch abbaubar sein; bevorzugt stellt die Formulierung ein relativ konstantes Freisetzungniveau für den aktiven Bestandsteil bereit. Die Menge der aktiven Verbindung, die innerhalb der Depotformulierung enthalten ist, hängt von der Implantationsstelle ab, der Rate und der erwarteten Dauer der Freisetzung und der Natur und der Bedingung die es zu behandeln gilt oder der vorgebeugt werden soll.
Für pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein Polynukleotid, dass für ein DSP-3-Polypeptid kodiert, und/oder modulierende Mittel umfassen (so dass das Polypeptid und/oder das modulierende Mittel in situ erzeugt wird) kann das Polynukleotid in irgendeinem einer Vielzahl von Abgabesystemen, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, einschließlich Nukleinsäure- und bakteriellen, viralen und Säugetierexpressionssystemen, vorliegen. Techniken zum Einbauen von DNA in solche Expressionssysteme sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt. Die DNA kann auch „nackt" sein, wie zum Beispiel von Ulmer et al., Science 259: 1745-1749, 1993 beschrieben und von Cohen, Science 259: 1691-1692, 1993 rezensiert. Die Aufnahme von nackter DNA kann durch Beschichten der DNA auf biologisch abbaubare Kügelchen, die wirksam in die Zellen transportiert werden, erhöht werden.
Innerhalb einer pharmazeutischen Zusammensetzung kann ein DSP-3 (oder einer alternativen Form des DSP-3) -Polypeptid, Polynukleotid oder modulierendes Mittel mit irgendeiner einer Vielzahl von Verbindungen verknüpft werden, Zum Beispiel kann ein solches Mittel mit einem Ansteuerungsrest verknüpft sein (z.B. ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, ein Protein oder ein Liposom), das die Abgabe des Mittels an die Zielstelle erleichtert. Wie hierin verwendet, kann ein „Ansteuerungsrest" jede Substanz sein (wie zum Beispiel eine Verbindung oder Zelle), die, wenn sie mit einem Mittel verknüpft ist, den Transport des Mittels zu einer Zielzelle oder -Gewebe verstärkt, wodurch die lokale Konzentration des Mittels erhöht wird. Ansteuerungsreste schließen Antikörper oder Fragmente davon, Rezeptoren, Liganden und andere Moleküle ein, die an Zellen oder in der Nachbarschaft des Zielgewebes binden. Ein Antikörper-Ansteuerungsmittel kann ein intaktes (ganzes) Molekül, ein Fragment davon oder ein funktionales Äquivalent davon sein. Beispiele für Antikörperfragmente sind F(ab')₂, -Fab', Fab und F[v]-Fragmente, die durch herkömmliche Verfahren oder durch genetische oder Proteinmanipulation hergestellt werden können. Die Verknüpfung ist im Allgemeinen kovalent und kann zum Beispiel durch direkte Kondensation, oder andere Reaktionen oder auf dem Wege der Bi- oder Multifunktionalen Linker erzielt werden. Ansteuerungsreste können basierend auf der/den Zelle(en) oder dem/den Gewebe(n) auf die das Mittel einen therapeutischen Nutzen haben soll, ausgewählt werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen können auf eine Art und Weise verabreicht werden, die für die zu behandelnde (oder vorzubeugende) Krankheit geeignet sind. Eine geeignete Dosierung, und eine geeignete Dauer und Frequenz der Verabreichung werden durch solche Faktoren bestimmt, wie zum Beispiel dem Zustand des Patienten, der Art und der Schwere der Erkrankung des Patienten, der jeweiligen Form des aktiven Bestandteils und des Verabreichungsverfahrens. Im Allgemeinen stellt ein geeignete Dosierung und ein Verabreichungsplan das/die Mittel in einer Menge bereit, die ausreichend ist, um eine therapeutischen und/oder prophylaktischen Nutzen bereitzustellen (z.B. ein verbessertes klinisches Ergebnis, wie zum Beispiel eine frequente vollständige oder teilweise Heilung oder ein längeres krankheitsfreies und/oder allgemeines Überleben) bereit. Für die prophylaktische Verwendung sollte eine Dosis ausreichend sein, um eine Erkrankung zu verhindern, den Ausbruch zu verzögern oder die Schwere der Erkrankung, die mit der Zellproliferation im Zusammenhang steht, abzuschwächen.
