TWI381850B - 藥物與聚合物之共軛物 - Google Patents

藥物與聚合物之共軛物 Download PDF

Info

Publication number
TWI381850B
TWI381850B TW095150007A TW95150007A TWI381850B TW I381850 B TWI381850 B TW I381850B TW 095150007 A TW095150007 A TW 095150007A TW 95150007 A TW95150007 A TW 95150007A TW I381850 B TWI381850 B TW I381850B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
moiety
conjugate
group
polypeptide
linker
Prior art date
Application number
TW095150007A
Other languages
English (en)
Other versions
TW200800272A (en
Inventor
Laurence I Wu
Bryan T H Wu
Kuo His Kao
Liming Shen
Kelly Teng
Original Assignee
Pharmaessentia Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pharmaessentia Corp filed Critical Pharmaessentia Corp
Publication of TW200800272A publication Critical patent/TW200800272A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI381850B publication Critical patent/TWI381850B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/26—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atom of at least one of the carbamate groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C271/28—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atom of at least one of the carbamate groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring to a carbon atom of a non-condensed six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L71/00—Compositions of polyethers obtained by reactions forming an ether link in the main chain; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L71/02—Polyalkylene oxides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Polyamides (AREA)
  • Polyethers (AREA)

Description

藥物與聚合物之共軛物
本發明有關於一種由治療性多肽分子與聚合物分子耦合而形成具有改進藥效的單一藥物整體(即，多肽與聚合物之共聚物)。
目前已研究兩種主要藥物遞送方法以改良治療藥物分子的藥物藥效性質(pharmacodynamic)與藥物動力性質(pharmacokinetic)。其中一種方法為修改藥物分子本身，例如進行聚乙二醇修飾(pegylation)，以及另一種方法為改變藥物配方，例如使用微脂體製備(liposomal preparation)。不論在任一種方法中，均希望發展出可提供延長藥學活性、降低副作用、增加病患順從度與增進病患生活品質之藥物遞送機制。
本發明為基於治療性多肽分子可與聚合物分子耦合以形成具有改良藥效之單一藥物整體(即多肽與聚合物之共聚物)的概念所做成。
在一態樣中，本發明特徵為一種多肽與聚合物之共軛物(polypeptide－polymer conjugate)，該共軛物包括一多肽部分(polypeptide moiety)、一聚環氧烷部分(polyalkyene oxide moiety)、一用以連結多肽部分與聚環氧烷部分的連接物(linker)、一位在多肽部分與連接物之間的第一鏈結(linkage)、以及一位在聚環氧烷部分與連接物之間的第二鏈結。多肽部分可含有一人類α干擾素部分(interferon－α moiety)(即，保留α干擾素活性之天然或經修飾的部分)以及在人類α干擾素部分之氮端的1至6個(如1至4個)額外胺基酸殘基。α干擾素部分的例子包括－Ser－Gly－IFN、－Gly－Ser－IFN、－Met－Met－IFN、－Met－His－IFN、－Pro－IFN與－Gly－Met－IFN，其中IFN為人類α2b 干擾素部分。α干擾素部分可包括一位在氮(N)端的半胱胺酸(cysteine)殘基。多肽部分亦可包括β 干擾素部分(interferon－β moiety)或顆粒細胞聚落刺激因子(granulocyte colony－stimulating factor)。聚環氧烷部分可含有1至20,000個C1 －C8 環氧烷重複單元。聚環氧烷部分的例子包括一含有5至10,000個重複單元的聚環氧乙烷部分(polyethylene oxide moiety)，例如數目平均分子量為20,000道爾頓(Dalton)的聚環氧乙烷部分。連接物可為C1 －C8 伸烷基(alkylene)、C1 －C8 雜伸烷基(heteroalkylene)、C3 －C8 環伸烷基(cycloalkylene,)、C3 －C8 雜環伸烷基(heterocycloalkylene)、伸芳基(arylene)、雜伸苯基(heteroarylene)、芳基伸烷基(aralkylene)或－Ar－X－(CH2 )n －，其中Ar可為伸芳基(如伸苯基)或雜伸芳基，X可為氧(O)、硫(S)或N(R)，R為氫或C1 －C10 烷基以及n可為1至10。第一與第二鏈結每一者獨立地可為羧酸酯(carboxylic ester)、羰基(carbonyl)、碳酸鹽(carbonate)、醯胺基(amide)、胺基甲酸基(carbamate)、尿素(urea)、醚(ether)、硫基(thio)、磺醯基(sulfonyl)、亞磺醯基(sulfinyl)、胺基(amino)、亞胺基(imino)、羥胺基(hydroxyamino)、膦酸鹽(phosphonate)或磷酸鹽(phosphate)基團。上述藥物與聚合物共軛物的一例子為： 其中mPEG為甲氧基封端的聚環氧乙烷部分(methoxy－capped polyethylene oxide moiety)。
聚環氧烷部分意指線性、分支或星狀部分。其可為飽和或不飽和以及經取代或未經取代。聚環氧烷部分的例子包括聚環氧乙烷、聚環氧丙烷(polypropylene oxide)、聚環氧異丙烷(polyisopropylene oxide)、聚環丁烷(polybutnylene oxide)及其上述化合物之共聚物。其他聚合物，如葡聚糖(dextran)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohols)、聚丙烯醯胺(polyacrylamides)或碳水化合物系聚合物亦可用來替代聚環氧烷部份，只要它們不具抗原性、毒性或不誘發免疫反應即可。
連接物從聚環氧烷部分延伸出且有助於將多肽部分連結至聚環氧烷部分。
多肽部分可包括一經修飾的多肽藥物，只要其仍保留至少一些藥物活性。此等治療性多肽部分的例子包括在氮端含有一或多個額外胺基酸殘基的修飾多肽分子或在其主要蛋白質序列之胺基酸殘基上具有一或多個取代基的修飾多肽分子。
多肽部分可於活體內在酵素作用下藉由切斷多肽部分與連接物間之鏈結或切斷聚環氧烷部分與連接物間之鏈結而釋放出來，例如經由水解而釋出。參與在活體內切斷鏈結之酵素的例子包括氧化酵素(如過氧化酶、胺氧化酶或脫氫酶)、還原酵素(如酮還原酶)與水解酵素(如蛋白酶、酯水解酶、硫酸酯水解酶或磷酸酯水解酶)。本發明之多肽與聚合物共軛物在活體中，不需將治療性多肽部分自多肽與聚合物共軛物上切下來亦具有療效。
