TW202305368A - 用於預測和調節蛋白質之醣化的方法 - Google Patents

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Abstract

實施例提供預測治療性生物分子中胺基酸之醣化百分比的方法。在一個實例中，一種預測生物分子中胺基酸之醣化百分比的方法包含：測定第一組溫度的去醣化反應之第一組速率；推斷第二組溫度的去醣化反應之第二組一或多種速率；及使用第二組一或多種速率來預測在對應於第二組溫度的任何溫度下及在任何持續時間內之醣化百分比。亦提供用於在治療性生物分子之儲存期限內將胺基酸之醣化百分比維持在預定醣化百分比範圍內的方法，及用於在投予時降低或增加個體內治療性生物分子之效力的方法。

Description

用於預測和調節蛋白質之醣化的方法
參考序列表
本申請案以引用之方式併入以電腦可讀形式作為文件10862WO01-Sequence.txt提交、於2022年2月16日創建且含有639個位元組之序列表。
本發明係關於治療性生物分子，且特別係關於活體外及活體內測定及/或預測治療性生物分子之醣化水平及效力的方法。
蛋白質醣化（還原糖與胺基酸之胺基的非酶反應）為生物分子，例如治療性生物分子（諸如單株抗體（mAb））中常見的轉譯後修飾。當醣化發生在對治療性生物分子的功能很重要之區域中時，例如在治療性mAb之互補決定區（CDR）上，其效力及生物活性可能會受損。具有敏感胺基之生物分子可在活體內及活體外經歷醣化（或去醣化）過程。
舉例而言，目前美國食品及藥物管理局(Food and Drug Administration；FDA)批准之所有單株抗體均由哺乳動物細胞培養物產生。在細胞培養過程期間，mAb分泌至培養基中，其中葡萄糖作為能量源存在。由於細胞培養環境與生理條件相似，因此大多數mAb有可能至少在一定程度上經醣化。mAb純化之後的調配、封裝及儲存（其中mAb之醣化可潛在地進一步進行或逆轉）視特定過程及條件而定。由於mAb產生過程之複雜性，醣化之機制及程度為不可預測的，目前對胺基酸序列或結構模體(structural motif)之分析無法提供可靠的醣化熱點預測。此外，目前沒有框架能夠預測在儲存條件下及/或在向有需要之個體投予之後可能發生的mAb醣化及/或去醣化程度。由於治療性生物分子（諸如mAb）之醣化可影響此類生物分子之效力，因此目前需要可在活體外（例如，在儲存條件下）及在活體內（例如，在向有需要之個體投予後）可靠地測定及/或預測治療性生物分子之醣化及去醣化的方法。
在一個態樣中，本發明提供一種預測生物分子中胺基酸之醣化百分比的方法，其包括：測定在第一持續時間內第一溫度組的第一組去醣化速率；基於第一組去醣化速率推斷第二溫度組的第二組一或多種去醣化速率；及使用第二組一或多種去醣化速率來預測在對應於第二溫度組之任何溫度下及在由第二預定時間範圍涵蓋之持續時間內的醣化百分比。
在實施例中，第一溫度組包括高於第二溫度組中之彼等的溫度。舉例而言，第一溫度組可包含範圍介於20至45℃之溫度，且第二溫度組可包含範圍介於2至8℃之溫度。在一些實例中，第二溫度組對應於5℃之溫度。
在一些實施例中，第一預定時間範圍小於40天。
在一些實施例中，第二預定時間範圍為至少三個月。舉例而言，第二預定時間範圍可為6個月、或9個月、或12個月、或甚至大於12個月，諸如18個月、或24個月、或36個月。
在實施例中，測定第一持續時間內第一溫度組的第一組去醣化速率包含：量測隨對應於第一持續時間之至少一部分的時間而變化的第一溫度組中所包含之各溫度的胺基酸之醣化百分比；及執行資料擬合程序以獲得第一組去醣化速率。
在實施例中，該方法包含測定隨兩個或更多個不同pH值而變化的第一組醣化速率。在一些實例中，對於兩個或更多個不同pH值中之每一者，該方法進一步包含基於第一組去醣化速率測定與胺基酸之去醣化相關的活化能。在一些實例中，該方法進一步包含推斷隨兩個或更多個不同pH值中之至少一者而變化的第二組去醣化速率，且使用第二組一或多種去醣化速率來預測在對應於第二溫度組之任何溫度下及在由第二預定時間範圍涵蓋之任何持續時間內隨兩個或更多個不同pH值中之至少一者而變化的醣化百分比。
在一些實施例中，該方法進一步包含在不存在葡萄糖之情況下測定第一組去醣化速率，其中生物分子之胺基酸係醣化至預定第一百分比。在實例中，預測醣化百分比係基於第二組一或多種去醣化速率、生物分子之胺基酸所醣化至的預定第一百分比及預定第一百分比與0%醣化之間的差異。
在一個態樣中，本發明提供一種用於在生物分子之儲存期限內將生物分子中胺基酸之醣化百分比維持在預定醣化百分比範圍內的方法。該方法包括在複數種不同葡萄糖濃度中培育具有第一醣化百分比之生物分子，且量測複數種不同葡萄糖濃度中之每一者的隨時間推移之醣化百分比；基於隨時間推移之醣化百分比的量測，測定隨複數種不同葡萄糖濃度中之每一者而變化的生物分子之醣化平衡百分比；鑑別醣化平衡百分比及使得第一醣化百分比維持在預定醣化百分比範圍內之對應葡萄糖濃度；及在生物分子之儲存期限內用對應葡萄糖濃度培育生物分子。
在一些實施例中，該方法進一步包含測定隨胺基酸之醣化百分比而變化的生物分子之效力水平。
在各種實施例之任一者中，生物分子可為抗體。在生物分子為抗體之一些實例中，胺基酸位於影響抗原結合之可變區內。舉例而言，胺基酸可位於互補決定區（CDR）內。在實例中，CDR位於重鏈可變區內。在一些情況下，胺基酸位於HCDR3內。
在一個態樣中，本發明提供一種用於在投予時降低個體內治療性生物分子之效力的方法。該方法包括：鑑別包括經受醣化之一或多個胺基酸殘基之治療性生物分子，其中一或多個胺基酸殘基之醣化降低了治療性生物分子之效力；及用濃度大於150 mg/dL之葡萄糖調配治療性生物分子。在一些實施例中，葡萄糖濃度大於200 mg/dL。
在一些實施例中，一或多個胺基酸殘基之醣化被降低且治療性生物分子之效力增加至平衡，該平衡係在向個體投予治療性生物分子後由個體之血糖濃度所確定的。
在一些實施例中，在投予時降低的治療性生物分子效力降低了細胞激素釋放症候群或輸注相關反應之發生率。
在各種實施例之任一者中，治療性生物分子可為抗體。在治療性生物分子為抗體之實例中，一或多個胺基酸可位於影響抗原結合之可變區內。舉例而言，一或多個胺基酸可位於CDR內。在實例中，CDR位於重鏈可變區內。在一些情況下，一或多個胺基酸位於HCDR3內。
在一個態樣中，本發明提供一種用於在向個體投予治療性生物分子後預測治療性生物分子中胺基酸之醣化百分比的方法，其中該方法包括：鑑別與胺基酸相關之平衡醣化百分比；鑑別胺基酸經醣化或經去醣化之速率；鑑別與在投予之前的治療性生物分子中之胺基酸相關的初始醣化百分比；及基於該速率、該初始醣化百分比與該平衡醣化百分比之間的差異及該平衡醣化百分比，預測隨投予治療性生物分子後之時間而變化的醣化百分比。
在一些實施例中，上文所論述之方法進一步包括測定與胺基酸相關之經鑑別平衡醣化百分比。在一些實施例中，上文所論述之方法進一步包括測定胺基酸經醣化或經去醣化之經鑑別速率。在一些實施例中，上文所論述之方法進一步包括測定與在投予之前的治療性生物分子中之胺基酸相關的經鑑別初始醣化百分比。
在一些實施例中，該方法進一步包括測定在35至40℃之間的溫度下之平衡醣化百分比。在實例中，該溫度為37℃。
在一些實施例中，該方法進一步包括測定在35至40℃之間的溫度下之速率。在實例中，該溫度為37℃。
在一些實施例中，該方法進一步包括測定在活體外隨一或多種葡萄糖濃度而變化的平衡醣化百分比。
在一些實施例中，該方法進一步包括基於在活體內達至之胺基酸之平衡醣化水平來測定平衡醣化百分比。
在一些實施例中，該方法進一步包括測定在活體外在3至8 mM葡萄糖之間的葡萄糖濃度下之速率。
在一些實施例中，平衡醣化百分比對應於3至8 mM葡萄糖之間的葡萄糖濃度。
在一些實施例中，該方法進一步包括在一階模型中使用該速率、該初始醣化百分比與該平衡醣化百分比之間的差異以及平衡醣化百分比來預測醣化百分比。
在上文所論述之各種實施例之任一者中，該方法進一步包括預測隨醣化百分比及投予後時間而變化的治療性生物分子之效力。
在各種實施例之任一者中，生物分子可為抗體。在實例中，胺基酸位於影響抗原結合之可變區內。在一個實例中，胺基酸位於CDR內。在一些實例中，CDR位於重鏈可變區內。在特定實例中，胺基酸位於HCDR3內。
在各種實施例中，可組合上文或此處論述的實施例之特徵或組件中之任一者，且此類組合涵蓋在本案之範疇內。上文或此處所論述之任何具體值可與上文或此處所論述之另一相關值組合以敍述範圍，其中該等值表示該範圍之上端及下端，且此類範圍及落入此類範圍內的所有值涵蓋於本案之範疇內。其他實施例將由隨後實施方式之詳述變得顯而易見。
以下詳細描述中，參考構成其一部分之附圖，且在附圖中藉助於說明示出可實踐之實施例。應理解的是，在不脫離範疇之情況下，可利用其他實施例且可進行結構或邏輯改變。因此，以下詳細描述不應視為具限制性意義。
可以以有助於理解實施例之方式將各種操作依次描述為多個離散操作；然而，描述之順序不應解釋為暗示此等操作是依賴於順序的。
本文使用術語「實施例(embodiment)」或「實施例(embodiments)」，其各自代表相同或不同實施例中之一或多者。此外，如關於實施例使用之術語「包括」、「包含」、「具有」及類似者為同義詞，且一般意指為「開放性」術語（例如，術語「包含（including）」應解釋為「包含但不限於（including but not limited to）」，術語「具有」應解釋為「至少具有」，術語「包含（includes）」應解釋為「包含但不限於（includes but is not limited to）」等）。
關於本文中任何複數及/或單數術語之使用，熟習此項技術者可在對於上下文及/或應用時，將複數解釋為單數及/或將單數解釋為複數。出於清楚起見，本文可明確地闡述各種單數/複數排列。
在描述本發明之前，應理解，本發明不限於所描述之特定方法及實驗條件，因為此類方法及條件是可變化的。亦應理解，本文所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的，而非限制性的，因為本發明之範疇將僅由隨附申請專利範圍所限制。任何實施例或實施例之特徵均可彼此組合，且此類組合明確地涵蓋於本發明之範疇內。
除非另外規定，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之通常知識者所理解相同之含義。如本文所使用的，當參考特定敍述數值使用時，術語「約」意謂值可與敍述值相差不超過1%。舉例而言，如本文所使用的，表述「約100」包含99及101以及其間之所有值（例如，99.1、99.2、99.3、99.4等）。此外，數值範圍之敍述包含由該範圍涵蓋的任何數值，及/或包含於該範圍內的值之任何範圍。舉例而言，1至10之數值範圍涵蓋該範圍，且另外涵蓋個別數值（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10），及該數值範圍內之範圍（例如，1至2、1至4、2至5、3至7、4至9、5至10等）。
儘管類似或等效於本文中所描述之方法及材料的任何方法及材料可用於本發明之實踐或測試中，但現在描述較佳的方法及材料。本說明書中所提及之所有專利、申請案及非專利公開物均以全文引用之方式併入本文中。 本文中所使用之縮寫
CDR：互補決定區
CEX：陽離子交換層析
CSF：群落刺激因子
ESI：電灑離子化
HC：重鏈
HCVR：重鏈可變區
IgG：免疫球蛋白G
IgM：免疫球蛋白M
IFU：使用說明
IEC：離子交換層析
LC-MS：液相層析-質譜
LCVR：輕鏈可變區
mAb：單株抗體
MALDI：基質輔助雷射脫附/離子化
MG：用藥指南
MS/MS：串聯質譜
NLLS：非線性最小平方
PPI：患者藥品說明書
PTM：轉譯後修飾
TCEP-HCl：三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽
TFA：三氟乙酸
TNF：腫瘤壞死因子
UV：紫外線 定義
如本文中所用的，術語「試劑」係指任何蛋白質、肽、抗體、抗原結合片段或其他所關注的分子。在實例中，試劑為能夠在一或多個胺基酸殘基處，例如在對於結合於抗原重要之胺基酸殘基處醣化之蛋白質、肽、抗體、抗原結合片段等。因此，試劑可包含治療劑、診斷劑或藥劑。治療劑或藥劑為單獨或與額外化合物一起誘導所需反應（諸如，當向個體投予時誘導治療性或預防性效應，包含治療患有疾病或病況之個體）的藥劑。本文中所論述之試劑可稱為治療性生物分子。
如本文中所用的，術語「抗體」意指由藉由雙硫鍵互連之四條多肽鏈，亦即兩條重鏈（HC）及兩條輕鏈（LC）構成之免疫球蛋白分子（亦即，「完整抗體分子」），以及其多聚體（例如，IgM）或其抗原結合片段。各重鏈由重鏈可變區（「HCVR」或「V H」）及重鏈恆定區（包括域C H1、C H2及C H3）構成。在各種實施例中，重鏈可為IgG同型。在一些情況下，重鏈選自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些實施例中，重鏈具有同型IgG1或IgG4，視情況包含同型IgG1/IgG2或IgG4/IgG2之嵌合鉸鏈區。各輕鏈由輕鏈可變區（「LCVR」或「V L」及輕鏈恆定區（C L）構成。V H及V L區可進一步細分成稱為互補決定區（CDR）之高度變異區，其間穿插有稱為構架區（FR）之更加保守的區域。各V H及V L由自胺基端至羧基端按以下順序排列之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。術語「抗體」包含提及任何同型或子類別之醣化及非醣化免疫球蛋白，及/或任何同型或子類別之糖化及非糖化免疫球蛋白。術語「抗體」包含藉由重組手段製備、表現、產生或分離之抗體分子，諸如自經轉染以表現抗體之宿主細胞中分離的抗體。關於抗體結構之綜述，參見Lefranc等人，《用於免疫球蛋白及T細胞受體可變域及Ig超家族V樣域之IMGT獨特編號（IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains）》，27(1)《發育與比較免疫學雜誌（Dev. Comp. Immunol.）》55-77 (2003)；及M. Potter，《免疫球蛋白多樣性之結構相關性（Structural correlates of immunoglobulin diversity）》，2(1)《免疫學研究概況（Surv. Immunol. Res.）》27-42 (1983)。