Optimale Dosierungen können im Allgemeinen unter Verwendung experimenteller Modelle/oder klinischer Versuche bestimmt werden. Im Allgemeinen variiert die Menge des Polypeptides, das in einer Dosierung vorhanden ist, oder die in situ durch DNA, die in einer Dosierung vorhanden ist, erzeugt wird, von etwa 0,01 μg bis etwa 100 μg pro Kilogramm des Wirtes, für gewöhnlich von etwa 0,1 μg bis etwa 10 μg. Die Verwendung der minimalen Dosierung, die ausreichend ist, um eine wirksame Therapie bereitzustellen, wird für gewöhnlich bevorzugt. Patienten können im Allgemeinen unter Verwendung von Assays, die für den zu behandelnden oder vorzubeugenden Zustand geeignet sind und die dem Fachmann auf diesem Gebiet vertraut sind, auf die therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit überwacht werden. Geeignete Dosierungsgrößen werden mit der Größe des Patienten variieren, aber werden sich für gewöhnlich in einem Bereich von 10 ml bis etwa 500 ml für 10-60 kg Tier bewegen.
Das folgende Beispiel dient der Illustration und nicht der Begrenzung.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
KLONIEREN UND SEQUENZIEREN VON cDNA, DIE FÜR DSP-3 KODIERT
Dieses Beispiel illustriert die Klonierung eines cDNA-Moleküls, das für humanes DSP-3 kodiert.
Ein konserviertes Sequenzmotiv, das die Domäne mit der aktiven Stelle der Phosphatasen mit dualer Spezifität umgibt, wurde wie folgt identifiziert: Phosphatasen mit dualer Spezifität gehören zur größeren Familie der Protein-Tyrosin-Phosphatasen (PTPs), die eine konservierte katalytische Domäne teilen, die einen Cystein-Rest enthalten, der N-terminal an einem Abschnitt von fünf variablen Aminosäuren gefolgt von einem Arginin-Rest angeordnet ist (Fauman et al., Trends In Bioch. Sci. 21: 413-417, 1996). Die DSP's enthalten für gewöhnlich ein PTP aktives Stellenmotiv, ihnen fehlt jedoch die Sequenzhomologie zu PTP's in anderen Bereichen (Jia, Biochem. and Cell Biol. 75: 17-26, 1997). Es ist jedoch von keiner Konsensussequenz berichtet worden, die unter den DSP's konserviert ist, noch ist von der Untersuchung der bekannten DSP-Sequenzen, wie zum Beispiel jenen, von denen weiter oben berichtet wurde, ein Konsensusbereich ersichtlich. Um ein längeres Konsensus-DSP-Aminosäuresequenzmotif abzuleiten, das für die Identifikation von neuen DSP-Familienmitglieder nützlich wäre, wurden mehrere bekannte Sequenzen von humanen Phosphatasen mit dualer Spezifität ausgerichtet und verglichen. Bei einer Ausrichtung von acht Aminosäuresequenzen, die von acht humanen DSP's, die MAP-Kinase-Phosphatase-Aktivität zeigen, abgeleitet wurden, ergaben einen konservierten homologen Bereich, der aus 23 Aminosäurepeptidsequenzen besteht, die das Signaturmotif der aktiven Stelle von PTP enthalten. Demnach wurde ein Kandidatenpeptid mit der folgenden Sequenz:
GRVLVHCQAGISRSGTNILAYLM SEQ ID NO: 4
verwendet, um die Expressed Sequence Tag Datenbank (Nat. Center für Biol. Information, www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST) zu durchsuchen. Die Suche verwendete einen Algorithmus (tblastn), der das Kandidatenpeptid mit Iterationen umgekehrt translatieren kann, was die Degenerierung des genetischen Codes innerhalb von Standardparametern ermöglicht. Die Suchergebnisse identifizierten sowohl EST AA374753 als auch AA411671 und H82446 als Kandidaten-MAP-Kinase-Phosphatase- Sequenzen. Die EST's enthielten keinen vollständigen Kodierungsbereich eines exprimierten Gens, wie zum Beispiel eines Gens, das für ein DSP-3 mit einer MAP-Kinase-Phosphatase-Aktivität kodiert, noch wurden der Sinnstrang und der offene Leserahmen identifiziert.
