JP2024514500A - タンパク質の糖化を予測および調節する方法 - Google Patents

Abstract

実施形態は治療用生体分子中のアミノ酸の糖化率を予測する方法を提供する。一例では、生体分子中のアミノ酸の糖化率を予測する方法は、第一の温度セットに対する脱糖化反応に対する速度の第一のセットを決定することと、第二の温度セットに対する脱糖化反応に対する一つ以上の速度の第二のセットを推定することと、一つ以上の速度の第二のセットを使用して、第二の温度セットに対応する任意の温度で、任意の持続時間にわたって糖化率を予測することと、を含む。また、治療用生体分子の貯蔵寿命にわたって所定の糖化率の範囲内のアミノ酸の糖化率を維持する方法、および投与時に対象における治療用生体分子の効力を減少または増加させる方法も提供される。【選択図】図２

Description

配列表の参照
本出願は、２０２２年４月１日に作成された６８１バイトのファイル「１０８６２ＷＯ０１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔ」としてコンピュータ可読形式で提出される配列表を参照により組み込む。

本発明は、治療用生体分子に関し、特に、インビトロおよびインビボでの治療用生体分子の糖化レベルおよび効力を決定および／または予測する方法に関する。

タンパク質糖化は、還元糖とアミノ酸のアミン基との非酵素反応であり、生体分子、例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）などの治療用生体分子における一般的な翻訳後修飾である。糖化が、その機能に重要な治療用生体分子の領域、例えば、治療用ｍＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）上で起こる場合、効力および生物学的活性が損なわれ得る。感受性アミン基を有する生体分子は、インビボおよびインビトロの両方で糖化（または脱糖化）のプロセスを受けることができる。

例えば、現在、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されているすべてのモノクローナル抗体は、哺乳類細胞培養物から産生される。細胞培養プロセス中、ｍＡｂは培養培地中に分泌され、グルコースはエネルギー源として存在する。細胞培養環境は生理学的条件と類似しているため、ほとんどのｍＡｂは少なくともある程度、糖化される可能性が高い。製剤、包装、および保管は、ｍＡｂの精製に続いて行われ、ｍＡｂの糖化は、特定のプロセスおよび条件に応じてさらにまたは逆に進む可能性がある。糖化の機構および程度は、ｍＡｂ産生プロセスの複雑さの結果として予測不可能であり、アミノ酸配列または構造モチーフの分析は、現在、糖化ホットスポットの信頼できる予測を提供することができない。さらに、現在、貯蔵条件下で、および／またはそれを必要とする対象への投与後に起こり得るｍＡｂの糖化および／または脱糖化の程度の予測を可能にするフレームワークはない。ｍＡｂなどの治療用生体分子の糖化は、このような生体分子の効力に影響を与え得るため、インビトロ（例えば、貯蔵条件下で）およびインビボ（例えば、必要とする対象への投与後）の両方で、治療用生体分子の糖化および脱糖化を確実に決定および／または予測することができる方法論が現在必要とされている。

一態様では、本発明は、生体分子中のアミノ酸の糖化率を予測する方法を提供し、以下を含む、第一の持続時間にわたる第一の温度セットに対する第一の脱糖化速度のセットを決定することと、第一の脱糖化速度のセットに基づいて、第二の温度セットに対して、一つ以上の脱糖化速度の第二のセットを推定することと、一つ以上の脱糖化速度の第二のセットを使用して、第二の温度セットに対応する任意の温度で、かつ第二の所定の時間枠によって包含される持続時間にわたって、糖化率を予測することと、を含む。

実施形態では、第一の温度セットは、第二の温度セットの温度よりも高い温度を含む。例えば、送信される第一の温度は、２０～４５℃の範囲の温度を含んでもよく、第二の温度セットは、２～８℃の範囲の温度を含んでもよい。一部の例では、第二の温度セットは、５℃の温度に対応する。

一部の実施形態では、第一の所定の時間枠は、４０日未満である。

一部の実施形態では、第二の所定の時間枠は、少なくとも３ヶ月である。例えば、第二の所定の時間枠は、６ヶ月、または９ヶ月、または１２ヶ月、またはさらに１８ヶ月、または２４ヶ月、または３６ヶ月など、１２ヶ月より大きくてもよい。

実施形態では、第一の持続時間にわたる第一の温度セットに対する第一の脱糖化速度のセットを決定することは、第一の持続時間の少なくとも一部分に対応する時間の関数として、第一の温度セットに含まれる各温度に対するアミノ酸の糖化率を測定することと、第一の脱糖化速度のセットを取得するためのデータフィッティング手順を実施することと、を含む。

実施形態では、方法は、二つ以上の異なるｐＨ値の関数として、第一の脱糖化速度のセットを決定することを含む。一部の例では、二つ以上の異なるｐＨ値の各々について、方法は、第一の脱糖化速度のセットに基づいて、アミノ酸の脱糖化に関連する活性化エネルギーを決定することをさらに含む。一部の例では、方法は、二つ以上の異なるｐＨ値のうちの少なくとも一つの関数として、第一の脱糖化速度のセットを推論することと、一つ以上の脱糖化速度の第二のセットを使用して、第二の温度セットに対応する任意の温度で、かつ二つ以上の異なるｐＨ値の少なくとも一つの関数として第二の所定の時間枠によって包含される任意の期間にわたって、糖化率を予測することと、をさらに含む。

いくつかの実施形態では、方法は、グルコースの非存在下で第一の脱糖化速度のセットを決定することをさらに含み、生体分子のアミノ酸は、所定の第一の割合に糖化される。例において、糖化率を予測することは、一つ以上の脱糖化速度の第二のセット、生体分子のアミノ酸が糖化される所定の第一の割合、および所定の第一の割合と０％の糖化との間の差に基づく。

一態様では、本発明は、生体分子の貯蔵寿命にわたって所定の糖化率の範囲内で生体分子中のアミノ酸の糖化率を維持する方法を提供する。方法は、複数の異なるグルコース濃度で第一の糖化率を有する生体分子をインキュベートすることと、複数の異なるグルコース濃度の各々について、経時的な糖化率を測定することと、経時的な糖化率の測定に基づいて、複数の異なるグルコース濃度の各々の関数として、生体分子の糖化平衡率を決定することと、糖化平衡率および第一の糖化率が所定の糖化率の範囲内に維持されることになる対応するグルコース濃度を特定することと、生体分子の貯蔵寿命にわたって、生体分子を対応するグルコース濃度とインキュベートすることと、を含む。

一部の実施形態では、方法は、アミノ酸の糖化率の関数として生体分子の効力レベルを決定することをさらに含む。

様々な実施形態のいずれかにおいて、生体分子は抗体であってもよい。生体分子が抗体である一部の例では、アミノ酸は、抗原結合に影響を与える可変領域内に位置する。例えば、アミノ酸は、相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置してもよい。例では、ＣＤＲは、重鎖可変領域内に位置する。一部の場合では、アミノ酸はＨＣＤＲ３内に位置する。

一態様では、本発明は、投与時に対象における治療用生体分子の効力を低減する方法を提供する。方法は、糖化の対象となる一つ以上のアミノ酸残基を含む治療用生体分子を特定することを含み、一つ以上のアミノ酸残基の糖化が治療用生体分子の効力を減少させ、１５０ｍｇ／ｄＬ超の濃度のグルコースで治療用生体分子を製剤化することと、を含む。いくつかの実施形態では、グルコース濃度は、２００ｍｇ／ｄＬ超である。

いくつかの実施形態では、一つ以上のアミノ酸残基の糖化は減少し、治療用生体分子の効力は、治療用生体分子の対象への投与後の対象の血中グルコース濃度によって決定される平衡まで増加する。

いくつかの実施形態では、投与時の治療用生体分子の効力の低下は、サイトカイン放出症候群又は注入関連反応の発生率を減少させる。

様々な実施形態のいずれかにおいて、治療用生体分子は抗体であってもよい。治療用生体分子が抗体である例では、一つ以上のアミノ酸は、抗原結合に影響を与える可変領域内に位置し得る。例えば、一つ以上のアミノ酸は、ＣＤＲ内に位置してもよい。例では、ＣＤＲは、重鎖可変領域内に位置する。一部の場合では、一つ以上のアミノ酸はＨＣＤＲ３内に位置する。

一態様では、本発明は、対象への治療用生体分子の投与後の治療用生体分子中のアミノ酸の糖化率を予測する方法を提供し、方法は、アミノ酸に関連する平衡糖化率を特定することと、アミノ酸が糖化または脱糖化される速度を特定することと、投与前に、治療用生体分子中のアミノ酸に関連する初期の糖化率を特定することと、速度に基づいて、治療用生体分子の投与後の時間の関数として糖化率を予測することと、初期の糖化率と平衡糖化率との間の差、および平衡糖化率を予測することと、を含む。

いくつかの実施形態では、上で考察した方法は、アミノ酸に関連する特定された平衡糖化率を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、上で論じた方法は、アミノ酸が糖化または脱糖化される識別された速度を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、上で考察した方法は、投与前の治療用生体分子中のアミノ酸に関連する特定された初期の糖化率を決定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、方法は、３５～４０℃の温度で平衡糖化率を決定することをさらに含む。例では、温度は３７℃である。

いくつかの実施形態では、方法は、３５～４０℃の温度での速度を決定することをさらに含む。例では、温度は３７℃である。

いくつかの実施形態では、方法は、一つ以上のグルコース濃度の関数としてインビトロでの平衡糖化率を決定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、方法は、インビボで到達したアミノ酸の平衡糖化レベルに基づいて、平衡糖化率を決定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、方法は、３～８ｍＭグルコースのグルコース濃度でインビトロでの速度を決定することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、平衡糖化率は、３～８ｍＭグルコースのグルコース濃度に対応する。

いくつかの実施形態では、方法は、速度を使用して、第一次モデルにおいて、速度、初期の糖化率と平衡糖化率との間の差、および平衡糖化率を使用して、糖化率を予測することをさらに含む。

上述の様々な実施形態のいずれかでは、方法は、治療用生体分子の効力を、糖化率および投与後の時間の関数として予測することをさらに含む。

様々な実施形態のいずれかにおいて、生体分子は抗体であってもよい。一例では、アミノ酸は、抗原結合に影響を与える可変領域内に位置する。一例では、アミノ酸はＣＤＲ内に位置する。いくつかの例では、ＣＤＲは、重鎖可変領域内に位置する。特定の例では、アミノ酸はＨＣＤＲ３内に位置する。

様々な実施形態では、上記または本明細書で論じた実施形態の特徴または構成要素のいずれかが組み合わされてもよく、こうした組み合わせは、本開示の範囲内に包含される。上記または本明細書で論じる任意の特定の値は、上記または本明細書で論じる別の関連する値と組み合わせて、範囲の上限および下限を表す値を有する範囲を列挙してもよく、こうした範囲およびこうした範囲内にあるすべての値は、本開示の範囲内に包含される。他の実施形態は、以下の詳細な説明の検討から明らかになるものとなる。

実施形態は、添付図の図における限定としてではなく例として説明される。

図１Ａは、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によって分離されたｍＡｂ－１の電荷バリアントを示す。線１０５：処置なしの１０ｍＭヒスチジンｐＨ６．０中のｍＡｂ－１、線１１０：１０ｍＭヒスチジンｐＨ６．０中のｍＡｂ－１であり、３７℃で１４日間インキュベートされた、線１１５：０．１Ｍグルコースを含む１０ｍＭヒスチジンｐＨ６．０中のｍＡｂ－１であり、３７℃で１４日間インキュベートされた。糖化されたｍＡｂ－１は、二本の破線１２０（８．６分および９．１分）の間に溶出する。糖化されていないｍＡｂ－１は、二本の破線１２５（９．３分および１０．１分）の間に溶出する。 図１Ｂは、対照（未変性）ｍＡｂ－１（ライン１３０）およびグルコースの非存在下で、３７℃で１４日間インキュベートされたｍＡｂ－１（線１３５）のペプチドマップの紫外線（ＵＶ）クロマトグラムを示す。緩衝液条件は以下のとおりであった。移動相Ａ：水中０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；移動相Ｂ：アセトニトリル中０．０４５％ＴＦＡ。 図２は、ｍＡｂ－１におけるＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８における糖化のレベルと、細胞ベースの効力アッセイによって測定される薬物効力との間の相関が線形であり、０．９７の相関係数を有することを示すグラフである。エラーバーは、三重効力の結果の標準偏差を表す。 図３Ａは、２８日間にわたって３７℃でインキュベートされた場合の、異なる濃度のグルコースを有する３０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４中の６．９μＭのｍＡｂ－１の糖化および脱糖化の動態を示すグラフである。円３０６：グルコースなし、円３０８：０．３ｍＭグルコース、円３１０：０．６ｍＭグルコース、円３１２：３ｍＭグルコース、円３１４：６ｍＭグルコース、円３１６：１０ｍＭグルコース、円３１８：２８ｍＭグルコース、円３２０：５６ｍＭグルコース、円３２２：１１１ｍＭグルコース。実線は、最良適合ｋ_１＝８．８９（±１．７９）Ｍ^－１日^－１およびｋ_－１＝０．０９（±０．０２）日^－１を有する動態モデルを使用したグローバル解析からのものである。 図３Ｂは、糖化反応の熱力学的分析を示すグラフである。示されるデータは、式５および式６を使用して、ベースラインおよび振幅の最良適合から決定された（実施例の後の材料および方法を参照されたい）。実線は、最良適合会合定数Ｋ＝１１２（±４０）Ｍ^－１を用いた熱力学的分析からのものである。 図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃは、異なる温度およびｐＨでのｍＡｂ－１脱糖化の動態を示すグラフを示す。１０ｍＭのヒスチジンｐＨ６．０、２９２ｍＭのスクロース、および０．０５％のポリソルベート２０中のｍＡｂ－１を、異なる温度、円４０６：２０℃、円４０８：３０℃、円４１０：３５℃、円４１２：４０℃、円４１４：４５℃、およびｐＨ５．０（図４Ａ）、ｐＨ５．５（図４Ｂ）、およびｐＨ６．０（図４Ｃ）でインキュベートした。図４Ａ～４Ｃのデータは、式６を使用して適合された。 同上。 同上。 図４Ｄは、異なるｐＨでのｍＡｂ－１脱糖化のアレニウス分析を示す。円４２０：ｐＨ５．０、円４２２：ｐＨ５．５、円４２４：ｐＨ６．０。線は、０．９８の相関係数を有する、指定されたｐＨにおける各データセットの線形適合である。見かけの活性化エネルギー（Ｅ_ａ）は、適合の勾配から決定された。 図４Ｅは、様々なｐＨでの５℃での予測およびリアルタイムの脱糖化動態の比較を示すグラフである。三角形４３０：ｐＨ５．０でのリアルタイムデータ、三角形４３５：ｐＨ５．５でのリアルタイムデータ、三角形４４０：ｐＨ６．０でのリアルタイムデータ。線４３１：ｐＨ５．０での予測、線４３６：ｐＨ５．５での予測、線４４１：ｐＨ６．０での予測。線４３１、４３６、および４４１は、アレニウス分析から生成された糖化率の予測である。 図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、平衡におけるｍＡｂ－１糖化レベルのｐＨ依存性を示すグラフである。６．９μＭのｍＡｂ－１を、様々な濃度のグルコース：３ｍＭ（図５Ａ）、６ｍＭ（図５Ｂ）、および１１ｍＭ（図５Ｃ）を含む３０ｍＭの緩衝液中で、３７℃で２８日間インキュベートした。図５Ａ～５Ｃでは、緩衝液は以下の通りであり、円５０５は酢酸塩であり、円５１０はヒスチジンであり、円５１５は ＨＥＰＥＳであり、円５２０はリン酸塩である。糖化の平衡レベルを、見かけの動態分析から決定した。三つのデータセットすべてを、式３によってグローバルに分析し、Ｌｙｓ９８のｐＫ_ａは６．７（６．６、６．９）であり、糖化についての顕微鏡的会合定数Ｋ_２は、１２０（±２６）Ｍ^－１であることを示した。 同上。 同上。 図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄおよび６Ｅは、４５℃（図６Ａ）、３７℃（図６Ｂ）、３０℃（図６Ｃ）、２５℃（図６Ｄ）、および１５℃（図６Ｅ）での様々なグルコース濃度の関数としてのＨＣ－ＣＤＲ－Ｌｙｓ９８の糖化平衡率を示すグラフである。各データ点は、糖化反応または脱糖化反応に応じて、式５または６のいずれかを使用した動態分析から取得された。線は、式１１を使用したＮＬＬＳ分析である。 同上。 同上。 同上。 同上。 図７は、ｍＡｂ－１糖化平衡のファント・ホッフ分析を示すグラフである。会合定数Ｋを、異なる温度およびグルコース濃度でのｍＡｂ－１糖化の熱力学的分析から決定した。グラフ内の線は、相関係数０．８９を有するすべてのデータの線形適合である。 図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、二つのｍＡｂ－１アームの予測される構造を示す。（図８Ａ）ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の予測された局所環境であって、このリジンは、Ｔｙｒ３２、Ｐｈｅ２７およびＴｙｒ１０６の芳香族環、ならびにＶａｌ２の脂肪族側鎖によって囲まれている。（図８Ｂ）ＭＤシミュレーションからのグルコース付加物を用いたＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の予測された局所環境。（図８Ｃ）ＨＣ^＊－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の予測された局所環境であって、このＬｙｓはＰｈｅ２７、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ１０９、およびＡｓｐ１１２によって囲まれている。芳香族環に面するＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８とは異なり、ＨＣ^＊－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８はＡｓｐ１１２の側鎖に向かって面する。 同上。 同上。 図９Ａおよび図９Ｂは、インビボでのＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８脱糖化の測定および予測レベル（図９Ａ）、ならびにインビボでのグルコース濃度の対応する測定値（図９Ｂ）を時間の関数として示す。 同上。 図１０Ａ、１０Ｂ、１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ、および図１２Ｂは、サルにおける静脈内注射後の治療用生体分子のインビボでの脱糖化のデータを示す追加のプロットを示す。図１０Ａ、１１Ａ、および図１２Ａは、時間（日）の関数としてｍＡｂ濃度（μｇ／ｍＬ）と共にプロットされたＨＣ－Ｌｙｓ９８糖化率を示し、図１０Ｂ、１１Ｂ、および図１２Ｂは、時間（日）の関数として測定されたグルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）と共にプロットされたＨＣ－Ｌｙｓ９８糖化率を示す。試験したｍＡｂの各々について、ｍＡｂを産生するためのバイオリアクター中のグルコース濃度は、３００～１０００ｍｇ／ｄＬであった。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。