術語抗體亦涵蓋「雙特異性抗體」，其包含可結合於超過一個不同表位之異四聚體免疫球蛋白。包含單個重鏈及單個輕鏈及六個CDR之雙特異性抗體的一半結合於一個抗原或表位，抗體之另一半結合於不同抗原或表位。在一些情況下，雙特異性抗體可結合相同抗原，但結合在不同表位或不重疊的表位處。在一些情況下，雙特異性抗體之兩半均具有相同輕鏈，同時保留雙重特異性。雙特異性抗體一般描述於美國專利申請公開案第2010/0331527號（2010年12月30日）中。
術語抗體之「抗原結合部分」（或「抗體片段」）係指抗體中保留特異性結合於抗原之能力的一或多個片段。涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內的結合片段之實例包含(i) Fab片段，由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii) F(ab′)2片段，其包括在鉸鏈區處藉由雙硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL及VH域組成之Fv片段；(v)由VH域組成之dAb片段(Ward等人(1989)《自然(Nature)》241:544-546)；(vi)經分離之CDR及(vii)由Fv片段之兩個域VL及VH組成之scFv，該兩個域藉由合成的連接子接合以形成其中VL及VH區成對以形成單價分子之單蛋白質鏈。其他形式之單鏈抗體(諸如雙抗體)亦涵蓋於術語「抗體」之下（參見例如Holliger等人(1993) 90 《美國國家科學院院刊（PNAS U.S.A.）》6444-6448；及Poljak等人(1994) 2 《結構（Structure）》1121-1123)。
另外，可使用本領域中習知之標準重組DNA技術來獲得抗體及其抗原結合片段（參見Sambrook等人，1989）。在基因轉殖小鼠中產生人類抗體之方法亦為本領域已知的。舉例而言，使用VELOCIMMUNE®技術（參見例如US 6,596,541，再生元醫藥（Regeneron Pharmaceutical），VELOCIMMUNE®）或任何其他已知用於產生單株抗體之方法，最初分離具有人類可變區及小鼠恆定區的針對所需抗原的高親和力嵌合抗體。VELOCIMMUNE®技術涉及產生具有基因體之基因轉殖小鼠，該基因體包括可操作地連接至內源性小鼠恆定區基因座之人類重鏈及輕鏈可變區，使得小鼠回應於抗原刺激產生包括人類可變區及小鼠恆定區的抗體。分離編碼抗體重鏈及輕鏈可變區的DNA且將其可操作地連接至編碼人類重鏈及輕鏈恆定區的DNA。接著使DNA在能夠表現完全人類抗體之細胞中表現。
術語「表位」係指與稱為互補位的抗體分子之可變區中之特異性抗原結合位點相互作用的抗原決定位。單一抗原可具有超過一個表位。因此，不同抗體可結合於抗原上之不同區域且可具有不同生物效應。表位可為構形或線性的。構形表位藉由來自線性多肽鏈之不同鏈段之空間並列胺基酸產生。線性表位為由多肽鏈中之相鄰胺基酸殘基產生的表位。在某些情況下，表位可包含抗原上之醣類、磷醯基或磺醯基部分。
術語「人類抗體」意指包含具有源自於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。本發明之人類mAb可包含不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基（例如，藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入的突變），例如在CDR中且特別是在CDR3中。然而，如本文中所用的，術語「人類抗體」不意指包含其中已將源自於另一哺乳動物物種（例如，小鼠）之生殖系的CDR序列移植至人類FR序列上的mAb。術語包含在非人類哺乳動物或非人類哺乳動物之細胞中以重組方式產生的抗體。術語不意指包含自人類個體分離或在人類個體中產生之抗體。
在抗體、Ig、抗體結合片段與抗原或其他分子（例如，糖）結合之上下文中，術語「結合」通常係指最少兩個實體或分子結構之間的相互作用或締合，諸如抗體-抗原相互作用或抗體-糖（例如，葡萄糖）相互作用。
舉例而言，當藉由例如表面電漿子共振（SPR）技術在BIAcore 3000儀器中使用抗原作為配位體且使用抗體、Ig或抗體結合片段作為分析物（或抗配位體）測定時，抗體、Ig或抗體結合片段與抗原之結合親和力通常可對應於約10 -7M或更小、諸如約10 -8M或更小、諸如約10 -9M或更小之 K D值。因此，抗體或其他結合蛋白以對應於 K D值之親和力結合於預定抗原或受體，該親和力比結合於非特異抗原（例如，BSA、酪蛋白）之親和力低至少十倍，諸如至少1,000倍，諸如至少10,000倍，例如至少100,000倍。
如本文所論述的，抗體、Ig或抗體結合片段與抗原之結合親和力可藉由PTM（例如，醣化）對抗體、Ig或抗體結合片段與抗原之間的結合重要的蛋白質區中之抗體、Ig或抗體結合片段進行改變（例如，降低）。降低的結合親和力進而可引起抗體、Ig或抗體結合片段之效力降低。如本文所論述的，關於抗體、Ig或抗體結合片段之「效力」係指以產生特定強度之效應所需之量表示的藥物活性之量度。舉例而言，強效藥物（例如，治療性mAb）可在較低濃度下引起給定的反應，而效力較低之藥物在較高濃度下引起相同的反應。例如，可在基於細胞之生物分析中量測mAb之效力，該生物分析依賴於發光信號強度將藥物（例如，mAb）濃度與活性相關聯。
如本文中所用的，術語「有效量」係指足以產生所需反應的試劑之量，諸如減少或抑制與病況或疾病相關之一或多種病徵或症狀。當向個體投予時，一般將使用達成目標組織/細胞濃度之劑量。在一些實例中，「有效量」係治療病症或疾病中之任一者之一或多種症狀及/或潛在病因的量。
在一些實例中，有效量為單獨或與醫藥學上可接受之載劑或一或多種額外治療劑一起誘導所需反應的醫藥製劑之量。
在一個實例中，所需反應為例如藉由減少與病況或疾病相關之症狀之數目及/或量來增加個體的存活時間及/或改善個體的生活品質。在另一實例中，所需反應為藉由減緩或消除疾病之進展，例如延緩或消除癌症之進展來增加個體之存活時間及/或改善個體之生活品質。
疾病、症候群、病毒感染等之症狀及/或潛在病因不需要被完全抑制以示醫藥製劑是有效的。舉例而言，相較於在不存在醫藥製劑之情況下的典型進展，醫藥製劑可將疾病、症候群、病毒感染等之進展降低所需量，例如至少10%、至少20%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或甚至至少100%。
在另一或額外實例中，其為足以部分地或完全地緩解個體內之疾病之症狀的量。治療可涉及僅暫時減緩疾病之進展，但亦可包含永久地停止或逆轉疾病之進展。
本文中所描述之試劑之有效量可以許多不同方式來測定，諸如（例如）分析與個體之病況或疾病相關的一或多種病徵或症狀之減少或量測已知與病況或疾病相關的一或多個分子之表現量。有效量亦可經由各種活體外、活體內或原位分析，包含本文中所描述之分析來測定。
所揭示之治療劑可在治療過程期間以單次劑量或以若干劑量，例如每小時、每天、每週、每月、每年投予。有效量可視所治療之個體、所治療之病況之嚴重性及類型以及投予方式而定。
如本文所用的，術語「醣化」係指蛋白質胺基，主要是離胺酸側鏈上之α胺末端及ε胺基的非酶醣化作用。醣化為朝向更複雜的美拉德反應（Maillard reaction）之第一步。當蛋白質與還原糖（例如，葡萄糖、半乳糖、果糖）一起培育或以其他方式接觸時可發生醣化。在醣化反應中，敏感的（例如，去質子化的）胺基可逆地與還原糖之醛基縮合以形成不穩定的希夫鹼中間體（Schiff base intermediate），該中間體可經歷自發的多步阿馬道里（Amadori）重排以形成更穩定的共價鍵結酮胺。然而，在某些條件下，酮胺阿馬道里產物可經可逆地驅動而失去糖加合物。
蛋白質醣化為活體內自然發生之過程，例如已發現人類血清白蛋白（HSA）及血紅蛋白視血糖水平及循環時間之量而具有不同程度的醣化。類似地，具有敏感胺基之蛋白質或肽可在活體外經歷醣化。在諸如高溫及/或氧化環境之壓力條件下，阿馬道里產物可經歷進一步反應，從而產生反應性羰基及二羰基化合物，其接著與蛋白質反應以形成更穩定及不可逆的加合物，稱為高級醣化終產物（AGE）。
鑒於商業治療性抗體生產之複雜性，醣化並不罕見，但目前無法預測反應動力學及程度。mAb之醣化可在醱酵過程期間發生，其中葡萄糖為產生mAb之細胞的能量源。在哺乳動物細胞培養之過程期間，醣化水平可受到總糖進料影響。包含但不限於溫度、pH、時間、離子強度及其類似者之變量可影響醣化之動力學及程度。所存在的糖之類型（例如，己糖）及可獲得胺基之特異性反應性可影響蛋白質醣化，且可增加治療性蛋白質之異質性。
在一些實例中，可藉由在儲存調配物中包含還原糖，在儲存條件期間將醣化引入蛋白質（例如，治療性mAb）。視包含但不限於pH（例如，酸性pH）及溫度（例如，升高的溫度）之條件而定，即使在調配物中不包含還原糖之情況下，其亦可藉由降解高級碳水化合物（例如，蔗糖）來產生。
迄今為止，尚未鑑定出指示潛在醣化位點或指示胺基酸對醣化之敏感性的特定蛋白質序列（例如，一級結構）或廣義（例如，簡併）序列。然而，三維局部環境可能潛在地影響醣化之形成。舉例而言，胺基之反應性可視局部條件而定，該等條件在形成酮胺阿馬道里產物之前影響中間體之胺去質子化及穩定化。具體而言，組胺酸殘基或鹼性殘基（精胺酸及其他離胺酸）與具有已知結構之一些蛋白質（例如，肝酒精去氫酶、RNase A、DNase I、白蛋白、血紅蛋白）中之醣化發生相關。羧酸（例如，天冬胺酸）之催化效應亦與醣化相關。
對於諸如mAb之治療性生物分子，醣化之潛在影響（例如破壞生物功能位點或誘導聚集的進一步降解）使醣化成為潛在的關鍵品質屬性（CQA）。本文中論述的術語「CQA」係指一或多種物理、化學、生物或微生物特性或特徵，其應在適當限度、範圍或分佈內，以確保所需產品品質。
如本文所用的，術語「 K D」（M）係指特定結合蛋白－配體相互作用之解離平衡常數。舉例而言， K D可指抗體、Ig或抗體結合片段與抗原之間或抗體、Ig或抗體結合片段與糖（例如，葡萄糖）分子之間的解離平衡常數。 K D與結合親和力之間存在反比關係，因此 K D值愈小，親和力愈高，亦即愈強。因此，術語「較高親和力」或「較強親和力」與形成相互作用之能力較高有關，且因此 K D值較小，且相反地，術語「較低親和力」或「較弱親和力」與形成相互作用之能力較低有關且因此 K D值較大。解離平衡常數 K D等於1/ K。
如本文中所用的，術語「 k 1」（M -1× 天 -1）係指特定蛋白質－糖（例如，抗體－葡萄糖)相互作用之締合速率常數，且亦稱為醣化速率。
如本文中所用的，術語「 k -1」（天 -1）係指特定蛋白質－糖（例如，抗體－葡萄糖）相互作用之解離速率常數，且亦稱為去醣化速率。
如本文中所用的，術語「 K」（M -1）係指特定蛋白質－糖（例如，抗體－葡萄糖）相互作用之表觀締合常數。可藉由將 k 1除以 k -1來獲得締合常數 K 。
如本文中所用的，術語「 K 1」及「 K 2」分別指對應於蛋白質去質子化反應及蛋白質醣化反應之平衡常數，各反應對應於平衡模型以定量分析pH值依賴性醣化。更具體的，本文所用之 K 1與HC-CDR3-Lys98側鏈上之胺去質子化的平衡常數有關，而 K 2與葡萄糖與去質子化胺結合的平衡常數有關。HC-CDR3-Lys98之ε-胺基之pK a可由pK a= -log ( K 1 )來確定，且與 K 相比， K 2 為醣化反應之pH值非依賴性微觀締合常數。較低的pK a值表示較強的酸，而較高的pK a表示較弱的酸。特定胺基酸組之pK a可視蛋白質微環境而改變。
如本文中所用的，術語「 k app,1」及「 k app,2」分別指醣化及去醣化反應之表觀反應速率常數。如本文所用的，術語「醣化反應」係指蛋白質之醣化百分比隨時間的增加，且術語「去醣化反應」係指蛋白質之醣化百分比隨時間的降低。
如本文中所用的，術語「E a」係指對應於必須提供給化合物以引起化學反應的最小能量的表觀活化能。E a可基於不同溫度下之去醣化動力學根據阿瑞尼斯方程式計算。E a可被降低從而增加反應速率，或者，E a可被增加從而降低反應速率。活化能可被降低之一個因子為溫度，例如溫度升高可引起參與特定反應之分子的能階升高，從而增加反應速率。活化能亦可藉由其他方式改變，例如特定反應可根據pH值進行得更快或更慢。通常，藉由降低其活化能來加速反應之過程稱為催化，而有助於降低活化能之因子稱為催化劑。因此，如本文所論述之催化劑包含但不限於溫度及pH值。
如本文中所用的，術語「阿瑞尼斯行為」或「展現阿瑞尼斯行為」係指 k app之自然對數（ln）與逆溫度（1/T）之曲線圖產生直線的反應。阿瑞尼斯曲線之線之斜率與活化能E a成正比，其中活化能愈高（例如，斜率愈陡），特定反應之速率常數（k app）的溫度依賴性愈強。因此，廣義而言，展現阿瑞尼斯行為之反應屬於受溫度影響的反應。
如本文中所用的，「接觸」包含使溶液或固相中的至少兩種物質結合在一起。
如本文中所用的，術語「自下而上質譜法」係指其中純化蛋白質（或複合蛋白質混合物）經受蛋白質水解裂解並藉由MS分析肽產物的質譜方法。
如本文中所用的，術語「自上而下質譜法」係指其中將完整蛋白質離子引入氣相中並在質譜儀中進行片段化及分析之質譜方法，從而產生蛋白質之分子量以及蛋白質離子片段梯。