Um einen vollängen kodierenden Bereich zu erhalten, wurde die humane Skelettmuskel-cDNA in 5' und 3' RACE (schnelle Amplifikation von cDNA Enden) Reaktionen durchmustert, wie beschrieben von (Frohman et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 8998, 1988; Ohara et al., Proc. Nat. Acad. Sci, USA 86: 5673, 1989; Loh et al., Science 243: 217, 1989), unter Verwendung von 5'/3'-RACE-Kits (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN; Clontech; Palo Alto, CA; Life Technologies, Gaithersburg, MD) gemäß den Anweisungen des Anbieters. Die Sequenzinformation, die in direkter Nachbarschaft zum konservierten Sequenzmotiv vorlag, wurde in 5' und 3'-RACE Reaktionen mit humaner Skelettmuskel-cDNA verwendet, wobei die folgenden Primer (SEQ ID NO: 5 bis 8) verwendet wurden:
Volllängen cDNA, der nur das Anfangs- und das Stopcodon fehlte, wurde unter Verwendung der folgenden Primer erhalten (SEQ ID NO: 9-10):
Eine cDNA (1; SEQ ID NO: 1), die für ein Protein von 184 Aminosäuren (2; SEQ ID NO: 2) kodiert, wurde als DSP-3 identifiziert. Diese Sequenz hat eine signifikante Homologie zu anderen MAP-Kinase-Phosphatasen (3). Die identifizierte cDNA enthält sowohl den 552 Basenpaar kodierenden Bereich, als auch die damit verbundenen 5' und 3' untranslatierten Sequenzen. Die Domäne mit der aktiven Stelle für DSP-3 wurde in einem Bereich lokalisiert, der durch Nukleotide kodiert wird, die in der Position 258 der SEQ ID NO: 1 beginnen.
Semiquantitative RT-PCR Analysen wurden durchgeführt. Diese Analysen zeigten höhere Niveaus von DSP-3 mRNA in Skelettmuskelgeweben.
BEISPIEL 2
DSP-3-EXPRESSION IN HUMANEM GEWEBE
In diesem Beispiel wird gezeigt, das eine DSP-3 kodierende Nukleinsäuresequenz mit einer humanen polyA+-RNA aus verschiedenen Gewebequellen hybridisiert. Die volllängen DSP-3 kodierende cDNA (SEQ ID NO: 1) wurde unter Verwendung des Zufalls-Primer-Verfahren, wie von Ausubel et al. (1998 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc., & John Wiley & Sons, Inc., Boston MA) beschrieben für die Verwendung als Nukleinsäure-Hybridisierungssonde mit ³²P-markiert. Die Sonde wurde an Blots hybridisiert, die humane polyA+-RNA enthielten, die von mehreren humanen Geweben stammten, normalisiert für die Menge an detektierbarer β-Actin-mRNA (4, Kat. Nr. 7759-1; Clontech, Inc., Palo Alto, CA). Die Blots durchliefen für 30 min bei 68°C in der Express Hyb^TM-Lösung (Clontech) eine Vorhybridisierung und wurden dann mit der markierten Sonde für 1 Stunde bei 68°C in der Express Hyb^TM-Lösung hybridisiert. Die Blots wurden als nächstes für 40 min bei Raumtemperatur in 2 × SSC, 0,05% SDS gewaschen, gefolgt von einer zweiten Waschung von 40 min bei 50°C in 0,1 × SSC, 0,1% SDS. Die Blots wurden übernacht dem Hyperfilm-MP^TM-autoradiographischen Film ausgesetzt (Amersham Life Sciences, Arlington Hts, IL). Die Ergebnisse werden in 4 dargestellt, in denen die humanen Gewebequellen der RNA's wie folgt dargestellt wurden: Bahn 1, Herz; Bahn 2, Gehirn; Bahn 3, Plazenta; Bahn 4, Lunge; Bahn 5, Leber; Bahn 6, Skelettmuskel; Bahn 7, Niere; Bahn 8, Pankreas. Eine besonders hervorstechende DSP-3-Expression wurde im menschlichen Herz, der Leber, dem Skelettmuskel und dem Pankreas nachgewiesen, wobei eine Expression auch in anderen Geweben nachgewiesen wurde.