術語「烷基(alkyl)」係指單價、飽和、線性或分支、非芳香性的碳氫化合物部分，如－CH3 或－CH(CH3 )2 。術語「烯基(alkenyl)」係指包含至少一個雙鍵之線性或分支的碳氫化合物部分，如－CH＝CH－CH3 。術語「炔基(alkynyl)」係指包含至少一個三鍵之線性或分支的碳氫化合物部分，如－C≡C－CH3 。術語「環烷基(cycloalkyl)」係指飽和、環狀的碳氫化合物部分，如環丙烷基。術語「環烯基(cycloalkenyl)」係指在環上含有至少一個雙鍵的非芳香性、環狀碳氫化合物部分，如環己烯基。術語「雜環烷基(heterocycloalkyl)」係指環上具有至少一雜原子(如N、O或S)的飽和環狀部分，如4－四氫吡喃基(4－tetrahydropyranyl)。術語「雜環烯基(heterocycloalkenyl)」係指環上具有至少一雜原子(如N、O或S)與至少一雙鍵的非芳香性環狀部分，如吡喃基。術語「芳基(aryl)」係指具有一或多個芳香環之碳氫化合物部分。芳基的例子包括苯基(phenyl，Ph)、萘基(naphthyl)、芘基(pyrenyl)、蒽基(anthryl)與菲基(phenanthryl)。術語「雜芳基(heteroaryl)」係指具有一或多個芳香環且環上具有至少一雜原子(如N、O或S)的基團部分。雜芳基的例子包括呋喃基(furyl)、茀基(fluorenyl)、吡咯基(pyrrolyl)、噻吩基(thienyl)、噁唑基(oxazolyl)、咪唑基(imidazolyl)、噻唑基(thiazolyl)、吡啶基(pyridyl)、嘧啶基(pyrimidinyl)、喹唑啉基(quinazolinyl)、喹啉基(quinolyl)、異喹啉基(isoquinolyl)與吲哚基(indolyl)。術語「伸烷基(alkylene)」係指二價、飽和、線性或分支且非芳香性的碳氫化合物部分，如－CH2 －。術語「雜伸烷基(heteroalkylene)」係指具有至少一雜原子(如N、O或S)的伸烷基部分，如－CH2 OCH2 －。術語「環伸烷基(cycloalkylene)」係指二價、飽和且環狀的碳氫化合物部分，如環伸己烷。術語「雜環伸烷基(heterocycloalkylene)」係指環上具有至少一雜原子的二價、飽和、非芳香性環狀碳氫化合物部分，如4－四氫伸吡喃基(4－tetrahydropyranylene)。術語「伸芳基(arylene)」係指具有一或多個芳香環的二價碳氫化合物部分。芳基部分的例子包括伸苯基與伸萘基。術語「雜伸芳基(heteroarylene)」係指具有一或多個芳香環且環上具有至少一個雜原子的二價部分。雜伸芳基之例子包括伸呋喃與伸吡咯基。術語「芳基伸烷基(aralkylene)」係指其上取代有芳基或雜芳基的二價烷基部分，其中一電子位於烷基部分且另一電子位於芳基或雜芳基上。烷基芳基之例子包括伸芐基(benzylene，或稱伸苯甲基)或吡啶基伸甲基(pyridinylmethylene)。
在此提及之烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、雜環烷基、雜環烯基、芳基、雜芳基、伸烷基、雜伸烷基、環伸烷基、雜環伸烷基、伸芳基、雜伸芳基與芳基伸烷基包括經取代部份與未經取代部分兩者。關於環伸烷基、雜環伸烷基、伸芳基、雜伸芳基與芳基伸烷基之取代基範例包括C1 －C10 烷基、C2 －C10 烯基、C2 －C10 炔基、C3 －C8 環烷基、C5 －C8 環烯基、C1 －C10 烷氧基(alkoxy)、芳基、芳氧基(aryloxy)、雜芳基、雜芳氧基、胺基、C1 －C10 烷胺基、C1 －C20 二烷胺基、芳胺基(arylamino)、二芳胺基、羥胺基、烷氧基胺基、C1 －C10 烷基磺胺基、芳基磺胺基、羥基、鹵素、硫基、C1 －C10 烷硫基、芳硫基(arylthio)、氰基(cyano)、硝基(nitro)、醯基(acyl)、醯氧基(acyloxy)、羧基(carboxy)與羧酸酯。烷基、伸烷基與雜伸烷基之取代基範例包括除了C1 －C10 烷基以外的所有上述取代基。環伸烷基、雜環伸烷基、伸芳基與雜伸芳基亦可與環烷基、雜環烷基、芳基或雜芳基稠合。
在另一態樣中，本發明特徵為一種多肽－聚合物之共軛物，其包括一多肽部分、一聚環氧烷部分、一用以連結多肽部分與聚環氧烷部分的連接物、位在多肽部分與連接物之間的第一鏈結以及位在聚環氧烷部分與連接物之間的第二鏈結。聚環氧烷部分可含有1至20,000個C1 －C8 環氧烷重複單元。連接物可為－Ar－X－(CH2 )n －，其中Ar可為伸芳基或雜伸芳基、X可為O、S或N(R)，R為氫或C1 －C10 烷基及n可為1至10。第一與第二鏈結每一者獨立地可為羧酸酯、羰基、碳酸根、醯胺基、胺基甲酸根、尿素、醚、硫基、磺醯基、亞磺醯基、胺基、亞胺基、羥胺基、膦酸根或磷酸根。
在另一態樣中，本發明特徵為式(I)之化合物： 在式(I)中，mPEG為甲氧基封端之環氧乙烷部分；R1 、R2 、R3 與R4 中之其中一者為其上取代有CHO之C1 －C10 烷基；且其它R1 、R2 、R3 與R4 之每一者獨立地為氫、C1 －C10 烷基、C2 －C10 烯基、C2 －C10 炔基、C3 －C20 環烷基、C3 －C20 環烯基、C1 －C20 雜環烷基、C1 －C20 雜環烯基、芳基或雜芳基。式(I)化合物之子群組(subset)為該些R2 與R3 是經CHO取代之丙基或經CHO取代之丁基。
在另一態樣中，本發明特徵為一多肽，其含有α干擾素部分(人類α2b 干擾素部分)與位在α干擾素部分之氮端上的1至6個額外胺基酸殘基。其範例包括－Ser－Gly－IFN、－Gly－Ser－IFN、－Met－Met－IFN、－Met－His－IFN、－Pro－IFN與－Gly－Met－IFN，其中IFN為人類α2b 干擾素部分。α干擾素部分亦可為野生型α干擾素部分，例如野生型人類α2b 干擾素部分。
在另一態樣中，本發明之特徵為用於治療多種疾病之方法，該些疾病例如B型肝炎病毒感染、C型肝炎病毒感染以及癌症，如多毛細胞白血病或卡波西氏肉瘤(Kaposi sarcoma)。此方法包括對需要治療之患者施予有效量的一或多種上述多肽－聚合物共軛物。術語「治療(treating)」或「療法(treatment)」係指對具有上述疾病、其病徵或其患病傾向的患者施予一或多種多肽－聚合物共軛物，以期賦予諸如治癒、緩和、改變、影響、改善或預防上述疾病、其病徵或其傾向等治療效果。
本發明亦包括其含有至少一有效量之上述多肽－聚合物共軛物與藥學可接受載劑的藥物組成物。
上述多肽－聚合物共軛物包括化合物本身，以及其適用的鹽類、前驅藥及溶劑合物。鹽類，例如由一陰離子與多肽－聚合物共軛物上之正電荷基團(如胺基)所形成。適當陰離子包括氯、溴、碘、硫酸根、硝酸根、磷酸根、檸檬酸根、甲基磺酸根、三氟乙酸根以及乙酸根。類似地，亦可由陽離子與多肽－聚合物共軛物上的負電荷基(如羧酸基)來形成鹽類。適當陽離子包括鈉離子、鉀離子、鎂離子、鈣離子、與銨離子，如四甲基銨離子。根據施用至患者身上的投藥方式，前驅藥的例子可包括能提供活性多肽－聚合物共軛物的酯類與其它藥學可接受衍生物為可提供。溶劑合物係指由活性多肽－聚合物共軛物與藥學可接受溶劑所形成的錯合物。藥學可接受溶劑之例子包括水、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯、乙酸與乙醇胺(ethanolamine)。
本發明範圍亦涵蓋該些含有一或多種上述多肽－聚合物共軛物且用於治療多種上述疾病的組成物，以及使用此等組成物來製造方才所提療法之藥劑的用途。
本發明之一或多個實施例之細節詳述如下。可從詳細描述與申請專利範圍清楚了解本發明的其他特徵、目的與優點。
本發明有關於多肽－聚合物共軛物，其係將一具療效之多肽部分耦合至至少一聚合物分子上。
多肽－聚合物共軛物可藉由化學領域中所熟知的合成方法製備而成。例如，含有官能基(如苯基胺基)之連接物分子首先透過胺基甲酸酯的鏈結方式而偶合至一含有羥基末端基團的甲氧基封端聚乙二醇(mPEG)聚合物上，以形成一連接物－聚合物共軛物。隨後，在把連接物－聚合物共軛物上的其它末端基團轉換為醛基後，可將含有另一官能基(如胺基)之療效多肽分子(如人類α2b 干擾素)耦合至上述連接物－聚合物共軛物上。為了能與連接物分子連接，可以諸如琥珀醯亞胺酯(succinimidyl ester)、對硝基酚(p －nitrophenol)、碳酸琥珀醯亞胺酯(succinimidyl carbonate)、三氟乙基磺酸酯(tresylate)、馬來醯亞胺(maleimide)、乙烯碸(vinyl sulfone)、碘乙醯胺(iodoacetamide)、維生素H(biotin)、磷脂(phospholipid)或螢光素(fluroescein)等基團將mPEG聚合物官能基化。在另一例子中，可先利用重組技術在具療效之多肽分子(如人類α2b 干擾素)的氮端引入1至6個額外胺基酸。接著將經修改後的人類α2b 干擾素分子耦合至其一端上具有連接物的甲氧基封端聚乙二醇部分。可藉著將修改連接物使其形成一適當官能基(如醛基團)，隨後使連接物上的官能基該經修改之人類α2b 干擾素分子上的官能基(如末端氨基)反應而達成耦合反應。
上方反應圖1顯示其中一個上述多肽－聚合物共軛物的製備例子。首先以四種化學轉化作用將4－硝基酚1 轉換為連接物分子2 ：(a)以3－氯丙－1－醇將羥基烷基化；(b)將末端羥基氧化為醛基；(c)藉由形成二甲醇縮醛基(dimethyl acetal group)來保護醛基；(d)將硝基還原為胺基。隨後使用碳酸N,N－二琥珀醯亞胺酯(N ,N －disuccinimidyl carbonate)將甲氧基封端聚乙二醇(mPEG)聚合物耦合至連接物分子2 ，以產生連接物－聚合物共軛物3 。接著移除連接物－聚合物共軛物3中的二甲醇縮醛保護基以獲得含有醛基的連接物－聚合物共軛物4 ，接著使該共軛物4 經修改人類α2b 干擾素分子(Ser－Gly－IFN)耦合，以形成多肽－聚合物共軛物5 。