如本文中所用的，術語「細胞激素」係指自細胞釋放之不同組的可溶性蛋白質及肽，其在奈米至皮莫耳濃度下充當體液調節劑，且其在正常或病理條件下調節個別細胞及組織之功能活性。此等蛋白質亦直接介導細胞之間的相互作用且調節細胞外環境中發生之過程。許多生長因子及細胞激素藉由防止程序性細胞死亡來充當細胞存活因子。細胞激素包含天然存在之肽及保留全部或部分生物活性之變體。特定細胞激素具有自分泌、旁分泌及/或內分泌活性，且經由受體結合，可視細胞激素及目標細胞而定引發多種反應。細胞激素之許多功能包括控制細胞增殖及分化以及調節血管生成以及免疫及發炎反應。
如本文中所用的，術語「細胞激素風暴」或「細胞激素釋放症候群」係指可發生於人類或其他動物中之生理反應，其中先天性免疫系統致使促發炎細胞激素之失控及過量釋放，其最終可嚴重地傷害或甚至致使經歷細胞激素風暴/症候群之人類或動物死亡。細胞激素風暴與廣泛多種感染性及非感染性疾病相關，且在一些實例中可回應於將諸如治療性生物分子（例如，單株抗體）之外來物質引入人類或動物中而經誘發。與細胞激素風暴相關之細胞激素可包含但不限於干擾素、介白素、趨化因子、集落刺激因子（CSF）及腫瘤壞死因子（TNF）。
如本文中所用的，術語「降低」或「減少」係指降低某物之品質、量或強度。在一個實例中，治療性生物分子（例如，治療性單株抗體）之醣化可在以下情況下降低治療性生物分子之效力：其中醣化發生在治療性生物分子之對其功能重要的區域中，例如在賦予治療性生物分子與目標分子之間特異性之區域中。在治療性生物分子為抗體之實例中，對應於HC或LC之一或多個CDR，較佳的是對應於HC之CDR，更佳的是HC CDR3中之醣化可降低抗體之效力。 一般描述
如本文所論述的，需要可用於可靠地預測生物分子，特別是治療性生物分子（例如，治療性抗體）在活體外及活體內發生醣化/去醣化之速率的方法，其中生物分子隨糖濃度（例如，葡萄糖濃度）、時間、溫度及包含但不限於pH值之其他變量中之至少一或多者而變化的生物分子。 活體外預測生物分子中之醣化百分比的方法
治療性生物分子（例如單株抗體）可具有任何數目之潛在醣化反應位點，因此治療性生物分子中醣化之鑑別及表徵可具挑戰性。治療性生物分子之某些區域中的醣化對於特異性識別（例如，結合）目標抗原並不重要，故可在不降低效力之情況下被耐受，然而穩定性仍可能受其影響。或者，對目標抗原之結合至關重要的胺基酸之醣化可降低效力，此反而可不利地影響所欲給予有需要之個體的治療劑之有效量。在由於醣化引起之效力降低而所欲向個體投予的生物治療劑之有效量在不知不覺中降低的情況下，治療之有效性可能會下降。舉例而言，抗體HC之CDR（例如，CDR1、CDR2、CDR3）或在一些實例中抗體LC中的胺基酸之醣化可降低效力。因此，對於諸如mAb之治療性生物分子，醣化為一種潛在的CQA，故而需要在活體外（例如，在儲存條件下）預測醣化/去醣化速率的方法。
在本案之範疇內的為用於評定治療性生物分子(例如，抗體)之醣化的分析方法。實例包含但不限於基於電荷之方法、LC-MS方法、比色分析及硼酸鹽親和層析。在基於電荷之方法中，毛細管等電聚焦（cIEF）或成像毛細管電聚焦（icIEF）包括基於電荷之分離方法，其能夠檢測由特定醣化位點上所致之正電荷損失的醣化。另一種基於電荷之方法為離子交換層析（IEC），其可用於解析具有表面電荷差異的醣化及非醣化蛋白質。陽離子交換層析（CEX)使用帶負電離子交換樹脂，該樹脂對具有淨正表面電荷之分子具有親和力，可用於製備及分析目的，且可用於分離大範圍之分子量的生物分子。CEX依賴於蛋白質之淨表面電荷以蛋白質的等電點（pI）決定之方式隨pH值變化的原理。當pH值等於蛋白質之pI時，蛋白質將不帶淨電荷。或者，在低於蛋白質之pI或高於蛋白質之pI的pH值下，蛋白質將分別攜帶淨正電荷或淨負電荷。因為醣化影響蛋白質之電荷，所以CEX可用於解析相同蛋白質之醣化及非醣化形式，例如治療性單株抗體。
LC-MS方法可用於測定醣化水平，藉由基質輔助雷射脫附/離子化（MALDI）或電灑離子化（ESI）。舉例而言，由於各醣化位點顯示+162 Da質量偏移，因此可使用自上而下質譜法快速估計特定生物分子中之醣化水平。為了定位特定醣化位點，可使用自下而上的肽圖譜分析法。舉例而言，由於胰蛋白酶由離胺酸殘基之醣化抑制，添加+162 Da質量之錯過的胰蛋白酶裂解可表示一個醣化離胺酸殘基。
關於比色分析，由抗體醣化形成之酮胺可藉由硝基藍四唑鎓（NBT）還原分析進行定量。NBT經酮胺形式之醣化蛋白還原，此引起525 nm處之吸光度發生變化。
關於硼酸鹽親和層析（BAC），其為一種分離富集順式二醇化合物之技術。固定相上之硼酸鹽官能基在鹼性pH值條件下形成四面體陰離子，其可與在糖分子上發現之順式-1,2-二醇陣列相互作用，而將醣化物種與非醣化物種分離。為了洗提醣化物種，可藉由降低pH值或添加競爭性羥基來源（例如，山梨醇）來破壞相互作用。
如前所述，治療性生物分子之醣化可影響或可不影響效力。醣化對效力之影響可藉由產生具有不同醣化水平（例如，0%至100%之間、1%至90%之間等）之生物分子溶液來檢查。在一個實例中，具有不同醣化水平之生物分子溶液可藉由以不同比例混合生物分子之醣化及非醣化型式來產生。接著可在與評估溶液活性相關之任何分析中測試不同的生物分子溶液。舉例而言，可在基於細胞或非基於細胞之分析中測試生物分子溶液，其中分析之讀數與各種生物分子溶液之效力有關。作為一個代表性的實例，基於細胞之分析可依賴於報告基因（例如，螢光素酶）之表現量來評估各種生物分子溶液之效力。效力可以是與其他方面相同但具有更大或更小醣化百分比的其他生物分子溶液相比，特定生物分子溶液抑制表現或增強表現之能力的量度。可標繪獲得之資料以揭示隨各種生物分子溶液中之醣化百分比而變化的效力度量（例如，效力百分比）。在實例中，醣化百分比愈大，生物分子之效力愈低，而醣化百分比愈小，效力愈大。
效力之量測可用一或多種其他分析，例如結合分析來證實。與本案相關之結合分析可包含但不限於評定治療性生物分子（或其部分）與目標（例如，抗原）之結合親和力的分析。此類分析包含但不限於基於福斯特（Förster）共振能量轉移（FRET）之結合分析、基於生物發光共振能量轉移（BRET）之結合分析、等溫滴定量熱法（ITC）、表面電漿子共振（SPR）技術（例如，在使用抗原作為配位體及治療性生物分子作為分析物或抗配位體之BIAcore 3000儀器中）及其類似者。治療性生物分子之結合親和力可依據生物分子被醣化之程度而受影響，只要醣化對應於牽涉識別且結合於目標分子之胺基酸殘基。舉例而言，治療性生物分子與目標分子之間的親和力可隨著醣化百分比增加而降低，且此親和力－醣化百分比關係可與隨醣化而變化的治療性生物分子之效力相關及/或指示其效力。
因為效力可依據治療性生物分子（諸如治療性抗體）之醣化而變化，所以預測隨包含但不限於時間、pH值、溫度、離子強度及其類似物的一或多個變量而變化的治療性生物分子之醣化水平能力可提高確保投予具有特定所需效力之治療性生物分子的能力。例如，單株抗體之醣化可發生在醱酵過程期間，其中葡萄糖為產生mAb之細胞的能量源，及/或醣化水平可受哺乳動物細胞培養過程期間總糖進料之影響。接著，醣化水平可隨時間推移進一步改變（例如，增加或降低），此視抗體在投予前的儲存條件而定。例如，在儲存調配物中不包含糖(例如，葡萄糖)或以有利於去醣化之水平包含糖的情況下，生物分子可被去醣化。或者，在儲存調配物中包含糖的情況下，例如在糖以有利於增加醣化之濃度被包含的情況下，生物分子可被額外醣化。
從本文中認識到去醣化速率可在較高溫度下更快，而在較低溫度下更慢。因為治療性生物分子之儲存條件通常在較低溫度下（例如，5℃或更低，例如4℃或更低，或0℃或更低，例如-20℃或更低，例如-80℃），在此等較低溫度下準確瞭解去醣化速率之能力將是有利的。然而，在此等較低溫度下量測去醣化速率可能是具有挑戰性且耗時的。相反的，能夠在較高溫度（例如，20至50℃）下測定去醣化速率的方法將是有利的，因其接著可在較低溫度（例如，5℃或更低）下預測去醣化速率。
因此，在一個實施例中，本文揭示在較高溫度下量測去醣化參數的方法，使得可在較低溫度下預測去醣化參數（例如，儲存治療性生物分子之溫度）。在一個實例中，該方法涉及在不存在糖（例如，葡萄糖）之情況下，在預定時間範圍（例如，5至40天）內使用表觀一階去醣化反應（係指實例後之材料與方法中的方程式6）在較高溫度下（例如，20至60℃、例如20至50℃，諸如20至45℃之間的兩個或更多個溫度）測定去醣化反應之表觀反應速率常數（例如，如本文所揭示之「 k app,2」），且繪製表觀反應速率常數與逆溫度（1000/K）之自然對數。在表觀速率常數之自然對數隨溫度降低而大致呈線性降低之情況下，資料可用一直線擬合（例如，相關係數為0.95或更高，例如0.98或更高）以使得能夠將表觀去醣化反應速率常數外推至較低溫度，諸如儲存治療生物分子之溫度（例如，5℃或更低）。透過此方式，可藉由依賴於在較高溫度下獲得之實際資料在較低溫度下預測去醣化表觀反應速率常數。使用在特定較低溫度（例如5℃）下所預測的去醣化表觀速率常數，可模擬在該特定較低溫度下，在任何所需時段內的（例如，10天至1年，或甚至超過一年，諸如兩年、三年、五年或超過五年）預測去醣化曲線（例如，透過實例後之材料與方法中的方程式6）。特別的，所預測的去醣化曲線可包括在所選溫度下隨時間推移之特定治療性生物分子之醣化百分比的變化。
如上所述，諸如pH值之其他變量可能會影響醣化/去醣化反應。因此，在實施例中，上述方法可在兩個或更多個（例如，3個）不同pH水平下進行。阿瑞尼斯方程式（實施例後之材料與方法中之方程式7）可用於測定不同pH水平下去醣化反應之表觀活化能（E a）。具體而言，各pH值下之表觀活化能（E a）可自所測定的表觀反應速率常數與逆溫度之自然對數的曲線之線性擬合之斜率來確定。此使得能夠理解pH值如何影響去醣化速率，例如較低的表觀活化能可對應於較快的去醣化速率，而較高表觀活化能可對應於較慢的去醣化速率。當調配包括用於儲存之治療性生物分子之特定組合物時，可使用/依賴於此資訊。舉例而言，若目標為在儲存期間減慢去醣化速率，則可選擇對應於較高表觀活化能之pH值。在另一實例中，若目標為在儲存期間增加去醣化速率，則可選擇對應於較低表觀活化能之pH值。
藉由能夠在儲存有治療性生物分子之溫度下預測隨時間而變化之醣化百分比的能力，可向有需要之個體投予有效量的治療性生物分子，而不管治療性生物分子已儲存多長時間。舉例而言，在治療性生物分子在儲存期間發生去醣化的情形下，若生物分子已儲存較長時間（例如，醣化百分比較小，且因此效力較高），則可向個體投予較少劑量，而若生物分子已儲存較短持續時間（例如，醣化百分比較大，且因此效力較低），則可向個體投予較大劑量，使得不管儲存時間如何向個體遞送相同治療效力。在額外或替代性實例中，回應於與疾病或病況相關之正在惡化或正在改善的病徵或症狀，可能需要依據時間來調整劑量，且在此等實例中，隨儲存時間而變化的治療劑之效力可用於確保經調整劑量對應於所投予治療性生物分子之所需效力。
關於與在儲存條件（例如，在特定溫度下）中隨時間而變化之劑量有關的效力之資訊可作為例如作為患者藥品說明書（PPI）、使用說明（IFU）、用藥指南（MG）及其類似物中之一或多者的一部分。本文中所論述之PPI係指為FDA批准之藥物標籤之一部分的患者標籤。PPI由製造商開發，經FDA批准，且需要配有特定產品或產品類別。其他PPI可由製造商自願提交給FDA且由FDA批准，但其分配不為強制性的。本文中所論述之IFU係指由製造商開發、經FDA批准且配有具有複雜劑量說明之特定產品，以幫助患者恰當地使用產品。本文中所論述之MG為隨許多處方藥一起提供的紙質講義。指南解決對特定藥物及藥物類別特定之問題，且其含有可有助於患者避免嚴重不良事件之經FDA批准的資訊。FDA要求在機構確定以下時向MG發放某些處方藥物及生物產品：1）某些資訊對於防止不良效應為必需的，2）患者決策應告知關於產品之已知副作用的資訊，或3）患者遵守產品之使用說明對其有效性至關重要。
舉例而言，可藉助於PPI、IFU、MG或其類似物告知患者關於隨儲存持續時間而變化的特定治療劑之適當劑量。另外或替代地，醫師或藥劑師可視效力、藥物劑量與儲存時間之間的預測關係推薦或指定特定劑量。
上述方法可用於治療性生物分子，其中期望在儲存條件下，調配物中不包含糖（例如，葡萄糖）。換言之，此類方法依賴於在儲存之前確定醣化百分比，其中特定治療性生物分子在儲存期間隨時間推移被去醣化。 在儲存期間維持生物分子之醣化百分比的方法
在另一實施例中，從本文中認識到在一些實例中可期望確保治療性生物分子（諸如治療性抗體）之醣化百分比在儲存條件下在預定時間量過程內保持恆定（例如，變化不超過0.1%、或不超過0.5%、或不超過1%、或不超過5%、或不超過10%）。舉例而言，與上文所論述的類似，特定醣化百分比可與特定效力相關，且可期望在治療性生物分子儲存之生命週期內維持該特定醣化百分比，且因此維持特定效力，直至向有需要之個體投予治療劑。在此類實例中，可理解的是，可調整劑量以增加治療劑之活性，而不考慮由於醣化水平變化所致之任何效力變化。
為了達至包含在包括能夠可逆地進行醣化/去醣化反應之治療性生物分子的調配物中的糖（例如，葡萄糖）濃度，可考慮至少兩個變量。具體而言，至少兩個變量可與隨醣化水平（例如，醣化百分比）及醣化之平衡水平（例如，醣化平衡百分比）而變化的治療性生物分子之效力有關。在所需效力水平以實驗方式確定為隨醣化水平而變化之情況下，下一個步驟可能是確定在儲存條件期間隨時間推移維持特定醣化水平之調配物中所需的糖（例如，葡萄糖）濃度。確定維持特定醣化水平所需的調配物中之糖濃度的過程可包括將具有對應於所需效力水平之醣化百分比的生物分子與多種不同葡萄糖濃度之一起培育，並確定針對不同葡萄糖濃度中之每一者的生物分子之醣化平衡百分比。在此方法中，可選擇葡萄糖濃度範圍以確保葡萄糖濃度之至少一部分預期使得生物分子隨時間推移而經歷醣化增加，且預期葡萄糖濃度之至少另一部分使得生物分子隨時間推移經歷去醣化反應，其中醣化反應及去醣化反應兩者在一定時間量之後達至平衡（例如，平台期）。藉由選擇糖濃度範圍以使得醣化反應及去醣化反應均發生，可能或預期所測試糖濃度中之至少一或多者將使得隨時間推移的醣化百分比幾乎沒有變化或沒有變化。可理解的是，不引起進一步醣化或去醣化反應之糖濃度包括：若包含在調配物中，則將足以在儲存治療性生物分子之時間範圍期間維持所需醣化百分比的濃度。