以下の詳細な説明では、本明細書の一部を形成し、実施され得る例示の実施形態によって示される添付図面を参照する。当然のことながら、他の実施形態が利用されてもよく、構造的または論理的な変更が、範囲から逸脱することなく行われてもよい。したがって、以下の詳細な説明は、制限的な意味で解釈されるべきではない。

様々な操作は、実施形態を理解するのに有用であり得る様式で、複数の個別の操作として説明され得るが、説明の順序は、これらの操作が順序依存性であることを暗示するものとして解釈されるべきではない。

説明は、それぞれ同じまたは異なる実施形態の一つ以上を指し得る、「実施形態」という用語を使用し得る。さらに、実施形態に関して使用される場合、「含む」、「有する」という用語は、同義であり、概して「オープン」用語として意図されている（例えば、「含む」という用語は、「限定されないが含む」というように解釈されるべきであり、「有する」という用語は、「少なくとも有する」というように解釈されるべきであり、「含む」という用語は、「限定されないが含む」というように解釈されるべきである）。

本明細書の任意の複数および／または単数形の用語の使用に関して、当業者は、文脈および／または用途に適切なように、複数形から単数形へ、および／または単数形から複数形へと翻訳することができる。様々な単数／複数の置換は、明確にするために本明細書に明示的に記載され得る。

本発明を記載する前に、記載された特定の方法及び実験条件に本発明が限定されず、それはこのような方法及び条件が変化し得るためであることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって制限されるものとなることから、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的で使用されており、制限することを意図しないことも理解されるべきである。実施形態の任意の実施形態または特徴は、互いに組み合わせることができ、こうした組み合わせは、本発明の範囲内に明示的に包含される。

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書にて使用される場合、「約」という用語は、特定の言及される数値に関して使用される場合、値が言及された値から１％以下まで変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現には、９９及び１０１、並びにその間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）が含まれる。さらに、数値の範囲の列挙は、該範囲によって包含される任意の数値、および／または該範囲内に含まれる任意の値の範囲を含む。例えば、１～１０の数値範囲は、範囲を包含し、追加的に、個々の数値（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）、および該数値範囲内の範囲（例えば、１～２、１～４、２～５、３～７、４～９、５～１０など）を包含する。

本明細書に記載されたものと類似又は均等な任意の方法及び材料を本発明の実践又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料をこれから記載する。本明細書に言及される全ての特許、特許出願、及び非特許刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される略語
ＣＤＲ：相補性決定領域

ＣＥＸ：陰イオン交換クロマトグラフィー

ＣＳＦ：コロニー刺激因子

ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化

ＨＣ：重鎖

ＨＣＶＲ 重鎖可変領域

ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ

ＩｇＭ 免疫グロブリンＭ

ＩＦＵ：取扱説明書

ＩＥＣ：イオン交換クロマトグラフィー

ＬＣ－ＭＳ：液体クロマトグラフィー質量分析

ＬＣＶＲ 軽鎖可変領域

ｍＡｂ：モノクローナル抗体

ＭＡＬＤＩ：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化

ＭＧ：医薬品ガイド

ＭＳ／ＭＳ：タンデム質量分析

ＮＬＬＳ：非線形最小二乗

ＰＰＩ：患者パッケージインサート

ＰＴＭ：翻訳後修飾

ＴＣＥＰ－ＨＣｌ：トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩

ＴＦＡ トリフルオロ酢酸

ＴＮＦ：腫瘍壊死因子

ＵＶ：紫外線

定義
本明細書で使用される場合、「試薬」という用語は、任意のタンパク質、ペプチド、抗体、抗原結合断片、またはその他の目的の分子を指す。例では、薬剤は、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原結合断片などであり、例えば、抗原への結合に重要なアミノ酸残基など、一つ以上のアミノ酸残基において糖化することができる。したがって、薬剤は、治療剤、診断剤、または医薬品を含み得る。治療剤または医薬品は、単独で、または追加の化合物と共に、所望の応答を誘発するものである（疾患または状態を患う対象を治療することを含む、対象に投与されたときに、治療効果または予防効果を誘発するなど）。本明細書で論じると、薬剤は治療用生体分子と称され得る。

本明細書で使用する「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された四つのポリペプチド鎖、二つの重鎖（ＨＣ）および二つの軽鎖（ＬＣ）からなる免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）またはこれらの抗原結合断片を指すことが意図される。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「Ｖ_Ｈ」）および重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ１ドメイン、Ｃ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインからなる）からなる。様々な実施形態では、重鎖は、ＩｇＧアイソタイプであってもよい。一部の事例では、重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択される。一部の実施形態では、重鎖は、アイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ４の重鎖であり、任意で、アイソタイプＩｇＧ１／ＩｇＧ２またはＩｇＧ４／ＩｇＧ２のキメラヒンジ領域を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲまたは「Ｖ_Ｌ」）および軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）からなる。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域へとさらに細分化することができる。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された三つのＣＤＲと四つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化および非グリコシル化免疫グロブリンと任意のアイソタイプまたはサブクラスの糖化および非糖化の両方の言及を含む。「抗体」という用語は、抗体を発現するためにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体などの組換え手段によって調製、発現、作成、または単離される抗体分子を含む。抗体構造に関するレビューについては、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ －ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，２７（１） Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５－７７（２００３）；ａｎｄ Ｍ．Ｐｏｔｔｅｒ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，２（１） Ｓｕｒｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２７－４２（１９８３）を参照されたい。

抗体という用語は、一つ以上の異なるエピトープに結合し得るヘテロ四量体免疫グロブリンを含む、「二重特異性抗体」も含む。単一重鎖および単一軽鎖ならびに六つのＣＤＲを含む二重特異性抗体の半分は、一つの抗原またはエピトープに結合し、抗体の残りの半分は、異なる抗原またはエピトープに結合する。場合によっては、二重特異性抗体は、同じ抗原に結合することができるが、異なるエピトープまたは重複しないエピトープに結合することができる。一部の場合では、二重特異性抗体の両方の半分が、二重特異性を保持しながら同一の軽鎖を有する。二重特異性抗体は、概して、米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号（２０１０年１２月３０日）に記載されている。

抗体の「抗原結合部分」（または「抗体断片」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の一つ以上の断片を指す。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって結合された二つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨドおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ２４１：５４４－５４６）、（ｖｉ）単離されたＣＤＲ、ならびに（ｖｉｉ）ＶＬおよびＶＨ領域がペアリングして一価分子を形成する、単一タンパク質鎖を形成するように合成リンカーによって継合された、Ｆｖ断片の二つのドメイン、すなわち、ＶＬおよびＶＨからなる、ｓｃＦｖが挙げられる。ダイアボディなどの単鎖抗体の他の形態も、用語「抗体」の下に包含される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３） ９０ ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．６４４４－６４４８；Ｐｏｌｊａｋｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３を参照されたい）。

さらに、抗体およびその抗原結合断片は、当該技術分野で一般的に知られている標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して取得することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成する方法も、当該技術分野で知られている。例えば、モノクローナル抗体を生成するためにＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技法（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）を参照されたい）または任意の他の既知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、所望の抗原に対する高親和性キメラ抗体が最初に単離される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが抗原刺激に応答してヒト可変領域及びマウス定常領域を含む抗体を産生するように、内在性マウス定常領域座に作動可能に連結されたヒト重鎖可変領域及びヒト軽鎖可変領域を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスを生成することを伴う。抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡが単離され、ヒト重鎖定常領域及びヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に結合される。次に、完全ヒト抗体を発現することができる細胞においてＤＮＡが発現される。

「エピトープ」という用語は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域中の特定の抗原結合部位と相互作用する抗原性決定基を指す。単一の抗原は、二つ以上のエピトープを有してもよい。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合してもよく、異なる生物学的効果を有してもよい。エピトープは、立体構造的又は直線状のいずれであってもよい。立体構造的エピトープは、直線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって生成される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基によって生成されるエピトープである。ある特定の状況では、エピトープは、抗原上の糖、ホスホリル基、またはスルホニル基の部分を含み得る。

「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本発明のヒトｍＡｂは、例えばＣＤＲ、特に、ＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダムもしくは部位特異的変異誘導により、またはインビボで体細胞変異により導入される変異）を含んでもよい。しかしながら、用語「ヒト抗体」とは、本明細書にて使用される場合、別の哺乳類種（例えば、マウス）の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列上に移植されているｍＡｂを含むようには意図されていない。この用語は、非ヒト哺乳類において、または非ヒト哺乳類の細胞において組換え産生された抗体を含む。この用語は、ヒト対象から単離された、またはヒト対象において生成された抗体を含むよう意図されるものではない。

抗体、Ｉｇ、抗体結合断片の、抗原または他の分子（例えば、糖）のいずれかへの結合との関連で「結合」という用語は、典型的には、最小二つの実体、または抗体－抗原相互作用、または抗体－糖（例えば、グルコース）相互作用などの分子構造間の相互作用または会合を指す。

例えば、抗体、Ｉｇまたはその抗体結合断片の抗原への結合親和性は、典型的には、例えば、抗原をリガンドとし、抗体、Ｉｇまたは抗体結合断片を分析物（または抗リガンド）として用いるＢＩＡｃｏｒｅ ３０００装置で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって測定した場合、約１０^－７Ｍ以下、例えば約１０^－８Ｍ以下、例えば約１０^－９Ｍ以下などのＫ_Ｄ値に相当する。したがって、抗体または他の結合タンパク質は、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対するその親和性よりも少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも１，０００倍低い、例えば少なくとも１０，０００倍低い、例えば少なくとも１００，０００倍低いＫ_Ｄ値に対応する親和性で、所定の抗原または受容体に結合する。

本明細書で考察されるように、抗体、Ｉｇ、または抗体結合断片の抗原に対する結合親和性は、抗体、Ｉｇ、または抗体結合断片と抗原との間の結合に重要なタンパク質の領域中の抗体、Ｉｇ、または抗体結合断片に対するＰＴＭ（例えば、糖化）によって変化（例えば、減少）され得る。結合親和性の低下は、次に、抗体、Ｉｇ、または抗体結合断片の効力の低下をもたらし得る。本明細書で論じるように、抗体、Ｉｇ、または抗体結合断片に関する「効力」は、特定の強度の効果を生じさせるために必要な量に関して表される薬物活性の尺度を指す。例えば、非常に強力な薬物（例えば、治療用ｍＡｂ）は、より低い濃度で所与の応答を誘発する場合があり、一方でより低い効力の薬物はより高い濃度で同じ応答を誘発することになる。ｍＡｂの効力は、例えば、発光シグナル強度に依存して薬物（例えば、ｍＡｂ）濃度を活性と相関させる細胞ベースのバイオアッセイで測定することができる。

本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、状態または疾患に関連する一つまたは複数の兆候または症状を低減または阻害するなど、所望の応答を生成するのに十分である薬剤の量を指す。対象に投与されるとき、標的組織／細胞濃度を達成する用量が一般的に使用される。一部の例では、「有効量」は、障害または疾患のいずれかの一つまたは複数の症状および／または根底にある原因を治療する量である。

一部の例では、有効量は、単独で、または薬学的に許容可能な担体もしくは一つ以上の追加の治療薬と共に、所望の応答を誘発する医薬調製物の量である。

一例では、所望の応答は、例えば、状態または疾患に関連する症状の数および／または量を低減することによって、対象の生存時間を増加させ、および／または対象の生活の質を改善することである。別の実施例では、所望の応答は、疾患の進行を遅らせるか、または除去すること、例えば、がんの進行を遅らせるか、または除去することによって、対象の生存時間を増加させ、および／または対象の生活の質を改善することである。

疾患、症候群、ウイルス感染などの症状および／または根底にある原因は、医薬調製物が効果的であるために完全に阻害される必要はない。例えば、医薬調製物は、医薬調製物の非存在下で典型的な進行と比較して、疾患、症候群、ウイルス感染などの進行を、所望の量、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらに少なくとも１００％減少させ得る。

別のまたは追加の例では、対象内の疾患の症状を部分的または完全に軽減するのに十分な量である。治療は、疾患の進行を一時的に遅らせることのみを含むことができるが、疾患の進行を永久的に停止または逆転させることも含み得る。

本明細書に記述した薬剤の有効量は、例えば、対象の状態または疾患に関連する一つまたは複数の兆候または症状の減少について分析する、または状態または疾患に関連することが知られている一つまたは複数の分子の発現レベルを測定するなど、多くの異なる方法で決定されうる。有効量はまた、本明細書に記載されるアッセイを含む、様々なインビトロ、インビボ、またはインサイツアッセイを介して決定することができる。

開示された治療薬は、治療過程の間、単回用量で、または複数回用量で、例えば、毎時、毎日、毎週、毎月、毎年投与することができる。有効量は、治療される対象、治療される状態の重症度およびタイプ、ならびに投与方法に依存し得る。

本明細書で使用される場合、「糖化」という用語は、タンパク質アミン基、主にアルファアミン末端およびリジン側鎖上のイプシロンアミン基上の非酵素的グリコシル化を指す。糖化は、より複雑なメイラード反応に向けた最初のステップである。糖化は、タンパク質が還元糖（例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース）とインキュベートされるか、またはそうでなければ接触したときに起こり得る。糖化反応では、感受性（例えば、脱プロトン化）アミン基は、還元糖のアルデヒド基と可逆的に縮合して不安定なシッフ塩基中間体を形成し、これは自発的な多段階アマドリ再構成を受けて、より安定な共有結合ケトアミンを形成することができる。しかしながら、ケトアミン・アマドリ産物は、特定の条件下で糖付加物を失うように可逆的に駆動され得る。

タンパク質の糖化は、インビボでの天然のプロセスであり、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヘモグロビンは、血糖値および循環時間の量に応じて様々な程度の糖化を有することが見出されている。同様に、感受性アミン基を有するタンパク質またはペプチドは、インビトロで糖化を受けることができる。より高い温度および／または酸化環境などのストレス条件下で、アマドリ生成物は、さらなる反応を受け、反応性カルボニルおよびジカルボニル化合物を生成し、次いで、タンパク質と反応して、より安定で不可逆的な付加物を形成することができ、これは、終末糖化産物（ＡＧＥ）として知られる。

