CN101010590A - 胰多肽作为β细胞衰竭的靶标/标记物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过测量液体样品中的胰激素水平监测疾病进展和诊断糖尿病中的β细胞衰竭，并且涉及筛选预防和/或治疗糖尿病的新化合物。

Description

胰多肽作为β细胞衰竭的靶标/标记物
背景技术
II型糖尿病是世界范围重要性迅速增长的疾病，并且可以将其描述为为了代偿周围胰岛素抗性，β细胞增加的胰岛素分泌引起胰β细胞的衰竭(β细胞衰竭)。这一衰竭可以通过β细胞群的相对损失以及分泌缺陷来解释，所述分泌缺陷包括通过β细胞增加的基础胰岛素分泌和主要在骨骼肌但也在其它器官对胰岛素敏感度的选择性丢失。认为由长期暴露于增高的葡萄糖和脂质水平(糖毒性和脂毒性)引起β细胞功能的丢失。
目前没有能够在脂/糖毒性状态下预防或延迟β细胞衰竭的经临床证实的治疗。鉴别更好的治疗靶标和比通常使用的标记物(如胰岛素、前胰岛素或C-肽)更敏感或更可靠的检测β细胞衰竭或功能的标记物也将是有用的。
此外，鉴别能够在血浆中检测的标记物将是有利的。
发明内容
本发明的目标是鉴别和提供新靶标，所述新靶标用于筛选预防、削弱或抑制β细胞衰竭的化合物，以及筛选能够在II型糖尿病早期监测和/或诊断β细胞衰竭并且比当前能够完成的更加可靠的标记物。
令人惊奇地，发现使用蛋白质胰激素可以至少部分地克服所述技术状态的已知问题。
胰肽(或胰激素)，一段36氨基酸的肽激素，是在胰岛中合成的并作为胰和胃肠功能的调节物起作用。令人惊奇地，在β细胞衰竭中发现分泌胰激素的水平增加。因此，本发明提供治疗和/或预防糖尿病的靶标和糖尿病中β细胞衰竭早期诊断的新标记物。
令人惊奇地，在β细胞衰竭中发现分泌胰激素的水平增加。因此，本发明提供治疗和/或预防β细胞衰竭的靶标，以及糖尿病中β细胞衰竭早期诊断的新标记物。
在优选的实施方案中，可以使用新靶标和/或标记物胰激素用于诊断、监测以及筛选目的。
当用于患者监测时，根据本发明的诊断方法可以帮助评估随访患者中β细胞衰竭的治疗效力和复发。因此，本发明提供蛋白质胰激素用于监测糖尿病治疗效力的用途。
在优选的实施方案中，根据本发明的诊断方法用于患者筛选目的，即，通过测量胰激素水平并将胰激素水平与存在或缺少β细胞衰竭相关联，将其用于评估无糖尿病预诊的受试者。
本发明的方法可用于在导致糖尿病的不同阶段(即胰岛素抗性、葡萄糖耐量受损和糖尿病)全程监测疾病的进展。
因此本发明提供监测糖尿病进展的方法，其包括步骤(a)提供从个体获得的液体样品，(b)将所述样品与胰激素的特异性结合剂在适合在所述结合剂和胰激素之间形成复合物的条件下接触，和(c)将在(b)中形成的复合物的量与在β细胞衰竭中形成的复合物的量相关联。
本发明还提供监测糖尿病治疗效力的方法，其包括步骤(a)提供从抗糖尿病治疗患者获得的液体样品，(b)将所述样品与胰激素的特异性结合剂在适合所述结合剂和胰激素之间形成复合物的条件下接触，和(c)将在(b)中形成的复合物的量与在β细胞衰竭中形成的复合物的量相关联。
本发明提供筛选与胰激素相互作用的化合物的方法，其包括步骤a)将蛋白质胰激素与化合物或多种化合物在使所述化合物或多种化合物与胰激素相互作用的条件下接触；和b)检测所述化合物或多种化合物与所述多肽之间的相互作用。
本发明提供筛选预防和/或抑制和/或削弱β细胞衰竭的化合物的方法，其包括步骤a)将化合物与蛋白质胰激素接触；和b)测量蛋白质胰激素的活性；其中刺激或抑制蛋白质胰激素活性的化合物是可以预防和/或抑制和/或削弱β细胞衰竭的化合物。优选地，所述方法在步骤a)之前或在步骤a)和b)之间另外地包括固定蛋白质胰激素的步骤。
如这里所用，术语“活性”涉及，例如胰激素与它的受体的结合(Zhang等人，中国药理学报，1999，20：59-64；Walker等人，1997，Peptides18：609-612；Gehlert等人，1996，Mol.Pharmacol.50：112-118)和/或胰激素对分泌的影响(Louie等人，1985，Am.J.Physiol.249：G489-495)。
本发明还包括无细胞测定法。这类测定法包括将一种形式的胰激素(如全长多肽、所述多肽的生物活性片断、或包括全部或部分所述多肽的融合蛋白质)与测试化合物接触并确定测试化合物与所述多肽结合的能力。可以如上所述直接或间接地确定测试化合物与所述多肽的结合。在一个实施方案中，所述测定法包括将所述多肽与结合所述多肽的已知化合物接触形成测定混合物，将所述测定混合物与测试化合物接触，并确定测试化合物与所述多肽相互作用的能力，其中测试化合物与所述多肽相互作用能力的确定包括确定测试化合物与已知化合物相比优先结合所述多肽的能力。
本发明的无细胞测定法适用于使用膜结合形式的多肽或其可溶片断。在包括膜结合形式多肽的无细胞测定法情况下，可能期望使用增溶剂使膜结合形式的多肽维持在溶液中。这些增溶剂的实例包括非离子去污剂如正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、正十二烷基麦芽糖苷、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺、Triton X-100、Triton X-114、Thesit(聚多卡醇)、异十三烷基聚(乙二醇醚)n、3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲氨基]-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)或N-十二烷基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐。
在本发明上述测定方法的多个实施方案中，可能期望固定多肽以利于将多肽与结合分子的复合形式从非复合形式中分离，并且适于测定的自动控制。测试化合物与多肽的结合，或在存在或缺少候选化合物时多肽与结合分子的相互作用可以在适于容纳反应物的任何容器中完成。这些容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可以提供添加了能够使一种或两种蛋白质都结合到基质上的结构域的融合蛋白质。例如，可以将谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白质吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠子(Sigma Chemical；St.Louis，Mo.)或谷胱甘肽衍生化的微量滴定板上，其随后与测试化合物结合或与测试化合物以及非吸附的结合蛋白质或多肽结合，并且在有利于复合物形成的条件下(如在盐和pH的生理条件下)孵育混合物。孵育之后，洗涤珠子或微量滴定板孔以移去任何未结合的组分并且，例如如上所述直接或间接地测量复合物形成。备选地，可以从基质上解离复合物，并且可以使用标准技术确定上文所述多肽的结合水平或活性水平。