用於上述合成方法中之化學物可包括，例如，溶劑、試劑、催化劑、保護基與去保護基試劑。上述方法可在文中所述步驟之前或之後包括額外的步驟，以添加或移除適當保護基團，最終允許多肽－聚合物共聚物之合成。此外，可以不同序列或順序進行多種合成步驟，以獲得所欲的多肽－聚合物共軛物。可用於合成可用之多肽－聚合物共軛物的合成化學轉換法與保護基方法(保護與去保護)為本技術領域中所熟知，包括，例如敘述於下列文獻中的方法：R.Larock,Comprehensive Organic Transformations ,VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis ,2d.Ed.,John Wiley and Sons(1991)；L.Fieser and M.Fieser,Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis ,John Wiley and Sons(1994)；與L.Paquette,ed.,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis ,John Wiley and Sons(1995)及其後續版本。
所合成出來的多肽－聚合物共軛物可進一步藉由例如管束色層分析法或高壓液態色層分析法來加以純化。
本文中所提及的多肽－聚合物共軛物可含有非芳香性雙鍵及一或多個不對稱中心。因此，該些共軛物可以外消旋化合物(racemate)與外消旋混合物、單一鏡像異構物、個別的非鏡像立體異構物、非鏡像立體異構物混合物與順式或反式異構物等型式存在。所有此等異構物型式均在本發明思及範圍內。
本發明之一態樣中為有關於投予有效量之一或多種上述多肽與聚合物共軛物以治療疾病的方法。更明確而言，可藉由對患有疾病、疾病病徵或可能罹患疾病之傾向的待治療者施用能提供治療效果之所需劑量的一或多種上述多肽－聚合物共軛物來治療疾病，且治療效果係指如治癒、緩和、改變、影響、改善或預防疾病、其病徵或其傾向。此對象可經由保健專業人員根據任何適當診斷方法加以確認。
含有至少一種有效量之上述多肽－聚合物共軛物與藥學可接受載劑的藥物組成物亦涵蓋在本發明範圍內。熟習此項技術者明白可根據如多肽－聚合物共軛物之水解速度、多肽－聚合物共軛物中之具療效多肽部分為何、聚合物之分子量、所治療疾病類型、投藥路徑、輔劑的使用以及是否與其他療法並用之可能性等因素來改變有效劑量。
為了實施本發明的方法，可經腸胃外管道、口、鼻、直腸、局部或頰(buccally)方式投予具有一或多種上所述多肽－聚合物共軛物之組成物。在此使用之術語「腸胃外(parenteral)」係指皮下、皮內、靜脈、肌肉內、關節內、動脈內、關節滑液內、胸骨內、膜內、病灶內(intralesional)、腹膜內、氣管內或顱內注射，以及任何適當注入技術。
無菌注射組成物可為在無毒之腸胃外可接受稀釋液或溶劑中之溶液或懸浮物，例如溶於1,3－丁二醇中所形成之溶液。可使用的可接受載劑與溶劑為甘露醇(mannitol)、水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、等滲透壓氯化鈉溶液。此外，不揮發油則是習知的溶劑或懸浮媒介，例如合成的單酸甘油酯或二酸甘油酯。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物可用於製備注射劑，例如天然藥學可接受油，如橄欖油或蓖麻油(castor oil)等，特別是它們的聚氧乙基化型式(polyoxyethylated versions)。這些油溶液或懸浮液亦可含有長鏈醇類稀釋劑或分散劑，或羧甲基纖維素或類似分散劑。其他常用來製造藥學可接受固體、液體、或其它劑型的界面活性劑(例如Tween或Spans)或其它類似乳化劑或生物利用性強化劑，亦可用於調配之目的。
用於口服用藥之組成物可為任何可口服的劑型，包括膠囊、藥片、乳劑以及水性懸浮液、分散液與熔液。在藥片方面中，常用的載劑包括乳糖與玉米澱粉。亦通常添加潤滑劑，如硬脂酸鎂。對於膠囊型的口服用藥，可用的稀釋劑包括乳糖及乾燥玉米澱粉。當口服水性懸浮液或乳劑時，活性成分可懸浮或溶解在與乳化劑或懸浮劑結合之油相中。如果需要，可添加某些增甜劑、風味劑或增色劑。
可根據在藥物配製技術領域中所熟知的技術來製備鼻噴劑或吸入組成物。例如，此組成物可以製備成一種溶於食鹽水中的溶液，並可使用技術領域中所熟知的芐醇(benzyl alcohol)或其它適當防腐劑、吸收促進劑以增加生物利用性、碳氟化物及/或其它增溶或助分散劑。具有一或多種上述多肽－聚合物共軛物的組成物亦可以製備成栓劑型式以用於直腸投藥。
藥學可接受載劑通常與一或多種上述的活性多肽－聚合物共軛物一起使用。在藥學組成物中的載體必須為「可接受的」，意思為其可與組成物之活性成分相容(且較佳地，可穩定活性成分)且對被治療對象無害。一或多種增溶劑可作為藥學輔劑以遞送上述化合物。其它載劑的例子包括膠狀氧化矽、硬脂酸鎂、纖維素、月桂基硫酸鈉以及D&C黃色色素十號(D&C Yellow #10)。
下述實施例僅做為說明之用，不能以任何方式限制本發明揭示內容的其餘部分。不需進一步詳細描述，相信熟習此項技術領域者可根據本文中的敘述內容將本發明做最大限度的運用。本文中所有提及的文獻均整體併入本文中以供參考。
實施例1 ：製備mPEG醛A至D
製備mPEG醛A： 步驟A：製備3－(4－硝基苯氧基)丙－1－醇 將3－氯丙－1－醇(3－Chloropropan－1－ol，160克，1.69莫耳(mol))加至含有4－硝基酚(4－nitrophenol，329克，2.37莫耳)與氫氧化鉀(KOH，151克，2.70莫耳)的1.4升之1：1乙醇－水混合物溶液中。加熱此混合物使之迴流60小時，冷卻至室溫，倒入1N氫氧化鈉水溶液(2.0升)，以及以二氯甲烷(dichloromethane，2×1.2升)萃取之。合併所得的有機萃取液後，以1N氫氧化鈉水溶液(NaOH，1.0升)及食鹽水(brine)清洗後，以無水硫酸鎂(MgSO4 )乾燥，以及真空濃縮獲得3－(4－硝基苯氧基)丙－1－醇(3－－(4－nitrophenoxy)propan－1－ol，273克，82%)，其為黃色固體。
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ 8.16(d,J ＝9.2 Hz,2 H),6.94(d,J ＝9.2 Hz,2 H),4.20(t,J ＝6.0 Hz,2 H),3.87－3.83(m,2 H),2.10－2.04(m,2 H),1.87(t,J ＝4.0 Hz,1 H)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )δ 163.9,141.2,125.8,114.3,65.8,59.1,31.7；GC－MS(m/z)計算C9 H11 NO4 ：197.2,發現值：197,139,123,109。
步驟B：製備3－(4－硝基苯氧基)丙醛 將溶於二氯甲烷(290毫升)中的溴化鈉(NaBr，18.6克，181.2毫莫耳(mmol))與TEMPO(0.85克，5.4毫莫耳)之混合物以0℃的溫度與30分鐘以上的時間徐徐加至含有3－(4硝基苯氧基)丙－1－醇(35.7克，181.2毫莫耳)的NaOCl冷溶液(240毫升，水與13重量%NaOCl水溶液為1：1的混合物)中。當添加完成，混合物變為淡黃色且在0℃攪拌1小時。在所得混合物分相後，以水(300毫升)清洗有機層，隨後以無水硫酸鎂乾燥之，以及經真空濃縮後獲得3－(4－硝基苯氧基)丙醛(3－(4－nitrophenoxy)propanal)(31克，87%)，其為淡黃色固體。
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ 9.93(s,1 H),8.24(d,J ＝9.2 Hz,2 H),7.01(d,J ＝9.2 Hz,2 H),4.45(t,J ＝6.0 Hz,2 H),3.05(t,J ＝6.0 Hz,2 H)；GC－MS(m/z)計算C9 H9 NO4 ：195.2,發現值：195,167,139,109,93,65。
步驟C：製備二甲醇縮3－(4－硝基苯氧基)丙醛 將AMBERLITE Ira－400(CI)離子交換樹脂(30克)加至溶於甲醇(300毫升)中的3－(4－硝基苯氧基)－丙醇(30克，0.15莫耳)溶液中。所得混合物在室溫下攪拌16小時且以矽藻土(Celite)過濾。濾液經真空濃縮後獲得二甲醇縮3－(4硝基苯氧基)丙醛(3－(4－nitrophenoxy)propanal dimethyl acetal)(30克，80%)，其為淡黃色固體。
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ 8.17(d,J ＝9.2 Hz,2 H),6.94(d,J ＝9.2 Hz,2 H),4.61(t,J ＝6.0 Hz,1 H),4.13(t,J ＝6.4 Hz,2 H),3.62(s,6 H),2.09－2.14(m,2 H)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )δ 163.8,141.4,125.8,114.3,101.6,64.8,53.3,32.4；GC－MS(m/z)計算出C11 H15 No3 ：241.2,發現：241,178,152,75。