市販の治療用抗体産生の複雑さを考慮すると、糖化は珍しくはないが、反応動態および程度は現在予測不可能である。ｍＡｂの糖化は、発酵プロセス中に起こり得、グルコースは、ｍＡｂ産生細胞のエネルギー源である。糖化のレベルは、哺乳類細胞培養のプロセス中の総糖供給によって影響を受け得る。温度、ｐＨ、時間、イオン強度、およびこれに類するものを含むがこれに限定されない変数は、糖化の動態および程度に影響を与えうる。存在する糖のタイプ（例えば、ヘキソース糖）およびアクセス可能なアミノ基の特異的反応性は、タンパク質の糖化に影響を与え、治療用タンパク質の不均一性を増加させることができる。

一部の例では、糖化は、保存製剤中に還元糖を含めることによって、保存条件中にタンパク質（例えば、治療用ｍＡｂ）に導入され得る。還元糖が製剤に含まれない場合であっても、それらは、ｐＨ（例えば、酸性ｐＨ）および温度（例えば、高温）を含むがこれらに限定されない条件に応じて、高次炭水化物（例えば、スクロース）の分解によって生成され得る。

これまでに、潜在的な糖部位を示すか、または糖化に対するアミノ酸の感受性を示す特定のタンパク質配列（例えば、一次構造）または一般化（例えば、縮重）配列は特定されていない。しかしながら、三次元ローカル環境が糖化の形成に影響を与える可能性がある。例えば、アミン基の反応性は、ケトアミン・アマドリ生成物が形成される前の中間体のアミン脱プロトン化および安定化に影響を与える局所条件に依存し得る。詳細には、ヒスチジン残基または塩基性残基（アルギニンおよび他のリジン）は、既知の構造（例えば、肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ、ＲＮａｓｅ Ａ、ＤＮａｓｅ Ｉ、アルブミン、ヘモグロビン）を有する一部のタンパク質における糖化の発生と相関する。カルボン酸（例えば、アスパラギン酸）の触媒効果はまた、糖化と相関する。

ｍＡｂなどの治療用生体分子については、例えば生物学的に機能する部位を破壊する、または凝集を誘発するさらなる分解などの糖化の潜在的な効果は、糖化を潜在的に重要な品質特性（ＣＱＡ）にする。本明細書で論じる「ＣＱＡ」という用語は、所望の製品品質を確保するために適切な限界、範囲、または分布の範囲内であるべきである物理的、化学的、生物学的、または微生物学的特性または特性のうちの一つ以上を指す。

本明細書で使用される場合、「Ｋ_Ｄ」（Ｍ）という用語は、特定の結合タンパク質－リガンド相互作用の平衡解離定数を指す。例えば、Ｋ_Ｄは、抗体、Ｉｇ、または抗体結合断片と抗原との間の解離平衡定数、または抗体、Ｉｇ、または抗体結合断片と糖（例えば、グルコース）分子との間の解離平衡定数を指し得る。Ｋ_Ｄと結合親和性の間に反比例の関係があり、したがって、Ｋ_Ｄ値が小さいほど、親和性が高い、すなわち、より強い。したがって、「より高い親和性」又は「より強い親和性」という用語は、相互作用を形成するより高い能力、したがって、より小さなＫ_Ｄ値に関し、逆に、「より低い親和性」又は「より弱い親和性」という用語は、相互作用を形成するより低い能力、したがって、より大きなＫ_Ｄ値に関する。解離平衡定数Ｋ_Ｄは、１／Ｋに等しい。

本明細書で使用される場合、「ｋ_１」（Ｍ^－１×日^－１）という用語は、特定のタンパク質－糖（例えば、抗体－グルコース）相互作用の会合速度定数を指し、糖化速度とも呼ばれる。

本明細書で使用される場合、「ｋ_－１」（日^－１）という用語は、特定のタンパク質－糖（例えば、抗体－グルコース）相互作用の解離速度定数を指し、脱糖化速度とも呼ばれる。

本明細書で使用される場合、「Ｋ」（Ｍ^－１）という用語は、特定のタンパク質－糖（例えば、抗体－グルコース）相互作用の見かけの会合定数を指す。会合定数Ｋは、ｋ_１をｋ_－１で割ることによって得ることができる。

本明細書で使用される場合、「Ｋ_１」および「Ｋ_２」という用語は、タンパク質脱プロトン化反応、およびタンパク質糖化反応にそれぞれ対応する平衡定数を指し、各反応は、ｐＨ依存性糖化を定量的に分析するための平衡モデルに対応する。より詳細には、本明細書で使用されるＫ_１は、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８側鎖上のアミンの脱プロトン化のための平衡定数に関し、Ｋ_２は、グルコースの脱プロトン化アミンへの結合のための平衡定数に関する。ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８のε－アミン基のｐＫ_ａは、ｐＫ_ａ＝－ｌｏｇ（Ｋ_１）から決定することができ、Ｋとは対照的に、Ｋ_２は、糖化反応のｐＨ非依存性の顕微鏡的会合定数である。ｐＫ_ａ値が低いほど、より強い酸を示し、ｐＫ_ａが高いほど、より弱い酸を示す。アミノ酸の特定の群のｐＫ_ａは、タンパク質微小環境に応じて変化し得る。

本明細書で使用される場合、“ｋ_{ａｐｐ，１}”および“ｋ_{ａｐｐ，２}”という用語は、それぞれ、糖化反応および脱糖化反応の見かけの反応速度定数を指す。本明細書で使用される場合、「糖化反応」という用語は、経時的なタンパク質の糖化の割合の増加を指し、「脱糖化反応」という用語は、経時的なタンパク質の糖化の割合の減少を指す。

本明細書で使用される場合、「Ｅ_ａ」という用語は、化学反応をもたらすために化合物に提供しなければならないエネルギーの最小量に対応する見かけの活性化エネルギーを指す。Ｅ_ａは、異なる温度での脱糖化動態に基づいて、アレニウス方程式から計算することができる。Ｅ_ａを減少させて、それによって反応速度を増加させることができ、または増加させることができ、次いで、反応速度を減少させることができる。活性化エネルギーを低減することができる一つの要因は、温度であり、例えば、温度の上昇は、特定の反応に関与する分子のエネルギーレベルの上昇を引き起こし、それによって反応速度を増加させることができる。活性化エネルギーはまた、他の方法で変化させることができ、例えば、特定の反応は、ｐＨに応じてより速くまたはより遅く進行し得る。一般に、その活性化エネルギーを減少させることによって反応を速めるプロセスは触媒と呼ばれ、活性化エネルギーの低下に寄与する因子は触媒と呼ばれる。したがって、本明細書で論じる触媒には、温度およびｐＨが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「アレニウス挙動」という用語または「アレニウス挙動を示す」という用語は、ｋ_ａｐｐの自然対数（ｌｎ）対逆温度（１／Ｔ）のプロットが直線をもたらす反応を指す。アレニウスプロットの線の勾配は、活性化エネルギーＥ_ａに比例し、活性化エネルギーが高いほど（例えば、勾配がより険しい）、特定の反応に対する速度定数（ｋ_ａｐｐ）の温度依存性が強くなる。したがって、広義に言えば、アレニウス挙動を示す反応は、温度によって影響を受ける反応に関する。

本明細書で使用される場合、「接触させる」ことは、溶液または固相中の少なくとも二つの物質を一緒にすることを含む。

本明細書で使用される場合、「ボトムアップ型質量分析」という用語は、精製されたタンパク質（または複合体タンパク質混合物）がタンパク質切断を受け、ペプチド生成物がＭＳによって分析される質量分析方法を指す。

本明細書で使用される場合、「トップダウン型質量分析」という用語は、インタクトなタンパク質イオンが気相に導入され、質量分析計で断片化および分析され、タンパク質ならびにタンパク質イオン断片ラダーの分子量をもたらす、質量分析方法を指す。

本明細書で使用される場合、「サイトカイン」という用語は、ナノからピコモル濃度で液性因子として作用し、正常または病理学的状態のいずれかで、個々の細胞および組織の機能活性を調節する、細胞から放出される可溶性タンパク質およびペプチドの多様な群を指す。これらのタンパク質はまた、細胞間の相互作用を直接媒介し、細胞外環境で起こるプロセスを調節する。多くの成長因子およびサイトカインは、プログラム細胞死を防止することによって細胞生存因子として作用する。サイトカインには、天然に存在するペプチドと、完全または部分的な生物学的活性を保持するバリアントの両方が含まれる。特定のサイトカインは、オートクリン、パラクリン、および／または内分泌活性を有し、受容体結合を介して、サイトカインおよび標的細胞に応じて様々な応答を誘発することができる。サイトカインの多くの機能には、細胞増殖および分化の制御、ならびに血管新生ならびに免疫および炎症応答の調節がある。

本明細書で使用される場合、「サイトカインストーム」または「サイトカイン放出症候群」という用語は、自然免疫系が炎症促進性サイトカインの制御不能な過剰放出を引き起こすヒトまたは他の動物で起こり得る生理学的反応を指し、これは最終的に、サイトカインストーム／症候群を経験するヒトまたは動物に重大な害を与えるか、または死を引き起こす可能性がある。サイトカインストームは、多種多様な感染性疾患および非感染性疾患と関連しており、一部の例では、治療用生体分子（例えば、モノクローナル抗体）などの異物をヒトまたは動物に導入することに応答して誘導され得る。サイトカインストームに関連するサイトカインには、インターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が含まれ得るが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「低減」または「減少」という用語は、あるものの品質、量、または強度を低減することを指す。一例では、治療用生体分子（例えば、治療用モノクローナル抗体）の糖化は、糖化が、その機能に重要な治療用生体分子の領域、例えば、治療用生体分子と標的分子との間に特異性を付与する領域で生じる状況下で、治療用生体分子の効力を低減することができる。治療用生体分子が抗体である例では、ＨＣまたはＬＣに対応する一つ以上のＣＤＲ、好ましくはＨＣに対応するＣＤＲ、より好ましくはＨＣ ＣＤＲ３における糖化は、抗体の効力を低減することができる。

概要
本明細書で論じるように、糖濃度（例えば、グルコース濃度）、時間、温度、およびｐＨを含むがこれに限定されない他の変数のうちの少なくとも一つ以上の関数として、インビトロおよびインビボの両方で生体分子、特に治療用生体分子（例えば、治療用抗体）において糖化／脱糖化が起こる速度を確実に予測するために使用され得る方法論に対するニーズがある。

インビトロでの生体分子における糖化率を予測する方法
モノクローナル抗体などの治療用生体分子は、任意の数の潜在的な糖化反応部位を有し得るため、治療用生体分子における糖化の特定および特徴付けは困難であり得る。標的抗原を特異的に認識（例えば、結合）するのに重要ではない治療用生体分子の特定の領域における糖化は、効力を低下させることなく許容され得るが、安定性は依然として影響を受け得る。あるいは、アミノ酸の糖化は、標的抗原の結合に重要であり、効力を低減することができ、これは次に、それを必要とする対象に与えられることが意図される治療剤の有効量に悪影響を及ぼし得る。対象に投与されることが意図される生物学的治療剤の有効量が、糖化から生じる効力の減少に起因して、不注意に低減される場合、治療の有効性は低下し得る。例えば、抗体ＨＣのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）、または一部の例では、抗体ＬＣにおけるアミノ酸の糖化は、効力を低下させ得る。したがって、ｍＡｂなどの治療用生体分子については、例えば貯蔵条件下で、インビトロでの糖化／脱糖化速度を予測する方法が必要である潜在的なＣＱＡである。

本開示の範囲内で、治療用生体分子（例えば、抗体）の糖化を評価するための分析方法がある。例としては、電荷ベースの方法、ＬＣ－ＭＳ法、比色アッセイ、およびボロネート親和性クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。電荷ベースの方法のうち、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）または画像化キャピラリー電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）は、特定の糖化部位上の正電荷の喪失による糖化を検出することができる電荷ベースの分離方法を含む。別の電荷ベースの方法は、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）であり、これは、表面電荷の差異を有する糖化タンパク質および非糖化タンパク質を分解するために使用され得る。陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）は、正味の正表面電荷を有する分子に対する親和性を有する負電荷イオン交換樹脂を使用し、分取目的および分析目的の両方に使用され得、広範囲の分子量生体分子の分離に有用である。ＣＥＸは、タンパク質の正味表面電荷が、タンパク質の等電点（ｐＩ）によって規定される様式でｐＨと共に変化するという原理に依存する。タンパク質のｐＩと等しいｐＨでは、タンパク質は正味の電荷を担持しない。あるいは、タンパク質のｐＩよりも低いｐＨ、またはタンパク質のｐＩよりも高いｐＨでは、タンパク質は、それぞれ正味正電荷または正味負電荷を担持する。糖化はタンパク質の電荷に影響を与えるため、ＣＥＸを使用して、同じタンパク質の糖化形態および非糖化形態、例えば治療用モノクローナル抗体を分解することができる。

ＬＣ－ＭＳ法を使用して、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）またはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）のいずれかによって、糖化レベルを決定することができる。例えば、各糖化部位が＋１６２Ｄａ質量シフトを示すため、特定の生体分子における糖化レベルの迅速な推定として、トップダウン型質量分析アプローチを使用することができる。特定の糖化部位を見つけるために、ボトムアップ型ペプチドマッピングアプローチを使用し得る。例えば、トリプシンはリジン残基の糖化によって阻害されるため、＋１６２Ｄａの質量添加によるトリプシン切断の見逃しは、糖化リジン残基を示し得る。

比色分析アッセイに関して、抗体糖化から形成されるケトアミンは、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）還元アッセイによって定量化することができる。ＮＢＴは、糖化タンパク質のケトアミン形態によって還元され、５２５ｎｍでの吸光度の変化をもたらす。

ボロン酸エステル親和性クロマトグラフィー（ＢＡＣ）に関して、ＢＡＣは、シス－ジオール化合物の濃縮を単離するための技術である。固定相上のボロン酸エステル官能基は、アルカリｐＨ条件下で四面体アニオンを形成し、これは糖分子上に見出されるシス－１，２－ジオールアレイと相互作用することができ、脱糖化した種から別個に糖化することができる。糖化された種を溶出するために、ｐＨを低下させるか、またはヒドロキシル基の競合源、例えばソルビトールを加えることによって、相互作用を破壊することができる。

上述のように、治療用生体分子の糖化は、効力に影響を与えてもよく、または影響を与えなくてもよい。効力に対する糖化の影響は、様々なレベルの糖化（例えば、０％～１００％、１％～９０％など）を有する生体分子溶液を生成することによって調べることができる。一例では、様々なレベルの糖化を有する生体分子溶液は、様々な比率で生体分子の糖化型および脱糖化型を混合することによって生成することができる。次いで、異なる生体分子溶液を、溶液の活性を評価するのに関連する任意のアッセイで試験することができる。例えば、生体分子溶液は、アッセイの読み出しが様々な生体分子溶液の効力に関連する、細胞ベースまたは非細胞ベースのアッセイで試験することができる。代表的な例として、細胞ベースのアッセイは、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）の発現レベルに依存して、様々な生体分子溶液の効力を評価し得る。効力は、別様に同じであるが、糖化率がより大きいかまたはより小さい他の生体分子溶液と比較して、発現を抑制または発現を増強する特定の生体分子溶液の能力の尺度であり得る。得られたデータをプロットして、様々な生体分子溶液中の糖化率の関数として効力指標（例えば、効力パーセント）を明らかにすることができる。例では、糖化率が大きいほど、生体分子の効力が低くなり、糖化率が少ないほど、効力が高くなる。