在本发明的筛选测定中还可以使用将蛋白质固定在基质上的其它技术。例如，可以利用生物素和链霉抗生物素的缀合作用固定上文所述的多肽或其结合分子。可以使用本领域众所周知的技术(如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals；Rockford，III.)从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备本发明的生物素化多肽或靶标分子，并将其固定在链霉抗生物素包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。备选地，可以将与多肽或结合分子反应，但是不干扰本发明的多肽与其结合分子结合的抗体在板的孔中衍生化。通过抗体缀合作用将本发明未结合的结合蛋白质或多肽捕获在孔中。除了上述GST-固定的复合物的那些方法，检测这类复合物的方法包括使用与上文所述多肽或结合分子反应的抗体进行复合物的免疫检测以及依赖于检测与多肽或结合分子相关的酶活性的酶联测定。
本发明还提供筛选预防和/或抑制和/或延迟β细胞衰竭的化合物的方法，其包括在存在或缺少所述化合物下检测宿主分泌的可溶胰激素的步骤，其中预防和/或抑制和/或延迟β细胞衰竭的化合物是使宿主分泌的可溶胰激素水平改变的化合物。
宿主可以是代表培养的β细胞的模型细胞，或者是可用作β细胞衰竭模型的动物。
本发明还提供蛋白质胰激素作为筛选预防和/或抑制β细胞衰竭的靶标和/或标记物的用途。
根据本发明的诊断方法是基于来源于个体的液体样品。与本技术领域已知的方法不同，通过使用特异性结合剂从该液体样品中特异性地测量胰激素。
特异性结合剂是，如胰激素受体或胰激素抗体。正如熟练的技术人员可以理解的那样，术语特异性用于表示在样品中存在的其它生物分子不能与胰激素特异性结合剂显著地结合。认为低于5％交叉反应水平是不显著的。
优选地，特异性结合剂是与胰激素反应的抗体。术语抗体指多克隆抗体、单克隆抗体、这类抗体的片断、以及包括抗体结合结构域的基因构建体。
例如，如Tijssen(Tijssen，P.，Practice and theory of enzymeimmunoassays 11(1990)全书，特别是43-78页；Elsevier，Amsterdam)所述，通过现有技术方法产生抗体。为了实现本发明所公开的成果，使用了兔子产生的多克隆抗体。然而，明显地还可以使用从不同物种，如大鼠或豚鼠产生的多克隆抗体以及单克隆抗体。由于可以以任何需要量产生特性恒定的单克隆抗体，其代表了临床常规测定开发的理想工具。以根据本发明的方法产生和使用胰激素的单克隆抗体是另一优选的实施方案。
如熟练的技术人员现在将会理解的那样，胰激素已经被鉴定为在β细胞衰竭诊断中有用的标记物，可以使用备选的途径获得与本发明成果相当的结果。例如，可以使用备选的策略产生抗体。这样的策略包括合成肽的使用、胰激素表位的免疫呈递及其它。备选地，可以使用又称之为DNA疫苗接种的DNA免疫。
在适合形成结合剂胰激素复合物的条件下，将从个体获得的液体样品与胰激素特异性结合剂接触以进行测量。由于熟练的技术人员无需任何创造性的努力就可以容易地鉴别这类合适的孵育条件，因此不需要对这些条件详细说明。
作为根据在本发明中公开方法的最后一步，测量复合物的量并将其与β细胞衰竭的诊断相关联。如熟练的技术人员将会理解的那样，在相关的教科书中对多种特异性结合剂胰激素复合物的量的测量方法都进行了详细描述(参见，如Tijssen P.，同前，或Diamandis等人编辑(1996)Immunoassay，Academic Press，Boston)。
优选地，以夹层型测定方式检测胰激素。在这类测定中，在一侧使用第一特异性结合剂捕获胰激素，而在另一侧使用经过标记可以直接地或间接地检测的第二特异性结合剂。
如上所述，已经令人惊奇地发现可以从由个体样品获得的液体样品测量胰激素。在应用胰激素标记物诊断β细胞衰竭时不需要组织和活组织检查的样品。
在优选的实施方案中，根据本发明的方法使用血清作为液体样品材料实施。
在更优选的实施方案中，根据本发明的方法使用血浆作为液体样品材料实施。
在更优选的实施方案中，根据本发明的方法使用全血作为液体样品材料实施。
尽管常规蛋白质组学方法在组织样品中的应用鉴别出许多有力的用于所选组织的候选标记物，本发明的发明者已经令人惊奇地能够在体液样品中检测蛋白质胰激素。更加令人惊奇地，他们已经能够证明在从个体获得的这些液体样品中胰激素的存在能够与β细胞衰竭的诊断相关联。
可以在成熟确立的方法，如在原位β细胞衰竭、活组织检查或免疫组织学方法中使用具有很大优点的胰激素抗体。
优选地，在定性(存在或缺少胰激素)或定量(测定胰激素的量)的免疫测定中使用胰激素抗体。
已经证明，测量蛋白质胰激素的水平在β细胞衰竭和糖尿病领域中非常有用。因此，在更优选的实施方案中，本发明涉及使用蛋白质胰激素作为个体液体样品β细胞衰竭诊断的标记物分子。
使用术语标记物分子表示从个体体液测量的分析物胰激素水平上的改变标志着β细胞衰竭的存在。
优选在II型糖尿病的早期诊断中使用新标记物胰激素。
尤其优选在葡萄糖不耐受的早期诊断中使用新标记物胰激素。
同样尤其优选在糖尿病疾病进展的监测中使用新标记物胰激素。
蛋白质胰激素本身的使用代表在β细胞衰竭诊断的挑战性领域的重大进展。将胰激素的测量与其它已知的糖尿病标记物(如胰岛素)组合，或与尚待开发的其它β细胞衰竭标记物组合，会产生进一步的提高。因此在更优选的实施方案中，本发明涉及在从个体获得的液体样品的糖尿病(优选β细胞衰竭)诊断中，将胰激素与另一糖尿病(优选β细胞衰竭)的标记物分子组合作为糖尿病(优选β细胞衰竭)的标记物分子的用途。可以与其组合测量β细胞衰竭的优选的其它糖尿病标记物有胰岛素、前胰岛素和/或C-肽。
在特异性结合测定(如免疫测定)领域中的诊断试剂通常以试剂盒的形式最佳地提供，所述试剂盒包括特异性结合剂和执行测定所需要的辅助试剂。因此本发明还涉及包括至少一种胰激素的特异性结合剂和用于测量胰激素的辅助试剂的免疫试剂盒。
评估新标记物胰激素的临床效用的一种方法是通过在10个依赖外源胰岛素注射的糖尿病患者中测量胰激素水平并与在具有证明的正常β细胞功能的10个患者中的测量水平相比较。使用标准斯氏t检验评估进行统计分析，认为＜0.05的数值有显著性。