BEISPIEL 3
IDENTIFIKATION EINER MURINEN DSP-3-VARIANTE
Dieses Beispiel beschreibt die Identifikation einer murinen DSP-3-Variante, basierend auf der DSP-3-Sequenz, die im Beispiel 1 identifiziert wurde. Die volllängen DSP-3 kodierende Polynukleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) wurde als Suchsequenz unter Verwendung des BLAST-Algorithmus, wie weiter oben beschrieben, in eine mobile EST-Datenbank übertragen und die folgenden zwei EST's wurden erhalten: AA103595 und AW413206. Das Ausrichten dieser zwei EST-Sequenzen, die eine Überlappung von 94 identischen Nukleotiden aufwiesen, führten zur kodierenden Sequenz (SEQ ID NO: 20) der murinen DSP-3-Variante, die in 5 dargestellt wird, und ermöglichten die Bestimmung eines offenen Leserahmens, der für ein Polypeptid einer murinen DSP-3-Variante von 205 Aminosäuren (SEQ ID NO: 21), wie in 6 dargestellt, kodiert. Die Sequenz der aktiven Stelle VHCLAGVSRS (SEQ ID NO: 3) ist in den Aminosäurepositionen mit den Nummern 86 bis 95 der SEQ ID NO: 21 vorhanden.
Um diese murine DSP-3-Variante molekular zu klonieren, wurde ein Polynukleotid, das die kodierende volllängen Sequenz enthält, aus einer murinen cDNA-Bank unter Verwendung von Standard-PCR-Bedingungen und den folgenden Primern amplifiziert:
BEISPIEL 4
IDENTIFIKATION EINER HUMANEN ALTERNATIVEN FORM DER DSP-3-SPLICEVARIANTE
Die murine kodierende Polynukleotidsequenz der volllängen DSP-3-Variante (SEQ ID NO: 20) wurde wieder einer humanen EST-Datenbank als Suchsequenz unter Verwendung des BLAST-Algorithmus, wie weiter oben beschrieben, vorgelegt und EST AK000383 wurde erhalten. Die Translation dieser EST in allen drei möglichen Leserahmen ergab im zweiten Leserahmen ein Aminosäuresequenzfragment, das mit den Aminosäuren 65 bis 205 in der murinen DSP-3-Variante, die im Beispiel 3 beschrieben wurde (SEQ ID NO: 21), identisch ist. Das Ausrichten dieses translatierten humanen EST AK000383 Aminosäuresequenzfragmentes mit der humanen DSP-3-Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 offenbarte eine Sequenzidentität vom Aminoterminus des translatierten offenen Leserahmens des EST, der von der Aminosäure Nummer 65 der SEQ ID NO: 2 bis zum Leucin-Rest, der der Position Nummer 169 der SEQ ID NO: 2 entspricht, entspricht. Jedoch waren die C-terminalen 15 Aminosäuren der SEQ ID NO: 2 in dem translatierten EST AK000383 Fragment nicht vorhanden, das stattdessen eine 36 Aminosäuresequenz umfasste, die mit dem C-Terminus der murinen DSP-3-Variante, die weiter oben beschrieben wurde (SEQ ID NO: 21), identisch war. Demnach repräsentieren die Aminosäuren in den Positionen 170 bis 205 in SEQ ID NO: 21 einen alternativen DSP-3-Carboxylterminus von 36 Aminosäuren, der anstelle der C-terminalen 15 Aminosäuren der SEQ ID NO: 2 in einer alternativen Form des DSP-3, die die Aminosäuren 65 bis 205 der SEQ ID NO: 21 umfasst und durch eine Nukleinsäuresequenz kodiert wird, die die gesamte oder einen Abschnitt der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 20 oder einer Variante davon umfasst, vorhanden sein kann. Diese alternative Form des DSP-3 erscheint, gemäß einer nicht begrenzenden Theorie, das Produkt eines alternativen mRNA-Splicereignisses zu sein.