効力の測定は、一つ以上の他のアッセイ、例えば結合アッセイで裏付けることができる。本開示に関連する結合アッセイには、標的（例えば、抗原）に対する治療用生体分子（またはその一部）の結合親和性が評価されるアッセイが含まれ得るが、これらに限定されない。そのようなアッセイには、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースの結合アッセイ、生体発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）ベースの結合アッセイ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、リガンドとして抗原を使用し、分析物として治療用生体分子を使用するＢＩＡｃｏｒｅ ３０００機器内、または抗リガンド内）などが含まれるが、これらに限定されない。治療用生体分子の結合親和性は、標的分子を認識および結合することに関与するアミノ酸残基に糖化が対応する場合、生体分子が糖化される程度の関数として影響を受け得る。例えば、治療用生体分子と標的分子との間の親和性は、糖化率が増加するにつれて減少し得、この親和性－糖化率の関係は、糖化の関数として治療用生体分子の効力と相関し、および／または効力を示してもよい。

効力は、治療用抗体などの治療用生体分子の糖化の関数として変化し得るため、時間、ｐＨ、温度、イオン強度などを含むがこれらに限定されない一つ以上の変数の関数として治療用生体分子の糖化レベルを予測する能力は、特定の所望の効力を有する治療用生体分子の投与を確実にする能力を改善することができる。例えば、モノクローナル抗体の糖化は、グルコースがｍＡｂ産生細胞のエネルギー源である発酵プロセス中に生じてもよく、および／または糖化のレベルは、哺乳類細胞培養プロセス中の総糖供給によって影響を受けてもよい。次いで、糖化レベルは、投与前に抗体が貯蔵される条件に応じて、経時的にさらに変化（例えば、増加または減少）し得る。例えば、生体分子は、糖（例えば、グルコース）が貯蔵製剤に含まれていない場合、または脱糖化が好ましいレベルで含まれる場合、脱糖化を受け得る。あるいは、糖が貯蔵形成に含まれる場合、例えば、糖が糖化の増加に有利な濃度で含まれる場合、生体分子が追加の糖化を受ける可能性がある。

本明細書において、脱糖化速度は、より高い温度でより速く、より低い温度でより遅くなり得ることが認識される。治療用生体分子の貯蔵条件は、一般的により低い温度（例えば、５℃以下、例えば、４℃以下、または０℃以下、例えば、－２０℃以下、例えば、－８０℃）であるため、これらのより低い温度での脱糖化速度を正確に知る能力が有利であろう。しかしながら、これらのより低い温度で脱糖化速度を測定することは困難であり、時間がかかる場合がある。代わりに、その後、より低温（例えば、５℃以下）で脱糖化速度を予測することができるように、より高温（例えば、２０～５０℃）での脱糖化速度の決定を可能にする方法が有利であろう。

したがって、一実施形態では、本明細書において、より高い温度で脱糖化パラメータを測定する方法論が開示され、その結果、脱糖化パラメータは、より低い温度（例えば、治療用生体分子が貯蔵される温度）で予測され得る。一実施例では、方法論は、糖（例えばグルコース）の非存在下で、所定の時間枠（例えば５～４０日）でより高温（例えば、２０～６０℃、例えば２０～５０℃、例えば２０～４５℃の間の二つ以上の温度）で、みかけの一次脱糖化反応（実施例に続く材料および方法の式６を参照）を使用して、脱糖化反応のみかけの反応速度定数（例えば、本明細書に開示される「ｋ_{ａｐｐ，２}」）を決定することと、逆温度に対するみかけの反応速度定数（１０００／Ｋ）の自然対数をプロットすることを伴う。見かけの速度定数の自然対数が、温度の低下とともにほぼ直線的に減少する状況下では、データは、直線（例えば、０．９５以上、例えば、０．９８以上の相関係数）と適合して、治療用生体分子が貯蔵される温度（例えば、５℃以下）など、見かけの脱糖化反応速度定数のより低い温度への外挿を可能にすることができる。このようにして、脱糖化見かけの反応速度定数を、より高い温度で得られた実際のデータに依存することによって、より低い温度で予測することができる。特定のより低い温度（例えば、５℃）で予測される脱グリケーション見かけ速度定数を使用して、任意の所望の時間枠（例えば、１０日～１年、またはさらに１年超、例えば、２年、３年、５年、またはそれ以上）にわたって、その特定のより低い温度について、予測される脱糖化プロファイルを（例えば、実施例に続く材料および方法の式６を参照の式６を介して）シミュレーションすることができる。詳細には、予測される脱糖化プロファイルは、選択された温度での経時的な特定の治療用生体分子の糖化率の変化を含み得る。

上述のように、ｐＨなどの他の変数は、糖化／脱糖化反応に影響を与え得る。したがって、実施形態では、上述の方法論は、二つ以上（例えば、３）の異なるｐＨレベルで実施され得る。アレニウス方程式（実施例に続く材料および方法の式７）を使用して、異なるｐＨレベルでの脱糖化反応のための見かけの活性化エネルギー（Ｅ_ａ）を決定することができる。詳細には、各ｐＨでの見かけの活性化エネルギー（Ｅ_ａ）は、決定された見かけの反応速度定数対逆温度の自然対数プロットの線形適合の傾きから決定されうる。これにより、ｐＨが脱糖化速度にどのように影響するか、例えば、見かけの活性化エネルギーが低いほど、より速い脱糖化速度に対応し得、より高い見かけの活性化エネルギーは、より遅い脱糖化速度に対応し得るかの理解が可能になる。この情報は、保存のための治療用生体分子を含む特定の組成物を製剤化する際に使用／信頼され得る。一例として、より高い見かけの活性化エネルギーに対応するｐＨは、貯蔵中の脱糖化速度を遅くすることが目標である場合に選択されうる。別の例では、より低い見かけの活性化エネルギーに対応するｐＨは、貯蔵中の脱糖化速度を速くすることが目標である場合に選択されうる。

治療用生体分子が貯蔵される温度での時間の関数として糖化率を予測する能力を可能にすることによって、治療用生体分子が貯蔵された期間にかかわらず、治療用生体分子の有効量を、それを必要とする対象に投与することが可能であり得る。例えば、貯蔵中に治療用生体分子の脱糖化が発生する状況では、生体分子がより長く保存された場合（例えば、糖化率がより低く、したがってより高い効力を有する）、より少ない用量が対象に投与され得、生体分子がより少ない期間保存された場合（例えば、糖化率がより高く、したがってより低い効力を有する）、より多い用量が対象に投与され得、貯蔵期間に関わらず、同じ効力の治療薬が対象に送達されることになる。追加的または代替的な例では、疾患または状態に関連する兆候または症状の悪化または改善に応答して、時間の関数として投与量を調節することが望ましい場合があり、このような例では、保存時間の関数としての治療薬の効力を使用して、調節された投与量が投与される治療用生体分子の所望の効力に対応することを確保してもよい。

（例えば、特定の温度での）貯蔵条件における時間の関数としての投与量に関連する効力に関する情報は、例えば、患者添付文書（ＰＰＩ）、使用説明書（ＩＦＵ）、医薬品ガイド（ＭＧ）などのうちの一つ以上の一部として含まれ得る。本明細書で論じると、ＰＰＩは、ＦＤＡが承認した薬物標識の一部である患者ラベリングを指す。ＰＰＩは、製造業者によって作製され、ＦＤＡによって承認され、特定の製品または製品のクラスで分注される必要がある。他のＰＰＩは、製造業者がＦＤＡに任意に提出し、ＦＤＡの承認を受けることができるが、それらの配布は義務付けられていない。本明細書で考察されるＩＦＵは、製造業者によって作製され、ＦＤＡによって承認され、患者が製品を適切に使用するのを助ける複雑な投与指示を有する特定の製品で分注される患者ラベリングを指す。本明細書で考察されるＭＧは、多くの処方薬と共に提供される紙の配布物である。本ガイドでは、特定の薬剤および薬剤クラスに特有の問題に対処し、患者が重篤な有害事象を回避するのに役立つＦＤＡが承認した情報を含む。ＦＤＡは、機関が、１）有害作用を防止するために特定の情報が必要である、２）患者の意思決定が、製品による既知の副作用に関する情報によって通知されるべき、または３）製品の使用に関する患者の指示の遵守がその有効性に不可欠であると判断した場合、ＭＧを特定の処方薬剤および生物学的製品に発行することを義務付けている。

例えば、患者は、貯蔵期間の関数として特定の治療剤を摂取するための適切な投与量について、ＰＰＩ、ＩＦＵ、ＭＧなどによって通知され得る。追加的または代替的に、医師または薬剤師は、効力、薬剤投与量、および貯蔵期間の間の予測される関係に依存する特定の投与量を推奨または処方してもよい。

上述の方法は、貯蔵条件下では、糖（例えば、グルコース）が製剤に含まれないことが望ましい治療用生体分子に使用することができる。言い換えれば、こうした方法は、保存前の糖化率の決定に依存し、ここで特定の治療用生体分子は、保存中に経時的に脱糖化を受ける。

貯蔵中に生体分子の糖化率を維持する方法
別の実施形態では、一部の例では、治療用抗体などの治療用生体分子の糖化率が、貯蔵条件下で所定の量の時間にわたって一定である（例えば、０．１％を超えて、または０．５％を超えて、または１％を超えて、または５％を超えて、または１０％を超えて変化しない）ことを確保することが望ましい場合があることが本明細書において認識される。例えば、上述のものと同様に、特定の糖化率は、特定の効力と関連付けられてもよく、治療剤がそれを必要とする対象に投与されるまで、治療用生体分子の貯蔵寿命の間、その特定の糖化率、ひいては、特定の効力を維持することが望ましい場合がある。こうした例では、用量は、糖化レベルの変化の結果として効力のいかなる変化も考慮することなく、治療剤の活性を増加させるように調整され得ることが理解されよう。

可逆的に糖化／脱糖化反応を受けることができる治療用生体分子を含む製剤に含まれる糖（例えば、グルコース）の濃度に到達するために、少なくとも二つの変数が考慮され得る。詳細には、少なくとも二つの変数は、糖化レベル（例えば、糖化率）、および糖化の平衡レベル（例えば、糖化平衡率）の関数としての治療用生体分子の効力に関連し得る。所望の効力レベルを、糖化レベルの関数として実験的に決定して、次のステップは、貯蔵条件中に特定の糖化レベルを経時的に維持するために必要な糖（例えば、グルコース）の濃度を決定することであり得る。特定の糖化レベルを維持するために製剤中に必要な糖の濃度を決定するプロセスは、所望の効力レベルに対応する糖化率を有する生体分子を様々な異なるグルコース濃度とインキュベートすることと、異なるグルコース濃度の各々に対する生体分子の糖化平衡率を決定すること、とを含み得る。そのような方法論では、グルコース濃度の範囲は、グルコース濃度の少なくとも一部分が経時的に増加した糖化を受ける生体分子をもたらすと予想されることを確実にするように選択されてもよく、グルコース濃度の少なくとも別の部分が、経時的に脱糖化反応を受ける生体分子をもたらすと予想され、糖化反応および脱糖化反応の両方がある量の時間の経過後に平衡に達すること（例えば、定常に達する）ことを確実にするように選択されてもよい。糖化反応および脱糖化反応の両方が生じるように、糖濃度の範囲を選択することによって、試験された糖の濃度のうちの少なくとも一つ以上が、経時的な糖化率の変化をほとんどまたは全くもたらさない可能性が高いか、または予想され得る。さらなる糖化反応または脱糖化反応をもたらさない糖の濃度は、製剤に含まれる場合、治療用生体分子が貯蔵される時間枠中に所望の糖化率を維持するのに十分であろう濃度を含むことが理解されよう。

例えば、０．１％未満、または０．５％未満、または１％未満、または５％未満の糖化率の変化をもたらす糖の濃度があってもよく、または一部の例では、１０％未満の変化が許容可能であってもよい。以下の実施例３に関して図３Ａを参照すると、選択される３ｍＭと６ｍＭの濃度との間のグルコース濃度は、糖化率の変化がほとんどまたは全く予想されないグルコース濃度に対応すると理解され得る。

また、本開示の範囲内で、治療用生体分子は、特定の濃度の糖（例えば、グルコース）中でインキュベートされてもよく、それにより、所望の糖化率が、いくつかの所定の時間（例えば、１日以内、２日以内、５日以内、１０日以内、１５日以内、１ヶ月以内など）内に到達する。代表的な例として、治療用生体分子の所望の糖化率は、４０％を含んでもよく、初期の糖化率は、その精製後に２５～２７％を含んでもよい。製剤中に含まれるグルコースの濃度は、所定の時間内に、治療用生体分子の糖化率が所望の４０％平衡糖化レベルに到達し、その後、貯蔵条件中にその平衡に維持されるように、経験的に決定され得る。例において、治療用生体分子は、所望の糖化率に達すると推定されるまで、より高い温度（例えば、２０～４０°Ｃ、または糖平衡決定が行われた任意の温度）に維持されてもよく、次いで、治療用生体分子は、貯蔵条件（例えば、５℃以下）に移されてもよい。

インビボでの治療用生体分子の初期効力を低減する方法
本明細書において、糖（例えば、グルコース）濃度の関数としての糖化の可逆的な性質は、一部の状況下で、治療用生体分子が糖化される程度（例えば、糖化率）の関数として治療用生体分子の効力を制御する能力を可能にし得ることが認識される。上述のように、効力が制御され得る一つの方法は、定義された比で異なる糖化率を有する治療用生体分子の混合を含み、それによって特定の糖化率を有する治療用生体分子の溶液を得ることを含み得る。別の例は、治療用生体分子が所望の糖化率で糖化平衡に達するように、所定の量の糖（例えば、グルコース）とある程度糖化される治療用生体分子をインキュベートすることを含み得る。こうした例では、患者は、所定の効力を有する治療用生体分子を投与され得る。

しかしながら、本明細書において、糖化の可逆的な性質に起因して、治療用生体分子が関与する糖化／脱糖化反応が、一部の例では、対象への投与後にインビボで起こり得ることがさらに認識される。糖化反応または脱糖化反応がインビボで起こるかどうかは、対象への投与時の治療用生体分子の初期の糖化率、および治療用生体分子を受ける対象の体内の糖（例えば、グルコース）の濃度を含むがこれらに限定されない、いくつかの因子に依存し得る。例えば、投与時に糖化がほとんどまたは全くない治療用生体分子は、循環中の経時的に、血流中のグルコース濃度に基づいて、いくらかの糖化平衡率まで糖化され得る。一方で、より重度に糖化される治療用生体分子（例えば、５０％の糖化）は、循環中の経時的に脱糖化反応を受けて、同様に血流中のグルコース濃度に基づいていくらかの糖化平衡率に達し得る。血糖反応が循環中で経時的に生じる場合（例えば、治療用生体分子がより糖化される）、投与時の生体分子の初期効力と比較して、生体分子の効力が経時的に低減され得る。あるいは、脱糖化反応が循環中で経時的に生じる場合（例えば、治療用生体分子がそれほど糖化されない）、投与時の生体分子の初期効力と比較して、生体分子の効力が経時的に増加され得る。

一部の例では、投与時に経時的に変化する（効力を増加または減少させる）初期効力を有する治療用生体分子を、必要とする患者に投与することが有利であり得ることが、本明細書において認識される。例えば、治療用生体分子などの異物の対象への投与は、一部の状況下で、対象においてある程度のサイトカインストームを誘導し得ることが知られている。治療用生体分子が対象においてサイトカインストームまたは他の望ましくない応答を誘発する可能性を減少させるための一つの選択肢は、循環において経時的に効力が増加すると予想して、低減された効力で治療用生体分子を対象に投与することを含み得る。これは、治療用生体分子の糖化率を、対象への投与のための第一の糖化率に制御することによって達成されてもよく、その結果、治療用生体分子の糖化率は、経時的に循環中の第二の糖化率（平衡糖化率）に変化（例えば、減少）する。これは、単回用量で、サイトカインストームを誘発する可能性を低減する効力を最初に有し、循環中に経時的に効力が増大する治療用生体分子を可能にする効果を提供し得る。

その投与後の循環において経時的に増加する低減された効力を有する治療用生体分子を提供するために、初期の糖化率は、インビボでの治療用生体分子の平衡糖化率よりも高い必要がある。インビボでの治療用生体分子の糖化平衡率は、治療用生体分子が循環している時間枠中の循環グルコース濃度（例えば、平均グルコース濃度）の関数である。例えば、対象におけるグルコースレベルは、食物摂取量、運動持続時間および／または強度、ストレスレベル、絶食持続時間などを含むがこれらに限定されない、一つ以上の変数の関数として経時的に変化し得る。したがって、経時的な平均グルコースレベルは、一部の個体では低く、他の個体では高くてもよい。例えば、血糖制御が不良な個体（例えば、インスリン抵抗性）は、平均してより高い血糖値になる傾向があり得る。