可以通过它的受试者操作特性(receiver-operating characteristics)(ROC)描述测试的精确度(尤其见Zweig，M.H.和Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC图是在所观察数据的整个范围内由连续变化的决定阈产生的全部灵敏度/特异度对的绘图。
实验室测试的临床表现依赖于它的诊断精确度或将受试者正确分类为临床相关亚群的能力。诊断精确度测量所述测试正确地区分调查受试者的两种不同状态的能力。这些状态是例如健康和疾病。
在每种情况下，ROC图通过将灵敏度相对决定阈完整范围内的1-特异度进行作图，描述两种分布之间的重叠。y轴为灵敏度，或真阳性率[定义为(真阳性测试结果的数值)/(真阳性的数值+假阴性测试结果的数值)]。这也被称为疾病或病症存在的阳性率。x轴为假阳性率，或1-特异度[定义为(假阳性测试结果的数值)/(真阴性的数值+假阳性结果的数值)]。其为特异度的指标，并且完全从未受感染的亚群计算。因为是通过使用来自两个不同亚群的测试结果完全分别地计算真阳性和假阳性率，ROC图不依赖于样本中疾病的患病数。在ROC图上的每个点代表对应于特定决定阈的灵敏度/-特异度对。完全区别的测试(在结果的两个分布之间没有重叠)具有通过左上角的ROC图，其中真阳性率是1.0或100％(完全敏感度)，且假阳性率是0(完全特异度)。无区别测试的理论图(两组结果的一致分布)是从左下角到右上角的45°对角线。大部分图落在这两个极端之间(如果ROC图完全落在45°对角线之下，可以通过从“大于”到“少于”颠倒阳性标准容易地矫正，或反之亦然)。定性地，绘图越接近左上角，测试的整体精确度越高。
定量实验室测试的诊断精确度一个方便的目的是通过单个数值表达它的工作表现。最常见的整体性度量是ROC曲线下面积。常规地，这一面积总是≥0.5(如果不是的话，可以颠倒决定规则使其符合)。数值范围在1.0(两组测试数值完全分开)和0.5(两组测试数值之间无明显的分布差异)之间。所述面积不仅依赖于图的特定部分，如接近对角线的点或在90％特异度处的灵敏度，还依赖于全图。这是ROC图与完美图(面积＝1.0)有多接近的定量、描述性的表达。
对基本如上文所述的，特别是参考以下实施例的方法、用途和试剂盒同样要求保护。
提供下列实施例、参考文献、序列表和附图以帮助理解本发明，其实际范围在所附权利要求书中提出。应该理解的是，可以在提出的方法中做出修改而不背离本发明的精神。
实施例
我们使用两种方法鉴别由INS-1(Asfari M，Janjic D，Meda P，Li G，Halban PA，Wollheim CB.Establishment of 2-mercaptoethanol-dependentdifferentiated insulin-secreting cell lines.Endocrinology.1992年1月；130(1)：167-78)或RINm5f胰岛素瘤细胞(Praz GA，Halban PA，WollheimCB，Blondel B，Strauss AJ，Renold AE.Regulation ofimmunoreactive-insulin release from a rat cell line(RINm5F).Biochem J.1983年2月15日；210(2)：345-52)分泌的蛋白质，所述方法为：(i)通过差异沉降将细胞分级分离为亚细胞区室，继之使用MALDI-TOF质谱分析法基于它们的肽质谱指纹鉴别蛋白质，和(ii)通过肝素层析继之以一维SDS-PAGE富集糖蛋白，并且通过液相层析耦合串联质谱分析法，经由分析蛋白质消化所产生的胰蛋白消化肽段产生基于蛋白质序列标签的鉴别来鉴别蛋白质。这两种纯化策略的组合使我们能够提高对细胞区室中以及培养细胞的培养基中蛋白质鉴别的效率。
细胞培养
我们通过将β细胞长期暴露于高葡萄糖/脂肪酸(FA)的组合中再现β细胞衰竭的特征，其表明高脂血和高血糖可能导致β细胞的代偿失调。将INS-1E和RINm5f细胞用10mM葡萄糖和0.5mM棕榈酸盐的组合预处理24小时用于这些实验。
实施例1
通过二维电泳(2-DE)绘图和鉴别细胞区室中的信号蛋白质并且通过MALDI-MS鉴别。
如别处所述(Peyrl A，Krapfenbauer K，Slave I等人，PROTEOMICS 3(9)：1781-1800 SEP 2003；Fountoulakis M.，Langen H.，Anal. Biochem.250(1997)153-156)，将从每种细胞系制备的样品用于2-DE。基本如所报道的那样执行2DE(Langen，H.，Roeder，D.，Juranville，J.-R，Fountoulakis，M.，Electrophoresis 1997，IS，2085-2090)。通过使用膜过滤管(MiUipore，Art.No.UFV4BGC25)对样品脱盐，并将2.0mg样品施加于固定的pH3-10非线性梯度带(Amersham，Pharmacia Biotechnology，Uppsala，Sweden)的碱性和酸性两端。以200V聚集蛋白质，随后以2V/分钟将电压逐渐增加到5000V。在5000V持续聚集24小时。在12％聚丙烯酰胺凝胶(Biosolve，Walkinswaard，Netherland)上进行第二维分离。在容纳12块凝胶的EttanDALT II系统(Amersham，Pharmacia Biotechnology，Uppsala，Sweden)中以50mA/凝胶跑胶(180×200×1.5mm)。在含有5％磷酸的50％甲醇中固定蛋白质12小时之后，用胶体考马斯蓝(Novex，San Diego，CA)染色凝胶24小时。通过跑覆盖10到200kDa范围的标准蛋白质参照物(Gibco，Basel，Switzerland)确定分子量。使用由IPG带(Amersham Pharmacia，Uppsala，Sweden)供应商所给出的PI值。凝胶用水脱色并在AGFA DUOSCAN光密度计中扫描。使用photoshop(Adobe)和PowerPoint(Microsoft)记录凝胶的电子图像。
MALDI-MS：如(Langen，H.，Roeder，D.，Juranville，J.-F.，Fountoulakis，M.，Electrophoresis 1997，18，2085-2090)所述以略微改动进行MS分析。