舉例而言，可存在引起醣化百分比變化小於0.1%、或小於0.5%、或小於1%、或小於5%，或甚至在一些實例中小於10%之變化為可接受的糖濃度。參考關於以下實施例3之圖3A，所選3 mM及6 mM濃度之間的葡萄糖濃度可理解為對應於預期醣化百分比幾乎沒有變化的葡萄糖濃度。
以下方法亦在本案之範疇內，其中可在特定濃度之糖（例如，葡萄糖）中培育治療性生物分子，使得在一些預定時間量內（例如，在1天內、在2天內、在5天內、在10天內、在15天內）達至所需醣化百分比。作為代表性實例，治療性生物分子之所需醣化百分比可包括40%，且在其純化後初始醣化百分比可包括25至27%。調配物中包含之葡萄糖濃度可憑經驗確定，使得在預定時間量內，治療性生物分子之醣化百分比達至所需的40%平衡醣化水平，且接著在儲存條件期間隨後維持處於平衡。在實例中，治療性生物分子可保持處於較高溫度（例如，20至40℃），或進行醣化平衡測定之任何溫度），直至推斷達至所需醣化百分比，且接著治療性生物分子可轉移至儲存條件（例如，5℃或更低）。 用於活體內降低治療性生物分子之初始效力的方法
從本文中認識到，隨糖（例如，葡萄糖）濃度而變化的醣化之可逆性質可在一些情況下實現控制隨治療性生物分子經醣化之程度而變化的治療性生物分子之效力（例如，醣化百分比）的能力。如上所述，可控制效力之一種方式可包含以限定比率混合具有不同醣化百分比之治療性生物分子，從而獲得具有特定醣化百分比的治療性生物分子之溶液。另一實例可包含將醣化至一定程度之治療性生物分子與預定量的糖（例如，葡萄糖）一起培育，使得治療性生物分子以所需醣化百分比達到醣化平衡。在此等實例中，可向患者投予具有預定效力之治療性生物分子。
然而，從本文中另外認識到，由於醣化之可逆性質，在一些實例中，涉及治療性生物分子之醣化/去醣化反應可在投予至個體後在活體內發生。活體內是否發生醣化反應或去醣化反應可視許多因素而定，包含但不限於在向個體投予時治療性生物分子之初始醣化百分比，及接收治療性生物分子的個體體內之糖（例如，葡萄糖）濃度。舉例而言，在投予後具有極少至無醣化之治療性生物分子可隨時間推移在循環中變得醣化至基於血流中之葡萄糖濃度的一些醣化平衡百分比。另一方面，更大量地醣化（例如，50%醣化）之治療性生物分子可隨時間推移在循環中經歷去醣化反應，以類似地達到基於血流中之葡萄糖濃度的一些醣化平衡百分比。在循環中隨時間推移發生醣化反應之情況下（例如，治療性生物分子變得更加醣化），相較於在投予後時生物分子之初始效力，生物分子之效力可隨時間推移降低。或者，在去醣化反應隨時間推移在循環中發生之情況下（例如，治療性生物分子變得較少醣化），相較於在投予時生物分子之初始效力，生物分子之效力可隨時間推移在循環中增加。
從本文中認識到，在一些實例中，向有需要的患者投予具有初始效力之治療性生物分子可能是有利的，該初始效力接著在投予時隨時間推移變化（增加或降低效力）。舉例而言，已知向個體投予諸如治療性生物分子之外來物質，可在一些情況下在個體中誘導一些程度之細胞激素風暴。用於降低治療性生物分子誘導個體內之細胞激素風暴或其他不合需要的反應之可能性的一種選項可包含以降低的效力向個體投予治療性生物分子，其中預期效力將隨時間推移在循環中增加。此可藉由將治療性生物分子之醣化百分比控制為向個體投予之第一醣化百分比來實現，使得在投予治療性生物分子時醣化百分比隨時間推移在循環中改變（例如，降低）至第二醣化百分比（平衡醣化百分比）。此可提供以單次劑量實現治療性生物分子之效應，該治療性生物分子最初具有降低的效力，此降低引發細胞激素風暴之可能性，且其效力隨時間推移在循環中增加。
為提供具有降低之效力的治療生物分子，該效力在其投予後隨時間推移在循環中增加，初始醣化百分比需要高於活體內治療性生物分子之平衡醣化百分比。活體內治療性生物分子之醣化平衡百分比隨著治療性生物分子在循環中之時間範圍期間的循環葡萄糖濃度（例如，平均葡萄糖濃度）而變化。舉例而言，個體中之葡萄糖水平可隨時間推移隨一或多個變量而變化，該一或多個變量包含但不限於食物攝入、運動持續時間及/或強度、壓力水平、禁食持續時間等。因此，隨時間推移之平均葡萄糖水平可因此對於一些個體較低，而對於其他個體較高。舉例而言，血糖控制（例如，胰島素抗性）不佳之個體可能平均傾向於較高的血糖值。
作為一代表性實例，在向個體投予治療性生物分子後，治療性生物分子可在一些時間量後達至20至25%之醣化平衡百分比。可影響達至平衡所消耗之時間的因素可包含但不限於初始醣化百分比、去醣化（或在一些實例中，醣化）反應速率（例如，其可為特定胺基酸對醣化之敏感程度的函數）及隨時間推移之葡萄糖濃度變化。因此，關於以上實例，初始醣化百分比為50%之治療性生物分子可在一些時間量內降低至20至25%之醣化平衡百分比。另一方面，若治療性生物分子以低於活體內醣化平衡百分比（例如，5%醣化）之醣化百分比投予，則治療性生物分子可隨時間推移在活體內被醣化，以隨時間推移在循環中達到20至25%的醣化平衡百分比。當然，視個體葡萄糖水平而定，不同個體可能有不同醣化平衡百分比。舉例而言，對於具有較高平均葡萄糖水平之個體，醣化平衡百分比可為30至35%，而對於具有較低平均葡萄糖水平之個體，醣化平衡百分比可為15至20%。
因此，治療性生物分子在活體內隨時間推移將效力自初始效力變為最終效力（例如，由活體內醣化平衡電位確定之效力）的程度可理解為初始醣化百分比與活體內平衡醣化百分比之差異的函數。因此，可選擇初始醣化百分比，使得治療性生物分子展現預定水平之降低的效力（例如，更大的初始醣化百分比），其隨時間推移增加至由循環葡萄糖濃度限定之效力，或使得治療性生物分子展現預定水平之增加的效力，其隨時間推移降低至由循環葡萄糖濃度限定之效力。
在初始醣化百分比高於活體內醣化平衡百分比且因此在向個體初始投予時展現降低的效力接著隨時間推移增加之實例中，初始降低的效力可產生以下效應中之一或多者。舉例而言，相較於不具有初始降低的效力的其他相同的治療性生物分子，降低的初始效力可具有降低與細胞激素風暴或源自治療性生物分子之投予的其他不良免疫反應有關的一或多種病徵或症狀的效應。舉例而言，相較於缺乏降低的初始效力的其他相同之治療性生物分子，降低的初始效力可導致一或多種細胞激素之釋放程度降低。釋放程度可降低之一或多種細胞激素可包含但不限於干擾素、介白素、趨化因子、CSF、TNF及其類似物。一或多種病徵或症狀之減少可包含發紅、腫脹或水腫、發燒、疼痛、功能喪失或與急性炎症相關的其他病徵或症狀中之一或多者的減少。
從本文進一步認識到，隨時間推移在體內調節治療性生物分子之效力可存在額外或替代的優點。具體而言，循環中治療生物分子之濃度可視一或多個相關藥物動力學參數而定隨時間推移降低。隨著濃度隨時間推移降低，此降低會減少循環中治療性生物分子之有效量。從本文中認識到，溶液中治療性生物分子之有效量的此減少可藉由以降低的初始效力提供治療性生物分子來至少部分地減輕，接著隨時間推移在循環中增加至與活體內醣化平衡百分比相關的更大效力。具體而言，隨著治療性生物分子之濃度降低，效力可對應地增加，因此至少在一定程度上抵消了治療有效性方面的濃度降低。
因此，基於上述內容，可理解為了賦予治療性生物分子降低的初始效力，該效力在活體內投予時隨時間推移增加，初始醣化百分比需要大於活體內平衡醣化百分比。由於個體之平均葡萄糖值可能不同，本文所揭示之與在循環期間增加的初始效力降低有關的方法的一個態樣可包含在投予治療性生物分子之前獲得個體之葡萄糖濃度曲線，使得可有效地控制/預測初始效力降低之程度及隨時間推移效力之變化。獲得葡萄糖濃度曲線可藉由在足以反映與個體相關之典型血糖濃度的預定時段內獲得血糖量測值來實現。葡萄糖量測值可例如經由傳統指尖血糖儀及/或連續葡萄糖監測系統中之一或多者來獲得。在瞭解個體之葡萄糖濃度曲線（例如，隨時間而變化之平均葡萄糖濃度）的情況下，治療性生物分子之初始醣化百分比可基於效力初始降低之程度及隨時間推移增加至由個體的葡萄糖濃度曲線決定之最終效力。
作為一代表性實例，生物反應器中之典型葡萄糖濃度可在300至1000 mg/dL之間。視濃度、一或多種胺基酸對醣化之敏感性等而定，此類生物反應器中產生之特定治療性生物分子可醣化至憑經驗確定的某種水平。在一些實例中，特定治療劑之醣化百分比在自生物反應器生物分子純化後可大於或在其他實例中小於在向個體投予後活體內實現的治療性生物分子之平衡醣化百分比。治療性生物分子之醣化程度可視所需初始醣化百分比而定進行進一步操控，例如藉由將醣化至不同程度的限定比率之治療性生物分子之不同溶液混合，藉由將治療性生物分子與葡萄糖濃度一起培育，使得達至所需初始醣化平衡濃度及其類似物。然而，如上文所詳細論述的，在不存在葡萄糖之情況下，治療性生物分子可在儲存中隨時間推移經歷去醣化。因此，在需要向個體提供特定初始醣化百分比之情況下，例如使得生物分子展現如所論述之降低的初始效力，生物分子可能需要與一定量的糖（例如，葡萄糖）一起調配，以在投予前在隨時間推移的儲存中維持所需的初始醣化百分比。通常，可理解的是，調配物中之此類糖濃度可使得治療性生物分子之初始醣化百分比維持在比投予後活體內實現的對應醣化平衡百分比更高的醣化百分比。活體內實現之醣化平衡百分比係視個體血糖曲線而定，其對於健康個體可在70至180 mg/dL之典型範圍中，且對於具有由諸如糖尿病（例如，I型或II型）之潛在疾病所致之併發症的個體，範圍可能會更大（例如，70至500 mg/dL或甚至更高）。因為，在需要提供具有降低的初始效力之治療性生物分子，該效力接著在投予後隨時間推移在循環中增加（初始醣化百分比大於活體內達至的對應醣化平衡百分比）的情況下，可理解治療性生物分子可能需要與糖濃度（例如，葡萄糖濃度）一起調配，該糖濃度（例如，葡萄糖濃度）至少略高於特定個體之平均血糖值。因此，在實例中，治療性生物分子可與以下濃度之葡萄糖一起調配：150 mg/dL或更高、或160 mg/dL或更高、或170 mg/dL或更高、或180 mg/dL或更高、或190 mg/dL或更高、或200 mg/dL或更高、或210 mg/dL或更高、或220 mg/dL或更高、或230 mg/dL或更高、或240 mg/dL或更高、或250 mg/dL或更高、或260 mg/dL或更高、或270 mg/dL或更高、或280 mg/dL或更高、或290 mg/dL或更高、或300 mg/dL或更高、或310 mg/dL或更高、或320 mg/dL或更高、或330 mg/dL或更高、或340 mg/dL或更高、或350 mg/dL或更高、或360 mg/dL或更高、或370 mg/dL或更高、或380 mg/dL或更高、或390 mg/dL或更高、或400 mg/dL或更高、或410 mg/dL或更高、或420 mg/dL或更高、或430 mg/dL或更高、或440 mg/dL或更高、或450 mg/dL或更高、或460 mg/dL或更高、或470 mg/dL或更高、或480 mg/dL或更高、或490 mg/dL或更高、或500 mg/dL或更高、或520 mg/dL或更高、或540 mg/dL或更高、或560 mg/dL或更高、或580 mg/dL或更高、或600 mg/dL或更高、或620 mg/dL或更高、或640 mg/dL或更高、或660 mg/dL或更高、或680 mg/dL或更高、或700 mg/dL或更高、或720 mg/dL或更高、或740 mg/dL或更高、或760 mg/dL或更高、或780 mg/dL或更高、或800 mg/dL或更高、或820 mg/dL或更高、或840 mg/dL或更高、或860 mg/dL或更高、或880 mg/dL或更高、或900 mg/dL或更高、或920 mg /dL或更高、或940 mg/dL或更高、或960 mg/dL或更高、或980 mg/dL或更高、或1000 mg/dL或更高、或1100 mg/dL或更高、或1200 mg/dL或更高、或1300 mg/dL或更高、或1400 mg/dL或更高、或1500 mg/dL或更高、或1600 mg/dL或更高、或1700 mg/dL或更高、或1800 mg/dL或更高、或1900 mg/dL或更高、或2000 mg/dL或更高。 用於預測活體內治療性生物分子中胺基酸醣化之百分比的方法
治療性生物分子（例如，治療性抗體）中胺基酸之醣化百分比會影響效力，因此效力會在接受治療性生物分子之個體內隨時間推移變化。因此，預測投予後隨時間推移之醣化百分比的能力可用於改良治療方案。
從本文中認識到，活體外測定之與特定治療性生物分子之醣化/去醣化速率有關的參數可與醣化平衡水平（例如，百分比）（自活體外及/或活體內研究獲得）及初始（例如，投予前）醣化水平（例如，百分比）結合使用，以便預測向個體投予治療性生物分子後隨時間而變化的醣化百分比。舉體而言，參考方程式5及6（參見實施例後之材料與方法），三個擬合參數可用於預測活體內隨時間而變化之醣化百分比，擬合參數為振幅（例如，初始醣化水平與醣化平衡水平之間的差異）、基線及醣化/去醣化速率。對於醣化反應（方程式5），醣化之平衡水平為振幅加基線。對於去醣化反應（方程式6），醣化之平衡水平為基線。
初始醣化水平可藉由如上所述之LC-MS/MS來測定，且在一些實例中，將醣化至不同程度的特定比例之治療性生物分子混合可用於產生醣化至一些預定百分比之治療性生物分子。
可用於預測隨時間而變化之活體內醣化百分比的醣化/去醣化速率可在與體溫相似之溫度（例如，35-40℃，例如37℃）下，且在預期通常在對應個體（例如，人類、猴、狗、貓、小鼠及其類似物）中發現的葡萄糖濃度下在活體外獲得，。舉例而言，血糖值可通常在約4 mM至約7 mM之間變化，因此對於可用於例如人類或猴之活體內預測方法，確定醣化/去醣化速率之實驗可在存在約3 mM至約8 mM葡萄糖，例如約4至7 mM葡萄糖，例如對應於選自3至8 mM葡萄糖之值的任何葡萄糖濃度下進行。