Zur molekularen Klonierung dieser alternativen Form des DSP-3 (SEQ ID NO: 20) wird ein Polynukleotid, das die kodierende volllängen Sequenz enthält, aus einer humanen cDNA-Bank unter Verwendung von Standard-PCR-Bedingungen mit den folgenden Primern amplifiziert:
BEISPIEL 5
DSP-3 PHOSPHATASE AKTIVITÄT
Es wurden Assays zur DSP-3-Aktivität unter Verwendung eines am Tyrosin phosphorylierten mit ³²P-markierten EGF-Rezeptor Autophosphorylierungsstellen-Peptides als Substrat durchgeführt, wie es im Wesentlichen beschrieben wird von (Flint et al., 1993 EMBO J. 12: 1937-1946; Zhang et al., 1994 Biochem. 33: 2285-2290). Ein Polynukleotid, das die DSP-3 kodierende Sequenz der SEQ ID NO: 25 umfasst, wurde in den pGEX-Expressionsvektor kloniert (Pharmacia, Piscataway, NJ) und in E. coli als ein DSP-3-Glutathion-S-Transferase (GST) -Fusionsprotein gemäß den Instruktionen des Anbieters exprimiert. Die Affinitätsisolation des DSP-3-GST-Fusionsproteins auf immobilisiertem Glutathion (Pharmacia) im Anschluss an die Extraktion, wurde ebenfalls wie vom Anbieter empfohlen, durchgeführt. Alle Reagenzien stammen von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), soweit nichts anderes angegeben wird. Ein Aliquot (20 μl) eines eiskalten Assay-Puffers (25 mM Imidazol (EM Science, Gibbstown, NJ), pH 7,2, 1 mM EDTA, 2 mM Dithiothreitol (DTT, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN), 0,25 mg/ml Ovalbumin (Calbiochem-Novabiochem, La Jolla, CA)) wurde zu den Kammern gegeben, die als Enzym-Negativkontrollen bezeichnet wurden. Es wurde DSP-3 (SEQ ID NO: 2), das in eiskalten Assay-Puffer aus einer 50% Glycerolstammlösung verdünnt wurde, so dass diese Menge an Enzym weniger als 20% des Substrates im Assay ausnützen würde, mit 20 μl pro Kammer zu allen Kammern mit Ausnahme der Enzym-Negativkontrollkammern zugegeben. Die Platte wurde für 20 sec geschüttelt, um die Inhalte jeder Kammer zu vermischen und für 13 min bei Raumtemperatur inkubiert. Für das Substrat wurde die Autophosphorylierungsstelle des EGF-Rezeptors mit der Aminosäuresequenz DADEpYL-NH₂ [SEQ ID NO: 26] als ein ³²P-markiertes Substratpeptid, im Wesentlichen wie von (Zhang et al., 1994 Biochem. 33: 2285; spezifische Aktivität 11 μCi/nMol) beschrieben, hergestellt, auf 0,6 μM im Assay-Puffer verdünnt und zu allen Kammern in 20 μl Aliquots gegeben. Die Platte wurde wiederum geschüttelt und dann für zusätzliche 13 min inkubiert, wobei während dieser Zeit 140 μl einer aktivierten Aktivkohlesuspension (25 mg/ml in 0,1 M NaH₂PO₄, pH ≤ 5) zu jeder Kammer gegeben wurden, die Inhalte wurden durch Vortexen gemischt und die Platte wurde dann bei 2400 rpm für drei min bei Raumtemperatur in einer Tabletop-Zentrifuge (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA) zentrifugiert. Aliquots (100 μl) der Überstandsflüssigkeit in jeder Kammer wurden in einem Beta-Szintillationszellplatte (Wallac, Inc., Gaithersburg, MD) übertragen und die ³²P-beta-Emissionen wurden unter Verwendung eines Wallac Microbeta^TM-Plattenzählers entsprechend den Empfehlungen des Herstellers quantifiziert. Nach dem Abziehen der Hintergrundzählung zum Korrigieren der Enzym-Negativkontrollwerte und Normalisieren gegenüber den Kontrollkammern, wurde die DSP-3 spezifische Aktivität des EGF-Rezeptor-Peptidsubstrates auf 88,4 nmole/min/mg, mit einem Km = 1,2 μM berechnet.