简言之，将斑点切下，用30％(v/v)乙腈在0.1M碳酸氢铵中脱色并且在真空离心蒸发浓缩器(Speed-Vac)中干燥。重新溶胀干燥的凝胶块并加入含有50ng胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，USA)的5μl的5mM碳酸氢铵(pH8.8)，离心1分钟并留置于室温约12小时。消化之后，加入5μl的水，10分钟之后加入含有0.3％三氟乙酸的10μl 75％乙腈，离心1分钟并且涡旋内容物20分钟。从分离的液体取1.5μl用于MALDI-MS，将其与1μl饱和α-氰基肉桂酸在50％乙腈、0.1％TFA的水中混合并用于MALDI靶标。在安装有反射器和延迟引出的飞行时间质谱仪(Ultraflex，Bruker，Bremen，Germany)中分析样品。使用Des-Arg-1缓激肽(Sigma)和促肾上腺皮质激素ACTH(18-38)(Sigma)作为标准肽。对样品进行内部校准。肽质量与来自SWISS-Prot数据库全部物种所有蛋白质的理论肽质量相匹配。
MALDI质谱的峰值注解：使用低通过中值参数样条过滤器两次过滤质谱分析数据以确定仪器基线。使用基线的平滑残差平均标准差(thesmoothed residual mean standard deviation from the baseline)作为数据中仪器噪声水平的估计。基线校正之后截取噪声水平之上的坐标数据，使用具有基线最大离差的数据点产生非线性(Levenberg-Marquardt)数据拟合程序以检测可能的肽峰。具体地，拟合程序尝试产生用峰高、解析度和单一同位素质谱参数表示的最佳拟合平均理论肽同位素分布。以常用方式通过跟踪∑值确定显著拟合的收敛性。成功收敛之后，使用1/3数据点随机交换的16重复引导程序产生对已确定参数的误差估计。从数据中扣除产生的拟合，将临近拟合的噪声水平调整至外推噪声水平与拟合峰偏差的和，并且重复该方法找到下一个峰(只要能够找到超过噪声水平5倍以上的候选峰)。当已经找到超过50个数据峰时停止该方法。使用检测到的内部标准峰的线性外推校正零点和一级飞行时间到质量的换算，并估计单一同位素质量值的置信区间构成峰和标准的质量精确度。
光谱峰对in-silico蛋白质消化的概率性匹配：将质谱的峰质量列表直接与全蛋白质序列数据库的理论消化物相比较。对于每一理论消化物，计算[1-II(1-N P(pi))c匹配，其中N是理论消化物中的肽数目，P(pi)是与通过序列数据库中全部肽的计算划分的单一同位素质量峰置信区间相匹配的肽数目，且c匹配是消化物和质谱之间的匹配数。可以显示这一数值与在消化物和质谱之间获得的假阳性匹配的概率成比例。进一步过滤概率值以产生匹配的高显著性质谱峰。在第一轮鉴别之后，使用在同一条件下获得的质谱的鉴别偏差校正第二和第三级飞行时间到质量的换算。产生的质量值大部分具有的绝对偏差少于10ppm。继之将这些质量值用于最后一轮匹配，其中接受Pmism少于0.01/N蛋白质(使用Bonferoni校正的1％显著性水平)的全部匹配。
实施例2
通过肝素柱富集推定的分泌蛋白质并且通过LC-MS鉴别
基于大多数具有信号功能的蛋白质是糖基化的这一观察结果，肝素琼脂糖柱的特性使其成为非常多用途的工具用于分离许多糖基化蛋白质，如具有信号功能的蛋白质，生长因子，凝结蛋白质和类固醇受体。在肝素琼脂糖柱中的配体是从猪肠黏膜的天然蛋白聚糖中提取的天然产生的硫酸化糖胺聚糖。肝素由糖醛酸和D-葡糖胺的交替单位组成，其大部分由一个或两个硫酸基团取代。固定化的肝素具有与蛋白质相互作用的两种主要方式。其可以作为亲和配体工作；如在它与凝结因子的相互作用中。由于其阴离子硫酸基团，肝素还具有作为高容量阳离子交换剂的功能。在本案中，通过使用注射器进行柱操作。
在两种情况下推荐的洗脱条件包括通过使用2M NaCl的分级梯度增加离子强度，其中结合缓冲液是pH～7的10mM磷酸钠，而洗脱缓冲液是pH～7的10mM磷酸钠、2M NaCl。
样品制备
25ml培养基于4℃在10000g离心10分钟以移去细胞和其它不溶材料。将样品溶液调节至结合缓冲液的组成。通过加入25ml的20mM磷酸钠缓冲溶液(pH＝7)稀释样品完成这一步骤。离心样品之后立即上柱。1ml肝素柱(HiTrap Heparin HP，1ml，Cat.Nr.17-0406-01，Amersham)的卸载体积是5ml。
通过肝素层析富集蛋白质的操作程序：
1.将25ml注射器灌满结合缓冲液。此外，移去塞子并用提供的转接器“drop to drop”连接柱和注射器以防止空气进入柱内。
2.移去扭旋末端并使用10倍柱体积的结合缓冲液洗肝素琼脂糖柱以平衡柱。
3.继之如上所述制备样品并通过使用安装于luer转接器的注射器泵入柱内施加样品。
4.接着，用5倍柱体积的结合缓冲液洗柱或直至在流出物中没有物质出现。
5.为了洗脱样品，使用5倍柱体积的洗脱缓冲液通过分级梯度洗柱。
6.最后，使用POROS R2柱对纯化的级分脱盐。
使用反相层析(POROS R2，PerSeptive Biosytems)对从肝素柱洗脱的样品级分脱盐，并使用真空离心蒸发浓缩器干燥。干燥之后，在以下提到的样品缓冲液中溶解样品并通过Bradford操作(BioRad蛋白质测定，BioRad)确定蛋白质含量。
1D电泳
样品上样和电泳条件
15μg的样品溶解于20μl样品缓冲液中(样品、2.5μl NuPAGE LDS样品缓冲液(4×)、1.0μl NuPAGE还原剂(10×)、并且加去离子水6.5μl，总体积10μl)和，在凝胶上样之前于70℃加热10分钟。以200ml 1×NuPAGE SDS运行缓冲液(通过向950ml去离子水中加入50ml的20×NuPAGE MES SDS运行缓冲液制备MES SDS运行缓冲液)灌注上层缓冲液室。在上层缓冲液室中加入200μl/200ml的抗氧化剂溶液作为还原剂。最后以600ml 1×NuPAGE SDS运行缓冲液灌注下层缓冲液室并在10％BT线性梯度，聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE，Invitrogen)上以恒定的200V室温进行凝胶电泳35分钟。
染色和脱色操作
使用含有5％(v/v)磷酸的50％(v/v)甲醇固定蛋白质12小时之后，用胶体考马斯蓝(Novex，San Diego，CA，USA)染色凝胶另外24小时。凝胶用水脱色，并在标准平板式扫描仪中扫描。使用Photoshop(Adobe)和PowerPoint(Microsoft)软件处理图像。使用Image Master 2D Elite软件(Amersham Pharmacia Biotechnology)定量蛋白质条带。