平衡醣化百分比可以藉由一或多種方式確定。平衡醣化百分比為特定治療性生物分子所見之葡萄糖濃度的函數。以下實例3以及對應的圖3A至圖3B論述/說明了如何基於治療性生物分子與不同濃度之葡萄糖一起培育之活體外研究獲得平衡醣化百分比。具體而言，與活體內所見之濃度（例如，3至7 mM葡萄糖）實質上相似的一或多種濃度下在活體外確定之平衡醣化百分比可用作活體內預測方法之平衡醣化百分比。
另外或替代地，平衡醣化百分比可根據活體內研究確定，其中一或多名個體接受特定治療性生物分子，接著在不同時間點處獲得血清樣本且進行LC-MS/MS以確定與循環治療性生物分子相關的醣化水平。當醣化水平趨於平穩時（例如，在預定時間量內不在預定範圍之外波動），則可確定對應於平台期的醣化百分比包括醣化平衡百分比。
在本案之範疇內，特定治療性生物分子之醣化平衡水平可與活體內葡萄糖水平相關，例如在一些預定時間量（例如，2至60天，或之間的任何天數）內的平均葡萄糖水平。活體內葡萄糖水平可經由例如連續葡萄糖監測（CGM）系統或諸如傳統指尖應用之其他方式來測定。因此，基於此關聯，具有第一葡萄糖水平之個體可能對應於特定治療性生物分子之第一醣化平衡百分比，而具有第二葡萄糖水平之個體可能對應於相同治療性生物分子之第二醣化平衡百分比。將特定個體之葡萄糖值與特定治療性生物分子的預期醣化平衡百分比相關聯可提高預測活體內特定治療性生物分子之醣化百分比的準確性。
作為一個實例，醣化平衡百分比可在用於特定治療性生物分子之臨床試驗過程期間獲得。在此類實例中，可定期監測血糖值，進而建立血糖值與醣化平衡百分比之間的相關性。接著，此相關性可在隨後的方法中用於預測後續個體之活體內醣化百分比，其中量測或推斷彼等個體之血糖水平（例如，基於諸如重量、運動水平、飲食習慣及其類似者之品質屬性推斷，及/或從作為醫院或醫生問診之一部分進行的一或多種過去的葡萄糖測試或其他實驗室測試結果推斷），且彼等血糖水平用於推斷醣化平衡百分比。
如前所述，預測向個體投予治療性生物分子後隨時間而變化的醣化百分比的能力，可使得能夠預測隨與活體內治療性生物分子相關之時間而變化的效力。舉例而言，在投予之前，可在活體外建立隨醣化百分比而變化之效力（參考實例1及圖2）。所得資料可擬合至一方程式，該方程式能夠預測0至100%之間的任何醣化百分比的效力。因此，預測活體內醣化百分比可進而能夠預測隨向個體投予後之時間而變化的治療性生物分子之效力。 實例
提出以下實例以便為一般熟習此項技術者提供如何製造及使用本發明之方法及組合物之完整揭示內容及描述，而非限制本發明人視作其發明之物的範疇。本文已努力確保關於所用數字（例如，量、溫度等）之準確性，但亦應考慮一些實驗誤差及偏差。除非另有指示，否則份數為重量份，分子量為平均分子量，溫度以攝氏度計，且壓力為大氣壓或接近大氣壓。 實例 1. 藉由 CEX 及 LC-MS 肽圖譜對 mAb-1 進行電荷變體分析揭示在 HC-CDR3-Lys98 處具有可逆醣化之物種
CEX用於分離mAb-1電荷變體。兩個主要物種在8.9及9.5分鐘洗提而出，且一些次要物種在早於8.6分鐘或晚於10分鐘洗提而出（圖1A）。在8.9分鐘及9.5分鐘洗提而出之純mAb-1中，此兩種主要物種之分數分別為總峰面積之大約27%及47%。在將mAb-1在10 mM組胺酸pH 6.0中及在37℃下培育14天之後，在8.9分鐘洗提而出之物種之相對量減少，而在9.5分鐘洗提而出之物種之相對量增加了大約相同的量（參考線110，圖1A），從而顯示蛋白質正在進行之反應導致在8.9及9.5分鐘洗提而出之物種之相互轉化，此可能反映了其表面電荷之差異。
為瞭解此兩種mAb-1電荷變體之化學性質，將其自CEX中純化，隨後進行LC-MS肽圖譜分析以鑑別且量化此兩種變體中之轉譯後修飾（PTM）。此分析顯示在8.9分鐘洗提而出之物種中HC-CDR3-Lys98之質量偏移為+162.7 Da，但在9.5分鐘溶離的物種中則沒有。將此質量偏移指定為HC-CDR3-Lys98處之醣化。進一步分析顯示，在8.9分鐘及9.5分鐘洗提之物種中的醣化水平分別為88%及1%。在此兩個物種中未鑑別出顯著不同的其他PTM。類似地，在其他重鏈(HC*) CDR3中，在沒有偵測到醣化水平的情況下，位置98處存在離胺酸（稱為HC*-CDR3-Ly98）。
在不存在葡萄糖之情況下，對純mAb-1（參考圖1B處之線130）及在37℃下培育14天後之mAb-1（參考圖1B處之線135）的基於LC-MS之肽圖譜分析顯示37℃培育的mAb-1（圖1B）中醣化HC-CDR3-Lys98肽峰之降低及天然（亦即非醣化）HC-CDR3-Lys98肽峰之伴隨增加，與CEX結果一致。在不存在葡萄糖之情況下，純mAb-1（線130）及在37℃下培育後之mAb-1（線135）的醣化水平分別為32.0%及2.0%，從而證實此反應之可逆性質及藉由CEX及LC-MS定量的醣化水平之一致性（通常相差≤5%）。
為研究此醣化是否由葡萄糖驅動，將mAb-1與0.1 M葡萄糖在37℃下培育14天。觀察到HC-CDR3-Lys98醣化物種之增加與非醣化物種之伴隨減少（參見線115，圖1A）。類似地，如藉由LC-MS肽圖譜所確定，醣化水平增加（資料未顯示）。CEX及LC-MS分析共同指出醣化反應為可逆的，且醣化水平視溶液中葡萄糖之存在而定。 實例 2.HC-CDR3-Lys98 處之醣化程度與藥物效力相關
為確定HC-CDR3-Lys98處之醣化是否干擾生物活性，將藉由半製備CEX層析純化之醣化及非醣化形式的mAb-1以不同比例混合，以產生具有範圍介於1%至88%之醣化水平的mAb-1（藉由基於LC-MS之肽圖譜測定），並進行基於細胞之效力分析。結果顯示HC-CDR3-Lys98處之醣化水平與效力之間的線性及負相關，其中HC-CDR3-Lys98處之較高醣化水平與較低水平的藥物效力相關（圖2）。此外，如Biacore所量測，與對應抗原之結合親和力顯示，與具有1%醣化的mAb-1相比，具有88%醣化的mAb-1之締合速率降低了大約兩倍，導致結合親和力降低了大約兩倍（資料未顯示）。此與基於細胞之效力結果一致。將此HC-CDR3-Lys98突變為精胺酸後，結合親和力降低超過20倍（資料未顯示）。總之，此等結果表明HC-CDR3-Lys98對於mAb-1與抗原之結合至關重要，且其醣化可損害結合親和力。 實例 3.HC-CDR3-Lys98 醣化反應 視溶液中葡萄糖之濃度而定
為瞭解葡萄糖對HC-CDR3-Lys98處之醣化的影響，將6.9 μM mAb-1（~1 mg/mL）與0.3至111 mM不同濃度之葡萄糖在37℃下一起培育28天。培育開始時，mAb-1中之醣化水平在HC-CDR3-Lys98處為大約為27%。在培育過程中，當溶液含有≤3 mM葡萄糖時，HC-CDR3-Lys98處之醣化水平緩慢降低。在較高葡萄糖濃度（≥6 mM）下，游離葡萄糖與非醣化HC-CDR3-Lys98共價結合，隨時間推移增加醣化水平直至達到平衡（圖3A）。
針對各溶液條件（表1），藉由解析三個擬合參數（表觀速率常數 k app及振幅 A及基線 b），使用一階模型（方程式5及方程式6）分析醣化之動力學，其中平衡時之醣化水平由醣化反應之 A+ b及去醣化反應之 b確定。基於簡單化學反應：
Figure 02_image001
（ G：游離葡萄糖； P：非醣化mAb-1； PG：醣化mAb-1，實施例8中之方案2），熱力學模型（方程式9）用於直接擬合各種葡萄糖濃度下之醣化平衡水平（圖3B），返回締合常數 K之最佳擬合為112 (±40) M -1（表2）。另外，應用基於相同化學反應之動力學模型來確定醣化（ k 1）及去醣化（ k -1）速率（方程式8）。對來自不同葡萄糖濃度之資料的全局分析得到最佳擬合 k 1=8.89 (±1.79) M -1天 -1及 k -1=0.09 (±0.02)天 -1。自 k 1及 k -1計算之締合常數 K為99 M -1，其在統計上與自熱力學分析獲得之 K相同。此反應之解離常數（( K D =1/ K）約為8至10 mM，從而顯示HC-CDR3-Lys98處之醣化水平將視任何給定時間處細胞培養基中的實際葡萄糖濃度而定，通常範圍為5至55 mM。因此，為產生具有一致電荷變體分佈之mAb-1，在細胞培養過程期間維持一致的葡萄糖水平是非常重要的。
表 1. 不同溶液條件中 mAb-1 去醣化之表觀動力學
緩衝液類型 緩衝液pH [葡萄糖]（M） 反應溫度（℃） [mAb-1]（M） k app (天 -1) a Amp(%) b
HEPES 7.4 0.1 37 6.9×10 -6 NA 57 (±6)
HEPES 7.4 0.06 37 6.9×10 -6 0.93 (±0.16) 53 (±5)
HEPES 7.4 0.03 37 6.9×10 -6 0.33 (±0.04) 42 (±2)
HEPES 7.4 0.01 37 6.9×10 -6 0.27 (±0.03) 19 (±1)
HEPES 7.4 0.006 37 6.9×10 -6 0.14 (±0.10) 5 (±1)
HEPES 7.4 0.003 37 6.9×10 -6 0.17 (±0.03) 7 (±1)
HEPES 7.4 0.0006 37 6.9×10 -6 0.13 (±0.01) 22 (±1)
HEPES 7.4 0.0003 37 6.9×10 -6 0.08 (±0.01) 25 (±1)
HEPES 7.4 0 37 6.9×10 -6 0.10 (±0.01) 29 (±1)
組胺酸 6.0 0 45 1.4×10 -5 0.18 (±0.03) 26 (±2)
組胺酸 6.0 0 40 1.4×10 -5 0.075 (±0.010) 26 (±1)
組胺酸 6.0 0 35 1.4×10 -5 0.058 (±0.008) 27 (±1)
組胺酸 6.0 0 30 1.4×10 -5 0.035 (±0.005) 28 (±1)
組胺酸 6.0 0 20 1.4×10 -5 0.009 (±0.001) 27 (±1)
組胺酸 5.5 0 45 1.4×10 -5 0.14 (±0.02) 26 (±2)
組胺酸 5.5 0 40 1.4×10 -5 0.062 (±0.008) 26 (±1)
組胺酸 5.5 0 35 1.4×10 -5 0.047 (±0.006) 27 (±1)
組胺酸 5.5 0 30 1.4×10 -5 0.027(±0.004) 27 (±1)
組胺酸 5.5 0 20 1.4×10 -5 0.006 (±0.001) 27 (±1)
組胺酸 5.0 0 45 1.4×10 -5 0.085 (±0.013) 25 (±1)
組胺酸 5.0 0 40 1.4×10 -5 0.036 (±0.005) 26 (±1)
組胺酸 5.0 0 35 1.4×10 -5 0.028 (±0.004) 27 (±1)
組胺酸 5.0 0 30 1.4×10 -5 0.016(±0.003) 27 (±1)
組胺酸 5.0 0 20 1.4×10 -5 0.003 (±0.001) 27 (±1)
a表觀速率常數 k app 由一階醣化（方程式5）或去醣化反應（方程式6）確定。
b振幅 Amp由一階醣化（方程式5）或去醣化反應（方程式6）確定。
表 2. 不同溶液條件中 mAb-1 去醣化之 熱力學參數
緩衝液類型 緩衝液pH 反應溫度（℃） [mAb-1]（M） K(M -1)a ΔG(kcal/mol) b
HEPES 7.4 37 6.9×10 -6 112 (±40) -2.91 (-3.10、-2.64)
組胺酸 6.0 45 6.9×10 -6 16 (±7) -1.75 (-1.98、-1.39)
組胺酸 6.0 37 6.9×10 -6 23 (±9) -1.93 (-2.14、-1.63)
組胺酸 6.0 30 6.9×10 -6 25 (±8) -1.94 (-2.11、-1.71)
組胺酸 6.0 25 6.9×10 -6 26 (±9) -1.93 (-2.11、-1.68)
組胺酸 6.0 15 6.9×10 -6 32 (±16) -1.98 (-2.22、-1.59)
a表觀締合常數 K由1:1結合模型（方程式9）確定。
b醣化反應之 ΔG由ΔG=- RTln K app 計算，其中 R 為氣體常數，且 T 為實驗之絕對溫度（以克耳文為單位）。
實例 4. HC-CDR3-Lys98 去醣化動力學 視溶液中之溫度及 pH 值而定且遵循阿瑞尼斯行為
藉由在無葡萄糖之溶液（10 mM組胺酸、0.05%聚山梨醇酯20及292 mM蔗糖）中且在介於20至45℃之溫度範圍下將13.8 μM mAb-1培育至多35天，來檢查溫度對去醣化動力學之影響。初始mAb-1在HC-CDR3-Lys98處醣化大約27%。在所有測試的溫度下，mAb-1隨時間推移經歷去醣化。此反應特定於還原糖，因為存在過量之非還原糖蔗糖不影響醣化水平。影響醣化動力學之另一關鍵因素為pH值。事實上，在相同培育溫度且在無葡萄糖之情況下，表觀去醣化在pH 6.0下比在pH 5.0下更快（圖4A至圖4C）。
使用一階動力學模型來測定去醣化速率，以便理解mAb-1去醣化之溫度依賴性（表1）。在所有三種pH值條件（pH 5.0、pH 5.5及pH 6.0）下，表觀速率常數之自然對數隨著溫度降低而線性下降，從而顯示去醣化動力學在20℃至45℃範圍內遵循阿瑞尼斯行為（圖4D）。使用阿瑞尼斯方程式（方程式7），表觀活化能 E a經計算在pH 5.0、5.5及6.0下分別為23.5 (±2.1)、23.1 (±1.8)及21.4 (±1.7) kcal/mol。較高pH值下之較低 E a表示去醣化之能量屏障較低，因為在較高pH值下觀測到較快的反應速率。此與pH值依賴性反應速率一致。