代表的な例として、治療用生体分子を対象に投与すると、治療用生体分子は、ある程度の時間後に２０～２５％の糖化平衡率に達し得る。平衡に達するのにかかる時間に影響を与え得る要因としては、限定されないが、初期の糖化率、脱糖化（または一部の実施例では、糖化）反応速度（例えば、特定のアミノ酸が糖化にどの程度感受性であるかの関数であり得る）、および経時的なグルコース濃度変動を挙げることができる。したがって、上記の例に関して、５０％の初期糖化率を有する治療用生体分子は、ある程度の時間にわたって２０～２５％の糖化平衡率まで減少し得る。一方で、治療用生体分子が、例えば５％の糖化などのインビボの糖化平衡率よりも低い糖化率で投与された場合、治療用生体分子は、経時的にインビボで糖化されて、循環中の時間と共に２０～２５％の糖化平衡率に達し得る。もちろん、個々のグルコースレベルに応じて、異なる個体に対して異なる糖化平衡率があり得る。例えば、糖化平衡率は、より高い平均グルコースレベルを有する個体では３０～３５％であり得、糖化平衡率は、より低い平均グルコースレベルを有する個体では１５～２０％であってもよい。

したがって、治療用生体分子がインビボで経時的に効力を初期効力から最終効力（例えば、インビボでの糖化平衡電位によって決定される効力）に変化させる程度は、初期の糖化率とインビボの平衡糖化率との差の関数であると理解され得る。したがって、初期の糖化率は、治療用生体分子が、循環グルコース濃度によって定義される効力まで経時的に増加する所定のレベルの低減された効力（例えば、より大きな初期の糖化率）を示すように、または治療用生体分子が、循環グルコース濃度によって定義される効力まで経時的に減少する所定のレベルの増強された効力を示すように、選択され得る。

初期の糖化率がインビボの糖化平衡率よりも高く、したがって、対象への初期投与時に効力の低下を示し、その後、経時的に増加する例では、初期の効力の低下は、以下の効果のうちの一つ以上をもたらし得る。例えば、初期効力の低下は、初期の低減された効力のない他の同じ治療用生体分子と比較して（例えば、より小さな程度まで糖化される）、サイトカインストーム、又は治療用生体分子の投与から生じる他の有害な免疫応答に関連する一つ以上の徴候又は症状を減少させる効果を有し得る。例えば、初期効力の低下は、初期効力の低下を欠く他の同じ治療用生体分子と比較して、一つ以上のサイトカインの放出の程度の低下をもたらし得る。放出の程度が減少され得る一つ以上のサイトカインには、インターフェロン、インターロイキン、ケモカイン、ＣＳＦ、ＴＮＦなどが含まれ得るが、これらに限定されない。一つ以上の徴候または症状の減少は、赤み、腫脹もしくは浮腫、発熱、疼痛、機能喪失、または急性炎症に関連する他の徴候もしくは症状のうちの一つ以上の減少を含み得る。

本明細書においてさらに、インビボでの経時的な治療用生体分子の効力を調節するための追加的または代替的な利点があり得ることが認識される。詳細には、循環中の治療用生体分子の濃度は、一つ以上の関連する薬物動態パラメータに応じて経時的に減少し得る。濃度が経時的に減少するにつれて、この減少は、循環中の治療用生体分子の有効量を減少させる。本明細書では、溶液中の治療用生体分子の有効量の減少は、治療用生体分子を減少した初期効力で提供することによって少なくとも部分的に軽減され得、その後、インビボの糖化平衡率に関連する効力がより大きくなるまで、循環において経時的に増加することが認識される。詳細には、治療用生体分子の濃度が減少するにつれて、効力は対応して増加し、したがって、治療剤の有効性の観点から濃度の減少を少なくともある程度相殺し得る。

したがって、上記に基づいて、治療用生体分子に、投与後のインビボで経時的に増加する低減された初期効力を付与するために、初期糖化率は、インビボ平衡糖化率よりも大きい必要があることが理解され得る。平均グルコース値は個体によって変化し得るため、循環中に増加する初期効力の低減に関する本明細書に開示される方法の一態様は、治療用生体分子を投与する前に個体についてのグルコース濃度プロファイルを取得することを含んでもよく、その結果、初期効力が低減され、経時的に効力の変化が効果的に制御／予測され得る。グルコース濃度プロファイルを取得することは、個体に関連する典型的な血糖濃度を反映するのに十分な所定の期間にわたって血糖測定値を取得することによって達成され得る。グルコース測定値は、例えば、従来のフィンガー・スティックグルコース計および／または連続グルコース監視システムのうちの一つ以上を介して取得され得る。個体のグルコース濃度プロファイル（例えば、時間の関数としての平均グルコース濃度）の理解により、治療用生体分子の初期糖化率は、最初に効力が低下し、対象のグルコース濃度プロファイルによって指示される最終効力まで経時的に増加する所望の程度に基づいて選択され得る。

代表的な例として、バイオリアクター中の典型的なグルコース濃度は、３００～１０００ｍｇ／ｄＬであってもよい。糖化に対する一つ以上のアミノ酸の濃度、感受性などに応じて、そのようなバイオリアクターで産生される特定の治療用生体分子は、経験的に決定され得る何らかのレベルに糖化され得る。いくつかの例では、バイオリアクター生体分子からの精製後の特定の治療剤の糖化率は、対象への投与後にインビボで実現される治療用生体分子の平衡糖化率よりも大きくてもよく、又は他の例ではそれよりも少なくてもよい。治療用生体分子の糖化の程度は、所望の初期糖化率に応じて、例えば、異なる程度に糖化される治療用生体分子の異なる溶液の定義された比を混合することによって、所望の初期糖化平衡濃度に達するように、治療用生体分子をグルコース濃度とインキュベートすることによって、さらに操作され得る。しかしながら、上で詳細に論じたように、グルコースの非存在下では、治療用生体分子は、保存中で経時的に脱糖化を受け得る。したがって、例えば、生体分子が考察されるように初期効力の低下を示すように、特定の初期糖化率を対象に提供することが望ましい場合、生体分子は、投与前の保存において経時的に所望の初期糖化率を維持するために、ある量の糖（例えば、グルコース）で製剤化される必要があり得る。概して、製剤中のこうした糖濃度は、治療用生体分子の初期糖化率が、投与後にインビボで実現される対応する糖化平衡率よりも高い糖化率で維持されるようなものであり得ることが理解され得る。インビボで実現される糖化平衡率は、個々の血糖プロファイルに依存し、これは、健康な個体については７０～１８０ｍｇ／ｄＬの典型的な範囲であってもよく、糖尿病（例えば、Ｉ型またはＩＩ型）などの基礎疾患に起因する合併症を有する個体については、その範囲がより大きく（例えば、７０～５００ｍｇ／ｄＬ以上）てもよい。なぜなら初期効力が低減された治療用生体分子を提供することが所望される場合、これはその後、投与後の循環において経時的に増加し（初期糖化率は、インビボで達した対応する糖化平衡率のものよりも大きい）、治療用生体分子は、特定の個体の平均血糖値よりも少なくともいくらか高い糖濃度（例えば、グルコース濃度）で製剤化される必要があり得る。したがって、例において、治療用生体分子は、１５０ｍｇ／ｄＬ以上 または１６０ｍｇ／ｄＬ以上、または１７０ｍｇ／ｄＬ以上、または１８０ｍｇ／ｄＬ以上、または１９０ｍｇ／ｄＬ以上、または２００ｍｇ／ｄＬ以上、または２１０ｍｇ／ｄＬ以上、または２２０ｍｇ／ｄＬ以上、または２３０ｍｇ／ｄＬ以上、または２４０ｍｇ／ｄＬ以上、または２５０ｍｇ／ｄＬ以上、または２６０ｍｇ／ｄＬ以上、または２７０ｍｇ／ｄＬ以上、または２８０ｍｇ／ｄＬ以上、または２９０ｍｇ／ｄＬ以上、または３００ｍｇ／ｄＬ以上、または３１０ｍｇ／ｄＬ以上、または３２０ｍｇ／ｄＬ以上、または３３０ｍｇ／ｄＬ以上、または３４０ｍｇ／ｄＬ以上、または３５０ｍｇ／ｄＬ以上、または３６０ｍｇ／ｄＬ以上、または３７０ｍｇ／ｄＬ以上、または３８０ｍｇ／ｄＬ以上、または３９０ｍｇ／ｄＬ以上、または４００ｍｇ／ｄＬ以上、または４１０ｍｇ／ｄＬ以上、または４２０ｍｇ／ｄＬ以上、または４３０ｍｇ／ｄＬ以上、または４４０ｍｇ／ｄＬ以上、または４５０ｍｇ／ｄＬ以上、または４６０ｍｇ／ｄＬ以上、または４７０ｍｇ／ｄＬ以上、または４８０ｍｇ／ｄＬ以上、または４９０ｍｇ／ｄＬ以上、または５００ｍｇ／ｄＬ以上、または５２０ｍｇ／ｄＬ以上、または５４０ｍｇ／ｄＬ以上、または５６０ｍｇ／ｄＬ以上、または５８０ｍｇ／ｄＬ以上、または６００ｍｇ／ｄＬ以上、または６２０ｍｇ／ｄＬ以上、または６４０ｍｇ／ｄＬ以上、または６６０ｍｇ／ｄＬ以上、または６８０ｍｇ／ｄＬ以上、または７００ｍｇ／ｄＬ以上、または７２０ｍｇ／ｄＬ以上、または７４０ｍｇ／ｄＬ以上、または７６０ｍｇ／ｄＬ以上、または７８０ｍｇ／ｄＬ以上、または８００ｍｇ／ｄＬ以上、または８２０ｍｇ／ｄＬ以上、または８４０ｍｇ／ｄＬ以上、または８６０ｍｇ／ｄＬ以上、または８８０ｍｇ／ｄＬ以上、または９００ｍｇ／ｄＬ以上、または９２０ｍｇ／ｄＬ以上、または９４０ｍｇ／ｄＬ以上、または９６０ｍｇ／ｄＬ以上、または９８０ｍｇ／ｄＬ以上、または１０００ｍｇ／ｄＬ以上、または１１００ｍｇ／ｄＬ以上、または１２００ｍｇ／ｄＬ以上、または１３００ｍｇ／ｄＬ以上、または１４００ｍｇ／ｄＬ以上、または１５００ｍｇ／ｄＬ以上、または１６００ｍｇ／ｄＬ以上、または１７００ｍｇ／ｄＬ以上、または１８００ｍｇ／ｄＬ以上、または１９００ｍｇ／ｄＬ以上、または２０００ｍｇ／ｄＬ以上の濃度のグルコースで製剤化されてもよい。

インビボでの治療用生体分子中のアミノ酸の糖化率を予測する方法
治療用生体分子（例えば、治療用抗体）中のアミノ酸の糖化率は、効力に影響を与える可能性があり、したがって、効力は、治療用生体分子を受ける対象において経時的に変化し得る。したがって、投与後の経時的な糖化率を予測する能力を使用して、治療レジメンを改善し得る。

本明細書において、特定の治療用生体分子の糖化／脱糖化速度に関するインビトロで決定されたパラメータは、対象への治療用生体分子の投与後の時間の関数として糖化率を予測するために、糖化平衡レベル（例えば、パーセンテージ）（インビトロおよび／またはインビボ研究から取得）、および初回（例えば、投与前）糖化レベル（例えば、パーセンテージ）と併せて使用され得ることが認識される。詳細には、式５および６（実施例に続く材料および方法を参照）を参照すると、三つの適合パラメータを使用して、時間の関数としてインビボでの糖化率の予測を可能にすることができ、適合パラメータは、振幅（例えば、初期糖化レベルと糖化平衡レベルとの間の差）、ベースライン、および糖化／脱糖化速度である。糖化反応（式５）について、糖化の平衡レベルは振幅＋ベースラインである。脱糖化反応（式６）については、グリケーションの平衡レベルはベースラインである。

初期の糖化レベルは、上述のようにＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって決定されてもよく、一部の例では、様々な程度に糖化された治療用生体分子の特定の比率の混合を使用して、いくつかの所定の割合に糖化された治療用生体分子を生成することができる。

時間の関数としてインビボの糖化率を予測するのに有用な糖化／脱糖化速度は、体温（例えば、３５～４０℃、例えば、３７℃）と類似した温度で、および対応する対象（例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウスなど）に典型的に見られると予想されるグルコース濃度で、インビトロで取得され得る。例えば、血糖値は、概して約４ｍＭ～約７ｍＭの間で変化してもよく、したがって、例えば、ヒトまたはサルに有用なインビボ予測方法論については、糖化／脱糖化速度を決定するための実験は、約３ｍＭ～約８ｍＭのグルコース、例えば、約４～７ｍＭのグルコース、例えば、３～８ｍＭのグルコースから選択される値に対応する任意のグルコース濃度の存在下で行われてもよい。

平衡糖化率は、一つ以上の方法で決定されうる。平衡糖化率は、特定の治療用生体分子によって見られるグルコースの濃度の関数である。以下の実施例３は、対応する図３Ａ～３Ｂと共に、治療用生体分子を様々な濃度のグルコースとともにインキュベートするインビトロ研究に基づいて、平衡糖化率がどのように得られ得るかについて考察／説明する。詳細には、インビボで見られるものと実質的に類似した濃度（例えば、３～７ｍＭのグルコース）でインビトロで決定される平衡糖化率は、インビボ予測方法論の平衡糖化率として使用され得る。

追加的または代替的に、平衡糖化率は、一人以上の対象が特定の治療用生体分子を投与され、次いで血清試料が様々な時点で得られ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを実施して循環治療用生体分子に関連する糖化レベルを決定する、インビボ研究から決定され得る。糖化レベルが定常である（例えば、所定の時間の間所定の範囲外で変動しない）場合、定常に対応する糖化率は、糖化平衡率を含むと判定され得る。

特定の治療用生体分子の糖化平衡レベルは、例えば、いくつかの所定の時間（例えば、２～６０日、またはその間の任意の日数）にわたる平均グルコースレベルなどのインビボグルコースレベルと相関し得ることが、本開示の範囲内である。インビボのグルコースレベルは、例えば、連続グルコースモニタリング（ＣＧＭ）システム、または従来のフィンガー・スティック適用などの他の様式を介して決定され得る。したがって、そのような関連に基づいて、第一のグルコースレベルを有する対象は、特定の治療用生体分子に対する第一の糖化平衡率に対応し得るが、第二のグルコースレベルを有する対象は、同じ治療用生体分子に対する第二の糖化平衡率に対応し得る。特定の個体についてのグルコース値を、特定の治療用生体分子についての予想される糖化平衡率と相関させることは、インビボでの特定の治療用生体分子についての糖化率を予測するという点で、精度を改善し得る。

一例として、特定の治療用生体分子の臨床試験の過程で、糖化平衡率を得ることができる。こうした例では、血糖値と糖化平衡率との間の相関が確立され得るように、血糖値は定期的に監視され得る。次に、この相関は、その後、方法論において使用されて、その後の個体についてインビボでの糖化率を予測することができ、この個体の血糖値は、測定または推定され（例えば、体重、運動レベル、食習慣などの定性的属性に基づいて、および／または病院もしくは医師の来院の一部として実施された一つ以上の過去のグルコース検査から、または他の臨床検査結果から推定される）、これらの血糖値は、糖化平衡率を推定するために使用される。

上述のように、対象への治療用生体分子の投与後の時間の関数として糖化率を予測する能力は、インビボでその治療用生体分子と関連する時間の関数として効力の予測を可能にし得る。例えば、投与前に、糖化率の関数としての効力をインビトロで確立してもよい（実施例１および図２を参照されたい）。結果として得られるデータは、０～１００％の任意の糖化率について効力を予測することを可能にする方程式に適合し得る。したがって、インビボでの糖化率の予測は、次に、対象への投与後の時間の関数として治療用生体分子の効力の予測を可能にし得る。