LC-MS：为了鉴别分泌蛋白质，还使用称为多维蛋白质鉴别技术(MudPIT)的LC/MS系统进行我们的蛋白质组学研究，LC/MS系统将多维液相层析与电喷射离子化串联质谱分析法组合在一起。为了分离由肝素柱富集的消化的蛋白质，我们的多维液相层析方法在双相柱中整合了强阳离子交换(SCX)树脂和反相树脂。每一MudPIT分析以一式两份进行，并且在两次分析之间分离的可重复性在0.5％之内。此外，已经证明在复合肽混合物中最高丰度和最低丰度蛋白质/肽之间的动态范围为10000到1。该方法通过提高样品制备与分离，经由鉴别富集分泌蛋白质的级分中的蛋白质提高蛋白质组的整体分析。MudPIT系统包括4cm×50-μm内径×5μm的C18微型SPE前置柱用于样品浓缩和85cm×15-μm内径×3μm的C18填充毛细管柱用于极小样品量的高效梯度反相纳米级LC分离。微型SPE载物台使能够以大约每分钟8μl将溶液上样至纳米LC柱，其上样10μl溶液需时＜2分钟且样品丢失＜5％(由注射器和阀转接器产生)。以10000psi恒压进行分离。长3-μm颗粒填充的15-μm内径毛细管提供约103的分离峰容量。该柱通过无死体积的不锈钢管道连接安装于可替换的纳米ESI发射体，该发射体是由10-μm内径×150-μm外径熔融石英毛细管做成的，具有用于高效离子化洗脱肽的约2-μm内径的喷口。将ESI源连接于FTICR MS或离子阱MS/MS用于肽/蛋白质检测和鉴别。利用FTICR质谱分光计基于高精度质谱测量和相对保留时间(RRT)信息的使用进行单阶MS，并利用Finnigan离子阱质谱分光计(LCQ XP，ThermoQuest Corp.，San Jose，CA)进行MS/MS。
实施例3
β细胞衰竭标记物胰激素抗体的产生
产生β细胞衰竭标记物胰激素的多克隆抗体以进一步将所述抗体用于通过免疫检测测定(如Western印迹和酶联免疫吸附测定ELISA)测量胰激素的血清和血浆以及血液水平。
大肠杆菌中的重组蛋白质表达
为了产生胰激素抗体，进行蛋白质的重组表达以获得免疫原。使用RTS100表达系统与大肠杆菌的组合进行表达。在第一步中，分析DNA序列并使用“Proteo Expert RTS大肠杆菌HY”系统获得推荐的高产cDNA沉默突变变体和各自的PCR引物序列。这是基于服务器(www.proteoexpert.com)的商业网站。使用推荐的引物对，使用“RTS100大肠杆菌线性模板产生装置，His-标签”(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，Cat.No.3186237)系统从cDNA产生线性PCR模板，进行编码胰激素蛋白质的核苷酸序列的体外转录和表达。对含有His标签的表达蛋白质进行Western印迹和随后的纯化。鉴别最佳表达变体。根据厂商说明书进行从PCR到表达和检测的全部步骤。按照厂商说明书将含有全部必需T7调控区(启动子、核糖体结合位点和T7终止子)的相应PCR产物克隆入pBAD TOPO载体(Invitrogen，Karlsruhe，Germany，Cat.No.K4300/01)。为使用T7调控序列表达，将构建体转化进入大肠杆菌BL21(DE3)(Studier，P.W.等人，Methods Enzymol.185(1990)60-89)，并以1L的批次培养转化的细菌，进行蛋白质的表达。
按照标准操作在Ni-螯合柱上完成His-胰激素融合蛋白质的纯化。简言之，通过离心沉淀含有His-胰激素融合蛋白质表达载体的1L细菌培养物。在含有pH8.0的磷酸盐，7M氯化胍、咪唑和硫甘油的裂解缓冲液中重悬细胞沉淀，继之使用Ultra-Turrax匀浆。通过高速离心沉淀不溶物质并将上清施加于Ni-螯合层析柱。用数倍床体积的裂解缓冲液洗柱，接着用含有pH8.0的磷酸盐和脲的缓冲液洗。最后，在酸性条件下使用含有SDS的磷酸盐缓冲液洗脱结合的抗原。
抗蛋白质胰激素的单克隆抗体的生产
a)小鼠的免疫
使用100μg胰激素对12周龄A/J小鼠腹膜内地进行起始免疫。接着在6周之后进行两次隔月的腹膜内免疫。在这一过程中，向每只小鼠施用吸收在氢氧化铝上的100μg胰激素和109的百日咳杆菌(Bordetellapertussis)病菌。继之在融合前的第三天和第二天腹膜内地进行最后两次免疫，每次使用100μg胰激素PBS缓冲液。
b)融合和克隆
将根据a)免疫的小鼠脾细胞按照Galfre，G.和Milstein，C，Methods inEnzymology 73(1981)3-46所述与骨髓瘤细胞融合。在这一过程中，将免疫小鼠的大约1×108个脾细胞与2×107个骨髓瘤细胞(P3X63-Ag8-653，ATCC CRL1580)混合并离心(于300g和4℃10分钟)。接着用不含胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养基洗细胞一次并在50ml圆锥管中以400g再次离心。弃去上清液，通过轻敲松动细胞沉淀，加入1ml PEG(分子量4000，Merck，Darmstadt)并通过吸打混合。在37℃水浴1分钟之后，于室温在4-5分钟之内逐滴加入5ml不含FCS的RPMI 1640。其后在大约1分钟之内逐滴加入含10％FCS的5ml RPMI1640，彻底混合，用培养基(RPMI1640+10％FCS)补至50ml并继之于400g，4℃离心10分钟。沉淀的细胞在含10％FCS的RPMI1640培养基中重悬，并种于次黄嘌呤-重氮丝氨酸选择培养基(在RPMI 1640+10％FCS中含100mmol/l次黄嘌呤、1μg/ml重氮丝氨酸)中。以100U/ml向培养基中加入白介素6作为生长因子。大约10天之后测试初级培养物的特异性抗体。通过荧光激活细胞分选仪将胰激素阳性初级培养物克隆至96孔细胞培养板。在这一过程中以100U/ml再次加入白介素6作为生长添加剂。
c)从细胞培养上清分离免疫球蛋白
以1×105个细胞/ml密度将获得的杂交瘤细胞种于含10％FCS的RPMI1640中并在发酵罐(Thermodux Co.，Wertheim/Main，MCS-104XL型，Order No.144-050)中增殖7天。在培养上清中获得单克隆抗体的平均浓度为100μg/ml。通过蛋白质化学的常规方法(如，根据Bruck，C等人，Methods in Enzymology 121(1986)587-695)从培养物上清液纯化这一抗体。
多克隆抗体的产生
a)免疫