接下來，外推阿瑞尼斯行為以測定在5℃下之去醣化速率。藉由外推法測定的5℃下之去醣化速率常數在pH 6.0、5.5及5.0下分別為0.0011、0.0007及0.0004天 -1。此等速率允許使用方程式6模擬去醣化曲線，其中在5.0℃下， A 2固定在t = 0處之醣化水平且 k app固定在外推的去醣化速率（在pH 6.0、5.5及5.0下分別為0.0011、0.0007及0.0004天 -1）。如圖4E中所示，5℃下的模擬曲線及即時去醣化資料至少在36個月內一致，從而顯示去醣化動力學1）即使在較低溫度（例如，5℃）下遵循阿瑞尼斯行為，及2）可自在較高溫度下之短期培育實驗中進行良好預測。 實例 5. 醣化平衡 之 pH 值依賴性顯示胺在 HC-CDR3-Lys98 側鏈上 之低 pK a
為瞭解醣化之pH值依賴性，將6.9 μM mAb-1在pH值介於5至8且葡萄糖濃度在3 mM至11 mM範圍內之不同緩衝液中培育，直至醣化達到平衡。使用表觀一階動力學模型測定醣化之平衡水平且將其標繪為pH值之函數（圖5A至圖5C）。與先前的結果一致，在恆定pH值（例如，pH 7.0）下，在較高的葡萄糖濃度下觀測到較高的醣化平衡水平。在恆定葡萄糖濃度下，醣化水平隨著pH值增加而非線性地增加。緩衝液成分對mAb-1之醣化水平無明顯影響（圖5A至圖5C）。
應用簡單的平衡模型來定量分析pH值依賴性的醣化作用。此模型構成兩種反應：HC-CDR3-Lys98側鏈上的胺之去質子化及葡萄糖與去質子化胺之結合，如下文所顯示，
方案1
Figure 02_image003
其中 PH + 及 P分別為在HC-CDR3-Lys98側鏈上具有質子化及去質子化胺的mAb-1， G為游離葡萄糖， H +為游離質子， PG為HC-CDR3-Lys98處醣化之mAb-1， K 1 為去質子化反應之平衡常數，而 K 2 為醣化反應之平衡常數。
觀察到的醣化mAb-1之總分數（%醣化）可寫成：
Figure 02_image005
方程式1 其中[ PG]為醣化mAb-1之濃度，而[ P t ]為總mAb-1之濃度。根據方案1中之質量守恆，[ P t ]為[ P]、[ PH + ]及[ PG]之總和，其中[ P]為去質子化mAb-1之濃度，且[ PH + ]為質子化mAb-1之濃度。
因此，方程式1可表示為，
Figure 02_image007
方程式2 隨後重新排列以獲得方程式3，
Figure 02_image009
方程式3 其中[ G]及[ H + ]分別為溶液中游離葡萄糖及游離質子之濃度。HC-CDR3-Lys98之ε-胺基之pK a可由pK a= -log ( K 1 )確定，且 K 2 為醣化反應之pH值非依賴性微觀締合常數。
方程式3用於全局擬合圖5A至圖5C中所顯示之三個平衡資料集。在非線性最小平方（NLLS）分析中，[ H + ]由量測之pH值確定；[ G]在0＜[ G]＜ [ G t ]之範圍內隱式求解（[ G t ]為由添加及結合的葡萄糖濃度確定之總葡萄糖濃度），其中[ P t ]針對各條件固定在6.9 μM。此分析返回最佳擬合全局參數 K 1 =2.03 (±0.76) ×10 -7M及 K 2 =120 (±26) M -1，由此HC-CDR3-Lys98之ε-胺基之pK a經估計為6.7（6.6、6.9）。pK a低於水溶液中之典型離胺酸ε-胺基pK a值（10.4）。 實例 6. 熱力學分析顯示醣化反應為焓驅動的
為瞭解醣化反應之驅動力，藉由將6.9 μM mAb-1與不同濃度之葡萄糖，在介於15至45℃之溫度範圍下一起培育，來量測結合於HC-CDR3-Lys98的葡萄糖之表觀締合常數 K。測定各條件之醣化之平衡水平，接著進行NLLS分析以確定各溫度下的 K（圖6A至圖6E及表2）。 K隨著溫度升高略有降低，從而顯明反應並非由熵之變化驅動。使用凡特何夫分析（標繪Ln ( K)對1/T）（圖7）確定焓（Δ H= -4.0 (±0.8) kcal/mol）及熵（Δ S= -0.007 (±0.003) kcal/mol∙K）之變化，從而顯示在HC-CDR3-Lys98處之醣化主要由焓驅動。小的及負熵變化顯示整個微環境可更受醣化的限制。下表3說明來自方案1、方案2及凡特何夫分析的用於37℃下mAb-1醣化反應的動力學及熱力學資訊之概述。
表 3. 用於 37 ℃ 下 mAb-1 醣化反應 的動力學及熱力學資訊之概述
來自方案2之動力學及熱力學分析 來自方案1之熱力學分析 凡特何夫分析
動力學及熱力學資訊 k 1(M -1天 -1) k -1(M -1) K # (M -1) K 1(M) K 2(M -1) ΔH( kcal/mol) ΔS( kcal/mol∙K)
最佳擬合參數 8.89 (±1.79) 0.09 (±0.02) 112 (±40) 2.03 (±0.76) ×10 -7 120 (±26) -4.0 (±0.8) -0.007 (±0.003)
#K由方程式9確定。
實例 7. 結構分析顯示 HC-CDR3-Lys98 由較小極性環境包圍
具有較低pK a值之離胺酸通常被發現埋在蛋白質內部或由較小極性環境包圍。pK a之偏移可用於使用波恩形式（Born formalism）計算表觀介電常數ε app：
Figure 02_image011
方程式4 其中 z為離胺酸側鏈之電荷數，pK a,ref為水溶液中離胺酸之參考pK a，Z為所轉移離子之價數，r cav為離胺酸之可電離部分之空腔半徑，r H為mAb-1之流體動力半徑，ε H2O為水之介電常數，且ĸ為mAb-1之反德拜長度（inverse Debye length）。此方法假定水中及HC-CDR3-Lys98局部環境中帶電離胺酸之間的自能差異為pK a偏移之唯一促成因素。使用以下參數，pK a,ref=10.4，Z=1，r cav=2Å，r H=49Å，ε H2O= 74.2（在37℃下）及ĸ=8.7E-4 (1/Å)，所估計之表觀介電常數ε app為13.0，其實質上低於水溶液中之對應介電特性，從而顯示HC-CDR3-Lys98之局部環境水合較少。
為瞭解HC-CDR3-Lys98之局部環境，藉由同時構築一個HC及輕鏈（LC）異二聚體來建構同源模型（圖8A及圖8B）。所預測mAb-1結構顯示HC-CDR3-Lys98之側鏈在非極性環境中，由Tyr32、Phe27及Tyr106之芳香環（圖8A）及Val2之脂族側鏈包圍。相較之下，HC*-CDR3-Lys98在更極性環境中，其中側鏈面向Tyr32及Tyr109之羥基，且靠近Asp112之側鏈之羧基，其可潛在地形成離子鍵，從而穩定HC*-CDR3-Lys98之局部環境（圖8C）。進行分子動力學（MD）模擬以將葡萄糖與HC-CDR3-Lys98對接（圖8B）。此相互作用之ΔG經估計為-2.8 kcal/mol，其與實驗資料非常一致（表2）。總之，電腦模擬分析之結果與熱力學量測結果一致，從而顯示HC-CDR3-Lys98存在於較少水合及較少可電離的微環境中。 實例 8. 自活體內分析預測之活體內 HC-CDR3-Lys98 去醣化
在非人類靈長類動物中研究HC-CDR3-Lys98醣化水平之變化。向猴投予單次劑量（0.5 mg/kg）之mAb-1，隨後在各種時間點（給藥前、5分鐘、5小時、1天、3天、7天、14天、28天及42天）收集猴血清樣本。使用LC-MS/MS對此等血清樣本中之mAb-1進行表徵，顯示活體內醣化水平自投予後5分鐘之樣本中的34.4%降至投予後42天之樣本中的23.7%（圖9A）。亦量測血清葡萄糖濃度，其在100 mg/dL左右波動(亦即5.6 mM，圖9B)。在此葡萄糖之濃度範圍下，預期醣化水平將在達到平衡之前隨時間推移略微降低。事實上，在投予後14天之後，HC-CDR3-Lys98醣化之水平穩定在25%左右，從而顯示活體內HC-CDR3-Lys98醣化水平由血清中之葡萄糖濃度驅動。
為比較活體外及活體內動力學，使用在活體外測定之參數生成預測曲線。如表1所示，使用方程式6模擬醣化水平，其中 b固定在醣化平衡水平（24.0%）， A 2 固定在平衡時之醣化水平與給藥前之醣化水平之間的差異（10.5%），且 k app 固定在0.14（天 -1）。此預測之醣化曲線與藉由LC-MS/MS量測之活體內醣化水平非常一致，從而顯示活體外及電腦模擬測定之醣化/去醣化之機制不受活體內環境影響（參考對應於圖9A處醣化之預測水平的線）。
圖10A至圖12B描繪類似於上文關於圖9A至圖9B所論述的來自猴之額外原始活體內資料。具體而言，將能夠在HC-Lys-98處醣化之測試抗體用0.9%鹽水與0.05%聚山梨醇酯80稀釋，接著靜脈內輸注至猴中。下表4示出樣本資訊。
表 4. 活體內研究之樣本資訊
    研究日     給藥後時間（h） 測試mAb A 0.5 mg/kg（第6組） 測試mAb B 0.5 mg/kg（第7組） 測試mAb B 1.0 mg/kg（第8組）
I11947 I11948 I11949 I11950 I11951 I11952 I11953 I11954 I11955
M M M M M M M M M
（µg/mL）
D1 0 BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ BLQ
D1 5 MIN（0.083H） 17.4 12.2 14.6 17.0 12.8 12.7 28.8 27.2 26.3
D1 5 14.6 10.1 11.1 12.7 10.6 10.3 24.4 23.6 21.1
D2 24 9.12 7.38 6.80 8.20 7.43 7.55 19.0 18.2 15.2
D3 48 7.85 5.34 6.0 6.70 5.64 5.31 11.9 13.3 12.8
D4 72 5.97 4.61 5.03 5.59 4.78 4.36 11.8 11.0 10.4
D6 120 5.32 4.02 4.36 4.87 3.42 3.74 9.21 9.39 9.15
D8 168 4.68 3.66 3.82 4.28 2.92 3.16 7.99 8.03 8.03
D11 240 4.34 2.86 2.84 3.74 2.31 2.59 7.35 6.50 6.99
D15 336 3.48 1.96 2.15 3.08 1.56 2.12 5.77 4.99 5.49
D19 432 3.00 1.35 1.54 2.68 1.23 1.73 4.56 4.31 4.78
D22 504 2.56 1.13 1.34 2.18 0.883 1.36 3.79 3.32 3.89
D25 576 1.86 0.731 0.927 2.15 0.799 1.19 3.22 3.20 3.33
D29 672 1.53 0.504 0.708 1.69 0.532 0.891 2.44 2.30 2.51
D33 768 1.20 0.351 0.528 1.33 0.434 0.742 1.96 1.84 2.05
D36 840 1.04 0.253 0.397 1.09 0.317 0.577 1.68 1.42 1.65
D39 912 0.854 0.166 0.351 0.988 0.264 0.521 1.41 1.27 1.41
D43 1008 0.749 0.110 0.282 0.741 0.194 0.380 1.21 0.951 1.12
選擇上表4以粗體標記之樣本進行HC-Lys98醣化定量。資料描繪在圖10A至圖12B中。具體而言，圖10A、圖11A及圖12A描繪與mAb濃度一起標繪之HC-Lys98醣化百分比，而圖9B、圖10B及圖11B描繪與所量測葡萄糖濃度（mg/dL）一起標繪之HC-Lys98醣化百分比。
對於圖10A至圖12B之資料，猴之血糖水平在約3至7 mM之間。循環mAb中之醣化水平在15天左右達至20至30%之穩定狀態，且當在猴中監測mAb時，此醣化水平保持穩定持續至少再另外25天。基於活體內猴資料及典型的人類葡萄糖濃度範圍（例如，4至7 mM），可預期以在20至35%範圍內之醣化水平（例如，在儲存及處理期間維持20至35%之水平）投予的mAb可在循環抗體之醣化水平中經歷極小變化至無變化。 與前述實施例相關之材料與方法一般材料細節
一種基於IgG4的單株、雙特異性抗體亦稱作mAb-1，由紐約州塔里敦的再生元醫藥製造且貫穿此等研究使用。mAb-1具有分別稱為HC及HC*之兩條不同重鏈。使用前將濃縮的mAb-1儲備溶液冷凍儲存。使用的所有其他化學品均為分析級。 一般實驗細節
所有反應均在1型玻璃小瓶中進行且用彈性塞及具有塑膠翻蓋之鋁密封件密封且儲存在溫控培養箱中。四種不同的緩衝劑用於不同pH範圍：醋酸鹽用於pH 5.0至5.5，組胺酸用於pH 5.0至6.5，HEPES用於pH 6.5至8.0，且磷酸鹽用於pH 6.0至8.0。藉由將mAb-1儲備溶液與其他緩衝液成分直接混合來製備所有蛋白質樣本。在培育期間監測各蛋白質樣本之pH值以確保不發生pH值偏移。使用9.97×10 -6M -1∙cm -1之消光係數，藉由280 nm處之UV吸收來測定蛋白質濃度。 HC-CDR3-Lys98醣化分析及樣本製備
藉由兩種方法，亦即CEX及LC-MS肽圖譜來量測HC-CDR3-Lys98之側鏈處的醣化反應。
CEX：CEX方法在Waters Acquity UPLC系統上運行，YMC-BioPro SP-F管柱控制在25℃。將10至50 μg之mAb-1加載至CEX管柱的結合緩衝液中：50 mM MES，pH 6.5，含20 mM NaCl，並以0.5 mM NaCl/min之線性濃度梯度自20至150 mM NaCl以0.5 mL/min之流速洗提。在280 nm波長處監測洗提，且藉由Empower 3資料軟體處理層析圖，其中各電荷變體之相對分數由層析圖之總面積計算。
LC-MS肽圖譜分析：將mAb-1樣本在80℃下用5 mM三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽（TCEP-HCl）變性及還原10分鐘。將經還原半胱胺酸殘基在室溫下用5 mM碘乙醯胺在黑暗中烷基化30分鐘。在消化之前將脲濃度稀釋至1.25 M。胰蛋白酶（加利福尼亞州森尼韋爾的普洛麥格（Promega, Sunnyvale, CA））或內蛋白酶Asp-N（馬塞諸塞州伊普斯威奇的新英格蘭生物實驗室（New England Biolabs, Ipswich, MA））以1：20之酶：受質比添加，並在37℃下培育4小時。藉由添加20%三氟乙酸(TFA；加利福尼亞州聖何塞的賽默飛世爾科技（Thermo Scientific, San Jose, CA）)終止消化。消化後的樣本在-80℃下儲存直至分析。在耦接至Q Exactive plus質譜儀（加利福尼亞州聖何塞的賽默飛世爾科技）之Waters Acquity UPLC系統上使用Acquity UPLC BEH C18管柱（馬塞諸塞州米爾福德的沃特世（Waters, Milford, MA））來加載且分離消化的樣本。流動相A為0.05% TFA水溶液，流動相B為0.1% TFA乙腈溶液。使用以0.25 mL/min之流速自0.1%流動相B至35%流動相B持續75分鐘的梯度進行肽分離。MS採集由全質量掃描，隨後各全掃描之前5個最強離子之串聯質量（MS/MS）掃描組成。肽鑑定藉由Proteome Discover 1.4（1.4.0.288版，加利福尼亞州聖何塞的賽默飛世爾科技）來測定並進行手動地驗證。肽定量藉由使用Skyline daily（華盛頓大學基因體科學系的麥考斯實驗室（MacCoss Lab, Depatment of Genome Science, UW））整合所提取之肽離子峰來測定，其中質量窗（mass window）為5 ppm。 在HC-CDR3-Lys98處具有不同醣化水平的mAb-1之樣本製備
藉由CEX方法純化在HC-CDR3-Lys98處具有不同醣化水平之mAb-1。藉由收集且彙集在CEX上在8.6與9.1 min之間洗提的部分來純化完全醣化的mAb-1。類似地，藉由收集在CEX上在9.3與10.1 min之間洗提的部分來純化非醣化的mAb-1。將經純化之醣化及非醣化形式之mAb-1各自針對10 mM組胺酸，pH 6.0進行透析。LC-MS分析證實HC-CDR3-Lys98處之醣化水平。將醣化及非醣化物種以不同比率混合以產生在HC-CDR3-Lys98處具有不同醣化百分比之mAb-1溶液。 mAb-1活性之活體外生物分析
在存在第二目標細胞（OVCAR-3細胞，10,000個細胞/孔）之情況下，將mAb-1之連續稀釋液一式三份地添加至第一目標細胞（Jurkat/NFAT-Luc，10,000個細胞/孔）中。抗體稀釋液及生物分析在Jurkat完全培養基（補充有10% FBS及1×青黴素-鏈黴素L-麩醯胺酸之RPMI培養基1640）中進行。不含抗體之孔用作對照。將盤在37℃、5% CO2下培育4-6小時，且接著使其達至室溫持續15分鐘。將One-Glo螢光素酶受質（100μL）添加至各孔，且將盤培育3-5分鐘。使用Perkin Elmer Victor X5盤讀取器來量測發光信號，且使用GraphPad Prism藉由11點反應曲線上的四個參數邏輯方程式來分析量測值。 動力學及熱力學分析
使用以下兩種模型進行表觀動力學分析：
醣化反應（亦即，醣化HC-CDR3-Lys98之百分比隨時間推移增加）
Figure 02_image013
方程式5
去醣化反應（亦即，醣化HC-CDR3-Lys98之百分比隨時間推移降低）
Figure 02_image015
方程式6 其中 A 1 及 A 2 為幅度， k app,1 及 k app,2 為表觀反應速率常數， t為時間，且 b為基線。
在資料擬合過程中， t固定為獨立參數，且允許 A 1 、 A 2 、 k app,1 、 k app,2 及 b變化以發現最佳擬合值。對於不具有葡萄糖之條件， b固定在0處以避免過度參數化。對於醣化反應，可由 A 1 及 b之總和來確定醣化之平衡水平（亦即平台）。對於去醣化反應，醣化之平衡水平由 b判定。
應用阿瑞尼斯方程式以由在不同溫度下之去醣化動力學計算表觀活化能 E a，
Figure 02_image017
方程式7 其中 A為常數， R為氣體常數，且 T為絕對溫度（以開爾文為單位）。Ln( k app,2 )與1/T之間的線性關係指示反應遵循阿瑞尼斯行為，其中 E a可由斜率確定。
對於更詳細的動力學分析，葡萄糖與mAb-1之間的反應可如下表述：
Figure 02_image019
方案2 其中 P為非醣化mAb-1， G為葡萄糖， PG為醣化mAb-1，且 k 1 及 k -1 分別為締合常數及解離速率常數。在游離葡萄糖之初始濃度[ G 0]遠大於非醣化mAb-1之初始濃度[ P 0]的情況下，時間 t處的醣化百分比之動力學描述可如下描述：
Figure 02_image021
方程式8 其中[ P t]為mAb-1之總蛋白質濃度，且[ PG 0]為醣化mAb-1之初始蛋白質濃度。在資料擬合過程中，[ G 0]、[ PG 0]及[ P t]為固定的，而允許 k 1 及 k -1 變化以發現最佳擬合值。
基於方案2，醣化百分比之平衡描述可如下描述：
Figure 02_image023
方程式9 其中[ G e]及[ P e]分別為平衡時游離葡萄糖及非醣化mAb-1之濃度。在資料擬合過程中，[ G e]及[ P e]在0＜[ G]＜ [ G t]及0＜[ P]＜ [ P t]之範圍內隱式求解，其中[ G t]及[ P t]分別為葡萄糖及mAb-1之總濃度，且允許 K變化以確定最佳擬合值。 mAb-1之結構建模
使用分子操作環境（Molecular Operating Environment）（MOE-加拿大蒙特利爾的化學計算小組（Chemical Computing Group, Montreal, Canada））生成mAb-1之預測結構模型。抗體結構資料庫用於產生重鏈及輕鏈之個別二聚體的同源模型。藉由接枝適當構架及環模板，隨後進行能量最小化來建構Fab域。藉由建模離胺酸側鏈之ε-胺基與葡萄糖之醛基之間的共價相互作用來進行對接實驗，其中局部環境藉由誘導擬合機制進行優化。 非線性最小平方分析中之不確定性計算
在資料擬合程序期間，在科學家軟體（Scientist Software）（密蘇里州聖路易的微數學（Micromath, St. Louis, MO））中程式化所有方程式。最佳擬合參數由NLLS分析確定，括號中報導了不確定性。對於對稱誤差，在95%信賴區間下，將不確定性報導為±誤差。對於不對稱誤差，95%信賴區間下，將不確定性報導為（下限、上限）。 臨床前樣本資訊
臨床前血清樣本獲自單劑量石蟹獼猴藥物動力學（PK）研究。向個體靜脈內（IV）投予mAb-1。石蟹獼猴之給藥劑量為0.5 mg/kg，且在指定時間點（給藥前、5分鐘、5小時、1天、3天、7天、14天、28天及42天）收集血清樣本。將血清樣本儲存於-80℃下直至分析。使用酶聯結免疫吸附分析（ELISA）量測各收集時間點處之mAb-1血清濃度。簡言之，在塗佈有藥物目標之微量滴定盤上捕獲mAb-1。使用生物素化小鼠抗人類IgG4單株抗體，隨後使用與辣根過氧化酶（NeutraAvidin-HRP）結合之中性抗生物素蛋白（NeutrAvidin）來偵測盤上捕獲的mAb-1。接著添加對過氧化酶具有特異性之基於魯米諾之受質（luminol-based substrate）以實現與mAb-1之濃度成比例的信號強度。使用自由式精簡版血糖監測系統（伊利諾伊州芝加哥的雅培公司（Abbott Laboratories, Chicago, IL））來量測血清葡萄糖水平。 來自血清樣本之mAb-1之親和純化
藉由親和純化自所收集猴血清樣本純化mAb-1。簡言之，在室溫下使生物素化抗人類抗體與Dynabeads MyOne鏈黴抗生物素蛋白T1磁珠（加利福尼亞州卡爾斯巴德的英傑（Invitrogen, Carlsbad, CA））結合10分鐘。接著將結合珠粒與血清樣本在室溫下一起培育30分鐘。將珠粒用HBS-EP緩衝液（賓夕法尼亞州匹茲堡的通用醫療（GE Healthcare, Pittsburgh, PA））洗滌，且接著用0.1%甲酸（FA）及50%乙腈溶離。 胰蛋白酶消化
使用真空濃縮器（密蘇里州堪薩斯城的拉博科（LABCONCO, Kansas City, MO））乾燥經純化之mAb1樣本。將經乾燥樣本重新懸浮在含有8 M脲及10 mM三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽（TCEP-HCl）之100 mMTris-HCl中，且接著在37℃下培育30分鐘。將經還原半胱胺酸殘基用10 mM之碘乙醯胺在室溫下在暗處烷基化30分鐘。在烷基化後，將脲濃度在消化之前稀釋至1.25 M。將胰蛋白酶(加利福尼亞州森尼韋爾的普洛麥格）以1:10之酶:受質比率添加至樣本中且在37℃下培育4小時。藉由添加20%甲酸來終止消化。所消化樣本在-80℃下儲存直至分析。 LC-MS/MS及資料分析
在耦接至Q Exactive plus質譜儀（加利福尼亞州聖何塞的賽默飛世爾科技）之Acquity I-Class UPLC系統（馬塞諸塞州米爾福德的沃特世）上使用Acquity UPLC CSH C18 1.7 µm，2.1 mm × 150 mm管柱（馬塞諸塞州米爾福德的沃特世）來分離由胰蛋白酶消化產生的肽。流動相A為0.1% FA/水，且流動相B為0.1% FA/乙腈。使用以0.25 mL/min之流速自2%流動相B增加至30%流動相B持續56 min的梯度進行肽分離。MS採集由全質量掃描，隨後各全掃描之前5個最高強度離子之串聯質量（MS/MS）掃描組成。肽及PTM鑑別藉由Byonic（2.16.11版，加利福尼亞州聖卡洛斯的蛋白質計量公司（Protein Metrics Inc., San Carlos, CA））來測定且手動地驗證。為了定量PTM之相對豐度，生成基於經修飾肽及天然肽兩者之第一同位素峰之m/z的所提取離子層析圖，且使用Skyline-daily（4.1.1.18151版，華盛頓大學基因體科學系的麥考斯實驗室）使用5 ppm之質量窗對所提取峰面積進行整合。使用經修飾肽之所提取離子層析圖（EIC）峰面積相對於經修飾肽及天然肽之峰面積總和來計算各PTM變體之百分比。 前述實施 例之簡要論述
在細胞培養過程期間，葡萄糖為細胞生長必不可少的能量源。為維持細胞之高生長率，將葡萄糖不斷地進料至生物反應器中，其中未消耗之葡萄糖引起HC-CDR3-Lys98之醣化。反應器中存在之葡萄糖濃度影響醣化水平。動力學分析表明，一旦mAb-1經醣化，與醣化反應相比，去醣化相對緩慢。淨結果為，在純化過程期間（不存在葡萄糖），醣化水平趨於恆定，且與生物反應器中存在之醣化水平直接相關。儘管在純化過程期間醣化水平保持相對恆定，但當mAb-1處於液體調配物中且在5℃下儲存時，資料顯示醣化mAb-1經歷一致且可量測的去醣化速率。已證明，在凍乾調配物中產生mAb-1大概藉由移除水解所需之水而基本上停止去醣化反應。
去醣化反應動力學在5-45℃之溫度範圍內遵循阿瑞尼斯行為（圖4A至圖4D）。因此，自較高溫度（20-45℃）生成之資料可與阿瑞尼斯模型結合使用，以預測在較低溫度（諸如5℃）下的去醣化行為。自阿瑞尼斯方程式計算之活化能指示去醣化為pH依賴性的，在較高pH下活化能較低。此表明去醣化速率有可能在較高pH下更快。實驗結果證實了此預測且證明當溶液之pH自5.0增加至6.0時，表觀去醣化速率常數在20℃下增加了3倍（表1）。此觀察結果可能歸因於阿馬道里產物（酮胺）之逆反應速率增加以及在較高pH條件下自希夫鹼中伴隨的葡萄糖釋放。
儘管在較高pH下之表觀去醣化反應更快，但在穩態下mAb-1之平衡醣化水平在較高pH下更高（圖5A至圖5C），從而表明醣化離胺酸在較高pH下更穩定。另外，資料顯示組胺酸及磷酸根離子/碳酸根離子之存在並不促進整個醣化反應。此為出人意料的，因為有證據指示組胺酸及磷酸根離子/碳酸根離子促進阿馬道里重排。可解釋該行為之替代假說為HC-CDR3-Lys98處之醣化不由穩定希夫鹼中間體或阿馬道里產物驅動，而是藉由降低HC-CDR3-Lys98之pK a來驅動。當使用簡單的去質子化模型全局分析不同pH值之平衡資料時，HC-CDR3-Lys98之pK a值低於正常值6.7得到解決。此pK a表明在pH 7.4下，84%之HC-CDR3-Lys98將經去質子化。用波恩形式分析pK a之偏移返回了13.0之表觀介電常數。儘管此值略微大於蛋白質內部所觀測到之介電特性，但其明顯低於水之介電常數，從而意指HC-CDR3-Lys98之微環境比在蛋白質表面預期的水合更少。另外，熱力學分析表明，整個醣化反應受焓影響而不受熵影響。結果表明以下醣化機制：醣化後，存在輕微的結構重組，使得局部環境受到更多限制。在此重組過程期間，微環境之較少水合性質限制水重排之程度。因此，反應藉由焓之變化驅動。
具有降低的pK a值之離胺酸ε-胺基之大多數實例被發現埋在蛋白質內部中以用於例如酶促或能量轉導功能。然而，HC-CDR3-Lys98位於表面且對於與抗原之相互作用至關重要。相反，HC*-CDR3-Lys98（此雙特異性抗體之其他CDR上的對應胺基酸）亦暴露在表面，但醣化水平低於偵測水平，此表明局部環境在HC-CDR3-Lys98處促進醣化。經模擬mAb-1結構指示HC-CDR3-Lys98之微環境比HC*-CDR3-Lys98極性更小，此不僅歸因於周圍的胺基酸，亦歸因於其側鏈方向。在4.5 Å內，HC-CDR3-Lys98由來自空間相鄰胺基酸之芳香環包圍。最近的極性基團為Tyr32之側鏈，大約4.7 Å外；然而，離胺酸及酪胺酸不太可能形成離子相互作用。另一方面，HC*-CDR3-Lys98面向Asp112及Tyr109之側鏈，且可潛在地與Asp112上之羧基形成鹽橋（僅1.8 Å外）。由於局部環境之性質，在醣化之前，有可能HC-CDR3-Lys98可比HC*-CDR3-Lys98具有更大的可撓性。醣化後，葡萄糖-離胺酸加合物可經歷結構重組且變得更加受限制，正如負熵變化所預測。