步驟D：製備二甲醇縮3－(4－胺基苯氧基)丙醛 將溴氫化鈉(Sodium borohydride，15.0克，0.39莫耳)加至含有二甲醇縮3－(4－硝基苯氧基)丙醛(30.0克，0.12莫耳)與氯化銅(I)(1.2克，12.4毫莫耳)的乙醇冷溶液(500毫升)中。將該混合物加熱至60℃並持續攪拌30分鐘後，冷卻至室溫，以水(250毫升)稀釋，經真空濃縮以移除乙醇，隨後以甲基第三丁基醚(methylt －butyl ether)或MTBE(3×150毫升)萃取之。合併所得的有機萃取液，經食鹽水清洗，以無水硫酸鎂乾燥，以及真空濃縮後獲得一粗殘餘物(cude residue)。此利用管柱色層分析法在中性氧化鋁(neutral aluminum oxide)上使用40%乙酸乙酯(ethyl acetate)－己烷(hexane)為沖提液來純化該粗殘餘物，而獲得二甲醇縮3－(4－胺基苯氧基)丙醛(3－(4－aminophenoxy)propanal dimethyl acetal，19.5克，75%)，其為深紫色液體。
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ 6.74(d,J ＝8.8 Hz,2 H),6.66(d,J ＝8.8 Hz,2 H),4.62(t,J ＝5.6 Hz,1 H),3.95(t,J ＝6.0 Hz,2 H),3.35(s,6 H),2.01－2.06(m,2 H)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )δ 152.3,139.1,116.7,115.6,102.1,64.5,53.2,32.8；GC－MS(m/z)計算出C11 H17 NO3 ：211.3,發現值：211,148,109,75。
步驟E：製備二甲醇縮mPEG醛A 以緩慢加熱的方式將線性20kDa mPEG－OH(60.0克，3毫莫耳)溶於300毫升的乾燥二噁烷(dioxane)中。在溶液冷卻至室溫後，依序加入碳酸N,N－二琥珀醯亞胺酯(5.0克，19.5毫莫耳)與4－(二甲基胺基)吡啶(4－(dimethylamino)pyridine，2.5克，20.4毫莫耳)。反應混合物在室溫攪拌24小時。接著將二甲醇縮3－(4－胺基苯氧基)丙醛(15.0克，71.0毫莫耳)加入反應混合物中。此混合物在室溫再攪拌18小時後，以4小時以上的時間將此混合物逐滴加入MTBE(4.5升)中。收集並真空乾燥所得到的白色沉澱，而得到59.5克的粗產物，將該粗產物再次溶於二氯甲烷(250毫升)中。在該粗產物溶液中以4小時以上的時間逐滴加入另一批MTBE(6.0升)。收集並真空乾燥所獲得的白色沉澱，而獲得二甲醇縮mPEG醛A(mPEG Aldehyde A dimethyl acetal，58.0克，97%)，其為白色固體。
1 H NMR(400 MHz,DMSO－d 6 )δ 9.54(br,1 H),7.35(d,J ＝8.8 Hz,2 H),6.85(d,J ＝8.8 Hz,2 H),4.56(t,J ＝5.6 Hz,1 H),4.17(t,J ＝4.4 Hz,2 H),3.93(t,J ＝9.6 Hz,2 H),3.25(s,6 H),3.24(s,3 H),1.93－1.97(m,2 H)。
步驟F：製備mPEG醛A 將二甲醇縮mPEG醛A(55.0克，2.75毫莫耳)溶解於一緩衝溶液(600毫升，檸檬酸－鹽酸－氯化鈉，pH＝2)。此溶液在室溫攪拌20小時且以二氯甲烷萃取(6×200毫升)。合併有機萃取液，並以食鹽水清洗，以無水硫酸鈉(Na2 SO4 )乾燥該有機萃取液，以及將其真空濃縮至體積大約為350毫升。以6小時以上的時間逐滴加入MTBE(6.0升)。收集且真空乾燥所得的白色沉澱物，而獲得mPEG醛A(52.0克，95%)，其為白色粉末。
1 H NMR(400 MHz,DMSO－d 6 )δ 9.73(s,1 H),9.56(br,1 H),7.36(d,J ＝8.8 Hz,2 H),6.86(d,J ＝8.8 Hz,2 H),4.23(t,J ＝6.0 Hz,2 H),4.17(t,J ＝4.8 Hz,2 H),3.32(s,3 H),2.83－2.87(m,2 H).
製備mPEG醛B： 步驟A：製備4－(4－硝基苯氧基)丁－1－醇 對－硝基氟基苯(p －Nitrofluorobenzene，10.0克，70.7毫莫耳)在室溫下以超過15分鐘的時間緩慢加至1－4丁二醇(1,4－butanediol，31.9克，354毫莫耳)與氫氧化鉀(5.0克，89.1毫莫耳)的混合物中。混合物在室溫攪拌1小時。接著將該混合物倒入水中且以二氯甲烷萃取。以食鹽水清洗該有機萃取液，以無水硫酸鎂乾燥，以及真空濃縮後獲得一粗產物。於乙酸乙酯－己烷再結晶該粗產物，而獲得4－(4－硝基苯氧基)丁－1－醇(4－(4－nitrophenoxy)butan－1－ol，9.6克，64%)，其為白色固體。
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ 8.22(d,J ＝8.8 Hz,2 H),6.98(d,J ＝8.8 Hz,2 H),4.14(t,J ＝6.0 Hz,2 H),3.80－3.75(m,2 H),2.00－1.94(m,2 H),1.83－1.76(m,2 H),1.65－1.48(br,1 H)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )δ 164.0,141.4,125.9,114.4,68.6,62.3,29.0,25.5；GC－MS(m/z)計算出C10 H13 NO4 ：211.2,發現值：211,139,123,109,73,55。
步驟B：製備4－(4－硝基苯氧基)丁醛 使用用於製備mPEG醛A之步驟B所述的方法，從4－(4－硝基苯氧基)丁－1－醇製備出4－(4－硝基苯氧基)丁醛(4－(4－Nitrophenoxy)butanal)，其為白色固體，產率81%。
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ 9.86(s,1 H),8.17(d,J ＝8.8 Hz,2 H),6.94(d,J ＝8.8 Hz,2 H),4.12(t,J ＝6.0 Hz,2 H),2.71(t,J ＝6.0 Hz,2 H),2.18(m,2 H)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )δ 200.3,162.8,140.5,124.9,113.5,66.7,39.3,20.7；GC－MS(m/z)計算出C10 H11 NO4 ：209.2,發現值：209,139,123,109,71。
步驟C：製備二甲醇縮4－(4－硝基苯氧基)丁醛 使用用於製備mPEG醛A之步驟C所述的方法，從4－(4－硝基苯氧基)丁醛製備出二甲醇縮4－(4－硝基苯氧基)丁醛(4－(4－Nitrophenoxy)butanal dimethyl acetal)，其為淺黃色固體，產率82%。
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ 8.19(d,J ＝8.8 Hz,2 H),6.96(d,J ＝8.8 Hz,2 H),4.62(t,J ＝5.6 Hz,1 H),4.10(t,J ＝5.6 Hz,2 H),3.37(s,6 H),1.90－1.93(m,2 H),1.85－1.81(m,2 H)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )δ 163.9,141.3,125.8,114.3,104.0,68.3,52.9,28.9,24.1；GC－MS(m/z)計算出C12 H17 NO5 ：255.3,發現值：255,224,192,117,75。
步驟D：製備二甲醇縮4－(4－胺基苯氧基)丁醛 二甲醇縮4－(4－硝基苯氧基)丁醛(4.0克，15.7毫莫耳)溶解於甲醇(40毫升)中，並在存在著10%鈀碳(palladium on carbon，0.4克)的情況下於室溫進行氫化反應16小時。混合物經矽藻土(Celite)過濾後，真空濃縮該濾液而獲得一粗殘餘物，以管柱層析法在中性氧化鋁上使用50%乙酸乙酯－己烷為沖提液來純化該粗殘餘物，而獲得二甲醇縮4－(4－氨基苯氧基)丁醛(4－(4－aminophenoxy)butanal dimethyl acetal，2.5克，70%)，其為深紫色液體。
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ 6.70(d,J ＝8.8 Hz,2 H),6.57(d,J ＝8.8 Hz,2 H),4.40(t,J ＝5.6 Hz,1 H),3.85(t,J ＝5.6 Hz,2 H),3.30(s,6 H),1.78－1.73(m,4 H)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )δ 151.6,139.9,115.9,115.3,104.0,67.8,52.4,28.8,24.3；GC－MS(m/z)計算出C12 H19 NO3 ：225.3,發現值：225,194,162,109,85。
步驟E：製備二甲醇縮mPEG醛B 使用用於製備mPEG醛A之步驟E所述的方法，從線性的20kDa mPEG－OH與二甲醇縮4－(4－胺基苯氧基)丁醛製備出二甲醇縮mPEG醛B(mPEG aldehyde B dimethyl acetal)，其為白色固體，產率93%。