以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作製し使用するかを当業者へ完全に開示するために提供されており、発明者がその発明としてみなすものの範囲を限定することを意図していない。使用した数字（例えば、量、温度など）に対する正確さを確保するために努力がなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差を考慮に入れるべきである。別途示さない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は大気圧でまたは大気圧付近での℃（摂氏）である。

実施例１．ＣＥＸおよびＬＣ－ＭＳペプチドマッピングによるｍＡｂ－１の電荷バリアント解析は、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８で可逆的な糖化を有する種を明らかにする
ＣＥＸを使用して、ｍＡｂ－１電荷バリアントを分離した。８．９分および９．５分で溶出した二つの主要な種、ならびに８．６分よりも早く、１０分よりも後に溶出した多数の小さな種（図１Ａ）。８．９分および９．５分で溶出する、きちんとしたｍＡｂ－１中のこれら二つの主要種の画分は、それぞれ、総ピーク面積の約２７％および４７％であった。ｍＡｂ－１を１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０、および３７℃で１４日間インキュベートした後、８．９分で溶出する種の相対量は減少し、９．５分で溶出する種の相対量は、ほぼ同じ量だけ増加し（線１１０、図１Ａを参照）、タンパク質内の継続的な反応が、８．９分および９．５分で溶出する種の相互変換をもたらし、これはそれらの表面電荷の差を反映し得ることを示唆している。

これら二つのｍＡｂ－１電荷バリアントの化学的性質を理解するために、これらをＣＥＸから精製し、続いてＬＣ－ＭＳペプチドマッピング分析を行い、これら二つのバリアントにおける翻訳後修飾（ＰＴＭ）を特定および定量した。この分析は、８．９分で溶出するが、９．５分で溶出する種では溶出しない種において、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８での＋１６２．７Ｄａの質量シフトを明らかにした。この質量シフトを、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８での糖化として割り当てた。さらなる分析は、８．９分および９．５分で溶出する種における糖化のレベルが、それぞれ８８％および１％であることを示した。これらの二つの種内で有意に異なる他のＰＴＭは特定されなかった。同様に、他の重鎖（ＨＣ＊）ＣＤＲ３では、９８位にリジン（ＨＣ^＊－ＣＤＲ３－Ｌｙ９８として知られる）があり、検出可能なレベルの糖化はない。

きちんとしたｍＡｂ－１のＬＣ－ＭＳベースのペプチドマッピング分析（図１Ｂの線１３０を参照されたい。）およびｍＡｂ－１を、３７℃で１４日間インキュベーションした後（図１Ｂの線１３５を参照されたい）グルコースの非存在下では、糖化ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８ペプチドピークの減少、および３７℃でインキュベートされたｍＡｂ－１における天然（すなわち、非糖化）ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８ペプチドピークの同時増加が明らかになり（図１Ｂ）、ＣＥＸ結果と一致した。グルコースの非存在下での３７℃（線１３５）でのインキュベーション後のきちんとしたｍＡｂ－１（線１３０）およびｍＡｂ－１における糖化のレベルは、それぞれ３２．０％および２．０％であり、この反応の可逆的な性質、ならびにＣＥＸおよびＬＣ－ＭＳによって定量化された糖化レベルの一貫性（典型的には≦５％で異なる）を確認した。

この糖化がグルコースによって駆動されたかどうかを調べるために、ｍＡｂ－１を０．１Ｍのグルコースと共に３７℃で１４日間インキュベートした。ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８糖化種の増加が観察され、同時に非糖化種の減少が観察された（線１１５、図１Ａを参照）。同様に、ＬＣ－ＭＳペプチドマッピングによって決定されると、糖化のレベルは増加した（データは示さず）。まとめると、ＣＥＸ分析およびＬＣ－ＭＳ分析は、糖化反応が可逆的であり、糖化のレベルが溶液中のグルコースの存在に依存することを示した。

実施例２．ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８における糖化の程度は、薬物効力と相関する
ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８での糖化が生物学的活性と干渉するかどうかを決定するために、半分取ＣＥＸクロマトグラフィーによって精製されたｍＡｂ－１の糖化形態および非糖化形態を様々な比で混合して、１～８８％の範囲の糖化レベル（ＬＣ－ＭＳベースのペプチドマッピングによって決定される）を有するｍＡｂ－１試料を生成し、細胞ベースの効力アッセイに供した。結果は、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８での糖化のレベルと、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８での糖化のレベルが高い効力との間の線形および逆の相関が、より低いレベルの薬剤効力と関連していることを示した（図２）。さらに、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定される対応する抗原に対する結合親和性は、８８％の糖化を有するｍＡｂ－１が、１％の糖化を有するｍＡｂ－１と比較して、会合速度が約二倍減少し、結合親和性が約二倍減少することを示した（データは示さず）。これは、細胞ベースの効力の結果と一致する。このＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８をアルギニンに変異させることで、結合親和性が２０倍を超えて低下した（データは示さず）。まとめると、これらの結果は、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８が抗原へのｍＡｂ－１結合に不可欠であり、その糖化が結合親和性を損なう可能性があることを示唆した。

実施例３．ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の糖化反応は溶液中のグルコース濃度に依存する
ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８での糖化に対するグルコースの影響を理解するために、６．９μＭのｍＡｂ－１（約１ｍｇ／ｍＬ）を、０．３～１１１ｍＭの異なる濃度のグルコースと共に３７℃で２８日間インキュベートした。インキュベーション開始時のｍＡｂ－１中の糖化レベルは、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８で約２７％であった。インキュベーションの過程中、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８での糖化レベルは、溶液が≦３ｍＭのグルコースを含有するとき、ゆっくりと減少した。より高いグルコース濃度（≧６ｍＭ）では、遊離グルコースは、非糖化ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８に共有結合し、平衡に達するまで経時的に糖化のレベルを増加させる（図３Ａ）。

糖化の動態を、各溶液条件（表１）について、見かけの速度定数、ｋ_ａｐｐ、および振幅、Ａ、およびベースラインｂの三つのフィッティングパラメータを解明することによって、第一次モデル（式５および６）で分析し、平衡における糖化のレベルを、糖化反応についてＡ＋ｂから、および脱糖化反応についてｂから決定した。単純な化学反応に基づく熱力学的モデル（式９）であって、（Ｇ：遊離グルコース、Ｐ：非糖化ｍＡｂ－１、ＰＧ：糖化ｍＡｂ－１、実施例８のスキーム２）を使用して、様々なグルコース濃度での糖化の平衡レベルに直接適合させ（図３Ｂ）、会合定数Ｋの最良の適合は１１２（±４０）Ｍ^－１であった（表２）。さらに、同じ化学反応に基づく動態モデルを適用して、糖化（ｋ_１）および脱糖（ｋ_－１）速度を決定した（式８）。異なるグルコース濃度からのデータのグローバル解析は、最良適合ｋ_１＝８．８９（±１．７９）Ｍ^－１日^－１およびｋ_－１＝０．０９（±０．０２）日^－１を返した。ｋ_１およびｋ_－１から計算された会合定数Ｋは、９９Ｍ^－１であり、熱力学的分析から得られたＫと統計的に同一である。この反応の解離定数（Ｋ_Ｄ＝１／Ｋ）は、およそ８～１０ｍＭであり、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８での糖化のレベルは、任意の所与の時点、典型的には５～５５ｍＭの範囲の細胞培養培地中の実際のグルコース濃度に依存することを示唆する。したがって、一貫した電荷バリアントプロファイルを有するｍＡｂ－１を産生するためには、細胞培養プロセス中に一貫したレベルのグルコースを維持することが重要である。

実施例４．ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８脱糖化動態は、溶液中の温度およびｐＨに依存し、アレニウス挙動に従う
グルコースを含まない溶液（１０ｍＭのヒスチジン、０．０５％のポリソルベート２０、および２９２ｍＭのスクロース）中、および２０～４５℃の範囲の温度で、最大３５日間、１３．８μＭのｍＡｂ－１をインキュベートすることによって、脱糖化動態に対する温度の影響を調べた。初期のｍＡｂ－１は、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８で約２７％の糖化があった。試験したすべての温度で、ｍＡｂ－１は経時的に脱糖化を受けた。この反応は、過剰な量の非還元糖であるスクロースの存在が糖化のレベルに影響を与えないため、還元糖に特異的である。糖動態に影響を与える別の重要な要因はｐＨである。実際に、同じインキュベーション温度で、かつグルコースなしで、見かけの脱糖化は、ｐＨ５．０よりもｐＨ６．０で速い（図４Ａ～４Ｃ）。

ｍＡｂ－１脱糖化の温度依存性を理解するために、一次動力学モデルを使用して脱糖化速度を決定した（表１）。三つのｐＨ条件（ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、およびｐＨ６．０）すべてにおいて、見かけの速度定数の自然対数の減少は、温度の低下とともに直線的に減少し、脱糖化動態が２０～４５℃の範囲のアレニウス挙動に従うことを示唆している（図４Ｄ）。アレニウス方程式（方程式７）を使用して、見かけの活性化エネルギーＥ _ａは、ｐＨ５．０、５．５、および６．０で、それぞれ２３．５（±２．１）、２３．１（±１．８）、および２１．４（±１．７）ｋｃａｌ／ｍｏｌであると計算された。より高いｐＨでＥａが低いほど、より高いｐＨでより速い反応速度が観察されたため、脱糖化のエネルギーバリアが低いことが示唆される。これは、ｐＨ依存性反応速度と一致する。

次に、アレニウス挙動を外挿して、５℃での脱糖化速度を決定した。５℃での脱糖化速度定数は、外挿によって決定され、ｐＨ６．０、５．５、および５．０でそれぞれ０．００１１、０．０００７、および０．０００４日^－１である。これらの速度は、式６を使用した脱糖化プロファイルのシミュレーションを可能にし、式中、Ａ_２はｔ＝０で糖化のレベルに固定され、ｋ_ａｐｐは５．０℃で外挿された脱糖化速度（それぞれ、ｐＨ６．０、５．５、および５．０で０．００１１、０．０００７、および０．０００４日^－１）に固定された。図４Ｅに示されるように、５℃でのシミュレーションプロファイルおよびリアルタイム脱糖化データは、少なくとも３６ヶ月間一致しており、１）より低い温度（例えば、５℃）であっても、脱糖化動態がアレニウス挙動に従っており、２）より高い温度での短期のインキュベーション実験から十分に予測され得ることを示す。

実施例５．糖化平衡のｐＨ依存性は、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８側鎖上のアミンのｐＫ_ａが低いことを示す
糖化のｐＨ依存性を理解するために、６．９μＭのｍＡｂ－１を、５～８の範囲のｐＨ、および３～１１ｍＭの範囲のグルコース濃度を有する異なる緩衝液中で、糖化が平衡に達するまでインキュベートした。糖化の平衡レベルを、見かけの一次速度論モデルを使用して決定し、ｐＨの関数としてプロットした（図５Ａ～５Ｃ）。一定のｐＨ（例えば、ｐＨ７．０）では、より高いグルコース濃度でより高い平衡レベルの糖化が観察され、これは以前の結果と一致した。一定のグルコース濃度では、糖化のレベルは、ｐＨの増加と共に非線形に増加した。緩衝液成分は、ｍＡｂ－１の糖化のレベルに明らかな効果を有しなかった（図５Ａ～５Ｃ）。

単純な平衡モデルを適用して、ｐＨ依存性糖化を定量的に分析した。このモデルは、以下に示すように、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８側鎖上のアミンの脱プロトン化、および脱プロトン化アミンへのグルコースの結合の二つの反応を構成する。

式中、ＰＨ^＋およびＰは、それぞれＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８側鎖上のプロトン化および脱プロトン化されたアミンを有するｍＡｂ－１であり、Ｇは遊離グルコースであり、Ｈ^＋は遊離プロトンであり、ＰＧはＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８で糖化されたｍＡｂ－１であり、Ｋ_１は脱プロトン化反応について均衡定数であり、Ｋ_２は糖化反応について糖化定数である。

糖化ｍＡｂ－１の全体的な観察された割合（糖化％）を記述することができる：

式中、〔ＰＧ〕は、糖化ｍＡｂ－１の濃度であり、〔Ｐ_ｔ〕は、総ｍＡｂ－１の濃度である。スキーム１の質量保存によると、〔Ｐ_ｔ〕は、〔Ｐ〕、〔ＰＨ^＋〕、および〔ＰＧ〕の合計であり、式中、〔Ｐ〕は、脱プロトン化ｍＡｂ－１の濃度であり、〔ＰＨ^＋〕は、プロトン化ｍＡｂ－１の濃度である。

したがって、式１は、

として表され、
続いて、再配列して式３を得、

式中、〔Ｇ〕および〔Ｈ^＋〕は、それぞれ、溶液中の遊離グルコースおよび遊離プロトンの濃度である。ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８のε－アミン基のｐＫ_ａは、ｐＫ_ａ＝－ｌｏｇ（Ｋ_１）から決定することができ、Ｋ_２は、糖化反応に対するｐＨ非依存性の顕微鏡的会合定数である。

式３を使用して、図５Ａ～５Ｃに示す三つの平衡データセットをグローバルに適合させた。非線形最小二乗（ＮＬＬＳ）分析では、［Ｈ^＋］を測定されたｐＨから決定し、［Ｇ］を、各条件について６．９μＭで固定された［Ｐ_ｔ］で０＜［Ｇ］＜［Ｇ_ｔ］（［Ｇ_ｔ］は、加えられたおよび結合されたグルコース濃度から決定される総グルコース濃度である）の範囲において暗黙に解かれた。この分析は、最良適合グローバルパラメータＫ_１＝２．０３（±０．７６）×１０^－７Ｍ、およびＫ_２＝１２０（±２６）Ｍ^－１を戻し、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８のε－アミノ基のｐＫ_ａは、６．７（６．６、６．９）と推定された。このｐＫ_ａは、水中の典型的なリジンε－アミノｐＫ_ａ値（１０．４）よりも低い。

実施例６．熱力学的分析は、糖反応がエンタルピー的に駆動されることを示す
糖化反応の駆動力を理解するために、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８に結合するグルコースの見かけの会合定数Ｋを、６．９μＭのｍＡｂ－１を、異なる濃度のグルコースおよび１５～４５℃の範囲の温度でインキュベートすることによって測定した。各条件について糖化の平衡レベルを決定し、次いでＮＬＬＳ分析を実施して、各温度でＫを決定した（図６Ａ～６Ｅおよび表２）。Ｋは、温度の上昇と共にわずかに減少し、反応がエントロピーの変化によって駆動されないことを示唆している。ファント・ホッフ分析（１／Ｔに対するＬｎ（Ｋ）のプロット）（図７）を使用して、エンタルピー（ΔＨ＝－４．０（±０．８）ｋｃａｌ／ｍｏｌ）およびエントロピー（ΔＳ＝－０．００７（±０．００３）ｋｃａｌ／ｍｏｌ・Ｋ）の変化を決定し、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８での糖化がエンタルピーによって主に駆動されることを示す。小さなエントロピー変化および負のエントロピー変化は、全体的な微小環境が糖化により制約され得ることを示唆した。以下の表３は、３７℃でのｍＡｂ－１糖化反応のスキーム１、２、およびファント・ホッフ分析からの動態および熱力学的情報の概要を示す。

実施例７．構造解析は、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８が、より極性の低い環境によって囲まれていることを示唆する
ｐＫ_ａ値が低いリジンは、典型的には、タンパク質内に埋め込まれるか、またはより極性の低い環境で囲まれることが見出される。ｐＫ_ａのシフトを使用してＢｏｒｎ ｆｏｒｍａｌｉｓｍ：

を使用して見かけの比誘電率ε_ａｐｐを計算してもよく、式中、ｚはリジン側鎖の電荷数であり、ｐＫ_{ａ，ｒｅｆ}は水中のリジンの参照ｐＫ_ａであり、Ｚは移動イオンの原子価であり、ｒ_ｃａｖはリジンのイオン化可能部分の空洞半径であり、ｒ_ＨはｍＡｂ－１の流体力学的半径であり、ε_Ｈ２Ｏは水の比誘電率であり、および、_ＫはｍＡｂ－１の逆デバイ長である。この方法は、水中の荷電リジンとＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の局所環境との間の自己エネルギー差が、ｐＫ_ａのシフトへの唯一の寄与であると仮定する。以下のパラメータ、ｐＫ_{ａ，ｒｅｆ}＝１０．４、Ｚ＝１、ｒ_ｃａｖ＝２Ａ、ｒ_Ｈ＝４９Ａ、ε_Ｈ２Ｏ＝７４．２（３７℃）、_Ｋ＝８．７Ｅ－４（１／Ａ）を使用して、見かけの比誘電率ε_ａｐｐは１３．０であり、これは水中の対応する誘電体の特性よりも実質的に低く、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の局所環境がそれほど水和されないことを示す。

ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の局所環境を理解するために、一度に一つのＨＣおよび軽鎖（ＬＣ）ヘテロ二量体を構築することによって相同性モデルを構築した（図８Ａおよび８Ｂ）。予測されたｍＡｂ－１構造は、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の側鎖が、Ｔｙｒ３２、Ｐｈｅ２７およびＴｙｒ１０６の芳香族環（図８Ａ）、ならびにＶａｌ２の脂肪族側鎖によって囲まれた非極性環境にあることを示唆した。対照的に、ＨＣ^＊－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８は、側鎖がＴｙｒ３２およびＴｙｒ１０９のヒドロキシル基に面し、Ａｓｐ１１２の側鎖のカルボキシル基に近接する、より極性の高い環境にあり、これはイオン結合を形成する可能性があり、ＨＣ^＊－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の局所環境を安定化させる（図８Ｃ）。グルコースをＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８にドッキングするために、分子力学（ＭＤ）シミュレーションを実施した（図８Ｂ）。 この相互作用のΔＧは、－２．８ｋｃａｌ／ｍｏｌであると推定され、これは実験データと優れた一致である（表２）。まとめると、インシリコ分析からの結果は、熱力学的測定値と一致しており、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８が、水和が少なく、イオン化性が低い微小環境にあることを示唆している。

実施例８．インビボ分析から予測されるインビボでのＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８脱糖化
ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の糖化のレベルの変化を、非ヒト霊長類で調査した。ｍＡｂ－１の単回投与（０．５ｍｇ／ｋｇ）をサルに投与し、続いて様々な時点（投与前、５分、５時間、１日、３日、７日、１４日、２８日、および４２日）でサル血清試料を採取した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して、これらの血清試料中のｍＡｂ－１を特徴解析すると、インビボでの糖化レベルが、投与後５分試料中の３４．４％から、投与後４２日試料中の２３．７％に減少したことが明らかになった（図９Ａ）。血清グルコース濃度も測定し、これは約１００ｍｇ／ｄＬ（すなわち、５．６ｍＭ、図９Ｂ）変動した。このグルコース濃度範囲において、平衡に達する前に、糖化のレベルが経時的にわずかに減少することが予想された。実際に、投与後１４日後、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の糖化のレベルは、約２５％で安定しており、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の糖化のインビボレベルが血清中のグルコース濃度によって駆動されたことを示す。

インビトロおよびインビボ動態を比較するために、インビトロで決定されたパラメータを使用して予測プロファイルを生成した。 表１に示すように、ｂを糖化の平衡レベル（２４．０％）に固定し、Ａ_２を平衡および投与前（１０．５％）での糖化のレベルの差に固定し、ｋ_ａｐｐを０．１４（日^－１）に固定した式６を使用して、糖化のレベルをシミュレーションした。この予測される糖化プロファイルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定されたインビボでの糖化レベルと非常に一致しており、インビトロおよびインシリコで決定された糖化／脱糖化の機構が、インビボで環境によって影響を受けなかったことを示唆している（図９Ａの糖化の予測レベルに対応する線を参照）。

図１０Ａ～１２Ｂは、図９Ａ～９Ｂに関して上述したものと類似したサルからの追加の未加工のインビボデータを示す。詳細には、ＨＣ－Ｌｙｓ－９８で糖化することができる試験抗体を、０．０５％のポリソルベート８０を含む０．９％生理食塩水で希釈し、次いでサルに静脈内注入した。以下の表４は、試料の情報を示す。

上記の表４で、太字で標識された試料を、ＨＣ－Ｌｙｓ９８の糖化定量のために選択した。データを図１０Ａ～１２Ｂに示す。詳細には、図１０Ａ、図１１Ａ、および図１２Ａは、ｍＡｂ濃度と共にプロットされたＨＣ－Ｌｙｓ９８糖化率を記載し、図９Ｂ、図１０Ｂ、および図１１Ｂは、測定されたグルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）と共にプロットされたＨＣ－Ｌｙｓ９８糖化率を示す。

図１０Ａ～１２Ｂに関連するデータについて、サルは、約３～７ｍＭの血糖値を有した。循環ｍＡｂにおける糖化のレベルは、約１５日で２０～３０％の定常状態に達し、このレベルの糖化は、ｍＡｂがサルでモニタリングされたとき、少なくともさらに２５日間安定なままであった。インビボのサルのデータおよび典型的なヒトグルコース濃度範囲（例えば、４～７ｍＭ）に基づいて、２０～３５％の範囲の糖化レベル（例えば、貯蔵および取り扱い中に維持される２０～３５％のレベル）で投与されるｍＡｂは、循環抗体の糖化レベルにほとんどまたは全く変化を生じさせない場合があることが予想され得る。

先行する実施例に関連する材料および方法
一般材料の詳細
モノクローナル、ＩｇＧ４ベースの二重特異性抗体は、ｍＡｂ－１とも呼ばれ、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ニューヨーク州タリータウンによって製造され、これらの研究全体を通して使用された。ｍＡｂ－１は、それぞれＨＣおよびＨＣ^＊と呼ばれる二つの異なる重鎖を有する。濃縮ストックｍＡｂ－１溶液を、使用前に凍結保存した。使用される他のすべての化学物質は、分析グレードである。

一般的な実験詳細
全ての反応を１型ガラスバイアル中で行い、エラストマーストッパーで密封し、アルミニウムシールをプラスチックフリップオフキャップで密封し、温度制御インキュベーターで保存した。四つの異なる緩衝剤を異なるｐＨ範囲に使用した：ｐＨ５．０～５．５の酢酸塩、ｐＨ５．０～６．５のヒスチジン、ｐＨ６．５～８．０のＨＥＰＥＳ、およびｐＨ６．０～８．０のリン酸塩。すべてのタンパク質試料を、ｍＡｂ－１のストック溶液を他の緩衝液成分と直接混合することによって調製した。インキュベーション中に各タンパク質試料のｐＨを監視し、ｐＨシフトが発生していないことを確認した。タンパク質濃度を、９．９７×１０^－６Ｍ^－１ｃｍ^－１の吸光係数を使用して、２８０ｎｍでのＵＶ吸収によって決定した。

ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の糖化分析および試料の調製
ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の側鎖での糖化反応を、ＣＥＸおよびＬＣ－ＭＳペプチドマッピングの二つの方法によって測定した。

ＣＥＸ：ＣＥＸ法を、２５℃で制御されたＹＭＣ－ＢｉｏＰｒｏ ＳＰ－Ｆカラムを有するＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムで実行した。１０～５０ｕｇのｍＡｂ－１を、結合緩衝液：５０ｍＭのＭＥＳ、２０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ６．５のＣＥＸカラムに装填し、０．５ｍＬ／分の流量で、２０～１５０ｍＭのＮａＣｌの０．５ｍＭ ＮａＣｌ／分の直線濃度勾配で溶出した。溶出を２８０ｎｍの波長で監視し、クロマトグラムをＥｍｐｏｗｅｒ ３データソフトウェアによって処理し、各電荷バリアントの相対画分をクロマトグラムの総面積から計算した。

ＬＣ－ＭＳペプチドマッピング：ｍＡｂ－１試料を変性させ、５ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）で８０℃で１０分間還元した。還元されたシステイン残基を、暗所で３０分間、室温で５ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化した。尿素濃度を消化前に１．２５Ｍに希釈した。トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社、カリフォルニア州サニーベール）またはエンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州イプソウィッホ）を、１：２０の酵素：基質比で添加し、３７℃で４時間インキュベートした。消化を、２０％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カリフォルニア州サンノゼ）を添加することによって終結させた。消化された試料を、分析まで－８０℃で保存した。消化された試料を、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｐｌｕｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カリフォルニア州サンノゼ）に結合されたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステム上のＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ社、マサチューセッツ州ミルフォード）を使用して装填し、分離した。移動相Ａは、水中０．０５％のＴＦＡであり、移動相Ｂは、アセトニトリル中０．１％のＴＦＡであった。０．１％の移動相Ｂから３５％の移動相Ｂまでの勾配を、０．２５ｍＬ／分の流量で７５分間ペプチド分離に使用した。ＭＳの取得は、完全質量スキャンとそれに続く各完全スキャンの最も強いイオンの上位５個のタンデム質量（ＭＳ／ＭＳ）スキャンからなった。ペプチド同定は、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ １．４（バージョン１．４．０．２８８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カリフォルニア州サンノゼ）によって決定され、手動で検証された。ペプチド定量は、５ｐｐｍの質量ウィンドウを有する、毎日のＳｋｙｌｉｎｅ（ＭａｃＣｏｓｓ Ｌａｂ、Ｄｅｐａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＷ）を使用した抽出されたペプチドイオンピークの積分によって決定された。

ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８における異なるレベルの糖化でのｍＡｂ－１の試料の調製
ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８における異なるレベルの糖化でｍＡｂ－１を、ＣＥＸ法によって精製した。完全に糖化されたｍＡｂ－１を、ＣＥＸで８．６～９．１分の間に溶出した画分を収集およびプールすることによって精製した。完全に糖化されていないｍＡｂ－１を、ＣＥＸで９．３～１０．１分の間に溶出した画分を収集することによって精製した。ｍＡｂ－１の精製された糖化形態および非糖化形態を各々、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０に対して透析した。ＬＣ－ＭＳ分析により、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８での糖化のレベルが確認された。糖化種および非糖化種を異なる比率で混合して、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８で様々な割合の糖化を有するｍＡｂ－１溶液を作製した。

ｍＡｂ－１活性のインビトロバイオアッセイ
ｍＡｂ－１の連続希釈を、第二の標的細胞（ＯＶＣＡＲ－３細胞、１０，０００細胞／ウェル）の存在下で、第一の標的細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ、１０，０００細胞／ウェル）に三回添加した。抗体希釈およびバイオアッセイを、Ｊｕｒｋａｔ完全培地（１０％のＦＢＳおよび１Ｘ ペニシリン－ストレプトマイシンＬ－グルタミンを補充したＲＰＭＩ培地１６４０）中で行った。抗体を含有しないウェルを対照として使用した。プレートを３７℃、５％のＣＯ２で４～６時間インキュベートし、次いで、室温まで１５分間置いた。１－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質（１００μＬ）を各ウェルに加え、プレートを３～５分間インキュベートした。発光シグナルを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ５プレートリーダーを使用して測定し、測定値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して１１点反応曲線にわたる４パラメータロジスティック方程式によって分析した。

動態および熱力学的分析
見かけの動態分析を、以下の二つのモデルを使用して行った。

糖化反応（すなわち、経時的な糖化ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の割合の増加）

脱糖化反応（すなわち、経時的な糖化ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の割合の減少）

式中、Ａ_１およびＡ_２は振幅であり、ｋ_{ａｐｐ，１}およびｋ_{ａｐｐ，２}は見かけの反応速度定数であり、ｔは時間であり、ｂはベースラインである。

データフィッティング手順では、ｔを独立したパラメータとして固定し、Ａ_１、Ａ_２、ｋ_{ａｐｐ，１}、ｋ_{ａｐｐ，２}、およびｂを、最良の適合値を見つけるために変化させた。グルコースを含まない条件については、過剰なパラメータ化を避けるためにｂを０に固定した。糖化反応については、糖化の平衡レベル（すなわちプラトー）は、Ａ_１とｂの合計から決定することができる。脱糖化反応については、糖化の平衡レベルはｂから決定される。

アレニウス方程式を適用して、異なる温度での脱糖化動態から、見かけの活性化エネルギー、Ｅ_ａを計算した。

式中、Ａは定数であり、Ｒはガス定数であり、Ｔはケルビンの絶対温度である。Ｌｎ（ｋ_{ａｐｐ，２}）と１／Ｔとの間の線形関係は、反応がアレニウス挙動に従うことを示し、式中、Ｅ_ａは、傾きから決定され得る。

より詳細な動態分析については、グルコースとｍＡｂ－１との間の反応を以下のように発現させることができる。

式中、Ｐは非糖化ｍＡｂ－１であり、Ｇはグルコースであり、ＰＧは糖化ｍＡｂ－１であり、ｋ_１およびｋ_－１はそれぞれ会合速度定数および解離速度定数である。遊離グルコースの初期濃度〔Ｇ _０〕が、非糖化ｍＡｂ－１の初期濃度〔Ｐ _０〕よりもはるかに大きい状態では、時間ｔでの糖化パーセントの動態的説明を以下のように説明することができる。

式中、［Ｐ_ｔ］は、ｍＡｂ－１の合計タンパク質濃度であり、［ＰＧ_０］は、糖化ｍＡｂ－１の初期タンパク質濃度である。データフィッティング手順では、〔Ｇ_０〕、〔ＰＧ_０〕、および〔Ｐ_ｔ］を固定し、ｋ_１およびｋ_－１を、最良の適合値を見つけるために変化させた。

スキーム２に基づいて、糖化の割合の平衡説明を以下のように説明することができる。

式中、〔Ｇ_ｅ〕および〔Ｐ_ｅ］は、それぞれ、平衡における遊離グルコースおよび非糖化ｍＡｂ－１の濃度である。データフィッティング手順では、〔Ｇ_ｅ］および〔Ｐ_ｅ］を、０＜［Ｇ］＜［Ｇ_ｔ］、および０＜［Ｐ］＜［Ｐ_ｔ］の範囲にわたって暗黙的に解決し、式中、〔Ｇ_ｔ］および〔Ｐ_ｔ］はそれぞれグルコースおよびｍＡｂ－１の総濃度であり、Ｋを変化させて、最良の適合値を決定した。

ｍＡｂ－１の構造モデリング
ｍＡｂ－１の予測構造モデルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ － Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ社、カナダ、モントレール）を使用して生成された。抗体構造のデータベースを使用して、重鎖および軽鎖の個々の二量体の相同性モデルを生成した。Ｆａｂドメインは、適切なフレームワークおよびループテンプレートを移植し、続いてエネルギーを最小化することによって構築された。ドッキング実験は、リジン側鎖のε－アミノ基とグルコースのアルデヒド基との間の共有結合相互作用をモデル化することによって実施され、局所環境は、誘導された適合機構によって精製された。

非線形最小二乗分析における不確実性の計算
データフィッティング手順中、すべての方程式を、Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｉｃｒｏｍａｔｈ社、ミズーリ州セントルイス）でプログラムした。最良適合パラメータは、括弧内で報告された不確実性を伴うＮＬＬＳ分析から決定された。対称誤差については、９５％信頼区間下で±誤差として不確実性を報告した。非対称誤差については、９５％信頼区間下で不確実性を（下限、上限）として報告した。

前臨床試料情報
前臨床血清試料は、単回投与のカニクイザル薬物動態（ＰＫ）試験から取得された。ｍＡｂ－１は、静脈内（ＩＶ）で対象に投与された。カニクイザルに０．５ｍｇ／ｋｇで投与し、血清試料を指定された時点（投与前、５分、５時間、１日、３日、７日、１４日、２８日、および４２日）で採取した。血清試料を、分析まで－８０℃で保存した。各収集された時点でのｍＡｂ－１の血清濃度を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定した。簡潔に述べると、ｍＡｂ－１を、薬剤標的でコーティングされたマイクロタイタープレート上で捕捉した。プレート上に捕捉されたｍＡｂ－１を、ビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体を使用して検出し、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＮｅｕｔｒａＡｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）にコンジュゲートしたＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎを使用した。次いで、ペルオキシダーゼに特異的なルミノール系基質を添加して、ｍＡｂ－１の濃度に比例するシグナル強度を達成した。血清グルコースレベルは、フリースタイルライト血糖モニタリングシステム（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国イリノイ州シカゴ）を使用して測定された。