Ausgehend vom zuvor genannten wird deutlich, dass, obwohl spezifische Ausführungsformen in der Erfindung für illustrative Zwecke hierin beschrieben worden sind, verschiedene Modifikationen ohne Abweichung vom Geist und Schutzumfang der Erfindung hergestellt werden können. Demgemäß wird die vorliegende Erfindung, mit Ausnahme durch die beigefügten Ansprüche, nicht begrenzt.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zum Durchmustern auf ein Mittel, das eine DSP-3-Aktivität moduliert, umfassend die Schritte: (a) In-Kontakt-Bringen eines Kandidaten für ein Mittel mit einem DSP-3-Polypeptid, wobei das Polypeptid entweder (1) die in SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz umfasst oder (2) die Aminosäuresequenz einer Variante des DSP-3-Polypeptids umfasst, die sich in einer oder mehreren Aminosäure-Deletionen, -Additionen, -Insertionen oder -Substitutionen an nicht mehr als 25% der Reste in SEQ ID NO: 2 unterscheidet, so dass das Polypeptid die Fähigkeit beibehält, eine aktivierte MAP-Kinase zu dephosphorylieren, unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die ausreichen, um eine Wechselwirkung zwischen dem Polypeptid und dem Kandidaten für ein Mittel zu gestatten, wobei der Kandidat für ein Mittel ein kleines Molekül ist; und (b) anschließendes Auswerten der Fähigkeit des Polypeptids, ein DSP-3-Substrat zu dephosphorylieren, relativ zu einer vorher bestimmten Fähigkeit des Polypeptids, das DSP-3-Substrat in Abwesenheit eines Kandidaten für ein Mittel zu dephosphorylieren; und daraus Identifizieren eines Mittels, das eine DSP-3-Aktivität moduliert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem DSP-3-Substrat um eine MAP-Kinase handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Kandidat für ein Mittel in einer kombinatorischen Genbank vorliegt.
Verfahren zum Durchmustern auf ein Mittel, das eine DSP-3-Aktivität moduliert, umfassend die Schritte: (a) In-Kontakt-Bringen eines Kandidaten für ein Mittel mit einer Zelle, die ein Polynucleotid umfasst, das fähig ist, ein DSP-3-Transkript zu exprimieren, das ein DSP-3-Polypeptid kodiert, unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die ausreichen, um eine Wechselwirkung zwischen dem Polynucleotid und dem Kandidaten für ein Mittel zu gestatten, wobei das DSP-3-Polypeptid die in SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz umfasst oder die Aminosäuresequenz einer Variante des DSP-3-Polypeptids umfasst, die sich in einer oder mehreren Aminosäure-Deletionen, -Additionen, -Insertionen oder -Substitutionen an nicht mehr als 25 % der Reste in SEQ ID NO: 2 unterscheidet, so dass das Polypeptid die Fähigkeit beibehält, eine aktivierte MAP-Kinase zu dephosphorylieren; und (b) anschließendes Auswerten der Expression des Polynucleotids relativ zu einem vorher bestimmten Expressionsniveau in Abwesenheit des Kandidaten für ein Mittel: und daraus Identifizieren eines Mittels, das eine DSP-3-Aktivität moduliert.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Zelle ferner ein Polynucleotid umfasst, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein Reporterprotein kodiert.
Für DSP-3-Substrat-Trapping mutantes Polypeptid, das sich von der in SEQ ID NO: 2 angeführten Sequenz unterscheidet, wobei das Polypeptid eine Substitution an Position 57 oder Position 88 von SEQ ID NO: 2 enthält, wobei das für DSP-3-Substrat-Trapping mutante Polypeptid die Fähigkeit beibehält, ein DSP-3-Substrat zu binden, und wobei die Fähigkeit des Polypeptids, ein Substrat zu dephosphorylieren, relativ zu dem DSP-3-Polypeptid reduziert ist.
Für Substrat-Trapping mutantes Polypeptid gemäß Anspruch 6, wobei Position 57 durch einen Alaninrest substituiert ist.
Für Substrat-Trapping mutantes Polypeptid gemäß Anspruch 6, wobei Position 88 durch einen Serinrest substituiert ist.
Isoliertes Polynucleotid, welches das für Substrat-Trapping mutante Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 6-8 kodiert.
Verfahren zum Durchmustern eines Moleküls auf die Fähigkeit, mit einem DSP-3-Polypeptid in Wechselwirkung zu treten, umfassend die Schritte: (a) In-Kontakt-Bringen eines Kandidatenmoleküls mit einem DSP-3-Polypeptid unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die ausreichen, um dem Kandidatenmolekül und dem Polypeptid zu gestatten, in Wechselwirkung zu treten, wobei das Polypeptid die in SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz umfasst oder die Aminosäuresequenz einer Variante des DSP-3-Polypeptids umfasst, die sich in einer oder mehreren Aminosäure-Deletionen, -Additionen, -Insertionen oder -Substitutionen an nicht mehr als 25 % der Reste in SEQ ID NO: 2 unterscheidet, so dass das Polypeptid die Fähigkeit beibehält, eine aktivierte MAP-Kinase zu dephosphorylieren; und (b) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit des Bindens des Kandidatenmoleküls an das Polypeptid, wobei der Schritt des Nachweisens eine Durchmusterung einer Phagen-Display-Bank umfasst, und daraus Bestimmen, ob das Kandidatenmolekül mit dem DSP-3-Polypeptid in Wechselwirkung tritt
Verfahren zum Modulieren einer proliferativen Antwort in einer Zelle in vitro, umfassend das Modulieren einer die MAP-Kinase dephosphorylierenden Aktivität eines DSP-3-Polypeptids in der Zelle, wobei das Polypeptid (a) die in SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz umfasst oder (b) die Aminosäuresequenz einer Variante des DSP-3-Polypeptids umfasst, die sich in einer oder mehreren Aminosäure-Deletionen, -Additionen, -Insertionen oder -Substitutionen an nicht mehr als 25 % der Reste in SEQ ID NO: 2 unterscheidet, so dass das Polypeptid die Fähigkeit beibehält, eine aktivierte MAP-Kinase zu dephosphorylieren.