1 H NMR(400 MHz,DMSO－d 6 )δ 9.53(br,1 H)7.35(d,J ＝8.8 Hz,2 H),6.84(d,J ＝8.8 Hz,2 H),4.40(t,J ＝5.6 Hz,1 H),4.17(t,J ＝4.4 Hz,2 H),3.91(t,J ＝9.6 Hz,2 H),3.24(s,3 H),3.23(s,6 H),1.71－1.63(m,4 H)。
步驟F：製備mPEG醛B 使用用於製備mPEG醛A之步驟F所述的方法，從二甲醇縮mPEG醛B製備出mPEG醛B(mPEG aldehyde B)，其為白色固體，產率87%。
1 H NMR(400 MHz,DMSO－d 6 )δ 9.71(s,1 H),9.54(br,1 H),7.34(d,J ＝8.8 Hz,2 H),6.83(d,J ＝8.8 Hz,2 H),4.17(t,J ＝4.8 Hz,2 H),3.91(t,J ＝6.0 Hz,2 H),3.24(s,3 H),2.60－2.56(m,2 H),1.97－1.93(m,2 H)。
製備mPEG醛C： 步驟A：製備3－(3－硝基苯氧基)丙－1－醇 使用用於製備mPEG醛A之步驟A所述的方法，從3－硝基酚(3－nitrophenol)與3－氯丙－1－醇製備出3－(3－硝基苯氧基)丙－1－醇(3－(3－nitrophenoxy)propan－1－ol)，所得3－(3－硝基苯氧基)丙－1－醇為淺黄色液體，產率93%。
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ 7.85(d,J ＝8.0 Hz,1 H),7.78(s,1 H),7.46(t,J ＝8.0 Hz,1 H),7.26(d,J ＝8.0 Hz,1 H),4.23(t,J ＝6.0 Hz,2 H),3.92(t,J ＝6.0 Hz,2 H),2.16－2.09(m,2 H)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )δ 159.3,149.1,129.9,121.5,115.7,108.7,65.7,59.6,31.7。
步驟B：製備3－(3－硝基苯氧基)丙醛 使用用於製備mPEG醛A之步驟B所述的方法，從3－(3－硝基苯氧基)丙－1－醇製備出3－(3－硝基苯氧基)丙醛(3－(3－nitrophenoxy)propanal)，所得的3－(3－硝基苯氧基)丙醛為淺黃色液體，產率78%。
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ 9.90(s,1 H),7.85(d,J ＝8.0 Hz,1 H),7.75(s,1 H),7.45(d,J ＝8.0 Hz,1 H),7.26－7.22(m,1 H),4.40(t,J ＝6.0 Hz,2 H),2.99(t,J ＝6.0 Hz,2 H)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )δ 199.1,158.9,149.1,130.0,121.5,116.1,108.7,62.0,42.8；GC－MS(m/z)計算出C9 H9 NO4 ：195.2,發現：195,167,139,93,65。
步驟C：製備二甲醇縮3－(3－胺基苯氧基)丙醛 依序使用用於製備mPEG醛A之步驟C與製備mPEG醛B之步驟D所述的方法，從3－(3－硝基苯氧基)丙醛製備出二甲醇縮3－(3－胺基苯氧基)丙醛，所得的二甲醇縮3－(3－胺基苯氧基)丙醛為深紫色液體，產率45%。
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ 7.04(t,J ＝8.0 Hz,1 H),6.33－6.24(m,2 H),6.24(s,1 H),4.62(t,J ＝5.6 Hz,1 H),4.23(t,J ＝4.4 Hz,2 H),3.61(br,2 H),3.36(s,6 H),2.08－2.03(m,2 H)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )δ 159.9,147.6,130.0,107.9,104.5,102.1,101.6,63.6,53.3,32.8；GC－MS(m/z)計算出C11 H17 NO3 ：211.2,發現：211,196,164,148,109,75。
步驟D：製備二甲醇縮mPEG醛C 使用用於製備mPEG醛A之步驟E所述的方法，從線性的20kDa mPEG－OH與二甲醇縮3－(3－胺基苯氧基)丙醛(3－(3－aminophenoxy)propanal dimethyl acetal)製備出二甲醇縮mPEG醛C(mPEG aldehyde C dimethyl acetal)，所得的二甲醇縮mPEG醛C為白色粉末，產率95%。
1 H NMR(400 MHz,DMSO－d 6 )δ 9.72(br,1 H),7.17－7.13(m,2 H),7.01(d,J ＝8.0 Hz,1 H),6.85(d,J ＝8.0 Hz, 1 H),4.95(t,J ＝5.6 Hz,1 H),4.53(t,J ＝4.8 Hz,2 H),3.95(t,J ＝9.6 Hz,2 H),3.26(s,3 H),3.24(s,6 H),2.00－1.95(m,2 H)。
步驟E：製備mPEG醛C 使用用於製備mPEG醛A之步驟F所述的方法，從二甲醇縮mPEG醛C製備出mPEG醛C，所得mPEG醛C為白色粉末，產率95%。
1 H NMR(400 MHz,DMSO－d 6 )δ 9.72(s,1 H),9.69(br,1 H),7.20－7.13(m,2 H),7.01(d,J ＝8.0 Hz,1 H),6.55(d,J ＝8.0 Hz,1 H),4.24－4.07(m,4 H),3.24(s,3 H),2.87(t,J ＝8.0 Hz,2 H)。
製備mPEG醛D： 步驟A：製備4－(3－硝基苯氧基)丁－1－醇 使用用於製備mPEG醛A之步驟A所述的方法，接著與濃縮硫酸於在乙醇中迴流反應0.5小時，從3－硝基酚與2－[(4－氯丁基)氧]四氫吡喃(2－[(4－chlorobutyl)oxy]tetrahydropyran)製備出4－(3－硝基苯氧基)丁－1－醇，產率81%。
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ 7.79(d,J ＝8.0 Hz,1 H),7.71(s,1 H),7.41(t,J ＝8.0 Hz,1 H),7.26－7.19(m,1 H),4.08(t,J ＝6.0 Hz,2 H),3.73(t,J ＝6.4 Hz,2 H),1.96－1.90(m,2 H),1.89－1.71(m,2 H)；GC－MS(m/z)計算C10 H13 NO4 ：211.2,發現值：211,139,123,109,93,73,55。
步驟B：製備4－(3－硝基苯氧基)丁醛 使用用於製備mPEG醛A之步驟B所述的方法從4－(3－硝基苯氧基)丁－1－醇製備出4－(3－硝基苯氧基)丁醛(4－－(3－nitrophenoxy)butanal)，產率78%。
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ 9.86(s,1 H),7.82(d,J ＝8.0 Hz,1 H),7.71(s,1 H),7.42(t,J ＝8.0 Hz,1 H),7.22－7.19(m,1 H),4.09(t,J ＝6.0 Hz,2 H),2.70(t,J ＝7.0 Hz,2 H),2.20－2.14(m,2 H)。
步驟C：製備二甲醇縮4－(3－胺基苯氧基)丁醛 依序使用用於製備mPEG醛A之步驟C與製備mPEG醛B之步驟D所述的方法，從4－(3－硝基苯氧基)丁醛製備出二甲醇縮4－(3－胺基苯氧基)丁醛，產率52%。
1 H NMR(400 MHz,CDCl3 )δ 7.10－7.04(m,1 H),6.94－6.33(m,3 H),4.43(t,J ＝5.6 Hz,1 H),3.92(t,J ＝6.4 Hz,2 H),3.34(s,6 H),1.82－1.78(m,4 H)；13 C NMR(100 MHz,CDCl3 )δ 160.1,164.5,130.1,108.3,105.3,104.3,102.1,67.3,52.8,29.1,24.5；GC－MS(m/z)計算出C12 H19 NO3 ：225.3,發現：225,194,164,109,85。
步驟D：製備二甲醇縮mPEG醛D 使用用於製備mPEG醛A之步驟E所述的方法，從線性的20kDa mPEG－OH與二甲醇縮4－(3－胺基苯氧基)丁醛(4－(3－aminophenoxy)butanal dimethyl acetal)來製備出二甲醇縮mPEG醛D(mPEG aldehyde D dimethyl acetal)，所得二甲醇縮mPEG醛D為白色粉末，產率90%。
1 H NMR(400 MHz,DMSO－d 6 )δ 9.71(br,1 H),7.16－7.12(m,2 H),7.01(d,J ＝8.8 Hz,1 H),6.54(d,J ＝8.8 Hz,1 H),4.95(t,J ＝5.6 Hz,1 H),4.20(t,J ＝4.8 Hz,2 H),3.92(t,J ＝6.0 Hz,2 H),3.25(s,6 H),3.24(s,3 H),1.71－1.64(m,4 H)。
步驟E：製備mPEG醛D 使用用於製備mPEG醛A之步驟F所述的方法從二甲醇縮mPEG醛D製備出mPEG醛D，所得mPEG醛D為白色粉末，產率95%。