本發明之範疇不受本文中所描述之具體實施例限制。實際上，除本文所描述之彼等修改之外，本發明之各種修改對熟習此項技術者而言將自前文描述及附圖變得顯而易見。此類修改意欲處在隨附申請專利範圍之範疇內。
105:線 110:線 115:線 120:虛線 125:虛線 130:線 135:線 306:圓圈 308:圓圈 310:圓圈 312:圓圈 314:圓圈 316:圓圈 318:圓圈 320:圓圈 322:圓圈 406:圓圈 408:圓圈 410:圓圈 412:圓圈 414:圓圈 420:圓圈 422:圓圈 424:圓圈 430:三角形 431:線 435:三角形 436:線 440:三角形 441:線 505:圓圈 510:圓圈 515:圓圈 520:圓圈
附圖僅用於做為實例來說明實施例，而非作為限制。
圖 1A顯示藉由陽離子交換層析（CEX）分離的mAb-1之電荷變體。線105：未處理的10 mM組胺酸pH 6.0中的mAb-1；線110：在10 mM組胺酸pH 6.0中且在37℃下培育14天的mAb-1；線115：在10 mM組胺酸pH 6.0與0.1 M葡萄糖中且在37℃下培育14天的mAb-1。醣化mAb-1在兩條虛線120之間洗提而出（8.6 min及9.1 min）。非醣化mAb-1在兩條虛線125之間洗提而出（9.3 min及10.1 min）。
圖 1B描繪對照（純）mAb-1（線130）與在不存在葡萄糖之情況下在37℃下培育14天（線135）之mAb-1的肽圖之紫外線（UV）層析圖。緩衝液條件係如下：流動相A：0.05%三氟乙酸（TFA）/水；流動相B：0.045% TFA/乙腈。
圖 2為說明mAb-1中HC-CDR3-Lys98處之醣化水平與藉由基於細胞之效力分析所量測的藥物效力之間的相關性為線性的且具有0.97之相關係數的圖。誤差槓表示三次效力結果之標準偏差。
圖 3A為說明當在28天之時程內在37℃下培育時，6.9 µM mAb-1在具有不同濃度之葡萄糖之30 mM HEPES pH 7.4中之醣化及去醣化動力學的圖。圓圈306：無葡萄糖；圓圈308：0.3 mM葡萄糖；圓圈310：0.6 mM葡萄糖；圓圈312：3 mM葡萄糖；圓圈314：6 mM葡萄糖；圓圈316：10 mM葡萄糖；圓圈318：28 mM葡萄糖；圓圈320：56 mM葡萄糖；圓圈322：111 mM葡萄糖。實線來自使用最佳擬合 k 1=8.89 (±1.79) M -1天 -1且 k -1=0.09 (±0.02)天 -1之動力學模型的全局分析。
圖 3B為說明醣化反應之熱力學分析的圖。所顯示資料為使用方程式5及方程式6由基線及幅度之最佳擬合所確定的（參考實施例後之材料及方法）。實線來自具有最佳擬合締合常數 K=112 (±40) M -1之熱力學分析。
圖 4A 、圖 4B 及圖 4C顯示在不同溫度及pH下之mAb-1去醣化動力學的圖。在不同溫度，圓圈406：20℃；圓圈408：30℃；圓圈410：35℃；圓圈412：40℃；圓圈414：45℃且在pH 5.0（圖4A）、pH 5.5（圖4B）及pH 6.0（圖4C）下，培育在10 mM組胺酸pH 6.0、292 mM蔗糖及0.05%聚山梨醇酯20中的mAb-1。使用方程式6擬合圖4A至圖4C處之資料。
圖 4D描繪在不同pH下對mAb-1去醣化之阿瑞尼斯分析（Arrhenius analysis）。圓圈420：pH 5.0；圓圈422：pH 5.5；圓圈424：pH 6.0。該等線為各資料集在指定pH下之線性擬合，其中相關係數為0.98。表觀活化能（E a）由擬合斜率所測定。
圖 4E為顯示在5℃和不同pH下預測的與即時去醣化動力學之比較的圖。三角形430：pH 5.0下之即時資料；三角形435：pH 5.5下之即時資料；三角形440：pH 6.0下之即時資料。線431：pH 5.0下之預測；線436：pH 5.5下之預測；線441：pH 6.0下之預測。線431、線436及線441為自阿瑞尼斯分析產生的醣化百分比之預測。
圖 5A 、圖 5B 及圖 5C為顯示平衡時mAb-1醣化水平之pH值依賴性的圖。將6.9 μM mAb-1在具有不同濃度之葡萄糖之30 mM緩衝液中在37℃下培育28天：3 mM（圖5A）、6 mM（圖5B）及11 mM（圖5C）。在圖5A至圖5C中，緩衝液係如下，圓圈505：醋酸鹽；圓圈510：組胺酸；圓圈515：HEPES；圓圈520：磷酸鹽。藉由表觀動力學分析來測定醣化之平衡水平。藉由方程式3對所有三個資料集進行全局分析，從而證明Lys98之pK a為6.7（6.6、6.9），且醣化之微觀締合常數 K 2 為120（±26）M -1。
圖 6A 、圖 6B 、圖 6C 、圖 6D 及圖 6E為描繪在45℃（圖6A）、37℃（圖6B）、30℃（圖6C）、25℃（圖6D）及15℃（圖6E）下隨各種葡萄糖濃度而變化的HC-CDR-Lys98之醣化平衡百分比的圖。視醣化或去醣化反應而定，各資料點使用方程式5或方程式6自動力學分析中獲得。線是使用方程式11進行之NLLS分析。
圖 7為說明mAb-1醣化平衡之凡特何夫分析（Van’t Hoff analysis）。締合常數 K由在不同溫度及葡萄糖濃度下mAb-1醣化之熱力學分析所測定。圖中之線為所有資料之線性擬合，其中相關係數為0.89。
圖 8A 、圖 8B 及圖 8C描繪兩個mAb-1臂之預測結構。（圖8A）預測HC-CDR3-Lys98之局部環境，其中此離胺酸被Tyr32、Phe27及Tyr106之芳香環以及Val2之脂族側鏈包圍。（圖8B）從MD模擬預測HC-CDR3-Lys98與葡萄糖加合物之局部環境。（圖8C）預測HC*-CDR3-Lys98之局部環境，其中此Lys被Phe27、Tyr32、Tyr109及Asp112包圍。與面向芳香環之HC-CDR3-Lys98不同，HC*-CDR3-Lys98面向Asp112之側鏈。
圖 9A 及圖 9B描述活體內HC-CDR3-Lys98去醣化之所量測及所預測水平（圖9A）及隨時間而變化的活體內葡萄糖濃度之對應量測值（圖9B）。
圖 10A 、圖 10B 、圖 11A 、圖 11B 、圖 12A 及圖 12B描述顯示在猴中進行靜脈內注射後治療性生物分子之活體內去醣化資料的額外圖。圖10A、圖11A及圖12A顯示隨時間（天）而變化的mAb濃度（µg/mL）與HC-Lys98醣化百分比，且圖10B、圖11B及圖12B顯示隨時間（天）而變化的所量測葡萄糖濃度（mg/dL）與HC-Lys98醣化百分比。對於所測試mAb中之每一者，用於產生mAb之生物反應器中的葡萄糖濃度為300至1000 mg/dL。
Figure 12_A0101_SEQ_0001

Claims (44)

  1. 一種預測生物分子中胺基酸之醣化百分比的方法，其包括： 測定在第一持續時間內第一溫度組的該胺基酸之第一組去醣化速率； 基於該第一組去醣化速率，推斷一或多種溫度中之第二溫度組的該胺基酸之第二組一或多種去醣化速率；及 使用該第二組一或多種去醣化速率來預測在對應於該第二溫度組之任何溫度下及在由第二預定時間範圍涵蓋之持續時間內的醣化百分比。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該第一溫度組包括高於該第二溫度組中之彼等的溫度。
  3. 如請求項2所述之方法，其中該第一溫度組包含範圍介於20至45℃之溫度；且其中該第二溫度組包含範圍介於2至8℃之溫度。
  4. 如請求項3所述之方法，其中該第二溫度組對應於5℃之溫度。
  5. 如請求項1所述之方法，其中第一預定時間範圍小於40天，且其中該第二預定時間範圍在3個月與36個月之間。
  6. 如請求項1所述之方法，其中測定在該第一持續時間內該第一溫度組之該第一組去醣化速率進一步包括： 量測該第一溫度組中所包含之各溫度的該胺基酸之醣化百分比，該醣化百分比隨對應於該第一持續時間之至少一部分的時間而變化；及 執行資料擬合程序以獲得該第一組去醣化速率。
  7. 如請求項1所述之方法，其進一步包括測定隨兩個或更多個不同pH值而變化的該第一組去醣化速率；及 對於該兩個或更多個不同pH值中之每一者，基於該第一組去醣化速率測定與該胺基酸之去醣化相關的活化能。
  8. 如請求項7所述之方法，其進一步包括： 推斷隨該兩個或更多個不同pH值中之至少一者而變化的該第二組去醣化速率；及 使用該第二組去醣化速率來預測在對應於該第二溫度組之任何溫度下及在由該第二預定時間範圍涵蓋之任何持續時間內隨該兩個或更多個不同pH值中之至少一者而變化的該醣化百分比。
  9. 如請求項1所述之方法，其進一步包括在不存在葡萄糖之情況下測定該第一組去醣化速率，其中該生物分子之該胺基酸係醣化至預定第一百分比；及 其中預測該醣化百分比係基於該第二組一或多種去醣化速率、該生物分子之該胺基酸所醣化至的該預定第一百分比、及該預定第一百分比與0%醣化之間的差異。
  10. 一種用於在生物分子之儲存期限內將該生物分子中胺基酸之醣化百分比維持在預定醣化百分比範圍內的方法，其包括： 在複數種不同葡萄糖濃度中培育具有第一醣化百分比之該生物分子，且量測該複數種不同葡萄糖濃度中之每一者的隨時間推移之該醣化百分比； 基於隨時間推移之該醣化百分比的該量測，測定隨該複數種不同葡萄糖濃度中之每一者而變化的該生物分子之醣化平衡百分比； 鑑別該醣化平衡百分比及使得該第一醣化百分比維持在該預定醣化百分比範圍內之對應葡萄糖濃度；及 在該生物分子之該儲存期限內用該對應葡萄糖濃度培育該生物分子。
  11. 如請求項10所述之方法，其進一步包括測定隨該胺基酸之醣化百分比而變化的該生物分子之效力水平。
  12. 如請求項1至11中任一項所述之方法，其中該生物分子為抗體。
  13. 如請求項12所述之方法，其中該胺基酸位於影響抗原結合之可變區內。
  14. 如請求項13所述之方法，其中該胺基酸位於互補決定區（CDR）內。
  15. 如請求項14所述之方法，其中該CDR位於重鏈可變區內。
  16. 如請求項15所述之方法，其中該胺基酸位於HCDR3內。
  17. 一種用於在投予時降低個體內治療性生物分子之效力的方法，其包括： 鑑別包括經醣化之一或多個胺基酸殘基的治療性生物分子，其中該一或多個胺基酸殘基之醣化降低了該治療性生物分子之效力；及 用濃度大於150 mg/dL的葡萄糖調配該治療性生物分子。
  18. 如請求項17所述之方法，其中該葡萄糖濃度大於200 mg/dL。
  19. 如請求項17或18所述之方法，其中該一或多個胺基酸殘基之醣化被降低且該治療性生物分子之效力增加至平衡，該平衡係在向該個體投予該治療性生物分子後由該個體之血糖濃度所確定的。
  20. 如請求項17至19中任一項所述之方法，其中在投予時降低的該治療性生物分子效力降低了細胞激素釋放症候群或輸注相關反應之發生率。
  21. 如請求項17至20中任一項所述之方法，其中該治療性生物分子為抗體。
  22. 如請求項21所述之方法，其中該一或多個胺基酸位於影響抗原結合之可變區內。
  23. 如請求項22所述之方法，其中該一或多個胺基酸位於互補決定區（CDR）內。
  24. 如請求項23所述之方法，其中該CDR位於該重鏈可變區內。
  25. 如請求項24所述之方法，其中該一或多個胺基酸位於HCDR3內。
  26. 一種用於在向個體投予治療性生物分子後預測該治療性生物分子中胺基酸之醣化百分比的方法，其包括： 鑑別與該胺基酸相關之平衡醣化百分比； 鑑別該胺基酸經醣化或經去醣化之速率； 鑑別與在投予之前的該治療性生物分子中之該胺基酸相關的初始醣化百分比；及 基於該速率、該初始醣化百分比與該平衡醣化百分比之間的差異、及該平衡醣化百分比，預測在投予該治療性生物分子後隨時間而變化的該醣化百分比。
  27. 如請求項26所述之方法，其進一步包括測定與該胺基酸相關之經鑑別平衡醣化百分比。
  28. 如請求項26或27所述之方法，其進一步包括測定該胺基酸經醣化或經去醣化之經鑑別速率。
  29. 如請求項26至28中任一項所述之方法，其進一步包括測定與在投予之前的該治療性生物分子中之該胺基酸相關的經鑑別初始醣化百分比。
  30. 如請求項27所述之方法，其中測定該經鑑別平衡醣化百分比包括測定在35至40℃之間的溫度下之該平衡醣化百分比。
  31. 如請求項30所述之方法，其中該溫度為37℃。
  32. 如請求項28所述之方法，其中測定該經鑑別速率包括測定在35至40℃之間的溫度下之該速率。
  33. 如請求項32所述之方法，其中該溫度為37℃。
  34. 如請求項27所述之方法，其中測定該經鑑別平衡醣化百分比包括測定在活體外隨一或多種葡萄糖濃度而變化的該平衡醣化百分比。
  35. 如請求項27所述之方法，其中測定該經鑑別平衡醣化百分比包括基於在活體內達至之該胺基酸之平衡醣化水平來測定該平衡醣化百分比。
  36. 如請求項28所述之方法，其中測定該經鑑別速率包括測定在活體外在3至8 mM葡萄糖之間的葡萄糖濃度下之速率。
  37. 如請求項26所述之方法，其中該平衡醣化百分比對應於3至8 mM葡萄糖之間的葡萄糖濃度。
  38. 如請求項26至37中任一項所述之方法，其進一步包括在一階模型中使用該速率、該初始醣化百分比與該平衡醣化百分比之間的該差異、及該平衡醣化百分比來預測該醣化百分比。
  39. 如請求項26至38中任一項所述之方法，其進一步包括預測隨該醣化百分比及投予後時間而變化的該治療性生物分子之效力。
  40. 如請求項26至39中任一項所述之方法，其中該生物分子為抗體。
  41. 如請求項40所述之方法，其中該胺基酸位於影響抗原結合之可變區內。
  42. 如請求項41所述之方法，其中該胺基酸位於互補決定區（CDR）內。
  43. 如請求項42所述之方法，其中該CDR位於該重鏈可變區內。
  44. 如請求項43所述之方法，其中該胺基酸位於HCDR3內。
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