Verfahren zum Modulieren der Differenzierung einer Zelle in vitro, umfassend das Modulieren einer die MAP-Kinase dephosphorylierenden Aktivität eines DSP-3-Polypeptids in der Zelle, wobei das Polypeptid (a) die in SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz umfasst oder (b) die Aminosäuresequenz einer Variante des DSP-3-Polypeptids umfasst, die sich in einer oder mehreren Aminosäure-Deletionen, -Additionen, -Insertionen oder -Substitutionen an nicht mehr als 25 % der Reste in SEQ ID NO: 2 unterscheidet, so dass das Polypeptid die Fähigkeit beibehält, eine aktivierte MAP-Kinase zu dephosphorylieren.
Verfahren zum Modulieren des Überlebens einer Zelle in vitro, umfassend das Modulieren einer die MAP-Kinase dephosphorylierenden Aktivität eines DSP-3-Polypeptids in der Zelle, wobei das Polypeptid (a) die in SEQ ID NO: 2 dargelegte Aminosäuresequenz umfasst oder (b) die Aminosäuresequenz einer Variante des DSP-3-Polypeptids umfasst, die sich in einer oder mehreren Aminosäure-Deletionen, -Additionen, -Insertionen oder -Substitutionen an nicht mehr als 25 % der Reste in SEQ ID NO: 2 unterscheidet, so dass das Polypeptid die Fähigkeit beibehält, eine aktivierte MAP-Kinase zu dephosphorylieren.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11-13, wobei der Schritt des Modulierens ein Genexpressionsmuster moduliert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11-13, wobei die Zelle eine Kontakthemmung des Zellwachstums aufzeigt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11-13, wobei die Zelle ein von einer Verankerung unabhängiges Wachstum aufzeigt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11-13, wobei die Zelle eine veränderte interzelluläre Adhäsionseigenschaft aufzeigt.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei Apoptose moduliert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei ein Zellzyklus der Zelle moduliert wird.
Verfahren zum Durchmustern eines Moleküls auf die Fähigkeit, mit einem DSP-3-Polypeptid in Wechselwirkung zu treten, umfassend die Schritte: (a) In-Kontakt-Bringen eines Kandidatenmoleküls mit einer DSP-3-Substrat-Trapping-Mutante gemäß einem der Ansprüche 6-8, unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die ausreichen, um dem Kandidatenmolekül und der DSP-3-Substrat-Trapping-Mutante zu gestatten, in Wechselwirkung zu treten; und (b) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit des Bindens des Kandidatenmoleküls an die DSP-3-Substrat-Trapping-Mutante und daraus Bestimmen, ob das Kandidatenmolekül mit dem DSP-3-Polypeptid in Wechselwirkung tritt.
Verfahren zum Durchmustern eines Moleküls auf die Fähigkeit, mit einem DSP-3-Polypeptid in Wechselwirkung zu treten, umfassend die Schritte: (a) In-Kontakt-Bringen eines Kandidatenmoleküls mit einer DSP-3-Substrat-Trapping-Mutante gemäß Anspruch 30, unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die ausreichen, um dem Kandidatenmolekül und der DSP-3-Substrat-Trapping-Mutante zu gestatten, in Wechselwirkung zu treten; und (b) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit des Bindens des Kandidatenmoleküls an die DSP-3-Substrat-Trapping-Mutante und daraus Bestimmen, ob das Kandidatenmolekül mit dem DSP-3-Polypeptid in Wechselwirkung tritt.