1 H NMR(400 MHz,DMSO－d 6 )δ 9.72(s,1 H),9.70(br,1 H),7.16－7.13(m,2 H),7.01(d,J ＝8.8 Hz,1 H),6.53(d,J ＝8.8 Hz,1 H),4.20(t,J ＝4.4 Hz,2 H),3.92(t,J ＝6.0 Hz,2 H),3.24(s,3 H),2.74－2.61(m,2 H),1.98－1.91(m,2 H)。
實施例2 ：製備Ser－Gly－IFN
，使用人類基因組DNA為模板以PCR方法來複製選殖(clone)出經修改重組的人類α2b －干擾素，即Ser－Gly－IFN。根據人類α2b 干擾素(GenBank Accession#NM_000605)的側翼序列來合成寡核苷酸。將所得到的PCR產物次選殖(subclone)至pGEM－T載體中(Promega)。透過pGEM－T的選殖株進行PCR反應以複製出IFN變體，隨後以NdeI/BamHI作為選殖位置將該INF變體次選殖至蛋白質表現載體pET－24a中(Novagen)，其中該pET－24a載體是一種由T7 RNA聚合酶啟動子所驅動的載體。將pET－24a載體導入BL21－CodonPlus(DE 3)－RIL大腸桿菌中(Stratagene)。使已轉型(transformed)的BL21－CodonPlus(DE 3)－RIL大腸桿菌生活於含有卡那黴素(Karamycin)(50微克/毫升)與氯黴素(chloramphenical)(50微克/毫升)的環境下，以篩選出高表現性的選殖株。
使用高營養培養液(Terrific broth medium，TB)(BD，200毫升)在1,000毫升的燒瓶中增殖具有Ser－Gly－IFN基因之BL21－CodonPlus(DE 3)－RIL大腸桿菌。燒瓶在37℃以230 rpm搖動16小時。在5公升的發酵瓶(Bioflo 3000；New Brunswick Scientific Co.，艾迪森市，新紐澤西洲)中進行批次與進料批次發酵(Batch and fed－batch fermentation)。使用150毫升之過夜預培養接種菌液與3公升之高營養培養液(TB)進行批次發酵，其中該高營養培養液(TB)含有卡那黴素(50微克/毫升)、氯黴素(50微克/毫升)、0.4%乙二醇與0.5%(v/v)微量元素(10克/升之FeSO4 ．7H2 O、2.25克/升之ZnSO4 ．7H2 O、1克/升之CuSO4 ．5H2 O、0.5克/升之MnSO4 ．H2 O、0.3克/升之H3 BO3 、2克/升之CaCl2 ．2H2 O、0.1克/升之(NH4 )6 Mo7 O24 、0.84克/升之EDTA、50毫升/升HCl)。將溶氧濃度控制在35%且藉由添加5N氫氧化鈉水溶液使pH值維持在7.2。準備含有600克/升葡萄糖與20克/升MgSO4 ．7H2 O之進料溶液。當pH值上升至超過預設值時，加入適當體積的進料溶液以增加培養液中的葡萄糖濃度。藉由添加IPTG至培養役中使其最終濃度為1mM來誘發Ser－Gly－IFN基因表現，且在培養3小時後收成培養液。
所收集細胞團塊(以大約1：10(濕重量，克/毫升)的比例重新懸浮在TEN緩衝液(50 mM Tris－HCl(pH 8.0)、1 mM EDTA、100 mM氯化鈉)中且藉由高壓均質機(microfluidizer)來打破細菌細胞，且接著以10,000 rpm的轉速離心20分鐘。含有蛋白含體(inclusion body,IB)的團塊以TEN緩衝液清洗兩次且以上述轉速離心。接著將含有IB的團塊懸浮在150毫升之4M鹽酸胍鹽(guanidium HCl,GuHCl)水溶液且在20,000 rpm離心15分鐘。接著將IB溶解在50毫升之GuHCl水溶液中。GuHCl溶解物質在20,000 rpm離心20分鐘。藉著僅在添加已變性(denature)IB時進行攪拌的方式將已變性的IB稀釋於1.5升新鮮製備的復性緩衝液(100 mM三－氯化氫(pH 8.0)、0.5M L－精氨酸、2 mM EDTA)中來進行復性(refold)。復性反應混合物在不攪拌的情況下進行48小時。復性後的重組人類α2b －干擾素(即Ser－Gly－IFN)再次以20mM的Tris緩衝液(含2mM EDTA與0.1M尿素，pH 7.0)做透析，以進一步使用Q－sepharose管柱色層分析法來純化。
復性後的重組人類蛋白質Ser－Gly－IFN裝載至Q－sepharose管柱中(GE Amersham Pharmacia，匹茲堡，賓夕法尼亞州)。管柱已用20mM Tris－HCl緩衝液(pH 7.0)預平衡。產物隨著20mM Tris－HCl緩衝液(pH 7.0)與200mM氯化鈉之混合物沖提出。根據分液在280nm的吸光度來收集含有Ser－Gly－IFN之分液。使用Bradford方法的蛋白質測定試劑組(Pierce,Rockford，伊利諾州)測定出Ser－Gly－IFN的濃度。
實施例3 ：mPEG醛A與Ser－Gly－IFN之共軛物。
含有mPEG醛A與Ser－Gly－IFN之代表性多肽與聚合物共軛物的製備方法如下：以mPEG醛A來處理上述實施例2中所製備且經Q－sepharose純化後的Ser－Gly－IFN(1毫克)。最後反應混合物含有50mM磷酸鈉(pH 6.0)、5mM氰硼氫化鈉(Aldrich,密爾瓦基市，威斯康辛州)以及10毫克mPEG醛A。隨後使混合物在室溫反應20小時以形成主產物單－聚乙二醇修飾的Ser－Gly－IFN，接著藉由SP XL sepharose管柱色層分析來純化之(GE Amersham Pharmacia，匹茲堡，賓夕法尼亞州)。更明確而言，SP管柱以20mM乙酸鈉溶液(pH 5.4)預平衡與清洗。接著以含有20mM乙酸鈉(pH 5.4)與60mM氯化鈉之緩衝液沖提單－聚乙二醇修飾Ser－Gly－IFN。藉由含有20mM乙酸鈉(pH 5.4)與200mM氯化鈉之緩衝液來沖提出未反應的IFN(即Ser－Gly－IFN)。藉由12%十二烷基硫酸鈉－聚丙烯醯胺膠體進行膠體電泳以分析該沖提出的分液(fractions)，且藉由以考馬斯亮藍R－250(Coomassie Brilliant Blue R－250)及銀染來偵測訊號。根據滯留時間與在280nm的吸光度來收集含有單－聚乙二醇修飾Ser－Gly－IFN分液。藉由蛋白質測定試劑組使用Bradford方法(Pierce,Rockford,伊利諾州)來測定單－聚乙二醇修飾Ser－Gly－IFN的濃度。單－聚乙二醇修飾Ser－Gly－IFN之單離產率為30%至40%。
實施例4： 單－聚乙二醇修飾之Ser－Gly－IFN的物理與生物性質
聚乙二醇修飾反應之特性係藉由Ser－Gly－IFN與單－聚乙二醇修飾Ser－Gly－IFN兩者經胰蛋白酶剪切後的胜肽圖譜(tryptic peptide mapping)來測定。每一化合物取出100微克樣品進行真空乾燥並且在60微升之8M尿素/0.4M碳酸氫鈉溶液中復原。在以還原劑與碘乙酸(iod oacetic acid)處理之後，以購自Promega的胰蛋白酶(定序級)來分解該溶液。將該溶液小量分裝(aliquot)並注射入C18 HPLC管柱中。所得經胰蛋白酶分解之胜肽使用在0.1% TFA－H2 0中含有0至70%濃度梯度之乙腈的沖提液進行75分鐘的沖提來加以分離。藉由測量在214nm的吸光度來監控得自Ser－Gly－IFN與單－聚乙二醇修飾Ser－Gly－IFN兩樣品之胜肽斷片並且手動收集之，隨後以Speed－Vac系統將其乾燥，並進行基質輔助雷射脫附游離/飛行時間質譜分析(MALDI－TOF)。比較得自兩個樣品的資料，顯示聚乙二醇修飾反應之主要位置發生在Ser－Gly－IFN的氮端(N－terminus)。
單－聚乙二醇修飾之Ser－Gly－IFN與其他經修飾之人類IFN－α2b 變體的單－聚乙二醇修飾產物(即單－聚乙二醇修飾的Gly－Ser－IFN、－Met－Met－IFN、－Met－His－IFN、－Pro－IFN與－Gly－Met－IFN)的抗病毒活性係在牛腎上皮細胞(MDBK)以囊口腔炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)進行測試。藉由在試驗中加入四唑鹽WST－1觀察活細胞內的酵素是否生成甲臢(formazan)來測定已感染細胞的細胞病變情形(cytopathic effect,CPE)。以每種濃度重複三次的方式來執行CPE測試。所有這些單－聚乙二醇修飾之人類IFN－α2b 化合物的特定抗病毒活性係根據能提供50%細胞保護效果(EC50 ，即50%細胞病變)的濃度來計算。使用Roferon作為標準品，CPE抗病毒生物試驗的結果係以IU/mg為單位來表示之。結果顯示單－聚乙二醇修飾之Ser－Gly－IFN的CPE生物活性為2.0×108 ，而其它單－聚乙二醇修飾之人類IFN－α2b 變體的CPE生物活性介在8.3×106 至2.9×107 IU/mg範圍內。
其它實施例
在此說明書中揭露的特徵可以任何結合方式結合。在此說明書揭露的每一特徵可替換成能提供相同、等效或類似目的之替代性特徵。因此，除非另有說明，否則本文中所揭露的每一特徵僅為一系列等效或類似特徵中的其一範例而已。
從上述描述，熟習該項技術者可輕易確定本發明之必要特徵，且在不偏離其精神與範圍之下，可做出許多本發明的變化與修飾態樣以符合不同用途與條件。因此，其它實施例亦在後附申請專利範圍之內。