按照1∶1比例制备蛋白质溶液(100μg/ml蛋白质胰激素)和完全弗氏佐剂的新鲜乳剂。使用1ml乳剂在第1天、7天、14天和30天、60天和90天免疫每只兔子。抽血，产生的抗胰激素血清用于如实施例3和4所述的进一步的实验。
b)通过辛酸和硫酸铵的顺序沉淀从兔血清中纯化IgG(免疫球蛋白G)
使用4体积的乙酸盐缓冲液(60mM，pH4.0)稀释1体积的兔血清。使用2M Tris碱调节pH至4.5。在剧烈搅拌下逐滴加入辛酸(25μl/ml的稀释样品)。30分钟之后离心样品(13000×g，30分钟，4℃)，弃去沉淀并收集上清液。通过加入2M Tris碱将上清液pH调节至7.5并过滤(0.2μm)。
通过在剧烈搅拌下逐滴加入4M硫酸铵溶液至2M终浓度沉淀上清液中的免疫球蛋白。通过离心(8000×g，15分钟，4℃)收集沉淀的免疫球蛋白。
弃去上清液。在10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl中溶解沉淀并彻底地透析。离心透析液(13000×g，15分钟，4℃)并过滤(0.2μm)。
多克隆兔IgG的生物素化
在10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl中将多克隆兔IgG加至10mg/ml。向每ml IgG溶液加入50μl生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(3.6mg/ml于DMSO中)。室温30分钟之后，在Superdex 200(10mMNaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl)上对样品进行层析。收集含有生物素化IgG的级分。已经根据相同操作生物素化单克隆抗体。
多克隆兔IgG的地高辛化
在10mM NaH2PO4/NaOH，30mM NaCl，pH7.5中将多克隆兔IgG加至10mg/ml。每ml IgG溶液加入50μl地高辛-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany，Cat.No.1 333 054)(3.8mg/ml于DMSO中)。室温30分钟之后，在Superdex200(10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl)上对样品进行层析。收集含有地高辛化IgG的级分。已根据相同操作用地高辛标记单克隆抗体。
实施例4
Western印迹
将通过肝素柱(以上提到的)从培养基中富集和分离的蛋白质样品溶解在包括10mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05％吐温20、1％SDS的样品缓冲液中，并于4℃在12000g离心10分钟。使用从已知牛血清白蛋白标准物的范围构建的标准曲线通过Bradford测量上清液的蛋白质浓度。将样品与样品缓冲液(60mM Tris-HCl、2％SDS、0.1％溴酚蓝、25％甘油和14.4mM 2-巯基乙醇，pH6.8)混合之后在70℃孵育5分钟，通过12.5％均质ExcelGel SDS凝胶(Amersham Bioscience)分离样品并电转移至硝酸纤维素膜上。在封闭溶液(10mM Tris-HCl，pH7.5、150mM NaCl、0.05％吐温20和5％脱脂干牛奶)中孵育之后，分别将膜与兔抗大鼠抗体于室温孵育2小时。用洗涤溶液(0.3％吐温20于tris-缓冲盐水中)洗膜3次每次10分钟之后，将膜与辣根过氧化物酶缀合的抗兔IgG(H+L)、抗小鼠IgG1和抗小鼠IgG2a(Southern Biotechnology Associates，Inc.，Birmingham，AL)于室温分别孵育1小时。洗膜3次每次10分钟，根据厂商说明书通过增强化学发光试剂(Western LightningTM，PerkinElmer Life Sciences，Inc.，Boston，MA)在X射线胶片上对抗原-抗体复合物显色。
实施例5.1
用于测量人血清和血浆样品中胰激素的酶联免疫吸附测定
开发夹层酶联免疫吸附测定用于人血清和血浆样品中胰激素的检测。为了捕获和检测抗原，将等分试样的抗胰激素多克隆抗体(见实施例2)分别与生物素和地高辛缀合。
链霉抗生物素包被的96孔微量滴定板与100μl生物素化抗胰激素多克隆抗体以10μg/ml在10mM磷酸盐pH7.4、1％BSA、0.9％NaCl和0.1％吐温20中孵育60分钟。孵育之后，用0.9％NaCl、0.1％吐温20洗板三次。接着将孔与作为标准抗原的重组蛋白质(见实施例2)的系列稀释液或患者稀释的血浆样品孵育2小时。结合胰激素之后，用0.9％NaCl、0.1％吐温20洗板三次。将孔与100μl地高辛化抗胰激素多克隆抗体以10μg/ml在10mM磷酸盐pH7.4、1％BSA、0.9％NaCl和0.1％吐温20中孵育60分钟，用于特异性地检测结合的胰激素。其后，洗板三次移去未结合的抗体。下一步，将孔与20mU/ml的抗地高辛-POD缀合物(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany，Catalog No.1633716)在10mM磷酸盐pH7.4、1％BSA、0.9％NaCl和0.1％吐温20中孵育60分钟。继之用相同的缓冲液洗板三次。将孔与100μl ABTS溶液(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany，Catalog No.11685767)孵育，并在30-60分钟之后使用酶联免疫吸附测定读取仪测量在405nm的OD值，以检测抗原-抗体复合物。
实施例5.2
通过酶免疫测定EIA证实人血浆中的胰多肽
用于证实胰多肽的酶免疫测定试剂盒是基于“竞争性”酶免疫测定原理设计用于检测特异性肽及其相关肽。该试剂盒购自PhoenixPharmaceuticals，Inc.，(Art.Nr.EK-054-02)并根据厂商说明书进行操作。
●使用950ml蒸馏水稀释测定缓冲液浓缩物。制备标准肽。
●使用5ml测定缓冲液再水化初级抗血清并涡旋。
●使用5ml测定缓冲液再水化生物素化肽并涡旋。
●孔A-1空置作为空白。
●向孔中加入50μl测定缓冲液以确定总结合。
●向孔中加入50μl制备的肽标准溶液。
●向指定的孔中加入50μl样品。
●向除了空白孔的每个孔中加入25μl再水化的初级抗血清。
●向除了空白孔的每个孔中加入25μl再水化的生物素化肽。
●使用乙酸盐板密封物(APS)密封免疫板。
●于室温孵育免疫板2小时。
●对本试剂盒中提供的SA-HRP瓶离心(500-1000转/分钟，15秒，4℃)，并吸取12μl SA-HRP加入12ml测定缓冲液中制备SA-HRP溶液，涡旋。
●从免疫板移去APS。
●弃去孔中内容物。
●用300μl测定缓冲液洗每个孔(空白孔除外)5次。
●向除了空白孔的每个孔中加入100μl SA-HRP溶液。
●用APS重新密封免疫板并于室温孵育1小时。
●如上所述，使用测定缓冲液洗涤和印迹干燥免疫板6次。
●向包括空白孔的每个孔加入本试剂盒中提供的100μl底物溶液。
●使用APS重新密封免疫板，并于室温孵育1小时。
●向每个孔(包括空白孔)加入100μl 2N HCl终止反应。在20分钟之内开始下一步。
●使用70％乙醇清洗免疫板底。
●移去APS并将免疫板置于微量滴定板读取仪上。
●读取在450nm的O.D.吸光度。
在半对数图纸上绘制标准曲线。将标准肽的已知浓度和它的相应O.D.读取值分别绘制在对数刻度(X轴)和线性刻度(Y轴)上。标准曲线显示了肽浓度和相应O.D.吸光度之间的逆相关关系。随着标准浓度增加，黄色的强度，从而依次是O.D.吸光度降低。
通过在Y轴绘制样品的O.D.，接着画出水平线与标准曲线相交确定样品中的肽浓度。从该点落下的垂直线将在相应于未知样品中的肽浓度的坐标上与X轴交叉。
实施例5.3
通过放射免疫测定RIA证实人血浆中的胰多肽
使用的试剂盒是基于“竞争性”酶免疫测定原理设计的用于检测特异性肽及其相关肽。该试剂盒购自Phoenix Pharmaceuticals，Inc.，(Art.Nr.RK-054-01)，并根据厂商说明书进行操作。
实施例6
患者数据的统计分析：
通过在依赖外源胰岛素注射的10个糖尿病患者中测量新标记物胰激素水平并与已经证明具有正常β细胞功能的10个患者中新标记物胰激素水平相比较，评估新标记物胰激素的临床效用。使用标准斯氏t检验评估进行统计分析，认为＜0.05的值具有显著性。
结果如下：
对照：30.9pg/ml+/-3.4pg/ml
IGT(葡萄糖耐量受损)：31.7pg/ml+/-5.5pg/ml，p＝0.75
IGT+IFG(空腹葡萄糖受损)：44.6pg/ml+/-15.1pg/ml，p＝0.012
II型糖尿病：69.8pg/ml+/-26.4pG/ml，p＝0.00022
I型糖尿病：44.6pg/ml+/-10.3pg/ml，p＝0.00086。
序列表
<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
<120>胰多肽作为β细胞衰竭的靶标/标记物
<130>case 22680
<160>2
<170>PatentIn Version 3.2
<210>1
<211>95
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>人胰多肽
<222>(1)..(95)
<223>登录号P01298
<400>1
Met Ala Ala Ala Arg Leu Cys Leu Ser Leu Leu Leu Leu Ser Thr Cys
1               5                   10                  15
Val Ala Leu Leu Leu Gln Pro Leu Leu Gly Ala Gln Gly Ala Pro Leu
            20                  25                  30
Glu Pro Val Tyr Pro Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln Met Ala Gln
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Asp Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Met Leu Thr Arg Pro Arg
    50                  55                  60
Tyr Gly Lys Arg His Lys Glu Asp Thr Leu Ala Phe Ser Glu Trp Gly
65                  70                  75                  80
Ser Pro His Ala Ala Val Pro Arg Glu Leu Ser Pro Leu Asp Leu
                85                  90                  95
<210>2
<211>98
<212>PRT
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>大鼠胰多肽
<222>(1)..(98)
<223>登录号P06303
<400>2
Met Ala Val Ala Tyr Tyr Cys Leu Ser Leu Phe Leu Leu Ser Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Ala Leu Leu Leu Gln Pro Leu Gln Gly Ala Trp Gly Ala Pro Leu
            20                  25                  30
Glu Pro Met Tyr Pro Gly Asp Tyr Ala Thr His Glu Gln Arg Ala Gln
        35                  40                  45
Tyr Glu Thr Gln Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Thr Leu Thr Arg Pro Arg
    50                  55                  60
Tyr Gly Lys Arg Asp Glu Asp Thr Ala Gly Leu Pro Gly Arg Gln Leu
65                  70                  75                  80
Pro Pro Cys Thr Ser Leu Leu Val Gly Leu Met Pro Cys Ala Ala Ala
                85                  90                  95
Arg Ser
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.筛选与Seq ID No.1或2的胰激素相互作用的化合物的方法，其包括步骤：
a)将蛋白质胰激素与化合物或多种化合物在允许所述化合物或多种化合物与胰激素相互作用的条件下接触；和
b)检测所述化合物或多种化合物与所述多肽之间的相互作用。
2.筛选可以预防和/或抑制和/或削弱β细胞衰竭的化合物的方法，其包括步骤：
a)将化合物与Seq ID No.1或2的蛋白质胰激素接触；
b)测量所述蛋白质胰激素的活性；
其中刺激或抑制所述蛋白质胰激素活性的化合物是可以预防和/或抑制β细胞衰竭的化合物。
3.权利要求2的方法，在步骤a)之前或在步骤a)和b)之间另外地包括固定所述蛋白质胰激素的步骤。
4.筛选预防和/或抑制和/或延迟β细胞衰竭的化合物的方法，其包括在存在或缺少所述化合物时检测宿主分泌的Seq ID No.1或2的可溶性胰激素的步骤，其中预防和/或抑制和/或延迟β细胞衰竭的化合物是使宿主分泌的所述胰激素水平改变的化合物。
5.Seq ID No.1或2的蛋白质胰激素作为靶标和/或标记物用于筛选预防和/或抑制β细胞衰竭的化合物的用途。
6.用于监测糖尿病进展的方法，其包括步骤：
a)提供从个体获得的液体样品，
b)将所述样品与Seq ID No.1胰激素的特异性结合剂在适合所述结合剂与所述胰激素之间形成复合物的条件下接触，和
c)将在(b)中形成的复合物的量与在β细胞衰竭中形成的复合物的量相关联。
7.用于监测糖尿病治疗效力的方法，其包括步骤：
a)提供从针对糖尿病治疗的患者获得的液体样品，
b)将所述样品与Seq ID No.1胰激素的特异性结合剂在适合所述结合剂与所述胰激素之间形成复合物的条件下接触，和
c)将在(b)中形成的复合物的量与缺乏治疗时形成的复合物的量相关联。
8.用于诊断β细胞衰竭的方法，其包括步骤：
a)提供从个体获得的液体样品，
b)将所述样品与Seq ID No.1胰激素的特异性结合剂在适合所述结合剂与所述胰激素之间形成复合物的条件下接触，和
c)将在(b)中形成的复合物的量与β细胞衰竭的诊断相关联。
9.根据权利要求6到8中任一项的方法，其特征还在于所述样品是血清。
10.根据权利要求6到8中任一项的方法，其特征还在于所述样品是血浆。
11.根据权利要求6到8中任一项的方法，其特征还在于所述样品是全血。
12.Seq ID No.1的蛋白质胰激素在从个体获得液体样品的β细胞衰竭诊断中作为标记物分子的用途。
13.Seq ID No.1的蛋白质胰激素在从个体获得液体样品的II型糖尿病早期诊断中作为标记物分子的用途。
14.根据权利要求13的用途，其中早期诊断是使用来自患有葡萄糖不耐受患者的样品。
15.Seq ID No.1的蛋白质胰激素用于监测糖尿病进展的用途。
16.Seq ID No.1的蛋白质胰激素用于监测糖尿病治疗效力的用途。
17.Seq ID No.1的蛋白质胰激素与至少一种其它β细胞衰竭的标记物分子组合在从个体获得液体样品的β细胞衰竭诊断中作为β细胞衰竭的标记物分子的用途。
18.免疫试剂盒，包含至少一种Seq ID No.1胰激素的特异性结合剂和用于测量所述胰激素的辅助试剂。
19.基本如上文所述，特别是参考前面实施例的方法、用途和试剂盒。

Claims (19)

1.筛选与胰激素相互作用的化合物的方法，其包括步骤：
a)将蛋白质胰激素与化合物或多种化合物在允许所述化合物或多种化合物与胰激素相互作用的条件下接触；和
b)检测在所述化合物或多种化合物与所述多肽之间的相互作用。
2.筛选可以预防和/或抑制和/或削弱β细胞衰竭的化合物的方法，其包括步骤：
a)将化合物与蛋白质胰激素接触；
b)测量蛋白质胰激素的活性；
其中刺激或抑制蛋白质胰激素活性的化合物是可以预防和/或抑制β细胞衰竭的化合物。
3.权利要求2的方法，在步骤a)之前或在步骤a)和b)之间另外地包括固定蛋白质胰激素的步骤。
4.筛选预防和/或抑制和/或延迟β细胞衰竭的化合物的方法，其包括在存在或缺少所述化合物时检测宿主分泌的可溶性胰激素的步骤，其中预防和/或抑制和/或延迟β细胞衰竭的化合物是使宿主分泌的胰激素水平改变的化合物。
5.蛋白质胰激素作为靶标和/或标记物用于筛选预防和/或抑制β细胞衰竭的化合物的用途。
6.监测糖尿病进展的方法，其包括步骤：
a)提供从个体获得的液体样品，
b)将所述样品与胰激素的特异性结合剂在适合所述结合剂与胰激素之间形成复合物的条件下接触，和
c)将在(b)中形成复合物的量与在β细胞衰竭中形成复合物的量相关联。
7.监测糖尿病治疗效力的方法，其包括步骤：
a)提供从针对糖尿病治疗的患者获得的液体样品，
b)将所述样品与胰激素的特异性结合剂在适合所述结合剂与胰激素之间形成复合物的条件下接触，和
c)将在(b)中形成复合物的量与缺乏治疗时形成复合物的量相关联。
8.用于诊断β细胞衰竭的方法，其包括步骤：
a)提供从个体获得的液体样品，
b)将所述样品与胰激素的特异性结合剂在适合所述结合剂与胰激素之间形成复合物的条件下接触，和
c)将在(b)中形成复合物的量与β细胞衰竭的诊断相关联。
9.根据权利要求6到8中任一项的方法，其特征还在于所述样品是血清。
10.根据权利要求6到8中任一项的方法，其特征还在于所述样品是血浆。
11.根据权利要求6到8中任一项的方法，其特征还在于所述样品是全血。
12.蛋白质胰激素在从个体获得液体样品的β细胞衰竭诊断中作为标记物分子的用途。
13.蛋白质胰激素在从个体获得液体样品的II型糖尿病早期诊断中作为标记物分子的用途。
14.根据权利要求13的用途，其中早期诊断是使用来自患有葡萄糖不耐受患者的样品。
15.蛋白质胰激素用于监测糖尿病进展的用途。
16.蛋白质胰激素用于监测糖尿病治疗效力的用途。
17.蛋白质胰激素与至少一种其它β细胞衰竭的标记物分子组合在从个体获得液体样品的β细胞衰竭诊断中作为β细胞衰竭的标记物分子的用途。
18.免疫试剂盒，包含至少一种胰激素特异性结合剂和用于测量胰激素的辅助试剂。
19.基本如上文所述，特别是参考前面实施例的方法、用途和试剂盒。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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