血清試料からのｍＡｂ－１の親和性精製
ｍＡｂ－１を、親和性精製によって収集されたサルの血清試料から精製した。簡潔に述べると、ビオチン化抗ヒト抗体を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＴ１磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）に室温で１０分間コンジュゲートした。次いで、コンジュゲートされたビーズを、室温で３０分間、血清サンプルとインキュベートした。ビーズをＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ペンシルバニア州ピッツバーグ）で洗浄し、次いで０．１％のギ酸（ＦＡ）および５０％のアセトニトリルで溶出した。

トリプシン消化
精製されたｍＡｂ１試料を、真空濃縮器（ＬＡＢＣＯＮＣＯ社、カンザス州カンザスシティ）を使用して乾燥させた。乾燥した試料を、８Ｍの尿素および１０ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）を含有する１００ｍＭのトリス－ＨＣｌ中に再懸濁し、次いで３７℃で３０分間インキュベートした。還元されたシステイン残基を、暗所で３０分間、室温で１０ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化した。アルキル化後、尿素濃度を消化前に１．２５Ｍに希釈した。トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社、カリフォルニア州サニーベール）を、１：１０の酵素：基質比で試料を添加し、３７℃で４時間インキュベートした。消化を、２０％のギ酸の添加によって終了させた。消化された試料を、分析まで－８０℃で保存した。

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳおよびデータ分析
トリプシン消化によって生成されたペプチドを、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カリフォルニア州サンノゼ）に結合されたＡｃｑｕｉｔｙ Ｉ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ社、マサチューセッツ州ミルフォード）上のＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１８ １．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ社、マサチューセッツ州ミルフォード）を使用して分離した。移動相Ａは、水中０．１％のＦＡであり、移動相Ｂは、アセトニトリル中０．１％のＦＡであった。５６分間、０．２５ｍＬ／分の流量２％の移動相Ｂから３０％の移動相Ｂまで増加した勾配をペプチド分離に使用した。ＭＳの取得は、完全質量スキャンとそれに続く各完全スキャンからの最も強いイオンの上位５個のタンデム質量（ＭＳ／ＭＳ）スキャンからなった。ペプチドおよびＰＴＭの同定は、Ｂｙｏｎｉｃ（バージョン２．１６．１１、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｃ社．、カリフォルニア州サンカルロス）により決定され、手動で検証された。ＰＴＭの相対存在量を定量化するために、修飾ペプチドおよび天然ペプチドの両方の第一の同位体ピークのｍ／ｚに基づいて抽出されたイオンクロマトグラムを生成し、抽出されたピーク面積を、５ｐｐｍの質量ウィンドウを使用して、Ｓｋｙｌｉｎｅ－ｄａｉｌｙ（バージョン４．１．１．１８１５１、ＭａｃＣｏｓｓ Ｌａｂ、ワシントン大学、ワシントン州）を使用して積分した。各ＰＴＭバリアントの割合を、修飾ペプチドおよび天然ペプチドのピーク面積の総和に対する修飾ペプチドの抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）ピーク面積を使用して計算した。

先行例の簡単な考察
細胞培養プロセス中、グルコースは成長細胞に必須エネルギー源である。細胞の高い成長速度を維持するために、グルコースはバイオリアクター内に常に供給され、ここで消費されていないグルコースはＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の糖化をもたらす。反応器内に存在するグルコース濃度は、糖化のレベルに影響を与える。動態分析は、ｍＡｂ－１が糖化されると、糖化反応と比較して脱糖化が比較的遅いことを示唆している。最終結果は、精製プロセス中（グルコースが存在しない）に、糖化のレベルが一定である傾向があり、バイオリアクター中に存在していた糖化のレベルと直接相関することである。精製中、糖化のレベルは比較的一定に保たれるが、ｍＡｂ－１が液体製剤中にあり、５℃で保存された時、データは、糖化ｍＡｂ－１が一貫した測定可能な脱糖化速度を受けることを示す。凍結乾燥製剤中でｍＡｂ－１を生成することが、おそらく加水分解に必要な水を除去することによって、脱糖化反応を本質的に停止させることが実証された。

脱糖化反応動態は、５～４５℃の温度範囲におけるアレニウス挙動に従う（図４Ａ～４Ｄ）。結果として、より高い温度（２０～４５°Ｃ）から生成されたデータは、５℃などのより低い温度で脱糖化挙動を予測するために、アレニウスモデルと併せて使用することができる。アレニウス方程式から計算された活性化エネルギーは、脱糖化が、より高いｐＨでのより低い活性化エネルギーとｐＨ依存性であることを示す。これは、脱糖化速度がより高いｐＨでより速くなる可能性があることを示唆している。実験結果は、この予測を確認し、溶液のｐＨが５．０から６．０に増加したときに、見かけの脱糖化速度定数が２０℃で３倍増加したことを示した（表１）。この観察は、アマドリ生成物（ケトアミン）の逆反応の速度の増加、およびより高いｐＨでのシッフ塩基からのグルコースの同時放出に起因する可能性がある。

見かけの脱糖化反応はより高いｐＨでより速かったが、定常状態ではｍＡｂ－１の糖化の平衡レベルはより高いｐＨでより大きく（図５Ａ～５Ｃ）、糖化リジンはより高いｐＨでより安定していることを示唆する。さらに、データは、ヒスチジンイオンおよびリン酸塩／炭酸塩イオンの存在が全体的な糖化反応を促進しないことを示した。これは、ヒスチジンイオンおよびリン酸塩／炭酸塩イオンがアマドリ再構成を促進することを示す証拠があるため、予想外であった。この挙動を説明することができる代替的な仮説は、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８での糖化が、シッフ塩基中間体またはアマドリ産物を安定化することによって駆動されず、むしろＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８でのｐＫ_ａを低下させることによって駆動されたことである。単純な脱プロトン化モデルを使用して、異なるｐＨ値での平衡データをグローバルに分析した場合、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８について、正常より低いｐＫ_ａ値である６．７が分解された。このｐＫ_ａは、ｐＨ７．４で、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の８４％が脱プロトン化されることを示唆する。Ｂｏｒｎ形式を有するｐＫ_ａのシフトを分析すると、見かけの誘電率１３．０が得られた。この値はタンパク質内部で観察される誘電特性よりもわずかに大きいが、水の誘電率よりも有意に低く、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の微小環境がタンパク質の表面で予想されるものよりも水和が少ないことを意味する。さらに、熱力学的分析は、全体的な糖化反応がエンタルピーによって好ましく、エントロピーによって好ましくないことを示唆している。結果は、以下の糖化機構を示唆している：糖化時に、局所環境をより制約するわずかな構造的再構成がある。この再構成プロセスの間、微小環境の水和が少ない性質は、水の再配置の程度を制限する。したがって、反応はエンタルピーの変化によって駆動される。

ｐＫ_ａ値が低減されたリジンε－アミノ基のほとんどの例は、タンパク質内に埋め込まれ、例えば、酵素またはエネルギー形質導入機能を果たすことが見出される。しかしながら、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８は表面上にあり、抗原との相互作用に重要である。対照的に、ＨＣ^＊－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８（この二重特異性抗体の他のＣＤＲ上の対応するアミノ酸）も表面に曝露されるが、それでも糖化のレベルは検出レベルより低く、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の局所環境が糖化を促進することを示唆している。模擬のｍＡｂ－１構造は、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８の微小環境がＨＣ^＊－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８よりも極性が低いことを示し、これは周囲のアミノ酸によるだけでなく、それらの側鎖の配向による。４．５Ａ以内で、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８は、空間に隣接するアミノ酸からの芳香族環によって囲まれる。最も近い極性基は、Ｔｙｒ３２の側鎖であり、およそ４．７Ａ離れているが、リジン及びチロシンは、イオン相互作用を形成する可能性が低い。一方で、ＨＣ^＊－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８は、Ａｓｐ１１２およびＴｙｒ１０９の側鎖に向かって面しており、Ａｓｐ１１２上のカルボキシル基と塩架橋を形成する可能性がある（１．８Ａしか離れていない）。局所環境の性質のため、ＨＣ－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８は、糖化前のＨＣ^＊－ＣＤＲ３－Ｌｙｓ９８よりも柔軟性が高い可能性がある。糖化後、グルコース－リジン付加物は、負のエントロピー変化によって予測されるように、構造的再構成を受け、より制約されるようになり得る。

本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態による範囲に限定されるものではない。実際に、本発明の種々の修正は、本明細書に記載されるものに加えて、上記の説明及び添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような改変も、添付される特許請求の範囲内にあることが意図される。

Claims (44)

1. 生体分子中のアミノ酸の糖化率を予測する方法であって、
   第一の持続時間にわたる第一の温度セットに対する前記アミノ酸の脱糖化速度の第一のセットを決定することと、
   脱糖化速度の前記第一のセットに基づいて、一つ以上の温度の第二の温度セットに対して、前記アミノ酸の一つ以上の脱糖化速度の第二のセットを推定することと、および
   一つ以上の脱糖化速度の前記第二のセットを使用して、前記第二の温度セットに対応する任意の温度で、第二の所定の時間枠によって包含される持続時間にわたって、糖化率を予測することと、を含む、方法。
2. 前記第一の温度セットは、前記第二の温度セットの温度よりも高い温度を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記第一の温度セットが、２０～４５℃の範囲の温度を含み、前記第二の温度セットが、２～８℃の範囲の温度を含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記第二の温度セットが、５℃の温度に対応する、請求項３に記載の方法。
5. 前記第一の所定の時間枠が４０日未満であり、前記第二の所定の時間枠が３ヶ月～３６ヶ月である、請求項１に記載の方法。
6. 前記第一の持続時間にわたって前記第一の温度セットに対する脱糖化速度の前記第一のセットを決定することが、
   前記第一の温度セットに含まれる各温度に対する前記アミノ酸の糖化率を、前記第一の持続時間の少なくとも一部分に対応する時間の関数として測定することと、および
   脱糖化速度の前記第一のセットを取得するために、データフィッティング手順を実施することと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
7. 二つ以上の異なるｐＨ値の関数として、脱糖化速度の前記第一のセットを決定することと、および
   前記二つ以上の異なるｐＨ値の各々について、脱糖化速度の前記第一のセットに基づいて、前記アミノ酸の脱糖化に関連する活性化エネルギーを決定することと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記二つ以上の異なるｐＨ値の少なくとも一つの関数として、脱糖化速度の前記第二のセットを推定することと、および
   脱糖化速度の前記第二のセットを使用して、前記第二の温度セットに対応する任意の温度で、前記二つ以上の異なるｐＨ値の少なくとも一つの関数として、前記第二の所定の時間枠によって包含される任意の持続時間にわたって、前記糖化率を予測することと、をさらに含む、請求項７に記載の方法。
9. グルコースの非存在下で脱糖化速度の前記第一のセットを決定することをさらに含み、前記生体分子の前記アミノ酸は、所定の第一の割合に糖化され、ならびに
   前記糖化率を予測することは、一つ以上の脱糖化速度の前記第二のセット、前記生体分子の前記アミノ酸が糖化される前記所定の第一の割合、および前記所定の第一の割合と０％の糖化との間の差に基づく、請求項１に記載の方法。
10. 生体分子の貯蔵寿命にわたって所定の糖化率の範囲内で前記生体分子中のアミノ酸の糖化率を維持する方法であって、
    複数の異なるグルコース濃度で第一の糖化率を有する前記生体分子をインキュベートし、前記複数の異なるグルコース濃度の各々について経時的な前記糖化率を測定することと、
    経時的な前記糖化率の前記測定に基づいて、前記複数の異なるグルコース濃度の各々の関数として、前記生体分子の糖化平衡率を決定することと、
    前記糖化平衡率および前記第一の糖化率が前記所定の糖化率の範囲内に維持される結果となる対応するグルコース濃度を特定することと、ならびに
    前記生体分子を、前記生体分子の前記貯蔵寿命にわたって前記対応するグルコース濃度とインキュベートすることと、を含む、方法。
11. 前記アミノ酸の糖化率の関数として前記生体分子の効力レベルを決定することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記生体分子が、抗体である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記アミノ酸が、抗原結合に影響を及ぼす可変領域内に位置する、請求項１２に記載の方法。
14. 前記アミノ酸が、相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置する、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ＣＤＲが、前記重鎖可変領域内に位置する、請求項１４に記載の方法。
16. 前記アミノ酸がＨＣＤＲ３内に位置する、請求項１５に記載の方法。
17. 投与時に対象における治療用生体分子の効力を減少させる方法であって、
    糖化の対象となる一つ以上のアミノ酸残基を含む治療用生体分子を特定することであって、前記一つ以上のアミノ酸残基の糖化が前記治療用生体分子の効力を減少させる、特定することと、ならびに
    １５０ｍｇ／ｄＬ超の濃度で前記治療用生体分子をグルコースで製剤化することと、を含む、方法。
18. 前記グルコース濃度が、２００ｍｇ／ｄＬ超である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記一つ以上のアミノ酸残基の糖化が減少し、前記治療用生体分子の効力が、前記治療用生体分子の前記対象への投与後の前記対象の血中グルコース濃度によって決定される平衡まで増加する、請求項１７または１８に記載の方法。
20. 投与時の前記治療用生体分子の効力の前記減少が、サイトカイン放出症候群または注入関連反応の発生率を低下させる、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記治療用生体分子が抗体である、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記一つ以上のアミノ酸が、抗原結合に影響を及ぼす可変領域内に位置する、請求項２１に記載の方法。
23. 前記一つ以上のアミノ酸が、相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置する、請求項２２に記載の方法。
24. 前記ＣＤＲが、前記重鎖可変領域内に位置する、請求項２３に記載の方法。
25. 前記一つ以上のアミノ酸がＨＣＤＲ３内に位置する、請求項２４に記載の方法。
26. 対象への治療用生体分子の投与後の前記治療用生体分子中のアミノ酸の糖化率を予測する方法であって、
    前記アミノ酸に関連する平衡糖化率を特定することと、
    前記アミノ酸が糖化または脱糖化される速度を特定することと、
    投与前に、前記治療用生体分子中の前記アミノ酸に関連する初期糖化率を特定することと、および
    前記速度、前記初期糖化率と前記平衡糖化率との間の差、および前記平衡糖化率に基づいて、前記治療用生体分子の投与後の時間の関数として前記糖化率を予測することと、を含む、方法。
27. 前記アミノ酸に関連する前記特定された平衡糖化率を決定することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記アミノ酸が糖化または脱糖化される前記特定された速度を決定することをさらに含む、請求項２６または２７に記載の方法。
29. 投与前の前記治療用生体分子中の前記アミノ酸に関連する前記特定された初期糖化率を決定することをさらに含む、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記特定された平衡糖化率を決定することが、３５～４０℃の温度で前記平衡糖化率を決定することを含む、請求項２７に記載の方法。
31. 前記温度が３７℃である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記特定された速度を決定することが、３５～４０℃の温度で前記速度を決定することを含む、請求項２８に記載の方法。
33. 前記温度が３７℃である、請求項３２に記載の方法。
34. 前記特定された平衡糖化率を決定することが、一つ以上のグルコース濃度の関数としてインビトロで前記平衡糖化率を決定することを含む、請求項２７に記載の方法。
35. 前記特定された平衡糖化率を決定することが、インビボで到達される前記アミノ酸の平衡糖化レベルに基づいて、前記平衡糖化率を決定することを含む、請求項２７に記載の方法。
36. 前記特定された速度を決定することが、３～８ｍＭのグルコースのグルコース濃度で、インビトロで前記速度を決定することを含む、請求項２８に記載の方法。
37. 前記平衡糖化率が、３～８ｍＭのグルコースのグルコース濃度に対応する、請求項２６に記載の方法。
38. 前記速度、前記初期糖化率と前記平衡糖化率との差、ならびに第一次モデルの前記平衡糖化率を使用して、前記糖化率を予測することをさらに含む、請求項２６～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記治療用生体分子の効力を、前記糖化率および前記投与後の時間の関数として予測することをさらに含む、請求項２６～３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記生体分子が抗体である、請求項２６～３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記アミノ酸が、抗原結合に影響を及ぼす可変領域内に位置する、請求項４０に記載の方法。
42. 前記アミノ酸が相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置する、請求項４１に記載の方法。
43. 前記ＣＤＲが前記重鎖可変領域内に位置する、請求項４２に記載の方法。
44. 前記アミノ酸がＨＣＤＲ３内に位置する、請求項４３に記載の方法。

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