Claims (17)

  1. 一種多肽與聚合物共軛物，其包含：一多肽部分(polypeptide moiety)；一聚環氧烷部分(polyalkylene oxide moiety)；一連接物，其連接該多肽部分與該聚環氧烷部分；一第一鏈結，其在該多肽部分與該連接物之間；以及一第二鏈結，其在該聚環氧烷部分與該連接物之間；其中該多肽部分含有一Ser-Gly-人類α干擾素(IFN)部分；該聚環氧烷部分含有1至20,000個C1 -C8 環氧烷重複單元；該連接物為C1 -C8 伸烷基(alkylene)、C1 -C8 雜伸烷基(heteroalkylene)、C3 -C8 環伸烷基(cycloalkylene)、C3 -C8 雜環伸烷基(heterocycloalkylene)、伸芳基(arylene)、雜伸芳基(arylene)、芳基伸烷基(aralkylene)或-Ar-X-(CH2 )n -，其中Ar為伸芳基或雜伸芳基，X為O、S或N(R)，R為氫或C1 -C10 烷基以及n為1至10；該第一與該第二鏈結每一者獨立地為羧酸酯、羰基、碳酸鹽、醯胺基、胺基甲酸基、尿素、醚、硫基、磺醯基、亞磺醯基、胺基、亞胺基、羥胺基、膦酸鹽或磷酸鹽。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之共軛物，其中上述之人類α干擾素為人類α2b -干擾素部分。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之共軛物，其中上述之聚環氧烷部分為一含有5至10,000個重複單元之聚環氧乙烷。
  4. 如申請專利範圍第3所述之共軛物，其中上述之聚環氧乙烷部分的數目平均分子量為20,000道爾頓。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之共軛物，其中上述之連接物為-Ar-X-(CH2 )n -。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之共軛物，其中上述之Ar為伸苯基(phenylene)。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之共軛物，其中上述之X為氧(O)。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之共軛物，其中上述之n為3。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之共軛物，其中上述之第一鏈結為胺基(amino group)，且第二鏈結為胺基甲酸基(carbamate group)。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之共軛物，其中上述之共 軛物為，其中mPEG為甲氧基封端的聚環氧乙烷(methoxy-capped polyethylene oxide)。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之共軛物，其中上述之聚環氧烷部分為一含有5至10,000個重複單元的聚環氧乙烷部分。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之共軛物，其中上述之聚環氧乙烷部分之數目平均分子量為20,000道爾頓。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之共軛物，其中上述之連接物為-Ar-X-(CH2 )n -。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之共軛物，其中上述之Ar為伸苯基。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之共軛物，其中上述之X為氧(O)。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之共軛物，其中上述之n 為3。
  17. 如申請專利範圍第1項所述之共軛物，其中上述之第一鏈結為胺基，且該第二連接物為胺基甲酸基。
TW095150007A 2005-12-30 2006-12-29 藥物與聚合物之共軛物 TWI381850B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US75545905P 2005-12-30 2005-12-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW200800272A TW200800272A (en) 2008-01-01
TWI381850B true TWI381850B (zh) 2013-01-11

Family

ID=38228947

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW095150007A TWI381850B (zh) 2005-12-30 2006-12-29 藥物與聚合物之共軛物

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20070185135A1 (zh)
EP (1) EP1976555A2 (zh)
JP (1) JP2009524598A (zh)
KR (1) KR20080091180A (zh)
CN (1) CN101405024B (zh)
AU (1) AU2006332533A1 (zh)
CA (1) CA2635889A1 (zh)
EA (1) EA200870137A1 (zh)
TW (1) TWI381850B (zh)
WO (1) WO2007079404A2 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
WO2004060300A2 (en) * 2002-12-26 2004-07-22 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
BR0317742A (pt) * 2002-12-26 2005-11-22 Mountain View Pharmaceuticals Conjugados poliméricos de interferon-beta com potência biológica aumentada
CN101883784B (zh) * 2007-10-01 2014-10-15 药华医药股份有限公司 N-端修饰的干扰素-α
WO2014148378A1 (ja) * 2013-03-19 2014-09-25 公立大学法人首都大学東京 界面活性剤様化合物
CN103980494B (zh) * 2014-04-21 2016-04-13 国家纳米科学中心 一种具有抗肿瘤活性的多肽聚合物及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5844099A (en) * 1993-10-20 1998-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cytokine antagonists
US6180095B1 (en) * 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US20020041898A1 (en) * 2000-01-05 2002-04-11 Unger Evan C. Novel targeted delivery systems for bioactive agents
US6458932B1 (en) * 1992-09-03 2002-10-01 Yeda Research And Development Co. Ltd. Interferon-α/β binding protein, its preparation and use

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4171282A (en) * 1977-12-07 1979-10-16 Ciba-Geigy Corporation Fluorinated nonionic surfactants
WO1986002068A1 (en) * 1984-09-26 1986-04-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Mutual separation of proteins
FR2676058B1 (fr) * 1991-04-30 1994-02-25 Hoechst Lab Prodrogues glycosylees, leur procede de preparation et leur utilisation dans le traitement des cancers.
CA2312975C (en) * 1997-12-17 2012-08-21 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
ES2317843T3 (es) * 1999-07-13 2009-05-01 Bolder Biotechnology, Inc. Proteinas de fusion de eritropoyetina-inmunoglobulina.

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6458932B1 (en) * 1992-09-03 2002-10-01 Yeda Research And Development Co. Ltd. Interferon-α/β binding protein, its preparation and use
US5844099A (en) * 1993-10-20 1998-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cytokine antagonists
US6180095B1 (en) * 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US20020041898A1 (en) * 2000-01-05 2002-04-11 Unger Evan C. Novel targeted delivery systems for bioactive agents

Also Published As

Publication number Publication date
KR20080091180A (ko) 2008-10-09
WO2007079404A2 (en) 2007-07-12
CN101405024A (zh) 2009-04-08
TW200800272A (en) 2008-01-01
AU2006332533A1 (en) 2007-07-12
EA200870137A1 (ru) 2008-12-30
CA2635889A1 (en) 2007-07-12
CN101405024B (zh) 2012-01-18
JP2009524598A (ja) 2009-07-02
WO2007079404A3 (en) 2007-11-15
US20070185135A1 (en) 2007-08-09
EP1976555A2 (en) 2008-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI381850B (zh) 藥物與聚合物之共軛物
TWI381851B (zh) 蛋白質－聚合物綴合物
KR101782084B1 (ko) 단백질-고분자 접합체의 치료적 용도
EA020347B1 (ru) Пептид-полимерные конъюгаты
TW200911288A (en) Peptide-polymer conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees